UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

UIARA SOUZA

AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE INOCULAÇÃO DE Phytophthora citrophthora E

DA RESISTÊNCIA DE PORTA-ENXERTOS E COMBINAÇÕES COPAS/PORTA-

ENXERTOS À GOMOSE

ILHÉUS – BAHIA 2018

UIARA SOUZA

AVALIAÇÃO DE MÉTODOS DE INOCULAÇÃO DE Phytophthora citrophthora E DA

RESISTÊNCIA DE PORTA-ENXERTOS E COMBINAÇÕES COPAS/PORTA-

ENXERTOS À GOMOSE

Dissertação apresentada, para obtenção do

título de mestre em Produção Vegetal, à

Universidade Estadual de Santa Cruz.

Área de concentração: Produção Vegetal

Orientadora: Dra. Edna Dora Martins Newman

Luz

Co-orientadores: Dr. Walter dos Santos

Soares Filho; Ms. Hermes Peixoto Santos

Filho.

ILHÉUS – BAHIA 2018

UIARA SOUZA



ENXERTOS À GOMOSE

Ilhéus, 26 de fevereiro de 2018.

_____________________________________

Edna Dora Martins Newman Luz – PhD

MAPA/CEPLAC/CEPEC

(Orientadora)

_____________________________________

José Luiz Bezerra – PhD

UESC/CEPLAC/UFRE

_____________________________________

Leandro de Souza Rocha– Ds

Embrapa Mandioca e Fruticultura

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus pais e minha irmã, por todo amor, dedicação e carinho.

Meu sucesso dedico a vocês!

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar agradeço a Deus, pelo dom da vida. Deus disse: de

maneira alguma te deixarei, nunca, jamais te abandonarei. Hebreus 13:5;

A Universidade Estadual de Santa Cruz pelo ensino;

A EMBRAPA, por ter me dado à primeira oportunidade de estagio e com isso

o conhecimento de um mundo inexistente pra mim;

A FAPESB pelo apoio financeiro através da concessão da bolsa;

A minha orientadora Dra. Edna Dora; agradeço por toda orientação recebida,

aprendi muito com a Senhora, levarei bons conhecimentos, experiência inestimável.

Obrigada;

Aos meus co-orientadores Dr. Walter dos Santos Soares Filho e Dr. Hermes

Peixoto Santos Filho, a quem tenho um carinho mais que especial, muito do que eu

sei hoje na minha vida profissional agradeço a vocês;

Agradeço aos meus, pais Balbino Serqueira Souza e Iris Souza que não

mediram esforços para me dar uma boa educação priorizando a ética e os bons

princípios. Muito obrigada por todos os ensinamentos, pela dedicação em me tornar

uma pessoa digna e honesta. Amo muito vocês;

A minha irmã Taiara Souza, por ser uma pessoa tão carinhosa, preocupada e

dedicada. Irmã seu sucesso está garantindo, com fé em Deus. Te amo muito;

As minhas tias Cristina e Roberta, muito obrigado pelo carinho e atenção;

A Paulo Laesso por todo carinho, dedicação e paciência;

Ao Laboratório de Fitopatologia e Setor de Campos Experimentais da

EMBRAPA, em especial a Leandro Rocha e Sr. Alcides;

A Maria Thîeta por toda ajuda e parceria nos experimentos;

As meninas Francis e Vanussa por toda ajuda nos momentos em que estive

na CEPLAC;

As minhas amigas, Fátima Costa, Nívea Adão, Mariana Lira, Olga Marques,

Bruna Codorna, Milene Caldas, Magali Mota, Leandra Barros, Diana Matos, Anelita

Rocha e Stephanie Arriero.

Muito Obrigada.....

