O Papel de Mn na Toxicidade de Cd em Plantas Jovens de...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ - UESC

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL -

PPGPV

JOEDSON PINTO BARROSO

O Papel de Mn na Toxicidade de Cd em Plantas Jovens de Cacau:

Respostas Fisiológicas, Bioquímicas, Moleculares,

Micromorfológicas e Ultraestruturais

ILHÉUS - BA

2018

JOEDSON PINTO BARROSO

O Papel de Mn na Toxicidade de Cd em Plantas Jovens de Cacau:

Respostas Fisiológicas, Bioquímicas, Moleculares,

Micromorfológicas e Ultraestruturais

Tese apresentada à Universidade Estadual de

Santa Cruz, como parte das exigências para

obtenção do título de Doutor em Produção

Vegetal.

Linha de Pesquisa: Cultivos em Ambiente

Tropical Úmido

Orientador: Prof. Alex-Alan Furtado de

Almeida

ILHÉUS – BAHIA

2018

iv

DEDICATÓRIA

À minha família e porto seguro: Lucy e Edvaldo (pais), Júnior e Vinny (irmãos), Ana Luiza

(sobrinha) e à minha esposa, Viviane, por todo amor, compreensão, incentivo e colaboração,

dedico.

v

AGRADECIMENTOS

Ao Glorioso Deus, pelo dom da vida e por ser sempre meu guia.

À Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC e ao Programa de Pós-Graduação

em Produção Vegetal por ter me dado a oportunidade de realizar esse curso.

Ao professor Dr. Alex-Alan Furtado de Almeida pelo exemplo, incentivo, orientação

recebida, amizade, pelos conhecimentos transmitidos, por estar sempre disposto a ajudar e

pelo empenho em sempre me fazer uma pessoa e um profissional melhor.

Ao professor Dr. José Olímpio de Souza Júnior pela coorientação e pelos

conhecimentos transmitidos.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal pelos

ensinamentos.

À Coordenadoria do Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de estudos.

Aos técnicos: Lucas Ribeiro, Larissa Silveira, Edilane Amaral (CME/UESC) e Horlei

(CBG/UESC), pelo auxílio durante o desenvolvimento do trabalho e a Dona Jaci, por sempre

suportar meus abusos e ser a pessoa maravilhosa que é.

À minha parceira de trabalhos, Junea Leandro, pela ajuda na condução do

experimento e análises, pelas conversas, pelo compartilhamento mútuo na hora das

dificuldades e pela amizade.

Aos eternos irmãos Ivanildes, Romária, Gracielle e Téssio pela ajuda, atenção e por

compartilhar conhecimentos tão importantes em minha jornada.

Aos integrantes do grupo de Fisiologia Vegetal (Tainã, Julian, Márcia, Naiara,

Mayana, Nicolle, Bruna, Nathália, Isabela, D’ávila, Claudia e Jadiel) pela contribuição e

pelas experiências compartilhadas.

Aos amigos: Patrícia Reis, Artur, Giovana, Pedro Henrique e Gonçalo pela amizade,

confiança e momentos de descontração ao longo desses anos.

Aos amigos do Lamep pelos cafezinhos, troca de experiências e momentos de

descontração.

À minha família por sempre acreditar, confiar, apoiar, crer em meu potencial e estar

ao meu lado em todos os momentos e, principalmente, pelo carinho e amor incondicional que

sempre depositaram em mim.

vi

E à minha esposa amada, Viviane, pelo amor incondicional, paciência, amizade e

companheirismo em todos os momentos que precisei, transmitindo tranquilidade e serenidade

com suas palavras de conforto.

Enfim, a todos que me apoiaram e participaram para o desenvolvimento deste

trabalho.

Obrigado!!!

vii

SUMÁRIO

RESUMO.................................................................................................................................. ix

ABSTRACT............................................................................................................................. xi

1. INTRODUÇÃO................................................................................................................... 1

1.1. Objetivo Geral.................................................................................................................... 4

1.2. Objetivos Específicos......................................................................................................... 4

2. REFERENCIAL TEÓRICO.............................................................................................. 6

2.1. Metais Pesados................................................................................................................... 6

2.2. Mn no solo e nas plantas.................................................................................................... 7

2.3. Cd no solo e nas plantas..................................................................................................... 9

2.4. Interação entre Mn + Cd e seus efeitos nas plantas............................................................ 13

2.5. Theobroma cacao, Mn e Cd............................................................................................... 14

3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................ 17

3.1. Material vegetal e condições de cultivo............................................................................. 17

3.2. Parâmetros fotossintéticos.................................................................................................. 20

3.2.1. Trocas gasosas foliares.................................................................................................... 20

3.2.2. Pigmentos fotossintéticos................................................................................................ 20

3.3. Concentrações de Mn e Cd................................................................................................. 21

3.4. Teor de Prolina................................................................................................................... 21

3.5. Peroxidação lipídica........................................................................................................... 22

3.6. Metabolismo antioxidativo................................................................................................. 22

3.6.1. Obtenção do extrato enzimático bruto............................................................................. 22

3.6.2. Atividade da dismutase do superóxido (SOD, EC. 1.15.1.1).......................................... 23

3.6.3. Atividade da peroxidase do guaiacol (GPX, EC. 1.11.1.7)............................................. 23

3.6.4. Atividade da catalase (CAT, EC. 1.11.1.6)..................................................................... 24

3.7. Expressão gênica................................................................................................................ 24

3.8. Análise micromorfológica e ultraestrutural celular............................................................ 25

3.8.1. Anatomia e micromorfologia foliar................................................................................. 25

3.8.2. Ultraestrutura celular de folhas e raízes.......................................................................... 26

3.9. Análise estatística............................................................................................................... 27

4. RESULTADOS.................................................................................................................... 28

viii

4.1. Parâmetros fotossintéticos.................................................................................................. 28

4.1.1. Trocas gasosas foliares.................................................................................................... 28

4.1.2. Pigmentos fotossintéticos................................................................................................ 32


4.3. Teor de prolina................................................................................................................... 35

4.4. Peroxidação lipídica........................................................................................................... 36


4.5.1. Atividade da dismutase do superóxido............................................................................ 38

4.5.2. Atividade da catalase....................................................................................................... 39

4.5.3. Atividade da peroxidase do guaiacol............................................................................... 40


4.7. Análise micromorfológica e ultraestrutural........................................................................ 43

4.7.1. Anatomia e micromorfologia foliar................................................................................. 43

4.7.2. Ultraestrutura celular de folhas e raízes.......................................................................... 47

5. DISCUSSÃO........................................................................................................................ 51

5.1. Trocas gasosas foliares e pigmentos fotossintéticos.......................................................... 51




5.5. Micromorfologia e ultraestrutura celular ........................................................................... 57

6. CONCLUSÕES.................................................................................................................... 60

7. REFERÊNCIAS.................................................................................................................. 61

ix

RESUMO

O papel de Mn na Toxicidade de Cd em Plantas Jovens de Cacau: Respostas

Fisiológicas, Bioquímicas, Moleculares, Micromorfológicas e Ultraestruturais

O manganês (Mn) é o micronutriente mais demandado pelo cacaueiro e capaz de ser

acumulado em grandes quantidades sem causar danos ao metabolismo da planta. O cádmio

(Cd), por sua vez, é altamente tóxico para as plantas e, em algumas regiões produtoras de

cacau, há níveis elevados de Cd nas amêndoas associados aos níveis de Cd no solo. O Mn

compete com o Cd pelos mesmos transportadores de membrana e pode atenuar a

fitotoxicidade do metal pesado nas plantas de cacau. O objetivo deste estudo foi avaliar a ação

de Mn no efeito tóxico de Cd em plantas jovens de cacau, genótipo CCN 51, submetidas a

diferentes concentrações de Mn (0; 0,4; 0,8; 1,2 e 1,6 mmol kg-1

solo), Cd (0; 0,2; 0,4; 0,6 e

0,8 mmol kg-1

solo) e suas interações (Mn + Cd) aplicadas no solo, por meio de alterações

morfofisiológicas, bioquímicas, moleculares, ultraestruturais e nutricionais. A taxa

fotossintética (A), a condutância estomática (gs) e a transpiração foliar (E) foram

incrementadas com as aplicações de Mn de forma isolada e associadas com a menor

concentração de Cd no solo. Por outro lado, a introdução de Cd isolado no solo afetou

negativamente A. A interação entre Mn e Cd no solo proporcionou reduções no teor de

clorofilas a e b, principalmente associadas às maiores concentrações de Cd. A absorção de

Mn pelas raízes foi comprometida com a adição de Cd, isolada ou em maiores concentrações,

contudo, houve um grande acúmulo foliar de Mn. Por sua vez, a presença de Cd no solo

contribuiu para maior absorção e acumulo deste metal pesado, principalmente quando

associado às maiores concentrações de Mn. O teor de prolina foi incrementado na presença de

Cd, contudo, o maior teor foi observado no tratamento 1,6 mmol Mn kg-1

soil + 0,8 mmol Cd

kg-1

soil, com as maiores concentrações de Mn e Cd associadas. Os tratamentos com

diferentes concentrações de Mn associadas à menor concentração de Cd apresentaram os

menores danos à membrana. Por sua vez, os tratamentos com 0,6 mmol Cd kg-1

soil e 0,8

mmol Mn kg-1

soil + 0,8 mmol Cd kg-1

soil apresentaram as maiores concentrações de

substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), refletindo em maior peroxidação

lipídica das membranas. As concentrações de Mn associados com 0,6 e 0,8 mmol Cd kg-1

soil

influenciaram na atividade da dismutase do superóxido (SOD) reduzindo a atividade dessa

enzima às 3, 6, 12, 24, 48 e 96 h após aplicação dos tratamentos (AAT). Por sua vez, a

atividade da catalase (CAT) foi incrementada nas plantas submetidas ao tratamento com a

concentração de 0,8 mmol Cd kg-1

solo. Já a peroxidase do guaiacol (GPX) apresentou maior

atividade quando o Mn e o Cd foram aplicados associados no solo. O número de transcritos

referentes aos genes envolvidos na biossíntese de proteínas do fotossistema 2 (psbA e psbO),

no metabolismo antioxidativo (sodcyt e sodchl) e na biossíntese da metalotioneína (mt2b)

foram altamente expressos no tratamento com 0,4 mmol Mn kg-1

soil + 0,6 mmol Cd kg-1

soil,

48 h AAT. Por outro lado, às 96 h AAT, os tratamentos com 1,6 mmol Mn kg-1

soil e 0,8

mmol Cd kg-1

soil apresentaram incremento no númer de transcritos dos genes psbA e psbO,

respectivamente. O tratamento com 0,8 mmol Cd kg-1

soil também influenciou a anatomia

foliar aumentando a abertura do poro estomático levando ao aumento de gs e E. Por sua vez,

observou-se que, aparentemente, a ultraestrutura dos cloroplastos não foi alterada com a

submissão das plantas aos metais, isolados ou associados, após aplicação no solo. Entretanto,

na presença do Cd, foi verificado nas células de folhas e raízes, deposição de material

x

eletrodenso aderido à parede celular e nos vacúolos, indicando que houve transporte do Cd

para a parte aérea. Além disso, verificou-se a presença de amido e plastoglóbulos nos

cloroplastos de todos os tratamentos avaliados. Em suma, altas concentrações de Mn no solo

favoreceram a manutenção e o desempenho da maquinaria fotossintética de plantas jovens de

cacau. Porém, altas concentrações de Cd e Mn + Cd no solo promoveram danos à

fotossíntese, alterações no metabolismo oxidativo e favoreceram a absorção e o transporte e

acúmulo de Cd em raízes e folhas, respectivamente. Além disso, alta concentração de Cd nos

tecidos radiculares e foliares causou danos irreversíveis à ultraestrutura celular,

comprometendo o funcionamento das células e levando à morte celular programada. Contudo,

houve mitigação da toxicidade de Cd quando as plantas jovens de cacau foram cultivadas em

solos com baixa concentração de Cd e na presença de Mn. Danos causados nos tecidos

radiculares e foliares de plantas jovens de cacau, provocados pela absorção de Cd em solos

contaminados, podem ser atenuados ou mitigados pela adição de altas concentrações de Mn

no solo.

Palavras-chave: Theobroma cacao, Metais Pesados, Fotossintese; Nutrição Mineral,

xi

ABSTRACT

The Role of Mn in Cd Toxicity in Young Cocoa Plants: Physiological, Biochemical,

Molecular, Micromorphological and Ultrastructural Responses

Manganese (Mn) is the micronutrient most demanded by cacao and capable of being

accumulated in large quantities without causing damage to plant metabolism. Cadmium (Cd),

in turn, is highly toxic to plants and in some cocoa producing regions there are high levels of

Cd in the beans associated with soil Cd levels. Mn competes with Cd for the same membrane

carriers and can attenuate the phytotoxicity of heavy metal in cocoa plants. Objective of this

study was to evaluate the action of Mn on the toxic effect of Cd on young plants of cacao,

genotype CCN 51, submitted to different concentrations of Mn (0, 0.4, 0.8, 1.2 and 1.6 mmol

kg-1

soil), Cd (0, 0.2, 0.4, 0.6 and 0.8 mmol kg-1

soil) and their interactions (Mn + Cd) applied

to the soil by means of morphophysiological changes, biochemical, molecular, ultrastructural

and nutritional. Photosynthetic rate (A), stomatal conductance (gs) and leaf transpiration (E)

were increased with Mn applications in isolation and associated with the lowest concentration

of Cd in the soil. On the other hand, the introduction of Cd isolated in the soil affected

negatively A. Interaction between Mn and Cd in the soil provided reductions in the content of

chlorophyll a and b, mainly associated to the higher concentrations of Cd. Mn uptake by the

roots was compromised with the addition of Cd alone or in higher concentrations, however,

there was a large accumulation of leaf Mn. In turn, the presence of Cd in the soil contributed

to the higher absorption and accumulation of this heavy metal, especially when associated to

the higher concentrations of Mn. Proline content was increased in the presence of Cd,

however, the highest content was observed in the treatment 1.6 mmol Mn kg-1

soil + 0.8 mmol

Cd kg-1

soil, with the highest concentrations of Mn and Cd associated. Treatments with

different concentrations of Mn, associated to the lower concentration of Cd, presented the

smallest damages to the cellular membrane. Treatments with 0.6 mmol Cd kg-1

soil and 0.8

mmol Mn kg-1

soil + 0.8 mmol Cd kg-1

soil presented the highest concentrations of

thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), reflecting higher lipid peroxidation of

cellular membranes. Mn concentrations associated with 0.6 and 0.8 mmol Cd kg-1

soil

influenced the activity of superoxide dismutase (SOD), reducing the activity of this enzyme at

3, 6, 12, 24, 48 and 96 h after application of treatments (AAT). Catalase activity (CAT) was

increased in the plants submitted to treatment with the concentration of 0.8 mmol Cd kg-1

soil.

On the other hand, guaiacol peroxidase (GPX) presented higher activity when Mn and Cd

were applied in the soil. Number of transcripts related to the genes involved in photosystem 2

protein biosynthesis (psbA and psbO), antioxidative metabolism (sodcyt and sodchl) and

metallothionein biosynthesis (mt2b) were highly expressed in the treatment with 0.4 Mn + 0.6

Cd, 48 h AAT. On the other hand, at 96 h AAT, treatments with 1.6 mmol Mn kg-1

soil and

0.8 mmol Cd kg-1

soil presented an increase in the number of transcripts of the psbA and psbO

genes, respectively. Treatment with 0.8 mmol Cd kg-1

soil also influenced the leaf anatomy,

increasing the opening of the stomatal pore and leading to the increase of gs and E. In turn, it

was observed that, apparently, the ultrastructure of the chloroplasts was not altered with the

submission of the plants to the metals, isolated or associated, after application to soil.

However, in the presence of the Cd, it was verified, in the cells of leaves and roots, deposition

of electrodense material adhered to the cell wall and in the vacuoles, indicating that there was

transport of the Cd to the aerial part. In addition, the presence of starch and plastoglóbulos in

xii

the chloroplasts of all evaluated treatments was verified. In summary, high concentrations of

Mn in the soil favored the maintenance and performance of the photosynthetic machinery of

young cacao plants. However, high concentrations of Cd and Mn + Cd in the soil promoted

damage to photosynthesis, alterations in oxidative metabolism and favored the absorption and

transport and accumulation of Cd in roots and leaves, respectively. In addition, high

concentration of Cd in the root and leaf tissues caused irreversible damage to the cellular

ultrastructure, compromising the functioning of the cells and leading to cellular death

programed. However, there was mitigation of Cd toxicity when young cacao plants were

grown in soils with low Cd concentration and in the presence of Mn. Damage to root and leaf

tissues of young cacao plants, caused by the uptake of Cd in contaminated soils, can be

attenuated or mitigated by the addition of high concentrations of Mn in the soil.

Keywords: Theobroma cacao, Heavy Metals, Photosysnthesis; Mineral Nutrition

1

1. INTRODUÇÃO

O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma espécie lenhosa típica de clima tropical,

diplóide (2n = 20), preferencialmente alógama, perene e, dentre as 22 espécies que compõem

o gênero, é a mais explorada comercialmente no Brasil (MOTAMAYOR et al., 2003;

ALMEIDA; VALLE, 2007). O cacau é cultivado em plantações comerciais por diversas

partes do mundo (RICE; GREENBERG, 2000; STEINBERG, 2002) e as Américas produzem

em torno de 16% da produção global de cacau, com o Brasil entre os principais países

produtores (ICCO, 2017). É considerado uma das culturas perenes mais importantes do

planeta, com uma produção mundial de amêndoas estimada em 4,7 milhões de toneladas na

safra 2016-2017 (ICCO, 2017). A região sul da Bahia é a principal região produtora de cacau

no Brasil, com produção estimada, em janeiro de 2018, de 143 mil toneladas, 70% a mais que

a safra anterior, em uma área total de 530 mil hectares (IBGE, 2018). Com o desenvolvimento

e uso de clones tolerantes à vassoura de bruxa e com características produtivas superiores, o

Brasil, voltou a despontar como um dos principais dentre os países produtores de cacau,

utilizando intensamente novas tecnologias dos sistemas de produção (CHEPOTE et al., 2005).

