ICSC48 - Criação e manejo de camundongos e ratos

Universidade Federal da BahiaInstituto de Ciências da Saúde

Campus Anísio Teixeira

Criação e manejo de camundongos,

ratos e hamsters

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Camundongos• Origem

• Registros de 4 mil anos e até mesmo na Bíblia

• Continente asiático – migrações humanas

• Associação com doenças

• Atividades de invadir estoque de alimentos (grãos)

• Pequeno, prolífero, gestação curta, ser de fácil domesticação e manutenção

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Taxonomia

• Classe: Mammalia

• Ordem: Rodentia

• Família: Muridae

• Gênero: Mus

• Espécie: Mus musculus

• Controvérsias - C57BL/6, 6,5% do genoma é originário de Mus spretus

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Características gerais

• Corpo fusiforme

• Cauda de comprimento até maior que o corpo

• Coloração natural – marrom escuro no dorso e ventre mais claro / cinzento – outros posteriores: branco, preto

• Não possui glândulas sudoríparas

• Ciclo estral - 4-5 dias, 4 fase distintas

• Superpopulação e ausência de machos (anestro)

• Gestação - 19 a 21 dias (10 dias - aumento no abdômen)

• Filhotes/parto é de 8-10 (outbred) e 5 filhotes/parto em linhagens inbred.12:44 4

Fases do ciclo estral

Efeito de Whitten

saída do anestroem 48h

reabsorção

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Dados biológicos• Nascem desprovido de pelos, com vibrissas

• Olhos e pavilhão auricular fechados

• Peso de 1 g

• Pelos aparecem por volta de 3-4 dias (cobertos – 1 semana)

• 10 – 15 dias: abrem os olhos + alimentação sólida

• Desmame – a partir de 18 dias

• Peso 21 dias - 10-12 g (outbred) e 8-10 g (inbred)

• Sexagem - distância ano-genital e visualização da bolsa escrotal

• Puberdade - 30 - 40 dias / Maturidade sexual - 50-60 dias

• Acasalamento - 18-20 g (outbred) e 15-18 g (inbred)

• Permanência em reprodução - um ano 6

Manejo das colônias• COLÔNIA DE FUNDAÇÃO: primeira colônia que se estabelece –

manutenção do biotério

• Acasalamentos monogâmicos permanentes!!!

• Grau de consangüinidade – controlado pelo número de casais

• COLÔNIA DE EXPANSÃO: segunda colônia a ser formada -estabelecimento consanguinidade

• COLÔNIA DE PRODUÇÃO: Terceira colônia a ser formada - produzir animais suficientes para as pesquisas

• Acasalamentos monogâmicos ou poligâmicos, permanentes ou temporários

• Casais e/ou haréns vêm das colônias de fundação (outbred) ou das colônias de expansão (inbred)

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Manejo das colônias

• Repor matrizes logo após a performance reprodutiva cair. Manter pares de matrizes de várias idades através da reposição semanal ou mensal. Uma colônia de matrizes de idades variadas produzem um número mais constante de ninhadas.

• Repor matrizes não produtivas. Os seguintes sinais são significativos:

• Não produzem ninhada em 60 dias após acasalamento.

• Não produzem ninhadas 60 dias após a última ninhada.

• Produzem três a quarto ninhadas que não desmamam no tempo correto

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• Reproduzir cedo, quando na idade de 6 a 8 semanas. Jovens produzem melhor ninhadas o que mais velhos;

• Usar machos com experiência. Usar machos mais velhos com fêmeas mais novas;

• Sempre manter dados de acasalamento meticulosos e acurados, e renová-los regularmente. O quanto antes o problema for detectado, o mais rápido será resolvido.

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• Manter a investigação constante sobre:

• Desvios na performance reprodutiva e no fenótipo devem ser investigadosimediatamente.

• Comparar a performance de sua colônia com a descrita por quem lhe forneceu. Se os dados de uma linhagem mutante não são disponíveis, use os dados do background. Dados de diferentes locais podem ser diferentes, mas devem ser os mais próximos possíveis.

• Manter as condições de criação sempre estáveis e favoráveis

• Periodicamente, verificar o genótipo das matrizes com sondas moleculares específicas

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Esquemas de Acasalamento

• Homozygous mutant (-/-) x homozygous mutant (-/-)

when homozygous mutants of both sexes are viable and fertile.

Although all off spring produced are homozygous mutants, breeder genotypes should be verified at least every two generations.

To be maintained on a stable inbred background, mutants should be backcrossed to the parental inbred strain about every 10 generations.

To maintain mutants on mixed or segregating genetic backgrounds choose breeders randomly from within a colony and backcross the off spring to F1 hybrids between the two strains that comprise the mixed background about every 10 generations.

