Nutrição 2017-18 - GC e GC-MS

20/11/2017

1

Cromatografia GasosaGC/MS

Processos de Derivatização

j. oliveira fernandes – FFUP/REQUIMTE

Cromatografia Gasosaj. oliveira fernandes

CROMATOGRAFIA

Conjunto de técnicas afins de separação que consistem na separação dos componentes de uma mistura de substâncias por

distribuição/repartição de cada composto entre duas fases:

Fase estacionária

Constituída por uma substância sólida ou líquida aderente a um meio

de suporte sólido poroso, com grande superfície específica

Fase móvel

Constituída por um fluido (líquido ou gasoso), imiscível com a fase

estacionária e que se move ao longo desta

2

20/11/2017

2


A separação das diversas substâncias tem como base um fenómeno

de migração diferencial, resultante da diferente afinidade de cada

composto para com as duas fases

Fase móvel

Fase estacionária

Soluto BSoluto A

3

CROMATOGRAFIA - SEPARAÇÃO

Cromatografia Gasosa j. oliveira fernandes

CROMATOGRAFIA - SEPARAÇÃO

4

20/11/2017

3


TIPOS DE CROMATOGRAFIA(de acordo com o mecanismo de separação)

Tipo de

cromatografia Fase móvel Fase estacionária Processo de distribuição

Adsorção

L

GS Adsorção

Partilha

L

GL Partilha

Troca iónica L S Reacção química reversível

Exclusão L S Crivagem molecular

5


CROMATOGRAFIA GASOSA

Tipo de cromatografia no qual a fase móvel é um gás, inerte ou não reactivo, e a

fase estacionária corresponde a uma camada microscópica de um líquido ou de

um polímero agarrado a um suporte sólido, no interior de um tubo de vidro ou

metálico, designado por coluna.

As substâncias atravessam a coluna no estado gasoso, sendo o papel do gás

que constitui a fase móvel o de promover o arrastamento das mesmas.

A migração diferencial dos diferentes analitos é conseguida à custa das

diferentes tensões de vapor e da diferente interacção com a fase estacionária,

sendo a interacção entre os compostos e a fase móvel considerada

desprezável

6

20/11/2017

4


TIPOS DE CROMATOGRAFIA(de acordo com o tipo de fase móvel)

7


8

Sempre que os compostos a analisar sejam gases à PTN ou sempre que seja

possível vaporizá-los por aumento de temperatura (até ± 400ºC) sem que se

degradem quimicamente

Alternativa:

Derivatização das substâncias a analisar

Quando é que se pode recorrer à cromatografia gasosa?

20/11/2017

5


9


10

Gas Usage Comments

Helium General carrier or make-up gas Excellent but expensiveCannot be used with ECD except with another make-up gas

Nitrogen General make-up gas or packed column carrier gas

CheapNot good for capillary carrier gas as gives long run times

Hydrogen Carrier gas for capillary columnsCombustion gas for FID, NPD and FPD

CheapHighly explosive - needs oven trip sensor and careful ventingBest carrier gas for capillary GC

Air Combustion gas for FID, NPD and FPD

Cheap and readily available

CROMATOGRAFIA GASOSA - GASES

20/11/2017

6


11

Filtros de gases

Oxigénio

Humidade

Hidrocarbonetos

CROMATOGRAFIA GASOSA - GASES


12

CROMATOGRAFIA GASOSA - INJECTOR

� Colocação rápida da amostra na fase móvel sem arrastamento (tailing) ou

dispersão

� Temperatura de injecção correcta e suficientemente alta para vaporizar

instantaneamente todos os compostos presentes na amostra sem que ocorra

decomposição ou condensação

� Estrutura que permita uma boa precisão (melhor que 1%)

� Ausência de contaminações

� Ausência de perda de amostra por adsorção ou fuga

20/11/2017

7


13

ESQUEMA BÁSICO DE UM INJECTOR

� Directos (colunas de enchimento)