Estes clones representam algumas seleções em fazendas, bem como seleções das populações-

base melhoradas no Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC) e os clones equatorianos CCN-

10 e CCN-51 (MONTEIRO; AHNERT, 2012). O clone CCN-51 foi selecionado no Equador,

sendo sugerido como o resultado de um cruzamento do híbrido IMC-67 x ICS-95 com um

cultivar equatoriano conhecido como "Canellos". É uma cultivar que tem sido amplamente

utilizada no Equador e está sendo usado como um pai em muitos programas de melhoramento

e seleção de cacau em outros países. Além disso, é altamente valorizado devido a sua alta

produtividade, resistência a doenças, além de alta concentração de gordura em suas amêndoas

(BOZA et al., 2014).

As amêndoas de cacau são matéria prima para o chocolate, além de serem fontes de

carboidratos, gorduras, proteínas, minerais naturais, flavonóides e vitaminas utilizadas na

produção de cosméticos, bebidas, geléias, cremes e sucos (ALMEIDA; VALLE, 2007).

Entretanto, pesquisas recentes têm revelado que os solos em área de cultivo de cacau, as

amêndoas e produtos derivados como doces e chocolates apresentam contaminação por metais

pesados, especialmente cádmio (Cd), nas principais regiões produtoras e consumidoras de

cacau e chocolates no mundo (CHAVEZ et al., 2015; TAKRAMA et al., 2015; DEVI et al.,

2

2016; BERTOLDI et al., 2016; ARÉVALO-GARDINI et al., 2017), muito acima do

recomendado pela União Européia (CAOBISCO, 2016). As principais vias de contaminação

dos solos por metais pesados são representadas pela rocha de origem do solo e pela ação

antrópica, na deposição de resíduos industriais, aplicação de lodo e fertilizantes fosfatados,

que embora imprescindíveis para atender a necessidade das culturas podem conter metais

pesados, inclusive o Cd, que são incorporados ao solo de forma indiscriminada (KRATZ et

al., 2016).

A possibilidade de detecção de alguns metais pesados, como o Cd, em resíduos em

cacau não podem ser evitadas, devido ao fato de que a maioria dos solos agricultáveis

apresenta estes elementos. Cd é facilmente absorvido pelas raízes e translocados para a parte

aérea das plantas, podendo ser armazenado nos componentes do fruto de cacau. Contudo, o

Mn pode atuar no metabolismo da planta reduzindo e, ou eliminando o efeito tóxico do Cd,

uma vez que o Mn, mesmo sendo um metal pesado, é absorvido em grandes quantidades pelo

cacaueiro sem geralmente lhe causar toxidez. Portanto, faz-se necessário estudo para elucidar

o processo de mitigação da toxicidade de Cd por Mn, em genótipos clonais e seminais de

cacau, de modo a reduzir os riscos à saúde do ser humano devido ao acúmulo de Cd nas

amêndoas e consequente contaminação do chocolate por esse metal.

Mn e Cd são elementos metálicos presentes na natureza e que possuem funções

distintas nas plantas. O Mn, normalmente presente como Mn2+

, é um micronutriente essencial

para todas as culturas (MILLALEO et al., 2010), sendo uma substância tóxica quando em

excesso (PENDIAS; PENDIAS, 1992). Mn é encontrado naturalmente nos solos, sendo a

forma bivalente (Mn2+

) a mais solúvel no solo (GUEST et al., 2002). A absorção de Mn pelas

raízes das plantas ocorre a partir da solução do solo, sendo transportado como cátion divalente

para a parte aérea (MILLALEO et al., 2010), onde geralmente ocorre o maior acúmulo desse

elemento. No entanto, experimentos com várias espécies demonstraram que Mn pode ser

acumulado nas raízes, porém, em menor concentração (PAGE; FELLER, 2005; PAGE et al.,

2006).

Cd é um metal pesado que não possui função biológica conhecida nas plantas, sendo,

provavelmente, o poluente mais significativo para as espécies vegetais, mesmo em baixas

concentrações (PINTO et al., 2004). Na solução do solo, Cd ocorre predominantemente como

Cd2+

, mas também como quelatos de Cd (TUDOREANU; PHILLIPS, 2004). O teor de Cd no

solo tem aumentado com o incremento da atividade humana, por meio de resíduos industriais,

siderúrgicos, adição de fertilizantes fosfatados e pesticidas (CAPDEVILA et al., 2003;

3

MORADI et al., 2005), cuja alta solubilidade em água, faz com que seja facilmente absorvido

e acumulado pelas plantas, afetando fortemente o crescimento e a produtividade

(BENAVIDES et al., 2005; DALCORSO et al., 2008). Em adição, Cd tem sua

biodisponibilidade dependente das condições do solo, temperatura e da concentração de

outros elementos (BENAVIDES et al., 2005; CLEMENS; MA, 2016). Cd é transportado da

raiz para parte aérea pelos mesmos transportadores transmembranas que os nutrientes

essenciais catiônicos, como Fe, Mg, Ca, K, Zn, Cu e Mn (SANITÀ DI TOPPI;

GABBRIELLI, 1999; DALCORSO et al., 2013). Além disso, transportadores de metais

pertencentes às famílias NRAMP (proteína macrofágica associada à resistência natural), e ZIP

(transportador regulado por Zn/proteína regulada por Fe) codificam proteínas integrais de

membrana que podem transportar Mn e Cd entre outros metais (HALL; WILLIAMS, 2003;

PAĽOVE-BALANG et al., 2006).

O excesso de Mn e, ou a presença de Cd nos sistemas vegetais desencadeia uma série

de reações comuns aos dois metais, tais como inibição ou decréscimo na taxa de crescimento

(SCHÜTZENDÜBEL; POLLE, 2002; MILLALEO et al., 2010); redução das taxas

fotossintéticas e transpiração (SANITÁ DI TOPPI; GABBRIELLI, 1999; ZORNOZA et al.,

2010; GILL et al., 2012); redução nos teores e biossíntese de clorofila a, b e carotenóides,

além de interferir no empilhamento de tilacóides (VASSILEV et al., 2002; MILLALEO et al.,

2010). A toxicidade tanto de Mn quanto de Cd também pode desencadear o estresse oxidativo

em células vegetais, ocasionando alterações metabólicas e danos macromoleculares,

interferindo na atividade de enzimas específicas, gerando excesso de espécies reativas de

oxigênio (ERO’s), principalmente OH•-, que perturbam a homeostase celular (HEGEDÜS et

al., 2001; POLLE, 2001; DEMIREVSKA-KEPOVA et al., 2004; LYNCH; ST. CLAIR,

2004). ERO’s são produzidas naturalmente pelas plantas como subprodutos de várias vias

metabólicas localizadas em diferentes compartimentos celulares como mitocôndrios,

cloroplastos e peroxissomos (DEL RÍO et al., 2006; NAVROT et al., 2007). Em condição de

estresse, causado por metais (por exemplo), há aumento na produção de ERO’s, o que causa

desequilíbrio às estruturas celulares, resultando na geração de estresse oxidativo (GILL;

TUTEJA, 2010).

As plantas possuem uma gama de mecanismos potenciais, como indução e ativação de

enzimas antioxidantes de defesa vegetal, como a dismutase do superóxido (SOD), catalase

(CAT) e peroxidase do guaiacol (GPX), que permitem a desintoxicação do excesso de ERO’s

produzidos em resposta à absorção de metais do solo pelas raízes (SCHÜTZENDÜBEL;

4

POLLE, 2002). Em adição, as plantas acumulam uma série de metabólitos para lidar com as

condições estressantes, principalmente a prolina (YANG et al., 2009). Prolina é um

aminoácido multifuncional que atua como osmólito, estabilizante de proteínas e membranas

celulares, elimina radicais livres, equilibra a homeostase celular e age como um sinalizador

em condições estressantes (SZABADOS; SAVOURÉ, 2009). Além disso, a fitotoxicidade de

Cd pode ser minimizada por meio da ação de agentes quelantes, como as fitoquelatinas (PCs)

e metalotioneínas (MTs). PCs pertencem ao grupo de tióis não protéicos (COBBETT;

GOLDSBROUGH, 2002) e formam vários complexos com Cd, que, quelado ao metal,

impede a circulação livre de Cd2+

no citoplasma (GRILL et al., 1985). Por outro lado, MTs,

componentes do mecanismo protéico de eliminação do efeito toxico de Cd em plantas, estão

envolvidas no sequestro celular e no ajuste no transporte de metais (CAPDEVILA; ATRIAM,

2011; GUO et al., 2013). A presença de Cd, mesmo em baixas concentrações, pode provocar

diminuição na absorção e distribuição de nutrientes minerais (SANDALIO et al., 2001) e

promover a indução de corpos apoptóticos e fragmentos de DNA oligonucleossômico e,

consequentemente, induzir à morte celular (SCHÜTZENDÜBEL; POLLE, 2002; SOUZA et

al., 2011).

1.1. Objetivo Geral

Avaliar a ação de Mn na mitigação do efeito tóxico de Cd em plantas jovens do

genótipo de cacau CCN 51, propagadas por sementes e submetidas a concentrações crescentes

de Mn e Cd no solo, por meio de mudanças morfofisiológicas, ultraestruturais, bioquímicas,

moleculares e nutricionais.

1.2. Objetivos Específicos

Medir as trocas gasosas e a concentração de pigmentos cloroplastídicos, em nível

foliar, nos diferentes tratamentos de Mn, Cd e Mn + Cd, para avaliar a influência destes

metais no metabolismo fotossintético;

Determinar a composição de Mn e Cd, em raízes e folhas, nos diferentes tratamentos

de Mn, Cd e Mn + Cd, visando analisar a redistribuição destes metais nas plantas;

5

Determinar a atividade de enzimas relacionadas ao metabolismo antioxidativo em

folhas, dos diferentes tratamentos de Mn, Cd e Mn + Cd, para o controle de ERO’s;

Analisar a expressão de genes envolvidos na biossíntese das proteínas de PS2, no

metabolismo antioxidativo e na biossíntese da metalotioneína em nível foliar, em diferentes

tratamentos de Mn, Cd e Mn + Cd, para avaliar a interferência destes metais na fotossíntese,

na homeostase de ERO’s e na síntese de quelante;

Avaliar a micromorfologia e ultraestrutura celular em folhas e raízes dos diferentes

tratamentos de Mn, Cd e Mn + Cd, utilizando MEV e MET, para avaliar a interferência destes

metais em níveis tissulares e de orgânulos celulares, respectivamente.

6

2. REFERENCIAL TEÓRICO

2.1. Metais pesados

A poluição do solo e da água por metais pesados é um grave problema ambiental. Os

metais pesados são constituintes naturais da litosfera e ocorrem naturalmente no solo como

elementos raros, cujos balanços dos ciclos geoquímicos e bioquímicos foram drasticamente

alterados pela atividade humana, sendo que as práticas agrícolas, deposição de lixo e a

metalurgia contribuem para a sua disseminação no meio ambiente (SEBASTIANI et al., 2004;

DALCORSO et al., 2010; ALMEIDA et al., 2013). Estas e outras atividades promovem um

aumento na concentração desses elementos na biosfera, que, diferentemente da maioria dos

poluentes, não são biodegradáveis e persistem no meio ambiente (BENAVIDES et al., 2005;

PILON-SMITS, 2005). Além disso, são considerados como poluentes inorgânicos e causam

sérios problemas para a vida dos seres vivos, quando presentes na atmosfera, solo e água,

incluindo a diminuição da atividade microbiana, fertilidade do solo e produtividade das

culturas (SANITÀ DI TOPPI; GABBRIELLI, 1999; YANG et al., 2005).

Os metais pesados constituem um grupo de elementos metálicos de densidade superior

a 5 g cm-3

(ADRIANO, 2001). Alguns destes são essenciais para o crescimento e

desenvolvimento normal das plantas (PRASAD; FREITAS, 2003; KRAMER et al., 2007),

como partes integrantes de muitas enzimas e proteínas, a exemplo de Cu, Fe, Zn, Mo, Ni e

Mn (KABATA-PENDIAS; PENDIAS, 2001). Além disso, todas as plantas têm a capacidade

de acumulá-los a partir da solução do solo (MCCUTCHEON; SCHNOOR, 2003). Por outro

lado, os metais pesados não essenciais têm função biológica ou fisiológica desconhecida e,

como resultado, não são importantes para a nutrição e o crescimento da planta (RASKIN et al,

1994). Ademais, podem causar efeitos tóxicos indiretos, pois são absorvidos pelas plantas em

substituição aos nutrientes essenciais na região de troca catiônica na solução do solo (TAIZ et

al., 2017). No entanto, concentrações elevadas tanto dos metais pesados essenciais quanto dos

metais não essenciais conduzem a sintomas de toxicidade, comprometendo o crescimento e

desenvolvimento das plantas (SCHMIDT, 2003).

A exposição das plantas aos níveis tóxicos de metais pesados desencadeia uma série

de alterações fisiológicas e metabólicas. No entanto, como os metais pesados possuem

diferentes sítios de ação na planta, a resposta visual da toxicidade difere entre estes metais. A

7

resposta mais difundida da toxicidade por metais pesados em plantas é a redução no

crescimento, incluindo o surgimento de clorose foliar, necrose, perda de turgescência, redução

na taxa de germinação de sementes e um aparato fotossintético danificado, freqüentemente

correlacionado com processos de senescência (DALCORSO et al., 2010; CARRIER et al.,

2003). Além disso, a fitotoxicidade por metais pesados causa a inativação de enzimas,

bloqueando grupos funcionais de moléculas metabolicamente importantes, deslocando ou

substituindo elementos essenciais, rompendo a integridade da membrana, levando à morte das

plantas (SCHALLER; DIEZ, 1991). Todos esses efeitos estão relacionados a alterações

ultraestruturais, bioquímicas e moleculares em tecidos e células vegetais, provocados pela

presença de metais pesados (GAMALERO et al., 2009).

2.2. Mn no solo e nas plantas

Mn é um elemento químico natural encontrado em muitos tipos de rochas e no solo,

ocorrendo combinado com outros elementos como o oxigênio (O), S e Cl. O teor total de Mn

nos solos é variável, com quantidades oscilando entre 20 a 10000 mg kg-1

solo (SPARKS,

1995). A biogeoquímica de Mn em solos é complexa, uma vez que está presente em vários

estados de oxidação (0, II, III, IV, VI e VII), enquanto que em sistemas biológicos ocorre

preferencialmente como II, III e IV. Mn II é a espécie mais solúvel de Mn no solo, enquanto

que a solubilidade do Mn III e Mn IV são muito baixas (GUEST et al., 2002). Óxidos de Mn

podem formar co-precipitados com óxidos de Fe, exibindo um comportamento anfótero. Além

disso, Mn interage tanto com cátions quanto com ânions em reações de oxidação-redução.

Estas reações são influenciadas por uma variedade de processos físicos, químicos e

microbiológicos (BRADL, 2004).

As condições de pH e redox influenciam a biodisponibilidade de Mn nos solos

(MARSCHNER, 1995; PORTER et al., 2004). Na maioria dos solos ácidos (pH<5,5), a

disponibilidade de Mn é alta, pois, neste tipo de solo, a redução de Mn é favorecida, enquanto

que a oxidação deste metal é restrita (SPARROW; UREN, 1987). O maior poder de redução

sobre a oxidação leva a um aumento na concentração da forma divalente de Mn. Em solos

com pH elevado (até pH 8), a auto-oxidação química de Mn2+

é favorecida sobre MnO2,

Mn2O3, Mn3O4 e mesmo Mn2O7, que não estão normalmente disponíveis para as plantas

(GHERARDI; RENGEL, 2004; HUMPRIES et al., 2007).

8

Em baixas concentrações, normalmente presente como Mn2+

na solução do solo, Mn é

um metal pesado essencial para todas as culturas. Entretanto, quando em excesso, Mn é

considerado uma substância tóxica e classificado como um metal pesado apresentando

densidade de 7,47 g cm-3

. A toxidez de Mn é favorecida em solos ácidos (PENDIAS;

PENDIAS, 1992). Com a diminuição de pH, a quantidade de Mn trocável - principalmente a

forma Mn2+

- aumenta na solução do solo. Esta forma de Mn está disponível para as plantas e

pode ser facilmente transportado para as células das raízes e translocado para a parte aérea,

onde é finalmente acumulado (MARSCHNER, 1995).

Nas plantas, Mn tem um papel fundamental na fotossíntese por meio de sua

participação no sistema de oxidação da molécula de água em nível do fotossistema 2 (PS2),

que fornece os elétrons necessários para a fotossíntese (MILLALEO et al., 2010;

BROADLEY et al., 2012; WHITE, 2012; WHITE; GREENWOOD, 2013), o qual foi

recentemente mostrado ser útil no diagnóstico de deficiência de Mn, por meio dos efeitos

sobre a fluorescência da clorofila (SCHMIDT et al., 2013). No entanto, seu excesso também

pode ser prejudicial ao aparato fotossintético (MUKHOPADHYAY; SHARMA, 1991).

Assim, Mn tem dois papéis nos processos metabólicos em plantas: como um micronutriente

essencial e como um elemento tóxico quando em excesso (KOCHIAN et al, 2004; DUČIĆ;

POLLE, 2005).

