Cromatografia em Fase Gasosa

A Cromatografia

- Método físico de separação - As espécies a serem separadas encontram-se distribuídas entre duas fases ; - Uma fase estacionária , fixa e com grande área superficial relativa- Uma fase móvel , um fluido que percola através da fase estacionária .

Classificação dos métodos Cromatográficos

O Processo de Separação

- A separação ocorre em função da distribuição da amostra entre as duas fases

- A fase estacionária e - a fase (gasosa) móvel ,chamada de gás de arraste , - é um gás inerte com a função de transportar os componentes de uma amostra através da

coluna para serem separados . -

Em função da característica da fase estacionária temos :

- A Cromatografia gás liquido (CGL) e

- A Cromatografia gás sólido (CGS) , onde

- Fase Estacionária é um sólido adsorvente de grande área superficial - Ex. sílica gel , zeolita sintética (peneira molecular) , carvão ativo (vegetal) .

A Separação se dá através da adsorção diferencial dos componentes da amostra é geralmente empregada na separação de gases como o N2, O2 , CO2 etc.

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- A Cromatografia gás liquido (CGL)

- A fase estacionária é uma fina camada liquida que reveste um suporte inerte e sólido . - A Separação se dá através da distribuição da amostra dentro e fora desta camada , ou

seja , a Partição da amostra entre as fases móvel e estacionária (liquida) .

A Separação

- No tempo t1 A e B , entram na coluna tal como se encontram na amostra (uma mistura)- No tempo t2 as moléculas de B, com maior interação com a fase liquida (estacionária) , começam

a se retardar .- No tempo t3 as moléculas de A já separadas de B , começam a deixar a coluna . - O componente A (menos retido) deixa a coluna em tempo inferior ao B (mais retido) e após a

separação A e B podem ser identificados e ou quantificados .

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TEORIA BÁSICAFatores que governam o desempenho de uma separação cromatográfica .

Cromatograma é um registro gráfico da analise , que indica

- O tempo de retenção e área do pico - A concentração de cada um destes componentes na amostra - Qualquer aumento na concentração dos componentes da amostra causará um aumento

proporcional na área do pico referente ao componente - Trás informações importantes sobre o desempenho da separação

A teoria nos permite determinar duas características ; a posição do máximo do pico e sua velocidade de alargamento .

- No momento da injeção = perfil estreito de concentração (t0)- Partição entre as duas fases e arraste através da coluna = gaussiana (tempo t1) - Maior Tempo na coluna = gaussiana de forma larga e baixa ( tempo t2) .

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O tempo de retenção tR = tempo transcorrido desde de o momento da injeção até que o máximo do pico seja obtido

tR é uma característica do soluto , da fase liquida , do fluxo do gás e da temperatura de trabalho na coluna , Mantendo-se todas as condições de trabalho o tR será sempre o mesmo tM = o tempo desde a injeção até obter-se o pico inerte (ex. ar ) . O tempo t M é uma medida do tempo em cada componente permanece na fase gasosa .

Posição do Pico

É dada pela velocidade de fluxo do gás de arraste e pelo fator de retenção k ( também denominado de relação de partição ou de distribuição ) :

k =

É a relação entre a quantidade de amostra na fase liquida (m) e a quantidade de amostra na fase gasosa (m’) e esta relacionada com o tR :

tR = tM + tM k

O fator de Retenção (k) também pode ser relacionado com a constante de Distribuição (K)

K = k

Onde :

= (relação de fases)

Assim ;

K =

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Volume de Retenção, VR .

O volume de gás de arraste necessário para eluir uma amostra da coluna È o volume de gás que flui desde o momento da injeção até a eluição do pico Como fluxo FC é constante no transcorrer de uma analise cromatografica em fase gasosa

VR = tR x FC ouV’R = VR - VM

V’R = tR x FC

Retenção Relativa

O fator de retenção () é a relação existente entre o tempo que dois picos permanecem na fase liquida , sendo proporcional aos coeficientes de partição ,

=

- É a medida da seletividade da fase liquida com relação a dois componentes . - Para = 1 os dois componentes terão a mesma solubilidade na fase estacionária e não

apresentarão separação nesta fase . quanto maior for o valor de , maior a seletividade da fase liquida , melhor a separação entre os picos .

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Determinação Gráfica de ()

Eficiência da Coluna

A eficiência de uma coluna cromatográfica = número de pratos teóricos (N)

Definição = É o equilíbrio de distribuição do soluto entre as duas fases , quanto maior o numero de pratos teóricos , mais equilíbrios existirão e melhor será a separação.

Na prática se calcula o N a partir do próprio cromatograma obtido . tR é o tempo de retenção e Wb a largura da base do pico , obtido a partir das tangentes da curva gaussiana interceptando a linha de base ,

N = 16

Alternativamente N pode ser calculado a partir da meia altura do pico , Wh ;

N = 5,545 ou

Uma unidade derivada de N , é o número de pratos teóricos efetivos (Nef) , que dizer , o numero de pratos calculados a partir do tempo de retenção ajustado .

Nef = 16 2 ou = 5,545

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Altura Equivalente a Um Prato Teórico (A.E.P.T. ou H )

* Diversos fatores afetam o número de pretos teóricos ; Tempo de retenção , Comprimento da coluna , Temperatura da coluna , Soluto , Fluxo do gás , Tamanho da amostra , Técnicas de injeção e etc.

Assim uma coluna pode ser melhor avaliada operacionalmente a partir de um artificio chamado de Altura Equivalente a Um Prato Teórico (A.E.P.T. ou H ) , que esta relacionado com o comprimento da coluna ,L ( cm ou mm ) e o número de pratos teóricos N .

