MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

INVESTIGAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DA SUBPOPULAÇÃO LIFOCITÁRIA NO

SANGUE PERIFÉRICO EM MULHERES COM PAPILOMAVÍRUS HUMANO DE

ALTO RISCO ONCOGÊNICO

DALIANA CALDAS PESSOA DA SILVA

NATAL/RN

2018

DALIANA CALDAS PESSOA DA SILVA

INVESTIGAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DA SUBPOPULAÇÃO LIFOCITÁRIA NO

SANGUE PERIFÉRICO EM MULHERES COM PAPILOMAVÍRUS HUMANO DE

ALTO RISCO ONCOGÊNICO

Tese apresentada ao programa de

Pós-Graduação em Ciências da

Saúde da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte como requisito

para a obtenção do título de Doutor

em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Junior

NATAL/RN

2018

FICHA CATALOGRÁFICA

Silva, Daliana Caldas Pessoa da.

Investigação das alterações da subpopulação lifocitária no

sangue periférico em mulheres com papilomavírus humano de alto

risco oncogênico / Daliana Caldas Pessoa da Silva. - Natal, 2019.

83f.: il.

Dissertação (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande

do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação

em Ciências da Saúde. Natal, RN, 2018. Orientador: Geraldo Barroso Cavalcanti Junior.

1. Papillomaviridae - Dissertação. 2. Papilomavírus humano -

Dissertação. 3. PCR - Dissertação. 4. Biomarcadores - Dissertação.

I. Cavalcanti Junior, Geraldo Barroso. II. Título.

RN/UF/BS-CCS CDU 616-006.5

I

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenador do Programa de pós-Graduação em Ciências da Saúde:

Profa. Dra. Anne Katherine da Silveira Gonçalves

Vice-Coordenador do Programa de pós-Graduação em Ciências da Saúde

Prof. Dr. Guilherme Maranhão Chaves

II

Daliana Caldas Pessoa da Silva

INVESTIGAÇÃO DAS ALTERAÇÕES DA SUBPOPULAÇÃO LIFOCITÁRIA NO

SANGUE PERIFÉRICO EM MULHERES COM PAPILOMAVÍRUS HUMANO DE

ALTO RISCO ONCOGÊNICO

Aprovada em 09/11/2018

Presidente da banca:

Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Junior

Membros da banca:

Profa. Dra. AMALIA CINTHIA MENESES DO REGO – (Membro Externo)

Dra.SARAH DANTAS VIANA MEDEIROS – (Membro Externo)

Profa.Dra.ANA CLAUDIA GALVÃO FREIRE GOUVEIA – (Membro Externo)

Profa. Dra MAIZA ROCHA DE ABRANTES – (Membro Externo)

III

DEDICATÓRIA

Ao meus pais, Fatima Caldas e Dailor Pessoa,

essenciais para mais esta etapa da minha vida

A minha avó, Isabel Caldas, que através de seu amor, carinho,

dedicação e compreensão fazem dela meu porto seguro.

Aos meus filhos, Isabelle e Arthur Caldas, alegria que me renova a

cada dia.

A meu esposo Jose Bonifácio Peixoto Filho, pelo carinho e

paciência, respeitando minha ausência em muitos momentos.

IV

AGRADECIMENTOS

1. A Deus, que sempre esteve ao meu lado me protegendo ao longo da vida.

2. Ao meu orientador Geraldo Barroso Cavalcanti Junior e a Profa. Ana

Katherine da Silveira Gonçalves, que me incentivaram a ingressar na carreira

acadêmica e compartilharam seus conhecimentos desde a dissertação do

mestrado até a conclusão dessa tese de doutorado. Agradeço e sou grata por

tudo que vocês me ensinaram.

3. À companheira de docência na Universidade Federal do Rio Grande do Note,

amiga, incentivadora e colaboradora nesse projeto de pesquisa, professora

Janaina Crispim, que sempre acreditou no meu potencial e me motivou com

palavras de incentivo, sem deixar de dividir comigo sua experiência.

4. Aos professores da Universidade Federal do Rio Grande do Norte e

Universidade Potiguar, Jose Queiroz Filho e Ricardo Cobbuchi, que foram

fundamentais para a execução dessa pesquisa, bem como para a minha

formação como pesquisadora.

5. À minha Madrasta, ginecologista, Dra. Célia Menezes, que me ajudou na

seleção das pacientes e na coleta de material da pesquisa na clínica Potengi.

6. Aos meus filhos Isabelle e Arthur pelo apoio incondicional, pela compreensão

nos momentos de ausência e pelo carinho e o amor fundamentais para que

nos momentos difíceis não desistisse desse sonho.

7. Ao meu amigo Thiago Diniz, por toda ajuda na formatação da tese

8. À todas as mulheres que aceitaram participar do estudo acreditando que

poderão contribuir com o avanço na prevenção e no tratamento de lesões de

colo de útero e principalmente confiando na seriedade do trabalho e nos

profissionais envolvidos

V

“ Se pensar é o destino do ser humano, continuar sonhando é o seu grande desafio.

E isto, é lógico, implica em trajetórias com riscos, em vitórias, com lutas, e não

poucos obstáculos pelo caminho. Apesar de tudo, seja ousado. Liberte sua

criatividade. E NUNCA DESISTA DOS SEUS SONHOS, pois eles transformarão sua

vida em uma grande aventura”.

Augusto Cury

VI

RESUMO

O câncer de colo do útero é um problema de grande relevância social, uma

vez que é a segunda malignidade ginecológica mais comum no mundo. O principal

precursor do câncer do colo uterino é a infecção pelo papilomavírus humano (HPV).

Apesar dos grandes avanços na biologia do HPV, pouco se sabe sobre a resposta

imune a este vírus. O vírus do papiloma humano (HPV) esta associado à

carcinogênese cervical por meio de evidências epidemiológicas e laboratoriais. As

infecções por HPV ocorrem em mulheres em todo o mundo. A busca de potenciais

marcadores de prognóstico, objetivando o entendimento da progressão das lesões

intraepiteliais é de suma importância. Acredita-se que fatores imunoregulatórios,

imunogenéticos e proteínas do ciclo celular estejam intimamente envolvidos no

processo de carcinogênese. Por esta razão, é de grande importância a detecção

precoce deste tipo de infecção. Considerando o exposto, a proposta inicial do projeto

foi avaliar o perfil imunológico sistêmico de pacientes portadoras do vírus HPV. Em

um primeiro momento foi realizado exames de citologia oncótica para triar pacientes

que fossem portadoras vírus HPV, em seguida foi realizada a técnica de captura

híbrida e reação em cadeia de polimerase (PCR) para se tipificar o vírus,

subsequentemente foi realizado a imunfenotipagem dessas pacientes para se

avaliar perfil imunológico, quantificando os linfócitos (células CD4, CD8, NK e NKT).

Sendo evidenciado, um aumento relativo dos linfócitos TCD8+ em pacientes com

HPV de alto poder oncogênico e uma expressiva diminuição das células NK e NKT,

independente da oncogenicidade do HPV. Nosso estudo esta cadastrado no comitê

de ética e pesquisa do hospital universitário Onofre Lopes (CEP-HUOL), com o

número 097/07. Posteriormente, realizamos uma revisão sistemática da expressão

imunohistoqímica de p16, ki-67 e p53 em pacientes com lesões cervicais, obtendo

como resultado, uma maior expresão desses marcadores de acordo com a

gravidade das lesões, podendo ser considerados biomarcadores valiosos para se

discriminar os estágios das lesões cervicais progressivas.

Palavras-chave: papilomavírus humano, PCR, biomarcadores.

VII

ABSTRACT

Cervical cancer is a problem of great social relevance, since it is the second

most common gynecological malignancy in the world. The main precursor of cervical

cancer is human papillomavirus (HPV) infection. Despite the great advances in the

biology of HPV, little is known about the immune response to this virus. Human

papillomavirus (HPV) is associated with cervical carcinogenesis through

epidemiological and laboratory evidence. HPV infections occur in women all over the

world. The search for potential prognostic markers, aiming at understanding the

progression of intraepithelial lesions is of paramount importance. It is believed that

immunoregulatory, immunogenic and cell cycle proteins are closely involved in the

process of carcinogenesis. For this reason, the early detection of this type of infection

is of great importance. Considering the above, the initial proposal of the project was

to evaluate the systemic immune profile of patients with HPV virus. Initially, oncotic

cytology tests were performed to screen patients who were carriers of HPV viruses,

followed by the hybrid capture and polymerase chain reaction (PCR) to typify the

virus, subsequently the immunophenotyping of these patients to evaluate the

immunological profile, quantifying the lymphocytes (CD4, CD8, NK and NKT cells). It

was evidenced a relative increase of the CD8 + T lymphocytes in patients with high

oncogenic HPV and an expressive decrease of the NK and NKT cells, independent

of HPV oncogenicity. Our study is registered in the ethics and research committee of

the university hospital Onofre Lopes (CEP-HUOL), number 097/07. Subsequently,

we performed a systematic review of the immunohistochemical expression of p16, ki-

67 and p53 in patients with cervical lesions, obtaining as a result a greater

expression of these markers according to the severity of the lesions, being able to be

considered valuable biomarkers to discriminate the stages of progressive cervical

lesions.

Key words: human papillomavirus, PCR, biomarkers.