Mn desempenha um papel na síntese de ATP (PFEFFER et al., 1986), nas reações

envolvendo a ribulose-1,5-bisfosfato-carboxilase/oxigenase (Rubisco) durante a assimilação

de carbono (HOUTZ et al., 1988) e nas biossínteses de ácidos graxos, lipídios e proteínas

(NESS; WOOLHOUSE, 1980). Além disso, Mn atua como co-fator, ativando cerca de 35

enzimas diferentes (BURNELL, 1988). A maioria destas enzimas catalisa as reações de

oxidação-redução, descarboxilação e de hidrólise. Mn também é essencial para a biossíntese

da clorofila (por meio da ativação de enzimas específicas), aminoácidos aromáticos (tirosina),

e produtos secundários, como a lignina e os flavonoides (LIDON et al., 2004). Este elemento

metálico também participa da via de biossíntese de isoprenóides e da assimilação de nitrato

(LIDON et al., 2004; DUČIĆ; POLLE, 2005). Portanto, Mn é fundamental para muitos

processos metabólicos, tais como a respiração, fotossíntese, síntese de aminoácidos e ativação

hormonal (BROADLEY et al., 2012; WHITE, 2012; WHITE; GREENWOOD, 2013). No

ciclo do ácido tricarboxílico, atua em reações de descarboxilação oxidativas e não oxidativas,

como, por exemplo, na descarboxilação de desidrogenase do malato NADPH específica,

enzima málica e desidrogenase do isocitrato.

9

Como um micronutriente essencial, os níveis baixos de Mn são absolutamente

necessários para a nutrição normal e desenvolvimento de plantas. De acordo com Clarkson

(1988), os teores normais de Mn nas folhas diferem grandemente entre espécies (30-500 mg

Mn kg-1

MS). No entanto, quando está presente em quantidades excessivas, é extremamente

tóxico para as células vegetais (MIGOCKA; KLOBUS, 2007). A extensão da lesão da

toxicidade de Mn é, aproximadamente, proporcional à concentração do excesso de Mn

acumulado. No entanto, existe uma variação intra e interespecífica considerável entre os

níveis de Mn que induz toxicidade, bem como os sintomas da toxicidade em espécies vegetais

(FOY et al., 1988). Além disso, concentrações excessivas desse nutriente em plantas podem

alterar diversos processos, tais como a atividade enzimática, absorção, translocação e

utilização de outros elementos minerais (Ca, Mg, Fe e P), causando estresse oxidativo

(DUČIĆ; POLLE, 2005;. LEI et al., 2007).

A toxicidade de Mn também pode desencadear o estresse oxidativo em células

vegetais (DEMIREVSKA-KEPOVA et al., 2004). Como metal tóxico, Mn pode causar

alterações metabólicas e danos macromoleculares que perturbam a homeostase celular

(HEGEDÜS et al., 2001; POLLE, 2001). De acordo com Lynch e St. Clair (2004), a

toxicidade de Mn em plantas gera espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente OH•-,

as espécies oxidantes mais reativas e nocivas em células (LIDON; HENRIQUES, 1993).

Também tem sido relatado que tanto o excesso de Mn quanto a intensidade de luz ótima

determinam um aumento no estresse oxidativo, concomitante com a inibição do crescimento

da planta (SHI et al., 2006).

2.3. Cd no solo e nas plantas

Cd é um metal pesado não essencial (densidade 8,65 g cm-3

) e, provavelmente, o

poluente mais significativo devido à sua alta toxicidade para muitas espécies vegetais, mesmo

em uma concentração muito baixa (PINTO et al., 2004). A presença de Cd nos solos é

derivada das rochas de origem e de sedimentos, cuja concentração média na crosta terrestre é

de 0,2 mg kg-1

solo (MASON; MOORE, 1982; ADRIANO, 1986). O teor médio de Cd total

nos solos está entre 0,06 e 1,1 mg kg-1

(ALLOWAY, 1995; KABATA-PENDIAS; PENDIAS,

2001). Além disso, Cd pode ser introduzido no solo e no ambiente por meio de diversos

processos antropogênicos (BOLAN et al., 2010), como rejeitos de mineração, os quais

10

possuem elevados níveis de Cd (LI, 2006); resíduos industriais de diversos processos

(ADRIANO, 2001; CORDERO et al., 2004); lodo de esgoto e biosólidos (MCBRIDE;

CHERNEY, 2004); adubos fosfatados utilizados na agricultura (MORTVEDT; BEATON,

1995), dentre outros.

Na solução do solo, Cd ocorre predominantemente como Cd2+

, mas também como

quelatos de Cd (TUDOREANU; PHILLIPS, 2004). Baixas concentrações de Cd2+

na solução

do solo, combinados com baixos coeficientes de difusão para Cd2+

em soluções aquosas,

sugerem que a transpiração, impulsionada pelo fluxo de massa, vai dominar o fornecimento

de Cd2+

da solução do solo para as raízes das plantas. Isto reforça o que dizem Ingwersen e

Streck (2005) que o acúmulo de Cd pelas plantas cultivadas em solo está diretamente

relacionado à transpiração. Na natureza, as concentrações de Cd na parte aérea variam muito.

Embora muito desta variação possa ser atribuído a fatores ambientais, existe uma variação

filogenética apreciável em concentrações de Cd na parte aérea (BROADLEY et al., 2001;

WATANABE et al., 2007).

Devido à alta solubilidade em água, Cd é facilmente absorvido e acumulado pelas

plantas, afetando fortemente o seu crescimento e a sua produtividade (BENAVIDES et al.,

2005; DALCORSO et al., 2008). A maioria das pesquisas sobre poluição por Cd está focada

nos processos envolvidos no acúmulo de Cd em plantas cultivadas e sobre as conseqüências

desse acúmulo na saúde humana (WAGNER, 1993). As plantas superiores são capazes de

absorver Cd, em função da sua disponibilidade e da concentração, a partir do solo ou da água,

mas muito pouco é absorvido diretamente da atmosfera (CLEMENS, 2006). A fitotoxicidade

por Cd, no entanto, é um problema relevante, especialmente em algumas regiões altamente

poluídas por metais, onde foi observada uma diminuição na produtividade das culturas

agrícolas (VASSILEV; YORDANOV, 1997). Cd é difundido em solos contendo resíduos de

minas de Zn, em água de esgoto usada para irrigação, em solos alterados com lodo de esgoto e

em solos adubados com fertilizantes fosfatados ricos em Cd. Em solos agrícolas, o limite

regulamentar de Cd é de 100 mg kg-1

solo, mas esse limite é continuamente crescente, devido

à correção do solo e o uso intenso de fertilizantes fosfatados e lodo de esgoto e seu teor em

solos não poluídos aumentam com a concentração de argila. (HÜTTERMANN et al., 1999;

SANITÀ DI TOPPI; GABBRIELLI, 1999; DALCORSO et al., 2010).

Embora Cd não seja um elemento metálico essencial para o crescimento e

desenvolvimento das plantas, Cd é absorvido através do sistema radicular e transportado para

parte aérea através do xilema. Nas células radiculares, Cd desequilibra a absorção de água e

11

nutrientes, interferindo na absorção de Ca, Mg, K e P. Além disso, inibe enzimas envolvidas

no metabolismo de nutrientes na raiz, tais como redutase de Fe3+

, redutase de nitrato, redutase

do nitrito, sintetase da glutamina, sintetase do glutamato, que conduz à deficiência de Fe2+

, e

reduz a assimilação e metabolismo de N (sintetase da glutamina e do glutamato são

responsáveis pela incorporação de amônio ao esqueleto de carbono) (BALESTRASSE et al.

2003; DALCORSO et al. 2008). Na parte aérea, Cd pode ser acumulado em altas

concentrações em órgãos vegetativos e reprodutivos, além de afetar a homeostase global

(METWALLY et al., 2005).

Cd pode se acumular em determinadas partes da planta e promover distúrbios como (i)

alterações morfológicas e ultraestruturais em folhas e raízes (SOUZA et al., 2011), (ii)

clorose (CHAFFEI et al., 2004) e epinastia foliar (ZHAO et al., 2006), (iii) lignificação da

parede celular nas raízes e folhas, (iv) redução na fotossíntese líquida, condutância estomática

e transpiração foliar (SOUZA et al., 2011), (v) peroxidação lipídica (LASPINA et al., 2005;

IANNONE et al., 2010), (vi) alteração na absorção de nutrientes, (vii) alterações morfológicas

típicas de apoptose em núcleos de pontas de raízes e células foliares, (viii) indução de morte

celular programada (SOUZA et al., 2011), (ix) perturbação no metabolismo de N e S e na

maquinaria antioxidante da planta (GRATÃO et al., 2008; GILL; TUTEJA, 2011), (x)

mudanças no balanço hídrico e inibição do crescimento, devido à redução na concentração e

inibição da síntese de clorofila e na abertura dos estômatos e escurecimento das raízes

(SOARES et al., 2005; GARNIER et al., 2006; RODRÍGUEZ-SERRANO et al., 2009) e (xi)

alterações no metabolismo germinativo das sementes (RAHOUI et al., 2010; SMIRI et al.,

2010).

Cd gera estresse oxidativo em plantas por meio do excesso de ERO’s e de mecanismos

desconhecidos, dando origem a uma explosão oxidativa, que induz alterações nas funções das

membranas, iniciando a peroxidação dos ácidos graxos poli-insaturados (GILL; TUTEJA,

2010). ERO’s, na ausência de mecanismos de proteção, podem promover a oxidação de

proteínas e lipídios nas membranas celulares, o que leva a um aumento do extravasamento de

eletrólitos, com um aumento concomitante do teor de malondialdeído. ERO’s podem ser

produzidas, indiretamente, por operação ineficiente do ciclo de ASC-GSH, induzida por Cd,

causando acúmulo de H2O2 (CHO; SEO, 2005). Assim, a capacidade das espécies vegetais em

sintetizar GSH parece ser crucial para proteger a célula do estresse oxidativo causado por Cd.

Schützendübel e Polle (2002) sugeriram que Cd induz uma perda transitória da atividade

antioxidante, resultando no acúmulo de H2O2. De acordo com estes autores, H2O2 atua como

12

uma molécula de sinalização desencadeadora do sistema de defesa secundário, que causará

lignificação da parede celular, redução da viabilidade das células e, finalmente, a morte

celular.

Cd pode estimular certas enzimas que limitam o crescimento das células e aceleram a

senescência dos tecidos vegetais. A mediação destes processos ocorre, principalmente, pela

atividade de peroxidases (PODs) ligadas, covalente ou ionicamente, à parede da célula e que

estão envolvidas na polimerização de monômeros de compostos fenólicos de suberina,

metabolismo de distensão e lignificação (SOUZA, 2007). A maior quantidade acumulada de

fenóis insolúveis, como a lignina, na parede celular secundária dos tecidos de plantas expostas

ao Cd, pode estar relacionada com o aumento da atividade de POD (CHAOUI; EL FERJANI,

2005). No entanto, a atividade das PODs também mostra uma estreita relação com as

mudanças em processos tais como, fotossíntese, respiração e transpiração, com o potencial de

servir como um indicador sensível de comprometimento da atividade metabólica

(MACFARLANE; BURCHETT, 2001).

O Cd também pode estimular algumas enzimas que limitam o crescimento da célula e

aceleram o envelhecimento do tecido. Este processo é mediado principalmente pela atividade

de peroxidases (POD), ligadas covalentemente ou ionicamente a parede celular, que estão

envolvidas na polimerização de monômeros de fenólicos de suberina, no metabolismo de

distensão e de lignificação. O acúmulo de fenóis insolúveis, como lignina, na parede

secundária de células vegetais expostas ao Cd, pode estar relacionado ao aumento na

atividade destas peroxidases (CHAOUI; EL FERJANI, 2005). Todavia, a atividade de

peroxidases demonstra, ainda, uma estreita relação com as mudanças nos processos

fisiológicos tais como respiração, fotossíntese e transpiração, assim estas enzimas apresentam

potencialidades para atuar como indicadoras de sensibilidade da atividade metabólica

comprometida (MACFARLANE; BURCHETT, 2001).

Certas espécies vegetais sobrevivem e se reproduzem em solos que contêm altas

concentrações de metais pesados. Estas plantas têm vários mecanismos potenciais, em nível

celular, que podem estar envolvidos na desintoxicação e, por conseguinte, na tolerância a

estresses causados por metais (BENAVIDES et al., 2005; GRATÃO et al., 2005; VAN

BELLEGHEM et al., 2007). Tem-se observado que espécies tolerantes possuem mecanismos

de defesa ligados ao sistema antioxidante celular, que protegem vários processos fisiológicos

vitais contra danos resultantes de formas reativas de oxigênio produzidas pelo estresse por

metais pesados (PANDA; CHOUDHURY, 2005). Além disso, as plantas tolerantes mostram

13

um aumento nos mecanismos homeostáticos, que contribuem para prevenir a translocação de

metais ou mantê-los numa forma estável. Tolerância ou resistência ao estresse por metal nas

plantas podem estar associadas com um ou mais mecanismos, dentre eles: (i) restrição do

movimento do metal para as raízes por micorrizas, (ii) ligação do metal à parede celular

(BENAVIDES et al., 2005; VÁZQUEZ et al., 2006), (iii) redução do fluxo através da

membrana plasmática, que envolve os canais de Ca (RIVETTA et al., 1997), (iv) efluxo ativo

para o apoplasto (VAN BELLEGHEM et al., 2007), (v) transporte e acúmulo de metais no

vacúolo (GRATÃO et al., 2005), (vi) agentes quelantes de metal no citosol (HALL, 2002) e

(vii) transporte do complexo fitoquelatina-Cd para o vacúolo. Como resultado destes

mecanismos de tolerância e, ou resistência (isoladamente ou em combinação), algumas

plantas podem crescer em ambientes contaminados por metais, onde outras espécies não

sobrevivem (HALL, 2002).

A quelação de metais por ligantes de alta afinidade no citosol é um mecanismo

potencial muito importante de tolerância e de desintoxicação de metais pesados em plantas.

Os agentes quelantes incluem nicotinamina, aminoácidos, ácidos orgânicos, proteínas e

peptídeos, em especial dois tipos de peptídeos: fitoquelatinas (PCs) e metalotioneínas (MTs)

(CLEMENS, 2001; DUČIĆ; POLLE, 2005; VERBRUGGEN et al., 2009). Em plantas, MTs

possuem afinidade com muitos metais, incluindo Zn, Cu, As e Cd (YANG; CHU, 2011) e

estão envolvidas com a proteção contra a toxicidade dos metais, por meio de sequestro

celular, homeostase de íons metálicos intracelulares e ajuste no transporte de metais

(MEMON et al., 2001; KOHLER et al., 2004; CAPDEVILA; ATRIAM, 2011; GUO et al.,

2013). Além disso, são agentes participativos na limpeza de ERO’s e na manutenção do nível

redox (WONG et al., 2004; MACOVEI et al., 2010; CAPDEVILA; ATRIAM, 2011), reparo

da membrana plasmática (MISHRA; DUBEY, 2006), proliferação celular, crescimento e

reparo do DNA danificado (GRENNAN, 2011).

2.4. Interação entre Mn + Cd e seus efeitos em plantas

Demonstrou-se que Mn pode interagir com Cd no ambiente, sendo Mn capaz de

atenuar os efeitos tóxicos de Cd em plantas (PAĽOVE-BALANG et al., 2006; PENG et al.,

2008; ZORNOZA et al., 2010). Entretanto, os mecanismos envolvidos nessa atenuação ainda

não estão bem elucidados. A atenuação da toxicidade de Cd por adição de Mn em Phytolacca

14

americana foi acompanhada pela redução significativa das concentrações de Cd em todos os

órgãos da planta (PENG et al., 2008). Também foi encontrado em azevém (Lolium

multiflorum L.) e soja (Glycine Max) que a absorção de Cd pelas raízes das plantas foi

reduzida por Mn (JARVIS et al., 1976; CATALDO et al., 1983). Por outro lado, uma redução

na absorção de Mn também foi observada em plantas estressadas por Cd (HERNANDEZ et

al., 1998; ZORZONA et al., 2002; ZHANG et al., 2003).

O antagonismo entre Cd e Mn tem sido observado em plantas estressadas por Cd.

Relatos mostram reduções na absorção de Mn e acúmulo na parte aérea e raízes, em diferentes

espécies vegetais, quando cultivadas em um meio poluído por Cd (CATALDO et al., 1983;

THYS et al., 1991; JALIL et al., 1994; YANG et al., 1998; WU et al., 2003a). Além disso,

vários trabalhos com espécies vegetais distintas indicam que uma baixa concentração de Cd

aumenta o acúmulo de Mn na parte aérea, embora não nas raízes (HERNÁNDEZ et al., 1998;

RAMOS et al., 2002) e que uma adequada nutrição com Mn pode estar associado com a

redução paralela da absorção de Cd (JARVIS et al., 1976; PAĽOVE-BALANG et al. 2006).

O decréscimo da concentração de Cd na planta, após a adição de Mn, e vice-versa,

pode ser explicado pela competição para os mesmos transportadores de membrana

(PAĽOVE-BALANG et al., 2006). Recentemente, devido ao sequenciamento de todo o

genoma de algumas espécies vegetais, foram identificados e descritos muitos transportadores

de metal multiespecíficos. Os genes NRAMP e IRT1 codificam proteínas de membrana

integrais que podem transportar Mn, bem como entre os outros metais, como por exemplo, o

Cd (ROGERS et al., 2000; THOMINE et al., 2003; COHEN et al., 2004). A alta concentração

de Mn em Lupinus albus, uma espécie hiperacumuladora de Mn, contribuiu para a redução

dos efeitos negativos de Cd, especialmente na fotossíntese (ZORNOZA et al., 2002). Um

acúmulo maior de Mn em cloroplastos, quando o Cd está presente no meio de crescimento, foi

também encontrado em Lactuca sativa (RAMOS et al., 2002). Além disso, a restauração

parcial da estrutura do cloroplasto, danificada pelo tratamento de Cd, foi observada após a

adição de Mn (BASZYŃSKI et al., 1980).