H =

Portanto H é o comprimento necessário de uma coluna para gerar um prato teórico , quanto maior N menor será o H e mais eficiente será a coluna .

EQUAÇÃO DE VAN DEEMTER

Os fatores que governam o alargamento das bandas de um pico podem ser melhor entendidos ,considerando-se a equação de Vai Deemter , assim chamada em homenagem ao autor do primeiro trabalho sobre o assunto em 1956 . Em sua forma mais simples a equação é ;

H = A + + C +

Onde ;

H = A.E.P.T.A = Efeito dos Múltiplos Caminhos (empacotamento)B = Difusão MolecularC = Resistência a transferencia de massa

= Velocidade linear média do gás de arraste = L / tM

Os termos A,B,C não serão aqui abordados , eles contem os fatores que determinam a eficiência da coluna e demonstram que as colunas mais eficientes são obtidas quando se tem, suportes sólidos pequenos e uniformes , são utilizadas pequenas percentagens de fase estacionária liquida (em CGL) e se utilizam baixas temperaturas para operar a coluna .

Resolução

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A resolução (RS) é uma medida quantitativa da separação de dois picos consecutivos , sendo determinada por dois fatores : tR e Wb

RS = =

tR é uma medida da separação dos máximos dos picos (tR1 - tR2) , poderá ser aumentado reduzindo-se a temperatura ou escolhendo-se uma fase mais seletiva ( maior ) . Wb é uma medida da eficiência da coluna , relacionando-se com a velocidade de alargamento da banda, pode ser medido pelo número de pratos teóricos N ou por H .

A figura abaixo mostra a influencia de N e na resolução .

Alem de N e , a resolução depende da posição relativa dos dois picos no cromatograma . Uma equação geral ilustrando esta dependência é denominada de equação mestra da Resolução .

RS =

INSTRUMENTAÇÃO

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1. Cilindro de Gases2. Reguladores de Pressão3. Injetor4. Seringa 5. Coluna6. Forno7. Detector8. Registrador

GÁS DE ARRASTEIdealmente :

- Não interagir com a Fase Estacionária e nem com a Amostra - Adequado ao Detector

- Barato e estar Disponível no Mercado

Tipo de Detector Gás de Arraste Ideal

Condutividade Térmica H2 , He

Ionização de Chama H2 , He , N2

Captura de Elétrons N2 ultra puro ou Argônio + 5% Metano

Para se ter Picos Ideais a Forma de Introduzir a Amostra na Coluna é muito importante

Introdução da Amostra

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Vaporização da Amostra

Amostras Gasosas : Seringas “Gas Tight” ou Válvulas Amostras Líquidas : Micro Seringas ( 1, 2, 3, 5, 25 e 100 L ) , o Injetor esta

aquecido a 20 ou 30 °C acima da P.ebulição da amostra Amostras Sólidas : Preparar uma Solução e Injetar como um Líquido

Coluna Seleção

“Coração do Sistema Cromatográfico”

Destaca-se os parâmetros ;

1. A Fase Estacionária ( O suporte Sólido e a Fase Líquida )

2. O Tubo ( Material , comprimento e Diâmetro )

Cobre : Baixo custo , Fácil preparo e Manipulação , Pouco Inerte ( aminas , esteroides )Vidro : Baixo custo , Inerte , Frágil Aço Inox : De largo uso na forma de espirais compactas de baixo volume , relativamente inerte

, mais caro .

3. Dimensões ideais : Definida pelo propósito do experimento e eficiência desejada

Colunas Empacotadas : Forma de espirais até 3 m com diâmetro de 2 a 4 mm , preenchidas integralmente com partículas da fase estacionária

Colunas Capilares : Até 100 m ( usual 15 a 30 m ) , diâmetro de 0,50 a 0,10 mm , com um fino filme da fase liquida depositado sobre as paredes do tubo .

4. Escolha da Fase Liquida : Processo difícil não existe procedimento básico ,

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Alternativa : Obter o máximo de informação sobre a amostra , Componentes Prováveis , Faixa de ebulição , Polaridades , estrutura química . O ponto de partida é sempre a velha regra , Similar dissolve Similar , Maior a similaridade entre a fase Liquida e a amostra , mais simples a separação maior a eficiência

5. Limite de Temperatura da Fase Liquida :

FASE Limite de Temperatura °C1 . Esqualano 0 – 125

2 . OV-1 ; SE-30 ; SP-2100 100 – 3503. DEXSIL-300 50 – 350

4. OV-17 ; SP-2250 0 – 3505. QF-1 ; OV-210 ; SP-2401 0 –275

6. CARBOWAX-20M 60 – 2257. DEGS 20 – 200

8. OV-275 20 – 250 6. Escolha do Suporte Sólido :

Ideal ; Grande área superficial , alta resistência mecânica ; inércia e tamanho uniforme O mais popular suporte do mercado é o Chromosorb produzido por Jhons Manville Co e é encontrado em diversas granulometrias ( A , G , F , T , W )

Controle de temperatura

De Suma Importância no processo de Separação ; O instrumento de ter controles independentes Para :

Temperatura de Injeção : Suficiente para Vaporizar a amostra RapidamenteSuficiente para não Decompor a amostra

Temperatura da coluna :Suficiente para se obter tempos curtos de analise Operar dentro dos limites da fase estacionáriaNa maioria das vezes , menores temperaturas , maior Razão dos Coeficientes de Partição , melhor a separação

Temperatura do Detector :

Aquecido o Suficiente para evitar condensação de amostra Efeito , alargamento dos picos

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Detector

Função :Indicar a Presença e Quantificar os Componentes no Efluente da Coluna

Classificação : ( de acordo com a Resposta e Seletividade )Universal :

Quando responde a todos os componentes presentes na amostra Seletivo :

Quando responde apenas a determinadas classes de compostos

Específicos :Quando responde apenas a Um ou um Específico grupo componentes com características químicas similares

Características desejáveis :

Sensibilidade elevada Baixo nível de RuídoAmpla faixa de Linearidade Detectabilidade Mínima Baixo CustoDurabilidade ElevadaSimplicidade e disponibilidade no Mercado

Registradores Potenciométricos Função :

Imprimir na forma de uma Gaussiana o sinal elétrico proveniente do Detector proporcional a quantidade de amostra injetada no sistema

Integradores Eletrônicos :

Alem de representarem o Cromatograma , permitem registrar , tempo de retenção , altura do pico e a área do pico .

