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O bago da uva: uma fábrica bioquímica complexa
Responsáveis:
•Ana Cunha
•Hernâni Gerós
•Richard Gonçalves
•António Teixeira
Alunos:
•Ana Paulina
•Inês Coturela
•Rodrigo Silva
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• Preparar extractos celulares de bagos de uvas verdes e maduras e dosear teor de proteína
• Determinar a actividade enzimática da MDH
• Dosear açúcares e ácidos orgânicos por HPLC
• Realizar curvas de resposta da fotossíntese à luz por fluorometria de pulso de amplitude modelada (PAM)
• Observar cortes histológicos por microscopia de epifluorescência
• Explicar algumas modificações bioquímicas e fisiológicas que ocorrem durante o desenvolvimento do bago
Objectivos
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Determinação da [proteínas]
Medição de actividades enzimáticas
N2(l)
Determinação da concentração de açúcares e ácidos pelo HPLC
Preparação de extractos celulares
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Actividade da malato desidrogenase
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Tampão Tris-HCl, pH 8
NADH
Extracto celular
Oxaloacetato
Cuvete
Actividade da malato desidrogenase
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• Doseamento de [proteína]pelo método de Bradford
[proteína]bago verde = 3,2 mg/ml
l = 595 nm
Actividade da malato desidrogenase
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• Espectros de absorção do NADH e do NAD+
Actividade da malato desidrogenase
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vi
pH = 8,0[oxaloacetato] = 10 mM
Actividade da malato desidrogenase• Velocidade inicial da reacção
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• Gráfico de Michaelis-Menten
Actividade da malato desidrogenase
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Km = 118,2 mM oxaloacetatoVmax =21 µmole de NAD+/min/mg de proteína
Actividade da malato desidrogenase• Estimativa de parâmetros cinéticos por modelo matemático
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Série de padrões de concentrações conhecidas
bago verde
bago maduro
Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC
• Cromatogramas de padrões e extractos
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0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
verdes maduras
Teo
r (m
g/g
pes
o f
resc
o)
Malato
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
S G F S G F
Teo
r (m
g/g
pes
o f
resc
o)
verdes maduras
Açúcares
Doseamento de açúcares e ácidos por HPLC
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Bago verde Folhas (madura/ senescente)
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000
ETR
PAR
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000
ETR
PAR
Órgão a (eficiência PSII) ETRr máx. (capacidade PSII)
Bago verde grande 0,593 83,7
Bago verde pequeno 0,538 73,0
Folha madura 0,726 100,1
Folha senescente 0,618 61,4
Curvas de resposta da fotossíntese à luz
Fluorometria de Pulso Amplitude Modulado (PAM)
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Microscopia
Microscopia
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Microscopia
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1. Foram obtidos extractos celulares de uvas verdes e de uvas maduras
2. No bago verde a concentração de ácido málico é muito elevado, sendo
residual no bago maduro
3. No bago maduro a concentração de açúcares é muito elevada, sendo
mínima no bago verde
4. Os principais açúcares acumulados no bago maduro são os
monossacarídeos glucose e frutose
5. A actividade da malato desidrogenase é compatível com a acumulação
do malato medida no bago verde
6. Tal como as folhas, o bago verde é fotossinteticamente activo
7. Folhas mais velhas têm actividade fotossintética inferior à dos bagos
verdes
8. A microscopia de fluorescência revelou a presença de clorofila
essencialmente numa zona externa do bago assim como nos tecidos
que envolvem a semente
9. O bago da uva é uma fábrica bioquímica complexa dado que
produz/acumula/metaboliza uma ampla variedade de compostos
Conclusões
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Material e Equipamento
Bancada de Trabalho
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Centrifuga
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Pipetas automáticas
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Medidor de pHBalança de precisão
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Microscópio de fluorescência