2.5. Theobroma cacao, Mn e Cd

Mn é dos micronutrientes essenciais mais exigidos pelas plantas de T. cacao, sendo

absorvido pelas raízes, principalmente, como cátion divalente (Mn2+

). Além disso, é o

15

micronutriente mais acumulado nas folhas (SOUZA JÚNIOR, 1999; DANTAS, 2011) e o

mais exportado para a casca e sementes do fruto de T. cacao (PINTO, 2013). O teor foliar

adequado de Mn em plantas de T. cacao varia entre 50 e 300 mg kg-1

MS (SODRÉ, 2017).

Poucos trabalhos abordam os problemas causados pela deficiência de Mn em T. cacao. Os

principais sintomas observados são clorose em folhas novas, limitada por uma faixa entre as

nervuras (sintomas mais visíveis nas partes marginais da folha), apresentando as nervuras e

adjacências com colorações normais. A deficiência de Mn é comum em solos alcalinos ou em

lançamentos foliares, após a colheita de grande número de frutos na planta de T. cacao

(SODRÉ, 2017). Por outro lado, tem sido observado que o excesso de Mn acumulado nas

folhas de T. cacao não causa distúrbios nas plantas. Muitas pesquisas têm mostrado o elevado

acúmulo de Mn nas folhas de T. cacao, mesmo quando as plantas estão submetidas a estresses

diversos, tais como baixas e altas intensidades de luz (BALIGAR et al., 2005); estresse

hídrico (REHEM et al., 2009; SANTOS et al., 2014) e estresse por metais pesados (SOUZA

et al., 2014; ALMEIDA et al., 2015; CASTRO et al., 2015; REIS et al., 2015; ARAÚJO et al.,

2017).

Atualmente, existe uma grande preocupação com os tipos de solos onde se cultiva T.

cacao, devido, principalmente, à presença de metais pesados, em especial o Cd, que são

absorvidos do solo pelas plantas de T. cacao e acumulados nas sementes de seus frutos

(ARÉVALO-GARDINI et al., 2017; CAOBISCO/ECA/FCC, 2015). Isto, por sua vez, gera

grande preocupação em relação à segurança alimentar, pois tem sido verificada, nos produtos

derivados de amêndoas (sementes fermentadas) de T. cacao, a exemplo do chocolate, maior

concentração de Cd, quando comparado à maioria dos outros alimentos (DAHIYA et al.,

2005, JALBANI et al., 2009). Com base nestas informações, a Codex Alimentarius

Commission (CAC) vem desenvolvendo, desde 2014, trabalhos objetivando fornecer limites

máximos harmonizados deste metal que protejam a saúde dos consumidores e garantam um

comércio internacional de cacau mais justo (CAOBISCO/ECA/FCC, 2015), uma vez que a

contaminação dos produtos a base de cacau por Cd é de grande importância comercial para os

países produtores de cacau, pois influencia diretamente na economia (ICCO, 2012).

No ano de 2014, foram estabelecidos, pela União Européia (UE), limites máximos de

Cd para os produtos a base de cacau, aplicáveis a partir de 1 de janeiro de 2019 (EU, 2014).

Estes limites máximos de Cd foram estabelecidos da seguinte forma: i) chocolate ao leite com

< 30% de sólidos secos totais de cacau - 0,10 mg Cd kg-1

; ii) chocolate com < 50% de sólidos

secos totais de cacau e chocolate ao leite com ≥ 30% de sólidos secos totais de cacau - 0,30

16

mg Cd kg-1

; iii) chocolate com ≥ 50% de sólidos secos totais de cacau - 0,80 mg Cd kg-1

; iv)

cacau em pó vendido ao consumidor final ou como ingrediente em cacau em pó adoçado e

vendido ao consumidor final (chocolate para consumo) - 0,60 mg Cd kg-1

.

O cacau produzido na América Latina é considerado de qualidade superior devido ao

seu potencial na produção de chocolates finos (LOOR et al., 2009). No entanto, estudos têm

revelado que solos de diversos países produtores de cacau, da América Latina, estão

contaminados por metais pesados (CHAVES et al., 2015; TAKRAMA et al., 2015), cujas

amêndoas produzidas, a partir de plantas de T. cacao cultivadas nestes solos, apresentam alto

teor de Cd (1,4 mg kg-1

), quando comparado com as amêndoas produzidas na América

Central (0,5 mg kg-1

), no Leste (0,5 mg kg-1

) e no Oeste africano (0,09 mg kg-1

) e na Ásia (0,3

mg kg-1

) (BERTOLDI et al., 2016). Entretanto, há poucas informações disponíveis sobre a

concentração máxima de Cd em amêndoas de T. cacao, contudo a UE estabeleceu limites

críticos de 0,6 mg de Cd kg-1

em amêndoas (MOUNICOU et al., 2003). Informações

referentes aos teores de Cd em amendoas cruas de cacau ainda são bem limitadas. Contudo,

concentrações elevadas de Cd foram encontradas no cacau em pó do Equador (0,7 e 0,5 mg

kg-1

), Venezuela (1,8 mg kg-1

) e Malásia (0,6 mg kg-1

), quando comparados com os países

produtores na Africa (0,09 e 0,1 mg kg-1

) e no Brasil (0,1 e 0,2 mg kg-1

) (MOUNICOU et al.,

2003).

Uma das principais portas de entrada de metais pesados, especialmente o Cd, nos

sistemas agrícolas, como a cacauicultura, é por meio da utilização de fertilizantes fosfatados

(SILVA et al., 2017), de grande importância para o aumento da produtividade das culturas.

Estes elementos metálicos estão presentes nos fertilizantes como resultados da composição

das matérias-primas utilizadas na sua fabricação e, consequentemente, são transferidos para as

plantas durante a aplicação, causando sérios prejuízos à produção (GUPTA et al., 2014;

SILVA et al., 2017).

A espécie T. cacao tem demonstrado ser bastante exigente em Mn. Este elemento

metálico, assim como o Cd, é absorvido como cátion divalente, competindo pelos mesmos

transportadores de íons. Logo, a maior disponibilidade de Mn para as plantas de T. cacao, em

solos contaminados por Cd, pode reduzir a absorção de Cd, em detrimento da absorção de Mn

pelas raízes, e evitar ou minimizar o transporte de Cd para a parte aérea e, consequentemente,

o seu acúmulo nas amêndoas de T. cacao, mitigando, desta forma, a toxicidade de Cd.

17

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Material vegetal e condições de cultivo

O experimento foi conduzido em casa de vegetação no campus da Universidade

Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil (14°47’ S, 39°10’W), utilizando

sementes do genótipo de T. cacao CCN 51, obtidas de frutos maduros, oriundos de plantas

adultas com 3 a 5 anos de idade, cujas flores foram autopolinizadas. As sementes foram pré-

germinadas em pó de serra umedecido com água. Logo após a protrusão da raiz primária, as

sementes pré-germinadas foram transplantadas para vasos plásticos pretos com capacidade de

5 L, contendo solo franco-arenoso (cujas características físicas e químicas são apresentadas na

Tabela 1) corrigido com uma mistura de CaCO3 e MgCO3, necessária para atingir a relação de

2:1 de Ca2+

e Mg2+

e aumentar o valor da saturação de base para 80%, e fertilizado (Tabela 2)

com base na recomendação de adubação feita a partir da análise do solo.

Tabela 1. Características físicas e químicas do solo para o crescimento de plantas seminais do

genótipo de Theobroma cacao CCN 51: P, Na, K, Fe, Zn, Mn e Cu (extraído por Mehlich 1);

Ca, Mg e Al (extraído por KCl, 1 mol L-1

); H + Al (extraído por acetato de cálcio 0,5 M, pH

7,0); B (extraído por água quente); S (extraído por fosfato monocálcico em ácido acético). SB,

soma das bases; t, capacidade efetiva de troca de cátions; T, capacidade de troca catiônica (pH

7,0); V, saturação de base; m, saturação por Al; MO, matéria orgânica; P-rem, fósforo

remanescente.

Análise fisico-química do solo

pH (H2O) 5,11

P (mg dm-3

) 10,4

K (mg dm-3

) 29

Ca2+

(cmolc dm-3

) 1,08

Mg2+

(cmolc dm-3

) 0,37

Al3+

(cmolc dm-3

) 0,5

H + Al (cmolc dm-3

) 3,3

S (mg dm-3

) 10,9

Zn (mg dm-3

) 2,17

SB (cmolc dm-3

) 1,52

(t) (cmolc dm-3

) 2,02

(T) (cmolc dm-3

) 4,82

Fe (mg dm-3

) 165,1

Mn (mg dm-3

) 23,7

Cu (mg dm-3

) 1,05

18

B (mg dm-3

) 0,17

V (%) 31,5

m (%) 24,8

Matéria Orgânica (dag kg-1

) 0,51

P-rem (mg L-1

) 41,0

Areia Grossa (kg kg-1

) 0,32

Areia Fina (kg kg-1

) 0,51

Silte (kg kg-1

) 0,09

Argila (kg kg-1

) 0,08

Tabela 2. Adubação de plantio e de cobertura para plantas jovens do genótipo de Theobroma

cacao CCN 51. *Padrão Analítico (PA).

Adubação de plantio

Nutriente Concentração Fertilizante

P 4,60 (g vaso-1

) MAP Purificado

K 7,63 (g L-1

) KCl PA*

B 0,27 (g L-1

) H3BO3 PA

Cu 0,47 (g L-1

) CuSO4.5H2O PA

Zn 1,41 (g L-1

) ZnSO4.7H2O PA

Mo 0,02 (g L-1

) (NH4)6Mo7O24.4H2O PA

Adubação de cobertura (15 dias após o transplantio e continuamente a cada 15 dias)

Nutriente Concentração Fertilizante

N 8,89 (g L-1

) Uréia

K 1,95 (g L-1

) KCl PA

S 2,17 (g L-1

) K2SO4 PA

Após 120 dias do transplantio das sementes pré-germinadas, foram adicionados ao

solo 50 mL de soluções distintas contendo diferentes concentrações de Mn (0; 0,4; 0,8; 1,2 e

1,6 mmol kg-1

solo) e Cd (0; 0,2, 0,4; 0,6 e 0,8 mmol kg-1

solo), utilizando cloreto de

manganês e cloreto de cádmio (Sigma-Aldrich), respectivamente (Tabela 3). Durante todo o

período experimental (150 dias), as plantas jovens de T. cacao foram regadas com água de

chuva previamente armazenada.

19

Tabela 3. Distribuição dos tratamentos com as concentrações de Mn e Cd aplicados no solo. *Sem adição de Mn e Cd ao solo (controle).

Cd (mmol kg-1

)

0 0,2 0,4 0,6 0,8

Mn

(mmol kg-1

)

0 0 + 0* 0 + 0,2 0 + 0,4 0 + 0,6 0 + 0,8

0,4 0,4 + 0 0,4 + 0,2 0,4 + 0,4 0,4 + 0,6 0,4 + 0,8

0,8 0,8 + 0 0,8 + 0,2 0,8 + 0,4 0,8 + 0,6 0,8 + 0,8

1,2 1,2 + 0 1,2 + 0,2 1,2 + 0,4 1,2 + 0,6 1,2 + 0,8

1,6 1,6 + 0 1,6 + 0,2 1,6 + 0,4 1,6 + 0,6 1,6 + 0,8

O experimento foi conduzido no período compreendido entre setembro de 2015 e

janeiro de 2016. Neste período, a radiação fotossinteticamente ativa (PAR) foi monitorada e

registrada continuamente (Figura 1), utilizando sensores de radiação luminosa S-LIA-M003, e

a temperatura e a umidade relativa do ar foram monitorados utilizando-se sensores

microprocessados Hobo H8 Pro Series (Onset, USA), acoplados a estação climatológica Hobo

Micro Station Data Logger (Onset Computer, Massachusetts, EUA).

Figura 1. Valores diários da radiação fotossinteticamente ativa (PAR), temperatura e umidade relativa

do ar, monitorados e registrados em casa de vegetação, durante o período experimental.

20

3.2. Parâmetros fotossintéticos

3.2.1. Trocas gasosas foliares

Durante o período experimental, a taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar

(A), a condutância estomática ao vapor de água (gs) e a transpiração foliar (E) foram medidas

no 1°, 4°, 7°, 14°, 21° e 28° dias após a aplicação dos tratamentos (DAAT). Essas variáveis

foram avaliadas, entre 8 e 12 h, em folhas completamente expandidas e maduras, utilizando o

sistema portátil de medição da fotossíntese LI-6400XT (LI-COR Biosciences, Lincoln,

Nebraska, USA), equipado com uma fonte de luz artificial 6400-02B RedBlue.

Para as medidas de trocas gasosas foliares, a fonte de luz artificial do sistema foi

ajustada para fornecer uma densidade de fluxo fotossintético de fótons (PPFD) de 800 μmol

m-2

s-1

, isto é, acima da irradiância de saturação de luz para folha de T. cacao, sem provocar

fotoinibição. Os valores de A, gs e E foram estimados a partir dos valores atmosféricos de

CO2 (Ca) e de umidade do ar medidos no interior da câmara e utilizados para calcular as

eficiências intrínsecas (A/gs) e instantâneas (A/E) de uso da água. Além disso, também foi

medida a relação entre as concentrações intracelular (Ci) e atmosférica de CO2 (Ci/Ca). As

medições foram salvas quando o coeficiente de variação (CV) atingiu valor inferior a 0,3%.

Além de PPFD, a temperatura foliar e o fluxo de CO2 atmosférico no interior da câmara foliar

foram mantidos constantes a 26 ± 1 °C e 400 ± 20 μmol (CO2) mol-1

, respectivamente.

3.2.2. Pigmentos fotossintéticos

As concentrações de clorofilas a (Chl a) e b (Chl b) e de carotenoides (Car) foram

obtidas a partir de 100 mg de tecido foliar liofilizado, utilizando 2 mL de acetona a 100%,

seguido de armazenamento em freezer a - 20° C por 24 h (TORRES et al., 2006). Logo após,

os extratos foram centrifugados a 5000 x g por 10 min a 4° C. Em seguida, as absorbâncias

dos extratos centrifugados foram lidas a 470, 645 e 662 nm para Car, Chl b e Chl a,

respectivamente, em espectrofotômetro de luz visível-UV Spectramax Paradigm (Molecular

Devices, CA, USA). As concentrações de Chl a, Chl b e Car foram determinadas seguindo as

equações abaixo (LICHTENTHALER; WELLBURN, 1983):

21

Chl a = (11,75 x A662) - (2,35 x A645)

Chl b = (18,61 x A645) - (5,03 x A662)

Car = [(1000 x A470) - (2,27 x Chl a) - (81,4 x Chl b)]/227

3.3. Concentrações de Mn e Cd

Ao final do experimento (30 DAAT), foram coletadas folhas e raízes das plantas

jovens de cacau dos diferentes tratamentos, em quatro repetições. As raízes foram submetidas

a lavagens com água corrente, solução detergente neutro a 0,1%, água destilada, solução de

HCl a 3% e água destilada (SOUZA JÚNIOR et al., 2011), visando a remoção do excesso de

metais na superfície radicular. Em seguida, o material vegetal foi submetido à secagem em

estufa de circulação forçada de ar a 70 °C ± 5 °C até massa constante. Posteriormente, o

material foliar seco foi moído, usando um moinho de rotor tipo ciclone/Willey (MA1340,

Marconi), enquanto que as raízes secas foram trituradas em moinho de bola com câmara

fechada (MA350, Marconi). Logo após, o material vegetal seco e triturado foi submetido à

digestão nitroperclórica (3:1 v/v) e, posteriormente, analisada quimicamente, utilizando a

técnica de espectrometria de emissão óptica por plasma indutivamente acoplado (ICP OES,

Varian, modelo 710ES).

3.4. Teor de prolina

A determinação do teor de prolina foi realizada de acordo com os procedimentos

metodológicos descritos por Bates et al. (1973), com alterações adaptadas para leitura em

microcubeta de quartzo e nos volumes de tolueno. Amostras foliares secas em estufa (35 mg

para o tratamento controle e 15 mg para os demais tratamentos) foram maceradas em

nitrogênio liquido. Em seguida, foi adicionado em cada tubo 1 mL de ácido sulfossalicílico a

3%. Imediatamente após, os tubos foram agitados vigorosamente em vórtex, seguidos de

centrifugação a 10000 x g durante 10 min. Logo após, coletou-se 0,2 mL do sobrenadante

(extrato bruto) e transferiu para tubos de ensaio de vidro e rosqueados. Em seguida, foram

adicionados em cada tubo de ensaio 0,2 mL de ninhidrina ácida e 0,2 mL de ácido acético

glacial concentrado (Bates et al. 1973). Logo após, os tubos foram fechados hermeticamente,

22

agitados em vórtex e incubados em banho-maria a 100 °C por 1 h. Imediatamente após, a

reação foi interrompida em banho de gelo, adicionou-se 0,4 mL de tolueno e agitou

vigorosamente em vórtex por 20 s. Posteriormente, os tubos foram deixados descansar até

atingir a temperatura ambiente. Em seguida, a fase superior foi recuperada com o auxílio de

uma pipeta Pasteur de vidro e transferida para uma microcubeta de quartzo. A leitura foi

realizada em λ de 520 nm usando tolueno como branco. A curva-padrão foi preparada com L-

prolina (PM: 115,13 g) e o teor de prolina foi calculado de acordo com a fórmula descrita por

Bates et al (1973). Os resultados foram expressos em mg g-1

MS.