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS................................................................................................ x

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... xiii

EXTRATO............................................................................................................... xvi

ABSTRACT........................................................................................................... xviii

1. INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................. 1

2. REVISÃO DE LITERATURA.......................................................................... 4

2.1. Citricultura...................................................................................................... 4

2.2. Gomose dos citros.......................................................................................... 5

2.3. O gênero Phytophthora.................................................................................. 6

2.4. Morfologia do patógeno................................................................................. 7

2.5. Sintomatologia............................................................................................... 8

2.6. Mecanismos de defesa da planta................................................................. 9

3. CAPÍTULO 1 – MÉTODOS PRECOCES DE INOCULAÇÃO PARA

AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA PRECOCE NO PATOSSISTEMA

CITROS/Phytophthora spp................................................................................... 12

Resumo.................................................................................................................. 12

Abstract.................................................................................................................. 14

3.1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 16

3.2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................ 17

3.2.1. Avaliação de métodos de inoculação de Phytophthora com material

destacado de plantas cítricas.................................................................... 20

3.2.1.1. Material vegetal................................................................................. 20

3.2.1.2. Inóculo................................................................................................ 20

3.2.1.3. Inoculação com suspensão de zoósporo em folhas sem

ferimento e com ferimento. ............................................................... 21

3.2.1.4. Inoculação com disco de micélio em folhas com e sem ferimento.... 21

3.2.1.5. Inoculação em frutos.......................................................................... 22

3.2.1.6. Inoculação em ramos de citros.......................................................... 22

3.3. RESULTADOS............................................................................................. 24

3.3.1. Avaliação da agressividade de isolados de Phytophthora spp..................... 24

3.3.2. Inoculações em folhas destacadas............................................................... 24

3.3.3. Inoculações em frutos................................................................................... 30

3.3.4. Inoculações em pedaços de ramos.............................................................. 30

3.3.4.1. Imersão dos ramos............................................................................ 30

3.3.4.2. Inoculação com disco de cultura e suspensão de zoósporos............ 32

3.4. DISCUSSÃO................................................................................................. 32

4. CAPÍTULO 2 – SELEÇÃO DE MÉTODO DE INOCULAÇÃO PARA

Phytophthora citrophthora EM HÍBRIDOS DE CITROS........................... 37

Resumo..................................................................................................................

Abstract.................................................................................................................. 39

4.1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 40


4.2.1. Preparo do inóculo.................................................................................... 41

4.2.2. Inoculação................................................................................................. 42

4.2.2.1. Método 1: Infestação do substrato sem ferimento no coleto da

planta................................................................................................ 42

4.2.2.2. Método 2: Infestação do substrato mais leves perfurações feitas

com agulha histológica no coleto das plantas................................... 42

4.2.2.3. Método 3: Injeção de zoósporos no caule da planta.......................... 43

4.2.2.4. Método 4: Deposição de disco de cultura contendo estruturas

do patógeno no caule da planta........................................................ 44

4.2.3. Avaliação ................................................................................................. 44

4.2.3.1. Avaliação das plantas inoculadas pelos métodos 1 e 2.................... 44

4.2.3.2. Avaliação das plantas inoculadas pelos métodos 3 e 4..................... 44

4.2.4. Isolamento de amostras do solo das plantas inoculadas pelo método

1 e 2............................................................................................................. 45

4.2.5. Isolamento do patógeno das raízes das plantas inoculadas pelo método

1 e 2............................................................................................................. 46

4.3. RESULTADOS............................................................................................ 46

4.4. DISCUSSÃO................................................................................................. 49

5. CAPÍTULO 3 – MÉTODOS DE INOCULAÇÃO PARA AVALIAÇÃO DE

PORTA-ENXERTOS E AVALIAÇÃO DE COMBINAÇÕES COPA/PORTA-

ENXERTO DE CITROS PARA RESISTENTE A Phytophthora citrophthora...... 53

Resumo.................................................................................................................. 53

Abstract.................................................................................................................. 55

5.1. INTRODUÇÃO............................................................................................. 57


5.2.1. Experimento 1: Comparação dos métodos de inoculação em folhas e

caule de porta-enxertos híbridos de citros.................................................... 58

