IMUNOEXPRESSÃO DO c-KIT EM OSTEOSSARCOMAS … · CLÍNICOS E TESTES IN VITRO Tese apresentada à...

LUCIANA NAKAO ODASHIRO MIIJI

IMUNOEXPRESSÃO DO c-KIT EM OSTEOSSARCOMAS HUMANOS: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS ANÁTOMO-PATOLÓGICOS,

CLÍNICOS E TESTES IN VITRO

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutorado em Ciências.

São Paulo

2009

LUCIANA NAKAO ODASHIRO MIIJI

IMUNOEXPRESSÃO DO c-KIT EM OSTEOSSARCOMAS HUMANOS: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS ANÁTOMO-PATOLÓGICOS,

CLÍNICOS E TESTES IN VITRO

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutorado em Ciências. Orientadora: Profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves

São Paulo

2009

Miiji, Luciana Nakao Odashiro Imunoexpressão do c-kit em Osteossarcomas Humanos: Correlação com parâmetros anátomo-patológicos, clínicos e testes in vitro. / Luciana Nakao Odashiro Miiji. – São Paulo, 2009.

Tese (Doutorado). Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Patologia.

Immunoexpression of ckit in Human Osteosarcomas: clinicopathologic analysis and in vitro assays

1. Osteossarcoma. 2. cKit. 3.Testes in vitro 4.Prognóstico.

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

Chefe do Departamento:

Profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves

Coordenadora do Curso de Pós-Graduação:

Profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara

iv

A Deus, pois sem Ele nada é possível.

A minha filha Ester e a minha avó Tomi, com muito carinho.

v

AGRADECIMENTOS

À profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves, minha amiga, orientadora e

professora, a quem tenho profunda admiração como pessoa e a quem sou

eternamente grata não apenas pelos ensinamentos como patologista, mas também,

por sempre ter me apoiado em todos os momentos que precisei, tanto na minha vida

profissional quanto pessoal.

Ao meu irmão Alexandre Nakao Odashiro, também patologista, que sempre

me incentivou na área da pesquisa e pela sua valiosa ajuda, tanto científica quanto

profissional, na realização desse trabalho.

Aos meus pais, pela compreensão.

Ao prof. Dr. Antônio Sérgio Petrilli, chefe do Setor de Oncologia do

Departamento de Pediatria da UNIFESP-EPM e Diretor Geral do Instituto de

Oncologia Pediátrica, pela sua dedicação e supervisão dos estudos realizados na

Oncologia Pediátrica.

Ao prof. Dr. Miguel Burnier Jr, pela colaboração e ajuda na realização dos

ensaios in vitro desse estudo, realizado na Universidade de McGill, Montreal,

Canadá.

À profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara, coordenadora do curso de Pós-

graduação em Patologia da UNIFESP/EPM, pelo seu apoio científico.

A Leonor Cristina Manoja Roman, amiga, bióloga e técnica de imuno-

histoquímica, pela companhia, pelo apoio e pela rapidez e destreza na realização

das reações.

Ao Sebastian di Cesare, aluno da Universidade McGill, Montreal, Canadá,

pela boa vontade e rapidez na realização dos ensaios in vitro.

vi

Às funcionárias do setor de imuno-histoquímica do departamento de

Patologia da UNIFESP/EPM, pela hospitalidade e bom humor.

Aos funcionários do departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, em

especial a Denise, Lobo, Serginho e Ivete, pela disposição em ajudar, sempre que

foi necessário.

Aos funcionários da pós graduação da Patologia da UNIFESP/EPM, em

especial a Virgínia e Jennifer, pela ajuda e compreensão.

vii

RESUMO

Objetivo: Investigar a imuno-expressão do c-kit e sua correlação com o prognóstico em pacientes portadores de Osteossarcoma e o efeito do Mesilato de Imatinibe (STI571) na proliferação e invasão de linhagens de células humanas de osteossarcoma. Material e Método Estudo retrospectivo com realização de imuno-histoquímica dos blocos de parafina de 52 pacientes com osteossarcoma de extremidades de alto grau, tratados no Instituto de Oncologia Pediátrica e diagnosticados no Departamento de Patologia da UNIFESP. Somente espécimes pré-quimioterapia foram analisados. Imunoexpressão forte e citoplasmática foram considerados como positivos. A linhagem cellular MG 63 foi incubada e o efeito inibitório do STI571 na proliferação e invasão dessas células tumorais in vitro foi estudada. Resultados: 24 casos (46,15%) expressaram o c-kit, sendo que esses tumores positivos tiveram pior resposta à qumioterapia pré-operatória. Não foi encontrada correlação entre os casos c-kit positivos e sobrevida global e livre de doença. STI571 inibiu a proliferação de células de osteossarcoma in vitro, em baixas doses e a invasão dessas células, em altas doses. Conclusões: Osteossarcomas expressam c-kit e esses tumores c-kit positivos são maus respondedores (têm menos necrose) à quimioterapia pré-operatória. O Mesilato de Imatinibe inibe a proliferação de células de osteossarcomas que expressam o c-kit, mas não inibem a invasão. Esses achados permitem sugerir que o STI571 pode ser uma nova estratégia no tratamento dos pacientes portadores de osteossarcomas

viii

ABSTRACT

Purpose: To investigate the immunoexpression and its prognostic relevance of KIT in patients with osteosarcomas and the effect of Imatinib mesylate (STI571) on proliferation and invasion of human cell osteosarcoma line. Material and Methods: A retrospective immunohistochemical study was performed on archival formalin fixed paraffin-embedded tissue obtained from Department of Pathology of Federal University of São Paulo of 52 high-grade patients with primary osteosarcomas of extremities treated at the Instituto de Oncologia Pediátrica. Only pre-chemotherapy specimens were analysed. Strong cytoplasmic and membranous staining cases were taken as positive. The human cell line MG 63 was incubated and inhibitory effect of STI571 on cell proliferation and invasion was studied. Results: Twenty four cases (46,15%) expressed c-kit and tumours ckit positive had lower necrosis pos chemotherapy. No correlation was found between ckit expression and overall and disease free survival. STI571 inhibited the rates of cell growth of osteosaroma cells in low doses and invasion in high doses Conclusions: Tumours c-kit positives had worse response to chemotherapy and STI571 plays a role in blocking or slowing the rate of growth of osteosarcoma cells expressing ckit, but not the invasive capacity of these neoplastic cells. These data suggested that Imatinib Mesylate could be a therapeutic target of strategies against Osteosarcoma that express c-kit.

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Distribuição dos pacientes com osteossarcoma,

de acordo com o sexo .........................................................................35


de acordo com a faixa etária ...............................................................35


de acordo com a localização óssea ...................................................35


de acordo com o tamanho do tumor ....................................................36


de acordo com o tipo de procedimento cirúrgico .................................36


de acordo com o tempo de seguimento em meses .............................36


segundo o seguimento clínico .............................................................37

Tabela 8 - Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo

com a presença de metástase ao diagnóstico. ...................................37

Tabela 9 - Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo

com o grau de necrose pós quimioterapia, segundo Huvos ................37


segundo o subtipo histológico .............................................................38

Tabela 11 - Análise de aspectos clínicos e histológicos e a presença

ou não de metástase ao diagnóstico ...................................................39

x


segundo a expressão do ckit ..............................................................44

Tabela 13 - Correlação da imunoexpressão do ckit

com o tipo de cirurgia .........................................................................46


com o subtipo histológico ..................................................................47


com o grau de resposta à quimioterapia ..........................................47


com o tamanho do tumor .................................................................47

Tabela 17 - Correlação da imunoexpressão do ckit com o

desenvolvimento de metástase durante o seguimento ..................48

Tabela 18 - Resultado do ensaio de invasão celular ........................................50

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Estrutura do receptor c-Kit ...................................................................16

Figura 2 - Tumores negativos para o receptor c-Kit pelo método da imuno-

histoquímica (Went et al, 2004). ..........................................................21

Figura 3 - Tumores positivos para o receptor c-Kit pelo método da imuno-

histoquímica (Went et al, 2004) ...........................................................22

Figura 4 - Curva de Sobrevida Global para o total de pacientes .........................41

Figura 5 - Curva de Sobrevida livre de Doença para o total de pacientes ...........41

Figura 6 - Curva de sobrevida global em relação à presença ou não de

metástase ao diagnóstico ....................................................................42

Figura 7 - Curva de sobrevida livre de eventos em relação à presença

ou não de metástase ao diagnóstico ..................................................43

Figura 8 - Curva de sobrevida global em relação à resposta

pós quimioterapia (Respondedores (graus I e II) e

não respondedores (graus III e IV) ......................................................44

Figura 9 - Curva de Sobrevida global de pacientes com tumores de

extremidades, sem metástases ao diagnóstico, comparando

com a imunoexpressão do ckit ...........................................................45

Figura 10 - Curva de Sobrevida livre de eventos, de pacientes com tumores de

extremidades, sem metástases ao diagnóstico, comparando com a

imunoexpressão do ckit ......................................................................46

Figura 11 - Demonstração gráfica dos ensaios de proliferação celular após o uso

do Mesilato de Imatinibe .....................................................................48

xii

Figura 12 - Ensaios de proliferação da linhagem celular MG 63 (24h), com

diferentes dosagens (1000uM - 0.001uM) do Mesilato de Imatinibe...49

Figura 13 - Demonstração gráfica do ensaio de invasão celular,

com e sem Mesilato de Imatinibe ...................................................... ..50

xiii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................1

1.1 Objetivos ..............................................................................................................6

2 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................7

2.1 Osteossarcomas ...................................................................................................7

2.2 c-Kit ....................................................................................................................13

2.2.1 Histórico ..........................................................................................................13

2.2.2 Receptor c-Kit: estrutura ..................................................................................15

2.2.3. Receptor c-Kit: mecanismo de ação ...............................................................16

2.2.4 Receptor c-Kit: regulação da expressão ..........................................................17

2.2.5 c-Kit ligante e c-Kit receptor nas células tronco: sobrevida celular,

proliferação e diferenciação .....................................................................................17

2.2.6 c-Kit ligante e c-Kit receptor: papel na adesão e migração .............................18

2.2.7 Expressão do receptor c-Kit e c-Kit ligante em tecidos normais ......................19

2.2.8 Expressão de receptor c-Kit e c-Kit ligante em tecidos neoplásicos ................20

2.3 Receptor c-Kit e osteossarcoma ........................................................................23

2.4 Mesilato de imatinibe (MI) ..................................................................................25

2.4.1 Estrutura química e farmacocinética ...............................................................26

2.5 Cultura celular, ensaios de proliferação, ensaios de invasão e mesilato de

imatinibe ...................................................................................................................26

3 MATERIAL E MÉTODO ........................................................................................28

3.1 Casuística ...........................................................................................................28

3.2 Aspectos clínicos ................................................................................................28

3.3. Anatomia patológica ..........................................................................................28

3.3.1 Estudo imuno-histoquímico .............................................................................28

3.4 Cultura celular ....................................................................................................30

3.4.1 Ensaio de invasão in vitro ................................................................................31

3.4.2 Ensaio de proliferação in vitro .........................................................................32

3.5 Análise estatística ...............................................................................................33

3.5.1 Aspectos clínicos e histológicos ......................................................................33

3.5.2 Imuno-histoquímica .........................................................................................34

3.5.3 Ensaios de proliferação e de invasão ..............................................................34

xiv

3.6 Detalhamento da amostra (Anexo C) .................................................................34

4 RESULTADOS ......................................................................................................39

4.1 Análise de aspectos clínicos e histológicos e a presença ou não de metástase ao

diagnóstico ...............................................................................................................39

4.2 Análise de sobrevivência ....................................................................................41

4.2.1 Análise de sobrevivência, em relação a presença ou não de metástase ao

diagnóstico ...............................................................................................................42

4.2.2 Análise de sobrevivência, em relação à resposta (necrose)

à quimioterapia .........................................................................................................43

4.3 Análise imuno-histoquímica – c-kit .....................................................................44

4.4 Ensaios de proliferação celular ..........................................................................48

4.5 Ensaios de invasão celular .................................................................................49

5 DISCUSSÃO .........................................................................................................51

6 CONCLUSÕES .....................................................................................................57

REFERÊNCIAS ........................................................................................................58

ANEXOS ..................................................................................................................76

1

1 INTRODUÇÃO

O osteossarcoma (OS) é um tumor mesenquimal maligno que apesar de raro

constitui aproximadamente 20% dos tumores malignos ósseos em humanos

(Papagelopoulos et al, 2000), sendo a neoplasia maligna primária óssea, não

hematológica mais comum em crianças e adultos (Ragland et al, 2002). Por ano,

ocorrem nos Estados Unidos e Europa, cerca de 2-3 casos por 1.000.000, sendo

que na faixa etária de 15-19 anos, essa incidência sobe para 8-11 casos por

1.000.000 (Bielack et al, 2008). No Brasil, cerca de 350 casos novos são

diagnosticados a cada ano (Censo Demográfico 2000). Normalmente, a segunda

década de vida é a época que ocorre maior crescimento ósseo, apontando uma forte

relação entre o estirão de crescimento e o desenvolvimento da neoplasia (Parkin,

1993). Esses tumores tipicamente crescem em regiões metafisárias de ossos

longos, sendo os três sítios mais comuns o fêmur distal, a tíbia proximal e o úmero

proximal (Dahlin, 1978; Clark et al, 2007). A literatura mostra discreta predominância

masculina, podendo ser atribuída ao período de crescimento ósseo mais longo no

sexo masculino (Fraumeni, 1967; Rytting, 2000).

Não se sabe a etiologia dos osteossarcomas e até o momento não há

diagnóstico citogenético ou marcador molecular identificado (Ragland et al, 2002);

acredita-se que sejam várias as alterações genéticas envolvidas na gênese do OS

(Fuchs et al, 2001; Reagland et al, 2002).

Podem ser classificados quanto a localização em ósseos e extra ósseos. Os

tumores ósseos podem ser centrais, quando acometem a medular e periféricos,

quando se localizam na superfície óssea. A Organização Mundiall da Saúde (OMS)

divide os tumores centrais em: convencional ou clássico, telangiectásico, intra-ósseo

bem diferenciado e de pequenas células. Quanto aos periféricos são considerados o

paraosteal, periosteal e o de superfície de alto grau (Schajowicz, 1995).

Radiologicamente ocorre uma combinação de características líticas e

osteoblásticas, imagens diretamente dependentes do grande número de subtipos

histológicos existentes. Com freqüência destroem e permeiam o córtex, invadindo

partes moles, levantando o periósteo e provocando as reações periosteais

classicamente conhecidas como em “raio de sol” e “triângulo de Codman”.

Macroscopicamente, os osteossarcomas localizam-se na região metafisária,

são de coloração e consistência variáveis, dependentes da quantidade de

2

calcificação e do tipo de matriz produzida pelo tumor (Dahlin, 1978). Podem ser

vistas áreas de necrose, assim como pseudocistos e hemorragia. Esses tumores

crescem para diáfise e ou epífise, rompendo a cortical e se estendendo para partes

moles (Murphey et al, 1997; Jesus-Garcia et al, 2000).

O diagnóstico dos osteossarcomas é histopatológico, sendo necessário pela

definição da OMS, a presença de células malignas com formação direta de osso ou

osteóide. A grande maioria dos OS são do tipo convencional ou clássico e estes são

subdivididos em osteoblásticos (50%), condroblásticos (25%) e fibroblásticos (25%)

(Dahlin, Unni, 1977). Há ainda os tumores ricos em células gigantes, os

“osteoblastomas símile”, osteossarcomas fibroma-condromixóide símile (Chow et al,

1996) e os osteossarcomas epitelióides com formação de rosetas (Okada et al,

2001).

O prognóstico dos osteossarcomas melhorou consideravelmente com o

advento da quimioterapia, principalmente após o trabalho de Rosen et al, (1982), no

qual o patologista do grupo, dr. Andrew G. Huvos, observou e classificou os tumores

em 4 diferentes tipos de resposta `a quimioterapia pré-operatória, correlacionando

essa resposta com a sobrevida dos pacientes. Desde então, outros autores (Ayala et

al, 1984; Picci et al, 1985), também fizeram outras classificações, sendo que

atualmente, o grau de resposta à qumioterapia, é o único fator histopatológico que

tem valor prognóstico comprovado, sendo que os pacientes bons respondedores

têm comprovadamente uma sobrevida global e livre de eventos muito maior que os

pacientes maus respondedores.

Com isso, têm se tentado estudar se existem parâmetros que podem predizer

a resposta à quimioterapia. Contudo, talvez, pela raridade desses tumores e pela

etiologia multifatorial dessa neoplasia, até hoje são poucos os parâmetros que

identificam precisamente aqueles pacientes que responderão pouco ao tratamento

quimioterápico e que terão pior evolução.

3

Proto-oncogene c-Kit

Nos útimos anos, vários estudos citogenéticos e moleculares do

osteossarcoma foram relatados com resultados conflitantes (Ragland, 2002), sendo

que vários marcadores biológicos (p53, Ki67, HER-2, dentre outros) já foram

pesquisados por diversas metodologias (imuno-histoquímica, RT-PCR, FISH,

Southern blot dentre outros) (Goto, 1998; Alves, 2008).