3.5. Peroxidação lipídica

Os produtos da peroxidação lipídica de membranas celulares foram avaliados como

substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), principalmente malondialdeído

(MDA), de acordo os procedimentos metodológicos descritos por Cakmak e Horst (1991),

com algumas modificações. Aos 30 DAAT foram coletadas, em nitrogênio líquido, folhas

maduras de todos os tratamentos, armazenadas em ultrafreezer a - 80°C e, posteriormente,

liofilizadas. No momento da análise, 20 mg de folhas liofilizadas, de cada tratamento, foram

maceradas com 2 mL de ácido tricloroacético (TCA) a 0,1% (p/v). Logo após, o extrato foi

centrifugado a 10.000 xg durante 6 min. Em seguida, uma alíquota de 500 µL do

sobrenadante foi adicionada a 1,5 mL de solução de ácido tiobarbitúrico a 0,5%, preparado

em TCA a 20%. Logo após, as amostras foram incubadas a 90ºC durante 20 min, seguidas de

paralisação da reação em banho de gelo. Imediatamente após, fez-se a centrifugação das

amostras a 10.000 x g por 4 min e realizou-se a leitura da absorbância do sobrenadante em λ

de 532 nm, seguido da correção para turvação não-específica por subtração da absorbância em

λ 600 nm. A concentração de TBARS foi calculada a partir do seu coeficiente de extinção de

155 mM cm-1

.

3.6. Metabolismo antioxidativo

3.6.1. Obtenção do extrato enzimático bruto

23

Para a análise das enzimas relacionadas ao metabolismo antioxidativo, foram

coletadas folhas maduras de todos os tratamentos nos tempos correspondentes a 3, 6, 12, 24,

48 e 96 h após a aplicação dos tratamentos (AAT). Durante as coletas, as folhas foram

congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em ultrafreezer - 80°C até o momento da

liofilização. Após a liofilização, macerou-se cerca de 100 mg de amostras, foi adicionado

polivinilpirrolidona (PVP) para evitar a oxidação do macerado e, logo após, as amostras

foram pesadas em 20 e, ou 40 mg. O material macerado foi ressuspenso em tampão de

extração 20x (tampão fosfato de sódio, 50 mM, pH 6,0 ou tampão fosfato de potássio 50 mM,

pH 7,0 ou 7,8) de acordo com a enzima analisada. Procedeu-se a ultrasonicação das amostras

(Ultrasonic processor Gex 130, 130 W) em gelo até o rompimento total dos tecidos, com

pulsos de 8 s, a intervalos de 10 s, e amplitude de 70%. Em seguida, as amostras foram

centrifugadas a 4°C por 10 min em 10000 x g. Imediatamente após, coletou-se a fase aquosa

(extrato bruto) e transferiu para tubos de 2 mL, que foi armazenada, temporariamente, em

gelo.

3.6.2. Atividade da dismutase do superóxido (SOD, EC. 1.15.1.1)

A atividade de SOD foi determinada de acordo com a metodologia descrita por

Gianopolitis e Ries (1977), com algumas modificações. Ao extrato bruto, foi adicionado o

tampão de reação (fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,8), EDTA a 1 mM e metionina a 130

mM. A atividade enzimática foi iniciada com a adição de riboflavina a 1 mM e NBT a 750

µM. A leitura inicial ocorreu após a placa ter ficado no escuro por 5 min, e a segunda leitura

realizada após a placa ter sido submetida à luz fluorescente de 15 W por mais 20 min. Foram

considerados como brancos os poços que não continham extrato vegetal. Uma unidade de

atividade (UA) foi determinada para medir a capacidade da enzima de inibir 50% da

fotorredução de nitroazul de tetrazólio (NBT) à formazana azul. As leituras foram realizadas a

560 nm em espectrofotômetro de microplacas UV/VIS SpectraMax Paradigm Multi-Mode

Microplate Reader (Molecular Devices).

3.6.3. Atividade da peroxidase do guaiacol (GPX, EC. 1.11.1.7)

A atividade de GPX foi determinada de acordo com Pirovani et al. (2008), medindo o

aumento do consumo de guaiacol em μmol s-1

g-1

de biomassa seca. A mistura reagente

24

consistiu em 140 μL de tampão de reação GPX 2x (guaiacol a 40 mmol L-1

, H2O2 a 30% e

fosfato de sódio a 50 mmol L-1

, pH 6,0), 139 μL de tampão fosfato de sódio a 50 mmol L-1

,

pH 6,0 e 1 μL de extrato enzimático bruto. A atividade da enzima foi calculada utilizando a

equação y = 0,1284x + 0,0189 (R2=0,99), originada a partir de uma curva padrão para POD-

guaiacol (REHEM et al., 2011). A atividade foi realizada 470 nm por 180s em

espectrofotômetro de microplacas UV/VIS SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate

Reader (Molecular Devices).

3.6.4. Atividade da catalase (CAT, EC. 1.11.1.6)

A atividade de CAT foi determinada de acordo com o método descrito por Havir e

McHale (1987). A atividade foi calculada pela velocidade do consumo de H2O2 na reação,

utilizando-se tampão de reação (tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,0) com adição de

20 μL do extrato vegetal. A reação foi iniciada pela adição de H2O2 a 300 mM e as leituras

foram feitas calculando-se o decaimento a 240 nm por 180 s, contra um branco livre de

extrato vegetal e expressa em mmol H2O2 g-1

MS s-1

, usando-se o coeficiente de extinção

molar de 36 M-1

cm-1

. A atividade foi realizada em espectrofotômetro de microplacas UV/VIS

SpectraMax Paradigm Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices).

3.7. Expressão gênica

Amostras foliares de plantas jovens de T. cacao [tratamentos 0 Mn + 0 Cd mmol kg-1

(controle); 1,6 mmol Mn kg-1

solo; 0,8 mmol Cd kg-1

solo; 1,2 Mn + 0,2 Cd mmol kg-1

solo;

0,8 Mn + 0,4 Cd mmol kg-1

solo; 0,4 Mn + 0,6 Cd mmol kg-1

solo] foram coletadas 48 e 96 h

após aplicação dos tratamentos (AAT), imersas em nitrogênio líquido, armazenadas em

freezer à - 80°C, liofilizadas e, por fim, armazenadas a - 20°C. Para a extração de RNA, as

amostras foram maceradas em nitrogênio líquido e pesadas 20 mg de biomassa seca de cada

tratamento. O RNA foi extraído com a utilização do kit RNAqueous®

(Ambion-Applied

Biosystems), seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, as amostras foram tratadas

com DNase I (Thermo Scientific) com incubação a 37°C por 30 min., seguido da inclusão de

EDTA a 50 mM e novamente incubadas a 65°C por 10 min. Após incubação, os RNA’s das

25

amostras foram quantificados em espectrofotômetro (NanoDrop 2000c UV-Vis

Spectrophotometer Thermo Scientific) a 260 e 280 nm e expressos em µg mL-1

.

A síntese de cDNA foi realizada a partir das amostras tratadas com DNase I,

utilizando o High Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems), de acordo com a

recomendação do fabricante. As reações foram incubadas a 37°C por 60 min., 95°C por 5

min. e 4°C por 1 min. A abundância de transcritos foi analisada utilizando primers específicos

previamente descritos por Araujo et al. (2017), relacionados à biossíntese das proteínas do

fotossistema 2 (PS2) da fase fotoquímica da fotossíntese (psbA e psbO), às enzimas

antioxidativas (Cu–Zn sod cyt e Cu–Zn sod chl) e à biossíntese do polipeptídeo

metalotioneína (Mt2b). A qPCR foi realizado em um sistema "PCR em tempo real" (modelo

ABI 7500, Applied Biosystems), utilizando o kit Power SYBR® Green PCRMaster Mix

(Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura da reação foi

composta por 50 ng de cDNA como modelo, 5 μM de cada primer e 6,5 μL de Power SYBR®

Green PCR Master Mix, para completar o volume final de 12,5 μL. Os números da expressão

relativa dos genes foram calculados como o número de vezes em relação à planta controle,

utilizando o método 2–ΔΔCt

(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001), tendo os genes actina e β-

tubulina como controles endógenos (referencial).

3.8. Análise micromorfológica e ultraestrutural celular

Para as análises micromorfológicas e ultraestruturais foram utilizados os seguintes

tratamentos de Mn, Cd e Mn + Cd aplicados no solo: 0 mmol Mn kg-1

solo + 0 mmol Cd kg-1

solo (controle, sem aplicação de Mn e, ou de Cd no solo); 0,8 mmol Mn kg-1

solo; 1,6 mmol

Mn kg-1



solo; 1,2 mmol Mn kg-1

solo + 0,2

mmol Cd kg-1


solo + 0,4 mmol Cd kg-1


solo +

0,6 mmol Cd kg-1

solo.

3.8.1. Anatomia e micromorfologia foliar

As análises de anatomia e micromorfologia foliar foram realizadas utilizando

microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para isso, fragmentos do terço médio foliar

foram fixados em solução de glutaraldeído a 2,5%, preparada em tampão cacodilato de sódio

26

a 0,1 M, pH 7,2. Em seguida, as amostras foram desidratadas em séries crescentes de acetona

PA (30, 50, 60, 70, 80, 90 e 100% (3x)), submetidas a um ponto crítico modelo CPD 030

(BAL-TEC AG, Liechtenstein) para retirada de toda a água dos tecidos e, logo em seguida, as

amostras foram revestidas com uma fina camada de ouro, utilizando um metalizador

SPUTTER COATER SCD 050 (BAL-TEC AG, Liechtenstein). As observações foram

realizadas utilizando o microscópio QUANTA 250 (FEI Company). As espessuras de

diversos componentes foliares foram medidas: parênquimas paliçádico (PP) e esponjoso (SP),

superfícies adaxial (EAd) e abaxial (EAb) da epiderme, mesofilo total (TM), espessura total

da folha (LT), aberturas transversal (TOS) e longitudinal (LOS) dos estômatos e densidade

estomática (SD).

3.8.2. Ultraestrutura celular de folhas e raízes

O microscópio eletrônico de transmissão (MET) foi utilizado para a realização das

análises ultraestruturais de folhas e raízes. Para isso, foram retirados fragmentos do terço

médio de folhas maduras e da extremidade de raízes primárias das plantas jovens de T. cacao,

genótipo CCN 51, nos tratamentos selecionados. O material foi pré-fixado em glutaraldeído a

2,5%, em solução tampão cacodilato de sódio a 0,1 M, pH 7,2, sob vácuo, seguida, de

lavagens no mesmo tampão (3x por 10 min. cada lavagem). A pós-fixação foi realizada com

tetróxido de ósmio a 1 %, preparado no mesmo tampão, seguido de outras lavagens no mesmo

tampão por 3x. As amostras foram desidratadas em séries etanólicas (30, 50, 70, 90 e 100%

PA) e, logo após, embebidas com o mix entre etanol PA e resina LR White (Sigma-Aldrich)

em diferentes proporções (3:1, 1:1 e 1:3) e, em seguida, com a resina pura (3x). Após esse

processo, houve a inclusão das amostras em cápsulas de gelatina e polimerização a 60ºC, por

24 h. Logo após, foram obtidas as secções ultrafinas (70 nm de espessura), utilizando-se o

ultramicrótomo Leica UC6 (Leica), que, em seguida, foram depositadas em grades de cobre

de 400 mesh. Posteriormente, as secções foram contrastadas com acetato de uranila e citrato

de chumbo (REYNOLDS, 1963). Em seguida, os cortes foram examinados e fotografados em

MET, Morgagni™ modelo 268 D, operando com voltagem de aceleração de 80 kV,

microprocessado e controlado por meio de plataforma Windows, equipado com câmera CCD.

27

3.9. Análise estatística

O experimento foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em esquema

fatorial, com 25 tratamentos, correspondentes às concentrações de Mn (0,4; 0,8; 1,2 e 1,6

mmol kg-1

solo) e Cd (0,2; 0,4; 0,6 e 0,8 mmol kg-1

solo) e suas interações, as quais foram

adicionadas no solo, mais o tratamento controle (sem adição de Mn e Cd ao solo), com

número variável de repetições por parâmetro avaliado. Para as análises anatômicas,

micromorfológicas e ultraestruturais, foram analisados somente oito tratamentos, conforme

informado anteriormente. Foram realizadas análises de variância (ANOVA) e as médias

foram comparadas utilizando o teste de Scott-Knott (p < 0,05).

28

4. RESULTADOS

4.1. Parâmetros fotossintéticos

4.1.1. Trocas gasosas foliares

A aplicação de diferentes concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd no solo causaram

efeitos distintos nas trocas gasosas foliares das plantas de T. cacao. As avaliações, realizadas

em diferentes dias após a aplicação dos tratamentos (DAAT), revelaram respostas diferentes

das plantas entre os tratamentos, principalmente quando comparados ao tratamento controle

(sem adição de Mn e, ou Cd). A taxa fotossintética líquida (A) das plantas jovens de T. cacao

apresentou diferenças significativas entre os tratamentos avaliados, com valores médios

variando entre 1,4 e 5,9 µmol (CO2) m-2

s-1

(Figura 2). A aplicação isolada de Mn no solo

contribuiu para o incremento nos valores de A, exceto aos 14 DAAT, principalmente na

concentração de 1,6 mmol Mn kg-1

solo, mostrando valores de A iguais ou superiores ao

tratamento controle (Figura 2 A-F). Para a maioria das interações Mn + Cd foi verificado

redução de A, principalmente aos sete DAAT. Por outro lado, em todos os DAAT, as

diferentes concentrações isoladas de Cd influenciaram negativamente, pois as plantas

submetidas a esses tratamentos apresentaram os menores valores de A. Notou-se que, aos 14,

21 e 28 DAAT, a aplicação de Mn, associada com a menor concentração de Cd (0,2 mmol kg-

1 solo), favoreceu ao aumento de A. O mesmo fato foi observado aos 21 DAAT, quando se

aplicou 0,6 mmol Cd kg-1

solo, juntamente com Mn (Figura 2 D-F).

29

Figura 2 - Taxa fotossintética líquida por unidade de área foliar (A) de plantas jovens do genótipo T.

cacao CCN 51, após aplicação de diferentes concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd no solo. Valores

médios de três repetições (± SE). As letras minúsculas indicam uma comparação entre os tratamentos,

em cada dia após aplicação dos tratamentos (DAAT), pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). 1 DAAT (A);

4 DAAT (B); 7 DAAT (C); 14 DAAT (D); 21 DAAT (E); 28 DAAT (F). C - Controle.

A condutância estomática (gs) apresentou diferença significativa entre os tratamentos

somente aos 28 DAAT, cujo tratamento controle apresentou valores médios superiores à

maioria dos tratamentos (Figura 3 A). Aplicação isolada no solo da maior concentração de Cd

não resultou em danos em gs, uma vez que as plantas submetidas a esse tratamento

apresentaram valores médios estatisticamente iguais às plantas controle e com maiores

concentrações de Mn aplicado isoladamente no solo. O mesmo foi observado em plantas nas

interações com 0,8 e 1,2 mmol Mn kg-1

solo e na menor concentração de Cd (0,2 mmol kg-1

solo) aplicadas no solo (Figura 3 A). Por outro lado, a transpiração foliar (E) foi afetada

significativamente pelos tratamentos somente em dois períodos de avaliação (4 e 28 DAAT),

sendo que aos 4 DAAT os valores médios de E, em todos os tratamentos, foram superiores ao

tratamento controle. Aos 4 DAAT foi verificado incremento nos valores de E com o aumento

da concentração de Mn isoladamente, com 0,2 e 0,4 mmol Cd kg-1

solo e com aplicação

conjunta de 0,4, 0,8 e 1,6 mmol Mn kg-1

solo Mn + 0,2 mmol Cd kg-1

solo aplicados no solo

30

(Figura 3 B). Por sua vez, aos 28 DAAT, as plantas controle e com menor concentração de

Mn, isoladamente, apresentaram valores superiores aos demais tratamentos (Figura 3 B e C).

Figura 3 - Condutância estomática ao vapor de água (gs) e transpiração foliar (E) de plantas jovens do

genótipo de T. cacao CCN 51, após aplicação de diferentes concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd no

solo. Valores médios de três repetições (± SE). As letras minúsculas indicam comparação entre os

tratamentos nos diferentes dias após a aplicação dos tratamentos (DAAT), pelo teste de Scott-Knott (p

<0,05). 28 DAAT (A); 4 DAAT (B); 28 DAAT (C). C - Controle.

31

A estimativa da eficiência intrínseca de uso da água (A/gs) mostrou que, em alguns

períodos de avaliação (1 e 14 DAAT), o tratamento controle foi superior à maioria dos

tratamentos (Figura 4 A e C). Em geral, a aplicação conjunta de Mn e Cd no solo (1 e 28

DAAT) e a adição de 0,8 mmol Cd kg-1

solo (1 e 28 DAAT) resultaram em incremento nos

valores de A/gs. Aos sete DAAT, no tratamento correspondente a 0,8 mmol Mn kg-1

solo, os

valores médios de A/gs e A/E foram superiores aos demais tratamentos, cujo incremento foi de

mais de 60% em relação ao controle (Figura 4 B e E).

Figura 4. Eficiência intrínseca (A/gs) e instantânea (A/E) do uso de água de plantas jovens do

genótipo de T. cacao CCN 51, após aplicação de diferentes concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd no

solo. Valores médios de três repetições (± SE). As letras minúsculas indicam comparação entre os

tratamentos, nos diferentes dias após a aplicação dos tratamentos (DAAT), pelo teste de Scott-Knott (p

<0,05). 1 DAAT (A); 7 DAAT (B); 14 DAAT (C); 28 DAAT (D); 7 DAAT (E). C - Controle.

