Elda Pereira Noronha

Leucemia linfoblástica aguda de

células T precursoras .

LEUCEMIAS AGUDAS

As leucemias agudas são grupos heterogêneos de

doenças, caracterizadas pela expansão clonal de

células hematopoiéticas imaturas na MO que pode

chegar a atingir o SP e demais órgão do SHP.

Proliferação

Diferenciação

Apoptose

Alterações Genomicas:

Mutações

Translocações

Rearranjos

Desregulação das vias de

transdução de sinais

Alterando o processos de

transcrição gênicas

(BUCCHERI; LORENZI, 2006)

� As alterações podem ocorrer em diversos níveis maturativosDEFININDO A LINHAGEM E SUBTIPO LEUCEMICO

LEUCEMIAS AGUDAS

LEUCEMIAS AGUDASLEUCEMIAS AGUDAS

LMA D@D@

Célula ProgenitoraPluripotente (Stem cell)

LAI

(Stem cell)

LLA-cpBPrecursores

TPrecursores

BLLA-T

LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDASLEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDASLLALLA--T x LLAT x LLA--cpBcpB

• LLA-T Associada a características clínicas

desfavoráveis:

• Leucometria elevada• Leucometria elevada

• Envolvimento do SNC

•Idade > 10 anos

LLA-T Freq(%)

Clinica-prognóstico EFS(%)

HOX11rearr 7-8 Bom progn ?

FREQ. CLINICA-PROGNOSTICO EFS (%)(%) 5 anos

LLApB

Hiperdiploide 20 à 30 Progn excelente - sensibil. Anti-metabolitos 85 à 95

Biologicamente complexas;

Rearranjos e translocações:SIL-TAL1, LMO1, LMO2, HOX11, HOX11L2, MLL-ENL, NUP214-ABL1

Mutações: NOTCH1, FBXW7, IL7R, PTEN ,PHF6

LEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDASLEUCEMIAS LINFOBLASTICAS AGUDASLLALLA--T x LLAT x LLA--cpBcpB

HOX11rearr 7-8 Bom progn ?

HOX11L2rearr

20-25 Bom Progn-Sem consenso ?

HOXArearr 4-6 Progn pobre-Bebeficio com

inibidores de histona

?

NUP214-

ABL1

6 Progn pobre-Beneficio com

IMATINIBE

40-50

MLL-ENL 2-4 Bom Prog 80-90

NOTCH1-

FBXW7

50 Bom Prog-Sem consenso 80

PTEN 10-28 Progn Pobre-? ?

Hiperdiploide 20 à 30 Progn excelente - sensibil. Anti-metabolitos 85 à 95

ETV6-RUNX1 15 à 25 Progn excelente com L-ASP intesiva 80 à 90

Tris 4 e Tris 10 20 à 25 Progn excelente - sensibil. Anti-metabolitos 85 à 90

TCF3-PBX1 2 à 6 Risco de rSNC; Progn excelente com MTX ad 80 à 85

i-amp21 3 Progn Pobre- Beneficio com intensificação(R-In) 30 à 40

MLL-AF4 2 à 4 Progn Pobre- varias tentativas de Modif Tto 30 à 40

BCR-ABL 3 à 5 Progn Pobre- Imatinibe melhorou a sobrevida 80* 3anos

t(8;14)(q23;q32) 2 Progn Bom- com intense Tto: MTX ad;Ara-C;CTX 75 à 80

Hipodiploide 2 Progn Pobre- ? 30 à 40

CRFL2 (tr/expres) 6 à 8 Progn Pobre- ?

del IKZ1 15 à 35 Progn Pobre- ? Resistente a L-Asp e DNR 50 à 55

LEUCEMIAS AGUDAS DE CÉLULAS TLEUCEMIAS AGUDAS DE CÉLULAS T

SUBCLASSIFICAÇÃOSUBCLASSIFICAÇÃO DASDAS LLALLA--TT DEDE ACORDOACORDO COMCOMESTAGIOSESTAGIOS DEDE MATURAÇÃOMATURAÇÃO DEDE TIMOCITOSTIMOCITOS NORMAISNORMAIS

SUBTIPOS cCD3 CD7 CD2 CD5 CD1a mCD3 CD4 CD8

T-I (Pro-T) + + - - - - - -

T-II (Pre-T) + + + ± - - - -

T-III (Cortical) + + + ± + - + +

T-IV (Medular) + + + ± - + ± ±

ONTOGENIA DE CELULAS TONTOGENIA DE CELULAS T-- Perfil Perfil maturativomaturativo

Béné, 2005

• 15% LLA-T

• Estagio maturativo mais imaturo –

ETPs, conjunto de timócitos que

inicialmente migram da medula óssea

EARLY TEARLY T--CELL PRECURSOR CELL PRECURSOR -- AALLLL

inicialmente migram da medula óssea

para o timo;

• Péssimo prognóstico

Coustain- Smith, et al . 2009 Lancet Oncology.