Os tumores estromais do trato gastrointestinal (GISTs) são os tumores

mesenquimais mais comuns do trato gastrointestinal. Acredita-se que se originem a

partir das células intersticiais de Cajal ou de células que compartilhem um precursor

comum com elas (Dematteo et al, 2002). Em 1998, Hirota et al publicaram a

presença de mutação do proto-oncogene c-kit na patogênese dos GISTs.

Atualmente, a pesquisa da proteína tirosina-quinase expressa pelos GISTs por

imuno-histoquímica é necessária para o diagnóstico dessa neoplasia, havendo

imunoexpressão em cerca de 90% desses tumores (Fletcher et al, 2002).

A proteína c-Kit é um dos membros da família dos receptores da tirosina-

quinase, situado na membrana celular, que se liga ao fator de crescimento

denominado fator de crescimento de célula tronco (SCF). O SCF também é

conhecido como fator de crescimento de mastócitos, fator Steel (SLF), e ligand c-Kit

(KL) (Heinrich et al, 2002).

Originalmente descrito como se desenvolvendo em células imaturas

hematopoiéticas, o c-Kit é agora conhecido como sendo expresso em um espectro

de células durante o desenvolvimento embrionário e na vida adulta. Estas incluem

células hematopoiéticas, mastócitos, melanócitos e células germinativas primordiais.

A função do c-Kit é essencial para a hematopoiese normal, melanogênese e para o

desenvolvimento e função dos mastócitos em muitos tecidos. O c-Kit, como já

descrito, é também encontrado, de maneira significativa nas células intersticiais de

Cajal (CICs) que funcionam como marcapasso para o trato gastrointestinal e

regulam a peristalse intestinal.

A transdução do sinal do c-Kit inicia-se na superfície celular

subseqüentemente à ligação do c-kit ligante ao receptor. A ligação dessa proteína

induz duas moléculas adjacentes ao c-Kit a dimerizar, autofosforilar e por

conseqüência, tornarem-se ativadas. Quando ativadas, o c-Kit se propaga

sinalizando eventos através das múltiplas vias de transdução de sinal. Como ocorre

4

com a maioria dos receptores tirosina-quinase (RTK) de fatores de crescimento,

foram atribuídas múltiplas funções fisiológicas para a transdução de sinal mediada

pelo c-Kit, incluindo sobrevida, proliferação, diferenciação, adesão celular,

quimiotaxia, secreção e apoptose, dentre outras (Heinrich et al, 2002).

A imuno-histoquímica (IHQ) tem sido empregada para se detectar a proteína

do gene Kit, sendo a atividade quinase do Kit primariamente controlada pela

expressão especifica da sua proteína, havendo uma variedade de anticorpos

comercialmente disponíveis anti-c-Kit/CD117 para se detectar a presença de c-Kit

nas células e tecidos.

Em 2001, a Food and Drug Administration, aprovou o medicamento STI571

ou mesilato de imatinibe (MI), para o tratamento de leucemias mielóides crônicas

(LMC). Nessas leucemias, a presença do cromossomo Philadelphia, induz a

formação de uma proteína fusionada, BCR-ABL, que é uma tirosina quinase com

função anormal, descontrolada, estando a mesma envolvida na patogênese dessa

neoplasia. Essa droga bloqueia a tirosina- quinase, inibindo a proliferação celular e

induzindo apoptose nas células BCR-ABL positivas (Tosoni et al, 2004). Com esse

mesmo pensamento de mutação do Kit como ponto crítico na patogênese desses

tumores, se propôs que o Imatinibe não era só inibidor da tirosina-quinase anormal

BCR-ABL, mas também poderia bloquear o receptor tirosina-quinase KIT e PDGFR.

Essa droga é, portanto antagonista competitivo para o sítio de ligação ATP,

bloqueando, desta forma, a habilidade do receptor c-Kit de transferir grupos fosfatos

da ATP para os resíduos de tirosina nos substratos das proteínas, interrompendo

então o sinal de transdução mediado pelo c-Kit, sendo usado atualmente com

sucesso, nos casos de GISTs irressecáveis e/ou metastáticos (Connolly et al, 2003).

A expressão de c-Kit (CD117) não é exclusiva ao GIST e está sendo

documentada através de critérios imuno-histoquímicos em uma variedade de outros

tumores sólidos, representando fenótipos transformados de seus correlativos

celulares normais, c-Kit-positivos. Os exemplos incluem melanoma, seminoma,

câncer de mama e alguns casos de leucemia mielóide aguda (Broudy et al, 1992;

Went et al, 2004). O papel do c-Kit não foi definido na patogênese destas

neoplasias. Em outros tumores c-Kit-positivos, as células neoplásicas expressam o

receptor, mas é desconhecido um c-Kit-positivo correspondente ao seu correlato

celular normal. A expressão do c-Kit neste grupo de doenças é considerado anormal,

não sendo conhecida sua causa. Os exemplos incluem sarcoma sinovial,

5

histiocitoma maligno e sarcoma de Ewing como também schwannoma,

neuroblastoma, carcinoma de pequenas células pulmonar, dentre outros. A

expressão de c-Kit atribui a estes tumores a característica de alvos potenciais do

Glivec®. Não é somente a expressão, mas a ativação constitutiva que é crucial.

Smithey et al (2002) foram os primeiros a pesquisarem a imunoexpressão do

c-kit em osteossarcomas. Em 18 casos, encontraram positividade focal/leve em 13

(61%) e moderada a forte em 7 casos (39%). Sugeriram que a positividade nesses 7

casos tinha padrão semelhante aos vistos nos GISTs e que o c-kit pode contribuir na

tumorigênese dessa neoplasia. Em 2005, Entz-Werle et al, pesquisaram essa

proteína em 56 pacientes pediátricos com osteossarcomas de alto grau, encontrando

positividade citoplasmática em 32 biópsias (57%). Utilizaram um valor de 10% de

células coradas para considerar o caso positivo. Esses autores encontraram

tendência dos casos positivos a apresentarem pior sobrevida.

Já em 2007, Sulzbacher et al estudaram 100 pacientes portadores dessa

neoplasia, entre adultos e crianças, e encontraram 20 biópsias (20%) com

imunoexpressão da proteína. Nesses casos positivos pesquisaram a mutação dos

éxons 9 e 11 do gene c-kit por PCR, e não encontraram alterações no DNA. Quando

correlacionaram a imunoexpressão do c-kit com parâmetros clínicos e histológicos,

não encontraram correlação com necrose pós quimioterapia, sobrevida global e livre

de doença e concluíram que o c-kit não prediz a evolução dos pacientes com

osteossarcomas.

Em 2008, Weih et al estudaram a imunoexpressão do ckit em 40 pacientes

portadores de osteossarcomas, e encontraram positividade em 25 deles (62,5%).

Esses autores encontraram significativa correlação dos casos fortemente positivos

para o ckit com recorrência local e pior sobrevida.

A importância em identificar fatores prognósticos de pacientes com OS no

momento do diagnóstico é consenso mundial, visto que esses pacientes poderiam

se beneficiar de tratamentos mais eficazes e talvez, menos agressivos, com melhora

na sobrevida e qualidade de vida.

Pelos resultados divergentes na literatura atual da expressão do ckit em

osteossarcomas, pareceu-nos importante estudar nos nossos pacientes a imuno-

expressão dessa proteína, na tentativa de correlacionar sua expressão com fatores

prognósticos em pacientes portadores dessa neoplasia.

6

Sabe-se ainda, que é através das linhagens celulares que se inicia a grande

maioria dos estudos na procura de potenciais agentes no combate ao câncer. Em

osteossarcomas, existe apenas um estudo com linhagem celular de osteossarcomas

e o Mesilato de Imatinibe (MI). Yoshitani et al (2003), estudaram em cultura de

células de osteossarcoma de rato e fibrohisitocitoma maligno de rato, a capacidade

de inibição do Gleevec in vitro. Encontraram que essa droga inibe o crescimento das

células de osteossarcoma e fibrohistiocitoma maligno in vitro, porém, em dosagens

bem maiores daquela utilizada no tratamento da Leucemia Mileóide Crônica. Esses

autores concluem que o Gleevec poderia ser uma nova estratégia na terapêutica do

Fibrohistiocitoma Maligno e Osteossarcomas, e que estudos in vivo deveriam ser

feitos. Na tentativa de verificar se o MI poderia realmente ser uma nova arma

terapêutica para pacientes portadores de osteossarcomas, resolvemos estudar

também a capacidade do MI de inibir, não só a proliferação como a capacidade de

invasão de células do osteossarcoma in vitro, utilizando linhagem celular de

osteossarcomas humanos (MG 63). Até o momento, na literatura atual, não

encontramos nenhum trabalho usando linhagem celular de osteossarcomas

humanos, nem avaliando a capacidade de invasão dessas células tumorais.

1.1 Objetivos

1. Caracterizar a imunoexpressão do c-kit em espécimes de pacientes

portadores de osteossarcomas tratados no Instituto de Oncologia Pediátrica

(IOP), segundo o Protocolo Brasileiro Osteossarcoma 2000.

2. Correlacionar a imunoexpressão do ckit com subtipo histológico, graus de

necrose pós quimioterapia, tamanho do tumor, sobrevida global e recaída da

doença.

3. Avaliar o efeito do Mesilato de Imatinibe na proliferação das células de

osteossarcomas, através de ensaios de proliferação celular.

4. Avaliar o efeito do Mesilato de Imatinibe na capacidade de invasão das

células do osteossarcoma, através de ensaios de invasão.

7

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Osteossarcomas

Os osteossarcomas são os tumores sólidos ósseos mais comuns,

compreendendo 20% dos sarcomas ósseos (TA et al, 2009). Na América, são

registrados anualmente, cerca de 400 novos pacientes a cada ano (Marina et al,

2004). É juntamente com o sarcoma de Ewing, o tumor ósseo maligno mais comum

da infância e adolescência (Dorfman, Czerniak, 1995).

Dorfman, Czerniak (1995) estudaram aproximadamente 2627 casos de

sarcomas ósseos num período de 24 anos, e encontraram em todas as faixas etárias

o osteossarcoma como tumor mais freqüente (922 casos - 35,1%), seguido do

condrossarcoma (677 casos - 25,8%) e sarcoma de Ewing (420 casos - 16%). Houve

predomínio dos OS na segunda década e um pico menor após a quinta década. A

raça branca teve incidência um pouco maior que a negra, assim como os homens

também foram um pouco mais atingidos, porém esses achados não apresentaram

valor estatístico. Histologicamente, os osteossarcomas osteoblásticos contribuíram

com 78,3% dos casos, seguidos dos condroblásticos (4,2%) e fibroblásticos (3,9%).

Antes do advento da quimioterapia, os pacientes portadores de

osteossarcomas tinham como única opção terapêutica a amputação, com sobrevida

global de 05 anos variando de 10 a 15% (Campanacci et al, 1981). Em 1972,

Friedman, Carter relataram a eficácia de vários agentes quimioterápicos no controle

local e sistêmico da doença.

Em 1977, Huvos et al estudaram as alterações histopatológicas da

quimioterapia pré-operatória em 20 pacientes com osteossarcomas. Em 18

pacientes, conseguiram mensurar o tumor pré e pós quimioterapia, observando que

em 17 (94%) houve redução significativa do tamanho do tumor. Eles mapearam o

tumor nas ressecções cirúrgicas, e viram que o efeito da terapia não era

uniformemente distribuído, sendo que campos microscópicos totalmente necróticos

alternavam com campos com células 100% viáveis. Esse padrão não uniforme,

também era visto na porção extra-óssea. Concluíram na época que o tratamento

quimioterápico apesar de causar uma grande destruição de células, não poderia ser

usado sem o tratamento cirúrgico, visto que muito tumor viável ainda existia entre as

células necróticas. Enfatizaram também que o estudo apenas da biópsia do tumor ou

8

da metástase, não é suficiente para dizer se o tumor respondeu ou não à

quimioterapia, visto que a distribuição da necrose não era uniforme. Mostraram

ainda que o tratamento quimioterápico é de grande importância para destruir tumor

microscópico que eventualmente tenha ficado após a ressecção cirúrgica,

diminuindo então, a possibilidade de recidiva da neoplasia.

Mas foi o artigo publicado em 1982 por Rosen et al juntamente com o dr.

Huvos, patologista do grupo, que revolucionou a avaliação prognóstica dos

pacientes com osteossarcoma. O grupo estudou, após o uso de poliquimioterapia

pré-operatória com metotrexate em altas doses, adriamicina, ciclofosfamida e a

combinação bleomicina, ciclofosfamida, dactinomicina e cisplatina a eficácia do

esquema quimioterápico pré-cirúrgico em osteossarcomas, através do estudo da

necrose na peça cirúrgica. Nesse artigo, dr. Huvos fez a classificação dos graus de

necrose pós quimioterapia, que é utilizada até hoje pela grande maioria dos

patologistas do mundo: Grau I - pouco ou nenhum efeito da quimioterapia; Grau II-

resposta parcial com mais do que 50% de necrose tumoral atribuída a quimioterapia,

entretanto muitos cortes histológicos demonstram áreas de tumor viável; Grau III –

Mais do que 90% de necrose tumoral atribuída a quimioterapia, entretanto, focos de

tumor viáveis eram observados; Grau IV – nenhuma célula tumoral viável era

observada aos cortes histológicos. Os bons respondedores eram os que tinham

maior grau de necrose, ou seja, graus III e IV e permaneciam com o mesmo

esquema quimioterápico; os maus respondedores (graus I e II) recebiam tratamento

mais agressivo. Com isso, o exame histopatológico passou a ter grande relevância,

predizendo sobrevida livre de doença e determinando quais pacientes deveriam

receber tratamento mais agressivo após a cirurgia. Até o momento, o grau de

necrose pós quimioterapia é o único parâmetro histológico comprovado que tem

correlação significativa com o prognóstico dos pacientes portadores de

osteossarcomas.

Em 1983, Salzer-Kunitschik et al estudaram 50 pacientes com osteossarcoma

e classificaram o grau de necrose pós quimioterapia em 6 graus: grau 1 – sem tumor

viável; grau 2 – células tumorais viáveis solitárias ou uma ilha de células tumorais

viáveis menor que 5cm; grau 3 – menos que 10% de tumor viável; grau 4 – 10 a 50%

de tumor viável; grau 5 – mais que 50% de tumor viável e grau 6 – sem efeito

quimioterápico. Encontraram correlação significativa entre o grau de resposta à

9

quimioterapia e a progressão tumoral. Encontraram também que tumores menores

que 10 cm respondiam melhor à quimioterapia que tumores maiores que 10 cm.

Ayala et al (1984) estudaram em 24 crianças com idade abaixo de 15 anos,

espécimes de osteossarcomas de pacientes que receberam infusão intra-arterial de

cisplatina antes do procedimento cirúrgico. Dessas 24 crianças, 23 tinham tumor de

extremidades e 1 era de região pubiana. O espécime cirúrgico foi dividido em tipos

de resposta ao tratamento quimioterápico: Grau I: nenhum efeito ou efeito duvidoso

– A: Nenhum efeito- necrose menor que 30%; B: efeito duvidoso - necrose em 40%,

podendo haver mínima evidência de regeneração fibrovascular. Grau II: Efeito

tumoral parcial - A: 40 a 50% de destruição tumoral, com evidência de regeneração

fibrovascular definida; B: 50 a 60% de destruição tumoral, com regeneração

fibrovascular. Grau III: Efeito tumoral definitivo - A: 60 a 90% de destruição tumoral,

podendo haver focos de tumor viável com franca evidência de regeneração

fibrovascular; B: Efeito tumoral completo com predominância da regeneração

fibrovascular e nenhuma ou mínima quantidade de tumor viável. Da mesma forma

que Rosen et al (1982), esses autores atribuíram que pacientes que tiveram má

resposta à quimioterapia pré-operatória, se beneficiaram de tratamento

quimioterápico mais agressivo no pós- operatório.

Picci et al (1985) avaliaram o grau de necrose pós-quimioterapia em 50

pacientes portadores de osteossarcoma. O grau de resposta foi assim considerado:

boa- necrose difusa, maior que 80%; moderada - 50 a 80% de necrose; ruim -

menos do que 50% de necrose. Essa subdivisão baseou-se na probabilidade de se

encontrar 50% de necrose espontânea em tumores virgens de tratamento. Um

achado importante desse estudo foi presença, em 50% das peças avaliadas, de

hemorragia do canal medular suficiente para alterar avaliação das margens tumorais

pela tomografia computadorizada. Para os autores, a existência destas áreas de

tumor viável nas proximidades das margens cirúrgicas confirma a necessidade de

uma cirurgia ampla.

Apesar do agressivo tratamento cirúrgico e quimioterápico atualmente usado

nos pacientes portadores de osteossarcomas, indivíduos com lesões pélvicas e

axiais ou com evidência de metástases clínicas, tem uma sobrevida de apenas 20 a

30% em 5 anos. Já nos tumores de extremidades, não metastáticos ao diagnóstico,

a sobrevida elevou consideravelmente variando de 50 a 70% em 5 anos (Meyers,

1992; Bacci, 2000). Ainda assim, observa-se que a agressividade desse tumor é alta

10

(30 a 40% de mortalidade pela doença) e inúmeros trabalhos têm sido relatados na

literatura tentando identificar fatores que poderiam estar associados à pouca

resposta aos tratamentos atuais.