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• Heterozygous mutant (-/+) x homozygous mutant (-/-)

when only one gender of a mutant is a viable and fertile homozygote (the other gender may be infertile or have reduced fertility, embryonic lethal, die in utero, or die before reaching sexual maturity).

Unless they can be recognized by a visible phenotype, all mutant mice must be genotyped or progeny tested

If the mutants are on a mixed genetic background, backcross the off spring to F1 hybrids about every 10 generations (to avoid producing recombinant inbred lines).

If the mutants are on an inbred background, prevent genetic drift by backcrossing them to the appropriate inbred strain every 10 generations.

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• Heterozygous mutant (-/+) x heterozygous mutant (-/+)

when homozygous mutant mice are severely impaired, infertile, embryonic lethal, die in utero, or die before reaching sexual maturity.

If the mutant homozygotes and heterozygotes cannot be visually distinguished, individuals must be genotyped.

If the mutants are inbred, prevent genetic drift by backcrossing them to the appropriate parental inbred strain every 10 generations inbred mouse).

If the mutants are on a mixed genetic background, backcross the off spring to appropriate F1 hybrids about every 10 generations (to avoid producing recombinant inbred lines).

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• Pequenas colônias:

• Mantenha um mínimo de seis pares de matrizes representandodiferentes gerações

• Mantenha duas gerações de cada linhagem, e não elimine umaenquanto a outra está produzindo (então três gerações podemestar presents por um determinado tempo)

• Tente manter a idade de suas matrizes entre dois e oito meses –mais velhos do que isso possuem menor capacidade reprodutiva

• Monitore a performance reprodutiva de forma constante: se a mesma reduz, tome atitudes rápidas

• A cada 10 gerações, faça um backcross com F1 para prevenirdivergências

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Custos

• Necessidade de 20 camundongos / semana (1040 animais)

• Pode requerer ao menos 30 matrizes fêmeas dentrodo períodode um ano

• Custo / gaiola - . ~ R$150/ano – incluindo custos de técnicos, gaiolas, lavagem de gaiolas, alimentação, outros insumos, mas não genotipagem

• Total - 30 gaiolas x R$150/gaiola = R$4500/ano = R$4,40/camudongo

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Custos

• Reduzindo custos:

• A chave para reduzir o cutso e manutenção de uma colônia é maximizar o uso de cada camundongo de sua colônia.

• Quando possível, observe os seguintes pontos:

• • Fornecer animais de ambos os sexos.

• • Fornecer animais de todas as idades

• • Fornecer animais semanalmente, ou use uma faixa de idade (4 a 8 semanas), mensalmente.

• • Repor matrizes por idade sempre em um esquema rígido.

• • Repor matrizes não produtivas em esquema rígido.

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Ratos• Origem

• Origem e disseminação –semelhante ao camundongo

• Rato de laboratório - Rattusnorvegicus e R. rattus

• Henry H. Donaldson - WistarInstitute (EUA)

• Osborne e Medel – estudos nutricionais

• Taxonomia: Mammalia, Rodentia, Muridae, Rattus

• 137 espécies• Não possuem glândulas

sudoríparas

• Não possuem vesícula biliar.12:44 19

Características• Nasce desprovido de pêlos, com vibrissas

• Olhos e pavilhão auricular fechados

• Peso ao nascer – 4-6 g

• Pêlos – 3 - 4 dias, coberto em 7 dias

• 10 – 16 dias – olhos abertos e alimentação sólida

• Desmame - 18 – 24 / 35 g a 45 g

• Sexagem - distância ano-genital + bolsa escrotal

• Puberdade - 30 dias / Maturidade sexual - 50 - 60 dias

• Acasalamento – 200 - 250 g (machos) e 150 -180 g (fêmas)

• Reprodução até os 9 meses de idade / 500 -600 g (M) e 300 - 400 g (F)

• Ciclo estral – 4-5 dias

• Gestação - 19 a 22 dias

• 10 dias - aumento de abdômen

• Filhotes/parto = 8 (Wistar), até 16


• Colônia de Fundação

• Colônia de Expansão

• Colônia de Produção

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Esquemas de Criação

• Dois diferentes tipos de esquema de criação podem ser realizados. Em ambos os casos, é necessário um monitoramento constante das gestações e desmame.

• A. Pares monogâmicos

• O estro pós parto ocorre 24h após o parto. Se o macho é deixado na gaiola, a fêmea pode se tornar gestante de novo durante a lactação.

• Macho removido após o nascimento da ninhada - Um casal é colocado por gaiola. Os machos não são separados durante a gestação e parto. Geralmente o macho é removido após a primeira troca de cama após o parto. Gestação de três semanas, desmame após três semanas.

• Macho removido antes do nascimento – após o diagnóstico de gestação.

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• Harem mating

• Um macho e duas fêmeas por gaiola.

