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ROSEANE LEANDRA DA ROSA
INVESTIGAÇÃO PRÉ-CLÍNICA SOBRE O
POTENCIAL GASTROPROTETOR DOS FRUTOS DE
Chrysopyllum cainito L. E DAS CASCAS DOS FRUTOS
DE Plinia edulis (Vell.) Sobral
Itajaí (SC)
2017
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ROSEANE LEANDRA DA ROSA
INVESTIGAÇÃO PRÉ-CLÍNICA SOBRE O
POTENCIAL GASTROPROTETOR DOS FRUTOS DE
Chrysopyllum cainito L. E DAS CASCAS DOS FRUTOS
DE Plinia edulis (Vell.) Sobral
Tese submetida à Universidade do Vale
do Itajaí como parte dos requisitos para a
obtenção do grau de Doutor em Ciências
Farmacêuticas
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de
Andrade
Co-orientador: Profª. Drª. Luisa Mota da
Silva
Itajaí (SC)
Outubro, 2017
Dedicatória
Dedico este trabalho a minha família, pelo apoio e
compreensão em todos os momentos, minha
fortaleza para continuar sempre. Em especial para
Dionei Alves dos Santos, companheiro fiel de
estudos e viagens
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos, que de uma maneira ou outra se fizeram
presentes contribuindo e auxiliando na realização deste trabalho,
especialmente a Deus, pois sem ele, nada disso seria possível:
Ao Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade, pela orientação, por ser um
profissional de respeito que por esses anos (mestrado e doutorado),
acompanhou e incentivou meu crescimento profissional;
A Profa. Dra. Luisa Mota da Silva (melhor co-orientadora), pelos
sábios ensinamentos, pela dedicação ao estudo e por estar presente em todos
os momentos;
Ao Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho, doutoranda Camila Leandra
Bueno de Almeida, Dra Luciane Ângela Nottar Nesello e Dra Adriana
Campos pelo fornecimento dos extratos, pela troca de informações,
conhecimentos e pelo apoio para plena realização deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz e Profa Dra. Marcia Maria de
Souza pelas contribuições fornecidas ao longo da elaboração deste trabalho
e pelos ensinamentos nas disciplinas lecionadas;
Aos técnicos dos laboratórios de farmacologia in vivo e in vitro,
Rafael Conde, Viviane Steimbach e Samanta Santos. Também a pós
doutoranda Priscila Souza pelo apoio, pelas dicas e dedicação, sempre
prontos a ajudar;
Aos colegas de mestrado e doutorado Thaise Boeing, Lincon S.
Bordignon, Luisa Bolda Mariano, Joanna Sievers e demais alunos de
iniciação científica dos cursos do Centro de Ciências da Saúde pelo auxílio
e pela companhia na realização dos testes no laboratório de farmacologia,
sempre com muito bom humor, amenizavam as dificuldades e obstáculos;
Aos colaboradores e à coordenação do Programa de Doutorado em
Ciências Farmacêuticas da UNIVALI, Prof. Dr. Clóvis Rodrigues, Juliano
dos Santos e Helenize Heyse Moreira;
A minha família, ao meu pai Alcediles e minha mãe Terezinha, a
minha irmã Rosangela, e as minhas sobrinhas Raissa e Vitória pelo carinho,
suporte e apoio, por compreenderem a minha ausência. Ao Dionei Alves
dos Santos, por fazer parte dessa caminhada, me apoiando, compartilhando
as horas intermináveis de leitura, pela paciência e compreensão na minha
ausência, por estar comigo nesta etapa;
Muito obrigada!
EPÍGRAFE
Tudo o que um sonho precisa para ser realizado é
alguém que acredite que ele possa ser realizado.
Roberto Shinyashiki
INVESTIGAÇÃO PRÉ-CLÍNICA SOBRE O
POTENCIAL GASTROPROTETOR DOS FRUTOS DE
Chrysopyllum cainito L. E DAS CASCAS DOS FRUTOS
DE Plinia edulis (Vell.) Sobral
Roseane Leandra da Rosa
Outubro/2017
Orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor.
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Bioativas.
Número de Páginas: 157.
Chrysophyllum cainito L. (Sapotaceae), popularmente conhecido como
abiu-roxo e Plinia edulis (Vell.) Sobral (Myrtaceae), conhecida como
cambucá, são frutos silvestres comestíveis, com interessante composição
química e atividades biológicas. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar
o efeito gastroprotetor dos extratos metanólicos das cascas (EMC), semente
(EMS) e polpa (EMP), dos frutos de C. Cainito (3, 10 e 30 mg/kg) e do
extrato metanólico das cascas dos frutos de Plinia edulis (EMCP, 10, 30 e
100 mg/kg), e de dois terpenoides isolados do EMCP, o ácido maslínico
(AM, 1, 3 e 10 mg/kg) e o ácido ursólico (AU, 0,1, 0,3, 1 e 3 mg/kg). Em
paralelo, o efeito antiúlcera do suco e da farinha obtidos dos frutos de C.
cainito também foi avaliado. As menores doses gastroprotetoras do EMC,
EMS e EMP contra a ação ulcerogênica do etanol/HCl foram 3, 3 e 10
mg/kg, respectivamente. Neste modelo, ambos os extratos aumentaram a
secreção de mucinas. A administração intraperitoneal de EMC (0,3 mg/kg),
EMS (0,3 mg/kg) e EMP (1 mg/kg) também promoveu gastroproteção
contra o etanol/HCl. Em adição, EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) e EMP
(10 mg/kg) reduziram a úlcera gástrica induzida por indometacina em
camundongos em 78%, 70% e 50%, respectivamente. Em relação ao modo
de ação dos extratos dos frutos de C. cainito, o efeito gastroprotetor do
EMC foi alterado pela pré-administração de N-etilmaleimida (NEM, 10
mg/kg, i.p), glibenclamida (10 mg/kg, i.p), indometacina (10 mg/kg, i.p) e
ioimbina (10 mg/kg, i.p); o EMS diminui efeito gastroprotetor mediante
pré-administração de NEM, glibenclamida, N-Nitro-L-arginina metil ester
(L-NAME, 70 mg/kg, i.p) e ioimbina (10 mg/kg, i.p); enquanto que o EMP
teve o efeito gastroprotetor reduzido em animais pré-tratados com NEM (10
mg/kg, i.p) e L-NAME. Todavia, os extratos dos frutos de C. cainito não
reduziram parâmetros da secreção ácida gástrica, mas aumentaram os níveis
de muco aderido à mucosa gástrica de camundongos submetidos à ligadura
pilórica. Adicionalmente, a ração suplementada com a farinha do fruto C.
cainito (10%), mas não o suco, também demonstrou potencial
gastroprotetor, evidenciando o fruto de C. cainito como promissor alimento
com propriedade funcional. Este trabalho também avaliou a eficácia
gastroprotetora do EMCP e dos triterpenos AM e AU, seus efeitos in vitro
na atividade da enzima H+, K
+-ATPase e no sequestro do radical livre
estável DPPH. O EMCP e o AU, mas não o AM, apresentaram atividade
sequestradora de radicais livres no teste de DPPH, reduzindo os níveis do
radical em 78,66 e 60,14% na concentração de 100 µg/mL. Ainda, os
resultados confirmaram o efeito gastroprotetor do EMCP, AM e AU
administrados pela via oral ou intraperitoneal. O AU foi capaz de promover
gastroproteção contra o etanol acidificado em doses menores que o AM,
aumentando os níveis de mucina em 692%, entretanto não alterou a
atividade da H+, K
+-ATPase. Todavia, tanto o EMCP e o AM nas
concentrações de 10 e 100 µg/ml inibiram a atividade da H+, K
+-ATPase.
De forma interessante, o favorecimento de mecanismos protetores da
mucosa foi evidenciado entre os diferentes, porém complementares, modos
de ação dos extratos de C. cainito. Em relação a Plinia edulis, concluiu-se
que o extrato metanólico das cascas do fruto das P. edulis possui atividade
gastroprotetora, em similaridade a infusão das folhas dessa espécie. Porém,
não é possivel propor o mesmo mecanismo de ação para os triterpenos
isolados.
Palavras-chave: Frutos silvestres. Alimento funcional. Antiúlcera
PRE-CLINICAL RESEARCH ON THE
GASTROPROTECTIVE POTENTIAL OF FRUITS OF
Chrysopyllum cainito L. AND FRUIT PEEL OF Plinia
edulis (Vell.) Sobral
Chrysophyllum cainito L. (Sapotaceae), popularly known as star apple and
Plinia edulis (Vell.) Sobral (Myrtaceae), known as cambuca, are edible wild
fruits with interesting chemical composition and biological activities. The
objective of this work was to evaluate the gastroprotective effect of the
methanolic extracts of the peels (MEPe), seeds (MESe) and pulp (MEPu) of
fruits of C. cainito (3, 10 and 30 mg/kg), of the methanolic extract of peels
from P. edulis fruits (MEPPE, 10, 30 and 100 mg/kg), and two terpenoids
isolated from MEPPE; maslinic acid (MA, 1, 3 and 10 mg/kg) and ursolic
acid (UA, 0.1, 0.3, 1 and 3 mg/kg). Meanwhile, the antiulcer effect of juice
and flour obtained from the fruits of C. cainito was also evaluated. The
lowest gastroprotective doses of MEPe, MESe and MEPu against the
ulcerogenic action of ethanol/HCl were 3, 3 and 10 mg/kg, respectively. In
this model, both extracts increased mucin secretion. Intraperitoneal
administration of MEPe (0.3 mg/kg), MESe (0.3 mg/kg) and MEPu (1
mg/kg) also promoted gastroprotection against ethanol/HCl. In addition,
MEPe (3 mg/kg), MESe (3 mg/kg) and MEPu (10 mg/kg) reduced
indomethacin-induced gastric ulcer in mice by 78%, 70% and 50%,
respectively. In relation to the mode of action of extracts of C. cainito fruits,
the gastroprotective effect of MEPe was altered by pre-administration of N-
ethylmaleimide (NEM, 10 mg/kg, ip), glibenclamide (10 mg/kg, ip,
Indomethacin (10 mg/kg, ip) and yohimbine (10 mg/kg, ip); MESe
decreases the gastroprotection effect by pre-administration of NEM,
glibenclamide, N-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 70 mg/kg, i.p)
and yohimbine (10 mg/kg, i.p); while the gastroprotective effect of MEPu
was reduced in animals pretreated with NEM or L-NAME. However, C.
cainito fruit extracts did not reduce parameters of gastric acid secretion, but
increased levels of mucus adhered to the gastric mucosa of mice submitted
to pyloric ligation. In addition, the diet supplemented with C. cainito fruit
flour (10%), but not juice, also promoted a gastroprotective action,
evidencing the fruit of C. cainito as a promising functional food. This work
also evaluated the gastroprotective efficacy, the in vitro effects on H+, K
+ -
ATPase activity, and the free radical DPPH scavenging activity of MEPPE,
MA and UA. MEPPE and UA, but not MA, showed free radical scavenging
activity in the DPPH test, reducing free radical levels by 78.66 and 60.14%
at 100 μg/mL. Furthermore, the results confirmed the gastroprotective effect
of MEPPE, MA and UA by the oral or intraperitoneal routes. UA was able
to promote gastroprotection against acidified ethanol at lower doses than
MA, increasing mucin levels by 692%, but did not alter the activity of H+,
K+ -ATPase. However, both MEPPE and MA at 10 and 100 μg/ml inhibited
the activity of H+, K
+ -ATPase. Together, the data confirmed the antiulcer
effect of the extracts from C. cainito fruit and the extract of the peel from P.
edulis fruit in different experimental models. Moreover, the gastroprotective
effects of C. cainito fruit flour supplementation were also confirmed.
Interestingly, the favoring of mucosal protective mechanisms was
evidenced among the different but complementary modes of action of C.
cainito extracts. In relation to P. edulis, it was concluded that the
methanolic extract of P. edulis fruit peels has a gastroprotective activity,
similar to the infusion of leaves of this species. However, it is not possible
to propose the same mechanism of action for the isolated triterpenoids. But,
it is possible that MA, but not UA, inhibits gastric acid secretion through
inhibition of the proton pump, and that UA exerts gastroprotection by
strengthening the mucus barrier adhered to the gastric mucosa via increased
mucin production.
Key Words: Wild fruits. Functional food. Antiulcer
LISTA DE ABREVIATURAS
AA – Ácido ascórbico
ABTS (2,2’- azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido-sulfônico)
ACh - Acetilcolina
ALFAC- 85 partes de álcool etílico 80%, 10 partes de formaldeído 40% e 5
partes de ácido acético gácial
AM – Ácido maslínico
AINES – Anti-inflamatório não esteroidal
AMPc – Adenosina 3’,5'-monofosfato cíclico
AMPK - Proteína quinase ativada por adenosina monofosfato
ANOVA – Análise de variância ATC
ATP – Trifosfato de adenosina
AU- Ácido ursólico
CAT – Catalase
CBX - Carbenoxolona
CCK-A – Colecistoquinina A
CCK-B - Colecistoquinina B
CONCEA – Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
COX – Cicloxigenase
DNA – Ácido desoxirribonucleico
DPPH – 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
ECL – Células enterocromafins
EC50 – Concentração do fármaco que induz metade do efeito máximo
EMC – extrato metanólico da casca do fruto C. cainito
EMS – extrato metanólico da semente do fruto C. cainito
EMP – extrato metanólico da polpa do fruto C. cainito
EMPC – extrato metanólico da casca do fruto P. edulis
eNOS – Óxido nítrico sintase endotelial
GO – Glutationa oxidase
GPx – Glutationa peroxidase
GSH – Glutationa reduzida
GSSH – Glutationa oxidada
GST - Glutationa S-transferase
GR – Glutationa redutase
H+, K+ ATPase – Bomba hidrogênio, potássio adenosina trifosfatase
H2 – Receptor de histamina tipo 2
IBPs – Inibidores da bomda de prótons
IL-6 – Interleucina 6
IL-1β – Interleucina 1 beta
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
i.p – via intraperitoneal
L-NAME - N-nitro L-arginina metil éster
MK 801 – Dizocilpina, antagonista do receptor de N-metil-D-aspartato
NEM – N-metil-maleimida
NMDA – N-metil-D-aspartato
NO – Óxido nítrico
NIQFAR – Núcleo de Investigaçõs Químico Farmacêuticas da Univali
NPY – Neuropeptídeo Y
Ome - Omeprazol
OMS – Organização mundial da Saúde
PAS - Ácido periódico de Schiff
PGE2 – Prostaglandina E2
PGC1 - proteínas co-ativadoras reguladores de transcrição
PGI2 – Prostaciclina I2
Pi – Fosfóro inorgânico
PIV – Peptídeo intestinal vasoativo
PPAR – Receptor ativado por proliferador de peroxissoma
ROS – Espécies reativas de oxigênio
SOD – Superóxido dismutase
TGI – Trato gastrointestinal
TRH – Hormônio liberador de tirotropina
TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa
Vei - Veículo
v.o – via oral
5-HTP – 5 - Hidroxitriptamina
SUMÁRIO
CAPÍTULO I ............................................................................................. 21 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 23 2 OBJETIVOS ........................................................................................... 27 2.1 Objetivo Geral ..................................................................................... 27 2.2 Objetivos específicos ........................................................................... 27 CAPÍTULO II ........................................................................................... 29
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA……..........................................................29
3 O ESTÔMAGO ...................................................................................... 31 3.1 Constituição anatômica e histológica do estômago ........................... 31 3.2 A secreção ácida gástrica .................................................................... 35 3.3 Fatores de proteção da mucosa gástrica............................................ 36 3.4 Fatores de agressão da mucosa gástrica ............................................ 45 4 ÚLCERA PÉPTICA .............................................................................. 47 4.1 Farmacoterapêutica da úlcera péptica .............................................. 48 5 FRUTOS SILVESTRES ........................................................................ 52 5.1 Frutos e atividade gastroprotetora .................................................... 53 5.2 Chrysophyllum cainito L. .................................................................... 55 5.3 Plinia edulis (Vell.) Sobral .................................................................. 57 CAPÍTULO III .......................................................................................... 65 Chrysophyllum cainito: um fruto silvestre com atividade
gastroprotetora em modelos experimentais ............................................ 67 CAPÍTULO IV ........................................................................................ 105 Evidências experimentais da atividade gastroprotetora dos triterpenos
isolados da casca dos frutos de Plinia edulis: ácidos maslínico e ursólico
.................................................................................................................. 105
CAPÍTULO V ..................................................................................... 131
CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................. 131
REFERÊNCIAS……………………………...……………145
21
CAPÍTULO I
Introdução e Objetivos
22
23
1 INTRODUÇÃO
A abordagem de que os alimentos poderiam ter a capacidade de
prevenir e de tratar doenças surgiu há mais de 2.500 anos. Hipócrates já
declarava: “Faça do seu alimento seu medicamento”. Em meados de 1920 o
isolamento de componentes dos alimentos e experimentos clínicos e
laboratoriais para comprovar a eficácia dos alimentos funcionais foram
iniciados (WILDMAN, 2001). De acordo com a Portaria nº 398, de 30 de
abril de 1999, da Secretaria de Vigilância Sanitária (ANVISA) foi
estabelecido que alimento funcional é “todo aquele alimento ou ingrediente
que, além das funções nutricionais básicas, quando consumido na dieta
usual, produz efeitos metabólicos e/ou fisiológicos e/ou benéficos à saúde,
devendo ser seguro para consumo”.
Estudos epidemiológicos e nutricionais sugerem que um maior
consumo de alimentos in natura, como frutas e hortaliças, reflete em uma
menor incidência de doenças crônicas, como problemas coronários,
cardíacos, cânceres, doenças neurodegenerativas e úlceras gástricas
(GESCHER et al., 1998; LI et al., 2016; NESELLO et al., 2017). Neste
contexto, pesquisas que busquem conhecer melhor a composição nutricional
e os fitoconstituintes presentes nestes alimentos têm ganhado destaque na
comunidade científica (BALIGA et al., 2011; DENG et al., 2013; LI et al.,
2014).
O interesse nos fitoconstituintes ocorre, entre outras razões, devido
ao potencial antioxidante desses compostos, os quais são biologicamente
produzidos para combater o estresse oxidativo experimentado pelo
organismo vegetal em decorrência de diferentes fatores do ambiente natural
(LOBO et al., 2010; LI et al., 2016). Desta forma, o potencial farmacológico
de diversos compostos de origem natural tem sido descrito para o
tratamento e/ou prevenção de várias doenças crônicas etiologicamente
associadas à exacerbada produção de espécies reativas de oxigênio ou ao
detrimento das defesas antioxidantes tissulares (FORBES-HERNANDEZ et
al., 2014; HUANG; ZHANG; CHEN, 2016).
Dentre as desordens associadas ao dano oxidativo, a úlcera péptica
ganha destaque, afetando cerca de 10 a 15% da população mundial
(PANGUIGAN et al., 2014). É evidenciada como um problema de saúde
pública, onde algumas de suas complicações, como hemorragia e
perfuração, ainda são causas importantes de morbimortalidade
24
(RAMAKRISHNAN; SALINAS, 2007; KOMEN et al., 2008; SUNG et al.,
2010). A úcera gástrica é caracterizada como lesão profunda na parede
estomacal envolvendo toda a espessura da mucosa e penetrando através da
camada muscular (TARNAWSKI, 2005).
Segundo Laine, Takeuchi e Tarnawski (2008) a úlcera gástrica
resulta de um desequilíbrio entre agentes protetores (barreira de muco,
secreção de muco, regeneração celular, produção de prostaglandinas) e
agentes agressores (secreção de ácido e pepsina) da mucosa gástrica. O
tratamento para esta patologia é classicamente realizado com o uso de
fármacos antissecretores, incluindo os antagonistas dos receptores do tipo 2
da histamina (cimetidina, ranitidina, famotidina e nizatidina), e os inibidores
da bomba de prótons (omeprazol, lanzoprazol, pantoprazol, rabeprazol e
esomeprazol).
É fato que esta última classe de fármacos, inibidores da bomba de
prótons, é mais eficaz na inibição da secreção do ácido gástrico e
frequentemente bem tolerada, porém em tratamento prolongado está
associada à efeitos colaterais como hiperplasia em células enterocromafins
(secretoras de histamina), hipersensibilidade, arritmia, impotência,
ginecomastia e desordens hematopoiéticas (SHEEN;
TRIADAFILOPOULOS, 2011). Além disso, são fármacos que atuam
predominantemente minimizando os fatores lesivos da mucosa, não
determinando a cicatrização do tecido, que em muitos casos, apresenta
recidivas da lesão, podendo desencadear consequências mais graves no trato
gastrointestinal como perfuração e sangramentos (TUNDIS et al., 2008).
Associada ao uso de medicamentos, a alimentação se torna um
fator relevante no tratamento das desordens gástricas, pois, quando
adequada às necessidades e sintomas de cada indivíduo pode auxiliar na
recuperação e manutenção do estado nutricional deste, atuando na redução
da secreção gástrica, na promoção do esvaziamento gástrico adequado e na
diminuição de efeitos colaterais dos medicamentos e da interação entre eles,
além de manter a hidratação corporal estável (FLOCH, 2007).
Neste cenário, há um grande interesse em terapias alternativas
como o uso de produtos naturais, especialmente os derivados de espécies
vegetais para o tratamento de úlceras gástricas (KLEIN et al., 2012;
ROZZA et al., 2015). Com isso, mediante pesquisas iniciais do Núcleo de
Investigações Químicas Farmacêuticas (NIQFAR) evidenciou-se que os
fruto de Chrysoplhyllum cainito (C. cainito) e Plinia edulis (P. edulis),
25
caracteristicamente silvestres, representam espécies com potencial atividade
biológica antiúlcera.
Os frutos da espécie C. cainito, nativos da América Central, apesar
de serem caracteristicamente silvestres, também são cultivados em todo o
Caribe, América Central e partes da América do Sul, representando uma
fonte econômica a comerciantes locais (MORTON, 1987; PARKER et al.,
2010). Seus frutos são globosos, a polpa com sabor agradável e doce, sendo
consumido também na forma de geléia e bebibas (PINO; MARBOT;
ROSADO, 2002).
A P. edulis é nativa do Brasil, endêmica da Mata Atlântica,
podendo ser encontrada do Rio de Janeiro até o Rio Grande do Sul, onde
também são cultivadas (LORENZI et al., 2006). Produz frutos comestíveis,
grandes e amarelados com sabor semelhante ao da jabuticaba, podendo ser
viabilizados para utilização em preparações da indústria alimentícia
(DONATO; MORRETES, 2013).
26
27
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito gastroprotetor dos extratos metanólicos da casca,
polpa e semente dos frutos de C. cainito, bem como do suco e da farinha
obtidos deste fruto. Da mesma forma, avaliar o potencial gastroprotetor da
casca dos frutos de P. edulis e de dois fitoconstituintes isolados deste fruto,
o ácido maslínico e ursólico.