1)

Screen Imunofenotípico de todos os casos

(ST JUDE+AIEOP)

N= 239

139 pacientes ST JUDE

17 ETP-LLA

122 LLA-T típicas

100 pacientes AIEOP

13 ETP-LLA

87 LLA-T típicas

DESENHODESENHO DODO ESTUDOESTUDO139 Pacientes

1992-2006

≤ 18 anos

(ST JUDE)

100 Pacientes 1992-2006

≤ 18 anos

(AIEOP)

55 Pacientes 34 Pacientes

Avaliação do perfil de expressão gênica

Genes expressos em ETP normais

2)

3) ETP- LLA x LLA-T � Perfil de expressão gênica, Imunofenotípica, análise de

sobrevida e avaliação de DRM .

13 casos com perfil de expressão

genica semelhante as ETPs

Avaliação do perfil

imunofenotípico dos casos de

ETP-LLA

RESULTADOSRESULTADOS

13 casos com perfil de expressão genica semelhante ao descrito para ETPs:

- Aumento da expressão de CD44, CD34, KIT, GATA2, CEPBA, SPI1, ID2 e MYB

- Genes pouco expressos: CD1, CD3, CD4, CD8, RAG1, NOTCH3, PTCRA, LEF1, TCF12,

LAT , LCK,TCF7 e ZAP70

RESULTADOSRESULTADOS

Avaliação do perfil de expressão de marcadores celulares:

- Perfil imaturo: ausência de CD1a e CD8

- expressão fraca do CD5 (<75% células positivas)

- Expressão de um ou mais marcadores mielóides (CD13, CD33, CD11b e CD65)

ou de células tronco (CD117, CD34 e HLA-DR)

12.2% (17/139) apresentaram esse perfil

RESULTADOSRESULTADOS

RESULTADOSRESULTADOS

RESULTADOSRESULTADOSUnivariate and multivariate analysis of event-free survivalaccording to the diagnosis of ETP-ALL and selected variables

• Os resultados demonstraram que o diagnóstico de ETP-LLA é

um maior preditor de prognóstico que DRM.

• O elevado risco de falha na remissão ou subseqüente recaída

para pacientes com ETP-LLA, se tratados com quimioterapia de

CONCLUSÕESCONCLUSÕES

para pacientes com ETP-LLA, se tratados com quimioterapia de

intensidade padrão, indica a necessidade alternativas de

tratamento.

Jinghui Zhang1*, LiDing2,3*, Linda Holmfeldt et al. + 62 co-autores

Nature,v. 1-481, 157-163,2012.

St Jude Children’s Research Hospital, Memphis, Tennessee, USA.

Department of Molecular and Developmental Genetics, Center for Human Genetics, Belgium.

University of California School of Medicine, San Francisco, California, USA

Department of Stem Cell and Developmental Biology, Campbell Family Cancer Research Institute, Ontario Cancer Institute,

University Health Network, Toronto, Canada.; Onco-Hematology Laboratory, Department of Pediatrics, University of Padua, Italy.

Oncology/Bone Marrow Transplantation and Center for Cancer and Blood Disorders, University of Colorado Denver School of

Medicine, Children’s Hospital Colorado, Aurora, Colorado USA.

Department of Biostatistics, University of Florida College of Medicine, Florida , USA.

Department of Laboratory Medicine, Seattle Children’s Hospital, Seattle, Washington ,USA.