� On-column

� Split-splitless

� PTV


14

MODOS DE INJECÇÃO

20/11/2017

8


15

INJECTOR SPLIT-SPLITLESS


16

INJECTOR SPLIT-SPLITLESS

20/11/2017

9


17

INJECÇÃO EM SPLIT-SPLITLESS

http://www.chromacademy.com/chromatography-Split-splitless-video.html


18

Deve assegurar uma temperatura uniforme em toda a

zona ocupada pela coluna, uma vez que a velocidade,

a eficácia e a reprodutibilidade da separação são

extremamente dependentes da temperatura

A temperatura do forno e, consequentemente, da

coluna pode manter-se constante ao longo do

processo cromatográfico – operação isotérmica – ou

subir gradualmente (linearmente ou por patamares) –

operação com gradiente de temperatura

CROMATOGRAFIA GASOSA - FORNO

20/11/2017

10


19

CROMATOGRAFIA GASOSA - COLUNAS


20


20/11/2017

11


21

PROPRIEDADES E CARACTERÍSTICAS DAS COLUNAS


22


20/11/2017

12


23



24


20/11/2017

13


25



26


20/11/2017

14


27


http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/pdf/GCcolumns.pdf

https://www.youtube.com/watch?v=q0pM-k0SvOQ


28

CROMATOGRAFIA GASOSA - DETECTORES

20/11/2017

15


29

CROMATOGRAFIA GASOSA - DETECTORES


30

DETECTOR FID

20/11/2017

16


31

DETECTOR FID


32

DETECTOR FID

20/11/2017

17


33

DETECTOR FID


34

DETECTOR ECD

20/11/2017

18

Espectrometria de Massaj. oliveira fernandes

35

Espectrometria de Massa

CROMATOGRAFIA GASOSA / ESPECTROMETRIA DE MASSA

Técnica analítica de identificação, quantificação e caracterização

molecular e estrutural de compostos, com base na sua composição

elementar


36

Princípio Geral da Espectrometria de Massa

Partículas carregadas, movendo-se num campo electromagnético, podem ser

separadas de acordo com a sua massa, mais rigorosamente, coma a sua relação

massa/carga (m/z)

Quando se trata de compostos orgânicos, o processo requer uma etapa inicial,

na qual as moléculas previamente vaporizadas são ionizadas e fragmentadas.

Após a sua separação, conseguida pela passagem num campo

electromagnético, é feito um registo dos iões formados, relacionando as suas

abundâncias relativas com os respectivos valores m/z, designado por

ESPECTRO DE MASSA

ESPECTROMETRIA DE MASSA

20/11/2017

19


37

1. Vaporização

2. Bombardeamento electrónico

3. Ionização

4. Fragmentação


38

Vaporização


Quando usado isoladamente (não acoplado a um cromatógrafo) o

espectrómetro de massa incorpora um sistema de introdução da amostra,

cujo objectivo primário é a sua vaporização e posterior transferência para

a câmara de ionização

Num sistema de GC/MS o cromatógrafo actua como sistema de

introdução da amostra, permitindo a chegada de cada substância à

câmara de ionização como um componente puro, separado de todos os

outros componentes da mistura a analisar

20/11/2017

20


39

Ionização (impacto electrónico)


As moléculas vaporizadas são ionizadas por

bombardeamento por um feixe de electrões emitidos

por um filamento metálico incandescente e acelerados

por uma diferença de potencial de 10-100 V criada pela

acção de uma placa situada no lado oposto


40

Ionização (impacto electrónico)


Como resultado da interacção com o feixe de electrões,

as diferentes moléculas absorvem energia, havendo

uma pequena % que fica de tal forma excitada que se

ioniza, dando origem a um ião positivo com a mesma

massa da molécula que lhe deu origem.

ABC + e- ABC+ + 2 e-.

Ião molecular

20/11/2017

21


41

Fragmentação


A estabilidade dos iões moleculares depende da sua estrutura e da

disponibilidade energética. Na presença de energia em excesso, o ião-

molecular pode fragmentar-se dando origem a outros iões (em regra com

carga positiva mas que também podem apresentar carga negativa),

radicais e moléculas neutras


42

Fragmentação


ABC A+ + BC

AB. + C+

AB+ + C

A + BC+

A+ + B + C

A2+ + BC-

AC+ + B

AC. + B+…

.