2.2 Objetivos específicos
a) Preparar os extratos metanólicos da casca, da polpa e semente
dos frutos de C. cainito, bem como obter a farinha e o suco desse fruto;
b) Obter o extrato metanólico da casca dos frutos de P. edulis e
realizar o isolamento do ácido maslínico e ácido ursólico;
c) Avaliar o potencial gastroprotetor e antissecretor ácido gástrico,
dos extratos metanólicos da casca, polpa e semente dos frutos de C. cainito
e possíveis mecanismos envolvidos no efeito observado;
d) Avaliar o potencial gastroprotetor da farinha e do suco dos
frutos de C. cainito;
e) Avaliar o potencial gastroprotetor do extrato metanólico da
casca de P. edulis e dos triterpenos isolados, ácido maslínico e ácido
ursólico e descrever possíveis mecanismos envolvidos nos efeitos
observados.
28
29
CAPÍTULO II
Revisão Bibliográfica
30
31
3 O ESTÔMAGO
3.1 Constituição anatômica e histológica do estômago
O trato gastrointestinal (TGI) tem como principal função, a
digestão e absorção dos nutrientes, proporcionando energia para
manutenção das funções do organismo (MERCHANT, 2007; SCHUBERT;
PEURA, 2008), sendo o estômago um órgão de fundamental importância
nesse processo (TYTGAT, 2011).
Considerado um reservatório, o estômago é uma dilatação do canal
alimentar que segue ao esôfago e continua no intestino. Possui formas e
volumes variáveis que dependem da particularidade da anatomia de cada
indivíduo, sendo o mais comum possuir a forma de “J”. Anatomicamente o
estômago é dividido em quatro regiões: cárdia, fundo, corpo e antro, além
de conter dois esfíncteres (cárdia e piloro) (Figura 1), tendo capacidade
aproximada de 1200 mililitros (FLOCH, 2007; SCHUBERT; PEURA,
2008).
Figura 1. Anatomia do estômago.
Fonte: Adaptado de http://www.infoescola.com/sistema-digestivo/estomago/
Antro
32
Histologicamente, o estômago é constituído por quatro camadas, a
mucosa, a submucosa, a muscular e a serosa. Na mucosa estão presentes
diversas células responsáveis pela produção do suco gástrico, as quais se
diferem de acordo com o tipo secreção, sendo, a secreção parietal composta
por ácido clorídrico e fator intrínseco e a secreção não parietal, também
denominada secreção péptica, composta por muco, bicarbonato, sódio,
potássio e pepsinogênio (HAUBRICH; SCHAFFNER; BERK, 1995;
CALABUIG; RELLOSO; CUBERO, 2009).
Para a produção do suco gástrico, o estômago possui dois tipos
principais de glândulas tubulares secretoras, as glândulas oxínticas ou
gástricas e as glândulas pilóricas. As glândulas oxínticas, mais abundantes,
estão localizadas no fundo e no corpo do estômago e são compostas por
diferentes células com funções variadas, podendo ser dividas em quatro: as
células principais que são as responsáveis pela secreção do pepsinogênio,
precursor da enzima proteolítica pepsina, que é ativada mediante a presença
de ácido clorídrico; as células mucosas, responsáveis pela secreção do muco
e do bicarbonato, fatores protetores da mucosa (MEJIA; KRAFT, 2009).
Ainda, as células parietais, reguladas também por
neurotransmissores, que secretam ácido clorídrico e fator intrínseco
(responsável pela absorção da vitamina B12) (MEJIA; KRAFT, 2009;
SCHUBERT; PEURA, 2008), e as células endócrinas que secretam aminas
bioativas e hormônios pépticos, fazendo parte do sistema neuroendócrino
difuso são distribuídas como células enterocromafins (secretoras de
histamina), células secretoras de gastrina (célula G) e as células secretoras
de somatostatina (células D), que possui efeito inibitório as demais
secreções endócrinas e parácrinas (CALABUIG; RELLOSO; CUBERO,
2009; PALOMO, BENAVIDES, 2010).
As glândulas pilóricas, que se situam no antro do estômago, são
constituídas também por células mucosas, por células D e ainda por células
G, as quais quando estimuladas libertam o hormônio gastrina, principal
responsável pela secreção ácida gástrica (Figura 2) (MEJIA; KRAFT, 2009;
SCHUBERT; PEURA, 2008).
33
Figura 2. Tipos de células da mucosa gástrica e suas funções
Fonte: http://arquivobioqui.com.br/2015/11/atividade-das-celulas-secretoras-da.html
A atividade motora gástrica tem como principais funções o
armazenamento de grandes quantidades de alimentos, até que possam
finalizar sua digestão e serem absorvidos no duodeno, e a mistura desses
alimentos com as secreções gástricas até formar o quimo e o esvaziamento
do quimo para o intestino delgado (YAKABI; KAWASHIMA; KATO,
2008). Este é um evento complexo, que envolve a interação entre vias
neurais, hormonais e neuromusculares, sendo determinadas pelo
funcionamento coordenado de dois principais compartimentos, estômago
proximal e distal (AMÉRICO et al., 2010).
A distribuição das refeições na porção distal e proximal do
estômago é denominada distribuição intragástrica de uma refeição (DIR),
iniciando após a ingestão do alimento presente na região proximal,
aumentando seu tônus e o redistribuindo para a parte distal a medida que há
esvaziamento gástrico (AMÉRICO et al., 2010). Os padrões de motilidade
do estômago são específicos de cada região, onde o fundo e a cárdia
(regiões de marcapasso) geram contrações tônicas, mantidas durante
minutos ou horas, e o corpo distal e antro possuem atividade motora fásica,
com ciclos de contração e relaxamento que duram apenas alguns segundos
(SILVERTHORN, 2008; PALOMO; BENAVIDES, 2010).
34
Diversos fatores influenciam na movimentação para digestão no
TGI, sendo alguns deles: sexo, idade, osmolalidade e densidade calórica da
refeição. Todavia, de maneira geral, o esvaziamento gástrico acontece,
quando o estômago está repleto e diminui o tamanho do fundo, dando
origem às contrações sistólicas do antro terminal, que influenciarão no
processo de esvaziamento e dependerão da distensão do duodeno ou jejuno,
da ação da gastrina no estímulo da motilidade antral, da pressão do esfíncter
esofagiano, da diminuição da motilidade gástrica e do relaxamento do
piloro, que promoverão estímulos irritantes, assim como a liberação da
enterogastrona que promoverá a acidificação do duodeno (HAUBRICH;
SCHAFFNER; BERK, 1995; FLOCH, 2007).
Além desses fatores, para o esvaziamento gástrico há também a
influência dos fatores emocionais, como estresse e tensão no momento da
alimentação. Assim, considerando a quantidade de alimento consumido, o
qual determinará o volume alimentar gástrico e consequentemente a
velocidade de esvaziamento, atenta-se para a alteração da distensão da
parede o que causará a excitação da bomba pilórica e inibição do piloro.
Com forte atuação da gastrina, que aumentará a atividade desta bomba
produzindo mais secreção de suco gástrico altamente ácido (HAUBRICH;
SCHAFFNER; BERK, 1995; FLOCH, 2007).
Ainda, conforme mencionado, diferentes substâncias endógenas
desempenham papel na motilidade gástrica, onde em resumo, podem ser
agrupadas de acordo com seu efeito dominante na contratilidade do músculo
liso, tendo efeito estimulante a gastrina, acetilcolina (ACh), colecistocinina
(CCK), motilina, substância P, 5-Hidroxitriptamina (5-HT), o hormônio da
liberação de gastrina (bombesina) e TRH (hormônio liberador de
tireotrofina) (HANSEN, 2003; SASAKI et al., 2003). E efeito inibidor:
secretina, glucagon, peptídeo intestinal vasoativo (PIV), encefalina, CGRP
(péptido que regula o gene da calcitonina), NPY (neuropeptídeo Y),
neurotensina, NO e somatostatina (HANSEN, 2003), as quais regulam a
motilidade através de sua ação em neurotransmissores, agindo em
receptores de dopamina tipo 2, receptores 5-HT e opioides presentes no
plexo mioentérico (SASAKI et al., 2003).
35
3.2 A secreção ácida gástrica
A secreção gástrica é fundamental para que o estômago
desempenhe seu papel fisiológico, é um processo contínuo e complexo, em
que múltiplos fatores centrais e periféricos contribuem para uma meta
comum: a secreção de hidrogênio (H+) pelas células parietais, sendo
constituída também por água, ácido gástrico, mucina, ânions, cátions,
enzimas, hormônios e fator intrínseco. Esta secreção é responsável pelo
início do processo de digestão da proteína e é produzida em grande
quantidade durante o dia, cerca de 2 litros, ocasionando um grande gasto
energético (HOOGERWERF; PASRICHA, 2006).
Para que aconteça a secreção gástrica, além de células secretoras de
muco que revestem toda a superfície do estômago, a mucosa gástrica conta
com dois tipos importantes de glândulas tubulares: glândulas oxínticas ou
gástricas e as pilóricas, conforme descrito no item acima (BIGHETTI;
ANTÔNIO; CARVALHO, 2002).
Devido a presença de glândulas diferenciadas para secreção
gástrica, o estômago tem característica peculiar, pela quantidade elevada de
ácido clorídrico (HCl), que mantêm o pH entre 0,9 e 2,0, favorecendo a
digestão e impedindo a entrada de micro-organismos. Além de estar
envolvido na absorção do ferro, cálcio, vitamina B12 e digestão de
proteínas, onde a acidez é fundamental para que o pepsinogênio secretado
pelas células mucosas e pépticas seja clivado para formar a pepsina ativa,
que possui atividade proteolítica (SCHUBERT, 2016).
O suco gástrico presente no lúmen estomacal, possui concentração
de íons hidrogênio 3 milhões de vezes maior do que a do sangue arterial e é
formado nos canalículos da célula parietal e conduzido até a extremidade
secretora da célula que, tem como principal força motriz a secreção da
enzima H+, K
+-ATPase (BIGHETTI; ANTÔNIO; CARVALHO, 2002;
CALVO; EGAN, 2015).
A estimulação da célula parietal (Figura 3) para que a bomba H+,
K+ -ATPase seja ativada ocorre em resposta a três sinais neuro-humorais:
ACh - um neurotransmissor liberado pelas terminações nervosas vagais;
gastrina - um hormônio local produzido pelas células G e histamina, um
ativo químico biológico produzido pelas células ECL na parede do
estômago (DACHA et al., 2015).
36
Figura 3. Representação da regulação da secreção ácida gástrica pela célula
parietal.
Fonte: Olbe, Carlsson e Lindberg, 2003
Esta última, a histamina, quando liberada promove a estimulação
das células parietais de forma direta ao se ligar com receptores do tipo 2 da
histamina, os quais são acoplados à proteína G, e quando ativados,
estimulam a adenilato ciclase com geração de adenosina 3’,5'-monofosfato
cíclico (AMPc). E de forma indireta através da sua ligação a receptores H3,
que inibem a secreção de somatostatina (KAZUMORI; ISHIHARA; RUMI,
2004).
As ECL são estimuladas a secretar histamina pelo hormônio
gastrina que é secretado pelas células G e estimulada por proteínas da carne
e outros alimentos proteicos ingeridos e também por substâncias hormonais
secretadas pelo sistema nervoso entérico da parede gástrica (SCHUBERT;
PERUA, 2008).
A gastrina secretada na corrente sanguínea possui diversos graus
de afinidade para os seus receptores. Estão estabelecidos dois tipos:
colecistoquinina (CCK) -A e CCK-B. A gastrina circulante estimula os
receptores de CCK-B na membrana basolateral das células parietais,
37
causando diretamente a secreção de ácido gástrico. A produção e secreção
de gastrina pelas células G podem ser inibidas pela somatostatina, a qual é
secretada a partir de células D presente na mucosa gástrica (DACHA et al.,
2015).
Por fim, a ACh é liberada pela estimulação parassimpática e atua
através de receptpres muscarínicos do subtipo M3 estimulando a secreção de
pepsinogênio pelas células pépticas, de ácido clorídrico pelas células
parietais, e de muco pelas células da mucosa; em comparação a histamina e
gastrina, estimulam fortemente a secreção de ácido pelas células parietais,
mas tem pouco efeito sobre as demais células (CALABUIG; RELLOSO;
CUBERO, 2009; SCHUBERT, 2016).
3.3 Fatores de proteção da mucosa gástrica
Estímulos nocivos ao TGI que podem causar lesões são frequentes
no organismo humano, entre eles estão os fatores endógenos, como a
produção fisiológica do suco gástrico, considerando principalmente HCl e
pepsinogênio, juntamente com as alterações de mucosa provocadas por
estresse com produção de espécies reativas de oxigênio, e os fatores
exógenos, como a ingestão de anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs),
álcool, alimentos em várias temperaturas, infecções por Helicobacter pylori,
lesões relacionadas à isquemia/reperfusão, entre outros (DONG;
KAUNITZ, 2006).
A mucosa gastrointestinal apresenta diversas formas de proteção
em defesa desses fatores de agressão, podendo ser dividida em fatores pré-
epiteliais, epiteliais e sub-epiteliais, onde todos os fatores atuam em
conjunto para prevenir o surgimento de lesões na mucosa (FLEMSTRÖM et
al., 1999; ALLEN; FLEMSTRÖM, 2004).
3.3.1 Fatores pré-epiteliais
O muco, produzido pelas células mucosa e epiteliais, constituído
por 95% de água e 5% de glicoproteínas (mucina), juntamente com o
bicarbonato, produzido nas células epiteliais superficiais e estimulado pelas
prostaglandinas endógenas, óxido nítrico e neurônios aferentes sensíveis à
capsaicina, sendo regulado pelo ácido luminal (ALQASOUMI et al., 2009;
38
LAI et al., 2009), fazem parte da primeira linha de defesa da mucosa
gástrica (Figura 4) (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008).
Figura 4. Esquema ilustrativo dos fatores protetores da mucosa gástrica
Fonte: http://shuangyi.com.mx/Semmedint/Junio07/fisiotubodig.htm
Ambos possuem capacidade de lubrificar e proteger a mucosa das
forças mecânicas da digestão, além de auxiliarem na difusão e neutralização
do ácido luminal contra a autodigestão causada pelo suco gástrico (ALLEN;
FLEMSTRÖM, 2005).
A camada de muco funciona como um gel aderente entre a mucosa
e o lúmen, protegendo-a contra agentes nocivos, agindo como uma barreira
física protetora, além de manter o gradiente de pH próximo a neutralidade,
impedindo danos a mucosa gástrica e facilitando a ação do bicarbonato
(LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008).
O muco é revestido com uma película de surfactante de
fosfolipídios na superfície luminal, criando uma potente barreira de natureza
hidrofóbica, que retarda a difusão de íons de hidrogênio
(LICHTENBERGER, 1999; LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008),
aumentando significativamente a viscosidade e a permeabilidade da camada
de muco, determinando a qualidade protetora da mucina gástrica
(GINDZIENSKI; ZWIERZ; SAROSIEK, 2003)
Ainda, o muco é secretado em todo o TGI mediante estímulo de
hormônios gastrointestinais, como a gastrina e a secretina, por
39
prostaglandina do tipo E2 (PGE2) e agentes colinérgicos (HOOGERWERF;
PASRISCHA, 2006).
O bicarbonato é retido pelo muco, ficando estável junto à camada
de gel aderente, originando um revestimento viscoso e alcalino,
proporcionando um gradiente de pH perto da neutralidade entre o lúmem e
o epitélio gástrico, além de inibir o contato da pepsina com o epitélio do
estômago em virtude da presença de fosfolipídeos hidrofóbicos (LAINE;
TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008).
Além disso, quando o alimento é ingerido as células parietais
liberam íon H+, e simultaneamente transportam o íon bicarbonato pela
membrana basolateral através da troca de Cl-/HCO3
-, resultando em uma
maior disponibilidade de bicarbonato. Também, para cada íon de H+
secretado pela célula parietal, uma molécula de CO2 é convertida em
bicarbonato, provocando alcalinização após a secreção de ácido gástrico
(DONG; KAUNITZ 2006). A secreção de bicarbonato é intensificada pela
ACh liberada dos terminais nervosos próximos às células superficiais
epiteliais (BERNER et al., 2004).
3.3.2 Fatores epiteliais
O fator primário de proteção epitelial tem propriedades intrínsecas
de característica anatômica. As junções fechadas e outras barreiras
intercelulares controlam a passagem de agentes lesivos do lúmem para a
mucosa gástrica, para espaços intersticiais e submucosos. As células
epiteliais são hidrofóbicas e repelem o ácido e os agentes solúveis em água
prejudiciais, devido à presença de fosfolípidos em sua superfície (LAINE;
TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008), além de migrarem até os tecidos
lesionados quando as barreiras gástricas são destruídas gerando morte
celular (TARNAWSKI; AHLUWALIA; JONES, 2013).
A proteção epitelial também envolve fatores bioquímicos, enzimas
que promovem a primeira linha de defesa contra as espécies reativas de
oxigênio, as quais, quando produzidas excessivamente, podem prejudicar o
funcionamento celular afetando sua integridade (KUROSE et al., 1997;
TACHAKITTIRUNGROD; OKONOGI; CHOWWANAPOONPOHN,
2007). As espécies reativas de oxigênico (EROs) causam inflamação e
morte celular, através da modulação de vias de transdução de sinal, afetando
as enzimas redox-sensíveis e fatores de transcrição, além de estimularem a
40
expressão de mediadores inflamatórios e moléculas de adesão (UZUN et al.,
2004).
O estresse oxidativo gerado pelo excesso de EROs no tecido
gástrico contribui para a formação de lesão na mucosa gástrica (TYTGAT,
2011). No entanto, a mucosa possui o próprio ambiente redox no interior
das suas células que impedem os danos oxidativos através da atuação de
moléculas antioxidantes (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006). Esse
sistema antioxidante inclui as enzimas: superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa S-transferase
(GST) (BAYIR, 2005), sendo que a segunda linha de defesa antioxidante
envolve compostos de moléculas químicas de tamanho pequeno, onde estão
incluídas as vitaminas, flavonoides da dieta, carotenoides, ácido úrico e
GSH (CNUBBEN et al., 2001).
Os antioxidantes apresentam a habilidade de quelar radicais livres
protegendo a mucosa gástrica contra ulcerações
(TACHAKITTIRUNGROD; OKONOGI; CHOWWANAPOONPOHN,
2007). Assim, em condições de estresse oxidativo, a SOD atua como um
sistema de defesa intracelular, degradando o ânion superóxido em oxigênio
e peróxido de hidrogênio (Figura 5) (H2O2) (YASUI; BABA, 2006;
CHANDE; BUDINGER, 2007; WEYDERT; CULLEN, 2010).
41
Figura 5. Esquema ilustrativo da formação de EROS e mecanismos
antioxidantes nos sistemas biológicos.
Fonte: https://radicaislivres96.wordpress.com/antioxidantes/
Verifica-se a importância desse sistema também, na atuação da
enzima SOD inibindo a inflamação através da modulação da apoptose dos
neutrófilos (YASUI; BABA, 2006), os quais em processos inflamatórios
liberam ânions superóxido que aumentam ainda mais a infiltração de
neutrófilos (MASINI et al., 2003).
A CAT é uma enzima que metaboliza o H2O2 (formado na reação
com SOD) em água e oxigênio, rapidamente, possuindo um papel protetor
relevante contra os efeitos tóxicos dos peróxidos gerados nos peroxissomos
(SIRAKI et al., 2002).
Ainda há outra via do metabolismo do H2O2, a via depende da
ativação da GPx e da cooperação da glutationa redutase (GR), onde ocorre a
redução do H2O2 em água pela GPx acompanhada da conversão de GSH
para a sua forma oxidada (GSSG) (KWIECIEN et al., 2014).
A GST é um tripeptídeo com atividade antioxidante e propriedade
de cofator enzimático relevante. Constitui a superfamília de isoenzimas que
catalisam a conjugação de compostos eletrofílicos a GSH, produzindo
compostos menos reativos (CNUBBEN et al., 2001).
42
A GSH pode atuar como sequestrador de radicais livres e
substancia tóxicas, participando em muitos aspectos do metabolismo
oxidativo, incluindo remoção de hidroperóxidos, proteção contra radiação
ionizada, manutenção do padrão fisiológico de proteínas sulfidrílicas e
condensação com xenobióticos, auxiliando na sua detoxificação e excreção,
contribuindo para integridade da mucosa (SHIRIN et al., 2001). Reage
rapidamente e de forma não enzimática com o radical hidroxila, com
trióxido nitroso (N2O3) e peroxinitrito (ONOO⁻ ), buscando manter o
equilíbrio redox celular, então o GSSG é exportado das células por
proteínas de transporte dependentes de ATP, demonstrando que em
condições severas de estresses os níveis celulares de GSH diminuem
(CNUBBEN et al., 2001).
Neste ínterim, uma diminuição da atividade da SOD, da CAT e da
concentração de GSH na mucosa gástrica, conforme descrito acima,
contribui para o dano celular (KWIECIEN et al., 2014) por intermédio das
espécies reativas de oxigênio, que induzem a peroxidação lipídica e
aumentam a produção de citoquinas pró-inflamatórias (BINDU;
MAZUMDER; DEY, 2013), condições estas relacionadas com a
patofisiologia de muitas doenças, apresentando o importante papel deste
sistema na manutenção da integridade dos sistemas fisiológicos
(CNUBBEN et al., 2001).
3.3.3 Fatores subepiteliais
Ainda, como fator de proteção, o estômago tem a proteção
subepitelial, que envolve a microcirculação, já que o fluxo sanguíneo
protege a mucosa por assegurar a chegada de oxigênio, nutrientes,
bicarbonato, além de remover substâncias tóxicas. A angiogênese também
atua como um excelente mecanismo de reparo e restauração da rede
microvascular através da formação de novos capilares no local da lesão, a
qual é desencadeada pelo fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF),
e o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e angioproteínas
denominadas fatores de crescimento angiogênicos (TARNAWSKI;
AHLUWALIA; JONES, 2013).
Agindo com protetoras, as células endoteliais dos microvasos
geram potentes vasodilatadores como o óxido nítrico (NO) e prostaciclina
(PGI2), que protegem a mucosa gástrica e se opõem a ação danosa de vários
43
agentes vasoconstritores como os lecoutrienos C4, tromboxano A2 e
endotelina (TULASSAY; HERSZENYI, 2010; MADALOSSO, 2011). O
NO também é responsável por manter a integridade do epitélio gástrico
inibindo a secreção de ácido clorídrico das células parietais. Ambos mantêm
a viabilidade endotelial e previnem a aderência de plaquetas e leucócitos
nas células endoteliais de microvasos, protegendo contra o
comprometimento da microcirculação (WALLACE, 2008; MADALOSSO,
2011).