32

4.1.2. Pigmentos fotossintéticos

Os teores de pigmentos cloroplastídicos em nível foliar, e suas relações, analisados aos

30 DAAT, apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos avaliados (Figura 5 A-

F). Quanto à concentração de Chl a, os tratamentos com 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Mn kg-1

solo, 0,4

e 0,6 mmol Cd kg-1

solo, 0,4 mmol Mn kg-1






solo e 1,6 mmol

Mn kg-1


solo foram estatisticamente iguais entre si, e superiores aos

demais tratamentos avaliados. A concentração de 0,8 mmol Mn kg-1

solo resultou no

incremento de 64% no teor de Chl a, quando comparada ao tratamento controle, ao passo que

a aplicação conjunta de 1,2 mmol Mn kg-1


solo resultou em

decréscimo de 38% em Chl a, em relação ao tratamento controle (Figura 5 A). Nos

tratamentos correspondentes às concentrações de 0,8 mmol Cd kg-1

solo e 0,8 mmol Mn kg-1


solo aplicados no solo apresentaram valores médios de 1,8 e 1,7 mg

Chl b g-1

MS e 3,1 e 3,0 mg Chl T g-1

MS, respectivamente, resultando no incremento de mais

de 400 e 200% nos teores de Chl b e Chl T, respectivamente, quando comparados ao controle.

Assim como para o teor de Chl a, o tratamento com 1,2 mmol Mn kg-1

solo + 0,6 mmol Cd

kg-1

solo apresentou a maior redução, tanto para Chl b quanto para Chl T, com decréscimos de

44 e 40%, respectivamente, em relação ao controle (Figura 5 B e C). Por outro lado, o teor de

Car foi similar para os tratamentos controle, 0,2 mmol Cd kg-1


solo

+ 0,2 mmol Cd kg-1

solo, com a maior média observada no tratamento controle (0,5 mg Car g-

1 MS). Além disso, a aplicação de 0,8 mmol Cd kg

-1 solo no solo resultou no decréscimo de

10%, aproximadamente, no teor de Car em relação ao controle (Figura 5 E).

33

Figura 5 - Teores de pigmentos fotossintéticos em folhas maduras de plantas jovens do genótipo de T.

cacao CCN 51, submetidas às concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd aplicadas no solo, 30 DAAT.

Valores médios de quatro repetições (± SE). As letras minúsculas indicam comparação entre

tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p <0,05). C - Controle.


O acúmulo de Mn nas raízes foi menor nos tratamentos de 0,2; 0,4; 0,6; e 0,8 mmol

Cd kg-1

solo, que corresponderam a 171,2; 150,0; 145,6 e 146,5 mg Mn kg-1

MS,

respectivamente. Nota-se que, nestes mesmos tratamentos de Cd, houve menor acúmulo de

Mn nas raízes quando comparado com o tratamento controle (224,4 mg Mn kg-1

MS), cujas

reduções foram de 24% (0,2 mmol Cd kg-1

solo), 33% (0,4 mmol Cd kg-1

solo) e 35% (0,6 e

0,8 mmol Cd kg-1

solo) (Figura 6 A). Por outro lado, o maior acúmulo de Mn nas raízes foi

observado nos tratamentos correspondentes a 1,6 mmol Mn kg-1


solo

34

+ 0,2 mmol Cd kg-1

solo, cujos valores foram de 355,1 e 354,7 mg Mn kg-1

MS. Nesses

tratamentos, houve incremento de aproximadamente 58% de Mn em relação ao controle

(Figura 6 A). Além disso, o teor de Mn nas folhas de plantas jovens do genótipo de T. cacao

CCN 51 variou de forma significativa entre os tratamentos avaliados. Verificou-se que os

tratamentos 1,2 mmol Mn kg-1



solo + 0,2

mmol Cd kg-1



solo foram estatisticamente

superiores aos demais, apresentando incremento no acúmulo de Mn de 105, 115 e 102%,

respectivamente, quando comparados ao tratamento controle (sem adição de Mn e Cd no

solo), o qual apresentou a menor concentração de Mn em nível foliar (Figura 6 B).

Nas raízes, os tratamentos controle, 0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Mn kg-1

solo

apresentaram acúmulo de Cd semelhante ao verificado para folhas, com os teores de Cd

variando entre 1,5 e 2,3 mg Cd kg-1

MS. O tratamento com 1,6 mmol Mn kg-1

solo + 0,8

mmol Cd kg-1

solo apresentou a maior concentração de Cd no sistema radicular, com um

acúmulo de 293 mg Cd kg-1

MS (Figura 6 C). Quanto ao acúmulo de Cd nas folhas, os

tratamentos controle, 0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Mn kg-1

solo apresentaram os menores teores de

metal, cujos valores foram de 2,0, 2,4, 3,3 e 3,4 mg Cd kg-1

MS, respectivamente. Por outro

lado, o tecido foliar dos tratamentos com 1,2 mmol Mn kg-1


solo e

1,6 mmol Mn kg-1


solo apresentaram os maiores valores médios

(581,5 e 570,2 mg Cd kg-1

MS, respectivamente), muito superiores ao tratamento controle

(Figura 6 D).

35

Figura 6 - Concentrações de Mn e Cd em raízes (A e C) e folhas (B e D) de plantas jovens do

genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd aplicadas no solo,

30 DAAT. Valores médios de quatro repetições (± SE). As letras minúsculas indicam comparação

entre tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p <0,05). C - Controle.

4.3. Teor de Prolina

O teor de prolina analisado em folhas coletadas 30 DAAT apresentou variação

significativa (p<0,05) entre os tratamentos avaliados. Observou-se que as folhas maduras de

plantas submetidas aos tratamentos controle, 0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Mn kg-1

solo Mn, 0,2

mmol Cd kg-1

solo e as interações 0,4 mmol Mn kg-1


solo e 1,6

mmol Mn kg-1


solo apresentaram os menores teores de prolina, com

valores médios variando entre 2,3 e 4,1 µmol (prolina) g-1

MS. Os tratamentos 0,4 e 1,2 mmol

Mn kg-1



solo apresentaram os menores

teores médios de prolina (Figura 7), cujos decréscimos foram de 47, 40 e 22%,

respectivamente, em relação ao tratamento controle. Verificou-se, também, que o incremento

da concentração de Cd no solo contribuiu para o aumento do teor de prolina nas folhas,

quando comparado ao tratamento controle, mesmo quando associado às concentrações de Mn

no solo. O tratamento com a maior concentração de Cd aplicado no solo (0,8 mmol Cd kg-1

de

36

solo) apresentou, quando comparado ao controle, incremento de 280% no teor de prolina

foliar (Figura 7). Por outro lado, o maior teor de prolina foi verificado no tratamento cuja

interação envolveu as maiores concentrações de Mn e Cd aplicadas ao solo (1,6 mmol Mn kg-

1 solo + 0,8 mmol Cd kg

-1 solo), com valor médio de 26,2 µmol (prolina) g

-1 MS,

correspondente a um incremento de 680% em relação ao controle (Figura 7).

Figura 7 - Teor de prolina em folhas de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a

concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd aplicadas no solo, 30 DAAT. Valores médios de quatro

repetições (± SE). As letras minúsculas indicam comparação entre tratamentos pelo teste de Scott-

Knott (p <0,05). C - Controle.

4.4. Peroxidação Lipídica

A partir da análise da atividade de substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS), realizadas em folhas maduras coletadas 30 DAAT, verificaram-se diferenças

significativas (p<0,05) entre os tratamentos analisados. Os tratamentos contendo diferentes

concentrações de Mn associados com a menor concentração de Cd (0,4 mmol Mn kg-1

solo +

0,2 mmol Cd kg-1




37


solo; e 1,6 mmol Mn kg-1


solo), juntamente

com o tratamento 1,2 mmol Mn kg-1


solo, apresentaram menores

danos às membranas celulares (Figura 8), correspondendo a decréscimos de 33, 32, 28 e 34%,

respectivamente, quando comparados ao tratamento controle. Além disso, a maior

concentração de Cd no solo (0,8 mmol de Cd kg-1

solo) proporcionou um incremento de

aproximadamente 18% na peroxidação lipídica, em relação ao controle (Figura 8). Por outro

lado, os tratamentos com 0,6 mmol Cd kg-1


solo + 0,8 mmol Mn kg-1

solo apresentaram os maiores danos às membranas celulares, com incrementos de 48 e 42%,

respectivamente, em relação ao controle (Figura 8).

Figura 8 - Peroxidação lipídica, definida como concentração de substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico (TBARS), em folhas de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a

concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd aplicadas no solo, 30 DAAT. Valores médios de quatro

repetições (±SE). As letras minúsculas indicam comparação entre tratamentos pelo teste de Scott-

Knott (p <0,05). C - Controle.

38


4.5.1 Atividade da dismutase do superóxido (SOD)

A atividade de SOD em folhas maduras de plantas jovens de T. cacao, submetidas a

diferentes concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd no solo, apresentou variação significativa (p

<0,05) entre os tratamentos (Figura 9). Verificou-se maior atividade de SOD para a maioria

dos tratamentos, independente do tempo de exposição das plantas aos metais, incluindo os

tratamentos controle, as duas maiores concentrações de Mn (1,2 e 1,6 mmol kg-1

solo) e de Cd

(0,6 e 0,8 mmol kg-1

solo) e o tratamento com as maiores concentrações de Mn + Cd (1,6

mmol Mn kg-1


solo) (Figura 9 A-F). Por outro lado, o tratamento 0,8

mmol Mn kg-1


solo apresentou atividades de SOD inferiores às

observadas nos tratamentos com os metais aplicados de forma isolada, principalmente às 6,

24, 48 e 96 h AAT, com reduções de 64, 57, 76 e 55%, respectivamente, quando comparados

ao tratamento controle (Figura 9 B, D, E, F).

39

Figura 9 - Atividade de SOD em folhas de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51,

submetidas a concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd aplicadas no solo, em diferentes períodos após a

aplicação dos tratamentos (AAT). Valores médios de quatro repetições (± SE). As letras minúsculas

indicam comparação entre tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). 3 h AAT (A); 6 h AAT (B);

12 h AAT (C); 24 h AAT (D); 48 h AAT (E); 96 h AAT (F). C - Controle.

4.5.2. Atividade da catalase (CAT)

As plantas jovens de T cacao submetidas a diferentes concentrações de Mn e Cd e Mn

+ Cd aplicados no solo apresentaram diferenças significativas (p <0,05) quanto à atividade

foliar de CAT (Figura 10). A atividade da CAT aumentou nas folhas das plantas submetidas

ao tratamento 0,8 mmol Cd kg-1

solo, maior concentração de Cd aplicado no solo,

principalmente às 3, 6, 12, 24 e 96 h AAT (Figura 10 A-D e F). Estes aumentos, quando

comparados ao controle, corresponderam a 34, 22, 54, 15 e 68%, respectivamente. Por outro

lado, as menores atividades de CAT foram observadas nos tratamentos 0,4 mmol Mn kg-1

solo

40

+ 0,8 mmol Cd kg-1



solo (24 h AAT) e 0,4

mmol Mn kg-1


solo (96 h AAT), com decréscimos de 67, 70 e 56%,

respectivamente, em relação ao tratamento controle (Figura 10 D e F).

Figura 10 - Atividade de CAT em folhas de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51,


aplicação dos tratamentos (AAT). Valores médios de quatro repetições (±SE). As letras minúsculas

indicam comparação entre tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p <0,05). 3 h AAT (A); 6 h AAT

(B); 12 h AAT (C); 24 h AAT (D); 48 h AAT (E); 96 h AAT (F). C - Controle.

4.5.3. Atividade da peroxidase do guaiacol (GPX)

Ao avaliar a atividade de GPX nas folhas de plantas jovens de T. cacao, observaram-

se variações significativas (p<0,05) quanto aos picos de atividade dessa enzima (Figura 11),

em todos os horários de avaliação. Houve maior variação significativa na atividade da enzima

GPX para os tratamentos 1,6 mmol Mn kg-1


solo (3 h AAT) e 1,2

mmol Mn kg-1


solo (3 e 6 h AAT), cujos incrementos

41

corresponderam a 275, 283 e 306%, respectivamente, em relação ao tratamento controle

(Figura 11 A e B). Por outro lado, as reduções mais significativas na atividade desta enzima,

quando comparadas ao tratamento controle, foram observadas nos tratamentos 1,2 mmol Mn

kg-1

solo (3 h AAT) e 1,6 mmol Mn kg-1


solo (48 h AAT), com

decréscimos de 51 e 61%, respectivamente (Figura 11 A e E).

Figura 11. Atividade de GPX em folhas de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51,


aplicação dos tratamentos (AAT). Valores médios de quatro repetições (±SE). As letras minúsculas

indicam comparação entre tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p <0,05). 3 h AAT (A); 6 h AAT

(B); 12 h AAT (C); 24 h AAT (D); 48 h AAT (E); 96 h AAT (F). C - Controle.


Houve alterações significativas (p<0,05) na expressão relativa de cinco genes

avaliados em folhas de plantas jovens do genótipo T. cacao CCN 51 submetidas aos

diferentes tratamentos de Mn, Cd e Mn + Cd, sendo dois genes relacionados à biossíntese de

42

proteínas de PS2 [uma intrínseca, (psbA) e outra extrínseca (psbO)]; dois relacionados ao

estresse oxidativo (Cu-Zn sodcyt e Cu-Zn sodchl) e um envolvido no seqüestro de metais no

citosol (met2b) (Figura 12). Observou-se, 48 h após da aplicação dos tratamentos, que os

maiores números de transcritos, referentes aos genes avaliados, ocorreram na interação 0,4

mmol Mn kg-1


solo, cujas expressões aumentaram cerca de 2 a 4

vezes em relação ao controle (Figura 12 A). Por sua vez, verificou-se, também, às 48 h AAT,

que as maiores repressões na transcrição desses genes ocorreram na maior concentração de

Mn aplicada de forma isolada no solo (6 mmol Mn kg-1

). Por outro lado, as respostas

observadas às 96 h AAT foram bastante discrepantes em relação ao horário anterior. O gene

psbA foi expresso em todos os tratamentos avaliados, entretanto, sua maior expressão relativa

foi verificada no tratamento correspondente a 1,6 mmol Mn kg-1

solo, cerca de 6 vezes maior

que o tratamento controle (Figura 12 B). Por outro lado, a maior expressão relativa do gene

psbO foi observada na maior concentração de Cd aplicado ao solo (0,8 mmol Cd kg-1

solo),

cujo valor foi cerca de 3 vezes maior em relação ao controle. Além disso, os genes sodcyt e

sodchl, envolvidos na biossíntese de SOD, foram superexpressos somente às 96 h AAT, no

tratamento correspondente a 1,2 mmol Mn kg-1


solo, enquanto que

nos demais tratamentos houve repressão destes genes (Figura 12 B). Para o gene da

metalotioneína (met2b), relacionado com o sequestro de metais no citosol, houve repressão na

maioria dos tratamentos às 96 h AAT, exceto para o tratamento com a concentração de 1,6

mmol Mn kg-1

solo, que apresentou expressão semelhante ao controle (Figura 12 B).

43

0

1

2

3

4

5

6

7

psbA psbO sod cyt sod chl met2b

Exp

ress

ão R

elati

va d

os

Gen

esA

a

c

a

aa

a

b

b

b

b

b

cd

cc

c cc

c

f ed

dd

dee

e ff

0

1

2

3

4

5

6

7

psbA psbO sod cyt sod chl met2b

Exp

ress

ão R

elati

va d

os

Gen

es Controle

1,6 Mn + 0,0 Cd

0,0 Mn + 0,8 Cd

1,2 Mn + 0,2 Cd

0,8 Mn + 0,4 Cd

0,4 Mn + 0,6 Cd

Ba

aaa

a

abb

b

b

bbbb

c

c

cd ccccc

cdd

c

e de

Tratamento (mmol kg-1 solo)

Figura 12 - Expressão relativa de genes associados à biossíntese de proteínas de PS2 (psbA e psbO),

do metabolismo antioxidativo (sodcyt e sodchl) e da quelação de metais (met2b) em folhas de plantas

jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Mn e Cd, e Mn +

Cd aplicadas no solo, às 48 h (A) e 96 h (B) após a aplicação dos tratamentos. Valores médios

intragenes seguidos pelas mesmas letras minúsculas não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott

(p<0,05). Valores médios de quatro repetições (± SE).

4.7. Análises micromorfológica e ultraestrutural

4.7.1. Anatomia e micromorfologia foliar

Verificou-se que os maiores valores médios das espessuras do parênquima esponjoso

(PE), mesofilo total (MT) e total da folha (EF) e da abertura transversal do estômato (TOS) e

de TOS*LOS (abertura longitudinal do estômato) foram encontrados no tratamento com

maior concentração de Cd (0,8 mmol Cd kg-1

solo) (Tabela 4). Contudo, o tratamento 0,8

mmol Cd kg-1

solo foi estatisticamente superior aos demais tratamentos apenas para PE e MT,

apresentando incremento aproximado de 53 e 23%, respectivamente, quando comparado ao

44

controle. O mesofilo foliar das plantas de T. cacao submetidas aos tratamentos de Mn, Cd e

Mn + Cd, aplicados no solo em diferentes concentrações, apresentou, em geral, uma única

camada de parênquima paliçádico (PP), e duas ou três camadas de pequenas células de

formato irregular formando PE, distribuídas nos espaços intercelulares formados (Figura 13

A-F).

45

Tabela 4 - Características anatômicas analisadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) de secções transversais de folhas de plantas

jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd aplicados ao solo. Valores médios de

quatro repetições (± SE). Letras minúsculas indicam comparação entre tratamentos pelo teste de Scott-Knott (p<0,05). PP: parênquima

paliçádico; PE: parênquima esponjoso; EAd: superfície adaxial da epiderme; EAb: superfície abaxial; MT: mesofilo total; EF: espessura total da

folha; TOS: abertura transversal do estômato; LOS: abertura longitudinal do estômato; DE: densidade estomática.