12 casos LLA-ETP + Amostras de remissão ���� whole-genome sequencing

Para identificação da frequência de mutações encontradas:

Sanguer sequencing e SNP array

DESENHODESENHO

52 ETP-LLA x 42 LLA-T típica

3 casos � whole-genome sequencing

Sequence mutations in ETP ALL

Genes comumente multados em LLA-T

NRAS (3/12); JAK1 (2/12); NOTCH1 (1/12); PHF6 (3/12); FLT3 (1/12)

Novos recorrente alvos:DNM2 (N=2)

ECT2L (N=2)

EP300 (N=2)

RESULTADOSRESULTADOS

EP300 (N=2)

GATA3 (N=2)

IL7R (N=2)

JAK3 (N=3)

RELN (N=2)

RUNX1 (N=4)

Sequence mutations in ETP ALL and Non-ETP ALL

81% ETP x 31% Non-ETP

42% ETP x 11% Non-ETP

RESULTADOSRESULTADOS

Expressão de genes das vias de sinalização celular

Aumento da expressão de genes envolvidos na via de sinalização JAK-STAT e

diminuição da expressão de genes da via de sinalização do receptor de célula T

HSC GMP SCL

Perfil de expressão ETP-ALL x NON-ETP comparados a células precursoras

normais e leucêmicas

ETP

• Uniformidade das características clinicas e Imunofenotípicas mas com grande

variedade de alterações genéticas.

• Apesar da diversidade observou-se uma prevalência de mutações em genes

envolvidos na via de sinalização receptores de citocinas e do RAS (IL-7R, FLT3,

JAK1, JAK3, NRAS, KRAS, BRAF) , desenvolvimento hematopoiético (EP300,

RUNX1, ETV6, GATA3, IKZF1) e modificadores de histona (SUZ12, EDD, EZH2,

SETD2).

• Mutações em genes que regulam receptores de citocina e/ou a via de sinalização do

RAS é uma característica comum de LMA e menos comum em LLAcpB e LLA-TRAS é uma característica comum de LMA e menos comum em LLAcpB e LLA-T

• Perfil de expressão genica semelhante ao ETP normais de murinos, também

mostrou forte similaridade a células tronco hematopoiéticas normais e mielóides

leucêmicas humanas.

• Regimes de tratamento usado nas LMA; Terapia com inibidores de receptores de

citocinas e sinalização da via JAK/STAT.

Caso de ETP-ALL identificado no PHOP

Paciente do sexo Feminino, 13 anos, Branca, São Paulo-SP.

Informações clínicas:Linfonodomegalia

Dados do Hemograma:

Leucometria: 22.800

MORFOLOGIA

Leucometria: 22.800

Hematocrito: 18,6%

Hemoglobina: 6,2

Plaquetas: 22.000

Caracterização Imunofenotípica

ESTUDO DA EXPRESSÃO CELULAR E GÊNICA DE RECEPTORES DE CITOCINAS E

SEU SIGNIFICADO CLÍNCO E PROGNÓSTICO EM LLA-T PEDIÁTRICASPROGNÓSTICO EM LLA-T PEDIÁTRICAS

ELDA PEREIRA NORONHA

Genes comumente multados em LLA-T

NRAS (3/12); JAK1 (2/12); NOTCH1 (1/12); PHF6 (3/12); FLT3 (1/12)

DNM2 (N=2)

ECT2L (N=2)

EP300 (N=2)

GATA3 (N=2)

IL7R (N=2)IL7R (N=2)

JAK3 (N=3)

RELN (N=2)

RUNX1 (N=4)

� IL-7 ���� estroma da medula óssea e timo; essencial para o desenvolvimento

normal de células-T e para homeostase.

� IL-7Rα � Regulador da progressão do ciclo celular, desenvolvimento e

proliferação de células-T.

� Cromossomo 5 locus p13.2

� Mutações no gene IL-7R em ~10% dos casos de LLAs-T pediátricas.

IL7R

(Gonzaléz et al, 2009; Zennatti et al, 2011; Shochat C et al, 2011;Mackall et al, 2011)

• Expressão do receptor de IL-7R em LLA-T

97%

IMF: 48.8IMF:12.3

5%

T-I

(n = 4)

T-II

(n = 8)

T-III

(n = 11)

T-IV

(n = 24)

Total

(n = 47)

P

CD127 (IMF) 11.1 ± 3.4

(7.0 - 15)

10.3 ± 5.4

(3.5 - 20.2)

14 ± 7.8

(4.9 - 30.6)

16.8 ± 9.9

(5.8 - 48.8)

14.6± 8.6

(3.5 - 48.8)

0.222

CD127 (%) 38.4 ± 19.5

(12.7- 60)

32.9 ± 20.6

(5 - 62)

49.9 ± 27.6

(12.4 - 93)

56.4 ± 26.5

(10 - 97)

49.2 ± 26

(5 - 97)

0.163

Tabela 1: Perfil de expressão do CD127 de acordo com perfil maturativo

TOTALn = 133 (100%)

FLT3 wtn = 128 (96.2%)