Petrilli et al (1991a) estudaram de janeiro de 1982 a dezembro de 1986, 92

pacientes com OS não metastáticos, estádio IIB. O tratamento quimioterápico

constitui-se de cisplatina intra-arterial em altas doses, seguido de cirurgia

(amputação em 62,6% dos casos e ressecção com colocação de endoprótese em

38,4% dos casos), e quimioterapia (QT) pós operatória com adriamicina e cisplatina

alternadamente. A idade média dos pacientes foi de 13,9 anos, variando de 4 a 28

anos. Pacientes do sexo masculino tiveram incidência um pouco maior (49 casos

contra 43 do sexo feminino). Para avaliação prognóstica, os pacientes foram

discriminados pela idade (maior ou menor que 16 anos) sexo, tamanho do tumor (>

ou < que 15cm), tipo de cirurgia, número de ciclos pré-operatórios de QT, grau de

necrose segundo Huvos e localização do tumor. A análise uni e multivariada mostrou

que o sexo masculino, má resposta à quimioterapia, tumores grandes (>15cm) e

subtipo histológico não osteoblástico tiveram maior probabilidade de recorrência,

enquanto o sexo masculino e tumores grandes foram fatores preditivos para o óbito.

Petrilli et al (1991b) encontraram, com o mesmo material acima citado, uma

significante associação entre o tamanho tumoral (maior ou igual a 15cm) e a menor

sobrevida livre do tumor. Esse fato foi de grande relevância visto que na maioria dos

seus casos, esses tumores eram grandes, apontando a necessidade de tratamento

quimioterápico mais agressivo.

Quintana et al (1991) estudaram entre janeiro de 1983 e agosto de 1987, 29

pacientes com osteossarcomas de alto grau, não metastáticos ao diagnóstico,

tratados com cisplatina intra-arterial pré-operatória. O grau de necrose pós

quimioterapia foi realizado de acordo com a classificação de Ayala (1984). Em 17

pacientes (58,6%), houve boa resposta à quimioterapia, com sobrevida livre de

eventos em 6 anos variando de 58,65% a 70,5%, superior aos maus respondedores,

que apresentaram um sobrevida livre de eventos de 41,6%. A medida do tumor foi

estimada pelo Rx, em cm2, multiplicando-se os 2 maiores diâmetros. Tumores

menores que 100cm2 foram considerados pequenos. Os tumores considerados

pequenos tiveram 75% de boa resposta à quimioterapia, e isso foi estatisticamente

significativo, quando comparados aos tumores considerados grandes, onde apenas

11

25% dos tumores foram bons respondedores. Além disso, tumores menores tiveram

uma sobrevida livre de eventos bem maior (73,6%) que os tumores grandes (33,3%)

Em 1994, Davis et al realizaram uma revisão da literatura de artigos

publicados no período de janeiro de 1973 e março de 1992. Selecionaram 8 artigos

publicados em revistas de alto impacto na literatura, e que avaliavam idade, sexo,

localização do tumor, tamanho e necrose tumoral pós quimioterapia. O critério era

que esses estudos englobavam pacientes com osteossarcomas de extremidades, de

alto grau, não metastáticos ao diagnóstico, tratados em uma combinação de

quimioterapia e cirurgia. Encontraram que o tamanho do tumor e a necrose tumoral

pós qumioterapia, em análise univariável, tinham correlação com o prognóstico. No

entanto, apenas a necrose pós qumioterapia se mantinha como valor prognóstico

significativo em análise multivariável.

Bielack et al (2002) estudaram entre 1980 e 1998, 1792 casos de OS de alto

grau, tanto de extremidades quanto de esqueleto axial, sem tratamento prévio. O

tratamento quimioterápico pré e pós-cirurgia foi uniforme de acordo com o protocolo

do grupo cooperativo de estudo do Osteossarcoma (COSS – Alemanha, Áustria e

Suíça), usando altas doses de metotrexate, doxorrubicina, cisplatina, ifosfamida,

bleomicina, ciclofosfamida e dactinomicina, em combinações variáveis. O parâmetro

idade foi dividido em pacientes com mais de 40 anos e menos de 40 anos. O

tamanho do tumor foi analisado só em OS de extremidades e foram considerados

pequenos aqueles menores que 1/3 do tamanho do osso acometido. As outras

variáveis analisadas foram sexo, localização, metástase ao diagnóstico, duração dos

sintomas, tipo de tratamento local (cirúrgico, radioterápico ou sem tratamento), grau

de necrose pós-QT e remissão cirúrgica. O tempo médio de seguimento foi de 3,8

anos. Em análise multivariável, esses autores acharam que mulheres tiveram melhor

resposta (grau de necrose) ao tratamento quimioterápico, porém isso não se

correlacionou a sobrevida. Pacientes com tumores localizados mais próximos ao

esqueleto axial tiveram pior sobrevida assim como aqueles que eram metastáticos

ao diagnóstico e maiores que 1/3 do osso acometido (considerados grandes). Má

resposta à QT e remissão cirúrgica incompleta do tumor também contribuíram para a

queda da curva de sobrevida global e sobrevida livre de doença.

Bacci et al, em 2005 estudaram 881 pacientes com menos de 40 anos de

idade, entre 1983 e 1999, todos com o diagnóstico de osteossarcoma central de alto

grau localizados em extremidades, e sem metástase ao diagnóstico. Todos esses

12

pacientes eram da mesma instituição e foram tratados por 5 diferentes protocolos de

quimioterapia pré e pós operatória, com combinações de metotrexate, cisplatina,

doxorrubicina e ifosfamida. O grau de resposta à quimioterapia foi dividido em bons

respondedores (90% ou mais de necrose) e maus respondedores (menos que 90%

de necrose). Esses autores correlacionaram o grau de necrose pós quimioterapia

com recaída local e sistêmica e com o subtipo histológico. Concluíram que os

pacientes bons respondedores tem sobrevida livre de doença e sobrevida global em

5 anos muito maior que pacientes maus respondedores. Eles acreditam que a

quimioterapia neoadjuvante deve ser agressiva a fim de se obter uma boa resposta

de necrose pós quimioterapia, pois não viram diferença nas curvas de sobrevida,

quando se muda o protocolo pós cirúrgico para pacientes que tiveram má resposta à

quimioterapia neoadjuvante. Esses autores também encontraram pior resposta à

quimioterapia em pacientes com osteossarcomas condroblásticos, estimulando a

classificação histológica na biópsia, a fim de se tentar quimioterapia neoadjuvante

mais agressiva nesses pacientes. A recorrência local não foi influenciada pelo grau

de necrose pós quimioterapia, ao contrário da recorrência sistêmica, que foi

significantemente maior nos pacientes maus respondedores.

Petrilli et al (2006) estudaram em 225 pacientes pediátricos com

osteossarcomas de extremidades, o impacto do tratamento quimioterápico e

cirúrgico e a evolução dos pacientes. Encontraram, assim como na literatura, que a

presença de metástase ao diagnóstico, pouca resposta à quimioterapia e tumores

grandes, se correlacionam com pior prognóstico. A sobrevida global em 5 anos foi de

50,1%. Já nos Estados Unidos e países da Europa, esta sobrevida varia de 50 a

75%. Chamam a atenção, que seus pacientes, em sua maior parte, já chegam com

doença avançada, ou seja, com metástase ao diagnóstico (20,8%) ou com tumores

grandes, maiores que 12cm. Atribuem tal fato à provável biologia desses tumores, já

que não encontraram correlação com o início dos sintomas antes do diagnóstico.

Em 2008, Kim et al estudaram em 331 pacientes com osteossarcomas de alto

grau de extremidades, a correlação do tamanho do tumor com o grau de necrose

pós quimioterapia. Todos os pacientes selecionados tinham idade inferior a 40 anos,

eram não metastáticos ao diagnóstico, se submeteram a tratamento cirúrgico e

quimioterápico na mesma instituição e tinham imagem de ressonância magnética

(RM) antes da realização da biópsia. O tumor foi mensurado pela RM antes e depois

da qumioterapia e foram classificados como tumores grandes e pequenos, de acordo

13

com a classificação da AJCC. Encontraram que tumores grandes respondem menos

à qumioterapia e têm pior sobrevida global.

Com todos esses estudos, vê-se que em osteossarcomas, até o momento, o

único parâmetro histológico nos tumores de alto grau, correlacionado ao prognóstico,

é o grau de necrose pós-quimioterapia.

Nos últimos anos, vários estudos citogenéticos e moleculares do

osteossarcoma foram relatados com resultados conflitantes (Ragland, 2002), sendo

que vários marcadores biológicos (p53, Ki67, HER-2, dentre outros) já foram

pesquisados por diversas metodologias (imuno-histoquímica, RT-PCR, FISH,

Southern blot dentre outros) (Goto, 1998; Miiji, 2006; Alves, 2008), mas não se

encontrou ainda, um marcador prognóstico para pacientes portadores dessa

neoplasia.

2.2 c-Kit

2.2.1 Histórico

Três linhas separadas de investigação levaram ao descobrimento do receptor

c-Kit, do c-Kit ligante e também do gene KIT.

Em meados de 1900, Russel et al descreveram pela primeira vez o locus W

do camundongo (domínio das “manchas brancas”). Os camundongos afetados por

mutação no locus W eram originalmente identificados, como o próprio nome diz, pela

presença de uma mancha branca. Um exame detalhado deste camundongo revelou

que esta mutação era pleiotrópica. O camundongo sofria de defeito no

desenvolvimento das células germinativas (manifestado por dificuldade de

reprodução) e na hematopoiese (caracterizado por anemia macrocítica) (Russell,

1979). O locus W está no cromossomo 5 e é um dos locus mais mutáveis do

camundongo (Lyman, Jacobsen, 1998). Várias mutações foram identificadas em

cada um destes locus e elas estão associadas com efeitos fenotípicos, desde

mortalidade neonatal até anemia leve. Foi observado que a mutação tanto no locus

W quanto em outro locus, o chamado locus Steel (SI), resultava em fenótipos muito

similares, caracterizados por alterações na coloração da pelagem (manchas

brancas), anemia e ausência de mastócitos nos tecidos, sugerindo que os genes

envolvidos eram importantes na hematopoiese e melanogênese (Russell, 1979).

14

Interessantemente, fazendo transplante de medula óssea de um camundongo

Sl podia-se curar a anemia de um camundongo W, porém o inverso não ocorria, o

que indicava que mutações W afetavam células-tronco e/ou progenitoras

hematopoiéticas, enquanto as mutações Sl afetavam a função de células estromais.

Estes achados foram confirmados in vitro em culturas de células hematopoiéticas

dependentes de estroma (Dexter, Moore, 1977), e levaram à hipótese de que Sl e W

codificam um ligante receptor.

Uma questão que permaneceu foi qual o tipo de proteína que o locus W

codificava, e como ela afetava tecidos tão diferentes. Uma resposta veio em 1988

quando foi demonstrado que o locus W codificava um receptor da tirosina quinase

conhecido como receptor c-Kit (Chabot et al, 1988; Geissler et al, 1988). Com essa

nova descoberta, a procura do ligante do receptor c-Kit começou logo em seguida.

Várias tentativas foram feitas, mas o sucesso veio somente com a purificação da

proteína do fator Steel (Lyman, Jacobsen, 1998). O clone de um c-DNA que

codificava o fator Steel foi simultaneamente reportado por 3 grupos diferentes, e

cada um deles deu um nome diferente para esta proteína: Fator da célula Tronco,

Fator de crescimento do Mastócito e c-Kit Ligante (Huang et al, 1990; Martin et al,

1990; Williams et al, 1990). Resumindo, estes 3 nomes correspondem a mesma

proteína que se liga ao receptor c-Kit e é codificada no locus SI do cromossomo 10

(Copeland et al, 1990; Zsebo et al, 1990).

Ao nível de proteína de membrana celular, o receptor c-Kit foi primeiramente

identificado como um marcador celular de superfície das células da Leucemia

Mielóide Aguda (LMA) utilizando-se um anticorpo monoclonal, o YB5.B8 (Gadd,

Ashman, 1985). O anticorpo foi selecionado para o estudo baseado na sua

capacidade de se ligar a células da LMA, mas não aos leucócitos normais do sangue

periférico. Posteriormente, foi demonstrado que o anticorpo identifica uma proteína

de 145-150 kDa expressa por células progenitoras hematopoiéticas normais

(Cambareri et al, 1988), e fortemente expressa em mastócitos nos tecidos humanos

(Mayrhofer et al, 1987). A observação de que um anticorpo monoclonal (YB5.B8)

ligava-se restritamente a uma proteína de superfície de pouca freqüência mas que

estava super-expressada em células da LMA, e que aquele anticorpo apresentava

efeito inibitório em ensaios de colônias de células hematopoiéticas (Cambareri et al,

1988; Ashman et al, 1990), sugeriu que este anticorpo identificava um fator de

crescimento. O mapeamento do receptor c-Kit no locus W (Chabot et al, 1988;

15

Geissler et al, 1988) sugeriu que o anticorpo monoclonal YB5.B8 identificava a

proteína humana c-Kit, e isto foi demonstrado em seguida (Lerner et al, 1991).

Em nível genético, o gene c-Kit foi originalmente identificado como o

oncogene viral (v-kit) responsável pela atividade anormal do vírus do sarcoma felino

Hardy-Zuckerman IV (Besmer et al, 1986). Subseqüentemente, os correspondentes

proto-oncogenes humanos e murinos foram clonados e demonstrou-se que eles

codificavam um receptor da tirosina quinase relacionado ao receptor do fator de

crescimento derivado das plaquetas (RFCDP) e ao receptor do fator estimulador de

colônias de macrófagos (Yarden et al, 1987; Qiu et al, 1988). O mapeamento do

receptor c-Kit no locus W em camundongos e a identificação do receptor c-Kit

humano como um alvo do anticorpo monoclonal YB5.B8, reuniu um montante de

informações sobre a expressão e função deste receptor na hematopoiese normal e

na leucemia. Em humanos, o gene c-Kit fica no cromossomo 4 (4q11-q12) (Sattler,

Salgia, 2004).

Em 1990 vários grupos clonaram o c-DNA que codifica o c-Kit ligante

utilizando características baseadas nas propriedades do camundongo mutante Sl

(Witte, 1990). Desde então uma vasta literatura sobre o receptor c-Kit e c-Kit ligante

tem sido acumulada, e várias revisões têm sido publicadas (Galli et al, 1994; Broudy,

1997; Lyman, Jacobsen, 1998).

2.2.2 Receptor c-Kit: estrutura

O receptor c-Kit é uma glicoproteína transmembrana (Yarden et al, 1987) de

145.000 dáltons, também chamado de CD117. É composto por 976 aminoácidos em

comprimento, e possui 9 sítios potenciais para glicosilação N-ligante no seu domínio

extracelular (QIU et al, 1988), sendo glicosilado em um ou mais destes sítios

(Majumder et al, 1988).

O receptor c-Kit é categorizado como receptor de membrana tipo III, membro

da família dos receptores da tirosina quinase (Ullrich, Schlessinger, 1990). Também

fazem parte desta família de receptores de citoquinas o receptor do fator estimulador

de colônias de macrófagos (Coussens et al, 1986; Woolford et al, 1988), o receptor

do fator de crescimento derivado das plaquetas (RFCDP) (Matsui et al, 1989) e o

receptor flk-2/flt3 (Small et al, 1994). Todos estes receptores possuem a mesma

estrutura geral. A estrutura destes receptores inclui um domínio extra-celular (figura

16

1) com 5 domínios imunoglobulina-símile, 1 único pequeno domínio

transmembranoso, e um domínio citoplasmático com atividade da tirosina quinase. O

domínio citoplasmático, também chamado de catalítico, é dividido por uma área

reservada para a inserção de um aminoácido quinase. Ela divide este domínio em

duas regiões, a primeira contém regiões para ligação do ATP, e a segunda possui

vários sítios para autofosforilação (Lemmon et al, 1997).

Figura 1 - Estrutura do receptor c-Kit

2.2.3. Receptor c-Kit: mecanismo de ação

A ligação do c-Kit ligante (que circula como um dímero covalente não-

associado) (Arakawa et al, 1991) ao receptor de membrana desencadeia a

homodimerização do receptor c-Kit e fosforilação intermolecular da tirosina do

receptor, criando sítios para moléculas transducionais sinalizadoras SH2 (Heldin,

1995).

Kapur et al (1998) estudaram os efeitos da ligação do c-Kit ligante no receptor

c-Kit. Na verdade, existem duas formas de c-Kit ligante: uma forma solúvel e uma

forma transmembranosa. Estas duas formas possuem diferentes efeitos na atividade

quinase do receptor c-Kit, porém ambas o dimerizam.