Tratamento

(mmol kg-1

solo)

PP

(µm)

PE

(µm)

EAd

(µm)

EAb

(µm)

MT

(µm)

EF

(µm)

TOS

(µm)

LOS

(µm)

TOS*LOS

(µm²)

DE

(mm²)

Controle 21,6 ± 1,0 ns 25,8 ± 1,8 c 16,9 ± 1,4 ns 9,4 ± 1,1 a 48,1 ± 1,1 c 69,7 ± 1,8 a 2,2 ± 0,2 a 5,2 ± 0,4 a 11,7 ± 1,7 a 551 ± 16,4 c

0,8 Mn + 0 Cd 18,4 ± 1,4 ns 32,2 ± 2,9 b 15,0 ± 1,4 ns 5,6 ± 0,5 b 50,6 ± 2,8 b 71,2 ± 3,7 a 1,3 ± 0,3 b 3,3 ± 0,3 b 4,6 ± 1,4 b 817 ± 22,8 a

1,6 Mn + 0 Cd 18,9 ± 0,6 ns 25,2 ± 2,2 c 15,4 ± 1,2 ns 6,9 ± 0,5 b 44,0 ± 2,6 c 66,8 ± 2,9 b 1,6 ± 0,0 b 4,1 ± 0,2 b 6,8 ± 0,6 b 688 ± 23,4 b

0 Mn + 0,4 Cd 19,0 ± 0,5 ns 26,9 ± 0,9 c 12,2 ± 1,0 ns 7,2 ± 0,3 b 45,9 ± 1,3 c 66,9 ± 1,3 b 1,8 ± 0,2 b 3,9 ± 0,6 b 7,4 ± 2,1 b 686 ± 36,7 b

0 Mn + 0,8 Cd 21,3 ± 0,5 ns 39,4 ± 4,5 a 15,2 ± 0,7 ns 7,2 ± 0,5 b 60,7 ± 4,1 a 85,4 ± 1,9 a 2,9 ± 0,4 a 4,9 ± 0,3 a 14,3 ± 2,9 a 688 ± 17,9 b

1,2 Mn + 0,2 Cd 20,5 ± 1,0 ns 22,8 ± 1,2 c 15,0 ± 0,9 ns 6,1 ± 0,2 b 43,3 ± 0,9 c 66,5 ± 0,9 b 2,2 ± 0,2 a 4,0 ± 0,2 b 8,8 ± 0,9 b 749 ± 4,9 a

0,8 Mn + 0,4 Cd 18,1 ± 1,1 ns 22,8 ± 2,8 c 12,6 ± 0,6 ns 7,1 ± 0,5 b 40,9 ± 3,8 c 64,2 ± 3,2 b 2,0 ± 0,2 b 4,8 ± 0,4 a 10,2 ± 1,8 a 807 ± 20,2 a

0,4 Mn + 0,6 Cd 22,0 ± 1,2 ns 31,1 ± 3,6 b 15,3 ± 1,2 ns 8,8 ± 0,6 a 53,1 ± 3,6 b 78,4 ± 3,2 a 1,9 ± 0,1 b 4,1 ± 0,2 b 7,8 ± 0,4 b 649 ± 66,6 b

46

Figura 13 - Micromorfologia de secções transversais, obtidas com o uso do MEV, do mesofilo foliar

(A-H) de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a concentrações de Mn, Cd e

Mn + Cd aplicados no solo: Controle (A); 0,8 mmol Mn kg-1

solo (B); 1,6 mmol Mn kg-1

solo (C); 0,4

mmol Cd kg-1

solo (D); 0,8 mmol Cd kg-1

solo (H). PP: parênquima paliçádico; PE: parênquima

esponjoso; EAd: superfície adaxial da epiderme; EAb: superfície abaxial; MT: mesofilo total; EF:

espessura total da folha. Barra: 30 µm.

47

4.7.2. Ultraestrutura celular de folhas e raízes

A análise de microscopia eletrônica de transmissão (MET) permitiu observar

alterações na ultraestrutura celular de tecidos foliares e radiculares de plantas jovens do

genótipo de T. cacao CCN 51, causadas após a aplicação de concentrações de Mn, Cd e suas

interações no solo (Figura 14). Nas células do tecido foliar de plantas submetidas aos

tratamentos controle, 0,8 e 1,6 mmol Mn kg-1

solo, os orgânulos celulares, assim como

núcleo, mitocôndrios, cloroplastos e vacúolos, bem como a parede celular, permaneceram sem

danos (Figura 14 A-C). Os demais tratamentos também apresentaram integridade dos

orgânulos celulares, porém, pode-se observar a presença de vesículas e de material

eletrodenso no vacúolo (0,4 mmol Cd kg-1

solo); a condensação da cromatina com indícios de

morte celular programada (MCP) e rompimento da membrana do cloroplasto e material

eletrodenso no vacúolo (0,8 mmol Cd kg-1

solo); e a deposição de material eletrodenso no

xilema (0,4 mmol Mn kg-1


solo), indicando possível transporte de

metais para o cloroplasto (Figura 14 E, F e H). Além disso, foi observada a presença de amido

e de uma grande quantidade de plastoglóbulos nos cloroplastos, em todos os tratamentos

avaliados.

48

Figura 14 - Eletromicrografias de secções transversais do mesofilo foliar (A-H), obtidas com o uso do

MET, de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a concentrações de Mn, Cd e

Mn + Cd aplicados no solo aos 30 DAAT. Controle (A); 0,8 mmol Mn kg-1

solo (B); 1,6 mmol Mn kg-

1 solo (C); 0,4 mmol Cd kg

-1 solo (D); 0,8 mmol Cd kg

-1 solo (E); 1,2 mmol Mn kg

-1 solo + 0,2 mmol

Cd kg-1

solo (F); 0,8 mmol Mn kg-1


solo (G); 0,4 mmol Mn kg-1

solo + 0,6

mmol Cd kg-1

solo (H). Setas pretas: indicam integridade do envoltório nuclear (A); Setas vermelhas:

presença de material eletrodenso (D, E e H); Setas brancas: presença de gotas de lipídeos no vacúolo

(F e G); Estrela amarela: indício de apoptose. n núcleo, mt mitocôndrios, cl cloroplastos, v vacúolos,

RE retículo endoplasmático, pc parede celular, am grãos de amido, pg plastoglóbulos, vs vesículas.

Barras: 1 µm (A); 2 µm (B, C, D, E, F, G, H).

49

Nas células de tecidos radiculares de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51,

nos tratamentos controle, 0,8 mmol Mn kg-1




solo não foram verificadas alterações ultraestruturais, cujos

orgânulos celulares se apresentaram intactos e sem anormalidades (Figura 15 A, B, C e F).

Entretanto, no tratamento correspondente a 0,4 mmol Cd kg-1

solo, foi observado rompimento

de membrana e desintegração do envoltório nuclear, evidenciando a presença de MCP (Figura

15 E). Além disso, verificou-se também a presença de material eletrodenso em células de

xilema, no tratamento 0,8 mmol Cd kg-1

solo, indicando possível transporte desses metais

para a parte aérea (Figura 15 E); em vacúolos, nos tratamentos 0,4 e 0,8 mmol Cd kg-1

solo

(Figura 15 D e E), e aderidos à parede celular em células nos tratamentos 0,8 mmol Mn kg-1




solo (Figura 15 G

e H). Evidenciou-se, também, a presença de uma grande quantidade de retículo

endoplasmático (Figura 15 D), que pode estar associada à formação de vesículas; e a retração

do citoplasma em células de tecidos radiculares, da maioria dos tratamentos, com a presença

de Cd nos tecidos.

50

Figura 15 - Eletromicrografias de secções transversais de raízes (A-H), obtidas com o uso do MET, de

plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a concentrações de Mn, Cd e Mn + Cd

aplicados no solo aos 30 DAAT. Controle (A); 0,8 mmol Mn kg-1

solo (B); 1,6 mmol Mn kg-1

solo

(C); 0,4 mmol Cd kg-1

solo (D); 0,8 mmol Cd kg-1

solo (E); 1,2 mmol Mn kg-1

solo + 0,2 mmol Cd kg-

1 solo (F); 0,8 mmol Mn kg

-1 solo + 0,4 mmol Cd kg

-1 solo (G); 0,4 mmol Mn kg

-1 solo + 0,6 mmol Cd

kg-1

solo (H). Setas pretas: indicam integridade do envoltório nuclear (A, B); Setas vermelhas:

envoltório nuclear se desfazendo, com indícios de núcleo em apoptose (D); Setas brancas: indicam

presença de material eletrodenso (E, G e H). n núcleo, mt mitocôndrios, RE retículo endoplasmático.

Barras: 1 µm (D); 2 µm (A, B, C, F, G e H); 5 µm (E).

51

5. DISCUSSÃO

5.1. Trocas gasosas foliares e pigmentos fotossintéticos

A adição de Mn no solo proporcionou incremento na fotossíntese das plantas jovens

de T. cacao, uma vez que este elemento metálico tem um papel importante no processo

fotossintético, pois está envolvido na oxidação da molécula de água em nível de PS2,

fornecendo uma quantidade de elétrons suficientes para a cadeia transportadora de elétrons da

fotossíntese, além de participar da ativação de várias enzimas envolvidas no metabolismo

celular (PENG et al., 2008; MILLALEO et al., 2010). Entretanto, tem sido relatado que o

excesso de Mn pode resultar na redução da assimilação de CO2, um dos principais efeitos

fitotóxicos de Mn (NABLE et al., 1988; KITAO et al., 1997; LI et al., 2010; MILLALEO et

al., 2013), fato não verificado neste trabalho.

As plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51 tiveram a fotossíntese líquida (A)

inibida após a aplicação de Cd no solo, em todos os tempos de avaliação. Normalmente, em

plantas superiores, o acúmulo de Cd nas folhas causa danos na maquinaria fotossintética, com

redução de A, gs e E (SANITÀ DI TOPPI; GABRIELLI, 1999; CLEMENS, 2006; MORADI;

EHSANZADEH, 2015; ARAÚJO et al., 2017), que pode ser atribuída a uma limitação no

suprimento de CO2 e ao fechamento parcial de estômatos, ocasionado tanto pela presença de

maior quantidade de íons nas células-guarda (DALCORSO et al., 2008; MORADI;

EHSANZADEH, 2015), quanto pela competição do Cd+2

com íons de Ca+2

e K+ (PERFUS-

BARBEOCH et al., 2002; NEDJIMI; DAOUD, 2009; MORADI; EHSANZADEH, 2015).

Entretanto, no presente trabalho, houve incremento de gs e E na presença da maior

concentração de Cd no solo, provavelmente devido à maior abertura transversal (TOS) e

longitudinal (LOS) dos estômatos (Tabela 4). Além disso, a maior absorção de Cd pelas

raízes, e consequente acúmulo na biomassa seca foliar, nos tratamentos contendo altas

concentrações de Cd (Figura 6C-D), pode estar relacionada com o decréscimo observado nos

parâmetros fotossintéticos das plantas jovens de T. cacao, mesmo quando associadas à adição

de Mn no solo. Mesmo assim, a ultraestrutura celular, em nível foliar, das plantas submetidas

ao Cd isoladamente não foram comprometidas, pois os cloroplastos permaneceram, em sua

maioria, íntegros (Figura 14).

No presente trabalho, a ação de Cd isoladamente no solo não comprometeu o teor de

Chl a nas folhas das plantas do genótipo de T. cacao CCN 51, entretanto e o teor de Chl b foi

52

maior no tratamento com maior concentração de Cd no solo (0,8 mmol Cd kg-1

solo) (Figura

5). A determinação dos teores de Chl a e b é um importante índice a cerca dos efeitos tóxicos

da poluição do ar e do estresse por metal pesado em plantas (JOSHI; SWAMI, 2009;

DEZHBAN et al., 2015), principalmente porque alguns metais, tais como Cd, podem

substituir o átomo central de Mg2+

da molécula de Chl, ocasionando diminuição no

rendimento quântico de PS2 (DEZHBAN et al., 2015). Vários estudos foram realizados para

compreender o efeito de Cd na redução dos teores de Chl a e b e carotenoides (Car) em

plantas submetidas ao estresse por Cd (BASZYNSKI et al., 1980; SKÓRZYŃSKA-POLIT;

BASZYŃSKI, 1995; MORADI; EHSANZADEH, 2015). Plantas crescidas em solos contendo

Cd apresentam clorose foliar, cuja principal causa é a degradação de moléculas de clorofila

(Chl a e Chl b), promovendo inibição de sua biossíntese e, consequentemente, redução no teor

de pigmentos (PARMAR et al., 2013; XUE et al., 2013).

Registros na literatura apontam para inexistência de um padrão definido quanto ao teor

de Car em plantas submetidas ao estresse por Cd (PARMAR et al., 2013). No presente

trabalho, houve decréscimo no teor de Car nas plantas submetidas ao tratamento com maior

concentração de Cd no solo (0,8 mmol Cd kg-1

solo). Araújo et al. (2017), trabalhando com

plantas jovens de T. cacao, submetidas a diferentes concentrações de Cd no solo, também

verificaram redução acentuada do teor de Car em nível foliar. O mesmo fato foi verificado em

Pisum sativum (HATTAB et al., 2009). Por outro lado, também há relatos de incremento no

teor de Car em folhas de plantas de Cucumis sativus e Zea mays submetidas a diferentes

concentrações de Cd (BURZYNSKI; ZUREK, 2007; CHANEVA et al., 2010). A ausência de

efeitos deletérios no teor de Chl pode estar relacionada à concentração foliar de Mn, uma vez

que Cd pode não estar afetando a função de Mn na evolução de O2 fotossintético. Além disso,

Mn pode restaurar parcialmente as estruturas dos cloroplastos, revertendo o efeito inibitório

de Cd na atividade de PS2 (BASZYNSKI et al., 1980), conforme observado na ultraestrutura

foliar do presente trabalho, cujos cloroplastos dos tratamentos avaliados se apresentaram, em

sua grande maioria, íntegros (Figura 14).


As plantas do genótipo de T. cacao CCN 51 avaliadas apresentaram altas

concentrações de Mn, principalmente nas folhas, tanto nas plantas controle (sem adição de

53

Mn e Cd no solo) quanto nas plantas submetidas a diferentes concentrações de Cd e Cd + Mn

no solo. Por outro lado, a absorção de Mn pelas raízes foi comprometida devida adição das

diferentes concentrações de Cd no solo. Essa redução está relacionada à competição de Cd2+

com cátions divalentes, a exemplo de Mn2+

(ZORNOZA et al., 2002), uma vez que esses

elementos compartilham sistemas comuns de transporte de minerais em plantas (HART et al.,

1998; CLEMENS, 2006; CLEMENS; MA, 2016). As plantas de T. cacao, mesmo sob

condições estressantes, têm a capacidade de acumular grande quantidade de Mn nas folhas,

sem lhe causar toxicidade (ALMEIDA et al., 2015; CASTRO et al., 2015; REIS et al., 2015;

ARAÚJO et al., 2017). A maior absorção e o acúmulo de Mn nas plantas podem estar

relacionados ao fato de que Mn seja um cofator imprescindível na via de oxidação da

molécula de água em nível de PS2 (BURNELL, 1988; DUCIC; POLLE, 2005), além de atuar

em mecanismos de redução da fitoxicidade de Cd (SARWAR et al, 2010).

A concentração de Cd nos tecidos vegetais analisados foi praticamente inexistente nas

plantas controle e nas plantas que houve somente aplicação de Mn no solo. A interação entre

maiores concentrações de Mn e menores concentrações de Cd (0,2 e 0,4 mmol Cd kg-1

MS)

aplicados no solo também não traduziram em maior absorção e translocação de Cd da raiz

para a parte aérea no genótipo de T. cacao CCN 51. Entretanto, a interação entre as maiores

concentrações de Mn e Cd (1,6 mmol Mn kg-1


solo) favoreceu a

maior absorção de Cd pelas raízes e acúmulo nas folhas. Cd não possui nenhuma função

específica nas plantas, e sua ação causa interferência negativa nos processos fisiológicos das

plantas, limitando a produtividade das principais culturas em todo o mundo (GILL et al.,

2012). Solos contaminados por Cd tem suas propriedades afetadas, principalmente na região

da rizosfera, a qual influencia a absorção dos nutrientes minerais essenciais para o

crescimento e desenvolvimento das plantas (NAZAR et al., 2012). Além disso, o efeito

fitotóxico de Cd na absorção de nutrientes minerais está relacionado com o nível de

contaminação do solo, tempo de exposição ao metal, características químicas e físicas do solo,

bem como espécie vegetal e sua capacidade de tolerância a metais tóxicos (BHARGAVA et

al., 2012; NAZAR et al., 2012; HE et al., 2015).

54


A toxicidade dos metais pesados ocorre de muitas maneiras quando acumulados em

níveis elevados nas células vegetais. O estresse provocado por metais pesados, inclusive o Cd,

desencadeia também o estresse oxidativo, produzindo espécies reativas de oxigênio (ERO's),

que danificam proteínas, membranas e até mesmo as moléculas de DNA, induzindo,

consequentemente, à morte celular programada (MCP) (MITTLER, 2002). Para evitar que as

ERO's prejudiquem o maquinário fotossintético, de forma irreversível, existem metabolismos

enzimáticos e não enzimáticos que atuam na eliminação de ERO's (GILL; TUTEJA, 2010).

Nesse contexto, a prolina, que é um osmólito essencial para as plantas sobre estresse, atua

como um importante agente antioxidante não enzimático capaz de eliminar as ERO's,

produzidas durante a condição estressante, e de inibir MCP (CHEN; DICKMAN, 2005;

GILL; TUTEJA, 2010).

O tratamento 1,6 mmol Mn kg-1


solo, correspondente às

maiores concentrações de Mn + Cd aplicados no solo, apresentou o maior acúmulo de prolina

no tecido foliar entre os tratamentos avaliados (Figura 7). Esse acúmulo de prolina coincidiu

com o maior acúmulo de Cd, o qual foi verificado para o mesmo tratamento (Figura 6B),

podendo, portanto, a prolina ter contribuído para atenuar um provável efeito danoso causado

pelo excesso de Cd nas folhas desse tratamento. O acúmulo de prolina, em resposta ao

estresse por metal pesado, tem sido relatado por diversos autores (BASSI; SHARMA, 1993

a,b; SHARMA; DIETZ, 2008), inclusive em microalgas, onde foi verificado que o aumento

nas concentrações de prolina fornece proteção aprimorada contra Cd (SIRIPORNADUSIL et

al., 2002). É importante salientar que a prolina reduz o estresse por Cd não pelo sequestro do

metal, mas pela redução do dano causado pelo Cd por meio da formação de ERO’s e pela

manutenção de um ambiente redutor rigoroso no interior da célula (HOSSAIN et al., 2010).