Computadores :

Alem dos registros de dados , permite o controle de todas as funções do Cromatografo

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DETECTORES

BASES FÍSICAS DO FUNCIONAMENTO- Velocidade da Perda de Calor de um Corpo quente para os Gases na sua vizinhança

- Em Condições Analíticas Ideais podemos utilizar isto para medir a composição de uma Amostra

- O Corpo Quente , são Filamentos Metálicos ( Platina , Ouro , Tungstênio ) inserido numa Cavidade de um bloco metálico grande

- Com o Choque das Moléculas vaporizadas com o Filamento Quente , esta transfere calor para o Gás

- Em função de sua Mobilidade ( Velocidade de Difusão ) O Gás apresenta maior ou menor Condutividade Térmica

Compostos C.R.T P.MGás de Arraste

Hélio 100 4Hidrogênio 128 2Nitrogênio 18 28

SolutosEtano 17,5 30

n-Butano 13,5 58n-Nonano 10,8 128i-Butano 14 58Etanol 2,7 46

Clorofôrmio 9,9 119Vantagens

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- Detector de construção simples , barato

- Faixa de Linearidade razoável e boa estabilidade

- Não Destrutivo pode ser usado para escalas preparativas

- Não apresenta Restrições para a natureza química dos compostos

Restrições de Uso

- Faixa de detectabilidade apenas razoável 10-6 g

BASES FÍSICAS DO FUNCIONAMENTO

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- Principio , a Condutividade elétrica de um Gás é Diretamente Proporcional a quantidade de Partículas Carregadas , nele presente

- Quando somente o gás de arraste passa pela chama a corrente emitida é muito pequena , 10-14 Amps .

- Quando Compostos Orgânicos Vaporizados passam pela Chama , o resultado da queima são Partículas Carregadas , a Corrente gerada é proporcional ao analito eluindo da coluna , da ordem de 10-8 a 10-12 Amps

- Alguns compostos não detectados (Visto) pelo FID ; O2 , N2 , NO , NO2 , CO , CO2 , CS2 , H2S , SO2 , H2O

- O Detector requer um gás como combustível H2 e outro como comburente O2 (Ar)

- O desempenho do Detector também esta relacionado com a relação dos gases para a queima , normalmente 1:1:10 ( H2 , gás de arraste , Ar )

Vantagens

- Detector de construção simples , barato

- Ampla Faixa de Linearidade e excelente estabilidade

- Seletivo a compostos Orgânicos

- Boa detectabilidade 10-12 g

- Excelente para analises a nível de traços

Restrições de Uso

- Detector destrutivo

- Requer três fontes de gases

- É limitado na analises de compostos Inorgânicos (mesmo que voláteis )

- Átomos eletronegativos presentes em compostos orgânicos ( O , P , S , halogênios), podem diminuir a sensibilidade do detector

SELEÇÃO da COLUNA

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Cromatografia Gás Sólido (Adsorsão)

Fase Estacionária : Sólido

Separação : Adsorsão seletiva nas Partículas do suporte

Uso mais Freqüente : Análise de Gases e compostos de baixo ponto de ebulição , especialmente utilizada na analise de poluentes a nível de traços

Principais Adsorventes :

Peneiras Moleculares , Zeolitas

Composição : Alumino-Silicatos ; 1,00 Al2O3 . 1,92 SiO2 . x H2O

Apresentação : 5 A (poro de diâmetro 5 Ǻ ) 13 X (poro de diâmetro 10 Ǻ)

Uso mais Freqüente : O2 , N2 , H2 , CH4 , CO , Ar ( a baixas temperaturas )

Dificuldades : Os gases CO2 , Cl2 , HCl , SO2 , e H2S são adsorvidos na coluna , precisa ser ativada a 300 °c por 2 horas .

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SILICA GEL

Composição : Polímero amorfo , grupo principal Si-OH

Apresentação : Spherosil (Rhone-Progil) e Porasil ( Waters )

Uso mais Freqüente : Ar, H2 , CH4 , CO e etano ( a baixas temperaturas )

SpherosilTipo XOA400 XOA200 XOB075 XOB030 XOB015 XOC005Área superficial m2/g

400 185 100 100 50 10

Diâmetro médio dos poros Ǻ

80 150 300 600 1250 3000

PorasilTipo A B C D E FÁrea superficial m2/g

350 - 500 125 - 200 50 -100 25 - 45 10 – 20 2 - 6

Diâmetro médio dos poros Ǻ

100 100 -120 200 – 400 400 – 800 800 - 1500 1500

* Atualmente esta praticamente substituída por Chromosrob 102 um polímero poroso

ALUMINA

Composição : Óxido de Alumínio ( -Al2O3- )

Uso mais Freqüente : Apresenta boa Separação para Hidrocarbonetos Insaturados

Dificuldades : É um adsorvente mais fraco que a sílica , requer ativação antes do uso