• A fêmea é retirada após diagnóstico de gestação.

• Gestação – três semanas

• Somente uma fêmea com ninhada por gaiola

• Após desmame, a fêmea retorna para a gaiola.

• Sempre após o nascimento, a gaiola é mantida isolada e sem perturbações por ao menos três dias (só reposição de água e ração).

• Casos de sujeira excessiva – retira-se primeiro a fêmea, depois a ninhada toda junta com um pouco da cama suja também, e transferidos para a nova gaiola. Até o movimento dos filhotes em toda a gaiola. 22


• Desmame:

• A grande maioria a 21 dias de idade. Em alguns casos de mutantes, 28 dias.

• Não é permitido que uma ninhada em lactação esteja em uma mesma gaiola do que uma ninhada recém-nascida

• Pares monogâmicos - Sempre aos 21 dias de idade.

• Harem mating – menos urgente, melhor para mutantes. Mas a base de cálculo é 21 dias de idade;

• Uma pequena quantidade de pellets de ração pode ser mantida na cama da gaiola sete dias antes e sete dias depois do desmame.

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• Separação de sexos

• Separação realizada no desmame.

• Se só existe um macho ou fêmea em uma ninhada, esse deve ser mantido junto com a ninhada (nunca um sozinho separado). Uma fêmea pode ser mantida com a mãe, um macho pode ser mantido com machos de outra ninhada de mesma idade.

• Se se trata de casal monogâmico, o filhote macho pode ser mantido com o pai em uma nova gaiola

• O macho pode ser mantido com as fêmeas de uma mesma ninhada até seis semanas de idade.

• Mais de um macho não podem ser mantidos juntos com as fêmeas.

• Recomendação de verificação de sexo após uma semana de nascimento. 24


• Quantos rato por gaiola?

• Ratos são animais sociais. Machos raramente brigam entre si. Devem, sempre que possível, ser mantidos juntos.

• Padrões – Gaiola com 4m2 de área de base.

• Sempre uma fêmea adulta com uma ninhada por gaiola. Nunca misturar ninhadas em lactação

• Oito ratos jovens até 100g de peso por gaiola

• Seis ratos até 200g por gaiola

• Quatro ratos de até 300g por gaiola

• Três ratos de até 400g por gaiola

• Dois ratos de até 500g por gaiola

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Hamsters• Origem

• Relativamente novo como animal de laboratório

• China (7 espécies) / Síria (3 espécies)

• 1919 - susceptibilidade à Leishmania

• Taxonomia

• hamster sírio dourado

• Classe: Mammalia

• Ordem: Rodentia

• Família: Cricetidae

• Gênero: Mesocricetus

• Espécie: Mesocricetus auratus12:44 26

Características• Hamster dourado (Sírio)

• Animal de corpo compacto e cauda muito curta

• Adultos – 15 - 17 cm comprimento, 85 - 120 g

• Pêlo curto e avermelhado no dorso (dourado)

• Ventre completamente cinzento

• Pele é extremamente flácida

• Bolsas laterais (guturais) no interior da boca –estoque de alimentos / grãos

• Não sofre processo digestivo

• Expelido no local onde ficará armazenado

• Tanto os machos quanto as fêmeas são bastante agressivos

• Estômago com duas áreas distintas: pilórica e glandular12:44 27


• Temperatura – mínimo 20°c – evitar hibernação

• Umidade: 45-70%

• Ciclo luz/escuro – 14:10

• Alimentação controlada em quantidade

• Alumínio, plástico ou madeira evitados em gaiolas

• Gaiola – 100cm2 por animal; 650cm2 mínimo / gaiola

• Mínimo 18cm de altura

• Gaiolas especiais com fundo removível

• Animais mais solitários – uma fêmea por gaiola em gestação

• Camas – maravalha de pinho, jornal picado, trocada a cada semana

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• Apesar de maturidade sexual ser alcançada em um mês, é recomendável cruzar com seis semanas (11 p/ chinês)

• Animais extremamente monogâmicos (mas nem sempre as fêmeas aceitam os machos fornecidos)

• Detecção de estro – 4 dias de ciclo, ovulação seguida de descarga vaginal de material viscoso

• Gestação de 16 (sírio) a 21 dias (chinês) – canibalismo frequente

• Fêmeas retiradas para parto

• Desmame – 21 dias

• Ninhadas mantidas juntas até o início de observação de comportamento violento – sexagem e separação