.

20/11/2017

22


43

Fragmentação


A estrutura da molécula tem um papel preponderante no tipo de

fragmentos produzidos e na sua abundância relativa.

As moléculas (iões-moleculares) fragmentam-se preferencialmente pelos

pontos susceptíveis de originar iões com a maior estabilidade possível

Anéis aromáticosPossibilidade de a carga se repartir por vários átomos

Pouca fragmentação

Hidrocarbonetos linearesIntensa fragmentação

Ião molecular pouco intenso ou inexistente no final do processo


44

Fragmentação do Pentano


20/11/2017

23


45

Fragmentação do Pentano



46

Fragmentação do Tolueno

20/11/2017

24


47

Fragmentação da Benzamida


48

Fragmentação do álcool benzílico

20/11/2017

25


49

Separação dos iões formados


Separador de sector magnético


50

Separação dos iões formados


Separador do tipo quadropolo

20/11/2017

26

GC-MSj. oliveira fernandes

51

Cromatografia gasosa

Excelente método de separação dos componentes de uma mistura

Escassa informação relativa à identidade dos compostos separados

Complementaridade das 2 técnicas

Espectrometria de massa

Informação detalhada acerca da estrutura de substâncias orgânicas

isoladas, podendo mesmo possibilitar a sua identificação

Incapacidade para análise de substâncias presentes em misturas



52

� A quantidade de amostra necessária para a análise é da mesma

ordem de grandeza

� Requerem a presença da amostra em fase gasosa

Compatibilidade das 2 técnicas


20/11/2017

27


53


A cromatografia gasosa requer um gás de arraste que flua através da

coluna cromatográfica a uma pressão igual ou maior do que 1

atmosfera, durante o desenvolvimento de todo o processo

cromatográfico

A espectrometria de massa requer uma pressão inferior a 10-5 Torr

(alto vácuo)

Incompatibilidade das 2 técnicas


54


Bomba Turbomolecular

Coluna Capilar

20/11/2017

28


55


Operação em modo de varrimento total (Full-Scan)

Operação em modo de monitorização selectiva de iões (SIM)

Universalidade versus Especificidade


56


Detecção dos iões correspondentes à totalidade do espectro de massa

Limites: entre m/z 10 e m/z 800

Velocidade de varrimento: 1 a 2 ciclos por segundo

Registo obtido: cromatograma iónico total (corresponde ao somatório,

em cada fracção de tempo, das abundâncias de cada um

dos iões sujeitos a detecção)

Sensibilidade: 10-10 a 10-9 g (0,1- 1ng), para volumes injectados de

1µl, correspondente a concentrações de 0,1 – 1mg/l

Operação em modo de varrimento total (full-scan)

20/11/2017

29


57



58


20/11/2017

30


59

Detecção de apenas um ou de um pequeno número de iões de diferente relação

massa/carga (m/z), correspondentes a fragmentos intensos e característicos do(s)

compostos (s) de interesse.

O espectrómetro de massa não faz o varrimento contínuo de todos os fragmentos iónicos

situados entre determinados limites de m/z, mas antes “salta” de determinados valores

de m/z para outros, previamente escolhidos.

Registo obtido: corresponde ao somatório em cada fracção de tempo, das

abundâncias de cada um dos iões sujeitos a detecção.

Sensibilidade: 10-13 a 10-12 g (0,1- 1pg), para volumes injectados de 1 µl,

correspondente a concentrações de 0,1 – 1 µg/l


Operação em modo de monitorização selectiva de iões (SIM)


60


3.50 3.60 3.70 3.80 3.90 4.00 4.10 4.20 4.30 4.40 4.50 4.60 4.70 4.80 4.90 0

300000

600000

900000

1200000

Tempo (min)

Abundancia

Ion 90.00 (89.70 to 90.70): B85-1.D

[2H8]Etilamina (PI - 1 mg/L)

Etilamina (1,835 mg/L)