Miyazawa et al (1995) relataram que a forma membranosa do c-Kit ligante

possui efeitos na fosforilação do receptor c-Kit mais prolongada (2 vezes mais) que a

17

forma solúvel. Porém, a primeira é a que está relacionada na manutenção da

hematopoiese normal in vivo.

Linnekin (1999) estudou as diversas vias em que o c-Kit ligante age na

proliferação celular. Ele concluiu que apesar da delineação da via de sinalização ser

atrativa, muitos dos componentes de sinalização ativados pelo c-Kit ligante atuam de

várias maneiras, e que a maioria das vezes, as repostas mediadas por c-Kit ligante

resultam na interconexão de múltiplas vias de sinalização. Além disto, Jacobsen et al

(1992) relataram que o c-Kit ligante é capaz de sinergizar com outros fatores de

crescimento.

2.2.4 Receptor c-Kit: regulação da expressão

Qiu et al (1988) relataram que a seqüência do c-DNA do proto-oncogene do c-

Kit já prediz que esta proteína é uma receptora da tirosina quinase, pois todas

possuem estruturas semelhantes. O gen c-Kit consiste de 21 exons e constitui-se de

aproximadamente 80 kb de DNA (Vandenbark et al, 1992), e possui uma estrutura e

organização semelhante aos genes que codificam outros tipos de receptores da

tirosina quinase tipo III, como o RFCDP e o receptor do fator estimulador de colônias

de macrófagos. As funções dos diferentes elementos que regulam a expressão do receptor c-

Kit ainda não são muito bem esclarecidas. Os níveis de mRNA do receptor c-Kit

podem ser regulados por proteínas e modulados por outras citocinas. A IL-4 regula

negativamente a expressão do c-Kit nos mastócitos (Sillaber et al, 1991), e possui

efeitos complexos na sua maturação (Nilsson et al, 1994; Toru et al, 1998). O TGF-β

é um modificador potente da hematopoiese (Keller et al, 1992) e regula

negativamente o c-Kit nas células hematopoiéticas precursoras (Dubois et al, 1994).

2.2.5 c-Kit ligante e c-Kit receptor nas células tronco: sobrevida celular, proliferação

e diferenciação

Broudy (1997) e Lyman, Jacobsen (1998) relataram que enquanto os

fenótipos Sl e W de camundongos mutantes indicavam um papel crítico do c-Kit

ligante na produção de mastócitos e células eritróides, estudos in vitro

demonstraram que o c-Kit ligante era um potente fator de crescimento para as

18

células hematopoiéticas primitivas e para diversas outras linhagens de células,

agindo em sinergia com outras citoquinas.

Diversos autores demonstraram que o c-Kit ligante possui um efeito de

supressão da apoptose nas células hematopoiéticas. Porém, cada um deles

apresentou um mecanismo de ação diferente. Carson et al (1994) relataram que o c-

Kit ligante promove a sobrevivência das células natural killer por um aumento da

regulação do Bcl-2 anti-apoptótico. Já Gommerman, Berger (1998) demonstraram

que o c-Kit ligante protege as células progenitoras das linhagens mielóide e os

mastócitos da apoptose aparentemente através de um mecanismo de insensibilidade

do Bcl-2, ao influxo de cálcio.

2.2.6 c-Kit ligante e c-Kit receptor: papel na adesão e migração

A adesão e migração são importantes na determinação correta da localização

tecidual, e também para facilitar a ação de fatores de crescimento (Ashman, 1999).

Okumura et al (1996) reportaram o efeito quimiotáxico do c-Kit ligante para células

progenitoras hematopoiéticas, parecido com o efeito nos mastócitos.

Kaneko et al (1991) relataram ainda que o c-Kit ligante promove a adesão das

células hematopoiéticas progenitoras. Isto ocorre, pois a ligação do c-Kit ligante ao

receptor c-Kit das células hematopoiéticas pode diretamente mediar a adesão.

Levesque et al (1995) relataram outra via na qual o c-Kit ligante e o receptor c-Kit

interferem na adesão celular. Segundo estes autores, a via de sinalização via c-Kit

parece aumentar a avidez da integrina ß1, VLA-4 e VLA-5 das células progenitoras e

dos mastócitos, para a fibronectina da matrix extracelular.

Dastych et al (1998) demonstraram, através de estudos com mastócitos

derivados do camundongo mutante W/Wv, que um baixo nível de ativação e

sinalização da via PI3-kinase pode mediar respostas ao c-Kit ligante de adesão e

migração. A resposta à adesão pode ser importante não só na manutenção da célula

em um microambiente permissivo, mas também na promoção de sinergismo,

sobrevivência mediada por integrinas e sinais proliferativos (Bendall et al, 1998).

To et al (1997) reportaram que, apesar dos mecanismos ainda não serem

totalmente conhecidos, o c-Kit ligante é um potente agente para a mobilização das

células progenitoras hematopoiéticas humanas e murinas da medula óssea para o

19

sangue periférico. Esta mobilização, por qualquer que seja o significado, é

acompanhada por uma diminuição da regulação do receptor c-Kit.

2.2.7 Expressão do receptor c-Kit e c-Kit ligante em tecidos normais

Alguns experimentos demonstraram que em tecidos normais, existe a

expressão da proteína ou mRNA do receptor c-Kit em mastócitos (Majumder et al,

1988; Nocka et al, 1989), melanócitos (Nocka et al, 1989), testículo (Majumder et al,

1988), e medula óssea (Wang et al, 1989), sendo todos estes tecidos alvos para

mutações W. Utilizando-se uma metodologia mais sensível, a expressão da proteína

do receptor c-kit foi encontrada em uma variedade de células não hematopoiéticas,

incluindo células endoteliais vasculares e células intersticiais de Cajal, estas últimas

responsáveis pelo controle da motilidade intestinal (Broudy et al, 1994; Huizinga et

al, 1995). Também foi encontrado a expressão da proteína do receptor c-kit em

astrócitos, túbulos renais, células epiteliais glandulares da mama e de glândulas

sudoríparas (Natali et al, 1992). Utilizando-se cortes seriados, várias destas células

também expressaram c-kit ligante, sugerindo uma relação entre receptor c-Kit e c-Kit

ligante na manutenção de alguns tecidos (Lammie et al, 1994). Sobre o sistema

hematopoiético humano, a proteína do receptor c-kit é expressa em

aproximadamente 70% das células CD34+ na medula óssea, incluindo a linhagem

restrita das células progenitoras hematopoiéticas e células precursoras das

linhagens B e T, além dos megacariócitos que também são positivos para o receptor

c-kit (Ashman et al, 1991; Papayannopoulou et al, 1991; Avraham et al, 1992;

Palácios, Nishikawa, 1992).

Uma pequena porção das células mononucleares da medula óssea que

expressam marcadores linfóides co-expressam receptor c-Kit (Rico-Vargas et al,

1994), consistente com o efeito do c-Kit ligante na linfopoiese humana in vitro.

Entretanto, estudos nos quais o receptor c-Kit foi bloqueado utilizando-se um

anticorpo monoclonal, demonstraram que apesar de necessário para a mielopoiese,

ele não é essencial para a linfopoiese (Ogawa et al, 1991). O c-kit ligante, produto

do locus Sl no camundongo (Witte, 1990), é um homodímero não glicosilado, não-

covalente, que é expresso amplamente por células estromais, fibroblastos e células

endoteliais em várias partes do corpo (Heinrich et al, 1993), e é detectado

20

normalmente em baixos níveis na circulação sangüínea (Broudy, 1997; Lyman,

Jacobsen, 1998).

2.2.8 Expressão de receptor c-Kit e c-Kit ligante em tecidos neoplásicos

A expressão de c-Kit já foi demonstrada em diversas neoplasias. Virtualmente

todos os pacientes com LMA possuem blastos positivos para o receptor c-Kit, e o c-

Kit ligante pode estimular a proliferação destas células (Broudy et al, 1992). Em

contraste, blastos leucêmicos de pacientes com Leucemia Linfóide Aguda raramente

expressam receptor c-Kit (Buhring et al, 1991). A maioria dos linfomas não-Hodgkin

não possuem expressão para o receptor c-Kit, com exceção de alguns casos de

Linfoma de Grandes Células Anaplásicas (Pinto et al, 1994). As células da Leucemia

Eritróide podem chegar a expressar de 50.000 a 100.000 receptores c-Kit (Turner et

al, 1995).

O receptor c-Kit também é expresso em diversos tumores sólidos. Went et al,

(2004) estudaram por imuno-histoquímica em TMA (do inglês tissue microarray) a

imunoexpressão de receptor c-Kit em mais de 120 tipos de tumores. Seus resultados

estão representados a seguir (Figuras 2 e 3).

21

Tumores Negativos para C-Kit

Adenocarcinoma da bexiga

Carcinoma de Merkel da Pele Craniofaringioma Lipossarcoma

Adenocarcinoma da vesicular biliar

Carcinoma de Pequenas Células do Esôfago

Dermatofibrosarcoma protuberans Meduloblastoma

Adenocarcinoma difuso do Estômago

Carcinoma Endometrióide do Endométrio Ependimoma Neurofibroma

Adenocarcinoma do cólon

Carcinoma Espinocelular da Cavidade Oral Estesioneuroblastoma Papiloma Invertido

da Bexiga

Adenocarcinoma do esôfago

Carcinoma Espinocelular da Laringe

Fibrohistiocitoma Maligno Rabdomiossarcoma

Adenocarcinoma do útero

Carcinoma Espinocelular da Vagina Glioma do Nervo Ótico Sarcoma Alveolar

Adenolinfoma da glândula salivar

Carcinoma Espinocelular do Ânus Hemangioma Capilar Sarcoma de Kaposi

Adenoma da glândula adrenal

Carcinoma Espinocelular do Pênis

Hemangioma Epitelióide Sarcoma Epitelióide

Adenoma do Cólon, displasia leve Carcinoma Hepatocelular Hemangiopericitoma Sarcoma Estromal

Endometrióide

Adenoma do Cólon, displasia moderada

Carcinoma Linfoepitelial da Faringe Histiocitoma Benigno Sarcoma Sinovial

Adenoma do Cólon, displasia severa

Carcinoma Lobular da Mama Leiomioma Schwanoma

Maligno

Angiomiolipoma Carcinoma Medular da Tireóide Leiomiossarcoma

Schwanoma’

Angiosarcoma Carcinoma Mucinoso da Mama

Leucemia Mielógena Aguda

Teratoma do Testículo

Astrocitoma Carcinoma Mucinoso do Ovário

Leucemia Mielógena Crônica

Tumor Adenomatóide

Carcinoma Anaplásico da Tireóide

Carcinoma Mucoepidermóide da Glândula Salivar

Linfoma de Hodgkin Tumor Carcinóide

Carcinoma Apócrino da mama

Carcinoma Seroso do Endométrio Linfoma de MALT

Tumor de Células Gigantes do Tendão

Carcinoma cribriforme da mama

Carcinoma Seroso do Ovário

Linfoma Não-Hodgkin B Difuso de Grandes Células

Tumor de Células Granulares

Carcinoma da glândula adrenal

Carcinoma Tubular da Mama

Linfoma Não-Hodgkin, outros

Tumor do Seio Endodérmico do Ovário

Carcinoma da Próstata, refratário à hormônios

Carcinosarcoma do Útero Lipoma

Figura 2 - Tumores negativos para o receptor c-Kit pelo método da imuno-histoquímica (Went et al, 2004).

22

Tumores positivos para o c-Kit

Tumores neurais Tumores de partes moles

Tumor genital masculino Mama

Glioblastoma multiforme Fibrosarcoma Carcinoma da próstata (não tratado)

Mama, carcinoma ductal

Meningeoma Tumor glômico Testículo, tumor de células germinativas não-seminoma

Mama, carcinoma medular

Oligodendroglioma PNET (tumor neuro-ectodérmico primitivo) Testículo, seminoma Mama, tumor Filóide

Tumor do trato genital

feminino Trato gastro-

intestinal Tumores neuro-

endócrinos Trato digestivo alto

e respiratório Ovário, tumor de Brenner

Esôfago, carcinoma espino-celular Paraganglioma Pulmão,

adenocarcinoma

Ovário, disgerminoma GIST Paratireóide, adenoma Pulmão, carcinoma de grandes células

Ovário, gonadoblastoma Pâncreas, adenocarcinoma Feocromocitoma Pulmão, carcinoma

de pequenas células Outros tipos de carcinoma de ovário

Intestino delgado, adenocarcinoma Tireóide, adenoma Pulmão, carcinoma

espino-celular

Cérvice uterina, carcinoma espino-celular

Estômago, adenocarcinoma do tipo intestinal

Tireóide, carcinoma folicular Mesotelioma maligno

Cérvice uterina, NIC III Tireóide, carcinoma papilar

Cérvice uterina, adenocarcinoma

Vulva, carcinoma espino-celular

Tumores da glândula salivar

Carcinoma de células acinares

Glândula salivar, carcinoma adenóide cístico

Glândula salivar, adenoma pleomórfico

Figura 3 - Tumores positivos para o receptor c-Kit pelo método da imuno-histoquímica (Went et al, 2004).

23

2.3 Receptor c-Kit e osteossarcoma

O primeiro estudo da imunoexpressão do c-kit em osteossarcomas foi

relatado em 2002, por Smithey et al. Esses autores estudaram essa proteína em 151

tumores sólidos pediátricos, dentre eles 18 osteossarcomas primários. Nesse

estudo, esses autores se preocuparam apenas em pesquisar a superexpressão do

c-kit por imuno-histoquímica, sem fazer correlação com parâmetros clínicos ou

histológicos. Eles não caracterizaram na amostra, quantos desses 18 pacientes

eram metastáticos ao diagnóstico, nem mencionaram a localização dos tumores.

Também, não relataram se usaram material pré ou pós quimioterapia. O anticorpo

utlizado foi o policlonal CD117 (DAKO), na diluição de 1:50. Os escores foram

analisados por 2 examinadores. A intensidade da expressão foi analisada em uma

escala de 0 a 3 (0= negativo, 1= fracamente positivo, 2= moderadamente positivo,

3=fortemente positivo) e a quantidade de células em porcentagem (< ou igual a

10%= focalmente positivo, 11 – 50% = moderadamente positivo, > 50% difusamente

positivo). Encontraram em 15 de 18 casos (83%), a imunoexpressão da proteína,

sendo quem em 7 casos (39%) a expressão era forte e difusa. Em 12 dos 15 casos

positivos (80%), a expressão era citoplasmática, 2 casos (13%) exibiram positividade

membranosa e um (15%) mostrou positividade citoplasmática e membranosa.

Relataram também que osteoblastos não neoplásicos no osso reativo ao redor da

neoplasia, também foram fortemente positivos para a proteína.

Entz Werle et al, em 2005 estudaram 56 pacientes pediátricos com

osteossarcomas primários de alto grau, diagnosticados de 1994 a 2000, submetidos

a um mesmo tipo de tratamento quimioterápico – protocolo francês OS94. Após o

diagnóstico, os pacientes eram submetidos a quimioterapia por 4 meses, usando

combinação de Doxorrubicina e altas doses de metotrexate ou combinação de

etoposida, ifosfamida e altas doses de metotrexate. O tratamento pós cirúrgico era

determinado pelo grau de necrose de Huvos, sendo que os bons respondedores

eram submetidos ao mesmo tratamento qumioterápico pré-cirúrgico e os maus

respondedores, com combinação de etoposida e ifosfamida ou combinação de

cisplatina e doxorrubicina. Desses pacientes 10 (14,7%) eram metastásticos ao

diagnóstico e 3 pacientes (4,41%) tinham tumores primários extra-axiais. Em 56

pacientes foi pesquisado a imunoexpressão do ckit. Utilizaram o anticorpo

monoclonal CD117, A4502 da Dako, na diluição de 1:250. As lâminas foram

24

examinadas por 2 investigadores, que consideraram o caso como positivo quando

haviam 10% de células positivas. A expressão foi determinada em cruzes, sendo: 0

nenhuma expressão; + expressão leve; ++ expressão moderada e +++ expressão

intensa. Encontraram 32 casos (57%) com positividade citoplasmática. Quando

correlacionaram os pacientes com superexpressão da proteína ao prognóstico,

encontraram tendência desses pacientes em evoluírem clinicamente pior.

Já Sulzbacher et al, em 2007 pesquisaram a imunoexpressão do ckit em 100

pacientes com osteossarcomas, diagnosticados no período de 1985 e 2004,

utilizando biópsias pré-qumioterapia. Desses 100 pacientes, 32 eram adultos e 15

pacientes tinham tumores extra-axiais. Utilizaram o anticorpo policlonal CD117 –

A4502 da Dako, na diluição de 1:400. Avaliaram 5 a 8 campos de grande aumento,

contando a porcentagem de células positivas em 500 células tumorais, considerando

positivos os casos com intensidade de expressão semelhante aos GISTs.

Encontraram em 20 casos (20%) de positividade para o ckit, variando de 5% a 90%

(média de 5,9%). Não encontraram correlação entre a expressão do c-kit, as curvas

de sobrevida global e livre de doença, e a necrose pós quimioterapia. Concluíram

que a expressão do ckit não está relacionada com o prognóstico em pacientes com

osteossarcoma.