* Atualmente esta praticamente substituída por polímeros porosos

CARVÃO VEGETAL Composição :Carvão

Apresentação : Carbosieve B (carvão ) , Carbopack (carvão grafitizado)

Uso mais Freqüente : Analise de compostos polares , H2O , álcoois , e compostos carbonílicos ao nível de ppm e ppb

Dificuldades : Produz picos com longa cauda (Carbosieve B) problema foi diminuindo com a introdução do Carbopack

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POLIMEROS POROSOS

Composição : Polímero Sintético poroso , Etilvinilbenzeno entrecruzado com Divinilbenzeno Apresentação : Porapack e Chromosorb série 100 e Tenax-GC (Óxido de 2,6 difenil-p-fenileno)

Uso mais Freqüente :

Gases e Compostos de baixo ponto de EbuliçãoPorapack Separação de ; Temperatura Nota :

P Compostos de polaridade intermediaria estável até 250 °c Menos Polar P-S Compostos de polares ( Cetonas ) 250 °c Polar

S = SilanizadoQ Gases , metano , CO2 , Ar , etano e.t.c 250 °c Mais utilizado deles

Q-S Para compostos altamente polares ( ácidos orgânicos)

250 °c

R Compostos reativos (ácidos caboxilicos) 250 °cS Álcoois de cadeia ramificada e normal 250 °cN Acetileno e outros Hidrocarbonetos 225 °cT 200 °c O mais polar da série

Chromosorb Tipo Área m²/g ø Poros Temp. °c Algumas Aplicação101 S-D 50 0,3 – 0,4 275 Ácidos Glaxos, Aldeídos,

Cegonhas , Glicois ,Éteres , Esteres 102 S-D 300 – 400 0,0085 250 Compostos de Baixo peso

Molecular, Apresenta cauda .103 PE 15 –25 0,3 – 0,4 275 Hidrazinas ,aminas , amidas 104 A-D 100 – 200 0,06 – 0,08 250 Nitrilos , Amônia , Óxidos de

Nitrogênio , Xilenois 105 P-A 600 – 700 0,04 – 0,06 250 Misturas Aquosas de Formaldeído ,

Acetileno e gases Leves

* S = Estireno , D = Divinilbenzeno , PE = Poliestireno , A = Acetonitrilo , PA = Poliaromático

Tenax Separação de Composto Ebulição °c Retenção min.Decanol-1 260 1,5

Dodecanol-1 265 2,5Hexadecanol-1 290 7,0

Fenol 210 2,5m-Cresol 220 4,0

o-Aminofenol 245 9,0m-Aminofenol 260 11,5

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Cromatografia Gás - Líquido (Partição)

Característica ideal para o suporte Sólido

Área Superficial 1 – 20 m² / gTamanho das Partículas Menor com melhor distribuiçãoUniformidade dos Poros 10 m

Inércia Atividade zeroForma das Partículas RegularResistência Mecânica Elevada

Alguns Suportes Sólidos de maior Uso

Tipo Área m² / g São produzidos a partir de tijolos refratários de terras diatomaceas , triturados e separados de acordo com sua granulometria , os mais rígidos e com maior área são os mais comumente empregados

T = resinas de Teflon

Chromosorb P 4,0Chromosorb A 2,7Chromosorb W 1,0Chromosorb G 0,5

Chromosorb T 7,8

TRATAMENTO dos SUPORTES SÓLIDOS

Problema com Terras Diatomaceas :

Grupos Si-OH ( Preparados a base de Diatomitas ) interferem na separação e apresentam problemas de adsorsão , causando alargamento de banda .

Óxidos minerais contidos nestes suportes podem catalisar reações com a Amostra

TRATAMENTO ÁCIDO :

Consiste em lavagens do suporte com um ácido Mineral para remover as impurezas e desativar a superfície sem alterar sua composição , precisa ser removido após o tratamento

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TRATAMENTO com SILANOS : 1 – Reação entre o Suporte e DimetildicloroSilano (DMCS) envolvendo apenas um grupo Hidroxil

A FASE LÍQUIDA

Em CGL a Fase Líquida tem a função de exibir capacidade necessária a separação dos componentes

Características Ideais

Ser Inerte Apresentar boa Solubilidade diferencial entre os componentes da Amostra ( elevado ) Ser Estável em ampla faixa de temperatura Não ser Volátil na faixa de temperatura de trabalho Estar facilmente disponível , ser reprodutível e de baixo custo

Escolha da Fase Líquida

A Solubilidade diferencial entre os componentes da Amostra ( ) é a características mais importante .

Quanto maior for o valor de , retenção relativa , melhor será a separação

=

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Si OH OSi Si

CH3

CH3

Cl(CH3)2SiCl2+

+

DMCS

CH3OHOSi Si

CH3

CH3

Cl OSi Si

CH3

CH3

O CH3

Influencia de sobre o n° de pratos teóricos (retenção relativa) N (n° pratos teóricos)

1,60 4851,37 9401,07 74001,015 160000

A seletividade ou fator de separação depende das interações entre o soluto e fase líquida ou forças coesivas de Van der Walls

Dipolo-Dipolo , Dipolo-Dipolo Induzido , Dipolo Induzido-Dipolo Induzido

Na prática a escolha da Fase liquida depende da composição da amostra :

Quanto mais se souber a cerca da amostra em estudo ( componentes , ponto de ebulição , estrutura ) , mais fácil será a seleção da coluna e das condições de operação .