Ion 95.00 (94.70 to 95.70): B85-1.D

Separação por tempo + Separação por massa

20/11/2017

31


61



8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 9.00 9.10 9.20 9.30 9.40

0

50000

100000

150000

200000

Tempo (min)

Abundância Ion 98.00 (97.70 to 98.70): B85-1.D

Isoamilamina (0,378 mg/L)

[2H8]Pirrolidina (PI - 1 mg/L) Pirrolidina (0,894 mg/L)

Ion 106.00 (105.70 to 106.70): B85-1.D Ion 132.00 (131.70 to 132.70): B85-1.D


62



8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 9.00 9.10 9.20 9.30 9.40 0

50000

100000

150000

Tempo (min)


8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 9.00 9.10 9.20 9.30 9.40 050000

100000150000

Tempo (min)

Abundância

Ion 106.00 (105.70 to 106.70): B85-1.D

8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 9.00 9.10 9.20 9.30 9.40 0 10000

20000

30000

Tempo (min)


8.00 8.10 8.20 8.30 8.40 8.50 8.60 8.70 8.80 8.90 9.00 9.10 9.20 9.30 9.40 0

1000

2000

3000

4000

Tempo (min)

Abundância

Ion 187.00 (186.70 to 187.70): B85-1.D

Pirrolidina (0,894 mg/L)

[2H8]Pirrolidina (PI–1 mg/L)

Isoamilamina (0,378 mg/L)

2-Metilbutilamina (0,018 mg/L)

20/11/2017

32


63

Consiste em submeter o analito (saído da coluna cromatográfica) a uma primeira

etapa de ionização/fragmentação/separação e, posteriormente, seleccionar um

dos fragmentos obtidos (tendo em conta a sua intensidade e especificidade) e

submetê-lo a uma 2ª etapa de ionização/fragmentação/separação. No final

utiliza-se o registo cromatográfico de um dos fragmentos obtidos nesta 2ª etapa

para fazer a quantificação do composto.

As vantagens do processo residem na grande diminuição dos possíveis

interferentes resultante do aumento da especificidade do fragmento usado para

a quantificação. Desta forma é possível aumentar a probabilidade de

identificação inequívoca do composto e, simultaneamente, aumentar

ligeiramente a sensibilidade , dada a acentuada diminuição do sinal

correspondente à linha de base.

GC/MS-MS


64

GC/MS-MS

Na prática, os aparelhos de GC/MS-MS do tipo quadrupolo, correspondem aos

habitualmente designados triplos quadrupolos. No 1º tem lugar a separação dos

fragmentos formados após a 1ª etapa de ionização. No 2º (na realidade um

hexapolo) tem lugar a “focagem” do fragmento seleccionado, a que se segue

uma 2ª etapa de ionização efectuada com recurso ao “bombardeamento” do

fragmento seleccionado com um gás, geralmente árgon (daí o nome de célula de

colisão geralmente usado). No 3º tem lugar a separação dos fragmentos

formados na sequência do 2º processo de ionização.

20/11/2017

33


65

GC/MS-MS


66

CROMATOGRAFIA GASOSA - RESUMO

Técnica cromatográfica usada em Química Analítica para

separar e analisar (qualitativa e quantitativamente)

compostos que possam ser vaporizados sem

decomposição

20/11/2017

34


67


Grande poder de separação

Rapidez da análise

Pequenas quantidades de amostra

Bons sistemas de detecção

Análise quantitativa

Identificação de compostos desconhecidos (GC/MS)

VANTAGENS


68


Compostos voláteis

Compostos que podem ser convertidos em compostos voláteis de uma forma rápida e reprodutível

Compostos passíveis de serem analisados por GC

Regra geral, a quase totalidade dos compostos orgânicos com MM até 1000 podem ser analisados por GC.

Não podem ser analisados por GC

Compostos ionizadosPolímeros

20/11/2017

35


69


Os extractos sujeitos a análise devem ser o mais “limpos” possíveis

de forma a garantir a reprodutibilidade analítica

(“ausência” de água, “ausência” de gordura, “ausência” de

proteínas, “ausência” de açúcares livres)

Por esse motivo, muitas amostras requerem processos de

preparação muito demorados

DESVANTAGENS


70

Em GC não é possível a injecção directa das amostras, mesmo quando

elas são líquidas como é o caso dos vinhos, devido à degradação da

performance cromatográfica provocada pela presença de:

Água

Compostos não voláteis

(açúcares, ácidos e bases não voláteis, material de origem proteica,

aminoácidos, polifenóis, etc.)