Em 2008, Wei et al estudaram a imunoexpressão do ckit em 40 pacientes

com osteossarcomas, do período entre 1998 a 2005, sendo 4 deles (10%),

metastáticos ao diagnóstico. O paciente mais velho tinha 35 anos e o mais novo 4

anos. Não identificaram a localização óssea dos tumores primários. Todos os

pacientes se submeteram a ressecção cirúrgica como primeiro tratamento, seguido

de quimioterapia adjuvante e radioterapia. Para a reação imuno-histoquímica usaram

o anticorpo monoclonal CD117 ZM 0437 – ZhongShan Co. Foram contadas em no

mínimo 100 células tumorais, aquelas que imunoexpressaram o ckit. A intensidade

da expressão foi dividida em fraca e forte, relatando apenas expressão

citoplasmática. Encontraram em 25 casos (62,5%) a expressão da proteína, sendo

que esses casos positivos tiveram maior recorrência local e pior sobrevida global.

Concluíram que a expressão do ckit pode servir como marcador prognóstico em

osteossarcomas.

25

2.4 Mesilato de imatinibe (MI)

Recentes avanços na biologia molecular levaram ao desenvolvimento de uma

nova classe de agentes terapêuticos que têm como alvo genes supressores tumorais

ou oncogenes. MI (Gleevec, Glivec, STI571; Novartis Pharma AG, Basel, Suíça) é

um agente anticâncer oral produzido para inibir seletivamente algumas proteínas

quinases envolvidas na oncogênese (Guilhot, 2004).

MI foi a primeira terapia molecular dirigida ao câncer a receber aprovação da

FDA (Food and Drug Administration) americana. Em março de 2001 o MI foi

aprovado para o tratamento de pacientes com LMC (Leucemia Mielóide Crônica) em

crise blástica, fase acelerada, ou fase crônica após falência de tratamento com

Interferon-α. Em fevereiro de 2002, o MI foi aprovado para o tratamento de pacientes

com GIST maligno ou irressecável que expressavam o receptor c-Kit (Pindolia,

Zarowitz, 2002).

Na literatura, encontramos apenas um estudo do uso do Gleevec em

Osteossarcomas. Em 2008, Bond et al estudaram pacientes com idade inferior a 30

anos, com tumores sólidos refratários a tratamento ou que recaíram. Entre junho de

2002 a outubro de 2004, selecionaram pacientes com diagnóstico de

osteossarcomas, sarcoma de Ewing, neuroblastoma, Tumor desmoplásico de

células redondas, sarcoma sinovial e GIST. Todos eles eram pacientes refratários a

tratatamento ou que tinham recaído, tinham expectativa de vida maior que 2 meses

e órgãos com adequada função (medida pela creatinina, alanina aminotransferase,

contagem perférica de neutrófilos e dosagem de hemoglobina). Utilizaram o Mesilato

de Imatinibe na dose de 440 mg/m2/dia, oralmente, uma a duas vezes ao dia.

Nenhum dos pacientes tratados fez imuno-histoquímica para ver se expressavam ou

não o ckit e o PDGF-R. 12 pacientes eram portadores de osteossarcomas. Não

encontraram resposta clínica significativa em nenhum dos pacientes submetidos a

esse protocolo de tratamento.

As proteínas tirosinas quinases controlam a ativação de vias de sinalização

de transdução que regula processos celulares críticos como crescimento,

diferenciação e apoptose. Elas estão funcionalmente desreguladas e super-

expressas em um grande número de cânceres (Savage, Antman, 2002).

O MI inibe 3 proteínas tirosinaquinases da superfície celular: BCR-ABL,

receptor do fator de crescimento derivado da plaqueta (RFCDP) e o receptor c-Kit.

26

Esta droga ocupa o sítio de ligação do ATP das moléculas quinases prevenindo a

fosforilação de substratos envolvidos na regulação do ciclo celular (Buchdunger et al,

2000).

2.4.1 Estrutura química e farmacocinética

O MI é um inibidor da tirosina quinase da classe 2-fenilaminopirimidina. É

quimicamente designado como 4-[(4-metil-1-piperazinil)metil]-N[4-metil-3-[[4-(3-

piridinil)-2-pirimidinilamino-fenilbenzamidemetanesulfonato.

Estudos farmacocinéticos mostraram que o MI encontra-se 98%

biodisponível, com o pico de concentração plasmática em 2 a 4 horas após a

administração oral. A média de concentração plasmática após administração de 400

mg em dose única diária é de 4,6 Mol/L. Em doses repetidas, não há mudanças na

farmacocinética do MI. A curva da farmacocinética aumenta proporcionalmente

quando se aumentam as doses entre 25 – 1000 mg. A meia vida do MI em pacientes

com LMC é de 13 a 16 horas. O MI sofre metabolização pelo sistema CYP, sendo

que a CYP3A4/5 é a maior enzima envolvida no metabolismo do MI. Os metabólitos

do MI são eliminados predominantemente pelas fezes. O MI possui algumas reações

adversas reportadas. A maioria dos efeitos adversos reportados para o MI foi

graduada em leve a moderada. Entretanto, foi interrompido o tratamento com MI por

reações adversas em 1% dos pacientes em fase crônica da LMC, 2% dos pacientes

em fase acelerada da LMC, 5% dos pacientes em crise blástica e 8% dos pacientes

com GIST. Dentre estas reações adversas severas destacam-se toxicidade

hematológica (46% dos casos), hepatotoxicidade (1 a 3,5%), edema (1 a 5%),

rashes cutâneos, náuseas e vômitos (Pindolia, Zarowitz, 2002).

2.5 Cultura celular, ensaios de proliferação, ensaios de invasão e mesilato de

imatinibe

Linhagem de células tumorais proporcionam a investigação da fisiopatologia

das neoplasias, podendo ser usada in vitro para o estudo da biologia das células

tumorais, incluindo mecanismos básicos da oncogênese, expressão de fatores de

crescimento e para avaliar a sensibilidade de determinada neoplasia a agentes anti-

neoplásicos (Hitora et al, 2005).

27

A habilidade das células de invadir através de uma membrana basal é

importante não somente para a fuga de células do tumor primário, mas também para

a implantação de células no sítio das metástases. A implementação deste passo nos

estudos in vitro tem possibilitado o uso de membranas basais artificiais como o

Matrigel. Estas membranas basais artificiais têm sido utilizadas no estudo da

habilidade de invasão celular e possíveis efeitos de proteínas solúveis nas taxas de

invasão (Woodward et al, 2002).

Poucos estudos têm investigado a participação de moléculas e citocinas na

regulação da habilidade invasiva das células de Osteossarcomas. Kawashima et al

(1994) demonstraram que a invasão celular do Osteossarcoma pode ser estimulada

pela indução da produção da metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9) pelo Fator de

Necrose Tumoral alfa (TNF alfa). Esses mesmos autores, em 2001, encontraram

que o TNF alfa também estimula a adesão e migração celular, através da indução da

produção de integrinas alfa. Radjabi et al (2007) encontraram que a trombina está

correlacionada à maior expressão na superfície celular da MMP-9 e integrina β1,

estando essas moléculas envolvidas na capacidade de invasão das células

tumorais.

Na literatura, há apenas um trabalho de estudo de inibição da proliferação

celular pelo Mesilato de Imatinibe. Yoshitani et al (2003), estudaram em cultura de

células de osteossarcoma de rato e fibrohisitocitoma maligno, a capacidade de

inibição do Gleevec in vitro. Utilizaram 3 linhagens de células de osteossarcoma de

ratos – COS1NR, COS2NR e COS4NR e 2 linhagens de células de fibrohistiocitoma

de ratos – MFH1NR e MFH2NR. Encontraram que essa droga inibe o crescimento

de cada linhagem celular tanto dose quanto tempo dependente, sendo que as

células do fibrohistiocitoma sofreram maior inibição do que as do osteossarcoma.

Entretanto ressaltaram que a dose para inibição é bem maior do que a dose utilizada

no tratamento da Leucemia Mileóide Crônica, alertando pelos maiores efeitos

colaterais naquela dosagem. Mesmo assim, concluem que o Gleevec poderia ser

nova estratégia na terapêutica do Fibrohistiocitoma Maligno e Osteossarcomas, e

que estudos in vivo deveriam ser realizados.

28

3 MATERIAL E MÉTODO

3.1 Casuística

Entre 2000 e 2005, estudamos 52 pacientes com osteossarcomas

acompanhados no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP)/Grupo de Apoio ao

Adolescente e à Criança com Câncer (GRAACC) – UNIFESP/EPM que foram

submetidos a tratamento segundo o Protocolo Brasileiro Osteossarcoma 2000

(Anexo A).

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da UNIFESP sob o número

369/09 (Anexo B).

3.2 Aspectos clínicos

Os seguintes aspectos clínicos foram discriminados: idade, sexo, localização

óssea, tipo de tratamento cirúrgico realizado, presença de metástase ao diagnóstico

e evolução clínica até dezembro de 2008.

3.3. Anatomia patológica

O estudo anatomopatológico constou da análise de lâminas coradas pela

Hematoxilina Eosina e pelo método imuno-histoquímico da estreptavidna-biotina-

peroxidase para o anticorpo policlonal CD117 (A4502). A avaliação das lâminas foi

feita por 2 anatomopatologistas sem o prévio conhecimento da evolução dos

pacientes.

O subtipo histológico e o grau de necrose pós-quimioterapia foram resgatados

dos laudos anatomopatológicos. Posteriormente, os casos foram divididos em não

respondedores (graus I e II) e Respondedores (graus III e IV).

3.3.1 Estudo imuno-histoquímico

O estudo imuno-histoquímico foi realizado para o anticorpo c-kit (CD 117 – A

4502 Dako A/S – policolonal, diluído a 1:100), avaliados em cortes

histológicos de 4µm de espessura, em lâminas previamente silanizadas (3-

29

Aminopropyltriethoxysilane Sigma Chemical CO USA código A3648)

deixadas na estufa a 60 graus por 24 h (para maior adesão dos cortes), de

acordo com o seguinte protocolo de reação:

Desparafinização com xilol a quente (60º C) por 15 minutos e a temperatura

ambiente por 15 minutos.

Hidratação dos cortes histológicos em concentrações decrescentes de álcool

100, 95, 80 e 70% respectivamente por 30 segundos cada.

Lavagem das lâminas com água corrente e destilada.

Recuperação antigênica em panela de pressão pelo calor úmido, imergindo

as lâminas em solução tampão citrato de sódio 10mM ph 6,0, por 5 minutos

após fervura, resfriando-as por pelos menos 20 minutos à temperatura

ambiente.

Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio a 20

volumes, diluído em água destilada.

Lavagem em água corrente, destilada e em solução salina tamponada com

fosfatos (PBS 10mM pH 7,4).

Incubação com anticorpo primário policlonal CD117 A4502, diluição 1:100,

durante a noite a 4º C na geladeira diluído em albumina bovina (Albumina

bovina Fração V Inlab Brasil código 1870).

Lavagem em solução PBS.

Incubação das lâminas no Kit LSAB-HRP (link Streptoavidina Biotina

Peroxidase) DAKO-K69:

1. Incubar as lâminas por 15 minutos no reagente nº 1 do Kit – Anticorpo

secundário Biotinilado.

2. Lavagem em solução de PBS.

3. Incubar as lâminas por 15 minutos no reagente nº 2 do Kit – Complexo

avidina biotina peroxidase.

Revelação da reação utilizando-se da seguinte solução substrato: 60mg de

Diaminobenzidina (3,3 – Diaminobenzidine etrahydrochloride Sigma

Chemical CO USA código D5637), 1 ml de água oxigenada a 20 volumes,

100ml de PBS e 1ml de dimetilsufóxido durante 5 minutos a 37ºC ao abrigo

da luz observando-se ao microscópio a formação do precipitado castanho

escuro produto final da reação.

30

Lavagem em água corrente e destilada.

Contra-coloração utilizando-se Hematoxilina de Harris por 1 minuto.

Imersão das lâminas em água amoniacal (solução de hidróxido de amônio a

0,5%).

Lavagem com água corrente e destilada.

Desidratação dos cortes em concentrações crescentes de álcool a 70, 80, 95

e 100%.

Imersão das lâminas em xilol.

Montagem da lâmina com lamínula e Entellan (Entellan Merck-Germany

código 1.07961.0100).

Avaliação da positividade imuno-histoquímica

A intensidade da expressão do c-Kit foi inicialmente discriminada em cruzes,

sendo considerados: 0 – casos sem nenhuma expressão; + = casos com expressão

fraca e citoplasmática; ++ = casos com expressão moderada e citoplasmática; +++ =

casos com expressão forte, citoplasmática e/ou membranosa. Depois, separamos os

casos com 10% ou mais de células positivas e com menos de 10% de células

positivas. Foram considerados positivos, aqueles casos com expressão semelhante

ao encontrado nos GISTs, ou seja, expressão moderada e forte (++ e +++) e difusa,

em 10% ou mais das células tumorais e negativos aqueles sem expressão (0) ou

fracamente expressos (+) em menos de 10% das células tumorais.

3.4 Cultura celular

A linhagem MG-63 de osteossarcoma humano foi incubada a 370 C em uma

atmosfera umidificada enriquecida com 5% de CO2. As células foram cutivadas em

meio RPMI-1640 (Invitrogen, Burlington, Ontário, Canadá), suplementado com 5%

de soro bovino fetal (FBS) inativado, 1% de anfotericina B (Fungizone) e 1% de

penicilina-estreptomicina (Invitrogen, Burlington, Ontário, Canadá). As células foram

cultivadas como monocamada em frascos de 25cm2 (Fisher, Whitby, Ontário,

Canadá) e observadas 2 vezes por semana, a cada troca do meio, em relação ao

crescimento normal através de microscópio de contraste. As culturas foram

31

cultivadas para confluir e passar por tratamento com 0,05% de tripsina com EDTA

(Fisher, Whitby, Ontário, Canadá) a 370C e lavadas com 7ml de meio RPMI-1640

antes de serem centrifugadas a 120g por 10 minutos para formar um sobrenadante.

Posteriormente, as células foram suspensas em 1 ml de meio e contadas utilizando

o teste de exclusão do Azul de Tripano.

3.4.1 Ensaio de invasão in vitro

Ensaios de invasão in vitro foram realizados para determinação da habilidade

de invasão celular da linhagem celular de osteossarcoma MG-3 mediante a adição

de MI ao meio celular.

As condições experimentais estudadas correspondem aos ensaios de invasão

da linhagem celular MG-63, analisadas separadamente, com e sem a presença de

MI. Os ensaios de invasão in vitro sem a presença de MI serviram de controle. As

duas condições foram realizadas em triplicata.

Uma câmara modificada de Boyden, que consiste de uma membrana de

traftalato de polietileno (PET) com poros de 8 m de diâmetro pré-cobertas com

Matrigel (Beckton Dickenson Labware, MA, EUA) foi utilizada como descrito

previamente (Woodward et al, 2002). O Matrigel é uma membrana basal artificial que

é utilizada para analisar a habilidade invasiva celular (Woodward et al, 2002). Uma

membrana PET sem Matrigel foi utiliizada para se determinar a quantidade basal de

células.

Brevemente, 1,25x105 células foram adicionadas à câmara superior em meio

RPMI-1640 com 0,1% de FBS. O meio RPMI-1640 com 10% de FBS foi adicionado

à câmara inferior como quimio-atrativo para se obter a habilidade invasiva basal das

linhas celulares. As câmaras foram então incubadas a 370C em uma atmosfera

enriquecida com 5% de CO2 por 48 horas para permitir a invasão celular através do

Matrigel.

O efeito do MI (Gleevec, Novartis) na invasão foi analisado, repetindo-se a

condição experimental acima descrita, porém adicionando-se 50 mol de Mesilato

de Imatinibe ao meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS na câmara

superior antes do período de incubação.

32

A dose utilizada foi de 50 mol de MI, pois foi a dose de “concentração de

inibição 50%” (IC50) do valor total determinada. As células foram completamente

mortas utilizando a concentração de 1000 mol, o que foi inviável para a medição da

invasão. Metade das células foi morta (dose letal de 50%) utilizando-se a

concentração de 100 mol, ainda, muito forte para medir a invasão. Não houve

efeito significativo no ensaio de invasão utilizando-se a concentração de 10 mol.

Assim, a dose de 50 mol foi uma dose IC50 coerente, entre 100 e 10 mol, não

matando nem destruindo as células e com um efeito citostático.

Porém, estudos prévios relataram que a dose máxima tolerada de MI em

ensaios clínicos é perto de 1000 mg/dia. Nesta dose, os níveis sangüíneos de MI

variam entre 06-10 mol (Druker et al, 2001; Druker, 2002).

As células que não invadiram através do Matrigel foram removidas da câmara

superior através de uma gentil limpeza na superfície da membrana com um

cotonete. As membranas foram removidas e posteriormente coradas com o kit da

coloração Diff-Quick, que cora o núcleo da célula em roxo e o citoplasma em rosa e

então analisadas à microscopia óptica. As células coradas foram contadas por dois

observadores simultaneamente, através de um microscópio óptico de duas cabeças,

em 10 campos de grande aumento (aumento de 400x). Apenas as células em que

os núcleos passaram completamente através da membrana PET foram contadas.