VIII

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AeMo – Anticorpos monoclonais

APC – Célula apresentadora de antígeno

CTL – Línfócito T citotóxico

CD- Célula dendítrica

CF- Citometro de fluxo

CCU – Câncer de colo uterino

CC – Cãncer Cervical

DNA- Ácido desoxirribonucleico

E1 – Proteína precoce E1 do HPV

E2 – Proteína precoce E2 do HPV

E3 – Proteína precoce E3 do HPV

E4 – Proteína precoce E4 do HPV

E5 – Proteína precoce E5 do HPV

E6 – Proteína precoce E6 do HPV

EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra - Acético

FAPERN- Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte

FICT – Isotiocianato de Fluoresceina

HIV- Vírus da imunodeficiência humana

HTLV – Vírus Linfotrópico de células T Humana

HPV- Papilomavírus humano

HSIL-Lesão Escamosa Intraepitelial de Alto Grau

HUOL- Hospital Universitário Onofre Lopes

INCA – Instituto nacional do câncer

IL – Interleucina

INF - Interferom

IST – Infecções Sexualmente Transmissíveis

LSIL- Lesão Escamosa Intraepitelial de Baixo Grau

LGL – Linfócitos Grandes Granulares

LCR – Long Central Region

LTA - Linfócitos T Auxiliares

LTP – Linfócitos T Periférico

NK – Natural Killer

MS – Ministério da Saúde

NIC1- Neoplasia intraepitelial cervical grau I

NIC2- Neoplasia intraepitelial cervical grau II

NIC3- Neoplasia intraepitelial cervical grau III

OR – Odds Rations

PCR- Reação em cadeia da Polimerase

PB – Pare de bases

PBS – Salina tamponada com fosfato

PPGCSA- Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

PSPP 0.8.3- Software de análise estatística

SP – Sangue periférico

SUS – Sistema Único de Saúde

TCLE- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Tregs - Células T reguladoras

TNF – Fator de Necrose Tumoral

UFRN- Universidade Federal do Rio Grande do Norte

UnP- Universidade Potiguar

URR – Upeper Regulatory Region

X

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................... 12

2 REVISÃO DA LITERATURA..................................................................... 14

2.1 BIOLOGIA E CARATERIZAÇÃO DO PAPILOMAVÍRUS

HUMANO..................................................................................................

14

2.2

2.3

2.4

3

PERSITÊNCIA E ELIMINAÇÃO DO VÍRUS.............................................

TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO DO HPV..............................................

O HPV E A INTERFERENCIA NO SISTEMA IMUNOLÓGICO DO

HOSPEDEIRO...........................................................................................

OBJETIVOS .............................................................................................

15

16

17

21

3.1 OBJETIVO GERAL .................................................................................. 21

3.2 OBJETIVOS.ESPECÍFICO........................................................................ 21

4

4.1

4.2

METODOLOGIA........................................................................................

ESTUDO DE REVSIÃO SISTEMÁTICA....................................................

INVESTIGAÇÃO DOS PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS DE

MULHERES INFECTADAS PELO PAPILOMAVÍRIS HUMANO..............

22

22

22

23

5 RESULTADOS ......................................................................................... 30

6 DISCUSSÃO ............................................................................................ 38

7 CONCLUSÕES.......................................................................................... 42

8 REFERÊNCIAS......................................................................................... 43

9 ANEXOS ................................................................................................... 50

12

1 INTRODUÇÃO

O câncer cervical é a segunda neoplasia mais prevalente entre mulheres no

Brasil e no mundo (1). Dados estimam que 231.000 mortes anualmente desta

doença e cerca de 80% delas são oriundas dos países em desenvolvimento (2,3).

A infecção persistente pelo Papiloma vírus Humana (HPV), do tipo

oncogênico desempenha papel preponderante no desenvolvimento do câncer do

colo uterino, sendo esse vírus detectado em quase todas as lesões pré–neoplásicas

e neoplásicas cervicais (4,5).

Além da infecção pelo HPV, existem ainda outros fatores de risco envolvidos

na carcinogênese cervical tais como: baixo nível socioeconômico, início precoce da

atividade sexual, multiplicidade de parceiros sexuais, tabagismo, higiene íntima

inadequada, uso prolongado de contraceptivos orais, doenças, infecciosas

sexualmente transmissíveis (DST) e imunossupressões (6 -10).

A carcinogênese cervical é um processo de múltiplas etapas, sendo a

infecção persistente por um ou mais tipos de HPV oncogênico seguida pela a

transformação neoplásica do epitélio infectado uma das mais importantes destas

(11,12). Embora estas etapas já estejam bem estabelecidas, diversos estudos

implicam os fatores imunológicos como determinantes destas transições (11,13, 14).

A capacidade do indivíduo de eliminar a infecção pelo HPV seria determinada

por fatores genéticos, possivelmente, atuando através de mecanismos imunológicos

(15).

A resposta imune do hospedeiro é considerada hoje um fator determinante da

carcinogênese cervical, portanto a elucidação do perfil imunológico desencadeado

no organismo pelo HPV, tanto relacionado ao tipo de resposta imune celular

determinado pelos linfócitos T (TCD4+ e TCD8+) bem como células NK e NKT, além

de contribuir para o diagnóstico precoce de possíveis neoplasias malignas, pode

também se tornar uma importante ferramenta de monitoramento em pacientes

portadoras de lesões intraepiteliais cervicais.

O surgimento de novos parâmetros de avaliação para infecção por HPV é de

grande relevância científica, visto a grande incidência deste vírus e a morbidade

ocasionada por este em mulheres no mundo inteiro. Dada à importância deste

estudo, podemos ressaltar que a sua aplicabilidade irá culminar com um novo

13

consenso para o diagnóstico das lesões intra-epiteliais cervicais na profilaxia do

câncer de colo uterino.

14

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 BIOLOGIA E CARACTERIZAÇÃO DO PAPILOMA VÍRUS HUMANO

O Papilomavírus Humano é considerado um vírus de tamanho pequeno, com

diâmetro variando entre 50 a 60nm, constituído por genoma de DNA de dupla fita

circular associado a proteínas semelhantes a histonas, contendo cerca de 8.000

pares de bases (pb), com oito sequências abertas de leitura, com todos os genes

localizados na mesma fita de DNA. O genoma é dividido em três regiões específicas

de acordo com a sua funcionalidade: a primeira é uma região conhecida como long

control region (LCR) ou upper regulatory region (URR), que é uma região regulatória,

não codificadora, que apresenta 400 a 1.000 pares de bases, situada entre os genes

L1 e E6. A segunda região precoce (E) do inglês early, onde estão localizados os

genes E1, E2, E4, E5, E6 e E7 iniciadores da transcrição e regulação da replicação

e persistência viral. E a última é a região tardia L (late), que codifica as proteínas do

capsídeo viral L1 e L2 (16-18).

Após a integração dos HPVs de alto risco no genoma celular das células

infectadas, esses passam a codificar as oncoproteínas E6 e E7 indutora do processo

malignização. A célula hospedeira possui genes supressores de tumores pRb e p53.

O gene Rb é o principal regulador do ciclo celular e o gene (p53) é chamado de

“guardião do genoma”, pois tem finalidade de supervisionar se todos os genes estão

íntegros.

15

Figura 1 - Representação esquemática do genoma do HPV: E (Early do inglês) são genes

precoces, L Late do inglês) são genes tardios e URR (upstream Region Regulation) é a região

reguladora da replicação viral (19) Fonte: Munoz 2006.

Quando o curso da infecção pelo HPV gera lesões do tipo benignas, a

replicação viral é do tipo extra cromossomal, ou seja, os vírus infectam o epitélio

celular e permanecem na camada basal das células como estruturas denominadas

extra cromossômicas, na qual, tem a capacidade de se replicar durante as etapas de

duplicação dos cromossomos. E o ciclo do vírus não provoca citólise, ou seja, à

medida que as partículas virais são geradas nas camadas mais externas e

diferenciadas, os vírus também são eliminados após morte da célula sem ocorrer o

processo de inflamação (20). No entanto, não ocorre o mesmo nas lesões malignas,

em que o DNA viral é integrado aos cromossomos das células do hospedeiro (21), e

essa inserção do genoma viral no DNA do hospedeiro se dá através da linearização

do DNA circular do vírus, na qual ocorre perda do gene E2, e consequentemente,

uma super expressão dos genes virais, de forma mais importante os genes E6 e E7,

que são responsáveis por estimular a proliferação e transformação celular (22).

2.2 PERSISTÊNCIA E ELIMINAÇÃO DO VÍRUS

A compreensão da persistência viral, eliminação, e possível latência causada

pela infecção do HPV, ainda são pouco compreendidas (23).

Na história natural da infecção pelo HPV, além dos casos de eliminação do

vírus e da persistência viral, que pode ser definida como o espaço longo de tempo

em que a infecção pelo mesmo tipo de HPV (variante) persiste, e pode ser detectado

por métodos sensíveis. Os casos de “eliminação viral” parecem desenvolver uma

proteção humoral e/ou celular de curto prazo, entretanto, apesar do DNA do vírus

não ser mais detectado no organismo por métodos sensíveis, a presença do vírus

não poderá ser descartada, uma vez que pequenos focos de células podem manter

a infecção com baixo número de cópias de DNA. Isso acontece devido o processo

de eliminação ser precedida pela ocorrência da latência viral, estado em que o vírus

permanece latente no organismo (24).