Isolamento/Enriquecimento dos

compostos de interesse

Extracção

Transformação dos compostos fixos

(não voláteis) em compostos voláteisDerivatização

20/11/2017

36


71

Os compostos a analisar devem:

� Apresentar volatilidade suficiente, de forma a permitir asua deslocação ao longo da coluna cromatográfica

� Possuir estabilidade térmica

� Apresentar um bom comportamento cromatográfico

CROMATOGRAFIA GASOSA - EXIGÊNCIAS


72

RAZÕES DA REDUZIDA VOLATILIDADE DE ALGUNS COMPOSTOS

Moléculas muito grandes apresentam reduzida

volatilidade devido às grandes forças de dispersão intra-

moleculares, responsáveis por manter a molécula intacta

Moléculas pequenas podem apresentar reduzida

volatilidade devido às intensas forças de atracção inter-

moleculares entre grupos polares

20/11/2017

37


73

RAZÕES DO MAU COMPORTAMENTO CROMATOGRÁFICO DE ALGUNS COMPOSTOS

Os compostos polares, mesmo quando dotados de suficiente

volatilidade para serem analisados directamente, apresentam

geralmente mau comportamento cromatográfico pois têm

tendência para serem adsorvidos em pontos localizados do

sistema cromatográfico (injector e coluna)

Peak Tailing


74

PEAK TAILING

20/11/2017

38


75

PEAK TAILING


76

20/11/2017

39


77

DERIVATIZAÇÃO ANALÍTICA

Processos de modificação química de compostos, usados para a

produção de derivados suficientemente voláteis e dotados de

propriedades adequadas para a sua análise cromatográfica

A + D A-D

D = Reagente de derivatização A = Analito de interesse

A-D = Composto com boas propriedades cromatográficas

Se a transformação de A em A-D for quantitativa e reprodutível, a análise (detecção e quantificação) de A pode ser feita indirectamente pela análise de A-D


78

PROCESSOS DE DERIVATIZAÇÃO - OBJECTIVOS

1. Permitir a análise de compostos cujas propriedades não permitem a sua análise directa

� Conferir volatilidade a compostos não voláteis

� Conferir estabilidade a compostos termicamente lábeis

2. Melhorar o comportamento cromatográfico de alguns compostos

� Obtenção de picos cromatográficos de melhor qualidade (menos tailing)

� Eliminação de picos duplos provenientes do mesmo composto

� Separação de compostos com comportamento cromatográfico muito semelhante (isómeros)

3. Aumentar a sensibilidade e/ou especificidade de alguns compostos em relação a determinado tipo de detectores

20/11/2017

40


79

REACÇÕES DE DERIVATIZAÇÃO MAIS USADAS EM GC

� Sililação

� Alquilação

� Esterificação

� Acilação

� Formação de derivados cíclicos

� Condensação de aminas primárias c/ compostos carbonílicos – formação de Bases de Schiff


80

REACÇÕES DE SILILAÇÃO

R-H + (CH3)3-Si-X R-Si-(CH3)3 + HX

Consistem na substituição de um hidrogénio reactivo presente num grupo polar por um grupo alquilsilil, como trimetilsilil (TMS) ou

t-butildimetilsilil (t-BDMS)

R-H + (CH3)3-C-Si-X R-Si-C-(CH3)3 + HX

CH3

CH3CH3

CH3

20/11/2017

41


81

� Constituem um dos mais populares métodos de derivatização decompostos previamente à sua análise por GC

� Praticamente todos os grupos funcionais que podem interferir coma análise por GC devido à sua ausência de volatilidade sãopassíveis de ser sililados

� A reactividade dos diferentes grupos funcionais para com um dadoreagente sililante segue geralmente a seguinte ordem:

álcool > fenol > ác. carboxílico > amina > amida

� Para cada grupo funcional, em particular alcoóis e aminas, edevido a impedimento estérico, a ordem de reactividade é:

primário > secundário > terciário

REACÇÕES DE SILILAÇÃO


82

REAGENTES DE SILILAÇÃO

Trimetilclorosilano

Hexametildissilazano

N,O-Bis-TMS-acetamida

N,O-Bis-TMS-trifluoroacetamida

N-Metil-N-TMS-trifluoroacetamida

TMCS

HDMS

BSA

BSTFA

MSTFA

(CH3)3-Si-Cl

(CH3)3-Si-NH-Si-(CH3)3

CH3-CN-Si-(CH3)3

O-Si-(CH3)3

CF3-CN-Si-(CH3)3

O-Si-(CH3)3

Si-(CH3)3

CF3-CO-NCH3

20/11/2017

42

Cromatografia Gasosa j. oliveira fernandes

83

� Os reagentes sililantes são facilmente hidrolisados pela água, o que exige

� grandes cuidados na sua conservação

� que as reacções tenham lugar na ausência total de água

� Os derivados formados são também muito sensíveis à presença de água

� Normalmente, é necessária a presença de solventes com grandecapacidade de solvatação (piridina, acetonitrilo, etc.)

� Colunas cromatográficas contendo fases estacionárias com hidrogéniosactivos (p. ex. Carbowax) são incompatíveis com derivados sililados

� Quando se usa o detector FID, pode haver um decréscimo gradual dasensibilidade devido à deposição de um aerossol de dióxido de silicone

REACÇÕES DE SILILAÇÃO - CARACTERÍSTICAS


84

REACÇÕES DE ALQUILAÇÃO

Consistem na substituição por um grupo alquilo do hidrogénio reactivo presente em grupos polares

Ácidos R - COOH Ésteres R - COOR′

Alcoóis R - OH Éteres R - OR′

Fenóis Ar - OH Éteres aromáticos Ar - OR′

Aminas R - NH2 N-alquilaminas R – NH R′

Amidas R -CONH2 N-alquilamidas R - CONHR′

Tióis R -SH Tioéteres R -SR′

R - O(N,S)-H R' - X R - O(N,S) - R' + HX

20/11/2017

43


85

REACÇÕES DE ALQUILAÇÃO

� São usadas principalmente para a derivatização de compostos com hidrogéniosacídicos: ácidos e fenóis

� À medida que diminui o carácter ácido dos hidrogénios activos, maior tem deser a força do reagente alquilante e mais drásticas as condições a usar, o quelimita a selectividade e a aplicabilidade do método

� Existem muitos processos de derivatização bietápicos (para aminoácidos, p.ex.) , em que se faz uma esterificação prévia dos grupos carboxílicos seguida deuma derivatização dos outros grupos funcionais com outro tipo de reagentes

� Os derivados alquílicos, em especial os ésteres, são geralmente muito estáveis

� Algumas reacções podem ter lugar em meio aquoso


86

ESTERIFICAÇÃO DE ÁCIDOS – PROCESSOS MAIS COMUNS

� Aquecimento (30 min a 70ºC) com um álcool (metanol, etanol ou butanol) napresença de HCl 3M

� Aquecimento até ebulição e sob refluxo, durante poucos minutos, com umasolução a 14% de BF3 em metanol (ou butanol). No final, os ésteres devem serextraídos com um solvente apolar (n-heptano, p. ex.)

� Reacção com diazometano – CH2N2

� Reacção com dialquilacetais (dimetilformamida-dimetilacetal, p. ex.)