Cada condição experimental, incluindo o controle, foi realizada e a média do número

de células que invadiram foi calculada para todas as condições experimentais.

A porcentagem de invasão foi determinada para cada linhagem celular em

cada condição experimental utilizando-se a seguinte fórmula: % de invasão = (média

do número de células invadindo através do matrigel + PET/média do número de

células migrando através da membrana PET sem matrigel) multiplicado por 100.

3.4.2 Ensaio de proliferação in vitro

Ensaios de proliferação in vitro foram realizados para determinação da

habilidade de proliferação da linhagem celular estudada (MG-63) mediante a adição

de MI ao meio celular.

O kit de ensaio baseado em Sulforrodamina-B (TOX-6, Sigma-Aldrich Co., St.

Louis, MO, USA) foi utilizado seguindo o protocolo do Instituto Nacional do Câncer

33

dos EUA (Skehan et al, 1990). Brevemente, a linhagem celular de osteossarcoma

humano estudada foi implantada em poços em uma concentração de 2,5x103 de

células por poço, em um mínimo de 8 poços para cada concentração de MI. Uma

linha de 11 poços foi exposta apenas ao meio RPMI-1640 e foram usadas como

controle. Vinte e quatro horas após a implantação das células, MI foi adicionado aos

poços do experimento. As concentrações de MI utilizadas foram de 1000 Mol, 100

Mol, 10 Mol, 1 Mol, 0.1 Mol, 0.01Mol e 0.001 Mol conforme descrito no

ensaio de invasão (Druker, 2002). As células foram incubadas por 24 horas após a

implantação celular. Após este período de 24 horas, as células foram fixadas ao

fundo dos poços utilizando uma solução de 50% de ácido tricloroacético (TCA) por 1

hora a 40C. As placas foram então enxaguadas com água destilada para remover o

TCA e o meio, e posteriormente secadas ao ar. A tintura de Sulforrodamina-B foi

adicionada em cada poço e corada por 25 minutos. A tintura de Sulforrodamina-B foi

removida subseqüentemente utilizando-se uma solução de 10% de ácido acético, e

mais uma vez secadas ao ar. A tintura que foi incorporada nas células fixadas no

fundo do poço foi solubilizada com uma solução de Tris a 10 Mol. A fotometria do

soluto foi medida utilizando um leitor de microplacas à onda de luz de 510 m. Isto

permitiu uma comparação entre as taxas de proliferação celular do controle em 24

horas comparadas com as taxas de proliferação das células expostas ao MI nas

doses determinadas durante o mesmo período de tempo.

3.5 Análise estatística

3.5.1 Aspectos clínicos e histológicos

Foi realizada uma comparação dos aspectos clínicos e histológicos

separando-se os pacientes em metastáticos e não metastáticos ao diagnóstico.

Utilizou-se o teste exato de Fisher (sexo, tipo de cirurgia, recaída e tamanho do

tumor); o Teste T de Student (t) (idade e tempo de acompanhamento) e o teste Qui-

quadrado (tipo histológico e a localização do tumor).

O subtipo histológico osteoblástico, predominou na nossa amosta, e para

análise estatística, agrupamos os tumores em osteoblásticos e não osteoblásticos.

34

Dividimos também os casos em não respondedores (graus I e II) e respondedores

(graus III e IV) à quimioterapia pré-operatória.

3.5.2 Imuno-histoquímica

Para correlacionar a expressão do c-kit com o subtipo histológico, tamanho do

tumor, grau de necrose pós quimioterapia e tipo de cirurgia, foi utilizado o teste de

Fisher. Todas as curvas de sobrevida foram construídas de acordo com a técnica de

Kaplan-Meier e estão expressas em fração de sobrevida (sobrevida livre de doença

– SLD – ou sobrevida global – SG) versus tempo em meses. A comparação entre as

curvas foi feita usando o teste de Logrank.

Toda essa análise foi calculada utilizando-se o programa Prism 4.0,

GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA, 2003.

3.5.3 Ensaios de proliferação e de invasão

A taxa de invasão foi determinada utilizando-se o teste ANOVA. Um valor de

p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os cálculos foram

feitos através de um sistema de computador (SPSS 11.5, SPSS Inc., Chicago,

Illinois, EUA).

A taxa de proliferação com e sem a adição de MI foi determinada utilizando-se

o teste t de student. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente

significativo. Os cálculos foram feitos através de um sistema de computador (SPSS

11.5, SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA).

3.6 Detalhamento da amostra (Anexo C)

Do total de 52 pacientes analisados, 29 (56%) eram do sexo masculino e 23

(44%) do sexo feminino (Tabela 1).

35

Tabela 1 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com o sexo

Sexo n % Masculino 29 56 Feminino 23 44 Total 52 100

O paciente mais novo tinha 5 anos e o mais velho 29 anos, com média de 15

anos (tabela 2)

Tabela 2 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com a faixa

etária

Idade ao diagnóstico (anos) Faixa 5 a 29 Média 15

Houve predomínio de ossos longos, num total de 49 (94,26%) casos quando

comparado a 3 (5,76%) casos localizados no esqueleto axial e em múltiplos ossos.

Nos ossos longos, houve predomínio absoluto do comprometimento dos membros

inferiores (45 casos), quando comparado aos membros superiores. A distribuição

segundo o osso acometido encontra-se na tabela 3.

Tabela 3 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com a

localização óssea

Osso n % Fêmur 30 57,69 Tíbia 15 28,84 Úmero 3 5,76 Radio 1 1,95 Outros 3 5,76 Total 52 100

O tamanho do tumor foi obtido de 50 pacientes, sendo que 20 tinham menos

de 12 cm e 30 eram maiores ou iguais a 12 cm (Tabela 4).

36

Tabela 4 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com o

tamanho do tumor

Tamanho n % < 12 cm 20 38,46 > ou = 12 cm 30 57,69 Sem informações 2 3,85 Total 52 100

Dos 52 pacientes, 44 (85%) realizaram cirurgia conservadora e 8 (15%)

pacientes fizeram amputação (tabela 5)

Tabela 5 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com o tipo

de procedimento cirúrgico

Tipo de Cirurgia n % Conservadora 44 85 Amputação 8 15 Total 52 100

O tempo mínimo de acompanhamento, desde o início do diagnóstico até a

última consulta (atualizada em dezembro de 2008), foi de 9,2 meses e o tempo

máximo foi de 96,8 meses, com uma média de 44,7 meses (tabela 6)

Tabela 6 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com o

tempo de seguimento em meses

Tempo de Acompanhamento (meses) Faixa 9,2 a 96,8 Média 44,7

A situação dos pacientes, segundo a última atualização para esse trabalho

(dezembro de 2008), está discriminada na tabela 7

37

Tabela 7 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, segundo o

seguimento clínico

Situação n % Remissão 24 46 Óbito 26 50 Recaída 1 2 Perda 1 2 Total 52 100

Dos 52 pacientes, 16 (30,8%) eram metastáticos ao diagnóstico e 36 (69,2%)

eram não metastáticos ao diagnóstico (Tabela 8)

Tabela 8 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com a

presença de metástase ao diagnóstico.

Metástase n % Sim 16 30,8 Não 36 69,2 Total 52 100

Em 50 pacientes obtivemos informação clínica do grau de necrose pós

quimioterapia (tabela 9)

Tabela 9 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, de acordo com o grau

de necrose pós quimioterapia, segundo Huvos.

Grau de necrose n % G I 25 48 G II 8 15 G III 9 17 G IV 8 15 Sem informações 2 4 Total 52 100

A distribuição dos tumores segundo o subtipo histológico foi obtida em 45

casos, demonstrados na tabela 10

38

Tabela 10 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, segundo o subtipo

histológico

Histologia n % Osteoblástico 28 53,87 Condroblástico 12 23,07 Fibroblástico 2 3,84 Telangiectásico 2 3,84 Pequenas células 1 1,92 Sem informações 7 13,46 Total 52 100

39

4 RESULTADOS

4.1 Análise de aspectos clínicos e histológicos e a presença ou não de metástase ao diagnóstico

Quando comparamos dados clínicos e histológicos com a presença ou não de

metástase ao diagnóstico encontramos que pacientes com metástase ao diagnóstico

têm 6,5X mais chances de recidivar ou morrer em um dado momento que pacientes

sem metástase. Observamos também que os grupos com e sem metástase são

diferentes quanto ao tipo de cirurgia, tempo de acompanhamento, grau de necrose e

evolução da doença (tabela 11).

Tabela 11 – Análise de aspectos clínicos e histológicos e a presença ou não de

metástase ao diagnóstico. Continua

Número de casos KIT 52 (56,5%) Metástase ao diagnóstico Sim 36 (69,2%) Não 16 (30,8%)

Grupos Geral Sem metástase Com metástase Valor de P Sexo Masculino 29 (56%) 7 (43,7%) 22 (61,1%) 0,3649 Feminino 23 (44%) 9 (56,3%) 14 (38,9%) Idade Intervalo 5 a 29 5 a 28 7 a 29 0,4653 Média 15 15 16 Mediana 15 15 16 Tipo histológico Osteoblástico 28 (54%) 22 (61,1%) 6 (37,5%) 0,1007 Condroblástico 12 (23%) 6 (16,7%) 6 (37,5%) Fibroblástico 2 (4%) 2 (5,6%) 0 Teleangiectásico 2 (4%) 1 (2,8%) 1 (6,3%) Células gigantes 0 (0%) 0 0 Pequenas células 1 (2%) 0 1 (6,3%) Não informado 7 (13%) 5 (13,9%) 2 (12,5%) Necrose GI 25 (48%) 14 (38,9%) 11 (68,8%) 0,0089 GII 8 (15%) 5 (13,9%) 3 (18,8%) I-II vs III-IV GIII 9 (17%) 9 (25%) 0 GIV 8 (15%) 7 (19,4%) 1 (6,3%) Conclusão

40

Grupos Geral Sem metástase Com metástase Valor de P Localização Fêmur 30 (58%) 23 (63,9%) 7 (43,8%) Tíbia 15 (28%) 9 (25%) 6 (37,5%) Úmero 3 (6%) 1 (2,8%) 2 (12,5%) Ilíaco 1 (2%) 1 (2,8%) 0 Rádio 1 (2%) 1 (2,8%) 0 Múltiplos 1 (2%) 0 1 (6,3%) Outros 1 (2%) 1 (2,8%) 0 Tipo de cirurgia Conservadora 44 (85%) 33 (91,7%) 11 (68,8%) 0,0345 Amputação 8 (15%) 3 (8,3%) 5 (31,3%) Acompanhamento (meses) Média 45 50 33 0,0139 Mínimo 9 9 14 Máximo 97 97 79 Recaída Ausente 28 (53,8%) 20 (55,6%) 8 (50,0%) 0,7693 Pulmão 11 (21,2%) 6 (16,7%) 5 (31,3%) Osso 6 (11,5%) 6 (16,7%) 0 Pulmão e osso 6 (11,5%) 4 (11,1%) 2 (12,5%) Outros 1 (1,9%) 0 1 (6,3%) Tamanho do tumor < 12cm 21 (40%) 19 (52,8%) 5 (31,3%) 0,2243 > 12cm 29 (56%) 16 (44,4%) 10 (62,5%) Não informado 2 (4%) 1 (2,8%) 1 (6,3%) Seguimento Remissão 24 (46%) 21 (58,3%) 3 (18,8%) Fisher* Óbito 26 (50%) 13 (36,1%) 13 (81,3%) 0,0076 Recaída 1 (2%) 1 (2,8%) 0 Perda 1 (2%) 1 (2,8%) 0

4.2 Análise de sobrevivência em relação à resposta (necrose) à quimioterapia

Para a análise de sobrevivência, excluímos 3 pacientes, 2 deles com tumor

em localização axial, e um poliostótico, para esses tipos de variáveis não

influenciarem nas curvas de sobrevida.

41

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Geral (n=49)

SOB

REVI

VÊN

CIA

CUM

ULAT

IVA

(%)

MESES Figura 4 - Curva de Sobrevida Global para o total de pacientes

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Geral (n=49)

PRO

BAB

ILID

AD

E LI

VRE

DE

EVE

NTO

S

MESES Figura 5 - Curva de Sobrevida livre de Doença para o total de pacientes

42

4.2.1 Análise de sobrevivência, em relação a presença ou não de metástase ao

diagnóstico

Quando comparamos a influência da presença de metástase ao diagnóstico

com a sobrevida global, observa-se que pacientes com metástase no momento do

diagnóstico têm uma sobrevida significativamente menor que os pacientes sem

metástase (p=0,0004) – Figura 6.

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Sem Metástase (n=34)Com Metástase (n=15)

P=0.0004

FUN

ÇÃO

DE

SO

BREV

IVÊN

CIA

MESES Figura 6 - Curva de sobrevida global em relação à presença ou não de metástase ao diagnóstico

Quando analisamos a influência da presença de metástase ao diagnóstico

com a sobrevida livre de eventos, observa-se que pacientes com metástase no

momento do diagnóstico têm mais chance de recidivar que os pacientes sem

metástase (p=0,0229) – Figura 7.

43

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Sem Metástase (n=34)Com Metástase (n=15)

P=0.0229

PR

OB

ABIL

IDA

DE

LIVR

E D

E EV

EN

TOS

MESES Figura 7 - Curva de sobrevida livre de eventos em relação à presença ou não de metástase ao diagnóstico

4.2.2 Análise de sobrevivência, em relação à resposta (necrose) à quimioterapia

Quando se correlaciona a sobrevida dos pacientes em relação ao grau de

resposta pós quimioterapia, observa-se que os pacientes respondedores (graus III e

IV) tiveram maior sobrevida global que os não respondedores (Figura 8).

44

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

GI e II (n=33)GIII e IV (n=17)

P=0.006

FUN

ÇÃO

DE

SOB

REV

IVÊN

CIA

MESES Figura 8 - Curva de sobrevida global em relação à resposta pós quimioterapia

4.3 Análise imuno-histoquímica – c kit

Em 52 pacientes com osteossarcomas, consideramos positivos aqueles com

positividade citoplasmática forte (++ e +++) e/ou de membrana em mais de 10 % das

células neoplásicas (tabela 12). Vale ressaltar que aqueles casos com positividade

citoplasmática fraca (1 +) em mais de 10% das células neoplásicas foram

considerados negativos. Também, todos os casos com positividade citoplasmática

forte, exibiam expressão em mais de 10% das células neoplásicas.

Tabela 12 – Distribuição dos pacientes com osteossarcoma, segundo a expressão

do ckit

c-kit N % Positivo 24 46,15 Negativo 28 53,85 Total 52 100

45

Apesar de graficamente observarmos que os tumores que expressaram o c-kit

tiveram pior sobrevida global e livre de eventos, esses valores não foram

estatisticamente signficativos (Figuras 9 e 10).

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Escores de KIT= 0 e 1 (n=19)

Escores de KIT= 2 e 3 (n=15)

P=0,3292

FUN

ÇÃO

DE

SOB

REV

IVÊN

CIA

MESES Figura 9 – Curva de Sobrevida global de pacientes com tumores de extremidades, sem metástases ao diagnóstico, comparando com a imunoexpressão do ckit

46

0 20 40 60 80 1000

20

40

60

80

100

Escores de KIT= 0 e 1 (n=19)Escores de KIT= 2 e 3 (n=15)

P=0,1819

PRO

BABI

LIDA

DE

LIVR

E D

E EV

ENTO

S

MESES Figura 10 – Curva de Sobrevida livre de eventos, de pacientes com tumores de extremidades, sem metástases ao diagnóstico, comparando com a imunoexpressão do ckit

Quando comparamos a expressão do ckit com o tipo de cirurgia e o subtipo

histológico, não encontramos correlação significativa (tabelas 13 e 14).

Tabela 13 – Correlação da imunoexpressão do ckit com o tipo de cirurgia

Tipo de Cirurgia KIT Conservadora Amputação

0 e 1 22 4 2 e 3 21 2

Teste de Fisher P=0,6707.

47

Tabela 14 – Correlação da imunoexpressão do ckit com o subtipo histológico

Tipo Histológico KIT Osteoblástico Outros

0 e 1 15 10 2 e 3 13 7


Pacientes ckit positivos têm pior resposta à quimioterapia (graus de necrose I

e II) que pacientes ckit negativos (tabela 15).

Tabela 15 – Correlação da imunoexpressão do ckit com o grau de resposta à

quimioterapia

KIT Necrose

0 e 1 2 e 3 Total GI e GII 14 19 33 GIII e GIV 13 4 17 Total 27 23 50

Teste de Fisher P=0,0355 (significante).

Apesar de não estatisticamente significante, houve maior número de casos

positivos nos tumores maiores que 12 cm (tabela 16).

Tabela 16 – Correlação da imunoexpressão do ckit com o tamanho do tumor

Tamanho do tumor KIT >12cm <12cm

0 e 1 13 14 2 e 3 16 7


Quando selecionamos pacientes não metastáticos ao diagnóstico, e

correlacionamos a imunoexpressão do ckit com a presença de metástase durante o

seguimento, não encontramos correlação dos pacientes com a expressão da

48

proteína e o desenvolvimento da metástase, ou seja, quando um paciente tem

expressão do ckit, a chance de ele ter metástase não é estatisticamente diferente

daquele paciente que não teve expressão da proteína (tabela 17).