Para uma eficiente e normal separação a Fase Liquida deve possuir estrutura química similar aos componentes da amostra

Classificação de SolutosClasse I

Muito PolarClasse II

PolarClasse III

IntermediariaClasse IV

Baixa PolaridadeClasse V

Não PolarÁgua Álcoois Éteres CHCl3 Hidrocarbonetos

saturadosGlicois, Glicerol Ác. Graxos Cetonas CH2Cl2 CS2

Amino Álcoois Fenois Aldeídos CH3CHCl2 MercapitanasÁc. Carboxílicos Aminas primárias

e secundariasEsteres Hidrocarbonetos

aromáticosSulfitos

PoliFenois Nitrilas c/ - H Aminas terciarias Hidrocarbonetos oleifinicos

Outros Hidrocarbonetos

Classe I , Compostos capazes de formar pontes de Hidrogênio Classe II, Compostos que contem um átomo doador (O,N,F) e hidrogênio ativo Classe III, Compostos que contem um átomo doador (O,N,F) sem hidrogênio ativo Classe IV, Compostos que contem hidrogênio ativo e não átomo doadores Classe V , Compostos que não exibem capacidade de ligação com o hidrogênio

Fases Líquidas , ClassificaçãoClasse I Classe II Classe III Classe IV & VFFAP Tetracianoetil penta-

eritriolTodos os poli - Esteres SE – 30

20M-TPA Zonyl E-7 Dibutil tetrafitalato SF – 96Carbowaxes Ethofat SAID DC – 200

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Ucons ’, - Oxidipropiononitrila

Benzil cianeto Dow 11

Versamid 900 XE-60 Lexam SqualaneHallcomid XF-1150 Carbonato de

propilenoHexadecano

Quadrol Amine 220 QF-1 ApiezonsTheed Epon 1001 Poli Fenilester OV – 1

Manitol Cyanoetilsucrose OV - 17DiglicerolCastorwax

Soluto – Líquido Efeito das classes sobre a Retenção

III – C IV – DV – C ou D

Sistema quase ideal , solutos separados de acordo com seus pontos de ebulição

IV – C Soluto bem retido pela fase liquidaI II A ou B III

Soluto geralmente retido pela fase liquida

II - DIV BV

Soluto não bem retido pela fase liquida

I - DIV AV

Soluto não retido pela fase liquida , Solubilidade normalmente limitada

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Algumas Fases Liquidas

Colunas CapilaresCromatografia gasosa de alta resolução (HRGC)

Tipos de colunas

SCOT ; Coluna de tubo aberto com suporte recoberto WCOT ; Coluna de tubo Aberto com parede interna recoberta

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As colunas tubulares abertas foram introduzidas por J.E.Golay no inicio dos anos 60 , revolucionado a técnica de CG , que passou a chamar HRGC . E foram popularizadas uma década após os trabalhos de Horváth .

Comparação entre Colunas Capilares e EmpacotadasParâmetro Capilar Empacotada

Comprimento m 5 – 50 2 – 6Diâmetro mm 0,1 – 0,5 2 – 4Fluxo ml /min. 0,5 – 10 10 – 60Pratos teóricos 150000 ( 30 m ) 5000 ( 3 m )

Pratos efetivos / m 3000 2500Capacidade do pico 50 ng 10 gEspessura do Filme 0,2 – 5 m 10 m

Sistemas de Injeção para HRGC

Por possuir uma capacidade volume muito menor torna-se necessário reduzir o volume de amostra injetado ;

“ SPLIT INJECTION ” , Injeção com Divisão , Exemplo ; Para um fluxo de 100ml/min e um fluxo de coluna de 1 ml/min , se introduzirmos 2 l de amostra o volume que entra na coluna é 0,02 l

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Injeção na Coluna “ On Column Injection “ ; Recentemente apareceram no mercado seringas com agulhas de 0,30 mm de diâmetro em sílica fundida , permitindo o uso desta técnica ate para as colunas WCOT .

Um Cromatograma de HRCG

Analise Quantitativa

Etapas do Procedimento Analítico em CG

1 . Amostragem2 . Preparo da amostra 3 . Análise Cromatográfica4 . Integração 5 . Cálculos6 . Reportar o resultado

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Amostragem : A tomada de amostra deve ser representativa , isolar uma pequena alíquota do total da população .

Preparo da Amostra : Dependendo da característica da amostra , esta devera sofrer uma série de processamentos químicos e físicos ate apresentar forma adequada para ser cromatografada . ( trituração , filtração , extração , diluição , concentração )

Analise Cromatográfica : Gás de ArrasteO InjetorA Coluna O DetectorO Registrador

Integração : A integração de pico cromatográfico visa relacionar o tamanho do pico com a concentração da amostra .

Principais Métodos de Integração

Manual Mecânico EletrônicoAltura do Pico Integrador tipo Bola e

DiscoIntegrador Digital e

ComputadoresÁrea do Pico

Altura x Largura na meia Altura

TriangulaçãoPlanimetria

Cortar e pesar o Papel

Integração Manual

A integração manual dispõe de duas alternativas :

Medir a altura do Pico , ou seja , a distância entre seu máximo e a linha de base Medir a Área sob o Pico

Altura do Pico

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Vantagem , procedimento bastante simples e rápido

Limitações , Picos mal resolvidos , muito pequenos , alterações na linha de base

Área do Pico

Existem quatro modos básicos para se integrar manualmente a área do pico

1) Altura x Largura a meia Altura ,

Procedimento bastante útil para picos simétricos com forma similar ao triângulo ,

A = H x Wh

Resultados aceitáveis são obtidos quando picos simétricos e de largura razoável são obtidos

2) Triangulação

Neste caso a Altura (H) é medida da linha de base até o encontro com as tangentes dos lados do pico , onde também se determina o valor da Base (B) do triângulo ;

A = B x H / 2

A técnica conduz a resultados satisfatórios desde que com picos de forma gaussiana

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3) Planimetria

Neste caso a área do pico é obtida com um dispositivo para medir o perímetro do Pico , um Planímetro , um contador digital mede a distancia percorrida que é proporcional a Área .