� Reacção com Hidróxido de tetrabutilamónio

N-CH

O-CH3

O-CH3CH3

CH3

20/11/2017

44


87

ALQUILAÇÃO DE HISTAMINA COM BROMETO DE PENTAFLUOROBENZILO

A reacção tem lugar à temperatura de 40°C durante 60 min, num meio reaccional constituído por acetonitrilo, isopropanol e uma pequena

quantidade de diisopropiletilamina

++

HN N

CH2CH2NH2

HN N

CH2CH2NH2

HN N

CH2CH2NH2

HN N

CH2CH2NH2

N N

CH2CH2N

N N

CH2CH2N

+ 3 HBr

3 C6F5CH2Br

C6F5CH2 CH2

C6F5

C6F5

CH2


88

REACÇÕES DE ACILAÇÃO

Envolvem a introdução de um grupo acilo numa molécula com um átomo de hidrogénio reactivo

R-O(N,S)-H + R'-C-X

O

R-O(N,S)- C-R'

O

+ HX

Mais raramente, podem envolver a adição de um grupo acilo a uma dupla ligação

C C R'-C-X

O

+ X-C-C- C-R'

O

20/11/2017

45


89

REACÇÕES DE ACILAÇÃO

� A acilação de álcoois, fenóis, aminas e tióis melhora consideravelmente o comportamento cromatográfico de compostos com as referidas funções

� Confere estabilidade a grupos muito susceptíveis a oxidação (p. ex. grupos fenólicos das catecolaminas)

� Possibilita a análise de moléculas com muitas funções polares como os açúcares e os aminoácidos

� Permite a separação de compostos difíceis de separar na forma não derivatizada

� É uma das vias mais usadas para a introdução nas moléculas de átomos de halogéneos, o que permite grandes ganhos de sensibilidade quando se usa o detector ECD (e com utilidade também quando a análise é feita por sistemas de GC-MS)


90

REACÇÕES DE ACILAÇÃO – TIPOS DE REAGENTES

R-C-Cl

O

R-C

R-C

O

O

O

Haletos de Acilo

R-C-

O

NN

Anidridos ácidos Acilimidazóis

20/11/2017

46


91

REACÇÕES DE ACILAÇÃO� As reacções de acilação exigem muitas vezes aquecimento, com uma duração

que pode variar, em regra, entre os 15 e os 60 minutos

� Os haletos de acilo são muito reactivos, sendo os escolhidos no caso de moléculas difíceis de acilar por impedimentos de ordem estérica

� Exigem a presença de uma base no meio reaccional para neutralizar o ácido formado

� Os anidridos não apresentam tantos problemas pois dão origem a um ácido carboxílico resultante do próprio anidrido

� Em qualquer dos casos, o excesso de derivatizante deve ser removido, o que implica um processo extractivo no final da derivatização

� O acetilimidazol e outros reagentes acilantes com grupos dadores de natureza básica são os escolhidos quando se trata de moléculas que se degradam em meio ácido


92

-C

O

O

OF3C -C

F3C

O

O

OF3C-F2C-C

F3C-F2C-C

O

O

OF3C-F2C-F2C-C

F3C-F2C-F2C-C

Anidrido Trifluoroacético

Anidrido Pentafluoropropiónico

Anidrido Heptafluorobutírico

REACÇÕES DE ACILAÇÃO – ANIDRIDOS FLUORADOS

20/11/2017

47


93

REACÇÕES DE ACILAÇÃO – ANIDRIDOS FLUORADOS

DerivadoNº de grupos derivatizado

Incremento de massa

Trifluoroacetil1

2

3

4

5

96

192

288

384

480

Pentafluorpropionil1

2

3

4

5

146

292

438

584

730

Heptafluorobutiril1

2

3

4

5

196

392

588

784

980

� As reacções de derivatização são levadas a cabo em escala muito pequena.O equipamento a usar tem, por isso, de ser adaptado a escala “micro”

� Geralmente, o material a analisar está presente em quantidades vestigiais.Por isso, todos os cuidados devem ser tomados para evitar contaminaçõesou perdas de amostra

� Os reagentes usados são, quase sem excepção, extremamente reactivos,dada a necessidade das reacções serem rápidas e quantitativas. Esse factoimplica cuidados especiais

� na conservação dos reagentes

� no seu manuseamento

DERIVATIZAÇÃO ANALÍTICACONSIDERAÇÕES DE NATUREZA PRÁTICA

94Cromatografia Gasosaj. oliveira fernandes

20/11/2017

48

DERIVATIZAÇÃO ANALÍTICACONSIDERAÇÕES DE NATUREZA PRÁTICA

� Antes de qualquer análise dos compostos de interesse, é essencial aexecução de ensaios em branco, de forma a conhecer-se os picosresultantes apenas dos reagentes usados