16

A teoria da explicação para a existência de um estado de latência se baseia

através de estudos em pessoas imunossuprimidas, entretanto não se tem muito

conhecimento a respeito da frequência que ocorre a latência em indivíduos

imunocompetentes, quanto tempo pode durar, o motivo para a ocorrência de um

estado novamente detectável, e quais cânceres surgem após esse período de

latência, sendo considerado um estado comum e geralmente benigno, mesmo em

indivíduos imunossuprimidos (23).

Entretanto, comparando-se as infecções pelo HPV em casos que ocorre a

eliminação do vírus, com as que ocorrem persistência, sabe-se que o risco de

câncer pode aumentar consideravelmente nos casos de persistência (25).

2.3 TÉCNICAS DE IDENTIFICAÇÃO DO HPV

Para determinação do câncer de colo de útero, o uso das técnicas atuais,

como teste citopatológico, apesar de serem subjetivas e confiáveis, apresentam

baixos índices de reprodutibilidade. Os testes moleculares, quando apresentam

resultados positivos para tipos virais altamente oncogênicos, não determinam

necessariamente o desenvolvimento de uma displasia, sendo necessários vários

outros fatores concomitantes. Portanto, novas técnicas citológicas de análises

prediletivas, confiáveis e reprodutíveis devem ser admitidas (26).

A utilização da técnica de captura híbrida e PCR como metodologia no

diagnóstico molecular do Papiloma vírus Humano (HPV) tem se mostrado como uma

das mais sensíveis na identificação do DNA viral existente nos mais diversos

materiais clínicos (27-31), bem como na resolução de dúvidas originadas durante o

diagnóstico citohistopalógico, não apenas nas infecções pré-neoplásicas, mas

também nas infecções latentes ou subclínicas associadas a esse agente viral (27,

32-34).

A Detecção do DNA do HPV pelas técnicas de captura hibrida e PCR são

importantes, mas se torna imperativo discriminar o tipo de HPV presente em

materiais clínicos provenientes das mucosas genitais, a fim de verificar se os tipos

presentes são de alto ou baixo potencial para desenvolvimento de neoplasias

cervicais (34, 35).

17

A determinação do tipo de HPV auxilia também na condução de um

tratamento mais apropriado para pacientes acometidas por essa infecção viral.

2.4 O HPV E A INTERFERÊNCIA NO SISTEMA IMUNOLÓGICO DO

HOSPEDEIRO

Nas infecções sexualmente transmissíveis o epitélio de revestimento da

vagina e da cérvice uterina atuam como as primeiras linhas de defesa física e

imunológica, mediadas pela imunidade inata, que age em primeiro plano, mediadas

por fagócitos, proteínas solúveis como citocinas, sistema complemento, e barreiras

epiteliais, e a resposta imune específica ou adaptativa que atua contra os patógenos

que causam tais infecções, através da produção de anticorpos e células efetoras

citotóxica (36- 38).

A resposta imune do epitélio vaginal, tanto celular quanto humoral, parece

depender da ação hormonal. Como o epitélio endometrial, a mucosa vaginal também

se modifica nas diferentes fases do ciclo menstrual, no entanto, mais

acentuadamente à ação de estrógenos e progesterona. Os hormônios parecem que

atuam de forma contrária aos mecanismos de defesa local. Estudos demonstram

claramente que o estrógeno e a progesterona influenciam na resposta imune inata e

adaptativa. Evidências destes efeitos são encontradas em estudos experimentais

realizados entre fêmeas e machos (39). Apesar de estar em uma fração menor do

que a local, a resposta imune sistêmica também possui um importante valor na

produção da resposta imune ao patógeno (40). Portanto, em resposta a uma

determinada infecção, tanto a resposta imune inata quanto à adaptativa

desenvolvem um mecanismo de inflamação, para combater o agente agressor (41).

Este processo é bastante complexo e esta associado a eventos em cascatas com

participação de mediadores denominados citocinas e quimiocinas, que agem

coletivamente na ativação e regulação da resposta inflamatória (24, 42).

Na resposta inata as citocinas são na sua maior parte produzidas por

fagócitos mononucleares, e na imunidade específica, pelos linfócitos T ativados, os

quais são capazes de provocar reações inflamatórias ricas em neutrófilos que

servem para conter e, quando possível, erradicar as infecções microbianas (43), e

as células NK por sua vez, representam uma barreira importante e um componente-

18

chave do sistema imune inato, reconhecendo e matando células infectadas por vírus

e as células transformadas através de dois mecanismos: a citotoxicidade

dependente de grânulo; e a via de apoptose em células alvo (44).

A resposta imune adaptativa ou específica ocorre tanto pela resposta humoral

quanto celular, que geram respostas efetoras específicas e células de memória para

os determinados antígenos dos patógenos (43, 45).

A resposta imune adaptativa inicia logo após ativação da resposta imune

inata, quando as células apresentadoras de antígeno (APCs), tais como Langerhans

e células dendríticas (CD) absorvem os antígenos virais, os transformam em

peptídeos e apresentam para linfócitos juntamente com a molécula MHC na

membrana da célula. Esse complexo liga-se à receptores de células T antígeno-

específico em células T naíves auxiliares (CD4+) e citotóxicas (CD8+), aumentando

assim a proliferação de células T, produção de IL-2 e ativação desses linfócitos (46).

Portanto, o perfil da resposta imune adaptativa pode ser do tipo humoral ou celular,

sendo esta última representada pela produção e ativação dos linfócitos TCD4+ e

TCD8+.

A maioria dos linfócitos circulantes são do tipo T, e uma menor quantidade do

tipo B e Natural Killer (NK). Os linfócitos T possuem receptores especializados em

reconhecer antígenos ligados a superfície de outras células, que pode ser do tipo

alfa/beta (TCR α ∕ β) ou gama/delta (TCR ɣ ∕ ∆). Na circulação sanguínea, ocorre o

predomínio de células T com TCR α ∕ β e na mucosa vaginal com TCR ɣ ∕ ∆. Existe a

hipótese de que os linfócitos T TCR ɣ ∕∆ desempenhem função primordial na

proteção das superfícies das mucosas (47, 48).

Funcionalmente os linfócitos T são classificados em: linfócitos T auxiliares e T

supressores citotóxicos. Os linfócitos T auxiliares também chamados T helper (Th),

possuem receptor CD4 que reconhece a molécula do complexo principal de

histocompatibilidade classe II, atuam no reconhecimento de macrófagos ativados e

são importantes “sinalizadores” através da produção de interleucinas, que interagem

com outros tipos celulares. De acordo com as citocinas produzidas desenvolve-se

uma resposta predominantemente celular (tipo Th1). Com o direcionamento de mais

células da resposta imune inata e linfócitos T para o local da infecção, ou uma

19

resposta predominantemente humoral (tipo Th2), induzindo o recrutamento de

linfócitos B e produção de imunoglobulinas (48, 43).

Os linfócitos T citotóxicos possuem receptores CD8 e são capazes de

reconhecer e tolerar as moléculas de MHC de classe I autóloga presente na

superfície de outras células nucleadas e consequentemente exercer a ação de cito

toxidade contra moléculas quando associadas a partículas virais ou se as mesmas

forem geneticamente de outra origem (43).

Outra população de linfócitos são os linfócitos denominados de linfócitos

grandes granulares ou LGL, do termo em inglês “Large Grand Lymphocyte”. Estes

linfócitos se caracterizam por apresentarem em seu citoplasma um abundante

conteúdo de grandes grânulos de tonalidade violeta (grânulos azurófilos), quando

corados por corantes hematológicos (43). Esses linfócitos são classicamente

denominados de “células assassinas naturais” ou Natural Killer (NK) sendo do ponto

de vista fenotípico identificados por imunofenotipagem pela expressão do antígeno

CD 56, expressando também altos níveis de controle (FC) receptor para fração das

imunoglobulinas (CD 16) ou ainda as enzimas granzimas e perfurinas que estão

presentes nos grânulos acima citados (48).

Cerca de 60 a 65% dos linfócitos circulantes nos adultos sadios

correspondem a linfócitos T total. Destes, cerca de 35 a 50% correspondem as

células TCD4+ e 25 a 30% as células TCD8+. As células NK correspondem a uma

contagem em torno de 10 a 15% e os linfócitos B em torno de 10 a 20% (49).

As células NK usualmente lisam células alvo que não expressam moléculas

de classe I, tais como, células tumorais ou aquelas infectadas por vírus. Dessa

forma, moléculas clássicas de classe I, quando expressas na superfície das células

nucleadas podem exercer um mecanismo protetor da lise mediada por células NK

nas células saudáveis (50).

A região de classe II possui genes que codificam as moléculas clássicas de

histocompatibilidade de classe II, expressas normalmente nas células

apresentadoras de antígenos (APCs), ou seja, nos monócitos, macrófagos, células

dendríticas, células de Langerhans e linfócitos B (51). Do ponto de vista funcional,

essas moléculas estão envolvidas na apresentação de peptídeos de origem

20

extracelular, tais como bactérias, para células TCD4+ (52). A ativação dessas

células libera citocinas que atuam em diversas reações imunes (53, 54).