Tabela 17 – Correlação da imunoexpressão do ckit com o desenvolvimento de

metástase durante o seguimento

Metástase na evolução KIT Sim Não

0 e 1 5 14 2 e 3 5 10

Teste de Fisher P=0,7176. 4.4 Ensaios de proliferação celular

As figuras 11 e 12 mostram os resultados do ensaio de proliferação celular.

As células que foram diretamente expostas ao MI mostraram uma diminuição na

proliferação estatisticamente significativa nas dosagens de 1000Mol, 100Mol,

0.1Mol, 0.01Mol e 0.001Mol quando comparadas ao grupo controle (valor de p

de < 0,0005). Não sabemos, no entanto, porque nas dosagens de 10Mol e 1Mol,

não houve inibição estatisticamente significativa.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Control 1000 µM 100 µM 10 µM 1 µM 0.1 µM 0.01 µM 0.001 µM

VARIAÇÃO DA DOSE DE CONCENTRAÇÃO

O.D

(565

nm

)

MG-63

*

*

Figura 11 - Demonstração gráfica dos ensaios de proliferação celular após o uso do Mesilato de Imatinibe

49

E. de Proliferação Controle 1000 µM 100 µM 10 µM 1 µM 0.1 µM 0.01 µM 0.001 µM

0,768 0,253 0,452 0,688 0,647 0,641 0,665 0,489

0,781 0,278 0,546 0,816 0,708 0,613 0,632 0,549

0,68 0,251 0,552 0,725 0,619 0,607 0,503 0,465

0,68 0,247 0,553 0,689 0,64 0,634 0,525 0,444

0,688 0,218 0,517 0,661 0,655 0,711 0,572 0,46

0,689 0,21 0,524 0,73 0,812 0,665 0,637 0,509

0,789 0,189 0,543 0,67 0,633 0,671 0,618 0,48

0,616 0,196 0,518 0,69 0,638 0,632 0,623 0,559

0,697 - 0,482 0,65 0,637 0,6 0,559 0,576

0,631 - - 0,588 0,573 0,602 0,592 0,603

0,6 - - 0,419 0,58 - 0,574 0,528

- - - - - - 0,622 -

Média 0,692636 0,23025 0,520778 0,666 0,649273 0,6376 0,5935 0,514727

desvio padrão 0,064343 0,031495 0,034296 0,099527 0,064906 0,035796 0,048324 0,052181

estatística em comparação ao controle

9,26E-13 1,07E-06 0,46469 0,131258 0,027571 0,000401 6,68E-07

Sig. Sig. Sig. Sig. Sig.

Figura 12 – Ensaios de proliferação da linhagem celular MG 63 (24h), com diferentes dosagens (1000uM - 0.001uM) do Mesilato de Imatinibe

4.5 Ensaios de invasão celular

A quantidade de células da linhagem celular MG63 que invadiram a

membrana basal sem MI em cada um dos ensaios foi de 350, 300 e 250, média de

300 com desvio padrão de 50.

Com a adição de MI na dosagem de 50 Mol, a quantidade de células que

invadiram foi de 8, 5 e 12, média de 8,33 com desvio padrão de 3,51. Esta diferença

foi estatisticamente significante (p=0,000545). Os resultados estão expostos na

figura 13 e na tabela 18.

50

Não houve alteração na morfologia celular.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

CONTROLE MESILATO DE IMATINIBE

NÚ

MER

O D

E CÉ

LULA

S IN

VA

SORA

S

MG-63

Figura 13 - Demonstração gráfica do ensaio de invasão celular, com e sem Mesilato de Imatinibe

Tabela 18 - Resultado do ensaio de invasão celular

Ensaios de invasão 1 2 3 Avg. Std. T-Test Controle 350 300 250 300 50 0,000545 Sig. Imatinib Mesylate 8 5 12 8,33 3,51

50 µM (p = 0.0005)

51

5 DISCUSSÃO

Os relatos no sucesso do tratamento dos GISTs com o Mesilato de Imatinibe,

uma droga inibidora da tirosina-quinase no domínio do receptor c-kit, estimularam o

desenvolvimento de estudos que tentam correlacionar alterações nesse gene com

uma possível contribuição na carcinogênese dos osteossarcomas, e

consequentemente, se tentar mais um tipo de tratamento para essa neoplasia.

Apesar de sabermos que para se tentar correlacionar fatores prognósticos com uma

neoplasia, se faz necessária seleção aleatória de um grande número de casos, os

trabalhos existentes na literatura exibem poucos casos, assim como o nosso, visto

que os osteossarcomas são tumores raros, sendo difícil selecionar grande número

de pacientes com casuística homogênea.

Portanto, há certa dificuldade em comparar nossos achados com os da

literatura, pela falta de padronização existente tanto para a seleção dos pacientes,

como para avaliar a imunoexpressão dessa proteína.

Como a grande maioria dos trabalhos da literatura que pesquisaram o ckit em

outros tumores sólidos, consideraram positivos os casos que se coram como os

GISTs, resolvemos então considerar positivos os casos com imunoexpressão forte e

difusa da proteína, tanto citoplasmática como em membrana. Dos nossos 52

pacientes, encontramos positividade citoplasmática forte e/ou membranosa em 24

pacientes (46,15%). Ressaltamos que em 6 casos houve positividade forte de

membrana, e em todos eles, houve também forte expressão citoplasmática. Smithey

e colaboradores, nos seus 18 pacientes, encontraram em 15 casos (83%), a

expressão da proteína, sendo que em 7 deles (39%), relatam que a expressão foi

moderada a forte e difusa, o que se compara aos nossos achados, pois não

consideramos positivos os casos que tiveram imunoexpressão fraca da proteína.

Eles encontraram positividade maior no citoplasma (12 dos 15 casos), sendo que em

2 casos houve positividade só em membrana e em um caso, positividade em

citoplasma e membrana.

Entz Werle et al (2005) encontraram 32 casos positivos, de um total de 56

casos (57%), quantificando os casos positivos em cruzes (+= fracamente positivos;

++=moderadamente positivos; +++= fortemente positivos), com um cutoff de 10%.

Portanto, esses autores consideraram positivos qualquer expressão citoplasmática

52

em mais de 10 % das células tumorais, inclusive aqueles casos que coraram o

citoplasma fracamente. Não relatam sobre encontrar positividade em membrana.

Já Sulzbacher et al (2007) encontraram uma porcentagem menor de células

positivas (20%); no entanto, esses autores contaram 500 células aleatoriamente,

avaliando a porcentagem de expressão delas considerando positivas aquelas

células que coraram semelhante ao GIST. Encontraram a expressão do ckit variando

entre 5% a 90% (média-5,9% e desvio padrão de 16,74%). Relataram ainda que a

expressão da proteína era na sua grande maioria citoplasmática, sendo a

positividade em membrana focal.

Nos GISTs, a expressão do receptor c-Kit é difusa citoplasmática e mais de

50% dos casos mostram reatividade em pontos no citoplasma (o chamado padrão

do tipo Golgi) (Fletcher et al, 2002). Além disto, não existem estudos que se

preocupam com os diferentes padrões de imunorreação (citoplasmática ou na

membrana celular) no GIST. Diante do exposto acima, optamos por considerar

positivos todos os casos que expressaram o receptor c-Kit difusamente,

independente da localização da reação.

Todos os nossos pacientes foram submetidos ao mesmo protocolo

quimioterápico e apenas 2 deles eram de localização axial e um poliostótico.

Quando correlacionamos com as curvas de sobrevida global e livre de eventos,

esses 3 pacientes foram excluídos da análise. Apesar de estatisticamente não

significante, as curvas de sobrevida global e livre de eventos parecem ser diferentes

entre os pacientes c-kit positivos e os que não expressaram a proteína. Talvez um

número maior de pacientes poderia esclarecer a questão.

Entz Werle et al (2005) também encontraram em 56 pacientes tendência

daqueles que superexpressaram o c-kit a terem sobrevida pior. Seus pacientes eram

todos pediátricos, submetidos a um mesmo protocolo de tratamento quimioterápico

(protocolo francês OS94). Vale ressaltar que esses autores, na sua casuística inicial,

descrevem 10 pacientes (14,70%) de 68 pacientes metastáticos ao diagnóstico.

Desses 68 pacientes, fizeram imuno-histoquímica em 56, mas não relataram

quantos desses últimos eram metastáticos ou não ao diagnóstico.

Wei et al (2008) encontraram forte correlação entre a expressão do c-kit com

recorrência local e sobrevida global. Não encontraram correlação entre a

positividade da proteína com subtipo histológico e tipo de procedimento cirúrgico.

Chamaram atenção, algumas diferenças na casuísta e metodologia desse trabalho.

53

Os pacientes não fizeram quimioterapia pré-operatória, sendo todos submetidos

primeiro ao tratamento cirúrgico e depois a quimioterpia adjuvante e radioterapia.

Sabe-se que os osteossarcomas não são radiossensíveis, o que nos faz questionar

o efeito do tratamento nesses pacientes. A localização óssea do tumor primário não

é citada. Em relação à imuno-histoquímica, o anticorpo usado por eles, é o único que

difere do usado na literatura para osteossarcoma. Além disso, quando descreveram

os seus resultados, relataram que em 25 dos casos houve expressão do c-kit. No

entanto, quando discorreram sobre a expressão da proteína e a correlação com

parâmetros clínicos e de sobrevida, esses autores descreveram que em 24

pacientes observaram baixa expressão e em 16 pacientes, forte expressão da

proteína, o que somando, são 40 pacientes, ou seja, sua casuística inteira, como se

houvesse 100% de expressão.

O grau de resposta à quimioterapia, o tamanho do tumor e a sobrevida, são

parâmetros que se correlacionam entre si em muitos trabalhos na literatura.

(Quintana, 1991; Petrilli, 1991, Bielack 2002; Petrilli, 2006; Kim, 2008). Em 50

pacientes, encontramos que aqueles com superexpressão da proteína apresentaram

uma pior resposta à quimioterapia. Na literatura, o único trabalho que correlacionou

a expressão do ckit com necrose pós quimioterapia foi o de Sulzbacher et al (2007),

e esses autores não encontraram correlação entre essas duas variáveis. Eles

também não encontraram correlação da imunoexpressão do ckit com idade, sexo,

localização, sobrevida livre de evento e sobrevida global. Para avaliar o grau de

necrose pós quimioterapia, utilizaram o sistema de Salzer-Kuntschik et al (1983), e

concluíram que em osteossarcomas, o ckit não tem correlação com o prognóstico

dos pacientes. No entanto, vale ressaltar que apesar do grande número de

pacientes (100), a casuística é pouco homogênea, o paciente mais velho tinha 62

anos, além de 15 pacientes (15%) exibirem localização axial. Há ainda o fato desses

100 pacientes terem sido submetidos a 4 tipos diferentes de protocolos

quimioterápicos.

Em 50 pacientes estudamos o tamanho do tumor, e encontramos tendência

de tumores maiores que 12cm apresentarem imunoexpressão do c-kit. Até o

momento, o nosso é o único trabalho que correlacionou o tamanho do tumor com a

imunoexpressão do c-kit. Há na literatura vários trabalhos relatando que tumores

grandes respondem pouco à quimioterapia, sendo este último o único parâmetro

histológico de valor prognóstico comprovado até o momento. Cumpre novamente

54

ressaltar que houve correlação na nossa casuística entre a resposta à quimioterapia

e a expressão do c-kit, tornando ainda mais interessante explorar a tendência

encontrada da associação do ckit com o tamanho da neoplasia. Não podemos deixar

de considerar que, se a nossa casuística fosse maior, esses valores se poderiam se

tornar significantes.

Ressaltamos ainda que três trabalhos (Sulzbacher et al, 2007; Entz–Werle et

al, 2007 e Wei et al, 2008) pesquisaram também a mutação genética nos casos que

expressaram c-kit e não encontraram nenhum tipo de alteração nos genes. Entz

Werle et al (2005), por sua vez, estudaram ainda o ‘status’ do locus do gene kit, o

4q12. Em um total de 68 pacientes, analisaram os alelos desses genes e

encontraram anormalidade nesses alelos em 39% dos pacientes. Desses 68

pacientes, fizeram imuno-histoquímica em 56, e encontraram correlação significativa

entre a expressão da proteína e a alteração alélica. Quando correlacionaram essas

alterações alélicas com curvas de sobrevida global e livre de eventos, encontraram

tendência desses pacientes em evoluírem pior, assim como a terem pior resposta à

quimioterapia. Em um estudo mais aprofundado, esses mesmos autores em 2007,

estudaram qual alteração alélica acontecia nessa população e também a existência

ou não de mutação nesse gene. Encontraram que havia uma amplificação desses

genes em 47% dos pacientes, e essa amplificação estava fortemente correlacionada

com a imunoexpressão do c-kit.

Como nenhum dos trabalhos na literatura encontrou mutação semelhante

àquelas encontradas nos GISTs, em osteossarcomas, e o objetivo maior de se tentar

descobrir essa mutação é saber se esses tumores respondem ao tratamento com o

Gleevec, resolvemos estudar, através de cultura de células de osteossarcomas, a

capacidade de inibição da proliferação e a capacidade de invasão das células

tumorais in vitro pelo Gleevec.

A concentração máxima da droga no sangue de pacientes recebendo 1000

mg/dia via oral de MI é de 10Mol, sendo esta, a dosagem máxima tolerada

reportada em ensaios clínicos. Na dose de 1000 mg/dia, a concentração sérica de

MI varia de 6 a 10Mol (Druker, 2002). De acordo com os ensaios clínicos, o atual

tratamento para o GIST é de 800 mg/dia de MI (Candelaria et al, 2005).

Utilizamos diferentes dosagens para inibir a proliferação da linhagem celular

MG 63 de osteossarcoma humano, e demonstramos, que houve diminuição,

estatisticamente significante, na proliferação celular dessas células com o MI,

55

mesmo em baixas doses. Yoshitani et al (2003) que estudaram a capacidade do

Gleevec de inibir a proliferação celular em 3 linhagens celulares de osteossarcomas

de ratos, conseguiram inibição na dosagem de 10Mol (1000 mg/dia), ou seja, na

dosagem máxima tolerada.

O efeito do MI na capacidade de invasão das células de osteossarcomas

nunca foi estudado antes. Os ensaios de invasão são importantes para demonstrar a

habilidade das células em atravessar uma membrana basal, simulando a saída das

células do tumor primário, assim como a implantação das células no sítio de

metástase. O uso de uma membrana basal artificial pode estudar a capacidade de

invasão das células em resposta a drogas, através da contagem da quantidade de

células capazes de invadir a camada matrigel. As células tumorais têm de possuir

habilidades invasivas para que a metástase possa ocorrer. As metástases dos

osteossarcomas ocorrem comumente nos pulmões. Nosso estudo demonstrou que o

MI diminuiu a capacidade de invasão da linhagem celular MG 63 apenas em altas

doses (50Mol), não conseguindo inibir a invasão na dose máxima tolerada

(10Mol).

Há na literatura, um único trabalho que estudou o uso do Gleevec em

pacientes com Osteossarcomas. Bond et al (2008) usaram o MI como única droga,

em pacientes com menos de 30 anos de idade e com neoplasias sólidas refratárias

ou recorrentes, dentre elas, pacientes portadores de Osteossarcomas. A dose

utilizada foi de 440mg/m2 o que equivale à dose de 750-800 mg em adultos. Esses

autores também dosaram a concentração plasmática do MI no oitavo dia de terapia,

que em média foi de 6 Mol. Nenhum dos pacientes teve a pesquisa do kit por

imuno-histoquímica ou PCR. Não houve melhora dos pacientes com o uso do MI. No

nosso trabalho, o MI inibiu a proliferação celular em dosagens de 1000, 100, 0.1,

0.01 e 0.001Mol, ou seja, valores muito inferiores ao utilizado na terapêutica atual

para os GISTs e LMC. Sabendo que a recaída tumoral, em osteossarcoma, é fator

de piora significativa no prognóstico desses pacientes, resultados pouco expressivos

utilizando o Gleevec como droga única na terapia desse grupo de pacientes, não

podem servir como exclusão dessa droga para pacientes portadores de

osteossarcomas. Nosso estudo mostrou que osteossarcomas humanos expressam

fortemente o ckit, e que in vitro, o MI inibe a proliferação de células tumorais de

osteossarcomas. Isso comprova que, de alguma forma, o kit está envolvido na

56

carcinogênese do osteossarcoma, e que, talvez, como droga associada, o MI pode

ser útil na terapêutica dessa neoplasia.

No nosso trabalho, aqueles pacientes que expressaram o ckit, não tiveram

maior chance de desenvolverem metástases durante o seguimento, que os

pacientes ckit negativos (tabela 17). Já in vitro, o MI não foi capaz de inibir a invasão

celular em baixas doses ou doses habituais, mas sim em altas doses. Isso nos faz

pensar que provavelmente, o desenvolvimento da metástase esteja correlacionado a

outros fatores, e que o kit tenha pouca ou nenhuma relação na progressão tumoral.