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Dados biológicos

• Ciclo estral – 4 dias

• Gestação - 16 dias

• Fêmeas próximas ao parto não devem ser manuseadas

• Extremamente irritadiças

• Canibalismo

• Filhotes/ninhada – 8, até 16

• Nascem desprovidos de pêlos, com vibrissas

• Olhos e o pavilhão auricular fechados

• Peso nascimento - 3 g

• 3 dias – pelos nascem, cobertos com 7 dias

• Alimentos sólidos – 7 dias

• Reprodução até 1 ano de idade

• Distância ano-genital

• Desmame - 16 dias

• 21 dias – 25 - 30 g

• Puberdade - 28 dias, Maturidade sexual – 42 dias

• Acasalamento – 2 meses (100g)

• Colônias = ratos e camundongos12:44 30

Universidade Federal da BahiaInstituto de Ciências da Saúde

Alguns camundongos mutantes

utilizados

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Beige (LYST BG)

• Lyst - gene regulador de transporte lisossomal(lysosomal trafficking regulator)

• Mutação original – radiação

• Acasalamento se faz entre bg/bg x bg/bg

• Macho e fêmea homozigotos recessivos

• Modelos para o estudo da Síndrome de Chediak-Higashi

• Lisossomos - digestão de organelas celulares envelhecidas e bactérias

• Mutantes – formação de vesículas gigantes e localização errônea de enzimas

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Nude (HFH11 NU)• genes FOX (Hfh11)

• Acasalamento - macho nu/nu x fêmea nu/+

• Fêmeas heterozigotas - ausência de pêlos impede que mantenham os filhotes aquecidos e a produção de leite é muito menor

• Crias - 50% heterozigotos / 50% homozigotos recessivos

• Aproveitamento de machos homozigotos + fêmeas heterozigotas

• Dr. Grist - laboratório de vírus do Ruchill Hospital, Glasgow

• Camundongos homozigotos, falta de pêlos, timo rudimentar / ausente, deficiência de linfócitos T (animais timectomizados naturalmente)

• Animais não rejeitam transplantes de outras linhagens

• Alta susceptibilidade a infecções

• Folículos pilosos normais - excessiva queratinização da pele impede sua erupção

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Hairless (HR)

• Acasalamento - macho hr/hr x fêmea hr/+

• Sem pelos, sem aquecimento de filhotes e leite...

• Mutação original - camundongo capturado em um aviário, Londres

• Homozigotos desenvolvem pelagem normal -pêlos caem aos 10 dias

• Animal pelado, mas sem deficiências imunológicas severas

• Baixa produção de T helper

• Hiperqueratose do epitélio estratificado com desenvolvimento de cistos

Distrofia muscular (LAMA 2 DY)• Acasalamento - machos e fêmeas

heterozigotos: dy/+ x dy/+.

• Produção de laminina

• Glicoproteinas de matriz extracelulares, componentes de membranas basais

• Adesão, migração, proliferação e diferenciação celulares

• Mutação ocorreu no The Jackson Laboratory, espontaneamente, na linhagem 129/Re, em 1951

• Homozigotos - progressiva fraqueza e paralisia, 3 semanas de idade

• Morte aos 6 meses de idade

• Animais são geralmente estéreis

Obesidade (LEP OB)• Acasalamento - machos ob/+ x fêmeas ob/+

(homozigotos estéreis)

• Camundongos mutantes obesos - não possuem leptina

• Gene da leptina - locus da obesidade (Lep OB)

• Mutação natural, no The Jackson Laboratory, em algumas linhagens

• Mutantes – 3 vezes o peso normal, 4 semanas de idade

• Hiperfagia e hiperglicemia semelhante ao diabetes, intolerância à glicose, elevados níveis de insulina plasmática, subfertilidade

• Camundogos obesos normais – aumento do numero de adipócitos

• Camundongos mutantes - aumento do número de adipócitos e aumento das células adiposas

Diabetes (LEPR DB)

• Acasalamento - macho db/+ x fêmea db/+

• Homozigotos são estéreis

• Leptina - hormônio controlador do peso / obesidade

• Diabetes no camundongo - Gene do receptor da leptina (leptin receptor)

• Mutação original espontânea na linhagem C57BLK6

• Camundongos homozigotos – obesidade 3 a 4 semanas de idade

• Elevação da insulina plasmática - 10 - 14 dias

• Elevação da glicose - 4 semanas

• background C57BL/KS - aumento na glicose, destruição das células pancreática (morte 10 meses)

• background C57BL/6 - hiperplasia compensatória pancreática e contínua hiperinsulinemia (morte 20 meses)

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SCID (PRKDC SCID)

• severe combined immunodeficiency

• Acasalamento – machos scid/scid x fêmeas scid/scid

• Proteína-quinases ativadas por DNA

• Reparação do DNA defeituosa

• Processo de recombinação VDJ inadequado

• Ausência de células T e B funcionais

• Homozigotos – baixos / ausentes níveis de IgA, IgM ou IgG

• Pouco desenvolvimento de órgãos linfóides

• Não rejeitam transplantes

• Transplante de medula restaura a capacidade linfóide12:44 38

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