� Mesmo no caso de reacções quantitativas e com aceitável grau dereprodutibilidade, o uso de padrões internos adequados é essencial para aobtenção de bons resultados analíticos

� É aconselhável reservar uma coluna cromatográfica para cada tipo dereagentes derivatizantes usado. O excesso de reagente pode levar aprocessos de derivatização “on-column” de resíduos não-voláteis aíacumulados, com o consequente aparecimento de picos “fantasmas”,muitas vezes difíceis de eliminar

95Cromatografia Gasosaj. oliveira fernandes


96

HHCl

O

O C

CH

CH

CH CH NHNH--RR +

O

O C

CH3

CH3

CH CH2RR--NHNH +

CH

CH CH

CH

CO Cl

CH3

CH CH2

CH3

CO Cl

O

22

DERIVATIZAÇÃO DE AMINAS COM CLOROFORMATO DE ISOBUTILO

A reacção tem lugar à temperatura ambiente durante 10 min, num meio reaccional constituído pela amostra (1 mL), tolueno (1 mL) e

tamponado a pH 12 (1 mL de sol. tampão de fosfatos 0,5 M)

20/11/2017

49


97

DERIVATIZAÇÃO DE AMINAS COM CLOROFORMATO DE ISOBUTILO

1. Centrifugação da amostra (ausência de processo extractivo)

2. Derivatização com cloroformato de isobutilo, por meio de um

processo bifásico (água/tolueno)

� Processo de derivatização (com extracção simultânea)

� Eliminação do excesso de reagente

3. Análise dos derivados obtidos por GC-MS em modo de monitorização

selectiva de iões


98

20/11/2017

50


99

Total ion chromatogram (TIC) corresponding to a Tawny Port wine sample containing (1) [2H3] methylamine (1.00 mg/L), (2) methylamine (1.835 mg/L), (3) diethylamine (0.094 mg/L), (4) [2H5] ethylamine (1.00 mg/L), (5) ethylamine (1.835 mg/L), (6) 2-methylbutilamine (0.018 mg/L), (7) [2H8] pyrrolidine (1.00 mg/L), (8) isoamylamine (0.378 mg/L), (9) pyrrolidine (0.894 mg/L), (10) heptylamine (1.00 mg/L), (11) 2-phenylethylamine (0.356 mg/L), (12) amphetamine (1.00 mg/L), (13) [2H8] putrescine (1.00 mg/L), (14) putrescine (0.773 mg/L), and (15) cadaverine (0.043 mg/L).

Published in: S. C. Cunha; M. A. Faria; J. O. Fernandes; J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 8742-8753.DOI: 10.1021/jf201379xCopyright © 2011 American Chemical Society

100

20/11/2017

51


101

Port wine Grape juice Table wine

Ethanol 200 ml – 120 ml

Glycerol 6 g – 6 g

Fructose 70 g 125 g 0.2 g

Glucose 40 g 125 g –

Tartaric acid 1.75 g 3 g 2 g

Malic acid 1 g 1.5 g 0.5 g

Lactic acid 0.25 g – 1 g

Citric acid 0.4 g 0.4 g 0.4 g

Acetic acid 0.5 g – 0.5 g

Succinic acid 0.5 g – 1 g

Phosphate 0.2 g 0.2 g 0.2 g

Tanic acid 1.8 g 1.8 g 1.8 g

Acetaldehyde 0.1 g – 0.1 g

Sodium chloride 0.1 g 0.1 g 0.1 g

pH adjusted to 3.5 adjusted to 3.8 adjusted to 3.4

Water Q.s. 1000 mla Q.s. 1000 ml Q.s. 1000 ml

Composition of the synthetic solutions used as matrices of thestandard (calibrating) solutions of amines


102

20/11/2017

52


103


104

20/11/2017

53


105

Nutrição 2017-18 - GC e GC-MS

Documents

Transcript of Nutrição 2017-18 - GC e GC-MS