A manutenção da integridade da mucosa, conta também com a
renovação contínua de células, sendo uma das mais importantes. O epitélio
é renovado a cada 2-4 dias por um sistema bem coordenado de proliferação
das células progenitoras que substituem as células envelhecidas. A
substituição completa do epitélio gástrico geralmente leva 3-7 dias (LAINE;
TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008; TULASSAY; HERSZENYI, 2010).
A geração contínua de PGE2 e PGI2 (Figura 6) é crucial para a
manutenção da integridade da mucosa e proteção contra agentes
ulcerogênicos e necrozantes. Ressalta-se que quase todos os mecanismos de
defesa são estimulados e/ou facilitados pelas PGs, como a inibição da
secreção ácida, estimulação da secreção de muco, bicarbonato e
fosfolipídeos, aumento do fluxo sanguíneo, aceleração da restituição
epitelial e cicatrização da mucosa, além de inibirem a ativação de
mastócitos, leucócitos, aderência plaquetária no endotélio vascular. A
maioria das ações protetoras das PGs na mucosa gástrica é mediada
principalmente por receptores do tipo EP1, já os receptores EP3 e EP4 afetam
a secreção de ácido e muco respectivamente. Quando os níveis superficiais
da defesa da mucosa são insuficientes ou há uma lesão luminal, o próximo
nível de defesa é a resposta inflamatória aguda (KANEKO; HARVEY;
BRUSS, 2008; LAINE; TAKEUCHI; TARNAWSKI, 2008).
44
Figura 6. Esquema ilustrativo da biossíntese de prostaglandinas
As prostaglandinas são sintetizadas mediante estímulos fisiológicos e/ou
patológicos nas membranas celulares. Por ação da fosfolipase A2 o ácido
araquidônico, constituinte normal dos fosfolipídios das membranas, é então
convertido e se torna substrato para duas vias enzimáticas, a das
cicloxigenases (COX-1 e COX-2), as quais então, desencadeiam a síntese
das prostaglandinas e dos tromboxanos. Pela via da COX é gerada a
prostaglandina (PG) H2, que estimula a formação de vários prostanoides,
incluindo diversas prostaglandinas - PGI2, PGD2, PGE2, PGF2 e
tromboxanos (Batlouni, 2009).
Fonte: http://www.vetorial.net/~coriolis/fisio.htm
A somatostatina também pode estar envolvida na defesa da mucosa
gástrica (HOLZER, 2007), reduzindo o peptídeo intestinal vasoativo (VIP,
do inglês: vasoactive intestinal peptide) e os leucotrienos no processo de
vasoconstrição das lesões gástricas, atuando com ações antioxidantes, anti-
inflamatórias e antiapoptóticas (NASSAR et al., 2011). Gyires Toth e
Zadori (2015) verificaram que a administração de etanol absoluto, o qual é
ulcerogênico, diminui consideravelmente os níveis de somatostatina na
mucosa.
Ressalta-se também, a ação protetora de vários neuropeptídeos e
hormônios, como a gastrina, hormônio libertador de tirotropina,
colecistoquinina, estrogênio, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
(CGRP), peptídeo libertador de gastrina, leptina e grelina, que agem contra
danos causados por substâncias corrosivas atribuídas a liberação de
prostaglandinas, NO e ativação dos nervos sensoriais, promovendo a
45
reparação e cicatrização de úlceras (PESKAR; EHRLICH; PESKAR, 2002;
BRZOZOWSKI et al., 2005).
3.4 Fatores de agressão da mucosa gástrica
Os fatores que condicionam ao surgimento de úlceras pépticas
inicialmente são a infeção pela bactéria H. pylori e o uso de AINEs.
Todavia, sabe-se que o tabaco, o álcool e uma dieta rica em alimentos
irritantes como doces, açúcares, refrigerantes e café e o stress, também são
fatores de risco para o desenvolvimento dessa doença. Em tempos
posteriores, o tratamento da úlcera péptica era baseado apenas na
erradicação da bactéria, conduzindo à diminuição da sua prevalência.
Contudo, tem-se verificado a existência de úlceras não associadas a H.
pylori ou AINEs, classificadas como úlceras pépticas de causa idiopática
(ARAKAWA et al., 2012).
A H. pylori é uma bactéria encontrada apenas no epitélio gástrico,
onde os organismos tendem a aglomerar-se à volta das junções entre as
células. A sua interação com o hospedeiro tem um impacto na severidade e
nos resultados clínicos da úlcera (SUZUKI et al., 2012; BLASER;
ATHERTON, 2004). Indivíduos com úlcera duodenal e infetados com a H.
pylori secretam mais ácido e liberam mais gastrina em resposta à ingestão
de alimentos em relação a doentes sem esta infeção (HOPKINS; GIRARDI;
TURNEY, 1996), além disso, esta bactéria tem capacidade de ativação do
sistema imune inato, fatores que induzem as citoquinas proinflamatórias que
ativam a resposta inflamatória na mucosa, de estimular fortemente a
resposta humoral e resposta imune mediada por células (SUGIMOTO;
YAMAOKA, 2009).
Outro agente agressor a mucosa, já bem descrito são os AINEs,
usados excessivamente a nível mundial, possui três efeitos principais,
nomeadamente o efeito anti-inflamatório, efeito analgésico e antipirético.
As ações farmacológicas são idênticas entre os diferentes tipos de AINEs.
Os efeitos adversos associados ao uso desta classe de fármacos é que
causam os efeitos deletérios na mucosa gástrica. Possuem efeitos tópicos
que causam erosões subcutâneas e os efeitos em nível do TGI, que são
comuns e resultam principalmente da inibição da enzima cicloxigenase do
tipo 1 (COX-1) responsável pela síntese de prostaglandinas de forma
constitutiva na mucosa gástrica, que atuam, conforme já descrito, como
46
agentes protetores de mucosa (RAMAKRISHNAN; SALINAS, 2007). Esta
inibição explica o mecanismo dos efeitos dos AINEs no desenvolvimento
de lesões gastrointestinais, tendo como efeitos colaterais desconforto
gástrico, dispepsia, diarreia ou obstipação, náuseas e vómitos, hemorragia
gástrica e ulceração (SOSTRES et al., 2010; TYTGAT, 2011).
Os estudos ainda demonstram a dependência de álcool e nicotina
como fatores de risco no desenvolvimento de úlceras pépticas
(LEVENSTEIN; KAPAN; SMITH, 1997; GOODWIN; STEIN, 2002). O
uso do cigarro tem relação direta na formação, gravidade e recorrência de
úlceras. Dados afirmam que em indivíduos tabagistas, as úlceras são mais
prevalentes e menos propícias à cura, isso porque os cigarros contêm
nicotina, substância que aumenta a probabilidade do aparecimento de
úlceras através do aumento da produção de ácido gástrico no estômago e da
diminuição da proteção do muco nesse local (TYTGAT, 2011;
CARVALHO, 2013).
Os fatores protetores da mucosa alterados pelo uso do tabaco são:
redução da quantidade de bicarbonato no duodeno, dificultando a
neutralização do ácido; diminuição da quantidade dos fatores de
crescimento epiteliais; aumento na produção de EROs nos tecidos, e
redução da atividade da enzima óxido nítrico sintase, que em conjunto com
a presença de radicais livres, resulta na diminuição do fluxo sanguíneo da
mucosa, aumentando o risco de morte celular da mucosa gástrica
(AINSWORTH et al., 1993; LI et al., 2014).
O álcool, exerce um efeito tóxico diretamente sobre o epitélio
gástrico, levando a formação de lesões necróticas por reduzir o muco,
produção de bicarbonato (MASSIGNANI et al., 2009) e aumento na
secreção gástrica, além do importante aumento na produção de espécies
reativas de oxigênio (BERNER et al., 2004). É considerado um dos agentes
que induz mais intensamente a úlcera gerando edema na mucosa,
hemorragia, exfoliação de células subepiteliais e infiltração de células
inflamatórias, contribuindo para vasoconstrição, isquemia e estase na
microcirculação, podendo levar a morte das células gástricas (HIRUMA-
LIMA et al., 2009).
Ainda, destacam-se fatores emocionais, pois, estudos demonstram
que doentes com problemas de ansiedade e distúrbios humorais apresentam
uma maior probabilidade de desenvolvimento de problemas
gastrointestinais, quando comparados com a população geral (HASIN et al.,
47
2005; HEILIGENSTEIN; SMITH, 2006; WAUGH; GRANT, 2006; LI et
al., 2014). De acordo com Rodrigues et al. (2008) a úlcera causada por
estresse está relacionada a distúrbios causados na microcirculação da
mucosa gástrica e redução na produção de muco, assim como, também tem
relação com o aumento na produção de espécies reativas de oxigênio.
4 ÚLCERA PÉPTICA
Envolvida por uma incerteza na área clínica médica, a úlcera
péptica não tem uma etiologia bem compreendida, acredita-se que o sistema
de proteção do estômago se torna ineficiente e a secreção ácida gástrica
passa a agredir a mucosa e o epitélio gerando lesões, inflamações e necroses
na área atingida (FLOCH, 2007).
A úlcera péptica é uma doença do TGI, geralmente crônica e
isolada, quando múltipla, cerca de 5% a 20% dos casos, ocorre
simultaneamente afetando o estômago e o duodeno (LIU; CRAWFORD,
2005). É caracterizada por lesão da mucosa na presença de ácido e pepsina,
como consequência da ação corrosiva resultante da hipersecreção de ácido
gástrico na mucosa (RAMAKRISHNAN; SALINAS, 2007), podendo estar
associada a fatores internos como a genética, patologias infecciosas e/ou
patologias granulomatosas associadas a doenças crônicas e a fatores
externos como qualidade de vida, estresse, consumo de álcool, cafeína,
drogas e medicamentos como aspirina e AINEs e/ou a infecção pela
bactéria H. pilory (BRUTON; LAZO; PARKER, 2006; MEDLOCK et al.,
2013; LI et al., 2014; VELASCO-ZAMORA; GÓMEZ-REYES;
USCANGAC, 2016).
Além disso, acredita-se que produtos do metabolismo do ácido
araquidônico, espécies reativas de oxigênio relacionadas aos eventos de
oxidação e formação de peróxido e elementos celulares, sejam os
responsáveis pelo desencadeamento das inflamações, depleções nas reservas
energéticas das mitocôndrias e danos no DNA das células do sistema
digestório (BECKMAN; KOPPENOL, 1996; REPETTO; LLESUY, 2002).
As lesões ocorrem maioritariamente na pequena curvatura do
estômago e na parte proximal do duodeno, podendo também desenvolver-se
na zona inferior do esófago, na zona distal do duodeno ou no jejuno
(RAMAKRISHNAN; SALINAS, 2007). No Brasil, levantamentos
epidemiológicos revelaram que a úlcera péptica duodenal é mais prevalente
48
que a úlcera gástrica, em uma proporção de 3:1, além de ser mais prevalente
em homens (ARAÚJO; BORINI; GUIMARÃES, 2014).
No geral, as úlceras pépticas são muito comuns, afetam cerca de 10
a 15% da população mundial (PANGUIGAN et al., 2014). A cada ano nos
Estados Unidos, cerca de 500.000 pessoas a desenvolvem. No ocidente a
incidência varia de 2 a 10/100.000 pessoas, evidenciando um problema de
saúde pública. A faixa etária predominante na qual a úlcera duodenal ocorre
está entre 20 e 50 anos, enquanto a gástrica é mais comum em pacientes
com mais de 50 anos. A doença ulcerosa péptica ainda permanece como
uma das doenças com maior prevalência em todo mundo, sendo que
algumas de suas complicações, como sangramento e perfuração, ainda são
causas importante de morbimortalidade (KOMEN et al., 2008; SUNG et al.,
2010).
Os sintomas mais comuns da úlcera péptica são dor e desconforto
abdominal, tipo queimação, cólica, náusea e anorexia. É comum também o
relato de pacientes com distensão abdominal, vômitos e intolerâncias
alimentares, assim como a perda de peso (TYTGAT, 2011).
4.1 Farmacoterapêutica da úlcera péptica
Por um longo período, as úlceras pépticas tiveram como tratamento
apenas procedimentos cirúrgicos, resultando em altas taxas de morbidade e
mortalidade. Em meados da década de 70, é que a supressão farmacológica
da secreção ácida gástrica foi efetivada com a introdução dos antagonistas
de receptores H2 histaminérgicos (cimetidina e ranitidina) e posteriormente,
com o surgimento dos inibidores da bomba de prótons H+/K
+ATPase (IBP)
(YUAN; PADOL; HUNT, 2006; SCHROETER et al., 2008; GALLERANI;
ARAI, 2011).
Atualmente, devido as duas principais chaves do tratamento,
melhorar os fatores defensivos e reduzir os fatores agressivos (SIVRI,
2004), as drogas mais usadas para tratar a úlcera péptica, são a combinação
de antibióticos em casos de úlcera causada por H. pylori (AL-EIDAN et al.,
2002), antagonistas dos receptores da histamina do tipo 2 (cimetidina,
ranitidina, nizatidina e famotidina) e inibidores da bomba de prótons H+/K
+-
ATPase (omeprazol, lansoprazol, pantoprazol e esomeprazol), além dos
antiácidos (hidróxido de magnésio, trissilicato de magnésio, hidróxido de
alumínio e bicarbonato de sódio) (SHEEN; TRIADAFILOPOULOS, 2011).
49
Nos últimos 15 anos, uma pesquisa mundial tem procurado
encontrar metodologias adequadas para tratamento da infecção por H.
pylori, bactéria localizada na superfície da mucosa gástrica e na camada de
muco que a protege, fazendo com que o sistema imunitário não consiga
contribuir para a cicatrização da infecção, exigindo desta forma, que os
medicamentos sejam utilizados em uma concentração maior, capaz de matar
a bactéria (LABENZ, 2010).
Ainda, para escolha do antibiótico a ser usado, a história de cada
paciente deve ser investigada, para evitar alergias ou reações
idiossincráticas. A função renal e hepática também deve ser avaliada
(SIVRI, 2004). A amoxicilina pode causar comprometimento da função
renal em pacientes com insuficiência renal crônica, sendo que o
metronidazol e a claritromicina têm apresentado menor toxicidade renal
(SHEU et al., 2003).
No contexto de rotina clínica, quatro principais antibióticos têm
sido mais indicados no tratamento de H. pylori: amoxicilina, claritromicina,
tetraciclina e metronidazol ou tinidazol. Além disso, com uma taxa de
erradicação de cerca de 30% ou menos, as monoterapias antibióticas são
contraindicadas (LABENZ, 2001; TYTGAT, 2011). Com base em
recomendações de consenso em conferências, o tratamento de primeira
linha para a infecção por H. pylori deve incluir um inibidor da bomba de
protons (IBPs) ou claritromicina mais amoxicilina ou metronidazol e ou
tinidazol, contando com uma terapia tripla padrão com dose aditiva de IBPs,
para a erradicação da infecção por H. pylori (SIVRI, 2004).
Os IBPs (omeprazol, lanzoprazol, pantoprazol, rabeprazol e
esomeprazol) são medicamentos mais eficazes na inibição da secreção do
ácido gástrico, resultando em melhoras nas taxas de cicatrização de úlceras
gástricas e duodenais (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006; SCHROETER
et al., 2008; GALLERANI; ARAI, 2011). Assim como os antagonistas dos
receptores tipo 2 da histamina utilizados clinicamente: cimetidina,
ranitidina, famotidina e nizatidina, os quais promovem a redução da
secreção do ácido ao competir reversivelmente com a histamina pela sua
ligação aos receptores H2 nas células parietais, diminuindo os níveis de
AMPc (YUAN; PADOL; HUNT, 2006; GALLERANI; ARAI, 2011).
Os fármacos antissecrretores atuam predominantemente
minimizando os fatores lesivos da mucosa; entretanto, em muitos casos,
ocorre a recidiva da lesão gástrica pós um ano de interrupção do tratamento
50
(TUNDIS et al., 2008). Adicionalmente, a falha terapêutica e resistência aos
antibióticos têm abrangido cerca de 20% ou mais, dos pacientes, que
permanecem infectados após o tratamento (QASIM; O’MORAIN, 2002).
As razões para esta falha incluem a má adesão, duração do tratamento,
número e dosagens dos fármacos prescritos e resistência bacteriana a
antibióticos (SHEU et al., 2003).
A incidência de reações adversas aos IBPs, identificados em
ensaios clínicos de pré-comercialização, são tipicamente da ordem de 1-5%
e incluem cefaleias, diarreia, obstipação, náuseas e erupções cutâneas,
sendo que a utilização de IBP em curto espaço de tempo e nas doses
recomendadas é geralmente bem tolerado (THOMSON et al., 2010).
Todavia, em longo prazo tem-se o risco de fraturas ósseas, aumento da
suscetibilidade a infeções e as alterações na função gástrica, além de má
absorção (vitamina B12) e hipergastrinemia (TSUKAMOTO et al., 2011).
Tsukamoto et al. (2011) demonstraram que a supressão de ácido gástrico
por altas doses de IBP induz hipergastrinemia e consequentemente o
aparecimento de tumores neuroendócrinos, em estudos com animais.
Da mesma forma, os antagonistas de H2 são bem tolerados,
podendo apresentar como efeitos adversos a diarreia, cefaleias, dores
musculares, obstipação, fadiga e quando administrados via intravenosa,
podem causar efeitos no SNC, como alucinações e confusão
(TAWADROUS et al., 2014).
Também, por provocarem um aumento do pH estomacal, os
antagonistas de H2 afetam a biodisponibilidade dos fármacos cuja absorção
requer valores de pH baixos, como por exemplo o caso do cetoconazol,
além de bloquearem os recetores androgênicos, resultando em ginecomastia
(aumento das mamas) nos homens e galactorreia (secreção de leite) nas
mulheres (WILSON et al., 2001; YEOMANS et al., 2005).
Associada ao uso de medicamentos, a alimentação se torna um
fator relevante no tratamento das desordens gástricas, pois, quando
adequada às necessidades e sintomas de cada indivíduo pode auxiliar na
recuperação e manutenção do estado nutricional deste, atuando na redução
da secreção gástrica, na promoção do esvaziamento gástrico adequado e na
diminuição de efeitos colaterais dos medicamentos e da interação entre eles,
além de manter a hidratação corporal estável (FLOCH, 2007;
GASBARRINI et al., 2014).
51
Destaca-se também, como opção terapêutica para a úlcera gástrica,
a Maytenus ilicifolia Mart. ex. Reissek, espécie vegetal pertencente a
família Celastraceae, uma família tropical, encontrada no Sul do Brasil,
Uruguai, Paraguai, Argentina, Chile e Bolívia (NASCIMENTO et al.,
2005). Popularmente é conhecida como "espinheira-santa" e suas folhas
usadas para tratamento das úlceras gástricas, sendo que o efeito
antiulcerogênico das folhas já é bem documentado na literatura (LEITE et
al., 2010). Souza-Formigoni et al. (1991) e Tabach e Oliveira (2003)
descreveram a efetiva redução nas lesões gástricas em animais induzidos a
úlcera com indometacina, etanol e estresse, após administração do extrato
aquoso e extrato seco das folhas, comparando a atividade a classe dos
medicamentos anti-histamínicos.
Pessuto et al. (2009) identificou o potencial antioxidante do extrato
e de taninos condensados isolados das folhas de M. ilicifolia destacando que
além dos taninos, os demais constituintes químicos presentes nesta espécies,
como flavonoides (CIPRIANI et al., 2004) e triterpenos, possuem evidente
atividade antioxidante, atuando como seqüestradores de radicais livres e
como quelantes de metais, despertando, para o interesse não apenas no
tratamento de úlceras, mas também para utilização em várias doenças
degenerativas (NIERO et al., 2001). Testes de toxicidade aguda e crônica
realizados com a infusão das folhas de M. ilicifolia não provocaram efeitos
tóxicos (CARLINI; BRAZ, 1998; PESSUTO et al., 2009) mutagênicos
(CAMPAROTO et al., 2002) e teratogênicos (OLIVEIRA et al., 1991) em
animais ou em células vegetais.
Neste contexto, tem-se verificado que as plantas possuem
constituintes formados a partir do metabolismo secundário, como os
flavonoides, taninos e terpenoides, que apresentam atividade antiúlcera
bastante significativa, apresentando um grande potencial das espécies
vegetais como fontes alternativas para o tratamento de úlceras gástricas
(DONATINI et al., 2009).
Desta forma, a busca por terapias mais eficazes e com menos
efeitos adversos/colaterais se torna relevante para o meio científico e
médico, sendo necessários mais estudos da fisiopatologia do trato
gastrintestinal, assim como sua relação com os produtos bioativos das
espécies vegetais, as quais nos últimos anos vem se demonstrando capazes
de produzirem efeitos idênticos ou até melhores que dos medicamentos
sintéticos no tratamento da úlcera péptica (SCHMEDA-HIRSCHMANN;
52
YESILADA, 2005; LEMOS et al., 2011). Estima-se que dos 1.135 novos
medicamentos aprovados nos últimos 30 anos, 50% foram originados de
produtos naturais (NEWMAN; CRAGG, 2016), todavia, mais de 95% da
biodiversidade do mundo não foi estudada com intuito de verificar possíveis
atividades biológicas, ressaltando a importância de mais estudos nesta área
(DAVID; WOLFENDER; DIAS, 2015).
5 FRUTOS SILVESTRES
Os alimentos in natura, como frutas e hortaliças, há algum tempo
já tem relatado seus benefícios para a saúde do homem, devido a sua
composição nutricional, alto teor de fibra dietética, vitaminas, minerais, e
também aos seus constituintes não nutricionais, os fitoconstituintes, também
conhecidos como metabólitos secundários, compostos fitoquímicos e/ou
princípios ativos (BALIGA et al., 2011; DENG et al., 2013; LI et al., 2014).
Os quais têm sido amplamente relacionados aos resultados positivos na
fisiologia humana (ROWLAND et al., 2015; HOFFMANN;
SCHWINGSHACKL, 2016;).
O destaque a esses fitoconstituintes encontrados nas espécies
vegetais se dá ao potencial antioxidante desses, que são produzidos para
combater o estresse oxidativo induzido por oxigênio e luz no ambiente
natural (LOBO et a., 2010; LI et al., 2016) e desempenham um papel
essencial em várias doenças crônicas ocasionadas entre outros fatores pela
grande geração de espécies reativas de oxigênio (FORBES-HERNANDEZ
et al., 2014; HUANG; ZHANG; CHEN, 2016).
Os antioxidantes fitoquímicos mais comuns incluem ácido
ascórbico (vitamina C), tocoferois e tocotrienois (Vitamina E), carotenoides
(pró-vitamina A) e compostos fenólicos tais como os ácidos fenólicos e
flavonoides (flavonas, isoflavonas, flavanonas, antocianinas e catequinas)
(HERTOG et al., 1993; ZHENG et al., 2003; SU; CHIEN, 2007; SPEISKY
et al., 2008; ROWLAND et al., 2015).