Uma vez que a infecção pelo HPV apresenta natureza não lítica, limita a

produção de antígenos virais que são processados e apresentados ao sistema

imune adaptativo. As proteínas codificadas pelo vírus, em sua maioria, não são

secretadas através das células infectadas. Portanto, as proteínas E (precoces) são

expressas em níveis baixos e, sobretudo, no núcleo celular e a produção de

proteínas do capsídeo viral, altamente imunogênicas, é limitada a camada mais

diferenciada e liberada ao epitélio, onde os sinais pró-inflamatórios são diminuídos.

O HPV apresenta um perfil insuficiente para ativar a resposta imune do hospedeiro,

uma vez que não há fase do ciclo de vida do HPV na corrente sanguínea, e apenas

quantidades mínimas de replicação do vírus são expostas ao sistema imune, o vírus

se torna praticamente imperceptível para o sistema imune do hospedeiro (55, 38).

Embora a resposta imune a infecção ao HPV seja pouco entendida, postula-se que a

resposta imune celular (Th1) é prioritária em relação à resposta imune humoral

(Th2). Ainda, a resposta imune do tipo Th1 pode gerar resposta específica dos

linfócitos T citotóxicos, contribuindo para eliminação da infecção e regressão das

lesões infectadas pelos tipos de HPV de baixo risco (56).

Figura 2 - Replicação do HPV relacionada à diferenciação das células do epitélio escamoso

estratificado da cérvice uterina mostrando um epitélio cervical normal e um infectado pelo vírus HPV

(19). Fonte: Munoz 2006.

21

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Revisar o desempenho da expressão das proteínas do ciclo celular p16, ki67 e p53

na avaliação prognóstica das lesões do colo uterino e comparar quantitativamente

os níveis de linfócitos TCD4+, TCD8+, linfócitos B (CD19) células NK e NKT em

mulheres portadoras do Papiloma vírus humano (HPV).

3.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

3.2.1- Revisar o desempenho da expressão dos biomarcadores p16, Ki67 e p53 e

como podem estar associados as lesões intraepiteliais;

3.2.2 - Quantificar as dosagens de CD4+, CD8+, células NK e NKT em pacientes

portadoras do vírus HPV, associando ao tipo de HPV;

3.2.3- Avaliar o perfil leucocitário das pacientes portadoras do vírus e pacientes

saudáveis por meio de contagem de monócitos, granulócitos, além de linfócitos total

e subpopulações: i) Linfócitos B (LB), ii) Linfócitos T (LT) e subpopulações LT Helper

e LT Supressor Citotóxico, iv) Células natural killer (NK) e NKT.

22

4 METODOLOGIA

4.1. ESTUDO DE REVISÃO SISTEMÁTICA

Seguindo as diretrizes de relatórios preferenciais para revisões sistemáticas e

metanálises (PRISMA) (36), realizamos uma ampla pesquisa bibliográfica de bancos

de dados eletrônicos PubMed, Embase, Web of Science, Scopus e Scielo para

identificar estudos comparativos de p16, p53 e Ki- 67, em mulheres com e sem

lesões cervicais de 01 de janeiro de 2010 até 1º de maio de 2016. Foram utilizados

os seguintes termos de pesquisa e suas combinações: "neoplasia intraepitelial

cervical", "câncer cervical", "carcinoma cervical uterino", " Papilloma Virus "," HPV ","

p16 "," p16INK4a "," Ki-67 "e" p53 ". As listas de referência associadas a todos os

estudos encontrados na pesquisa foram utilizadas para identificar outras publicações

potencialmente relevantes. Nenhuma restrição de idioma foi aplicada.

Para serem incluídos na revisão sistemática, os estudos primários tiveram de:

1) ser de estudo de caso-controle ou de estudo de coorte; 2) ter um grupo controle

de mulheres sem lesões cervicais; 3) ter um grupo de casos de mulheres com CIN

ou CC confirmado pelo método histopatológico; 4) relatar odds ratios (OR), ou conter

dados suficientes para o seu cálculo; 5) comparar a expressão de IHC de p16, p53 e

Ki-67 em mulheres com e sem lesões cervicais; E 6) não foram publicados como

relatórios completos (por exemplo, resumos de conferências) ou continham dados

parciais ou incompletos. Dois investigadores determinaram a elegibilidade do estudo

de forma independente. Os desacordos foram resolvidos por consenso. Os dados

foram cuidadosamente avaliados e extraídos de todas as publicações elegíveis. Os

dados recuperados dos estudos incluíram autor, ano de publicação, país, o desenho

do estudo, tipo de biomarcador e tamanho da amostra. Avaliaram-se o efeito da

expressão de IHC p16, p53 e Ki-67 na lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau

(LSIL), lesão intra-epitelial escamosa de alto grau (HSIL) e câncer cervical (CC),

calculando o odds Correspondente intervalo de confiança de 95% (IC95%). Uma

heterogeneidade estatística entre os estudos foi avaliada pelo I2-estático (<25%,

sem heterogeneidade, 25% - 50%, heterogeneidade moderada, > 50%, forte

heterogeneidade) (37). (I2 > 50%), utilizando modelos de análise de efeitos (38)

caso contrário; O modelo de efeitos fixos foi utilizado (39). Tal como as parcelas de

23

fungos de Begg foram efectuadas para avaliar um potencial viés de publicação (39).

Todas as análises estatísticas foram realizadas com Software Review Manager 5.1.

4.2 INVESTIGAÇÃO DOS PARÂMETROS IMUNOLÓGICOS DE MULHERES

INFECTADAS PELO PAPILOMA VÍRUS HUMANO.

Nosso primeiro estudo foi conduzido mediante a aprovação do comitê de ética

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, com protocolo com o número

97/07. Realizamos tambem um estudo prospectivo com 60 mulheres, com idade

entre 18 e 55 anos (média=30 anos), atendidas no serviço de ginecologia da Clínica

Potengi, no período de 02 de janeiro de 2014 a 31 de dezembro de 2017.

Como critérios de inclusão, foram consideradas mulheres adultas, sem

alterações genitais que impedissem a realização do exame citopatológico tais como

menstruação ou qualquer outro sangramento local, uso de medicamentos tópicos e

também com sorologia não reagente para sífilis, hepatites B e C, vírus da

imunodeficiência humana (HIV) e vírus linfotrópico de células T humana (HTLV-I e

II).

Foram excluídos do estudo, mulheres fora do grupo etário escolhido,

submetidas a qualquer tipo de tratamento ginecológico ou a qualquer tipo de

doenças do sistema imunológico tais com imunodeficiências, doenças inflamatórias

e autoimunes e gestantes.

Todas as mulheres incluídas no estudo (n=60), após a assinatura do TCLE,

passaram por consulta com ginecologista que realizou, seguido da coleta de

amostras cérvico-vaginal para realização do exame de Papanicolau, captura híbrida

e do HPV-DNA por PCR, além da coleta sangue periférico para realização do

hemograma e imunofenotipagem por citometria de fluxo.

Em pacientes com diagnóstico citológico de Lesão Intraepitelial Escamosa de

Baixo Grau (LSIL) comparamos o perfil imunológico de células do sangue periférico

por citometria de fluxo (FC) em mulheres infectadas pelo HPV e HPV não infectadas,

através da investigação do total de linfócitos T (CD3+) e subpopulações: Linfócitos T

auxiliares (LTa) ou CD3+/CD4+ e Linfócitos T citotóxicos (LTc) ou CD3+/CD8+;

Linfócitos-B (CD19+), Células assassinas naturais ou Natural Killer (NK) (CD16-56+),

a células NKT (CD3 + / CD16-56 +).

24

Análise citomorfológica Cervical

Foram preparadas esfregaços a partir de celulas descamadas do epitelio da

cérvice uterina das pacientes. As lâminas dos esfregaços foram coradas pelo

método de Papanicolaou, capas de detectar alterações celulares associadas a

infecção pelo HPV Quando examinadas ao microscópio óptico. Todos os pacientes

que apresentavam características clínicas de HPV, como condiloma acuminado,

foram confirmados pelo exame Papanicolau. A presença das características

citomorfológicas da infecção por HPV, como coilócitos e binucleação, entre outras

características. Em 30 mulheres, foram encontradas lesões cervicais intraepiteliais

escamosas de baixo grau (LSIL). (Figura 3)

Em espécimes de citologia cervical, 30 pacientes (50%) da amostra analisada

apresentaram alterações celulares compatíveis com o vírus HPV, diagnosticadas

como LSIL e 30 pacientes (50%), sem alterações (grupo controle saudável) não

foram observadas alterações citomorfologicas.

Figura 3- Analise de esfregaço cervio vaginal de uma paciente infectadas

com HPV. Coilocitos

Detecção do tipo HPV por captura híbrida e Reação em Cadeia da Polimesare

Para a coleta e o transporte das amostras cérvico vaginais foram utilizados

kits coletores da Digene® (Universal Collection Medium UCM). Inicialmente utilizou-

se a técnica de CH (captura híbrida) (Digene) para detecção de DNA/HPV de baixo

e alto risco. A presença do HPV foi determinada por meio da quantificação da

emissão de luz e expressa em unidade de luz relativa (RLU), seguindo as

orientações do fabricante. As amostras com RLU < 1pg/mL foram consideradas

negativas. Os resultados com valor ≥ 1 pg/ml foram julgados positivos. Depois da

utilização da técnica de CH, as amostras foram congeladas (-20º.C) para posterior

25

análise pelo método de PCR. Para a reação de PCR, as amostras foram

descongeladas e 1 mL submetido à extração automatizada de DNA (Magna Pure

LC® Roche). O kit utilizado para a extração foi o Magna Pure LC DNA Isolation Kit

Large Volume, de acordo com as orientações do fabricante (Roche). A PCR foi

realizada com o uso de tampões próprios e Platinum Taq DNA Polymerase®

(Invitrogen). Os primers utilizados para a amplificação do DNA dos diversos tipos de

HPV foram os universais: HPV MY11 e MY09.