Técnica bastante versátil , mede qualquer tipo de pico , limitada a habilidade da pessoa que esta efetuando a medida .

4 ) Cortar e pesar o Papel

Apesar de enfadonho e lento é um dos melhores métodos de integração manual , desde que a umidade e gramatura do papel integrador sejam constante .

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Integração Eletrónica

Detetor envia um sinal em pulsos a um conversor analógico – digital (interface A/D) A integração é efetuada somando-se estes pulsos . Um circuito lógico determina , o máximo e fim do pico , calculando ainda a inclinação Um microprocessador calcula o tempo de retenção a área e reporta os resultados obtidos

Diagrama genérico Integrador Eletrónico

Algumas das vantagens da Integração Eletrónica ; ampla faixa dinâmica de sinais ( desde microvolts ata volts ) , Boa sensibilidade , ótima precisão e exatidão .

* A integração eletrônica , atualmente substituiu todos os outros métodos

Comparação entre métodos de integraçãoMétodo Tempo de Análise

( para um pico)Precisão Sr

Planimetria Lento ( 1 min ) 4,06Triangulação Lento ( 1 min ) 4,06

Altura x Largura Lento ( 1 min ) 2,58

Cortar e Pesar Bastante Lento ( 2 min ) 1,74Eletrónico Rápido ( 10 seg. ) 0,44

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Cálculos

Normalização :

Consiste no cálculo da % de um comente da amostra ( A ) , a partir da % de área que este pico representa na área total do Cromatograma ,

% A =

Limitações :

Assume que todos os picos foram eluidos e detectados , e que o detector apresenta a mesma resposta para todos os picos .

Normalização de Área Corrigida / Fator de Resposta : ( Ou Fator de Resposta do Detector )

São Fatores utilizados para converter as áreas obtidas em valores proporcionais a % das massas .

Preparam-se soluções de Massa (m) conhecida para cada um dos Componentes de Interesse

Após obter a área (A) de cada um dos picos , cácula-se a razão A/m , fator de resposta para aquele pico

A área corrigida do componente é obtida , dividindo-se a área do Cromatograma pelo fator de resposta

Então a % em massa do componente é dada por

% A =

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Cálculo para Normalização de Área Corrigida

Pico Massa Injetada

m

Área ACm²

Fator de resposta

A / m

Área CorrigidaA / ( A/m)

%massapico

A 10 100 10 10 25B 10 150 15 10 25C 10 300 30 10 25D 10 600 60 10 25

% A =

% A = = 25 %

Apesar de melhor que a Normalização simples este método ainda assume que todos os picos eluiram da coluna

Padronização Externa

A % em massa de uma amostra desconhecida é determinada a partir de um gráfico de calibrarão

Prepara-se a curva de Calibração lançando-se as áreas obtidas a partir de soluções de padrões de massas conhecidas

A % em massa da amostra é dada por

% massa =

Este método é melhor que os métodos anteriores , mas requer o uso de padrões de alta pureza e controle exato dos volumes injetados .

Padronização Interna

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Padrão Interno (PI) é um Composto que se adiciona a amostra e deve ;

Não estar presente na amostra Não interferir na analise Possuir alto grau de pureza Ser adicionado em concentrações similares ao composto de interesse Ser bem resolvido em relação aos outros picos

Preparo da curva de Calibração

Prepara-se varias soluções com o padrão do componente a ser analisado e o PI

Construir a curva de calibração de área x massa ;

Lançar no Gráfico :

A área do Padrão (Ap) dividida pela área do PI (API ) contra a massa do Padrão (mp ) dividida pela massa do PI (mPI )

A seguir , adiciona-se um a quantidade de PI a Amostra (desconhecida) , Cromatografando-se a mistura tem-se , Aa e API

Calcula-se a razão Aa / API e obtém-se um valor

Este valor é interpolado no gráfico de calibração para se encontrar a razão das massas da amostra e do PI ( ma / mPI )

Multiplicando-se este valor ( ma / mPI ) pela massa do padrão interno conhecido , temos a massa do componente em questão

ma =

Efeitos da Temperatura em Cromatografia Gasosa

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Analise Isotérmica : Temperatura constante do forno do inicio ao final da analise

Programação de Temperatura : Temperatura do forno é alterada durante a analise

Separação de uma mistura complexa ( hipotético)

A Programação de Temperatura

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A temperatura inicial : normalmente é inferior ( de 50 a 90 °C ) ao ponto de ebulição do componente mais volátil presente na amostra

A velocidade do Aquecimento : O Valor ótimo é um compromisso entre a Resolução e o Tempo de Analise . Na prática tipicamente variamos de 5 a 10 °C / min. a rampa de temperatura

A temperatura final : Deve ser próxima ao ponto de ebulição do componente mais volátil , levando-se em conta a temperatura máxima de operação da coluna

Requisitos necessários para a P.T.C.G.

A . Programador de temperatura para o Forno

B . Aquecedores separados para , injetor , Forno e detector

C . Forno de pequeno volume com capacidade de refrigeração rápida

D . Fase estacionária adequada a temperatura final de trabalho

Comparação entre uma Analise Isotérmica e com P.T.C.G.Característica Analise Isotérmica P.T.C.G.