Neste ínterim, estudos epidemiológicos e nutricionais sugerem que
o maior consumo de frutas e hortaliças, reflete em uma menor incidência de
doenças crônicas, como problemas coronários cardíacos, câncer e doenças
neurodegenerativas (GESCHER et al., 1998; LI et al., 2016).
Pesquisas como a de Li et al., (2016) tem demonstrado que os
frutos silvestres (não cultivados), muitas vezes exóticos, apresentam maior
53
potencial antioxidante que os frutos cultivados devido a diferentes
genótipos e preocupações ambientais, apresentando com isso maior
quantidade de fitoquímicos, como antocianinas e flavonoides. Todavia,
infelizmente, ainda são subutilizados e pouco estudados.
Nos últimos anos, devido às descobertas iniciais, os frutos
silvestres têm atraído a atenção e investigações vem sendo realizados para
identificar os efeitos biológicos que podem ser realizados pelos compostos
bioativos dessas espécies vegetais e tem-se verificado efeitos anti-
inflamatórios, anti-cancerígenos, antioxidantes, antimicrobianos e
anticancerígeno, caracterizando-se como alimentos funcionais e potencial
para produtos farmacêuticos que busquem a prevenção e tratamento das
doenças crônicas (LI et al., 2016).
Vale ressaltar, que para a plena utilização dos recursos das frutas
silvestres, e de sua bioatividade, devem ser intensificadas as pesquisas que
busquem identificar os componentes bioativos e os mecanismos de ação,
além da verificação das propriedades toxicológicas que alguns frutos
silvestres apresentam, para que a o consumo humano possa ser seguro
(ROWLAND et al., 2015; LI et al., 2016).
Recentemente, estudos dedicam-se a determinar como o conteúdo
e a atividade desses componentes bioativos podem ser mantidos ou
melhorados através do desenvolvimento de cultivares, práticas de produção,
pós-colheita armazenamento, e processamento da planta (GUERREIRO et
al., 2010).
Também, Moure et al. (2000) relatam que é uma prioridade
substituir substâncias sintéticas pelas naturais, razão pela qual a busca por
estes componentes vegetais tem sido intensificada, para a sua utilização na
indústria alimentar, farmacêutica e cosmética (GUERREIRO et al., 2010).
5.1 Frutos e atividade gastroprotetora
O consumo de alimentos in natura, com destaque para os frutos,
tem aumentado nos últimos anos, isso devido ao valor nutritivo, efeitos
terapêuticos e diferentes possibilidades de preparo. A utilização da polpa de
frutas congeladas é crescente nas indústrias de alimentos, o que aumenta o
interesse dos produtores e dos consumidores (KUSKOSKI et al., 2005).
Os frutos contêm, além dos nutrientes essenciais e de
micronutrientes como minerais, fibras e vitaminas, diferentes
54
fitoconstituintes (HARBORNE; WILLIAMS, 2000) os quais, em inúmeros
estudos demonstram a capacidade de captar radicais livres (atividade
antioxidante) e seus efeitos na prevenção de doenças cardiovasculares e
circulatórias (NESS; POWLES, 1997; STOCLET et al., 2004), cancerígenas
(WANG; MAZZA, 2002; KATSUBE; IWASHITA; RUMI, 2003), no
diabetes entre outras atividades biológicas (HERTOG et al., 1997;
ABDILLE et al., 2005). Ainda, de acordo com Vattem et al. (2005) vários
compostos fitoquímicos, com destaque aos compostos fenólicos, presentes
em diferentes espécies de frutos vem atuando com eficácia nas infecções
causadas por H. pylori.
Dentre alguns dos estudos já realizados nesta área, está uma
pesquisa pré-clínica com o fruto da Aegle marmelos. O extrato aquoso da
polpa demonstrou possuir atividade antioxidante, protegendo a mucosa
gástricadas úlceras gástricas induzidas por aspirina (WALLACE, 2008). A
dose utilizada do extrato aquoso da fruta foi de 400 mg/kg de peso corpóreo
e os resultados desse estudo sugeriram que os compostos fenólicos do
extrato aquoso da fruta são uma boa fonte de antioxidantes, que poderiam
fornecer efeitos protetores contra úlcera gastroduodenal induzida por
AINES (DAS; ROY, 2012).
Apesar das propriedades medicinais das plantas e frutos serem
atribuídas principalmente à presença de flavonoides, elas também são
influenciadas por outros compostos orgânicos e inorgânicos, tais como
cumarinas, alcaloides, terpenos, taninos, ácidos fenólicos e micronutrientes
antioxidantes, por exemplo, cobre, zinco, manganês (CZINNER et al.,
2001). O fruto Musa sapientum (banana) foi relatado na prevenção de várias
doenças, inclusive nas lesões da mucosa gástrica por conter leucocianidinas
(taninos condensados).
No estudo de Prabha et al. (2011), que buscou avaliar a eficácia do
pó de Musa sapientum no tratamento da úlcera péptica induzida por
indometacina em ratos, foi verificado efeito positivo na atividade de
proteção gástrica. Os pesquisadores verificaram aumento do NO e de
compostos ativos, como a leucocianidina na mucosa do tecido gástrico,
caracterizando estes como os responsáveis por proteger a mucosa, através
da estimulação da proliferação de células, promoção da secreção de muco, e
inibição da secreção ácida gástrica.
Além dos frutos, as sementes dessas espécies frutíferas têm sido
estudadas com hipótese anitulcera. Brzozowski et al. (2005) realizaram uma
55
pesquisa com extrato da semente da Citrus sinensis L. Osbeck (grapefruit) e
observaram que exerce uma potente atividade gastroprotetora contra lesões
induzidas por etanol e estresse através do aumento na produção de
prostaglandinas endógenas, supressão de peroxidação lipídica e hiperemia,
possivelmente, mediada por NO e CGRP. Além disso, associaram essas
ações gastroprotetoras a atividade antioxidante de flavonoides como a
naringenina. Também, verificaram que o suco da C. sinensis apresenta
potente atividade anti H. pylori in vitro (BAE; HAN; KIM, 1999;
TIRILLINI, 2000).
Também, Schlickmann et al. (2015) pesquisaram o efeito
antiulcerogênico do extrato metanólico de diferentes partes do fruto da
espécie Mimusops balata, já utilizado na medicina tradicional indiana para
esta finalidade. Evidenciaram que as lesões gástricas induzidas por etanol
acidificado e indometacina em camundongos, foram reduzidas de maneira
significativa mediante a pré-administração do extrato das sementes, quando
comparadas ao grupo veículo. Neste mesmo estudo, os autores verificaram
que a atividade antiulcerogênica identificada, pode estar relacionada à
manutenção dos níveis de GSH, redução do conteúdo de LPO (peroxidação
lipídica), inibição da migração de neutrófilos e uma atividade potente de
eliminação de radicais livres, além de diminuir o volume gástrico, o pH, a
acidez total e a atividade da pepsina no suco gástrico.
5.2 Chrysophyllum cainito L.
O fruto da espécie C. cainito é popularmente conhecido como abiu
roxo, maçã-estrela ou caimito. Pertencente à família Sapotacea, a espécie é
nativa da América Central, cultivada em todo o Caribe, América Central e
partes da América do Sul, bem como no Sudeste da Ásia (MORTON, 1987;
PARKER et al., 2010). A árvore é ornamental, podendo chegar a uma altura
de 8 a 30 m, maturando seus frutos em aproximadamente 180 dias. Os
frutos são globosos com cerca de 5 a 8 cm de diâmetro, tendo a polpa com
sabor agradável e doce (Figura 7) (PINO; MARBOT; ROSADO, 2002).
56
Figura 7. Fotos do fruto e semente de C. cainito
.
Fonte: O autor
Tradicionalmente o fruto é consumido fresco e também em
conservas e bebidas (PINO, MARBOT, ROSADO, 2002). De acordo Luo,
Basile e Kennelly (2002) a espécie C. cainito é popularmente consumida
para tratamento de disenteria, processos inflamatórios, diabetes mellitus,
como antifúngica (BAUTISTA-BANOS et al., 2002) e anti-hipertensiva
(MEIRA et al., 2014; MAO et al., 2015). Sendo que N’guessanet al. (2009),
comprovaram o efeito hipoglicemiante das folhas do fruto em ratos
induzidos por aloxano e Shailajan e Gurjar (2016) verificaram também na
folha atividade anti-inflamatória.
A análise nutricional do fruto da C. cainito demonstrou que 100g
deste possui, 67,2 kcal, distribuídas entre 0,72-2,33 g de proteína, 14,7 g de
hidratos de carbono e 0,55-3,30 g de fibras. As vitaminas encontradas foram
caroteno (0,004-0,039 mg), tiamina (0,018-0,08 mg), riboflavina (0,013-
0,04 mg), niacina (0,935-1,340 mg), e ácido ascórbico (3,0-15,2 mg). Além
de possuir aminoácidos essenciais como triptofano, metionina e lisina, bem
como cálcio e fósforo (LUO; BASILE; KENNELLY, 2002; MORTON,
1987)
Também, Coee e Anderson (1996) encontraram nos frutos
alcalóides e Einbond et al. (2004) antocianinas, sendo que na fração aquosa
identificaram 3-0- glucopiranósido de cianidina, assim como outras
cianidinas, como catequina, epicatequina, epigalocatequina e flavonoides
como quercetina, quercitrina, isoquercitrina, miricitrina e ácido gálico.
Compostos estes que dão ao fruto a capacidade antioxidante, verificada por
Lou, Basile e Kennelly (2002).
Considerando a presença de compostos antioxidantes em frutos
silvestres, como é o caso do C. cainito, Moo-Huchin et al. (2015),
57
realizaram uma pesquisa buscando verificar a manutenção dos compostos
bioativos nas cascas de três frutos consumidos regularmente no México,
após o processo de liofilização. Puderam comprovar que as cascas
liofilizadas de C. cainito, e de Anacardium occidentale, duas variedades
(casca amarela e vermelha) continham vitamina C, antocianinas, compostos
fenólicos, flavonoides e carotenoides, sendo que apresentaram boa atividade
antioxidante usando os ensaios de ABTS (2,2’- azinobis (3-
etilbenzotiazolina-6-ácido-sulfônico) e DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil).
Ainda, Moo-Huchin et al. (2015), identificaram que os principais
compostos fenólicos presentes na casca destes frutos foram ácido ferúlico,
ácido gálico, ácido elágico e miricetina, ressaltando que são boas fontes de
fitoconstituintes com propriedades antioxidantes e que a exploração destes
recursos renováveis de baixo custo, poderia ser utilizada pelas indústrias
farmacêuticas e de alimentos, viabilizando o desenvolvimento de
ingredientes para a formulação de produtos alimentares funcionais e/ou
produtos farmacêuticos.
Mao et al. (2015), verificaram também que o fruto C. cainito,
apresentou atividade anti-hipertensiva em testes in vivo e in vitro, com
extrato alcoólico, induzindo a redução da pressão arterial, com perfil
farmacológico semelhante ao captopril, medicamento utilizado para
tratamento da hipertensão arterial sistêmica. Segundo os pesquisadores,
mediante estudos mais aprofundados, o fruto poderia ser uma fonte eficaz e
inovadora para tratar esta doença e diminuir os riscos cardiovasculares.
Shailajan e Gurjar (2016) relatam ainda que por serem ricos em compostos
bioativos, como alcalóides, glicosídeos, taninos, fitosteróis e flavonoides
são necessários mais estudos para elucidar melhor os potenciais
farmacológicos do mesmo.
5.3 Plinia edulis (Vell.) Sobral
A família Myrtaceae é uma das mais representativas da flora
brasileira, estando mais presente na Mata Atlântica e restingas. Suas
espécies incluem árvores ou arbustos simples, que possuem comprovadas
propriedades anti-inflamatórias associadas aos óleos essenciais produzidos
por estas plantas (DONATO; MORRETES, 2013). Nascente (2008),
descreve ainda um amplo espectro de efeitos biológicos a família
58
Myrtaceae, incluindo anticancerígeno, anti-malárico, anti-inflamatório,
antiviral e microbicida.
Pertencente a família Myrtaceae, a Plinia edulis (Vell.) Sobral,
popularmente conhecido como "cambucá", é uma espécie arbórea que
alcança de 5 a 10 metros (Figura 8). É endêmica da Mata Atlântica e cresce
naturalmente no Brasil, do Rio de Janeiro até o Rio Grande do Sul
(LORENZI et al., 2006). Produz frutos comestíveis, grandes e amarelados
(Figura 8) com sabor semelhante ao da jabuticaba. Seu período de floração
é curto, aproximadamente 7 a 12 dias, a partir do início de janeiro e é
seguido pela frutificação, que perdura até início de março. As flores
crescem diretamente na haste e o tronco é tipicamente "marmoreado"
devido à esfoliação do ritidoma, o que confere a espécie P. edulis,
característica ornamental (DONATO; MORRETES, 2013).
Figura 8. Fotos das partes aéreas da espécie P. edulis
Fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Plinia_edulis
Importante destacar que as folhas da espécie da P. edulis são
utilizadas popularmente para tratar problemas no estômago, além de dores
de garganta, diabetes, doenças inflamatórias, diarreia, bronquite e como
tônico, antipirético e diurético (ISHIKAWA et al., 2008; CARVALHO;
ISIKAWA; GOUVÊA, 2012; DONATO; MORRETES, 2013).
Entre os constituintes fitoquímicos da P. edulis estão flavonoides,
taninos, saponinas e terpenoides, incluindo o ácido maslínico e o ursólico
(ISHIKAWA et al., 2008; 2014). Ishikawa et al. (2008), observaram que o
extrato hidroalcoólico das folhas de P. edulis possui atividade
antiulcerogênica, destacando o efeito ao potencial antioxidante dos
compostos identificados, sem apresentar toxicidade aguda in vivo.
59
Carvalho, Ishikawa e Gouvêa (2012) verificaram em células de
câncer de mama (linhagem MCF-7) que a folha da P. edulis possui
atividade quimiopreventiva e por isso é um promissor candidato para
desenvolvimento de medicamento antineoplásico.
Em uma análise fitoquímica e farmacológica com plantas silvestres
da flora catarinense, Nesello (2015) verificou que a P. edulis, entre quatorze
espécies de diferentes famílias, foi uma das que apresentou melhor perfil
fitoquímico, considerando a quantidade de compostos e suas classes
(esteroides e terpenos), identificando nas cascas dois terpenos, ácido
maslínico e ácido ursólico, compostos anteriormente já identificados nas
folhas da espécie (ISHKAWA et al., 2014).
5.3.1 Ácido Maslínico
O ácido maslínico (AM), presente no extrato da Plinia edulis, é um
triterpeno pentacíclico (Figura 9), encontrado também em outras espécies
vegetais como na Cornus kousa e na Junillia aspera, porém em uma
pequena quantidade. Já nas folhas da Olea europaea L., popularmente
conhecida como oliveira, sua quantidade é tão superior a outras espécies
que pode chegar a uma concentração de 80% (ZURITA et al., 2008). Cabe
destacar que a folha da oliveira é usada popularmente há séculos na
prevenção e tratamento de doenças cardíacas, microbianas e também
gastrointestinais (Parra et al., 2009).
Figura 9. Estrutura química do ácido maslínico
Fonte: O Autor
60
O AM vem sendo muito estudado devido a sua relação com
diferentes atividades biológicas, com efeito hipoglicemiante (LOZANO-
MENA et al., 2012; HUANG et al., 2011) antioxidante (ALLOUCHE et al.,
2010), neuroprotetor (HUANG et al., 2011), cardioprotetor (SHAIK et al.,
2012; RODRÍGUEZ-RODRÍGUEZ et al., 2006) e anticancerígeno (JUAN
et al., 2006, 2008).
Yan et al. (2014) e Rajopadhye e Upadhye (2016) em estudos in
vivo verificaram que o AM também pode ter ação terapêutica na prevenção
da hepatotoxicidade provocada pelo estresse oxidativo. Assim como,
Mkhwanazi et al. (2014) verificaram diminuição no estresse oxidativo e
melhora na função renal em ratos induzidos ao diabetes mellitus após
administração do AM. Ainda, Zurita et al. (2008) e Juan et al. (2008)
verificaram efeito anti-tumoral, onde o AM apresentou potencial de inibição
no crescimento de células, sem citotoxicidade e atividade pró-apoptótica.
Fukumitsu et al. (2016) descreveram os efeitos do AM na artralgia.
Através de um estudo clínico, randomizado, duplo cego e placebo
controlado, orientaram o consumo de um suplemento com extrato da O.
europaea com 50 mg de AM padronizado, por via oral, em 20 voluntários
de meia idade e idosos com dores articulares no joelho (12 indivíduos no
grupo AM e 8 no grupo placebo), e após 12 semanas de estudo, verificaram
que o grupo tratado com AM apresentou melhora significativa nas dores
articulares, com efeitos anti-inflamatórios além de promover a perda de
peso.
Na busca por uma atividade neuroprotetora relevante aos
tratamentos pós isquemia, Qian et al. (2016) investigaram os efeitos do AM
na janela de tempo terapêutica e na faixa de dose de MK-801 (antagonista
do receptor de N-metil-D-aspartato - NMDA), após uma lesão cerebral
isquêmica. O AM e MK-801 foram administrados
intracerebroventricularmente em ratos induzidos a isquemia cerebral por
oclusão da artéria cerebral média, seguida por reperfusão. Os resultados
mostraram que a presença de AM estendeu a janela de tempo terapêutica
para MK-801 de 1 h a 3 h, demonstrando que o co-tratamento do AM com
MK-801 induziu a neuroproteção após a isquemia.
Ainda, Qian et al. (2016) sugeriram que o efeito sinérgico do AM
sobre a protecção neurológica pode estar associado com a melhoria da
função glial, onde a terapêutica combinada de AM e MK-801 pode revelar-
61
se uma estratégia potencial para o tratamento do acidente vascular cerebral
isquêmico agudo.
Também, Nesello (2015) verificou que a administração do AM (1 -
10 mg/kg) via intraperitoneal (i.p) em ratos induzidos a dor com ácido
acético 0,6%, promoveu efeito antinociceptivo, com efeito dose dependente,
sendo o AM na dose de 10 mg/kg, mais potente que o fármaco de
referência, paracetamol.
5.3.2 Ácido Ursólico
O ácido ursólico (AU, 3β-hidroxi-urs-12-en-28-óico) já foi isolado
a partir de diferentes espécies vegetais, tais como Eriobotrya japonica,
Rosmarinns officinalis, Melaleuca leucadendron, Ocimum santuário,
Eugenia jambolana, Calluna vulgaris, Malus domestica, Vaccinium
macrocarpon e Glechoma hederaceae (BAI et al., 2012). É um ácido
lipofílico, da classe dos triterpenoides pentacíclicos (Figura 10), tem sido
relatado por possuir uma gama de propriedades farmacológicas, como
antialérgica, antiviral, anti-inflamatória, antibacteriana, anticancerígena,
citotóxica para agentes tumorais (LIU, 2005; BAI et al., 2012) antioxidante,
anti-hiperlipidemica, antiúlcera, (TOKUDA et al., 1986; LIU, 1995; LU et
al., 2007; LIANG et al., 2016) e antinociceptiva (RODRIGUES et al., 2012;
PARK et al., 2013; VERANO et al., 2013).
Figura 10. Estrutura química do ácido ursólico
Fonte: O autor
62
A ação relacionada à propriedade antitumoral vem sendo muito
estudada. Diversos autores têm indicado que AU e os seus derivados inibem
o crescimento das células cancerosas através da inativação do ciclo celular e
a estimulação da apoptose (HARMAND et al., 2003; AGGARWAL;
SHISHODIA, 2006; TANG et al., 2009).
Em 1995, Liu já descrevia em sua revisão de literatura que o AU é
relativamente não tóxico para as células normais, destacando sua
importância em pesquisas para terapia antitumorais. Em uma análise pré-
clínica Huang et al. (1994) já evidenciara efeito quimiopreventivo com
administração do AU, posteriormente Cha et al. (1998) e Yamai et al.
(2009) verificaram em estudos in vitro e in vivo que o AU inibiu metástases
do carcinoma esofágico, assim como Shin, Kim e Park (2012) que puderam
evidenciar in vitro, a indução de apoptose pelo AU em células de câncer de
próstata, reforçando os achados de Liu em 1995.
Além disso, Liang et al. (2016) relatam como efeito farmacológico
do AU, a atenuação da lesão oxidativa e inflamatória no cérebro,
diminuindo prejuízos cognitivos induzidos pela D-galactose (LU et al.,
2007). Liang et al., (2016) observaram que o AU reverteu
significativamente os déficits de aprendizado e de memória induzidos pelo
peptídeo amiloide Aβ25-35, que é o fragmento central do peptídeo Aβ de
comprimento completo que possui toxicidade no sistema nervoso central.
Demonstraram ainda, como sendo um dos mecanismos de ação do efeito
neuroprotetor a atenuação do acúmulo de malondialdeído e a depleção de
glutationa no hipocampo induzidos pelo βA 25-35. Além dessa supressão
significativa nos níveis de IL-1β, IL-6 e do fator de necrose tumoral α no
hipocampo dos ratos tratados com βA25-35. (LIANG et al., 2016)
De acordo com Liang et al. (2016) esses achados sugerem que o
AU previne a perda de memória através da melhora do estresse oxidativo e
da resposta inflamatória, podendo proporcionar uma nova estratégia
terapêutica para o tratamento da doença de Alzheimer.
Jia et al. (2011) confirmaram que o AU, atua sobre os receptores
ativados por proliferador de peroxissoma (PPAR-α) in vitro. O PPAR-α é
um fator transcricional, que pertence a família dos receptores nucleares e
tem a capacidade de regular a expressão de genes envolvidos em beta-
oxidação de ácidos graxos, além de ser um importante regulador da
homeostase de energia. Embora Jia et al. (2011) não tenham observado
ligação direta do AU no domínio de ligação de PPAR-α, observaram que o
63
AU aumentou a ligação de PPAR-α ao elemento de resposta do proliferador
de peroxissoma nos genes de PPAR-α-responsivo, alterando a expressão de
genes chave no metabolismo lipídico, reduzindo as concentrações de
triglicerídeos e de colesterol intracelulares em hepatócitos.
Wang et al. (2016) em sua pesquisa puderam verificar que o AU
também tem influência sobre a integridade da membrana bacteriana,
seguida pela inibição da síntese de proteínas e a via metabólica, sugerindo
que a abordagem proteômica dá novos insights sobre a resposta bacteriana
em direção a compostos antibacterianos com mecanismos de ação
desconhecidos. Sendo que para o AU os efeitos pleiotrópicos o tornam um
promissor agente antibacteriano na investigação farmacêutica.
Ainda, Wang et al. (2017) avaliaram os possíveis efeitos protetores
do AU contra danos induzidos pela radiação gama in vitro e in vivo.