Análise hematológica

Dez mililitros (mL) de sangue periférico (SP) foram recolhidos em tubos

Vacutainer contendo EDTA e homogeizados imediatamente. A contagem de

globulos brancos totais (Leucócitos) foram obtido no analisador hematológico (Cell-

Dyn 3000). A análise citomorfológica foi feita em esfregaços de sangue corados pelo

Leishmann. Um total de 100 leucócitos foram contados e os resultados anotados em

percentual (valor relativo). Para a conversão de valores relativos em absolutos

(celulas/L), os valores percentuais foram multiplicados pela contagem de leucócitos

absoluto e dividido por 100.

Determinação do perfil imunologico por citometria de fluxo.

A imunofenotipagem foi realizada por análise de FC de quatro cores em

amostras SP após marcação com um painel de anticorpos monoclonais (AcMo)

conjugados a fluorocromos e com especificade contra: Linfócitos B e T

(CD3FITC/CD19PE/CD45PerCP), LTa e LTc (CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP/CD45APC), Célula

NK e NKT (CD3FITC/CD16-56PE/CD45PerCP). Todos os MoAb foram da marca BD

(Becton-Dickinson Imunocitoquímica Sistema /San José, CA, EUA).

Cem microlitros (100 mL) de SP total previamente homogeneizadas foram

incubadas com 20 mL de MoAb durante 30 minutos à temperatura ambiente no

escuro. Após essa etapa, a celular foi novamente homogeinizada e a mesma

acrescida 1 mL de solução de hemolizante.

Solução de FACS´lise (FACS´lise solution/Becton-Dickinson Imunocitoquímica

Sistema /San José, CA, EUA), previamente preparada em água destilada (01:10; v:

v), e, em seguida, incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro.

26

Em seguida, a suspensão de célular foi centrifugada por 5 minutos a 600 g, o

sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi ressuspendido em solução

salina tamponada com fostato (PBS,pH 7,2) e centrifugada novamente nas

condições acima espefificada sendo esta etapa repetida mais uma vez. Finalmente,

o sedimento celular foi ressuspendido em 1 mL de 0,5% de formaldeído em PBS, e a

suspensão de células foi mantida no escuro a 4°C até análise no citometro de fluxo.

Um total de 20.000 eventos por tubo foram adquiridas no citometro de fluxo

de, com dois laser (um azul e outro vermelho) com capacidade de análise de até

quatro cores (FACScan, San Jose, CA, EUA), com o software de analise (Cell

QuestTM Software, Becton Dickinson Immunocytometry Sistemas, San Jose, CA,

EUA). Foram considerados os seguintes parâmetros: dispersão para a frente (FSC)

para avaliar o tamanho celular, dispersão lateral (SSC) para avaliar a complexidade

celular, e análise de expressão do marcador celular com análise de fluorescência

por FL1 (verde), FL2 (laranja) e FL3 (vermelho ), em escala logarítmica, as quais

representam a reacção antigénio-anticorpo conjugado com isotiocianato de

fluoresceína (FICT), ficoeritrina (PE), e peridin proteína clorofila (PerCP),

respectivamente.

Os resultados foram expressos como percentagem de células em dupla

marcação, tais como: Linfócitos-T (CD3+/CD45+), Linfócitos-B (CD19+/CD45+), Lta

(CD3+/CD4+/CD45+), LTc (CD3+/CD8+/CD45+), Células NK (CD45+/CD16-

56+/CD3-), Células NKT (CD3+/CD16-56+/CD45+) (Figura 4).

Para a conversão de valores relativos em absolutos (celulas/L), os valores

percentuais foram multiplicados pelos valores absolutos de linfócitos e divididos por

100. Os valores de referências para adultos sadios empregados nesse estudo

encontra-se resumido no quadro 1. Por meio dos valores relativos de LTCD4+ e

LTCD8+ obtidos, calculou-se a relação CD4/CD4 em todas as pacientes

investigadas.

27

Quadro 01: Valores de referência da sub-população linfocitária

.

Referência: Adaptado de SANTAGOSTINO et al, 1999.

Subpopulação Linfocitária Valores de Referência (%) / µL

Linfócitos T (CD3+)

(60 – 87) / 605 - 2.460

Linfócito T Helper (CD3+/CD4+)

(32 - 61) / 600 - 1.666

Linfócito T Supressor Citotóxico (CD3+/CD8+)

(14 - 43) / 224 - 1.112

Células Natural killer (CD16-56+)

(04 - 28) / 73-654

Linfócitos B (CD19+)

(05 - 20) / 72-520

Relação CD4/CD8 1 - 2,5 (1,5)

28

Figura 4- Representação esquemática de um perfil linfocitário determinado pela

citometria de fluxo. A) CD45+/CD14- perfil característicos de linfócitos com ausência

de antígeno relacionado a monócitos; B) CD3+ (Linfócitos T) e CD19+ (Linfócitos B);

C: Linfócitos T-helper (CD3+/CD4+); D) Linfócitos T-citotóxico (CD3+/CD8+); E)

Células NK e NKT; F) Padrão de espalhamento luminoso das células sanguíneas.

Em destaque a população linfocitária.

a b

c d

e f

29

Análise estatística

A comparação da contagem total de linfócitos e de seus subgrupos entre os

dois grupos de mulheres foi feita usando o teste de Mann-Whitney pelo programa

Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 10.014) para Windows e

significância estatística: p <0,05.

30

5 RESULTADOS

Parte dos resultados deste estudo estão descritos em dois artigos com

publicação em revistas indexadas:

Artigo 1: Immunohistochemical expression of p16, Ki-67 and p53 in cervical lesions

– A systematic review. Publicado na revista Pathology Research and Practice.

Fator de impacto 1,543 e Qualis B1 da CAPES para área Medicina II (9.Anexo).

Artigo 2: Investigation of lymphocyte subpopulation alterations in peripheral

blood of women with high risk oncogenic human papillomavirus Submetido ao

Journal of Clinical Laboratorila Análisis. Fator de impacto 1,543 e Qualis B2 da

CAPES para área Medicina II (9. Anexo).

1. Dados Demográficos das Pacientes

Dados demograficos dos pacientes estão resumidos na Tabela 1 e inclui

idade, estado civil, número de parceiros sexuais, gravidez e hábito de fumar.

2. Detecção de papilomavírus humano em amostras de citologia cervica

De acordo com análises citopatológicas, 30 pacientes apresentaram

diagnóstico de LSIL e 30 tiveram análise citológica cervical normal.

Por meio dos testes de captura híbrida e Reação em Cadeia da Polimerase

em Tempo Real das pacientes com LSIL sendo detectadas a presença de HPV

em todas as pacientes com LSIL e negativo nas pacientes do grupo controle.

Dentre os espécimes citológicos que apresentaram HPV, 07/30 (23,3%)

apresentaram apenas DNA de HPV de alto risco, 15/30 (50,0%) DNA de HPV de

baixo risco e 8/30 (26,7%) de ambos os tipos (Tabela 2).

3. Análise dos linfócitos periféricos por citometria de fluxo

Os intervalos de referência para a contagem de linfócitos totais perifericos (LTP),

linfócitos-T e B, subpopulação T-helper (LTh), T-citotoxico (LTc) e também células NK

e NKT em contagens absolutas (células/L), no grupo controle e em mulheres com

HPV estando listados listados nas Tabelas 2 e 3 respectivamente.

No grupo controle (mulheres sem HPV), o LTP variou de 1.550 a 2.630/L com

mediana e média de 1.900/L and e 1.999/L respectivamente. A contagem de

31

linfócitos-T totais variou de 1.070 a 1.810/L com mediana de 1.350/L e média de

1.400/L. A contagem de LTc variou de 260 a 805/L com mediana de 400/L e

média de 460/L. Os níveis de LTh foram: mínimo de 770 /L, máximo de 1.300 /L,

mediana de 920 /L e média de 921/L. Neste grupo, o cálculo da relação CD4/CD8

oscilou de 1,25 para 3,33 com mediana e média de 2,05 e 2,16 respectivamente.

Em relação aos linfócitos-B, foram observados nos seguintes valores: mínimo de

130/L, máximo de 400/L, mediana de 200/L e média de 228/L. Os níveis de

células NK apresentados foram mínimos de 180/L, máximo de 390/L, mediana de

230/L e média de 234/L. em relação às células NKT, foram observados os

seguintes resultados: mínimo de 13/L, máximo de 184/L, mediana de 230/L e

média de 234/L.

No grupo de mulheres HPV+, os LTP variou de 1.000 a 5.100/L com mediana e

média de 2.500/L e 2.408 / L, respectivamente. A contagem de linfócitos-T variou

de 890 a 4.100/L, mediana de 1.800/L e média de 1.850/L. A contagem de níveis

de TcL flutuou de 240 para 2.000/L, com mediana de 1.700/L e média de 823/L.