5.2.1.1. Inoculação em folhas......................................................................... 60

5.2.1.2. Inoculações no caule dos porta-enxertos.......................................... 61

5.2.2. Experimento 2: Inoculação em porta-enxertos com duas variedade

copa de citros ............................................................................................. 61

5.2.3. Experimento 3: Inoculação em porta-enxertos com três variedades

copa de citros.............................................................................................. 63

5.3. RESULTADOS............................................................................................. 64


caule de porta-enxertos híbridos de citros................................................... 64

5.3.1.1. Inoculações em folhas....................................................................... 64

5.3.1.2. Inoculações no caule dos porta-enxertos.......................................... 67

5.3.1.3. Correlação entre os métodos de inoculação em folhas com

e sem ferimento e caules de porta-enxertos..................................... 67

5.3.2. Experimento 2: Inoculação em porta-enxertos com duas variedades

copa de citros.............................................................................................. 69

5.3.3. Experimento 3: Inoculação em porta-enxertos com três variedades

copa de citros.............................................................................................. 71

5.4. DISCUSSÃO................................................................................................. 72

6. REFERÊNCIAS............................................................................................ 78

7. CONCLUSÕES GERAIS.............................................................................. 88

x

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Tabela 1 – Fonte de isolados de Phytophthora citrophthora e P. nicotianae, obtidos

para ativação em folhas e frutos de Limoeiro Siciliano........................................... 17

Tabela 2 – Lesões causadas por isolados de Phytophthora citrophthora e P.

nicotianae, ativados em folhas e frutos de Limoeiro Siciliano................................. 24

Tabela 3 – ANAVA para o experimento de inoculação em folhas (cm2)................. 26

Tabela 4 – Comparação das médias de lesões provocadas por P. citrophthora nos

dois porta-enxertos para análise do desdobramento das interações: face da folha x

método de inoculação x tipo de inoculação, sendo comparados os valores médios da

porcentagem de lesão, obtidas das folhas de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata

‘Kryder’, em função da face da folha abaxial e adaxial, do método de inoculação com

e sem ferimento e o tipo de inoculação em disco e suspensão.............................. 27

Tabela 5 – Análise do desdobramento da face da folha dentro de cada nível de:

porta-enxerto x método de inoculação x tipo de inoculação, sendo comparados os

valores médios da porcentagem de lesão, obtidas das folhas de limoeiro siciliano e

Poncirus trifoliata ‘Kryder’ em função de: porta-enxerto limoeiro siciliano e P. trifoliata

‘Kryder’, método de inoculação com ferimento e sem ferimento e tipo de inoculação

através de disco de micélio e suspensão de zoósporos......................................... 27

Tabela 6 – Análise do desdobramento do método de inoculação dentro de cada nível

de: porta-enxerto x face da folha x tipo de inoculação, sendo comparados os valores

médios da porcentagem de lesão, obtidas das folhas de limoeiro siciliano e Poncirus

trifoliata ‘Kryder’ em função dos porta-enxertos limoeiro siciliano e P. trifoliata

‘Kryder’, face da folha abaxial ou adaxial com os tipo de inoculação através de disco

de micélio e suspensão de zoósporos.................................................................... 28

xi

Tabela 7 – Análise do desdobramento do tipo de inoculação dentro de cada nível de:

porta-enxerto x face da folha x método de inoculação, sendo comparados os valores

médios da porcentagem de lesão, obtidas das folhas de limoeiro siciliano e Poncirus

trifoliata ‘Kryder’ em função dos porta-enxertos limoeiro siciliano e P. trifoliata

‘Kryder’, face da folha.............................................................................................. 30

Tabela 8 – Análise da imersão de ramos de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata

‘Kryder’ inoculados com Phytophthora citrophthora nos tempos de 20, 40 e 60

minutos.................................................................................................................... 34

Tabela 9 – Análise da inoculação de ramos de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata

‘Kryder’ com Phytophthora citrophthora nos métodos de suspensão de zoósporos e

disco de cultura....................................................................................................... 34

CAPÍTULO 2

Tabela 1 – Quadro da análise de variância dos tratamentos e métodos de

inoculações.............................................................................................................. 48

CAPÍTULO 3

Tabela 1 - Porta-enxertos de citros, avaliados em dois tipos de métodos de

inoculação: em folhas e caule.......................................................................................