Observaram que a exposição à radiação gama, independente do tempo
causou uma diminuição significativa na viabilidade celular, enquanto o
tratamento do AU atenuou essa citotoxicidade. A produção de radicais
livres, incluindo EROs e NO, aumentaram significativamente após a
irradiação nos grupos controles, além do aumento na peroxidação lipídica e
nos danos oxidativos no DNA dessas células. Esses efeitos deletérios foram
efetivamente bloqueados pelo tratamento com AU. Além disso, o AU
também reverteu as respostas inflamatórias induzidas pela radiação gama,
diminuindo a produção de TNF-α, IL-6 e IL-1β, prolongando
significativamente a sobrevivência de camundongos expostos a irradiação.
Dada a sua eficácia radioprotetora e antioxidante o AU pode funcionar
como um agente farmacológico importante na proteção contra a lesão
induzida por radiação gama
Também, Chen et al. (2017) em um estudo com ratos, utilizando o
teste de natação com peso e teste de suspensão demonstraram que o AU
pode melhorar a adaptação mitocondrial ao exercício físico aeróbio,
possibilitando melhora no desempenho do exercício físico, possivelmente
por atrasar a fadiga muscular. O AU apresentou aumento na massa
mitocondrial e capacidade de geração de ATP, com uma produção
concomitante baixa nos níveis de espécies reativas de oxigênio mitocondrial
(ROS). Os pesquisadores sugeriram que o AU pode induzir a biogênese
mitocondrial através da ativação de caminhos de AMPK (proteína quinase
ativada por adenosina monofosfato) e PGC-1 (proteínas co-ativadoras,
classe de reguladores de transcrição que controlam programas de resposta
64
gênica) no músculo esquelético, oferecendo com isso uma perspectiva
promissora para seu uso no aumento a resistência ao exercício e alivio da
fadiga nos humanos.
65
CAPÍTULO III
Chrysophyllum cainito: um fruto silvestre com atividade
gastroprotetora em modelos experimentais
Este artigo foi submetido ao periódico Journal of Plant Foods for Human
Nutrition, com fator de impacto igual a 2,276.
66
67
Chrysophyllum cainito: um fruto silvestre com atividade
gastroprotetora em modelos experimentais
Roseane Leandra da Rosa1,2
, Camila Leandra de Almeida1, Lincon
Bordigon Somensi1, Thaise Boeing
1, Luisa Nathália Bolda Mariano
1, Valdir
Cechinel Filho1, Luisa Mota da Silva
1,2, Sérgio Faloni de Andrade
1*
1Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Universidade do
Vale do Itajai (UNIVALI) – Campus Itajaí, Santa Catarina. Rua Uruguai,
458, Centro. CEP: 88302-901.
2Curso de Nutrição. UNIVALI – Campus Itajaí, Santa Catarina.
3Curso de Biomedinica. UNIVALI – Campus Itajaí, Santa Catarina.
Autor correspondente: *Docente Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) – Campus Itajaí, Santa Catarina,
[email protected]. Correspondência: Rua Uruguai, 458, Centro. CEP:
88302-901.
68
Resumo: Chrysophyllum cainito L. (Sapotaceae), conhecido comumente
como maçã-estrela ou abiu-roxo, é uma árvore tropical que produz frutos
comestíveis. O objetivo foi avaliar a atividade gastroprotetora do extrato
metanólico dos frutos de Chrysophyllum cainito, bem como do suco e
farinha obtidos desse fruto. O potencial gastroprotetor da administração de
3, 10 e 30 mg/kg dos extratos metanólicos das cascas (EMC), semente
(EMS) e polpa (EMP) dos frutos de C. cainito foi avaliado em
camundongos neste estudo, bem como o efeito antiúlcera do suco e da
farinha dos frutos. As menores doses gastroprotetoras do EMC, EMS e
EMP contra a ação ulcerogênica do etanol/HCl foram 3, 3 e 10 mg/kg,
respectivamente. Neste modelo, ambos os extratos aumentaram a secreção
de mucinas. De forma interessante, a administração intraperitoneal de EMC
(0,3 mg/kg), EMS (0,3 mg/kg) e EMP (1 mg/kg) também promoveu
gastroproteção contra o etanol/HCl. Em adição, EMC (3 mg/kg, v.o), EMS
(3 mg/kg, v.o) e EMP (10 mg/kg, v.o) reduziram a úlcera gástrica induzida
por indometacina em camundongos em 78%, 70% e 50%, respectivamente.
Em relação ao mecanismo de ação dos extratos, o efeito gastroprotetor do
EMC foi diminuído pela pré-administração de, N-etilmaleimida (NEM, um
quelante de grupametos sulfidrílicos, 10 mg/kg, i.p), glibenclamida (um
bloqueador dos canais de potássio dependentes de ATP,10 mg/kg, i.p),
indometacina (um inibidor de cicloxigenases, 10 mg/kg, i.p) e ioimbina (um
antagonista dos receptores alfa adrenérgicos, 10 mg/kg, i.p); o EMS perdeu
efeito gastroprotetor mediante pré-administração de NEM, glibenclamida,
N-Nitro-L-arginina metil ester (L-NAME, um inibidor de óxido nítrico
sintase, 70 mg/kg, i.p) e ioimbina (10 mg/kg, i.p); enquanto que o EMP teve
o efeito gastroprotetor diminuído em animais pré-tratados com NEM (10
mg/kg, i.p) e L-NAME. Por outro lado, os extratos não alteraram nenhum
parâmetro de secreção ácida gástrica, porém todos aumentaram os níveis de
muco aderido à mucosa gástrica de camundongos submetidos à ligadura
pilórica. Adicionalmente, a ração suplementada com a farinha do fruto C.
cainito (10%), mas não o suco, também demonstrou potencial
gastroprotetor, evidenciando o fruto como promissor alimento funcional.
Em conjunto, os dados demonstram o efeito antiúlcera dos extratos do fruto
de C. cainito em diferentes modelos experimentais. Em paralelo, os efeitos
gastroprotetores da suplementação com a farinha do fruto também foi
verificado. De forma interessante, o favorecimento de mecanismos
protetores da mucosa foi evidenciado entre os diferentes, porém
complementares, modos de ação dos extratos.
Palavras-chave: Alimento funcional. Gastroproteção. C. cainito
69
Introdução
A úlcera gástrica é uma lesão necrótica profunda envolvendo toda
a espessura da mucosa e musculatura lisa [1] promovida pelo desequilíbrio
entre fatores agressivos [tais como: a secreção ácida gástrica, a pepsina e a
geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) ] e protetores da mucosa,
os quais destacam-se um adequado fluxo sanguíneo, a camada de muco-
bicarbonato e antioxidantes luminais [2,3]. Etiologicamente, a úlcera
gástrica é frequentemente associada à infecção por Helicobacter pylori, uma
dieta inadequada, consumo excessivo de álcool e o uso prolongado de anti-
inflamatórios não-esteróides (AINES) [2-4].
As opções terapêuticas para o tratamento das úlceras gástricas
incluem o uso de antibióticos em caso de infecção com H. pylori [5],
todavia os medicamentos mais utilizados são fámacos antissecretores,
incluindo os antagonistas dos receptores do tipo 2 da histamina e os
inibidores da bomba de prótons. Entretanto, apesar de efetivos, esses
fármacos estão associados a numerosos efeitos adversos, tais como
hipersensibilidade, deficiência de B12 e de ferro, arritmia, impotência,
ginecomastia, alterações hematopoiéticas, hipergastrinemia e alguns autores
destacam a possibilidade de cancer gástrico [5-8].
Diante do exposto, há um grande interesse em terapias alternativas
para o tratamento da úlcera gástrica e os frutos são uma interessante fonte
nessa busca, seja para a obtenção de fitoterápicos ou sob a forma de
alimento com propriedade funcional.
O fruto da espécie Chrysophyllum cainito (Sapotacea) é
popularmente conhecido como abiu roxo, maçã-estrela, ou caimito, é uma
espécie nativa da América Central, porém também cultivada na América do
Sul [9]. Tradicionalmente o fruto é consumido fresco e também em
conservas e bebidas [10], além de ser utilizado na medicina popular para o
tratamento de inflamações, diabetes mellitus, diarreia e febre [11,12]. De
fato, estudos pré-clínicos evidenciaram a ação anti-hirpentensiva [13] e
antioxidante [12] de extratos dos frutos de C. cainito. Além disso, extratos
das folhas de C. cainito também desempenharam ação antidiabética [14] e
antinociceptiva [15] em modelos experimentais.
Diferentes compostos fenólicos têm sido identificados nos frutos
de C. cainito, incluindo catequina, epicatequina, galocatequina,
epigalocatequina, quercetina, quercitrina, isoquercitrina, miricitrina e ácido
70
gálico, além de vitaminas do complexo B e aminoácidos essenciais [12]. A
atividade antioxidante destes compostos pode promover efeitos benéficos a
saúde humana, prevenindo ou combatendo diferentes patologias associadas
ao estresse oxidativo.
Considerando o envolvimento do estresse oxidativo na etiologia
das úlceras gástricas [16] e o efeito antiúlcera de compostos fenólicos [17],
o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial gastroprotetor dos extratos
metanólicos das cascas, polpa e sementes dos frutos de C. cainito. Além
disso, os efeitos antiúlcera do suco obtido da polpa do fruto e da farinha
obtida dos frutos de C. cainito também foram investigados.
Material e Métodos
Material vegetal
Os frutos de C. cainito foram coletados em setembro de 2015, na
cidade de Itajaí/SC. As espécies foram identificadas pelo Prof. Oscar B. Iza
(UNIVALI) e as exsicatas encontram-se depositadas no Herbário Barbosa
Rodrigues no município de Itajaí/SC, estando registrada com número V.C.
Filho 121.
Obtenção dos extratos
As cascas (360,00 g), polpa (540,00 g) e sementes (27,70 g) foram
coletadas, lavadas, picadas manualmente e submetidas separadamente a um
processo de maceração com metanol a temperatura ambiente (± 22 ºC) por
um período de uma semana. Após filtração, o solvente foi removido por
destilação em rotaevaporador sob pressão reduzida para obtenção dos
respectivos extratos: extrato metanólico da casca (EMC – 18,30 g), extrato
metanólico da semente (EMS – 1,73 g) e extrato metanólico da polpa (EMP
– 31,30 g).
Obtenção do suco
O suco do fruto de C. cainito foi obtido através do processo de
prensagem a frio, o qual se utiliza um processo mecânico de rotação lenta e
prensa hidráulica para extrair o máximo do suco dos frutos. Foram
71
selecionados manualmente os frutos maduros (878,76 g), os quais foram
prensados a frio, coados e o líquido dos frutos (suco) no volume de 380 mL,
foi armazenado em temperatura de -20 ºC.
Obtenção da farinha e da ração suplementada com a farinha de C.
cainito
Da prensagem para retirada do suco, foi recolhido para
aproveitamento 474,72 g do resíduo do fruto, com a casca, semente e polpa.
Este material foi estocado em embalagem de plástico a 4 ºC, e direcionado
para preparação da farinha. A matéria prima (474,72 g) foi submetida ao
processo de secagem em estufa, com monitorização da temperatura, não
ultrapassando 50 ºC (128,94 g). Posteriormente a secagem, o produto foi
processado em moinho próprio para fabricação de farinhas (CF Máquinas,
JP 250), rendendo 110,00 g, armazenado em recipiente plástico e mantido a
temperatura ambiente até ser utilizado na produção da ração.
A ração Nuvilab CR-1 para animais de laboratório, foi moída,
umidificada, suplementada com 10% de farinha do fruto C. cainito, foram
formados peletes e secados para posterior fornecimento aos animais.
Determinação de fenois totais dos extratos do fruto C. cainito
A determinação do teor de fenóis foi realizada utilizando o método
de Folin-Ciocalteu [18]. O teor de fenóis totais foi determinado através de
curva padrão de ácido tânico e expresso como equivalentes de ácido tânico
(EAT). Todas as análises foram realizadas em triplicata.
Determinação de flavonoides totais dos extratos do fruto C. cainito
O teor de flavonoides totais foi determinado segundo o método
de Dowd [19], onde utilizou-se de 500 mL de cloreto de alumínio (AlCl3),
preparados em 2% de metanol com mesmo volume de solução dos extratos
(400-100 µg/mL) ou água destilada (para o branco). A quantidade total de
flavonoides foi expressa em Equivalentes de Quercetina (EQ) calculados
através de uma curva padrão de quercetina.
Determinação de Vitamina C do suco do fruto C. cainito
72
Para determinação da vitamina C foram utilizados 5 mL de suco
acrescido de 50 mL de ácido oxálico (5 mg/mL). A titulação da quantidade
de vitamina C nas amostras foi feita utilizando 2,6-diclorobenzenoindofenol
[20].
Determinação da escala de Brix do suco do fruto C. cainito
As análises foram feitas de acordo com Spencer e Mead [21]. As
amostras preparadas a uma concentração final de 1% foram aplicadas
diretamente no aparelho refratômetro a uma temperatura de 25 °C e as
leituras foram mensuradas.
Estudo in vitro da atividade sequestradora do radical livre estável 2,2-
diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
Este procedimento foi realizado de acordo com método descrito
por Shama e Bhat [22]. Para isso, 750 μL de solução dos extratos (1-10
μg/mL) foram misturadas a 250 μL de solução metanólica de DPPH (0,04
mg/mL). Após 5 minutos, o decréscimo da absorbância (517 nm) foi
mensurado. Uma solução de ácido ascórbico (50 μg/mL) foi utilizada como
controle positivo.
Animais
Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem Swiss, pesando
entre 25–35 g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do
Itajaí – UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno,
contendo maravalha, as quais foram higienizadas, trocadas diariamente e
dotadas de enriquecimento ambiental com papel. A sala foi mantida com
temperatura média de 22 ºC e ciclos controlados (claro/escuro 12 horas
cada), umidade de 60%, com ração e água ad libitum. Nas doze horas
anteriores aos experimentos, os animais foram mantidos em jejum e com
livre acesso à água, sendo adicionada a caixa uma grade para inibir a
coprofagia. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética na
Utilização de Animais (CEUA) da Universidade do Vale do Itajaí, sob o
protocolo nº 005/16.
73
Úlcera aguda induzida por etanol acidificado em camundongos
A metodologia utilizada foi descrita por Mizui e Doteuchi [23] e
Boeing et al. [24], com algumas modificações. Os camundongos foram
submetidos a jejum de doze horas e após esse período, divididos em
diferentes grupos (n=6) e pré-tratados por via oral com veículo (VEI, água
destilada, 10 mL/kg), carbenoxolona (CBX, 200 mg/kg) e EMC (1-30
mg/kg), EMS (1-30 mg/kg) ou EMP (1-30 mg/kg), sendo administrado após
uma hora o agente lesivo, etanol/HCl (60%/0,3 M) na dose de 10 mL/kg.
Para avaliar a atividade sistêmica dos extratos, estes foram
administrados por via intraperitoneal (i.p) na dose 0,3 mg/kg para EMC e
EMS e na dose de 1 mg/kg para o EMP, seguindo a mesma metodologia
citada, sendo que a única alteração é que o etanol/HCl (60%/0,3 M) foi
administrado após 30 minutos da administração intraperitoneal dos extratos
[25].
Em outro experimento, camundongos foram divididos (n=6) e
tratados com veículo (VEI, água destilada, 10 mL/kg) ou suco de C. cainito
(100 mL/kg) via gavagem durante sete dias. Adicionalmene, outro grupo de
animais recebeu ração enriquecida com 10% da farinha de C. cainito ad
libitum por setes dias. A administração do veículo ou suco foi realizada
todos os dias no mesmo horário, sendo que no último dia, a administração
ocorreu uma hora antes da indução de úlcera com etanol acidificado. O peso
dos animais foi aferido antes de cada tratamento durante todo o período de
tratamento.
Após esse período os animais foram mantidos em jejum por doze
horas e a úlcera gásrica foi induzida por etanol acidificado como descrito
anteriormente. Uma hora após a administração do agente lesivo, os animais
foram eutanasiados e em seguida os estômagos removidos e abertos ao
longo da curvatura maior. As imagens foram captadas e analisadas pelo
software de análise de imagens EARP, a fim de determinar se ocorreu
regressão da lesão nos tratamentos quando comparados com o grupo
veículo.
74
Avaliação histopatológica e histoquímica
O tecido ulcerado por etanol acidificado também foi verificado
microscopicamente, conforme metodologia descrita Kallaya et al. [26] com
algumas modificações. Após cortados em pequenas amostras, os estômagos
ulcerados foram fixados em solução ALFAC (85% etanol 80%; 10% formol
e 5% ácido acético) e embebidos em parafina, sendo reduzidos em secções
de 5 μm.
Uma parte das lâminas com os cortes histológicos foram
submetidas à coloração de hematoxilina e eosina (HE), desidratadas em
uma série ascendente de álcoois, diafanizadas em xilol e montadas entre
lâmina e lamínula, para avaliação de mudanças histopatológicas e da
extensão das úlceras.
Os cortes histológicos dos estômagos ulcerados foram oxidados em
ácido periódico 0,5% por 5 min, lavados em água destilada, corados com
reativo de Schiff por 20 min, lavados em água sulfurosa e água corrente.
Posteriormente, as lâminas foram contracoradas com hematoxilina por 20 s,
desidratadas em uma série ascendente de álcoois, diafanizadas em xilol e
estruturadas entre lâmina e lamínula, sendo observadas em microscópio
óptico em aumento de 400× e fotografadas [27]. As glicoproteínas
(mucinas) coradas pelo ácido periódico de Schiff (PAS) foram quantificadas
com o programa ImageJ® de acordo com descrito por Pereira et al. [28].
Úlcera aguda induzida por etanol acidificado em camundongos pré-
tratados com N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), N-metil-
maleimida (NEM), glibenclamida, ioimbina e indometacina
Ainda, foi utilizado o metodo descrito por Arrieta et al. [29] e
Matsuda, Li e Yoshikawa [30], com algumas modificações, onde os animais
(n=6) receberam L-NAME (70 mg/kg, i.p), NEM (10 mg/kg, i.p),
glibenclamida (10 mg/kg, i.p), ioimbina (10 mg/kg, i.p) e indometacina (8
mg/kg, i.p) ou apenas salina (10 mL/kg, i.p) 30 minutos antes do início dos
tratamentos.
Após uma hora do tratamento (EMC, EMS e EMP), foi realizado a
indução da úlcera através da administração por via oral de 10 mL/kg uma
solução de etanol acidificado (60%/0,3 M). Uma hora após a administração
75
do agente lesivo, os animais foram eutanasiados e seguidos mesmos
procedimentos descritos anteriormente.
Úlcera aguda induzida por indometacina
A metodologia utilizada foi descrita por Rainsford [31] e Beber et
al. [32], com algumas modificações. Após doze horas de jejum, os
camundongos foram divididos em diferentes grupos (n=6) e pré-tratados por
via oral com veículo (10 mL/kg), CBX (200 mg/kg), o EMC (3 mg/kg), o
EMS (3 mg/kg) ou o EMP (10 mg/kg), respectivamente. Após uma hora da
administração do tratamento, os animais receberam oralmente 80 mg/kg de
indometacina, para induzir lesão gástrica. Passadas seis horas os animais
foram eutanasiados em câmara de CO2, os estômagos removidos e abertos
ao longo da curvatura maior com os demais procedimentos conforme
descrito anteriormente.
Determinação da secreção gástrica
Este experimento foi realizado de acordo com descrito por Shay et
al. [33] com algumas modificações. Os camundongos foram submetidos a
jejum de doze horas e divididos em diferentes grupos (n=6). Foram
anestesiados com xilazina (5 mg/mL) e cetamina (2 mg/mL) e submetidos a
uma incisão longitudinal abaixo ao processo xifoide, o estomago foi
localizado e o piloro ligado com linha de sutura. Imediatamente após a
ligadura, os animais receberam por via intraduodenal os diferentes
tratamentos: veículo (10 mL/kg), carbenoxolona (CBX, 200 mg/kg), EMC
(3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) e EMP (10 mg/kg).
Depois dos tratamentos, as incisões foram suturadas, sendo que
quatro horas após a cirurgia, os animais foram eutanasiados em atmosfera
de CO2. As incisões foram reabertas e após o pinçamento da válvula cárdia,
o estômago foi retirado para determinação do conteúdo estomacal e pH.
Após a determinação do volume, foi adicionado 5 mL de água
destilada à amostra, sendo posteriormente centrifugada por 10 min a 3000
rpm. No sobrenadante foi determinado o pH que foi determinado em
pHmêtro modelo Q 400 A, marca Quimis®.
76
Determinação do muco aderido à mucosa gástrica
Este ensaio foi realizado utilizando a porção glandular dos
estômagos obtidos no experimento de ligadura do piloro. O tecido coletado
foi pesado e imerso em 5 mL de solução Alcian blue 0,1% preparada em
solução de sacarose 0,16 mol/L diluída em acetato de sódio 0,05 mol/L,
permanecendo neste durante 2 horas. A solução de Alcian Blue foi
removida, procedendo a lavagem dos estômagos em 5 mL de solução de
sacarose 0,25 mol/L por 15 minutos e por 45 minutos. Após a remoção da
solução de sacarose, solução de cloreto de magnésio 0,5 mol/L foi
adicionada a fim de extrair o corante aderido ao muco do tecido; esta última
solução permaneceu por 2 horas, todo procedimento foi realizado a
temperatura ambiente.
Após leve homogeneização do líquido extrator, transferiu-se 1 mL
deste para um tubo cônico, onde igual quantia de éter etílico também foi
adicionado. A mistura foi agitada em vórtex e centrifugada por 15 minutos a
3.000 rpm. Posteriormente, 200 μL da fase aquosa foi transferido para uma
placa de 96 poços em duplicata, a absorção foi determinada em
comprimento de onda de 598 nm. O conteúdo de muco foi calculado usando
uma curva padrão de Alcian Blue (6,25–100 μg/mL), e os resultados foram
expressos em μg Alcian Blue/g tecido [34].
Análise Estatística
Os resultados obtidos foram apresentados como média ± erro
padrão da média, com n=6. Utilizou-se a análise de variância (ANOVA) de
uma ou duas vias, seguida por teste de Bonferroni. As análises foram
realizadas usando o Programa GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad
Software, San Diego, EUA). Um valor de P<0,05 foi considerado
estatisticamente significativo.
77
Resultados
Níveis de fenóis e flavonoides totais nos extratos de C. cainito
A quantificação dos níveis de compostos fenólicos e flavonoides
nos diferentes extratos dos frutos de C. cainito podem ser verificados na
tabela 1 e 2.
Tabela 1. Níveis de compostos fenólicos nos extratos do fruto de C. cainito
Concentração
(µg/mL) E.A.T ± E.P.M.