Os resultados dos níveis de LTh foram: mínimo de 430/L, máximo de 2.000/L,

mediana de 880/L e média de 976/L. Neste grupo, o cálculo da relação CD4/CD8

oscilou entre 0,65 a 2,30 com mediana e média de 1,25 e 1,30, respectivamente.

Em relação à contagem de linfócitos B, foram observados os seguintes

resultados: mínimo de 84/L, mediana máxima e média de 660/L, 230/L e 281 /L

respectivamente. Os níveis de células NK mostraram-se, mínimo de 12/L, máximo

de 174/L, mediana de 69/L e média de 82/L. Em relação às células NKT, os

valores variou de zero em seis casos a 9,0/L com mediana e média de 3,0/L e

3,35 / L respectivamente.

Maior variabilidade desses resultados foi observada em pacientes HPV+,

confirmada pelo desvio padrão dessas medidas. Nas mulheres sem HPV, os valores

observados estavam dentro dos padrões normais de acordo com os valores contidos

no quadro1.

A avaliação quantitativa do perfil imunológico determinada pela análise de

citometria de fluxo, encontrou contagens elevadas de LTc predominantemente em

pacientes infectados com HPV de alto risco oncogenico em comparação com as com

HPV de baixo risco e especialmente em mulheres não infectadas, refletindo

32

diminuição da relação CD4/CD8 em alguns casos no grupo de mulheres com HPV,

especialmente aqueles infectados com HPV de alto risco oncogênico e nas mulheres

duplamente infectadas, quando comparado ao grupo controle, sendo encontrada uma

inversão da relação CD4/CD8 em 9 mulheres desse grupo: quatro infectadas com

HPV de alto risco oncogênico e 5 duplamente infectados (Tabela 2).

Além disso, a avaliação quantitativa de linfócitos B normais em pacientes com

LSIL e HPV+ quando comparados com as mulheres do grupo controle e, finalmente,

em relação à contagem de células NKT e NKT, foram observadas contagens

significativamente mais baixas no grupo de mulheres infectadas quando

comparados com os resultados observados no perfil linfocitário do grupo controle

(Tabelas 2 e 3).

A análise comparativa dos parâmetros imunológicos entre os dois grupos

mostrou uma diferença significativa para um PLC (p= 0,0003), linfócitos T (p =

0,018), TcL (p = 0,01), células NK (p <0,0002), células NKT (p <0,000) e relação

CD4/CD8 (p <0,003), mas não nos níveis de linfócitos B e ThL com valores de p de

0,22 e 0,088, respectivamente (Figuras 5 e 6).

33

Tabela 01- Características Sócio- Demográficas dos Participantes do Estudo

Infectadas com papiloma vírus

(n= 30)

Não infectadas com papiloma vírus

(n= 30)

Faixa Etária do Grupo (idade)

≤ 30 06 (20.0%) 11 (36.7%)

31 – 45 23 (76.7%) 16 (53.3%)

> 45 01 (03.3%) 03 (10.0%)

Estado civil

Solteira 13 (43.3%) 18 (60.0%)

Casada 17 (56.6%) 12 (40.0%)

Número de Parceiros Sexual

≤ 3 10 (33.3%) 07 (23.3%)

> 3 20 (66.6%) 23 (76.6%)

Número de Gestações

Sem Gestações 03 (10.0%) 02 (06.7%)

1 - 2 19 (63.3%) 21 (70.0%)

> 3 08 (26.6%) 07 (23.3%)

Fumantes

Não 25 (83.3%) 23 (76.6%)

sim 05 (16.6%) 07 (23.3%)

34

Tabela 02 – Características imunológicas das mulheres do grupo controle

Caso

N

n

Idade Linf.

(cel/L)

LT/CD3+

(cel/L)

LT/CD4+

(cel/L)

LT/CD8

(cel/L)

Relação CD4/CD8

LB /CD19+

(cel/L)

Cél NK

(cel/L)

Cél NKT

(cel/L)

01 27 2.200 1.600 920 600 1.60 270 280 20

02 32 1.700 1.200 800 390 2.00 180 240 60

03 46 1.550 1.100 780 280 2.78 150 315 45

04 35 2.000 1.440 960 580 1.65 170 340 100

05 35 1.700 1.070 900 300 3.00 170 180 75

06 26 2.300 1.790 1.040 690 1.51 250 320 23

07 40 1.700 1.480 920 400 2.30 170 250 17

08 33 2.200 1.323 920 460 2.00 370 230 42

09 25 1.900 1.430 800 630 1.27 270 160 13

10 27 1.600 1.180 770 260 2.96 160 118 32

11 32 1.900 1.280 780 500 1.56 340 250 108

12 48 1.560 1.330 1.000 300 3.33 130 230 78

13 30 1.800 1.400 970 400 2.42 180 180 80

14 29 2.100 1.490 1.100 440 2.50 290 170 105

15 34 2.000 1.110 770 339 1.27 210 210 90

16 34 2.600 1.500 800 650 1.23 290 260 104

17 32 1.720 1.300 960 330 2.90 160 180 78

18 33 1.600 1.350 940 400 2.35 160 240 80

19 46 1.750 1.400 800 400 2.00 130 130 84

20 33 2.330 1.738 1.140 572 1.99 260 140 132

21 33 2.600 1.800 1.300 475 2.73 400 320 78

22 27 1.660 1.240 800 320 2.50 160 220 32

23 33 2.300 1.540 1.000 667 1.50 230 270 184

24 35 2.630 1.810 1.000 805 1.25 340 390 84

25 32 2.340 1.150 800 330 2.38 250 210 64

26 27 1.700 1.300 770 490 1.57 170 200 30

27 26 1.790 1.200 770 320 2.40 260 260 64

28 25 2.300 1.541 1.150 667 1.72 230 280 161

29 24 1.800 1.140 770 300 2.56 280 280 45

30 32 2.230 1.780 1.200 500 2.40 220 160 60

Min. 24 1.550 1.070 770 260 1.25 130 180 13

Max. 48 2.630 1.810 1.300 805 3.33 400 390 184

Med. 32 1.900 1.350 920 400 1.99 220 230 75

Mean 32 1.999 1.400 921 460 2.16 228 234 72

Nota: Linf (Linfócitos) LTCD3+ (Linfócitos-T); LBCD19+ (Linfócitos B) LTCD4+ (Linfócitos T-helper),

LTCD8+ (Linfócitos TCD8+); Células NK (Células Natural Killer); Células NKT (Células NKT); Min.

(Minimo); Máx. (Maximo); Med. (Mediana); Mean. (Media).

35

Tabela 03- Parâmetros imunológicos de 30 mulheres com lesão intraepitelias escamosa de baixo grau (LSIL) em presença de papilomavírus humano de alto e baixo risco de malignidade Caso

n Age

HPV

Linf.

(cel/L)

LT/CD3+

(cel/L)

LT/CD4+

(cel/L)

LT/CD8

(cel/L)

Relação CD4/CD8

LB /CD19+

(cel/L)

Cél NK

(cel/L)

Cél NKT

(cel/L) AR BR

01 39 ( - ) ( + ) 1.400 1.100 740 360 2.06 260 40 0 02 42 ( - ) ( + ) 1.630 1.400 900 590 1.52 180 50 0 03 24 ( + ) ( - ) 3.100 2.300 1.100 1.170 0.94 300 60 5.4 04 30 ( - ) ( + )

1.800 1.200 750 450 1.66 170 51 3.0 05 34 ( + ) ( + )

1.000 1.000 430 570 0.75 110 20 9,0 06 29 ( - ) ( + )

2.700 1.800 970 830 1.16 490 130 2.0 07 31 ( - ) ( + )

2.200 1.120 700 420 1.66 150 187 5.0 08 44 ( + ) ( + )

1.790 1.600 780 820 0.98 102 85 3.4 09 38 ( + ) ( - ) 1.950 1.600 680 910 0.73 270 72 1.0 10 38 ( - ) ( + ) 1.420 1.200 740 430 1.70 160 48 3.0 11 29 ( + ) ( - ) 1.450 1.300 630 650 0.96 84 84 0 12 48 ( + ) ( + )

3.300 2.700 1.300 920 1.41 330 46 9.0 13 35 ( - ) ( + )

3.000 2.300 1.440 810 1.78 429 105 3,7 14 35 ( + ) ( + )

3.500 2.700 1.500 1.200 1.25 574 164 0 15 32 ( - ) ( + )

2.300 2.000 1.000 1.000 1.00 270 30 0 16 34 ( - ) ( + )

1.300 990 600 350 1.71 120 12 0 17 30 ( - ) ( + )

2.500 1.990 1.200 700 1.71 400 81 2.0 18 34 ( + ) ( + )

3.000 1.800 750 870 0.86 600 90 1.5 19 18 ( + ) ( - ) 2.900 2.000 870 1.050 0.82 660 174 1.0 20 39 ( - ) ( + )

2.300 1.780 1.000 780 1.20 230 69 2.0 21 35 ( - ) ( + )

3.000 2.300 1.300 990 1.31 230 99 1.0 22 27 ( + ) ( - ) 3.400 2.700 1.400 1.050 1.33 370 165 3.0 23 34 ( - ) ( + ) 1.200 890 550 240 2.30 140 60 6.0 24 36 ( + ) ( - ) 2.500 2.000 1.280 720 1.78 250 50 1.0 25 43 ( + ) ( + ) 3.000 2.300 1.000 1.300 0.77 310 93 6.0 26 40 ( + ) ( - ) 3.000 2.000 1.200 750 1.60 120 51 9.0 27 35 ( - ) ( + )

5.000 4.100 2.000 2.000 1.00 650 100 5.0 28 35 ( + ) ( + )

2.500 2.230 880 1.350 0.65 220 37 6.6 29 42 ( - ) ( + )

1.610 1.300 800 500 1.60 150 152 3.0 30 35 ( + ) ( + )

2.500 1.880 800 1.000 0.80 91 52 9.0

Min. 18 ------------- 1.000 890 430 240 0.65 84 12 0

Max. 48 ------------- 5.000 4.100 2.000 2.000 2.06 660 174 9.0

Med. 35 ------------- 2.500 1.800 880 810 1.25 230 69 3.0

M 35 ------------- 2.408 1.850 976 828 1.30 281 81.86 3.4

Nota: AR-HPV (Elevado risco human papillomavirus); BR-HPV (Baixo risco human papillomavirus); Nota: Linf (Linfócitos) LTCD3+ (Linfócitos-T); LBCD19+ (Linfócitos B) LTCD4+ (Linfócitos T-helper), LTCD8+ (Linfócitos

TCD8+); Células NK (Células Natural Killer); Células NKT (Células NKT); Min. (Mínimo); Máx. (Máximo); Med. (Mediana); M. (Media).