Precisão na medida dos picos Varia com a forma do Pico Pequena VariaçãoIntervalo de ebulição da

amostraLimite : 100 °C Até 450 °C

Fase estacionária Muitas limitadaControle de Fluxo Simples Controle diferencialFornos separados Conveniente Necessário

Separação Depende dos componentes Pode ser Otimizado

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ( HPLC )

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1 – Reservatório de Fase Móvel , frascos de vidro de 1 a 3 litros , volume suficiente para um dia de trabalho

2 – Bombas ; Aspectos mais importantes p/ o sistema de bombeamento

Pressão máxima de operação de 600 bars Vazão continua sem pulsos , ou com amortecedor de pulsos Intervalo de vazões entre 0,01 e 10 ml / min. Reprodutibilidade de constância de vazão de 1,0 % Pequeno volume de bombeado , 0,5 ml para sistemas de bombas com pistão e eleuição com

gradiente Tipos de Bombas mais utilizadas ; Bombas reciprocas e Bombas tipo seringa

3 – Medidores de Pressão ; ajudam a diagnosticar problemas com o sistema , como vazamentos e entupimentos

4 – Válvulas de Amostragem ; Com uma nicro-seringa injeta-se a amostra dentro de uma pequena câmara , onde é dilucida e arrastada pela fase móvel , o volume deste “loop” varia entre 1 e 100 L .

5 – Colunas

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Colunas empacotadas geralmente com comprimento de 15 a 25 cm e 4,5 mm de diâmetro Existem algumas fases estacionárias diferentes , que implicam em alguns mecanismo de

separação

5.1 - Líquido – Sólido ou Adsorsão

Baseia-se na competição entre as moléculas da amostra na fase móvel e os sítios ativos da fase estacionária ( Suporte sólido )

5.2 – Líquido – Líquido ou por Partição ( Fase normal e Fase Reversa )

Baseia-se nas diferentes solubilidades existentes entre os componentes da amostra na fase móvel e fase estacionária , Assim ; componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidas por ela , enquanto as menos seletivas são transportadas mais rapidamente pela fase móvel .

5.3 – por Exclusão

Efetua a separação de acordo com o tamanho efetivo das moléculas , as moléculas pequenas penetram mais nos poros do suporte , enquanto que as maiores são excluídas de todos os poros , movendo-se mais rapidamente e as moléculas pequenas são eluídas mais lentamente .

5.4 – por Troca Iônica

A fase estacionária é uma resina de poliestireno entrecruzada com divinil benzeno ligados a grupos iônicos , - SO-

3 para trocadores de cátions e – NR+3 no caso de trocadores de ânions .

M+ + R-SO-3 Na+ Na+ + R-SO-

3M+

6 – Detectores ; idealmente devem exibir

Alta sensibilidade e baixo limite de detecção Resposta rápida a todos os solutos Insensibilidade a mudanças de temperatura e vazão de fase móvel Pequena contribuição ao alargamento do pico em função do volume da célula do detector Resposta linear as mudanças de massa do soluto Não destruição do soluto e Segurança e conveniência para o uso

Alguns Detectores mais populares em HPLC :

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Adsorvente

Solvente Soluto

1 - Detector de aborvâmcia Ultravioleta e no Visível

Baseia-se na absorvância da luz por parte da amostra ao passar através duma radiação eletromagnética .

Faixa do Ultravioleta até o infravermelho (em um dado comprimento de onda) Resposta seletiva aos compostos que absorvem no comprimento de onda de operação Existem dois tipos de Detectores , os de comprimento de onda variável , espectrofôtometos

e os fotométricos , que funcionam com um ou dois comprimentos de onda fixos .

2 – Detector por Índice de Refração

E o segundo detector de maior uso em HPLC Acompanha continuamente a diferença no Índice de Refração da fase móvel pura e do

efluente da coluna Para substâncias que não absorvem no UV VIS , este é sua melhor escolha Resposta universal com sensibilidade razoável da ordem de g ( 10-6 g ) O detector é sensível a variações de temperatura , vazão e composição da fase móvel

Vantagens da HPLC

Menor tempo de análise , Consegue-se análises em alguns minutos , devido as rápidas vazões de fase móvel e eficiência da coluna .

Alta Resolução ; é possível análise de misturas complexa , checa a separar até duzentos compostos diferentes

Resultados quantitativos ; exibem grande precisão para a maioria dos métodos , com desvios inferiores a 0,5%

Boa sensibilidade ; é possível utilizar-se detectores que permitem medidas de até 10-9 g Versatilidade ; é a grande vantagem da HPLC , pode-se ser utilizada na análise

compostos orgânicos, inorgânicos e as amostras podem ser líquidas , sólidas , iônicas ou covalentes , sua única limitação são os gases .

Automação ; ampla possibilidade de automação

Limitações da HPLC

Alto custo da Instrumentação ; os sistemas mais simples custam de U$ 7,000 a 20,000 e os mais automatizados atingem mais de U$ 50,000

Alto Custo de Operação ; Reagentes de alta pureza , colunas de reposição periódica , manutenção especializada e peças de reposição periódica , etc.

Falta de um Detector Universal Seletivo ; Ainda não se dispõe de um detector simultaneamente sensível e universal . O de índice de refração é universal porem sua sensibilidade é bem limitada , o de UV VIS é bem sensível mas é seletivo .

Necessidade de Experiência na sua Operação ; Um operador necessita de pelo menos seis meses de treinamentos .