EMC EMP EMS
200 391,70 ± 2,09 87,94 ± 0,50 47,45 ± 0,29
150 297,19 ± 1,59 65,00 ± 0,38 35,55 ± 0,23
100 213,02 ± 1,15 45,22 ± 1,15 23,68 ± 0,16
50 109,47 ± 1,46 21,73 ± 0,15 9,04 ± 0,09
Os resultados são expressos como média ± E.P.M. (n=3) como equivalentes de ácido
tânico (E.A.T) em µg. EMC: extrato metanólico da casca do fruto de C. cainito.
EMS: extrato metanólico da semente do fruto de C. cainito. EMP: extrato
metanólico da polpa do fruto de C. cainito.
Tabela 2. Níveis de flavonoides nos extratos do fruto de C. cainito
Concentração
(µg/mL)
E.Q ± E.P.M.
EMC EMP EMS
200 0,133 ± 0,08 0,108 ± 0,05 0,133 ± 0,08
150 0,121 ± 0,06 0,107 ± 0,05 0,125 ± 0,07
100 0,119 ± 0,06 0,112 ± 0,05 0,154 ± 0,10
50 0,118 ± 0,06 0,105 ± 0,04 0,115± 0,06
Os resultados são expressos como média ± E.P.M. (n=3) como equivalentes de
quercetina (EQ) em µg. EMC: extrato metanólico da casca do fruto de C. cainito.
EMS: extrato metanólico da semente do fruto de C. cainito. EMP: extrato
metanólico da polpa do fruto de C. cainito.
78
Determinação da Vitamina C e escala BRIX do Suco do fruto C. cainito
A metodologia original (método I) foi realizada segundo o
indicado pela AOAC (967.21) e os níveis de ácido ascórbico identificados
no suco de C. cainito foram de 0,19 ± 0,03 mg/mL.
Por sua vez, a escala Brix, que é calibrada pelo número de
gramas de açúcar contidos em 100 g de solução, resultou em 16,0 ºB,
representando a concentração percentual dos sólidos solúveis contidos na
amostra do Suco do fruto C. cainito, sendo este percentual constituido
basicamente, de açúcares (sacarose, frutose e glicose).
Efeito dos extratos de C. cainito em sequestrar o radical livre estável
DPPH
Como pode ser observado na tabela 3, os extratos obtidos dos
frutos de C. cainito apresentaram atividade sequestradora do radical DPPH
em todas as concentrações testadas. O ácido ascórbico, controle positivo,
conforme esperado reduziu o radical em 79,62%.
79
Tabela 3. Atividade seqüestradora do radical DPPH do EMC, EMS e EMP
in vitro.
Grupos Dose (µg/mL) DPPH (µM)
EMC 1
10
100
1000
24,54 ± 0,42*
9,66 ± 0,51*
6,79 ± 1,19*
8,05 ± 0,44*
EMS 1
10
100
1000
28,67 ± 0,81*
26,98 ± 0,45*
26,19 ± 0,61*
15,92 ± 0,21*
EMP 1
10
100
1000
30,91 ± 0,54*
28,04 ± 0,45*
27,03 ± 0,36*
9,03 ± 0,58 *
Ácido Ascórbico 50 7,53 ± 0,13*
Veículo - 36,95 ± 0,02
Resultados são apresentados como média ± E.P.M. Análise estatística foi realizada
utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. *p<0,05
comparado ao grupo veículo. EMC: extrato metanólico da casca do fruto de C.
cainito. EMS: extrato metanólico da semente do fruto de C. cainito. EMP: extrato
metanólico da polpa do fruto de C. cainito.
Efeito dos extratos de C. cainito na úlcera gástrica induzida por etanol
acidificado
Como é possível verificar na Figura 1 A, o pré-tratamento com o
EMC foi capaz de reduzir as lesões gástricas induzidas por etanol
acidificado nas doses de 3 e 10 mg/kg em 72% e 85%, assim como a
carbenoxolona que foi capaz de reduzir a lesão em 72,84%, quando
comparados com o grupo ulcerado tratado com veículo (9,39 ± 0,98 mm2).
O EMS (Fig. 1 B) e o EMP (Fig. 1 C) também apresentaram potencial
gastroprotetor, onde o pré-tratamento com o EMS reduziu as lesões
gástricas induzidas por etanol acidificado em 76% e 72%, nas doses de 3 e
80
10 mg/kg, respectivamente e a administração de EMP reduziu as lesões nas
doses de 10 e 30 mg/kg em 81% e 63%, quando comparados com o grupo
controle.
Fig. 1 Efeito dos extratos do fruto de C. cainito na úlcera gástrica induzida por
etanol acidificado em camundongos. Os animais foram tratados por via oral com
veículo (Vei: Água 10 mL/kg), Carbenoxolona (CBX 200 mg/kg), EMC, EMS (1, 3
e 10 mg/kg) e EMP (3, 10 e 30 mg/kg). Resultados são apresentados como média ±
E.P.M. (n=6). ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. *p<0,05, **p<
0,01, ***p<0,001 comparando com grupo ulcerado tratado com veículo. Painel A:
EMC= extrato metanólico da casca do fruto de C. cainito. Painel B: EMS= extrato
metanólico da semente do fruto de C. cainito. Painel C: EMP= extrato metanólico da
polpa do fruto de C. cainito.
A Figura 2 apresenta as imagens representativas macroscópicas e
microscopicas dos estômagos provenientes dos diferentes grupos
experimentais, onde se percebe a aparência microscópica da mucosa
gástrica exposta ao etanol acidificado com perda de células do epitélio
81
gástrico em paralelo a pontos hemorrágicos no grupo ulcerado tratado com
veículo, além de intensa desorganização da arquitetura das fossetas
gástricas. Por outro lado, os tratamentos com EMP, EMS e EMC
minimizaram os danos histológicos evidenciados (Fig. 2).
Fig. 2 Imagens macroscópicas e microscópicas (magnificação de 400×,
hematoxilina e eosina) do efeito gastroprotetor dos extratos de C. cainito no modelo
de úlcera induzida por etanol acidificado em camundongos. As setas pretas indicam
a lesão hemorrágica macroscópica e setas pretas pontilhadas indicam o dano no
epitélio gástrico.
Ainda, no modelo de indução com etanol, pode-se observar (Fig. 3)
que a administração pela via intraperitoneal com os EMC (0,3 mg/kg), EMS
(0,3 mg/kg) e EMP (1 mg/kg) foi capaz de reduzir as lesões gástricas em 74,
81 e 58%, quando comparados com o grupo ulcerado tratado com veículo
(20,49 ± 2,23 mm2).
82
Vei EMC EMS EMP0
5
10
15
20
25
***
(mg/kg, v.ip)
Etanol/HCl
******
Áre
a t
ota
l le
sad
a (
mm
2)
Fig. 3 Efeito dos extratos do fruto de C. cainito administrado intraperitonealmente
na úlcera induzida por etanol acidificado em camundongos. Os animais foram
tratados com Vei (Salina, 1 mL/kg, i.p), EMC (0,3 mg/kg, i.p), EMS (0,3 mg/kg, i.p)
ou EMP (1 mg/kg). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. (n=6).
ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ***p < 0,001 comparado a
grupo ulcerado tratado com veículo. EMC= extrato metanólico da casca do fruto de
C. cainito. EMS= extrato metanólico da semente do fruto de C. cainito. EMP=
extrato metanólico da polpa do fruto de C. Cainito
Efeito dos extratos dos frutos de C. cainito nos níveis de mucina
A intensidade de marcação das glicoproteínas do tipo mucina pode
ser observada nas Figuras 4 A e imagens representativas podem ser
verificadas na Figura 4 B. Como esperado, a carbenoxolona aumentou os
níveis de mucina em 236%. Da mesma forma, o EMC, EMS e EMP
também aumentaram os níveis de mucina em 176%, 198% e 193%,
respectivamente em relação ao controle negativo (6,86 ± 2,47 pixels ×
103/campo, Fig. 4 A).
83
Fig. 4 Efeito dos extratos do fruto de C. cainito nos níveis de mucina em tecido
gástrico ulcerado pela administração de etanol acidificado em camundongos. Os
animais foram tratados por via oral com Vei (água, 10 mL/kg), CBX (200 mg/kg),
EMC e EMS (3 mg/kg) e EMP (10 mg/kg). As mucinas coradas pelo PAS foram
quantificadas com o programa ImageJ® (Painel A). Resultados são apresentados
como média ± E.P.M. n=6 para cada grupo. Análise estatística foi realizada
utilizando ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ***p< 0,001;
**p<0,01 e *p<0,05 comparando com o grupo ulcerado tratado com veículo. Painel
B: Imagens representativas da marcação histoquímica de mucina (coradas em
magenta) com magnificação de 400 ×. EMC= extrato metanólico da casca do fruto
de C. cainito. EMS= extrato metanólico da semente do fruto de C. cainito. EMP=
extrato metanólico da polpa do fruto de C. cainito
Efeito gastroprotetor dos extratos do fruto de C. cainito na úlcera
gástrica aguda induzida por indometacina
A administração oral de indometacina (80 mg/kg) induziu lesão
gástrica na extensão de 9,01 ± 0,80 mm2
no grupo tratado com veículo. Por
outro lado, os grupos tratados com EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) e EMP
(10 mg/kg) apresentaram redução de 78%, 70% e 50%, respectivamente, na
84
área ulcerada, quando comparados com o grupo ulcerado tratado com
veículo, como pode ser observado na Figura 5 A. Imagens representativas
desses dados podem ser visualizadas na Figura 5 B.
Fig. 5 Efeito dos extratos de C. cainito na úlcera gástrica induzida por indometacina
em camundongos. Os animais foram tratados oralmente com Vei (Água, 10 mL/kg),
CBX (200 mg/kg) EMC (3 mg/kg), SEM (3 mg/kg) e EMP (10 mg/kg). Panel A:
Resultados são apresentados como média ± E.P.M. (n=6). ANOVA de uma via,
seguida por teste de Bonferroni. ***p<0,001 comparando com veículo. EMC=
extrato metanólico da casca do fruto de C. cainito. EMS= extrato metanólico da
semente do fruto de C. cainito. EMP= extrato metanólico da polpa do fruto de C.
cainito. Panel B: Imagens representativas do efeito gastroprotetor do EMC, EMS e
EMP no modelo de úlcera induzida por indometacina em camundongos.
Efeito gastroprotetor dos extratos do fruto de C. cainito em
camundongos pré-tratados com L-NAME
Pode-se observar que o pré-tratamento com L-NAME (um inibidor
não especifico da enzima óxido nítrico sintase, 70 mg/kg, i.p) não afetou o
85
efeito gastroprotetor do EMC (Fig. 6 A). Por outro lado, uma redução
significativa no efeito gastroprotetor do EMS (Fig. 6 B) e EMP (Fig. 6 C)
foi observada em animais pré-tratados com L-NAME.
Fig. 6 Efeito gastroprotetor dos extratos dos frutos de C. cainito em animais pré-
tratados com L-NAME. Os animais pré-tratados com salina (10 mL/kg, i.p)
receberam oralmente, Veículo (Vei: água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg, Painel A),
EMS (3 mg/kg, Painel B) ou EMP (10 mg/kg, Painel C). O grupo pré tratado com L-
NAME (70 mg/kg, i.p) recebeu Vei (água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3
mg/kg) ou EMP (10 mg/kg). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 6).
**p< 0,01; ***p< 0,001, quando comparados ao grupo Vei pré-tratado com salina; #p< 0,05 quando comparado com o grupo tratado com extrato e pré-tratado com
salina; 000p< 0,001 quando comparado com o grupo tratado com veículo e pré-
tratado com L-NAME. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni.
Painel A: EMC= extrato metanólico da casca do fruto de C. cainito. Painel B: EMS=
extrato metanólico da semente do fruto de C. cainito. Painel C: EMP= extrato
metanólico da polpa do fruto de C. cainito.
86
Efeito gastroprotetor dos extratos do fruto de C. cainito em
camundongos pré-tratados com NEM
Na Figura 7 é possível verificar que o pré-tratamento com NEM
[um quelante de grupamentos sulfidrílicos não-proteícos (NP-SH), 10
mg/kg, i.p) reduziu o efeito gastroprotetor do EMC (Fig. 7 A), EMS (Fig. 7
B) e EMP (Fig. 7 C).
Fig. 7 Efeito gastroprotetor dos extratos dos frutos de C. cainito em animais pré-
tratados com NEM. Os animais pré-tratados com salina (10 mL/kg, i.p) receberam
oralmente veículo (água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) ou EMP (10
mg/kg). O grupo pré tratado com NEM (10 mg/kg, i.p) recebeu Vei (água, 10
mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) ou EMP (10 mg/kg). Resultados expressos
como a média ± E.P.M. (n = 6). *p< 0,05; ***p< 0,001, quando comparados ao
grupo veículo pré-tratado com salina; ##p< 0,01; ###p<0,001, quando comparado com
o grupo tratado com extrato e pré-tratado com salina; 0p<0,05; 000p< 0,001 quando
comparado com o grupo tratado com veículo e pré-tratado com NEM. ANOVA de
duas vias seguido pelo teste de Bonferroni. Painel A: EMC= extrato metanólico da
casca do fruto de C. cainito. Painel B: EMS= extrato metanólico da semente do fruto
de C. cainito. Painel C: EMP= extrato metanólico da polpa do fruto de C. cainito.
87
Efeito gastroprotetor dos extratos do fruto de C. cainito em
camundongos pré-tratados com glibenclamida
Na Figura 8, verifica-se que o pré-tratamento com glibenclamida
[um bloqueador de canais de potássio dependentes de adenosina trifosfato
(ATP), 10 mg/kg, i.p] reduziu o efeito gastroprotetor do EMC (Fig. 8 A) e
EMS (Fig. 8 B). Por outro lado, o efeito gastroprotetor do EMP não foi
alterado após a administração de glibenclamida (Fig. 8 C).
Fig. 8 Efeito gastroprotetor dos extratos dos frutos de C. cainito em animais pré-
tratados com glibenclamida. Os animais pré-tratados com salina (10 mL/kg, i.p)
receberam oralmente veículo (Vei: água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3
mg/kg) ou EMP (10 mg/kg). O grupo pré tratado com Glibenclamida (10 mg/kg, i.p)
recebeu Vei (água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) ou EMP (10
mg/kg). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 6). *p< 0,05; ***p<
0,001, quando comparados ao grupo veículo pré tratado com salina; #p< 0,05; ###p<0,001, quando comparado com o grupo tratado com extrato e pré-tratado com
salina; 00p<0,01; 000p< 0,001 quando comparado com o grupo tratado com veículo e
88
pré-tratado com Glibenclamida. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de
Bonferroni.
Efeito gastroprotetor dos extratos do fruto de C. cainito em
camundongos pré-tratados com ioimbina
Como observado na Figura 9, o pré-treatamento com ioimbina (um
antagonista de receptores adrenérgicos do tipo alfa-2, 10 mg/kg, i.p) reduziu
o efeito gastroprotetor do EMC (Fig. 9 A) e EMS (Fig. 9 B) e aboliu o
efeito gastroprotetor do EMP (Fig. 9 C).
Fig. 9 Efeito gastroprotetor dos extratos dos frutos de C. cainito em animais pré-
tratados com ioimbina. Os animais pré-tratados com salina (10 mL/kg, i.p)
receberam oralmente veículo (Vei: água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3
mg/kg) ou EMP (10 mg/kg). O grupo pré tratado com ioimbina (10 mg/kg, i.p)
recebeu veículo (água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) ou EMP (10
mg/kg). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 6).*p< 0,05; ***p<
0,001, quando comparados ao grupo veículo pré-tratado com salina; #p< 0,05; ###p<0,001, quando comparado com o grupo tratado com extrato e pré-tratado com
salina; 00p<0,01 quando comparado com o grupo tratado com veículo e pré-tratado
89
com Ioimbina. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni. Painel A:
EMC= extrato metanólico da casca do fruto de C. cainito. Painel B: EMS= extrato
metanólico da semente do fruto de C. cainito. Painel C: EMP= extrato metanólico da
polpa do fruto de C. cainito.
Efeito gastroprotetor dos extratos do fruto de C. cainito em
camundongos pré-tratados com indometacina
Verifica-se na Figura 10 A, que a indometacina aboliu o efeito
gastroprotetor do EMC. Por outro lado, o efeito gastroprotetor do EMS (Fig.
10 B) foi parcialmente prevenido enquanto que o EMP (Fig. 10 C)
continuou exercendo efeito gastroprotetor em animais pré-tratados com
indometacina.
Fig. 10 Efeito gastroprotetor dos extratos do fruto de C. cainito em animais pré-
tratados com indometacina. Os animais pré-tratados com salina (10 mL/kg, i.p)
receberam oralmente veículo (Vei: água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3
mg/kg) ou EMP (10 mg/kg). O grupo pré tratado com indometacina (10 mg/kg, i.p)
recebeu Vei (água, 10 mL/kg), EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) ou EMP (10
mg/kg). Resultados expressos como a média ± E.P.M. (n = 6). *p< 0,05; **p< 0,01,
quando comparados ao grupo veículo pré tratado com salina; ##p<0,01, quando
90
comparado com o grupo tratado com extrato e pré-tratado com salina; 000p<0,001
quando comparado com o grupo tratado com veículo e pré-tratado com
indometacina. ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni. Painel A:
EMC= extrato metanólico da casca do fruto de C. cainito. Painel B: EMS= extrato
metanólico da semente do fruto de C. cainito. Painel C: EMP= extrato metanólico da
polpa do fruto de C. cainito.
Efeito dos extratos dos frutos de C. cainito na secreção ácida gástrica e
no muco aderido
Na tabela 4 é possível verificar os resultados da administração
intraduodenal do EMC (3 mg/kg), EMS (3 mg/kg) e EMP (10 mg/kg) sobre
a secreção ácida gástrica, avaliado por meio do ensaio de ligadura do piloro.
Diante dos resultados expostos é possível verificar que a administração dos
extratos não foi capaz de alterar o pH ou o volume da secreção ácida
gástrica, quando comparados ao grupo tratado com veículo.
Ainda, na mesma tabela pode-se observar que todos os extratos
testados aumentaram os níveis de muco aderido na mucosa, quando
comparado ao veículo.
Tabela. 4 Efeitos dos extratos de C. cainito na secreção gástrica basal e no
muco aderido à mucosa gástrica
Tratamento Dose
(mg/kg)
pH Volume
(mL)
Muco (µg Alcian
Blue/g de tecido
Vei - 5,51 ± 0,57 2,33 ± 0,28 401,4 ± 20,1
CBX 200 6,38 ± 0,26 3,66 ± 0,46 1010,0 ± 70,8***
EMC 3 5,80 ± 0,28 2,64 ± 0,07 616,3 ± 34,8*
EMS 3 5,70 ± 0,72 2,62 ± 0,04 797,1 ± 125,3*
EMP 10 6,69 ± 0,15 2,46 ± 0,13 595,1 ± 77,6*
Resultados são apresentados como média ± E.P.M (n=6). *p<0,05; ***p<0,001
quando comparando com grupo veículo. ANOVA de uma via, seguida por teste de
Bonferroni. CBX: carbenoxolona. EMC: extrato metanólico da casca do fruto de C.
cainito. EMS: extrato metanólico da semente do fruto de C. cainito. EMP: extrato
metanólico da polpa do fruto de C. cainito.
91
Efeito gastroprotetor do suco e da farinha dos frutos de C. cainito na
úlcera gástrica induzida por etanol acidificado
A suplementação com a farinha de C. cainito (10%) consumida
durante sete dias apresentou potencial gastroprotetor. Na Figura 11,
verifica-se que o grupo tratado com veículo apresentou média de lesão da
mucosa gástrica de 14,11 ± 2.80 mm2, sendo que a suplementação da ração,
assim como o tratamento com o omeprazol, reduziu a área lesada em 83% e
71 %, respectivamente, em relação ao grupo ulcerado tratado com veículo.
Por outro lado, o consumo diário do suco dos frutos de C. cainito (100
mL/kg) não foi capaz de proteger a mucosa gástrica contra o etanol
acidificado (Fig. 11).
Fig. 11 Efeito da suplementação em 10% com farinha dos frutos de C. cainito e do
consumo do suco da polpa de C. cainito (100 mL/kg) na úlcera gástrica induzida por
etanol em camundongos. O grupo veículo consumiu ração não suplementada e foi
tratado oralmente com veículo (Água 10 mL/kg). Os animais receberam ração com
10% da farinha do fruto de C. cainito ou o suco da polpa dos frutos (100 mL/kg) por
7 dias. Omeprazol (30 mg/kg, v.o) foi utilizado como controle positivo. Resultados
são apresentados como média ± E.P.M. (n=6) ***p<0,001 comparando ao veículo.
ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni.
Em adição não houve diferença no peso dos camundongos que
receberam a farinha suplementada ou o suco dos frutos de C. cainito,
quando comparado ao grupo tratado com ração normal ou veículo (dado não
mostrado).
92
Discussão
A presença de compostos fenólicos, em especial os flavonoides nos
frutos de C. cainito têm sido descritas e pode justificar seu potencial
medicinal através de intensa atividade antioxidante [35]. Em consequência,
infe-se que os frutos de C. cainito podem ser benéficos no tratamento de
doenças associadas ao estresse oxidativo. De fato, em uma abordagem pré-
clinica, este trabalho confirmou o potencial gastroprotetor de extratos
obtidos deste fruto. Em paralelo, no intuito de contribuir com dados que
favorecem o aproveitamento do fruto em uma abordagem nutracêutica, os
efeitos gastroprotetores da farinha (resíduo do fruto), mas não do suco, dos
frutos de C. cainito também foi confirmado.
De fato, a presença de compostos fenólicos foi identificada nos
extratos do fruto de C. cainito, sendo que na solução de 200 µg/mL do
EMC, EMP e EMS apresentaram 391,70 ± 2,09; 87,94 ± 0,50 e 47,45 ±
0,29, respectivamente de equivalentes de ácido tânico. Ainda que elevados,
vale ressaltar que no extrato proveniente das cascas os níveis encontrados
foram ainda mais significativos. Como esperado, os compostos fenólicos
encontrados nos frutos do C. cainito possuem intenso potencial antioxidante
[36] e a concentração desses fitoconstituintes na casca do fruto pode
garantir uma interessante proteção contra fatores agressores ambientais. De
forma diferente, os níveis de flavonoides foram semelhantes nos três
extratos, havendo uma redução de aproximadamente 20% nos teores de
flavonoides para o extrato proveniente da polpa.
Ainda, considerando a presença de fitoquímicos, em especial os
de natureza fenólica nos extratos dos frutos de C. cainito, a capacidade
antioxidante in vitro do EMC, EMS e EMP pelo método de DPPH foi
avaliada. De fato, todos os extratos apresentaram intenso potencial
sequestrador de radical livre, corroborando com o resultado de Moo-Huchin
et al. [35], que também verificaram que as cascas liofilizadas do fruto de C.
cainito, apresentaram interessante atividade antioxidante usando os ensaios
de ABTS e DPPH.