36

Figura 1. Variações das contagens de linfócitos totais, linfócitos T, linfócitos TCD4+

e linfócitos TCD8+

p= 0.88

HPV+ HPV-

HPV+ HPV-

430 770

2.000 1.300

976 921

880 920

D. Padrão

386.9 192.5

CD3+/CD4+ Cells/L

LTCD4+

p= 0.0003

HPV+ HPV -

Linfócitos Cells/L

HPV+ HPV -

Minimo 1.000 1.550

Maximo 5.000 2.630

Media 2.500 1.900

Mediana 2.400 1.999

D. Padrão 1.074 414

Linfócitos

HPV+ HPV-

HPV+ HPV -

890 1.070

4.100 1.810

1.800 1.400

1.859 1.350

D. Padrão 844 320

LT/CD3+ Cells/L p= 0.0018

Linfócitos T

p= 0.01

HPV+ HPV-

240 260

2.000 805

823 460

810 400

D. Padrão

375.8 159.7

HPV+ HPV-

CD3+/CD8+ Cells/L

LTCD8+

Minimo

Maximo

Media

Mediana

Minimo

Maximo

Media

Mediana

Minimo

Maximo

Media

Mediana

37

D. Padrão

Figure 6. Variações da relação CD4/CD8 e contagens de Linfócitos-B, Células NK

and NKT

Relação CD4/CD4

HPV+ HPV-

0.73 1.25

2.30 2.33

1.50 2.16

1.25 2.99

D. Padrão

0.51 0.47

HPV+ HPV-

CD4/CD8

p= 0.003

HPV+ HPV -

12 180

174 390

82 230

69 234

173 46

p= 0.0002

HPV+ HPV-

NK (CD16

- 56)/mm3

CD16-56+ Cells/L

Células NK

p< 0.00001

HPV+ HPV-

Células NKT

HPV+ HPV-

Negative 13

09.0 184

03.4 72

03.0 75

05.8 46.2

CD3+/CD16+-CD56+ Cells/L

HPV+ HPV- HPV+ HPV- HPV+ HPV-

HPV+ HPV -

84 130

660 400

281 228

230 220

D. Padrão

182 87

p= 0.22

CD19/mm3

CD19+ Cells/L

Linfócitos-B

HPV+ HPV- D. Padrão

Minimo

Maximo

Media

Mediana

Minimo

Maximo

Media

Mediana

Minimo

Maximo

Media

Mediana

Minimo

Maximo

Media

Mediana

38

6 DISCUSSÃO

A resposta imune adaptativa ou específica ocorre tanto pela resposta humoral

quanto celular, que geram respostas efetoras específicas e células de memória para

os determinados antígenos dos patógenos (45, 43) A resposta imune adaptativa

inicia logo após ativação da resposta imune inata, quando as células apresentadoras

de antígeno (APCs), tais como Langerhans e células dendríticas (DC) absorvem os

antígenos virais, os transformam em peptídeos e apresentam para linfócitos

juntamente com a molécula MHC na membrana da célula. Esse complexo liga-se à

receptores de células T antígeno-específico em células T naíves auxiliares (CD4+) e

citotóxicas (CD8+), aumentando assim a proliferação de células T, produção de IL-2

e ativação desses linfócitos (46).

A resposta imune mediada por células (CD4+ CD8+) assim como a resposta

imune humoral, tem fundamental importância na defesa antiviral. O papel das

células TCD4+, além de estar ligado no auxílio na ativação dos linfócitos B durante a

produção de imunoglobulinas através da expressão específica de citocinas, essas

células são necessárias também durante a fase inicial de diferenciação dos linfócitos

T efetores na resposta de células TCD8+, para indução da morte celular programada

(apoptose) na célula alvo pela ação de perforinas e granzimas, e na geração de

células T de memória (57).

O perfil Th1 e o Th2 são os mais comuns, o Th1 produz IL-2, IL-12, IL- 15, IL-

18, fator de necrose tumoral (TNF- α), e IFN-γ, induzindo a proliferação e aumento

da capacidade citotóxica dos LT CD8. Th2 produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13,

favorecendo a produção de anticorpos (46). Estudos têm demonstrado níveis

significativamente mais baixos de células de defesa tipo TH1 (células de

Langerhans) no epitélio cervical de pacientes portadoras de lesões intraepiteliais de

alto grau (LIEAG) quando comparadas aquelas encontradas no epitélio cervical de

pacientes saudáveis (58).

Sabe-se ainda que os linfócitos T citotóxicos (CTL) desempenham um papel

importante na imunidade local, impedindo a progressão da doença. Existe na

literatura forte evidências de que os linfócitos T citotóxicos específicos para o HPV

de alto poder oncogênico parecem ter um papel central na inibição da carcinogênese

cervical (59). As referidas células desempenham uma função valiosa no

reconhecimento e defesa contra antígenos específicos do HPV e agem como

sentinelas no combate de células malignas. Trabalhos têm demonstrado que

39

dependendo do tipo de resposta Th específica para o vírus HPV-16 produtor da

oncoproteína E7 pode resultar no clearance ou na persistência viral em pacientes

com neoplasia cervical (60).

Em estudo prévio, Kadish (61) avaliou in vitro a resposta imune celular linfo

proliferativa aos peptídeos E6 e E7 do HPV 16 em 136 mulheres portadoras de NIC

(neoplasia intraepitelial cervical) I e II seguidas durante um ano, neste estudo

observou-se que a resposta imune celular ao peptídio E7 esteve relacionada a

clarificação da infecção e a regressão da doença neste período.

Os HPVs de alto risco, como HPV 16 e 18, utilizam-se de meios que

promovem a redução da secreção de IFN e de MCP1 nos queratinócitos cervicais. A

expressão da oncoproteína E7 do HPV18 pode reduzir a expressão de IRF-1 nos

tecidos cervicais e a expressão de E6 pode estar relacionada com a inibição da

fosforilação de moléculas envolvidas na sinalização de IFN como Tyk2 quinase,

START1 e START2 em câncer cervical (62).

O presente estudo teve a finalidade de avaliar o perfil imunológico e a

resposta imune ao HPV, mediante a caracterização quantitativa da subpopulação

linfocitária por citometria de fluxo em mulheres infectadas com o HPV de baixo ou

alto risco oncogênico e portadoras de LSIL. Identificamos uma diminuição na

contagem de linfócitos TCD4+, com relativo aumento no número de células TCD8+

entre as pacientes acometidos com HPV de alto risco quando comparados com

aquelas infectadas com HPV de baixo risco e principalmente com as mulheres

pertencentes ao grupo controle. Tal fato sugere que possivelmente, o HPV,

especialmente o de alto risco poderia estar induzindo um efeito citopático nos

linfócitos TCD4+ como uma estratégia de subverter a resposta imunitária destas

pacientes frente à infecção.

Em pacientes com câncer cervical foi observado uma perda completa ou uma

diminuição da expressão das moléculas de classe I em células tumorais. Este

mecanismo representa uma estratégia do vírus para escapar da vigilância

imunológica e, consequentemente, não ser reconhecido em virtude da ausência o da

diminuição da expressão dos antígenos por parte destas moléculas apresentadoras.

Consequentemente, a paciente apresentará uma redução do número de linfócitos T

específicos para erradicar o vírus (63; 64). Em contrapartida, Kanodia (55) observou

que a expressão de moléculas imunossupressoras no microambiente cervical

favoreceu ao escape viral. Talvez, incialmente ocorra uma maior expressão de

40

moléculas imunossupressoras a nível local, que posteriormente seriam inibidas a

nível sistêmico.

Neste estudo, observamos ainda um decréscimo na quantidade de linfócitos

TCD4+ e um acréscimo de TCD8+ nas pacientes infectadas com HPV de alto risco

oncogênico, similarmente ao que acontece em pacientes infectados pelo vírus da

imunodeficiência humana (HIV). Neste caso específico, o mecanismo de apoptose

induz a um esgotamento fisiológico dos linfócitos T no curso da infecção viral

diminuindo a resposta imune e contribuindo desta forma para o quadro de

imunodeficiência.