57

6 CONCLUSÕES

1 - Osteossarcomas humanos expressam fortemente o c-kit e esta expressão

caracteriza um grupo de pacientes maus respondedores à quimioterapia.

2 - A alta expressão do c-kit em tumores virgens de tratamento, sua

correlação com o grau de necrose à quimioterapia e a capacidade do MI de inibir a

proliferação de células de osteossarcomas in vitro, nos faz considerar que o kit

esteja envolvido na carcinogênese do osteossarcoma, podendo o MI ser opção

terapêutica, associado à quimioterapia neodajuvante, nos pacientes portadores de

osteossarcomas.

3 - Nos pacientes não metastáticos ao diagnóstico, não houve diferença

estatística na capacidade de fazer metástase, entre aqueles que expressaram ou

não o kit e isso se correlacionou aos ensaios in vitro, onde o MI não inibiu, nas doses

habituais toleradas, a capacidade de invasão das células de osteossarcoma. Esses

dados indicam que o kit, provavelmente, não está relacionado à progressão da

doença.

58

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SEM 0 3 6 9 12 AVALIAÇÃO AVALIAÇÃO CIRURGIA INICIAL CDDP AD IFO CDDP AD IFO PRÉ-CIRÚRGICA DOxO DOxO

ANEXO A - PROTOCOLO BRASILEIRO OSTEOSSARCOMA 2000

GRUPO BRASILEIRO COOPERATIVO DE TRATAMENTO DE TUMORES ÓSSEOS (GBCTTO) 1999 Protocolo de Osteossarcoma – Não Metastático Tempo total = 24 semanas

RNM ou TC local e tórax, cintilografia, Raio-X local e tórax, HMG completo, TGO, TGP, Fosfatase alcalina, DHL, Clearance creatinina, patologia, genética, audiometria, aval. cardíaca, banco de tumor; BTF,U, Cr, bioquímico (Na,k,Mg,Ca)

Ortopedia (consulta)

Audiometria/ Aval. cardíaca (S5)

Ciclo I – pré-operatório

RNM ou TC local e tórax, cintilografia, Raio-X local e tórax, HMG completo, TGO, TGP, Fosfatase alcalina, DHL, Clearance creatinina, audiometria, aval. cardíaca (S11)

AVALIAÇÃO Patologia e Genética

SEM 15 18 21 24

AVALIAÇÃO CDDP AD IFO CDDP AD IFO FINAL DOxO DOxO

Audiometria/ Aval.cardíaca (S20)

Ciclo II – pós-operatório

RNM ou TC local e tórax, cintilografia, Raio-X local e tórax, HMG completo, TGO, TGP, Fosfatase alcalina, DHL, Clearance creatinina, audiometria, aval. cardíaca(S27-28).

DROGA DOSE DIÁRIA DOSE TOTAL / m2 CDDP 60 mg/m2 D1, D2 = 120 mg/m2 x 4 480 mg/m2 DOXO 40 mg/m2 D1, D2 = 80 mg/m2 x 4 320 mg/m2 IFO 2,7 g/m2 D1 – D5 = 13,5 g/m2 x 4 54 g/m2 MESNA 600 mg/m2 hora 0, 3, 6 e 12 2,7 g / m2 / dia

Obs.: hora 12 Mesna tabletes via oral (opcional)

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COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA Data: 14-04-2009 06:19:06

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO/HOSPITAL SÃO PAULO id = 1732

IImo(s). Sr(a). Pesquisador(a) LUCIANA NAKAO ODASHIRO MIIJI Co-Investigadores: Antonio Sergio Petrilli; Disciplina/Departamento ANATOMIA PATOLÓGICA da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo Patrocinad or BANCO DO BRASIL E FINEP

São Paulo, 27 de Março de 2009

CEP 0369/09

CARTA DE APROVAÇÃO E PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA INSTITUCIONAL

Ref: Projeto de pesquisa intitulado: 'Correlação Clínico-Anátomo-Patológica e Imunoexpressão do c-Kit em Osteossarcomas Humanos'

ÁREA TEMÁTICA ESPECIAL: Não há necessidade de envio à CONEP para análise

CARACTERISTICA DO ESTUDO: Retrospectivo - material estocado e estudo in vitro com cultura de células

RISCO PACIENTE: Sem risco, sem contato com paciente

OBJETIVOS: Carcterizar a imunoexpressão do c-kit em espécimes de pacientes pediátricos portdores de osteossarcomas. Correlacionar a imunoexpressão do c-kit com subtipo histológico, graus de necrose pós quimioterapia, tamanho do tumor, sobrevida global e recaída da doença. Avaliar o efeito do mesilato de Imatinibe na proliferação das células de osteossarcomas, através de ensaios de proliferação celular. Avaliar o efeito do Mesilato de Imatinibe na capacidade de invasão das células do osteossarcoma, através de ensaios de invasão.

RESUMO: A amostra será constituída de 52 pacientes com osteossarcomas acompanhados no instituto de Oncologia Pediátrica/GRAACC-UNIFESP que foram submetidos a tratamento segundo o protocolo brasileiro Osteossarcoma 2000, no período 2000 e 2005. Serão avaliados os seguintes aspectos clínicos: idade, sexo, localização óssea, tipo de tratamento cirúrgico realizado, presença de metástase ao diagnóstico e evolução clínica até dezembro de 2008. Será realizada análise anátomopatológica de lâminas coradas por HE e método imuno-histoquímico para o anticorpo CD117, avaliando-se: subtipo histológico, grau de necrose e expressão de c-kit. Será realizado um estudo com cultura celular da linhagem MG-63 de osteossarcoma, realizando o ensaio de invasão in vitro na presença de mesilato de imatinibe, para determinação da habilidade de invasão celular e ensaios de proliferação celular.

FUNDAMENTAÇÃO RACIONAL: Nos últimos anos, muito se tem estudado sobre os mecanismos de ação dos fatores de crescimento e seus receptores nas neoplasias malignas. O Mesilato de Imatinib ou Glivec é um inibidor específico, estruturalmente semelhante a tirosino-quinase, c-kit, que tem se mostrado eficaz em Leucemias mielódes crônicas e tumores estromais do trato gatrointestinal.

MATERIAL E METODO: Estão descritos os procedimentos, não havendo contato com paciente. Apresenta autorização para utilização do material estocado, bem como justificativa da impossibilidade de obtenção do termo de consentimento.

TCLE: Não se aplica

DETALHAMENTO FINANCEIRA: Banco do Brasil e Finep

CRONOGRAMA: 4 anos

OBJETIVO ACADÊMICO: Doutorado

PRIMEIRO RELATÓRIO PREVISTO PARA: 01/04/2010, os demais relatórios deverão ser entregues ao CEP anualmente até o termino do estudo

O Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo ANALISOU e APROVOU o projeto de pesquisa referenciado. 1. Comunicar toda e qualquer alteração do projeto e termo de consentimento livre e esclarecido. Nestas circunstâncias a inclusão de pacientes deve ser temporariamente interrompida até a resposta do Comitê.

Rua Botucatu, 572 - 1º andar - conj 14. CEP 04023-062 - São Paulo / Brasil

Tel.: (011) 5571-1062 - 5539 - 7162

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COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA Data: 14-04-2009 06:19:06

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO/HOSPITAL SÃO PAULO id = 1732

2. Comunicar imediatamente ao Comitê qualquer evento adverso ocorrido durante o desenvolvimento do estudo. 3. Os dados individuais de todas as etapas da pesquisa devem ser mantidos em local seguro por 5 anos para possível auditoria dos órgãos competentes.

Atenciosamente,

Prof. Dr. José Osmar Medina Pestana Coordenador do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo

Rua Botucatu, 572 - 1º andar - conj 14. CEP 04023-062 - São Paulo / Brasil Tel.: (011) 5571-1062 - 5539 - 7162

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ANEXO C – DETALHAMENTO DA AMOSTRA

BIOPSIA ckit DT_NASC IDADE DT_INCLU DIAGN SEXO TU_PRIM T_CRG DT_CRG GNECRO TAMANHO TIPO HISTOLÓGICO FEZ_TOR N_NOD RECAIDA DT_RECAI B00 14042 negativo 04/11/83 17 30/05/00 Não Metastático Feminino Outros Cons/Ressec 28/08/00 GI < 12cm sem informação Não Não B00 14477 negativo 06/06/92 7 30/05/00 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 08/12/00 GI < 12cm osteoblástico Sim 0 Sim 26/08/02 B00 17387 1+ 11/05/88 12 20/06/00 Não Metastático Feminino Tíbia Cons/Endo 22/11/00 GIII < 12cm osteoblástico Não Não B00 17965 1+ 12/03/84 16 17/07/00 Não Metastático Masculino Tíbia Cons/Endo 09/11/00 GIV > 12cm condroblástico Não Não B00 28182 1+ 06/11/81 18 31/10/00 Metastático Masculino Tíbia Amputação Pré 18/10/06 NA N_Aval osteoblástico Sim 6 Sim 11/06/02 B00 30447 negativo 06/10/85 15 26/10/00 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 11/04/01 GIII > 12cm condroblástico Sim 1 Não B00 32947 2+ 27/03/90 10 08/11/00 Metastático Feminino Tíbia Amputação 11/04/01 GI > 12cm osteoblástico Sim 6 Não B00 32768 negativo 12/12/84 16 08/11/00 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 09/05/01 GIV < 12cm osteoblástico Não Sim 15/01/02 B01 282 negativo 14/05/82 18 10/01/01 Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 25/07/01 GI > 12cm osteoblástico Não Não B01 902 3+ 14/07/80 20 23/01/01 Metastático Masculino Tíbia Cons/Endo 07/08/01 GI < 12cm telangiectásico Sim 2 Sim 25/07/03 B01 6922 2+ 06/04/91 9 04/04/01 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 15/08/01 GI > 12cm osteoblástico Não Sim 05/01/02 Pulmonar + ÓsteoB01 25763 1+ 02/08/85 16 24/09/01 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Placa+Enx 27/02/02 GIII < 12cm osteoblástico Não Não B01 26299 1 + 29/01/91 10 03/09/01 Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 18/04/02 GI > 12cm condroblástico Sim 21 Não B01 27281 2+ 16/08/84 17 05/09/01 Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 06/03/02 GIV > 12cm osteoblástico Sim 4 Não B01 35350 2+ 08/04/85 16 01/11/01 Não Metastático Masculino Úmero Cons/Endo 20/03/02 GI > 12cm osteoblástico Não Sim 10/09/02 Pulmonar + ÓsteoB01 37773 1+ 13/04/84 17 28/11/01 Não Metastático Masculino Tíbia Cons/Endo 08/05/02 GIV > 12cm osteoblástico Não Não B01 39699 1+ 16/05/96 5 04/12/01 Não Metastático Masculino Fêmur Amputação 26/04/02 GIII < 12cm osteoblástico Não Sim 28/03/03 B01 40536 1+ 21/08/87 13 18/12/01 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 10/04/02 GI > 12cm condroblástico Não Não B02 1602 1+ 24/01/84 17 29/01/02 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 10/07/02 GII < 12cm osteoblástico Não Não B02 1601 1+ 14/07/86 15 04/02/02 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 24/07/02 GI > 12cm condroblástico Sim 3 Não B02 5615 negativo 28/08/87 14 27/02/02 Metastático Feminino Tíbia Cons/Endo 07/08/02 GII > 12cm condroblástico Sim 7 Sim 15/02/03 Pulmonar + ÓsB02 9837 1+ 22/09/86 15 03/04/02 Metastático Masculino Tíbia Cons/Placa+Enx 14/08/02 GI < 12cm condroblástico Sim 3 Sim 27/06/03 Pulmonar + ÓsB02 33647 1+ 22/01/90 12 16/10/02 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 26/03/03 GI > 12cm condroblástico Não Sim 13/06/03 Pulmonar + ÓsB02 36966 1+ 28/06/84 18 28/11/02 Não Metastático Masculino Tíbia Cons/Endo 26/02/03 GIII < 12cm osteoblástico Não Não B02 40052 1+ 05/04/81 21 13/12/02 Não Metastático Feminino Tíbia Amputação 10/04/03 GI > 12cm fibroblástico Não Não B03 2173 2+ 19/07/89 13 11/02/03 Metastático Feminino Múltiplos Óssos Amputação 02/07/03 GI > 12cm osteoblástico Sim 1 Não B03 3600 1+ 08/10/78 24 26/02/03 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 11/06/03 GIV > 12cm osteoblástico Não Sim 01/02/05 Pulmonar + ÓsteoB03 5534 2+ 22/11/89 14 13/03/03 Não Metastático Feminino Tíbia Cons/Placa+Enx 18/07/03 GII < 12cm osteoblástico Não Não B03 3404 2+ 03/07/96 6 13/03/03 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Placa+Enx 23/07/03 GI > 12cm condroblástico Não Sim 13/11/07 B03 6040 3+ 07/03/93 10 31/03/03 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 30/07/03 GI < 12cm osteoblástico Não Sim 16/06/04 B03 8701 2+ 25/05/82 20 30/04/03 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 13/08/03 GI < 12cm osteoblástico Sim 4 Sim 08/03/05 B03 11617 2+ 16/08/87 16 15/05/03 Metastático Masculino Tíbia Amputação 04/06/03 GI > 12cm pequenas células Sim 2 Sim 03/08/04

80

B03 19124 2+ 03/05/88 15 18/08/03 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 26/11/03 GIII > 12cm osteoblástico Não Sim 15/02/05 B03 20894 3+ 17/03/92 11 25/08/03 Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 11/02/04 GI > 12cm condroblástico Sim 3 Sim 10/05/05 B03 20686 1+ 06/12/97 5 28/08/03 Não Metastático Feminino Ilíaco Amputação 26/03/04 GIV < 12cm sem informação Não Sim 06/08/04 B03 23313 3+ 12/04/88 15 16/09/03 Não Metastático Masculino Rádio Cons/Placa+Enx 18/12/03 GIV > 12cm osteoblástico Não Não B03 32016 (VER) 2+ 17/12/81 21 15/12/03 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 24/03/04 GII > 12cm osteoblástico Não Sim 22/02/05 B03 33338 2+ 09/09/91 12 29/12/03 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Placa+Enx 31/03/04 GI < 12cm osteoblástico Não Sim 12/03/05 B04 7073 1+ 03/05/90 13 07/04/04 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 18/08/04 GIII < 12cm osteoblástico Não Não B04 10885 negativo 23/12/74 29 21/05/04 Metastático Masculino Fêmur Amputação 22/09/04 GII < 12cm osteoblástico Sim 2 Não B04 10282 2+ 26/02/91 13 24/05/04 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 08/09/04 GII > 12cm sem informação Sim 2 Não B04-11591 negativo 07/11/75 28 25/05/04 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 06/10/04 GI > 12cm osteoblástico Não Sim 18/12/05 B04 11592 1+ 25/03/90 14 25/05/04 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Placa+Enx 26/08/04 GIV < 12cm telangiectásico Não Não B04 17959 2+ 27/07/85 19 18/08/04 Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 21/02/05 GII < 12cm sem informação Não Não B04 21170 2+ 18/08/90 14 16/09/04 Metastático Masculino Úmero Cons/Endo 13/01/05 GI > 12cm condoblástico Sim 20 Sim 02/08/05 B04 20141 1+ 02/07/91 13 02/09/04 Não Metastático Masculino Tíbia Cons/Endo 08/12/04 GIII > 12cm osteoblástico Não Não B04 22897 2+ 16/10/89 15 13/10/04 Não Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 28/02/05 GIII > 12cm osteoblástico Não Não B04 26212 2+ 05/05/97 7 22/11/04 Metastático Feminino Fêmur Cons/Endo 18/04/05 GI > 12cm condoblástico Sim 6 Sim 06/09/05 B05 7660 2+ 19/11/86 18 20/04/05 Não Metastático Masculino Fêmur Cons/Endo 08/08/05 GI > 12cm sem informação Não Não B05 14177 3+ 14 15/04/05 Não Metastático Feminino Tíbia Cons/Endo S Info S. Info sem informação Não Não B05 19327 negativo 03/10/81 23 05/09/05 Metastático Feminino Úmero Cons/Endo 28/11/05 GI < 12cm sem informação Sim 4 Não B05 21884 3+ 21/03/86 19 19/09/05 Não Metastático Masculino Tíbia Cons/Endo 19/12/05 GII > 12cm fibroblástico Sim 2 Sim 20/09/07

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ANEXO D - FOTOS DE IMUNO-HISTOQUÍMICA

Figura 14 - Osteossarcoma – Imuno-expressão do ckit 400X – padrão citoplasmático e de membrana (seta).

Figura 15 - Osteossarcoma – Imuno-expressão do ckit 400X – padrão citoplasmático e de membrana (seta).

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Figura 16 - Linhagem celular MG-63 corada por imuno-histoquímica para o ckit (400x).

IMUNOEXPRESSÃO DO c-KIT EM OSTEOSSARCOMAS … · CLÍNICOS E TESTES IN VITRO Tese apresentada à...

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