Os modelos experimentais empregados para a avaliação da
atividade gastroprotetora envolvem diferentes agentes ulcerogênicos,
contudo, o etanol ainda continua sendo o agente mais apropriado para testes
iniciais do potencial gastroprotetor de substâncias. Em adição, o modelo de
lesão gástrica induzida por etanol também permite investigar os
93
mecanismos envolvidos nos efeitos citoprotetores observados. Através de
sua ação ulcerogênica, o etanol rompe a barreira de muco e bicarbonato
desencadeando danos teciduais e um desequilíbrio na homeostase gástrica,
aumentando a formação de EROs e alterando a microcirculação gástrica, o
que em consequência promove extensas áreas hemorrágicas e de necrose na
mucosa gástrica [37,38].
Inicialmente, foram testadas várias doses do EMC, EMS e EMP no
modelo de úlcera aguda induzida por etanol acidificado em camundongos,
as quais possibilitaram evidenciar potencial gastroprotetor dos extratos e
posteriormente a escolha da dose mínima efetiva para cada um. A
administração oral de EMC e EMS reduziu as lesões gástricas em uma dose
mínima efetiva de 3 mg/kg, enquanto que o EMP somente reduziu a área
ulcerada a partir da dose de 10 mg/kg. Portanto, as respectivas doses
mínimas efetivas de cada extrato foram utilizadas para os demais
procedimentos metodológicos, sendo que para fortalecer esses resultados, os
extratos foram administrados intraperitonealmente, verificando a absorção e
efeito sistêmico, não apenas local do EMC (0,3 mg/kg), EMS (0,3 mg/kg) e
EMP (1 mg/kg), confirmando os resultados de proteção da cavidade gástrica
frente ao etanol.
Vale ressaltar que, ainda que compostos fenólicos e flavonoides
tenham sido confirmados em todos os extratos, o EMP apresentou menores
valores dos teores de flavonoides, o que pode justificar uma dose miníma
efetiva pelo menos 3,3 vezes maior que os demais extratos.
Além dos extratos metanólicos, também foram testados o suco e a
ração suplementada com 10% de farinha do fruto C. cainito, no intuito de
investigar o potencial dos frutos dessa espécie na obtenção de um alimento
funcional com propriedades antiúlcera. Sabe-se que um alimento funcional
é todo aquele alimento que ao ser introduzido diariamente na alimentação
traz benefícios fisiológicos específicos, além da função de nutrir, devido à
presença de constituintes com atividades biológicas [39].
No entanto, apesar dos teores de ácido ascórbico evidenciados no
suco do fruto de C. cainito, o potencial gastroprotetor advindo do consumo
do suco por sete dias não foi confirmado. Em contrapartida, a ração
suplementada com a farinha deste fruto, um subproduto, foi capaz de
prevenir o dano à mucosa gástrica, confirmando a possibilidade do
aproveitamento do fruto como um alimento com propriedade funcional
antiúlcera. Releva-se neste resultado a possível composição do suco, o qual
94
apenas foi extraído o líquido da polpa do fruto, diferentemente da ração
suplementada com a farinha, onde estavam presentes constituintes da casca
e da semente do fruto C. cainito, que com frequecia são subprodutos do
fruto descartados. Inferindo que a preparação da farinha preservou os
fitoconstituintes ativos no que se refere ao efeito da gastroproteção, sendo
possível justificar os dados obtidos.
Em continuidade, o efeito gastroprotetor dos extratos no modelo de
indução de úlcera gástrica pela administração de um AINE, a indometacina,
também foi verificado. Em seres humanos, a administração prolongada de
AINES resulta em um risco elevado de hemorragias, perfurações e/ou
úlceras em decorrência da redução da disponibilidade de prostaglandinas na
mucosa [41] e, por conseguinte substância que previnam o dano à mucosa
gástrica associada a essa classe terapêutica têm sido valorizada na prática
clínica.
Fortalecendo o potencial gastroprotetor dos frutos de C. cainito, os
resultados verificados evidenciaram que o EMC, EMS e EMP também
foram capazes de prevenir a lesão gástrica induzida por indometacina.
Dessa forma, fica evidente que os fitoconstituintes presentes nos extratos
estudados possuem potencial antiúlcera contra diferentes agentes
ulcerogênicos.
O aumento da secreção ácida gástrica está presente em uma
variedade de distúrbios que podem afetar o esôfago, estômago e o duodeno
[42]. Considerando que a terapia farmacológica atual no tratamento das
úlceras pépticas é classicamente associada a fármacos que reduzem a
secreção ácida gástrica, o efeito dos extratos do fruto de C. cainito sobre
parâmetros secretores também foi investigado. Entretanto, os extratos do
fruto C. cainito não apresentaram efeito antissecretor.
Mediante o exposto, percebe-se que o modo de ção dos extratos na
prevenção de lesões gástricas induzidas quimicamente não envolve a
inibição da secreção ácida, mas sim, atuam preservando a integridade das
células presentes na mucosa gástrica pelo aumento dos fatores protetores da
mucosa.
Neste contexto, pode-se destacar o fato de que a mucosa
gastrintestinal é revestida por uma camada de muco, com funções de
proteger e lubrificar, além de atuar como barreira de difusão entre o lúmen e
o epitélio [4,43]. Assim, é possível que na ausência do efeito antissecretor, o
95
favorecimento da produção de muco aderido à mucosa gástrica esteja
envolvido no efeito gastroprotetor elicitado pelos extratos testados.
Na análise histoquímica, foi evidenciado que a administração de
EMC, EMS e EMP aumentou significativamente os níveis de mucina,
ressaltando a possibilidade de o modo de ação dos extratos acontecerem
pela manutenção da integridade da barreira de muco aderido a mucosa
gástrica. De fato, os extratos dos frutos de C. cainito administrados na
mínima dose capaz de promover gastroproteção em camundongos também
foram capazes de aumentar os níveis de muco aderido à mucosa gástrica de
camundongos submetidos à ligadura pilórica.
Além dos mecanismos descritos, é provável que outros fatores
protetores da mucosa gástrica também sejam favorecidos pela administração
dos extratos do fruto de C. cainito, entre os quais se destaca o óxido nítrico
(NO), que está diretamente relacionado a efeitos benéficos no trato
gastrointestinal (TGI), ao favorecer a microcirculação junto à mucosa [44].
O efeito gastroprotetor dos extratos provenientes da semente e da polpa dos
frutos de C. cainito foi revertido pelo tratamento com L-NAME (inibidor
não especifico das enzimas NO sintases) evidenciando que o efeito
gastroprotetor desses extratos é depende da disponibilidade de NO.
Todavia, o extrato proveniente da casca ainda exerceu gastroproteção
mesmo diante da abolição da contribuição nitrérgica na homeostasia
gástrica.
Os dados obtidos demonstram que ainda que a composição de
flavonoides seja semelhante nos três extratos; é provável, porém ainda não
provado, que outros fitoconstituintes da casca ainda conferem um
mecanismo de ação independente de óxido nítrico ao EMC.
No intuito de elucidar outros mecanismos de ação envolvidos no
efeito gastroprotetor do EMC, EMS e EMP, investigou-se a participação
dos grupamentos sulfidrilas não protéicos nos efeitos observados. Os
grupamentos sulfidrílicos não proteícos viabilizam mecanismos
antioxidantes, auxiliando na defesa e manutenção da mucosa [45,46]. Desta
forma, a redução dos níveis normais desses grupamentos permite que a
mucosa gástrica fique mais susceptível a ulcerações. Experimentalmente, a
N-etilmaleimida (NEM) têm sido uma ferramenta adequada para quelar
compostos sulfidrílicos, potencializando as injúrias ocasionadas por agentes
ulcerogênicos na mucosa gástrica [46].
96
Diante do exposto, os resultados obtidos, permitem afirmar como
correta a hipótese sobre a associação da atividade gastroprotetora dos
extratos do fruto de C. cainito com os compostos sulfidrilas não proteícos,
dado que todos os extratos não foram capazes de manter o efeito
gastroprotetor após a administração do NEM. Considerando a importância
de grupamentos sulfidrílicos, em especial a glutationa reduzida, na
manutenção do estado redox em níveis normais, os resultados obtidos
reforçam que a disponibilidade de substratos redutores, são cruciais no
modo de ação dos extratos.
Em paralelo à importância da disponibilidade de óxido nítrico e
dos grupamentos sulfidrílicos não proteicos na citoproteção gástrica, tem-se
estudado que os canais de potássio ATP dependentes (KATP) também estão
envolvidos em uma variedade de funções fisiológicas do estômago, tais
como: a regulação do fluxo sanguíneo, a secreção de ácido gástrico e a
contratilidade gástrica [47,48]. Corroborando com o descrito, a
administração de glibenclamida reverteu o efeito protetor do EMC e EMS
demonstrando a importância dos canais KATP no efeito gastroprotetor desses
extratos. Em contraste o extrato obtido com a polpa do fruto de C. cainito
foi capaz de promover efeito gastroprotetor mesmo em animais pré-tratados
com glibenclamida, fortalecendo que os extratos atuam por mecanimos
complementares, porém diferentes.
Os receptores adrenérgicos também atuam no trato gastrointesnial
participando do controle de diversas funções como a inibição a secreção
ácida gástrica, a motilidade e o trânsito. Na mucosa gástrica, percebe-se que
a ativação de receptores α2-adrenérgicos resulta na diminuição de lesões
gastrintestinais [49,50].
Buscando verificar mais uma possibilidade de mecanismo de ação,
nossos resultados mostraram que a administração prévia de ioimbina
(antagonista de receptores α-2-adrenérgicos) aboliu o efeito gastroprotetor
do EMC, EMS e EMP, indicando também o envolvimento destes receptores
na atividade de proteção gástrica exercida pelos extratos.
Ainda, as prostaglandinas mantêm a integridade da mucosa
gástrica pela inibição da ativação de mastócitos, estimulação de secreção de
muco e bicarbonato, inibição da secreção ácida, diminuição da aderência
leucocitária ao endotélio, além do aumento e manutenção do fluxo
sanguíneo [51].
97
Por fim, além de mensurar os níveis de mucina e do muco aderido,
a importância das prostaglandinas na gastroproteção elicitada pelos extratos
também foi investigada pela pré-administração de indometacina em animais
ulcerados por etanol acidificado. Entretanto, apesar dos efeitos em aumentar
os níveis de mucina e muco aderido à mucosa gástrica, o pré-tratamento
com indometacina não foi capaz de reverter o efeito gastroprotetor do EMS
e EMP. Assim, considerando os diferentes mecanismos de ação adjacentes à
gastroproteção promovida por esses extratos, é possível concluir que ainda
que haja redução na disponibilidade de protaglandinas, outros mecanismos
protetores se sobrepõem e resultam na manutenção do efeito antiúlcera
observado.
Por outro lado, de forma interessante, o extrato obtido com as
cascas do fruto C. cainito perdeu o efeito protetor gástrico em camundongos
pré-tratados com indometacina. Vale ressaltar que o EMC foi o único
extrato a desempenhar gastroproteção de forma independente à
disponibilidade de óxido nítrico, sendo assim, a manutenção da
microcirculação gástrica em decorrência da administração deste extrato é
provavelmente favorecida por prostanoides.
Desta forma, podemos inferir a importância dos prostanóides,
incluindo as prostaglandinas, no efeito gastroprotetor do EMC.
Conclusão
Em conjunto, os dados deste estudo demonstraram pela primeira
vez o efeito antiúlcera dos extratos da casca, da semente e da polpa do fruto
de C. cainito em diferentes modelos experimentais. Em paralelo, o efeito
gastroprotetor da suplementação com a farinha do fruto também foi
descrita. De forma interessante, o favorecimento de mecanismos protetores
da mucosa foi evidenciado entre os diferentes, porém complementares
modos de ação dos extratos. Assim, ainda que pré-clinicamente, o potencial
dos frutos de C. cainito como um alimento com propriedade funcional na
prevenção à doença ulcerosa gástrica foi aqui destacado.
98
Agradecimentos
Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Apoio à Pesquisa
Científica e Tecnológica do Estado de Santa Catarina (FAPESC) e
Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) pelo apoio financeiro.
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104
105
CAPÍTULO IV
Evidências experimentais da atividade gastroprotetora dos
triterpenos isolados da casca dos frutos de Plinia edulis:
ácidos maslínico e ursólico
Este artigo foi submetido ao periódico Naunyn-Schmiedeberg's Archives
of Pharmacology com fator de impacto igual a 2,558.
106
107
Evidências experimentais da atividade gastroprotetora dos triterpenos
isolados da casca dos frutos de Plinia edulis: ácidos maslínico e ursólico
Roseane Leandra da Rosa1, Luciane Ângela Nottar Nesello
1, Luisa Nathalia
Mariano Bolda1, Lincon Bordignon Somensi
1, Adriana Campos
1, Ana
Myrelle Pinheiro2, Sabrina Costa
2, Marjana Rial
3, Mariana Tozzo
3, Valdir
Cechinel Filho1, Sérgio Faloni de Andrade
1, Luisa Mota da Silva
1
1Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas. Universidade do
Vale do Itajai (UNIVALI) – Campus Itajaí, Santa Catarina. Rua Uruguai,
458, Centro. CEP: 88302-901.
2Curso de Nutrição. Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) – Campus
Itajaí, Santa Catarina.
3Curso de Biomedicina. Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) –
Campus Itajaí, Santa Catarina.
Autor correspondente: *Luísa Mota da Silva. Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) – Campus
Itajaí, Santa Catarina, [email protected]. Correspondência: Rua Uruguai,
458, Centro. CEP: 88302-901.
108
Resumo: O efeito antiúlcera da infusão das folhas de Plinia edulis (Vell.)
Sobral (Myrtaceae), popularmente conhecida como cambucá e indicada
para tratar desordens gástricas, assim como a presença dos triterpenos
ácidos maslínico (AM) e ursólico (AU) nessa infusão já foram descritas.
Ambos triterpenos também já foram identificados no extrato metanólico das
cascas do fruto das P. edulis (EMCP), entretanto o efeito antiúlcera desse
extrato e desses triterpenoides ainda não foi estudado. Assim, o objetivo
desse estudo foi avaliar a eficácia gastroprotetora do EMCP e dos AM e
AU, utilizando modelos animais validados, a saber: etanol/HCl e
indometacina em camundongos. Em paralelo os efeitos in vitro da
capacidade sequestradora de radical livre (DPPH) e da enzima H+, K
+-
ATPase também foram mensurados. O EMCP e o AU, mas não o AM,
apresentaram atividade sequestradora de radicais livres no teste de DPPH,
reduzindo os níveis do radical em 78,66% e 60,14% em uma concentração
de 100 µg/mL. Em adição, os resultados confirmaram que o EMCP, AM e
AU possuem efeito antiulceroso contra diferentes modelos experimentais,
administrados pela via oral ou intraperitoneal. O AU é capaz de promover
gastroproteção em doses menores que o AM, aumentando os níveis de
mucina em 692%, entretanto não altera a atividade da H+, K
+-ATPase. Em
contraste, tanto o EMCP e o AM nas concentrações de 10 e 100 µg/mL
inibiram a atividade da H+, K
+-ATPase em 61,81%, 68,37%, 54,04% e
70,45, respectivamente. A partir dos dados concluiu-se que o extrato
metanólico das cascas do fruto de P. edulis possui atividade gastroprotetora,
em similaridade a infusão das folhas dessa espécie. Porém, não é possivel
propor o mesmo mecanismo de ação para os triterpenoides isolados. No
entanto, é possível que o AM altere a secreção ácida gástrica através da
inibição da bomba de prótons, enquanto o AU fortalece as barreiras de
defesa da mucosa gástrica, em especial a produção de mucina.
Palavras-chave: Triterpenoides. Fruto silvestre. Antiúlcera. H+, K
+ -
ATPase
Introdução
Hábitos alimentares e o estilo de vida contemporâneo tem sido
relacionado ao maior acometimento de doenças no trato gastrointestinal
(TGI) na população (Ddine et al. 2012). Dentre as desordens gástricas mais
109
prevalentes, destacam-se as úlceras gástricas, com a etiologia ainda não bem
definida (Deore et al. 2011; Nesello et al. 2017), mas com relação direta ao
desequilíbrio entre fatores agressores (ácido clorídrico, pepsina, refluxo de
bile e espécies reativas de oxigênio) e protetores da mucosa gástrica
(barreira de muco intacta, prostaglandinas, fluxo sanguíneo mucoso
adequado e atividade de compostos antioxidantes) (Laine et al. 2008; Wang
et al. 2010; Rozza et al. 2015).
Para tratamento dessas doenças são utilizados os medicamentos
antissecretores, que promovem a redução da secreção ácida gástrica através
do antagonismo dos receptores histaminérgicos do tipo 2 ou da inibição da
bomba de prótons na célula parietal. Todavia, além de ser comum a
recorrência da lesão gástrica, na interrupção do tratamento com esses
agentes terapêuticos, em longo prazo estes são tipicamente associados a
diferentes efeitos adversos, como maior susceptibilidade a pneumonia e
fraturas ósseas, trombocitopenia, hipergastrinemia, deficiência de ferro e
vitamina B12 além do aparecimento de câncer gástrico (Kangwan et al.
2014; Dacha et al. 2015; Boeing et al. 2016).
Estudos epidemiológicos têm apontado que o consumo regular de
frutas e hortaliças está associado à redução da mortalidade e da morbidade
(Lobo et al. 2010; Vieira et al. 2011). De fato, os frutos têm conquistado
papel de destaque na busca de alternativas terapêuticas para diversas
doenças devido a sua composição nutricional e fitoquímica (Feliciano et al.
2010; Albuquerque et al. 2016). Recentemente, Nesello et al. (2017)
descreveram o potencial gastroprotetor de extratos de diferentes frutos
silvestres e indicaram que a presença de triterpenos e flavonoides pode
justificar tal potencial.
A Plinia edulis (Vell.) Sobral (Myrtaceae) é uma espécie arbórea
com frutos comestíveis e endêmica da Mata Atlântica popularmente
conhecida como "cambucá" (Lorenzi et al. 2006). Na medicina popular
brasileira esta espécie é utilizada para tratamento de desordens gástricas,
dor de garganta, diabetes, doenças inflamatórias, diarreia, bronquite e como
tônico, antipirético e diurético (Ishikawa et al. 2008; Carvalho et al. 2012;
Donato e Morretes, 2013). De fato, o efeito gastroprotetor da infusão das
folhas de P. edulis já está descrito na literatura (Ishikawa et al. 2008).
Nesello (2015) evidenciou na casca da P. edulis, triterpenos
pentacíclicos como o ácido maslínico (AM) e o ácido ursólico (AU), os
quais possuem efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e anticancerígenos
110
já descritos (Parra et al. 2009; Zurita et al. 2008; Liang et al. 2016).
Destaca-se que ambos triterpenos também foram identificados na infusão
gastroprotetora estudada por Ishikawa et al. (2008), entretanto não há
relatos pré-clínicos ou clínicos dos efeitos gastroprotetores advindos da
administração desses compostos.
Neste contexto, o presente estudo foi desenhado para avaliar o
potencial gastroprotetor do extrato metanólico bruto das cascas do fruto de
P. edulis e de dois triterpenos majoritários isolados, o AM e o AU, em
modelos experimentais de úlcera gástrica.
Materiais e Métodos
Material vegetal
A coleta dos frutos de P. edulis, bem como a obtenção do extrato e
isolamentos dos compostos foi realizada e descrita anteriormente por
Nesello (2015). Brevemente, os frutos foram coletados no mês de novembro
de 2015, na cidade de Camboriú/SC, identificados pelo prof. Oscar B. Iza
(Universidade do Vale do Itajaí) e exsicata depositada no Herbário Barbosa
Rodrigues (Itajaí/SC, V.C. Filho 121). As cascas foram lavadas, retiradas
(350 g), picadas manualmente e submetidas a um processo de maceração
com metanol (25 °C) por uma semana. Após filtração, o solvente foi
removido sobre pressão reduzida para obtenção do extrato metanólico das
cascas de P. edulis (EMCP).
Como descrito por Nesello (2015), uma parte do EMCP passou
pelo processo de cromatografia em coluna (CC) e dois terpenos foram
isolados e identificados como AM e AU. Identificados por cromatografia
em camada delgada por comparação com amostras autênticas e
estruturalmente confirmadas por espectrometria de massas (EM)-injeção
direta.
Estudo in vitro da atividade sequestradora de radical livre 2,2-diphenyl-
1-picrylhydrazyl (DPPH)
Este procedimento foi realizado de acordo com método descrito
por Da Silva et al. (2015). O potencial redutor do radical livre estável DPPH
foi determinado sob absorbância de 517 nm. O meio reacional foi composto
111
de 750 μL de solução do extrato ou dos compostos triterpênicos em
diferentes concentrações (1, 3 e 10 μg/mL) e 250 μL de solução metanólica
de DPPH (0–60 µM). Após 5 minutos, o decréscimo da absorbância foi
mensurado. Ácido ascórbico (AA: 50 μg/mL) foi utilizado como controle
positivo do teste e água ultrapura como controle negativo (veículo).
Animais
Foram utilizados camundongos fêmeas da linhagem Swiss, pesando
entre 25–35g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do
Itajaí – UNIVALI, mantidos segundo as normas e cuidados com animais de
laboratório, bem-estar e biossegurança na experimentação, conforme
descritas na Lei n. 11.794, de 8 de outubro de 2008, e de acordo com as
diretrizes da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório.
Um cadáver de coelho (Oryctolagus cuniculus) pesando aproximadamente 2
kg foi utilizado para isolamento de microssomos gástricos. Os experimentos
foram submetidos ao Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA) da
Universidade do Vale do Itajaí sob o parecer consubstanciado 047/15.
Úlcera aguda induzida por etanol acidificado em camundongos
A metodologia utilizada foi anteriormente descrita por Beber et al.
(2017). Os camundongos foram submetidos a jejum de doze horas e após
esse período, divididos em diferentes grupos (n=6) e pré-tratados por via
oral com veículo (VEI, água destilada, 10 mL/kg), carbenoxolona (CBX,
200 mg/kg), EMCP (10-300 mg/kg), AM (1-10 mg/kg) e AU (0,1-3 mg/kg).
Em um segundo experimento, os animais foram tratados via
intraperitoneal com 3 mg/kg de EMCP, 1 mg/kg de AM, 0,3 mg/kg de AU e
após uma hora receberam etanol/HCl (60%/0,3 M, 10 mL/kg, v.o) para
indução da lesão gástrica. Posterior, passada mais uma hora da
administração do agente ulcerogênico, os animais foram eutanasiados em
atmosfera de CO2., seus estômagos retirados e abertos para mensuração da
área lesada. As lesões foram quantificadas medindo a área total lesada de
cada estômago em mm² pelo programa de computador EARP®.