FLT3mutn = 5 (3.8%)

p

Age (years)

<10 66 (49.6%) 64 (50%) 2 (40%)

10-18 65 (48.9%) 62 (48.4%) 3 (60%) 0.680

SI 2 (1.5%) 2 (1.6%) -

Gender

Male 99 (74.4%) 95 (74.2%) 4 (80%)

Female 34 (25.6%) 33 (25.8%) 1 (20%) 1.000

WBC ( x 109/L)

< 50 60 (45.1%) 56 (43.7%) 4 (80%)

≥50 71 (53.4%) 70 (54.7%) 1 (20%) 0.178

Mutações do FLT3

≥50 71 (53.4%) 70 (54.7%) 1 (20%) 0.178

NA 2 (1.5%) 2 (1.6%) 0

EGIL

T-I 16 (12%) 14 (11%) 2 (40%)

T-II 23(17.3%) 21 (16.4%) 2 (40%) 0.119

T-III 27(20.3%) 27 (21.1%) 0

T-IV 54 (41%) 53 (41.4%) 1 (20%)

NA 13 (9.7%) 13 (10.2%) 0

HOX11L2

Positive 16 (12%) 15 (11.7%) 1 (20%)

Negative 93(70%) 89 (70%) 4 (80%) 0.978

NA 24 (18%) - -

SIL-TAL1

Positive 27 (20.3%) 27(21.1%) 0

Negative 63 (47.4%) 59 (46.1%) 4 (80%) 0.312

NA 43 (32.3%) - -

Table 2: Differences of immunophenotyping expression of CD117 and CD135 according to T-ALL subtypes.

Totaln = 54 (100%)

T-In = 5 (9.3%)

T-II n = 11 (20.4%)

T-IIIn = 13

(24%)

T-IVn = 25 (46.3%)

p

MFI CD135 6.7

(3.0 - 15)

7.7 ± 4.9

(3.0-15)

7.1 ± 3.2

(3.3-13.3)

5.9 ± 2.5

(3.4-1.8)

6.7± 3.0

(3.0-11.4)

0.766

MFI CD117 12.8

(2.9 - 93)

43.5 ± 33

(4.0 - 93)

17.8 ± 18

(3.0 - 66)

6.1 ± 2.0

(3.3 -9.0)

7.8 ± 8.2

(2.9 - 41)

0.025*

Avaliação da expressão celular do Receptor FLT3 e c-KIT por CMF

Table 3: Differences of immunophenotyping expression of CD117 and CD135 according to FLT3 status.

Total n = 54 (100%)

FLT3 wt n = 51 (94.4%)

FLT3mutn = 3 (5.6%)

p

CD117

<20% 39 (72 %) 39 (76%) 0 0.018*

≥20% 15 (28 %) 12 (24%) 3 (100%)

MFI CD117 12.8 (2.9 - 93) 5.7 (2.9 - 93) 26.6 (8.4 - 40) 0.042*

CD135

<20% 44 (81.2%) 42 (82%) 2 (67%) 0.461

≥20% 10 (18.8%) 9 (18%) 1 (33%)

MFI CD135 6.7 (3.0 - 15) 6 (3.0-13) 9.7 (6.7-15) 0.063

PERSPECTIVAS• Rastrear mutações do gene IL-7R, bem como, identificar

alterações adicionais através da técnica de MLPA em genes de

via de sinalização celular e diferenciação tais como SIL,TAL1,

LEF1, CASP8AP2, MYB, CDKN2A, CDKN2B,MTPA,

NUP214,ABL1, PTEN, LMO1, LMO2, NF1, PTPN2 e PHF6.

• Buscar as informações clínicas, proceder com as análises para

testar as possíveis correlações entre perfil imunofenotípico,

alterações moleculares identificadas e associação com a

sobrevida dos pacientes.

PHOPPHOP

ALUNOS ALUNOS ::Bruno Lopes, Bruno Lopes, FrancianneFrancianne

Andrade,ThayanaAndrade,Thayana Barbosa, Barbosa, TállitaTállita

Dra Maria S Pombo de OliveiraDra Beatriz de Camargo

Andrade,ThayanaAndrade,Thayana Barbosa, Barbosa, TállitaTállita

MecianyMeciany, Aline , Aline M.ScovinoM.Scovino, Caroline , Caroline

Barbieri, Suellen Valadares, Rafaela Barbieri, Suellen Valadares, Rafaela

Montalvão.Montalvão.