O HPV utiliza algumas estratégias para evitar a ação das células NK e NKT,

desregulando a expressão de receptores que possuem ações inibitórias e ativadoras

durante as infecções de HPV e nos casos de câncer. Alguns destes mecanismos

estão relacionados com a diminuição da expressão CD1d, o que pode representar

uma estratégia para as células infectadas pelo HPV para evadir-se da vigilância

imunológica durante as fases iniciais da infecção (65).

Quando analisamos a população de células NK e NKT, independente do

poder oncogênico do HPV, observou-se uma diminuição acentuada nas duas

subpopulações avaliadas. O decréscimo observado nestas subpopulações pode

estar relacionado com a expressão aumentada de proteínas pro-apoptóticas, desta

forma nós leva a especular sobre a ativação de mecanismos indutores de apoptose.

Entretanto, não observamos diferença significativa na contagem de linfócitos

B no sangue periférico dos dois grupos de mulheres estudados (com e sem HPV), o

que talvez não ocorresse se tivéssemos avaliado material cérvicovaginal, uma vez

que a mucosa genital normal é infiltrada por linfócitos (TCD4+, TCD8 + e células

plasmáticas), células dendríticas (DCs) e macrófagos (65, 66).

Este resultado pode traduzir ainda uma participação limitada da resposta

imune humoral, quando a infecção está instalada. Constatamos ainda uma

contagem mais elevada de linfócitos TCD3 nas pacientes portadoras de HPV. Em

adição, outro estudo examinou a expressão forte e positiva de linfócitos T CD3

positivos entre os pacientes CIN III (67). Resultados semelhantes foram observados

em uma análise por imuno-histoquímica da expressão de células TCD4+ e TCD8+

na presença do HPV de alto risco oncogênico em lesões pré-malignas e malignas do

colo uterino (68).

41

A resposta imune pode ser um elemento-chave na progressão ou regressão

da infecção por papiloma vírus humano (HPV) e diferentes linhas de evidência

apontam que a regressão de lesões HPV induzidas é consequência da resposta

imune mediada por células (69).

Essas descobertas são importantes, no entanto, estudos adicionais tais como

investigação de padrão de resposta Th (Th1, Th2 e Treg), investigação de apoptose

dentre outras são necessários para identificar os mecanismos responsáveis pela

interação entre as infecções pelo HPV e o sistema imunitário do hospedeiro e sua

relação com a progressão das lesões.

42

7 CONCLUSÕES

A resposta imune pode ser um fator chave na progressão ou regressão da

infecção por HPV e diferentes linhas de evidência sugerem que a regressão de

lesões induzidas pelo HPV é o resultado da resposta imune mediada por células

43

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50

9 ANEXOS

9.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS TOXICOLÓGICAS TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Título do projeto: Avaliação imunológica e citológica de pacientes portadoras de Papiloma Vírus Humano (HPV). Responsável pela pesquisa: Geraldo Barroso Cavalcante Junior

A Sra. está sendo convidada a participar, voluntariamente, de uma pesquisa que visa associar os

resultados dos exames de sangue e coletas cervico - vaginais para através dessas diferentes

técnicas identificar e tipificar pacientes portadoras de HPV. Para avaliação desse estudo, será

necessário a coleta de 10 mL de sangue periférico por punção venosa para realização dos seguintes

exames imunológicos: Pesquisa de CD3 3, CD4e CD8, coleta de material cervico vaginal para análise

citológicas, reação de polimerase em cadeia (PCR) e imunocitoquímica. As amostras biológicas serão

coletadas no Laboratório da Universidade Potiguar (UnP) e analisadas no Laboratório de Imunologia

Clínica da Universidade Federal da Rio Grande Norte (UFRN) e na Unp. Sua participação neste

estudo é totalmente voluntária, podendo recusar-se a fazer parte do mesmo ou interromper se julgar

conveniente, sem prejuízo para o andamento do trabalho de pesquisa.

RISCOS: As atividades propostas neste projeto oferecem o mínimo de risco à saúde dos indivíduos

envolvidos na pesquisa. Dessa forma, podendo ser considerados os riscos referentes ao

procedimento de coleta, tais como: hematomas, sangramentos e desmaios referentes à coleta do

material biológico.

BENEFÍCIOS: Os benefícios deste trabalho, serão a identificação e confirmação do HPV através da

realização de exames sorológicos e cervicos vaginais realizados nos pacientes. Serão feitos exames

de citologia oncótica, PCR, imunocitoquímica. Além disso, será realizada também uma palestra

educativa de orientação sobre prevenção e tratamento do HPV, pela mestranda Daliana Caldas

Pessoa da Silva.

CONFIDENCIAL DO ESTUDO: Os participantes do trabalho de pesquisa em questão terão a garantia

do sigilo das informações geradas com as análises, até o limite permitido por lei. Além dos

pesquisadores envolvidos, apenas os componentes do Comitê de Ética em Pesquisa do HUOL

poderão, em algum momento, ter acesso aos resultados da pesquisa, se necessário. Cada pessoa

participante do projeto terá acesso aos resultados de seus exames, bem como o seu significado se

assim o desejar em qualquer momento de realização da pesquisa ou mesmo após a conclusão da

mesma. Cada indivíduo será registrado e terá um número de identificação, o que garante o sigilo dos

dados obtidos. Dessa forma, a identidade do paciente não será revelada em qualquer relatório ou

publicação científica resultante deste estudo.

DANO ADVINDO DA PESQUISA: Em caso de danos devidamente comprovados, resultantes desta

pesquisa, o sujeito será devidamente indenizado pela instituição responsável.

PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA: O participante do projeto de pesquisa poderá desistir da colaboração

em qualquer etapa e por qualquer motivo, sem que haja nenhuma penalidade ou prejuízo ao mesmo.

ARMAZENAMENTO (GUARDA) DO MATERIAL BIOLÓGICO: Posteriormente após as análises

laboratoriais, o material biológico remanescente cervico vaginal será armazenada no laboratório de

citologia da URFN e parte na Unp, não podendo em hipótese alguma ser removido do local de

acondicionamento nem cedido a terceiros. Os sangues coletados para realização da citometria de

fluxo, serão desprezados em expurgos da UFRN, de acordo com as normas dessa universidade.

51

PERGUNTAS: Estimulamos que você faça perguntas a respeito da pesquisa. Se houver alguma

dúvida, entre em contato com a Farmacêutica-Bioquímica, especialista em citologia clínica, Daliana

Caldas Pessoa da Silva no Laboratório de citologia Clínica do Departamento de Análises Clínicas e

Toxicológicas da UFRN.

COMITÊ DE ÉTICA: Este projeto foi avaliado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do HUOL (CEP).

Informações adicionais podem ser obtidas pelo telefone 3202-3719.

CONSENTIMENTO PARA PARTICIPAÇÃO: Declaro que os responsáveis pela pesquisa informaram

os riscos e benefícios do projeto de pesquisa a ser realizado e que após ter lido e compreendido as

informações contidas neste documento, estou disposto a participar de livre e espontânea vontade do

estudo, consciente de que posso, a qualquer momento, desistir de participar se assim o desejar.

Assim, autorizo a utilização das informações obtidas com finalidade de desenvolver a pesquisa

citada, a exposição do fato caso tenha sido realizada, como também a publicação do referido

trabalho de forma escrita, podendo utilizar inclusive minhas informações. Concedendo também o

direito de uso para quaisquer fins de ensino e divulgação nos jornais e/ ou revistas científicas, desde

que mantenham o sigilo sobre minha identidade.

Nome do paciente: __________________________________________________________

Testemunha: ______________________________________________________________

Assinatura do paciente: ______________________________________________________

Natal, _____/______/______

COMPROMISSO DO INVESTIGADOR:

Como coordenadora e responsável pelo projeto de pesquisa “AVALIAÇÃO IMUNOLÓGICA E

CITOLÓGICA DE PACIENTES PORTADORAS DE PAPILOMA VIRUS HUMANO (HPV) ”, declaro

que expliquei aos pacientes todos os procedimentos necessários para a realização do referido

trabalho. Comprometo-me a cumprir o que foi acordado com os mesmos sobre os riscos e benefícios

da pesquisa, de acordo com as normas estabelecidas na Resolução 196/96-CNS, procurando manter

a integridade e bem-estar dos indivíduos participantes neste projeto.

______________________________________

Daliana Caldas Pessoa

Av. Gal. Cordeiro de Farias, s/n, Petrópolis, Natal/RN

Telefone: 3215-4229

e-mail: dalicaldas@hotmail.com

Comitê de Ética em Pesquisa

Hospital Universitário Onofre Lopes

Telefone: 3202-37

52

9.2 Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário

Onofre Lopes CEP-HUOL

53

9.3 ARTIGOS

Artigo 1: Immunohistochemical expression of p16, Ki-67 and p53 in cervical lesions

– A systematic review. Publicado na revista Pathology – Research and Practice que

possui fator de impacto 1,543 e Qualis B2 da CAPES para área Medicina II.

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Artigo 2: Investigation of lymphocyte subpopulation alterations in peripheral blood of women with high risk oncogenic human papillomavirus. Submetido ao Journal of Clinical Laboratorila Analysis. Fator de impacto 1,543 e Qualis B2 da CAPES para área Medicina II.

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