112
Análise histológica e histoquímica
Os tecidos gástricos ulcerados pelo etanol/HCl foram coletados
para avaliação histológica em técnica de hematoxilina/eosina e para
quantificação histoquímica das glicoproteínas tipo mucinas coradas pelo
método do ácido periódico de Schiff (PAS) conforme descrito por Mariano
et al. (2016). Para quantificação das mucinas foi empregado o programa
ImageJ® como descrito por Mariano et al. (2016).
Úlcera aguda induzida por indometacina
Similarmente ao descrito por Mariano et al. (2016), após doze
horas de jejum, os camundongos foram divididos em diferentes grupos
(n=6) e pré-tratados por via oral com veículo (VEI, água destilada, 10
mL/kg), CBX (200 mg/kg), o EMCP (30 mg/kg), AM (10 mg/kg) e AU (3
mg/kg). Vale ressaltar que estas doses foram as menores doses efetivas em
reduzir a úlcera gástrica induzida por etanol acidificado.
Após uma hora da administração dos tratamentos orais, os animais
receberam 80 mg/kg (v.o) de indometacina, para induzir lesão gástrica.
Passadas seis horas os animais foram eutanasiados em câmara de CO2, os
estômagos removidos e abertos ao longo da curvatura maior e as lesões
gástricas foram mensuradas conforme descrito anteriormente.
Determinação in vitro da atividade de H+, K
+-ATPase
A enzima H+, K
+-ATPase foi isolada de microssomos gástricos
de um coelho adulto, conforme descrito por Beber et al. (2017). A atividade
ATPasica foi determinada medindo o fosfato inorgânico liberado da
hidrólise de adenosina trifosfato. As misturas de reação continham tampão
Tris-HCl 400 µL (pH 7,4), KCl 20 mM, MgCl2 2,5 mM, ATP 1 mM e 100
µL de microssoma, os quais foram incubados a 37 °C durante 10 min com
ou sem AM (1-100 µg/mL), AU (1-100 µg/mL), Ome (omeprazol, 10 µM)
ou Uoa (Uoabaina, 10 µM). A atividade enzimática foi calculada utilizando
o coeficiente de extinção molar de Pi (11.000/M/cm).
113
Resultados e Discussão
Em todo o mundo, existe uma grande variedade de frutos não
tradicionais com potencial medicinal não explorado. Apesar do uso popular
das folhas de P. edulis na medicina tradicional brasileira, o potencial
farmacológico dos frutos provenientes do cambucazeiro ainda permanece
desconhecido. Ishikawa et al. (2008) identificaram na infusão das folhas da
espécie P. edulis entre outros fitoconstituintes, componentes triterpênicos
(AU e AM), os mesmos terpenoides identificados e isolados por Nesello
(2015) nas cascas dos frutos dessa espécie. Pela semelhança em
fitoconstituinte, este estudo investigou se o extrato metanólico das cascas de
P. edulis, bem como os ácidos maslínico e ursólico desempenham atividade
gastroprotetora, no intuito de acrescer informações validadas acerca do
potencial medicinal de diferentes partes dessa planta e se de fato os
triterpenos em questão participam do efeito antiúlcera desta espécie.
Inicialmente, a capacidade antioxidante do EMCP (1-1000 µg/mL)
foi avaliada através do ensaio da redução do radical DPPH (Fig. 1 A) e
evidenciou que o extrato reduziu em até 78,66%, na concentração de 1000
µg/mL os níveis desse radical, assim como o ácido ascórbico (usado como
controle positivo) que reduziu os níveis do radical em 88,12%, comparado
ao grupo incubado com veículo (62,43 ± 0,02 µM de DPPH).
114
Fig. 1 Atividade sequestradora do radical DPPH do extrato metanólico da casca do
fruto de P. edulis (EMCP) e dos triterpenos isolados ácidos maslínico (AM) e
ursólico (AM). Resultados são apresentados como média ± E.P.M. (n=6). ANOVA
de uma via, seguida por teste de Bonferroni. ***p<0,001, comparando com veículo
(Vei: água). AA= ácido ascórbico (50µg/mL). EMCP= extrato metanólico das
cascas de P. edulis (Painel A). AM= ácido maslínico (Painel B). AU= ácido ursólico
(Painel C).
Diferente do extrato metanólico, o AM não apresentou atividade
antioxidante em todas as concentrações testadas (Fig. 1 B). Além do
método de DPPH, existem diversas metodologias para identificar a
capacidade antioxidante de um composto, incluindo o método de ABTS
(2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido-sulfônico) e a determinação
pelo β caroteno/ácido linoleico. Vale ressaltar que devido à particularidade
de algumas substâncias, como por exemplo, a possibilidade de impedimento
estérico devido à conformação estrutural e, portanto, a necessidade de um
maior tempo reacional, um único método pode não ser capaz de identificar a
capacidade sequestradora de radicais livres (Cabral et al. 2017). Assim, é
possível que a ausência de efeito do AM no teste de DPPH pode ter
ocorrido por conta desse viés experimental.
115
Jamkhande et al. (2016) também descreveram discreta atividade
antioxidante in vitro para o AM no teste de DPPH, porém, quando esses
autores avaliaram a atividade sequestradora de radicais livres do AM
através do método antioxidante total, esse triterpeno apresentou ação tão
eficaz quanto o ácido ascórbico.
O efeito sequestrador do radical livre do AU foi confirmado pelo
método de DPPH (Fig. 1 C), no qual o triterpenoide na concentração de 100
e 1000 µg/mL reduziu em 25,62 e 60,14% os níveis do radical. Çulhaoğlu et
al. (2012) também descreveram o efeito sequestrador do radical DPPH do
AU (100 µg/mL) isolado de S. chrysophylla. Entretanto, o nível de
atividade sequestradora reportada por esses autores foi menor que 10%,
assim os dados aqui apresentados adicionam informações complementares
sobre o efeito antioxidante in vitro do AU.
Para investigação da atividade gastroprotetora do EMCP, AM e
AU, realizou-se a metodologia da indução da úlcera aguda pelo etanol
acidificado em camundongos. Esta metodologia é classicamente utilizada na
busca por compostos protetores da mucosa gástrica, tendo em vista a ação
ulcerogênica do etanol, o qual promove edema na mucosa e hemorragias
subepiteliais. Os mecanismos ulcerativos do etanol compreendem
principalmente a diminuição de fluxo sanguíneo da mucosa culminando no
aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio (EROs) e morte
celular (Lichtenberger, 1999; Beber et al. 2017).
Pode-se observar na Figura 2 A, que o pré-tratamento com o
EMCP reduziu as lesões gástricas induzidas por etanol acidificado nas doses
de 10, 30 e 100 mg/kg em 56,15%, 84,96% e 81,44%, respectivamente,
quando comparados com o veículo (27,73 ± 4,79 mm2). Como esperado, a
administração de carbenoxolona também reduziu a lesão gástrica em
96,55%.
116
Fig. 2 Efeito do extrato da casca do fruto de P. edulis e dos ácidos maslínico e
ursólico na úlcera gástrica induzida por etanol acidificado em camundongos. Os
animais foram tratados por via oral com veículo (Vei: Água 10 mL/kg),
carbenoxolona (CBX 200 mg/kg), extrato metanólico das cascas de P. edulis
(EMCP, 10-100 mg/kg, Painel A), ácido maslínico (AM, 1-10 mg/kg, Painel B) e
ácido ursólico (AU, 0,1-3 mg/kg, Painel C). Resultados são apresentados como
média ± E.P.M. (n=6). ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. **p<
0,01, ***p<0,001 comparando com grupo ulcerado tratado com veículo.
Corroborando com nossos dados, Ishikawa et al. (2008; 2014)
demonstraram que o extrato aquoso (100 - 400 mg/kg, v.o) e etanólico (100
mg/kg, v.o) da folha da P. edulis tem atividade antiúlcera, a qual foi
relacionada com a presença de flavonoides e triterpenoides. Ainda, a
presença dos fitoconstituintes α-amirina, ácido oleanólico, AU e AM
também foram descritas nos extratos testados nestes estudos. Mais
recentemente, Nesello (2015) identificou a presença do AU e AM no extrato
metanólico da casca do fruto de cambucá. Estes achados nos encorajaram a
avaliar o efeito gastroprotetor desses triterpenoides e assim avaliar a
117
hipótese de que tais compostos participam do efeito antiúlcera de extratos
provenientes de P. edulis.
Como é possível verificar na Figura 2 B, o pré-tratamento com
AM, 3 e 10 mg/kg foi capaz de reduzir as lesões gástricas induzidas por
etanol acidificado em 85,40% e 97,12%, respectivamente, quando
comparados com o grupo ulcerado tratado com veículo (19,97 ± 3,94 mm2).
O triterpeno pentacíclico AM é abundantemente encontrado nas folhas da
Olea europaea L., popularmente conhecida como oliveira, onde sua
quantidade é superior a outras espécies, podendo chegar a uma
concentração de 80% do material ceroso que recobre as folhas desta espécie
(Zurita et al. 2008). Entre as atividades descritas para o AM destaca-se seu
potencial antioxidante (Parra et al. 2009), nefroprotetor (Mkhwanazi et al.
2014), hepatoprotetor (Rajopadhye e Upadhye, 2016), antitumoral (Zurita et
al. 2008; Juan et al. 2008), antivírus da imunodeficiência humana (anti-
HIV) (Parra et al. 2009) e hipoglicemiante (Liu et al. 2007), além da cardio
e neuroprotetora (Martín et al. 2007; Lozano-Mena et al. 2014).
Em relação ao AU, o pré-tratamento com esse triterpeno foi capaz
de reduzir as lesões gástricas induzidas por etanol acidificado nas doses de
0,3; 1 e 3 mg/kg em 83,11%, 86,55% e 88,16%, respectivamente, quando
comparados com o grupo tratado com veículo (43,85 ± 6,88 mm2, Fig. 2 C).
Como pode ser observado, o AU promoveu gastroproteção em uma dose
33,33 vezes menor que o AM, sugerindo o papel crucial deste composto no
efeito gastroprotetor do extrato da casca de P. edulis.
Assim como para o AM, diversas atividades biológicas têm sido
descritas para o AU, incluindo antialérgica, antiviral, anti-inflamatória,
antibacteriana e anticancerígena (Liu, 2005; Bai et al. 2012), além de
antioxidante, anti-hiperlipidêmica (Tokuda et al. 1986; Liu, 1995; Lu et al.
2007; Liang et al. 2016), antinociceptiva (Rodrigues et al. 2012; Verano et
al. 2013). Em adição, esse composto tem sido isolado de diferentes espécies
vegetais (Bai et al. 2012). Vale ressaltar que, ainda que pré-clinicamente, o
potente efeito gastroprotetor do AU descrito em nossos resultados em
conjunto ao seu efeito antinociceptivo e anti-inflamatório já descritos
anteriormente, colocam esse composto em uma posição de destaque,
considerando a intolerância gástrica e a ação ulcerogênica de muitos
fármacos utilizados para o tratamento da dor e condições inflamatórias.
118
Na Figura 3, é possível verificar imagens representativas do
aspecto macroscópico das lesões gástricas induzidas por etanol acidificado
em camundongos tratados com veículo, carbenoxolona, EMCP, AM e AU
Fig. 3 Imagens representativas do efeito gastroprotetor do EMCP, AM e AU no
modelo de úlcera induzida por etanol em camundongos. Os animais foram tratados
por via oral com veículo (Vei: Água 10 mL/kg), carbenoxolona (CBX 200 mg/kg),
extrato metanólico das cascas dos frutos de P. edulis (EMCP, 30 mg/kg), ácido
maslínico (AM, 10 mg/kg) e ácido ursólico (AU, 3 mg/kg).
Corroborando com os dados obtidos, a imagem microscópica da
mucosa gástrica exposta ao etanol acidificado evidenciou a perda de células
do epitélio gástrico em paralelo a pontos hemorrágicos no grupo ulcerado
tratado com veículo, além de intensa desorganização da arquitetura das
fossetas gástricas (Fig. 4 A). Por outro lado, o tratamento com AM e AU
minimizou os danos histológicos evidenciados (Fig. 4 A).
119
Fig. 4 Imagens representativas da análise histológica e histoquímica do efeito
gastroprotetor do AM e AU e efeito nos níveis de mucina em tecido gástrico
ulcerado pela administração de etanol acidificado em camundongos (Painel A). Os
animais foram tratados por via oral com veículo (Vei: Água 10 mL/kg),
carbenoxolona (CBX 200 mg/kg), ácido maslínico (AM, 10 mg/kg) e ácido ursólico
(AU, 3 mg/kg). Setas indicam o dano no epitélio gástrico com focos de tecido
hemorrágico, magnificação= 100 × Hematoxilina e eosina. Imagens representativas
da marcação histoquímica de mucina (coradas em magenta) com magnificação de
400 ×. Painel B: resultados são apresentados como média ± E.P.M. n=6 para cada
grupo. Análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguida por
teste de Bonferroni. ***p< 0,001 e *p<0,05 comparando com o grupo ulcerado
tratado com veículo.
Juntamente com os resultados da análise histológica, pode-se
observar na Figura 4 B, que apenas o AU aumentou de forma significativa
os níveis de mucina, em 692% quando comparado ao grupo veículo (371,8
± 43,4 pixels/campo), assim como a carbenoxolona que, conforme
esperado, aumentou os níveis de mucina em 828%. Ainda, na Figura 4 A,
120
apresenta-se a intensidade de marcação das glicoproteínas do tipo mucina
dos estômagos dos animais tratados com veículo, carbenoxolona, AM e AU.
Mediante este resultado, pressupõe-se que o modo de ação do AU,
e não do AM, está relacionado à manutenção da integridade da barreira de
muco aderido à mucosa gástrica, um resultado relevante considerando ser
um diferencial frente aos tratamentos utilizados tradicionalmente nas
úlceras gástricas.
Em similaridade aos resultados obtidos com administração oral, na
Figura 5 verifica-se que o pré-tratamento intraperitoneal com o EMCP (3
mg/kg) foi capaz de reduzir as lesões gástricas induzidas por etanol
acidificado em 86,54%, assim como o AM (1 mg/kg) que reduziu as lesões
em 90,77% quando comparado com o grupo ulcerado tratado com veículo
(57,30 ± 1,71 mm2). Ainda, o AU (0,3 mg/kg), demonstrou possuir
potencial gastroprotetor, com redução nas lesões gástricas em 45,76% em
relação ao grupo ulcerado tratado com veículo.
Fig. 5 Efeito gastroprotetor do extrato da casca do fruto de P. edulis e dos ácidos
maslínico e ursólico administrado via intraperitoneal no modelo de úlcera gástrica
induzida por etanol acidificado em camundongos. Os animais foram tratados por via
intraperitoneal com veículo (Vei: Água 1 mL/kg), carbenoxolona (CBX 20 mg/kg),
extrato metanólico das cascas do fruto de P. edulis (EMCP, 3 mg/kg), ácido
maslínico (AM, 1 mg/kg) ou ácido ursólico (AU, 0,3 mg/kg). Resultados são
apresentados como média ± E.P.M. (n=6). ANOVA de uma via, seguida por teste de
Bonferroni. ***p<0,001 comparando com grupo ulcerado tratado com veículo.
121
Em continuidade à investigação do potencial gastroprotetor do
EMCP e os triterpenos isolados, os efeitos de tais amostras também foram
verificados no modelo de úlcera gástrica induzida por indometacina. De
forma colateral ao efeito terapêutico, os AINEs, com destaque a
indometacina, inibem a atividade da cicloxigenase-1 (COX-1) nas células
do epitélio gástrico, gerando diminuição nos níveis de prostaglandinas e no
fluxo sanguíneo e assim executando efeito ulcerogênico em uso crônico
(Brzozowski et al. 2006; Mózsik, 2010).
Como é possível verificar na Figura 6, o pré-tratamento com o
EMCP (30 mg/kg, v.o) foi capaz de reduzir as lesões gástricas induzidas
pela indometacina em 99,01%, assim como a carbenoxolona (200 mg/kg,
v.o) que foi capaz de reduzir a lesão em 67,32%, quando comparados com o
grupo ulcerado tratado com veículo (13,14 ± 3,04 mm2). O AM e o AU
também apresentaram potencial gastroprotetor contra indometacina, onde o
pré-tratamento oral com AM (10 mg/kg) reduziu as lesões gástricas em
96,28%, e de AU (3 mg/kg) reduziu as lesões em 92,11%, quando
comparados com o grupo veículo.
122
Fig. 6 Efeito gastroprotetor do extrato da casca do fruto de P. edulis e dos ácidos
maslínico e ursólico, na úlcera gástrica induzida por indometacina em camundongos.
Os animais foram tratados por via oral com veículo (Vei: Água 10 mL/kg),
carbenoxolona (CBX 200 mg/kg), extrato metanólico da casca do fruto de P. edulis
(EMCP, 30 mg/kg), ácido maslínico (AM, 10 mg/kg) e ácido ursólico (AU, 3
mg/kg). Painel A: Resultados são apresentados como média ± E.P.M. (n=6).
ANOVA de uma via, seguida por teste de Bonferroni. **p<0,01; ***p<0,001
comparando com grupo ulcerado tratado com veículo. Painel B: Imagens
representativas do efeito gastroprotetor do EMCP, AM e AU no modelo de úlcera
induzida por indometacina em camundongos, setas pretas indicam o sítio da úlcera
no grupo veículo.
Mediante o exposto, fortalecendo o potencial gastroprotetor do
EMCP, AM e AU, os resultados evidenciam que o extrato da casca do fruto
de P. edulis, possui potencial antiúlcera contra diferentes agentes
ulcerogênicos e que este efeito pode estar diretamente relacionado ao AM e
AU. Na Figura 6 (Painel B), podem ser verificadas as imagens
representativas do aspecto macroscópico das lesões gástricas induzidas por
indometacina em camundongos tratados com veículo, carbenoxolona,
EMCP, AM e AU.
123
Considerando que a terapia atual para tratar úlcera gástrica é
baseada em drogas antissecretoras, o efeito do EMCP, AU e AM na
atividade da enzima H+, K
+-ATPase, última etapa na secreção de ácido
gástrico, também foi mensurada.
Como demonstrado na tabela 1, a incubação com EMCP e AM
nas concentrações de 10 e 100 µg/mL inibiram a atividade da H+, K
+-
ATPase em 61,81%, 68,37%, 54,04% e 70,45%, respectivamente.
Entretanto, ainda que o AU tenha promovido gastroproteção em dose menor
que o AM, este triterpeno não modificou a atividade da bomba de prótons.
Com isso, este dado demonstra que o efeito antiúlcera do AU não é devido a
seu potencial inibitório na H+, K
+-ATPase, mas provavelmente devido ao
fortalecimento de fatores protetores da mucosa gástrica, conforme
observado no seu relevante resultado de aumento nos níveis de mucina.
Tabela 1. Efeito in vitro do extrato metanólico das cascas de P. edulis e dos
ácidos maslínico e ursólico na atividade da enzima H+/K
+-ATPase
Grupos Concentração Atividade
da H+/K
+-ATPase (mM
iP/mg/min)
Veículo - 1,249 ± 0,072
Omeprazol 10 µM 0,681 ± 0,085***
Uoabaína 10 µM 1,430 ± 0,036
EMCP 1 µg/mL 0,900 ± 0,032
10 µg/mL 0,477 ± 0,013***
100 µg/ mL 0,395 ± 0,007***
AM 1 µg/ mL 1,108 ± 0,110
10 µg/mL 0,574 ± 0,006***
100 µg/mL 0,369 ± 0,004***
AU 1 µg/mL 1,360 ± 0,010
10 µg/mL 1,373 ± 0,002
100 µg/mL 1,229 ± 0,009 Resultados estão expressos como média ± E.P.M. (n=3). ***p <0.001 comparado ao
grupo veículo (DMSO 10%). ANOVA de uma via seguida do teste de Bonferroni.
EMCP: extrato metanólico das cascas de P. edulis. AM: ácido maslínico. AU= ácido
ursólico.
124
Conclusão
Em conclusão, os dados aqui demonstram que o extrato metanólico
das cascas dos frutos de P. edulis e os dois triterpenos isolados desse
extrato, o ácido maslínico e o ácido ursólico, apresentam potencial
gastroprotetor. O efeito antiúlcera dos triterpenos foi mediado por
mecanismos diferentes, destacando ação inibitória do ácido maslínico na
atividade da H+, K
+-ATPase e à manutenção da integridade da barreira do
muco aderida à mucosa gástrica promovida pelo ácido ursólico. Uma vez
que esses compostos já foram identificados na infusão das folhas de P.
edulis, a qual é popularmente indicada para o tratamento de úlceras
gástricas, os dados aqui obtidos também contribuem para a validação do uso
popular desta espécie, indicando a participação desses triterpenos nesse
efeito verificado na casca.
Agradecimentos
Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Apoio à Pesquisa
Científica e Tecnológica do Estado de Santa Catarina (FAPESC) e
Universidade do Vale do Itajaí (UNIVALI) pelo apoio financeiro.
REFERÊNCIAS
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Costa HS (2016) Nutritional and phytochemical composition of Amonna
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130
131
CAPÍTULO V
Considerações Finais
Em conclusão, o presente estudo apresentou o efeito antiúlcera dos
extratos metanólicos da casca, da semente e da polpa do fruto de C. cainito,
assim como do extrato metanólico da casca do fruto de P. edulis e de seus
fitoconstituintes isolados, ácidos maslínico e ursólico, em diferentes
modelos experimentais. Em adição, o efeito gastroprotetor da
suplementação com a farinha do fruto C. cainito também foi evidenciado.
Os extratos da casca, semente e polpa do fruto de C. cainito
demonstraram possuir atividade antioxidante, o que pode ser justificado
pela alta concentração de compostos fenólicos; além de apresentarem efeito
gastroprotetor por vias distintas e complementares, através do
favorecimento de diferentes mecanismos protetores da mucosa gástrica
(NO, SH-NP, receptores α-2-adrenérgicos e prostaglandinas). Entretanto, os
extratos dos frutos de C. cainito não promoveram a inibição da secreção
ácida gástrica, mas aumentaram a secreção de mucina na mucosa gástrica.
Assim, ainda que pré-clinicamente, o potencial dos frutos de C. cainito
como uma fonte funcional na prevenção à doença ulcerosa gástrica foi aqui
confirmado.
O extrato da casca do fruto de P. edulis, e os triterpenos isolados
deste extrato, os ácidos maslínico e ursólico, também apresentaram vias de
ação complementares e distintas, destacando para o ácido maslínico a
redução na atividade da enzima H+K
+-ATPase e para o ácido ursólico a
atividade antioxidante e manutenção da integridade da barreira do muco
aderida à mucosa gástrica
Desta forma, diante da grande biodiversidade brasileira a qual
conta com inúmeras espécies frutíferas, os dados obtidos neste estudo
confirmam o potencial gastroprotetor dos frutos C. Cainito e P. edulis e
ressaltam a possibilidade terapêutica de fitoconstituintes de frutos silvestres
e a utilização de ambos como alimentos com propriedades funcionais.
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