A integridade das membranas celulares do tecido foliar foi avaliada a partir dos níveis

de peroxidação lipídica. Este é um dos processos mais prejudiciais aos organismos vivos, que

ocorre quando os níveis de ERO’s sobrepujam os limites de eliminação e afeta o

funcionamento normal das células, promovendo o estresse oxidativo e, consequentemente,

produzindo radicais derivados de lipídios (MONTILLET et al., 2005; GILL; TUTEJA, 2010).

As concentrações de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) dos tratamentos

submetidos somente ao Cd foram superiores ao tratamento controle (exceto 0,4 mmol Cd kg-1

solo), principalmente na concentração de 0,6 mmol Cd kg-1

solo, sugerindo que a presença do

55

Cd provocou alterações nas membranas celulares (Figura 8), devido à degradação lipídica.

Entretanto, mesmo com o aumento no teor de TBARS nos tratamentos contendo somente Cd,

a análise ultraestrutural das folhas permitiu observar que a maioria das células permaneceu

com suas membranas intactas (Figura 14 D e E). Embora muitos autores relatasse o aumento

no teor de TBARS após submeter às plantas de várias espécies a diferentes tratamentos com

Cd (CHAOUI et al., 1997; SINGH; TEWARI 2003; WU et al., 2003b). Por outro lado, a

associação entre as diferentes concentrações de Mn (0,4, 0,8, 1,2 e 1,6 mmol Mn kg-1

solo) e a

menor concentração de Cd (0,2 mmol Cd kg-1

solo) demonstrou claramente a redução do teor

de TBARS nesses tratamentos (Figura 8), indicando atenuação nos danos às membranas

celulares causados por peroxidação lipídica.

O acúmulo de Cd nos tecidos vegetais interfere negativamente em diversos processos

metabólicos essenciais, levando à toxicidade pela geração de ERO’s, causando danos

oxidativos (SANITÀ DI TOPPI; GABBRIELLI, 1999; FOYER; NOCTOR, 2005; GILL;

TUTEJA, 2010; GILL et al., 2011). Nesse sentido, o aumento da atividade das enzimas

antioxidativas é considerado como resposta geral ao excesso de metais traços no solo,

resultando em proteção contra perturbações e danos celulares (MITTLER, 2002). A enzima

SOD apresentou alta atividade na maioria dos tratamentos, sendo estatisticamente igual ao

tratamento controle (Figura 9). A SOD constitui a primeira linha de defesa contra ERO’s,

catalisando a dismutação do O2•-

a H2O2 e O2 (GILL; TUTEJA, 2010). A atividade de SOD

tende a aumentar em plantas sob estresses induzidos por Cd (KHAN et al., 2007; GOMES et

al., 2012; ARAÚJO et al., 2017) e a sua resposta aos estresses por metal, incluindo Cd, é

variável e depende da espécie vegetal, de sua fase de desenvolvimento e da concentração e do

tempo de exposição ao metal (GALLEGO et al., 2012; GILL et al., 2015). Por sua vez, Mn,

como metal tóxico, pode provocar, quando em excesso, distúrbios metabólicos e danos em

macromoléculas em consequência da produção em excesso de ERRO’s (HEGEDUS et al.,

2001; POLLE, 2001; DEMIREVSKA-KEPOVA et al., 2004). Alguns autores afirmam que o

excesso de Mn causa desorganização no cloroplasto e que a elevada atividade de SOD

ameniza o dano celular (LINDON; TEIXEIRA, 2000). No presente trabalho, a atividade de

SOD, nos tratamentos com maior concentração de Mn (1,6 mmol Mn kg-1

solo), foi elevada e

não diferenciou dos tratamentos controle e 0,8 mmol Cd kg-1

solo. Entretanto, não foram

verificadas alterações na ultraestrutura dos cloroplastos (Figura 12C).

As atividades de CAT e GPX apresentaram variação em relação à atividade de SOD

(Figuras 10 e 11). A atividade de CAT foi maior no tratamento correspondente a 0,8 mmol Cd

56

kg-1

solo, em todos os tempos de exposição ao metal, exceto às 48 h AAT (Figura 10). Um

aumento na atividade de CAT é considerado uma evidência direta de danos oxidativos

(SAIRAM; SEXENA, 2000; KHAN et al., 2007). Por sua vez, a maior atividade de GPX não

coincidiu com a maior concentração de Cd aplicada isoladamente no solo. Os tratamentos

com Mn + Cd aplicados no solo apresentaram as maiores atividades de GPX, nos diferentes

tempos de exposição aos metais (Figura 11). Além disso, tanto CAT quanto GPX têm

potencial para converter H2O2 em H2O + O2, sendo importantes para a desintoxicação de

ERO’s em plantas sob condições estressantes (MONTILLET et al., 2005, GILL; TUTEJA,

2010). Entretanto, CAT foi mais eficiente do que GPX na eliminação de H2O2 gerado nos

tratamentos contendo somente Cd, principalmente a maior concentração (0,8 mmol Cd kg-1

solo).


As plantas quando submetidas a estresse biótico ou abiótico são acometidas por uma

explosão oxidativa desencadeando uma série de respostas no maquinário antioxidante e na

regulação da expressão gênica (GILL; TUTEJA, 2010). Contudo, mecanismos de proteção

contra ERO’s têm sido desenvolvidos pelas plantas, como um processo evolutivo para

controlar os níveis dessas moléculas e anular a sua toxicidade (LOGAN, 2006).

Observou-se aumento no número de transcritos para todos os genes avaliados às 48 h

AAT, principalmente para os tratamentos com concentrações de 1,2 mmol Mn kg-1

solo + 0,2

mmol Cd kg-1



solo (Figura 12 A).

Verificou-se aumentos de, aproximadamente, 2,5, 6,5, 3,7, 3,9 e 5,0 vezes para os transcritos

dos genes psbA, psbO, sodcyt, sodchl e met2b, respectivamente, em relação ao controle, para

o tratamento com concentração de 0,4 mmol Mn kg-1


solo. Por outro

lado, às 96 h AAT, os tratamentos com as maiores concentrações de Mn e Cd, aplicados

isoladamente no solo (1,6 mmol Mn kg-1

solo e 0,8 mmol Cd kg-1

solo), foram os que

apresentaram o maior número de transcritos de psbA e psbO, com valores 6,5 e 1,8 vezes

maior do que o controle, respectivamente (Figura 12 B). O acúmulo de transcritos de psbA, às

96 h AAT, observado para o tratamento com concentração de 1,6 mmol Mn kg-1

solo (Figura

12 B), pode estar relacionado com a biossíntese da proteína D1, para manutenção dos níveis

dessa proteína na célula, uma vez que podem ser facilmente danificadas (SANTOS et al.,

57

2014). Pois, o gene psbA participa na codificação da proteína D1, a principal proteína

intrínseca de PS2, envolvida no transporte fotossintético de elétrons, que pode ser facilmente

degradada e sintetizada continuamente sob estresse e afetada pelos mecanismos oxidativos

induzidos por Cd (GIARDI et al., 1996; MØLLER et al., 2007). Por outro lado, a exposição

de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51 aos tratamentos com 0,4 mmol Mn kg-1


solo e 0,8 mmol Cd kg-1

solo estimulou o aumento na transcrição do

gene psbO às 48 e 96 h AAT, respectivamente, provavelmente para evitar danos ao PS2. A

proteína PsbO, codificada pelo gene psbO, está relacionada com a estabilização do complexo

de evolução do oxigênio de PS2 e tem importância fundamental na fotossíntese

(MURAKAMI et al., 2005) por desempenhar função protetora ao aparato fotossintético sob

condições de estresse (PAWLOWICZ et al., 2012; NICKELSEN; RENGSTL, 2013).

O aumento da expressão dos genes Cu-Zn sodcyt, Cu-Zn sodchl e mt2b sugerem a

existência de um mecanismo de defesa contra o estresse oxidativo e a tolerância à toxicidade

causada após aplicação de Mn e Cd e de Mn + Cd no solo, uma vez que os genes Cu-Zn

sodcyt, Cu-Zn sodchl codificam enzimas antioxidantes (LEE et al., 2007). Por outro lado, as

metalotioneínas são pequenos polipeptídios ricos em cisteína, codificados geneticamente, cuja

expressão é induzida por diversos fatores como senescência, estresse oxidativo e,

principalmente, por metais como Cd, Cu e Zn (ZHOU; GOLDSBROUGH, 1994; GUO et al.,

2003; MIR et al., 2004; WONG et al., 2004, DALCORSO et al., 2013). A metalotioneína,

codificada pelo gene mt2b, atua na imobilização, sequestro e desintoxicação de Cd e de outros

íons metálicos (CAPDEVILA; ATRIAN, 2011), inativando-os e, ou transportando-os para o

vacúolo (SUNITHA et al., 2012).

5.5. Micromorfologia e ultraestrutura celular

As observações em microscopia eletrônica de varredura (MEV), realizadas em tecido

foliar, mostraram variações na anatomia foliar das amostras submetidas à aplicação de

concentrações distintas de Mn, Cd e de Mn + Cd no solo. A maior espessura de SP e,

consequentemente, de TM e TFT no tratamento 0,8 mmol Cd kg-1

solo pode estar relacionada

à ausência ou a pouca destruição das células no tecido foliar. Sandalio et al. (2001),

trabalhando com Pisum sativum, também encontraram aumento na espessura do mesofilo

foliar com o incremento da concentração de Cd. Entretanto, outros trabalhos evidenciam a

58

redução dos parâmetros morfométricos foliares em função de altas concentrações de Cd,

como em Arachis hypogaea (SHI; CAI, 2008), Solanum lycopersicum (DJEBALI et al.,

2010), Zea mays (GOWAYED; ALMAGHRABI, 2013), Glycine max (PÉREZ-CHACA et

al., 2014).

Normalmente, Cd afeta diretamente a expansão foliar (DJEBALI et al., 2005),

reduzindo o tamanho das células, dos parênquimas e dos espaços intercelulares, o que pode

ser explicado pela ação deletéria do metal sobre a turgescência celular e a plasticidade da

parede celular (BARCELÓ et al., 1986). Existem relatos que o estresse por Cd reduz o

tamanho do poro estomático e, ou o fechamento estomático, o que pode ser considerado uma

medida protetora ou um mecanismo para atenuar o efeito tóxico nas plantas (GUPTA;

GHOUSE, 1987; KHUDSAR et al., 2001). Entretanto, foi observado neste trabalho aumento

na abertura tanto transversal quanto longitudinal dos estômatos, após adição de 0,8 mmol Cd

kg-1

solo no solo, o que pode ter levado ao incremento em gs e E aos 28 DAAT, além de um

ligeiro aumento na absorção e transporte deste elemento metálico para as folhas.

As análises ultraestruturais em células de tecidos foliares e radiculares de plantas

jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, submetidas a diferentes concentrações de Mn e Cd e

Mn + Cd aplicados no solo, revelaram alterações, principalmente nos tratamentos contendo

Cd isolado ou associado com Mn (Figura 14 C-F, L, M, O e P). Embora apresentasse elevado

acúmulo de Mn (Figura 6 A), muito acima da faixa de suficiência adotada para T. cacao, de

150-750 mg kg-1

MS (SOUZA JÚNIOR et al., 2012), não foram observadas alterações

ultraestruturais ou danos celulares nos tecidos foliares dos tratamentos com 0,8 e 1,6 mmol

Mn kg-1

solo Mn (Figura 14 B e C). Esse fato sugere a hipótese de que plantas de T. cacao

possuem a capacidade de absorver e acumular grande quantidade de Mn sem causar

toxicidade. Por sua vez, plantas submetidas ao Cd, isolado ou associado com Mn,

apresentaram deposição de material eletrodenso aderido à parede celular, no vacúolo e no

xilema (Figura 14 D, E e H), além de corpos vesiculares, gotas de lipídios no vacúolo (Figura

14 D, F e G) e plastoglóbulos (Figura 14 B-H). No entanto, a maioria das imagens analisadas

mostrou integridade celular e com a estrutura dos cloroplastos inalterada.

A toxicidade de Cd geralmente causa rupturas na membrana plasmática,

desorganização das membranas tilacóides dos cloroplastos, deformação no núcleo,

condensação da cromatina, resultantes do estresse oxidativo devido ao excesso de ERO’s

(DAUD et al., 2009; ANJUM et al., 2015), e material eletrodenso no parênquima xilemático

(SEREGIN; KOZHEVNIKOVA, 2008; CONN; GILLIHAM, 2010; CASTRO et al., 2015),

59

sugerindo que o transporte de Cd pode estar restrito ao xilema, fato também observado no

presente trabalho. A presença de plastoglóbulos no cloroplasto e de vesículas pode estar

relacionada à exposição ao estresse (HAKMAOUI et al., 2007). Os plastoglóbulos atuam na

síntese e reciclagem de compostos lipofílicos produzidos durante o estresse oxidativo causado

por metais (AUSTIN et al., 2006; OLMOS et al., 2006). Além disso, a senescência foliar

também pode ser considerada como um fator para o aumento do número de plastoglóbulos

(SANDALIO et al., 2001; ESPOSITO et al., 2012).

As raízes das plantas submetidas aos tratamentos contendo somente diferentes

concentrações de Mn no solo (Figura 14 J e K) não apresentaram alterações na ultraestrutura

celular, mostrando integridade da estrutura e dos orgânulos celulares. Entretanto, foi

observado rompimento de membranas, desintegração do envoltório celular com indícios de

núcleo em apoptose, deposição de material eletrodenso (possivelmente Cd) no xilema e

aderido à parede celular (Figura 14 L, M, O e P). Além disso, foi verificada a presença de

material eletrodenso, também relatada em outras espécies vegetais submetidas ao Cd (JIANG

et al., 2009; GE et al., 2012; SHI et al., 2016), em plantas jovens de T. cacao submetidas

também ao Cd (CASTRO et al., 2015) e na presença de outros metais, como Al (ALMEIDA

et al., 2015) e Cu em altas concentrações (REIS et al., 2015) em T. cacao, fornecidos via

embebição de sementes, destituídas de polpa e tegumento, em solução por 24 h.

Existem relatos diversos sobre o acúmulo de material eletrodenso na parede celular do

tecido radicular, demonstrando que a parede celular desempenha função na tolerância ao

metal, quando este se encontra adsorvido à parede celular em maior quantidade do que no

citosol ou vacúolo (NEUMANN et al., 1997). Além disso, a deposição de material

eletrodenso tem maior relação com a alta concentração de material absorvido (KÜPPER et al.,

2000), pois o metal pode ser distribuído na parede celular devido à afinidade com proteínas

ricas em cisteína, presentes na parede (LIU; KOTTKE, 2004). Ademais, a parede celular é o

local principal para deposição e acúmulo de material eletrodenso, como Cd nas raízes (KHAN

et al., 1984; VÁSQUEZ et al., 1992; LIU et al., 2007; GE et al., 2012). Pois, a raiz é o

primeiro órgão em contato direto com o metal, quando aplicado diretamente no solo, se

tornando o primeiro mecanismo de defesa contra a toxicidade de Cd (SHI et al., 2016).

Contudo, o acúmulo de material eletrodenso no xilema é um importante indício de que o Cd

foi transportado para a parte aérea, haja vista que as folhas acumularam uma quantidade de

metal bem superior que a absorção pelas raízes (Figura 6 C e D).

60

6. CONCLUSÕES

Plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51 foram tolerantes a altas concentrações

de Mn no solo, ao passo que altas concentrações de Mn favoreceram o funcionamento e o

desempenho da maquinaria fotossintética;

Houve maior absorção e transporte de Cd da raiz para a parte aérea, quando as plantas

jovens do genótipo de T. cacao CCN 51 foram cultivadas no solo contendo Mn + Cd em altas

concentrações;

Altas concentrações de Cd no solo, de forma isolada ou conjuntamente com Mn (Mn +

Cd), promoveram danos à fotossíntese e alterações no metabolismo antioxidativo em plantas

jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, sendo a catalase uma das peroxidases mais

importante na eliminação do excesso de espécies reativas de oxigênio, na presença de altas

concentrações de Cd em nível foliar;

Houve mitigação da toxicidade de Cd, quando as plantas jovens do genótipo de T.

cacao CCN 51 foram cultivadas em solos com baixa concentração de Cd e na presença de

Mn;

A maior absorção de Cd pelas raízes e, consequentemente, o seu transporte e acúmulo

nas folhas, de plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, causou danos irreversíveis na

ultraestrutura celular do tecido foliar, principalmente em nível de cloroplasto, com grande

deposição de material eletrodenso na parede celular e vacúolos, seguido de morte celular

programada.

Danos ultraestruturais irreversíveis em células de tecidos radiculares e foliares de

plantas jovens do genótipo de T. cacao CCN 51, provocados pela absorção de Cd em solos

contaminados, podem ser atenuados ou mitigados pela adição de Mn no solo em altas

concentrações;

Os genes associados à biossíntese de proteínas do fotossistema 2 (PS2) da fase

fotoquímica da fotossíntese (psbA e psbO), do metabolismo antioxidativo (Cu-Zn sodcyt e

Cu-Zn sodchl) e da quelação de metais (mt2b) no citoplasma celular apresentaram expressão

do número de transcritos diferenciados com o tempo de exposição aos metais Mn e Cd e Mn

+ Cd e contribuíram para a reparação dos danos causados às proteínas PsbA e PsbO e para a

redução da produção de espécies reativas de oxigênio.

61

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