Principais fases estacionárias em HPLC

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ALGUNS ADSORVESTES SÓLIDOS DISPINÍVEIS COMERCIALMENTE

Adsorvente Forma Diâmetro m

Marca Comercial Fabricante

Sílica Gel M 4 Microsil Sílica Gel Micromeritic InstrumentsM 5 Porasil 5 Whatman Inc.M 10 Porasil 10 Whatman Inc.M 20 Porasil 20 Whatman Inc.P 40 HS Pellosil Whatman Inc.P 40 HC Pellosil Whatman Inc.M 5,10,30 LiChrosorb S1-60 E. MerckM 5,10,15,20 Polygosil 60 MacHerey - NagelM 40 Chromosorb LC-1 Johns - ManvileM 5,10,20 LiChrosfere S1-100 E. MerckM 10 Vydac 101 IR Separations GroupM 5,10 Spherisorb S-W Phase Separations LimitedM 10 Porasil Waters Associates

Alumina M 5,10,30 LiChrosorb Alox-T E. MerckM 40 Chromosorb LC-3 Johns - ManvileP 40 HS Pellumina Whatman Inc.

Poliamida P 40 Pellamidon Whatman Inc.M = micro partículas porosas , P = Pelicular

Idealmente o material sólido deve exibir :

Em menor tempo possível de separação Apresentar máxima capacidade de amostra Apresentar a melhor resolução na separação da mistura Apresentar fácil capacidade de empacotamento Apresentar pequena que de pressão e de baixo custo

Na Prática temos

Os empacotamentos com Sílica são os mais utilizados atualmente resistem a altas pressões, produzem um enchimento estável e colunas eficientes de partículas pequenas e ainda é possível ligar-se vários grupos funcionais a superfície da sílica .

Conforme se diminui o tamanho das partículas a profundidade dos poros também diminui e a saída da amostra dos poros de forma mais rápida , obtendo-se assim análises mais rápidas sem perda de eficiência , assim em HPLC matérias com partículas de até 10 m são preferidos .

Fase estacionária para HPLC com Fase LigadaALGUNS LÍQUIDOS DISPINÍVEIS COMERCIALMENTE

Grupos Tipo de Diâmetro Marca Comercial Fabricante

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fase mAmina Normal 10 MicroSil NH2 Waters Associates

10 LiChrosorb NH2 E. Merck

5,10 Polygosil 60-D NH2 MacHerey - Nagel

5,10 Nucleosil NH2 MacHerey - Nagel

10 Bondapack NH2 Waters Associates

10 Spherisorb S5 NH Phase Separations Limited

Nitrila Normal 10 Microsil CN Micromeritic Instruments

5,10 Polygosil 60-D-CN MacHerey - Nagel

10 Vydac 501 TP Separations Group

5 Spherisorb S5 CN Phase Separations Limited

5,10 Nucleosil CN MacHerey - Nagel

10 Chromosorb LC-8 Johns - Manville

10 Bondapack CN Waters Associates

Amina & Nitrila Normal 10 Partisil 10 PAC Whatman Inc.

40 Co:Pell PAC Whatman Inc.

Octyl ( C8H17 ) Reversa 4 Microsil C8 Waters Associates

5,10 LiChrosorb RP-8 E. Merck

5,10 Polygosil 60-D C8 MacHerey - Nagel

5,10 Nucleosil C8 MacHerey - Nagel

10 Vydac 2081 R Separations Group

Octadecyl ( C18H37 ) Reversa 4 Microsil C18 Micromeritic Instruments

5,10 Polygosil 60-D C18 MacHerey - Nagel

5,10 LiChrosorb RP-18 E. Merck

5,10 Nucleosil C18 MacHerey - Nagel

10 Bondapack C18 Waters Associates

10 Vydac 201 IR Separations Group

5 Partisil 5 ODS Whatman Inc.

10 Partisil 10 ODS Whatman Inc.

40 Co:Pell ODS Whatman Inc.

A superfície da Sílica é o suporte mais utilizado e pode ser modificado por alguns tratamentos químicos :

Formação da ligação siloxano ( Si-O-SiR ) com o grupo silanol e um organoclorossilano

Si-OH + ROH Si-O-SiR3 + HCl

Ligação Silício – Carbono por tratamento com Tioníla e um Organo metálico

Si-OH + SOCl2 Si-Cl + HCl + SO2

Si-Cl + RLi Si–R + LiCl

Fase estacionária para HPLC de Troca Iônica ALGUNS FASES COMERCIALMENTE

Tipo Diâmetro m Marca Comercial Fabricante

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Troca Aniônica 10 Partisil 10 SAX Whatman Inc.

10 LiChrosorb NA E. Merck

10 Ionex – SB 10 MacHerey - Nagel

10 Vydac 301 TP Separations Group

5,10 Nucleosil SB MacHerey - Nagel

Troca Cationica 10 Partisil 10 SCX Whatman Inc.

10 LiChrosorb KAT E. Merck

10 Ionex – SA 10 MacHerey - Nagel

10 Vydac 401 TP Separations Group

5,10 Nucleosil SA MacHerey - Nagel

O empacotamento utilizado em Troca Iônica , possui grupos de cátions ou ânions quimicamente ligados a :

Partículas Porosas de Resinas Poliméricas Sílica com Camada Pelicular Micro Partículas porosas de Sílica e Micro Particular porosas Resinas Poliméricas

O material geralmente utilizado para a troca iônoca é o copolimero poliestireno-divinil benzeno que contém grupos ativos trocadores de ions ;

-SO-3 ( Trocadores forte de Cátions )

-CO-2 ( Trocadores fracos de Cátions )

-NR+3 ( Trocadores forte de Ânions )

-NH2R+ ( Trocadores fracos de Ânions )

As fases Catiônicas são adquiridas comercialmente na forma de sais de Sódio ( Na+ )

As fases Aniônicas são adquiridas comercialmente na forma de sais de Sódio ( Cl - )

Nota : Os processos de troca iônica dependem muito da temperatura , assim recomenda-se um controle desta condição durante a analise .

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