Tabela 2 - Porta-enxerto de citros enxertados com duas variedades copas e

avaliados em relação a Phytophthora citrophthora.......................................................

Tabela 3 - Porta-enxerto de citros enxertados com três variedades copas e avaliados

em relação a Phytophthora citrophthora........................................................

Tabela 4 - Análise de variância das lesões em folhas de 23 genótipos de citros,

avaliados em dois tipos de métodos de inoculação: com ferimento (CF) e sem

ferimento (SF).......................................................................................................... 63

xii

Tabela 5 - Médias da porcentagem de lesão nas folhas de 23 genótipos, avaliados

em dois tipos de inoculações: com ferimento (CF) e sem ferimento

(SF).......................................................................................................................... 65

Tabela 6 - Comparação de médias de 23 porta-enxertos de citros com relação á

Gomose de Phytophthora citrophthora.................................................................... 67

Tabela 7 - Valores de correlação de Spearman entre os métodos de inoculação em

folhas (com e sem ferimento) e no caule de mudas. .............................................. 69

Tabela 8 - Análise de variância referente a área lesionada de onze porta-enxertos

de citros enxertados com duas copas distintas (laranjeira Pera e limeira ácida

‘Tahiti’) em relação a Phytophthora citrophthora..................................................... 70

Tabela 9 - Comparação de médias da área de lesão (cm2) lesionada de onze porta

enxertos de citros enxertados com duas copas distintas (laranjeira ‘Pera’ e limeira

ácida ‘Tahiti’) em relação a Phytophthora citrophthora........................................... 71

Tabela 10 - Análise de variância referente a área lesionada de nove porta-enxertos

de citros enxertados com três copas distintas (laranjeira ‘Pera’, limeira ácida ‘Tahiti’ e

laranjeira valência) em relação a Phytophthora citrophthora.................................. 72

Tabela 11 - Comparação de médias da área lesionada de nove porta enxertos de

citros enxertados com três copas distintas (laranjeira ‘Pera’, limeira ácida ‘Tahiti’ e

laranjeira valência) em relação a Phytophthora citrophthora.................................. 73

xiii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1

Figura 1 – Ativação da agressividade dos isolados Phytophthora citrophthora e P.

nicotianae em frutos de limoeiro Siciliano: A. Desinfestação de frutos de limoeiro

siciliano; B. Retirada do disco do meio de cultura contendo estruturas do patógeno;

C. Deposição do disco contendo micélio; D. Fruto inoculado; E. Frutos incubados em

saco de polietileno para efeito de câmara úmida; F. Isolamentos a partir dos frutos

inoculados............................................................................................................... 18

Figura 2 – Inoculação de Phytophthora citrophthora pelo o método de disco de

cultura em folhas de citros: A. Deposição no abrasivo na folha; B. Abrasivo sendo

friccionado sobre a folha; C. Folhas sendo lavadas para retirar o abrasivo; D.

Retirada do disco do meio de cultura contendo estruturas do patógeno; E. Disco de

cultura sendo depositado sobre a folha; F. Folhas inoculadas na face abaxial e

adaxial..................................................................................................................... 21

Figura 3 – Inoculação de Phytophthora citrophthora em pedaços de ramos de

limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata ‘Kryder através do método de disco de micélio:

A. Ramos de limoeiro siciliano e P. trifoliata ‘Kryder medindo 10 cm; B. Furo de 3

mm de diâmetro para retirada da casca; C. Furo com as mesma dimensões em

placa contendo culturas do patógeno; D. Retirada do disco do meio de cultura

contendo estruturas do patógeno; E. Deposição do disco de micélio em ramos de

citros e devolução da casca.................................................................................... 23

Figura 4 – Comparação de médias da lesão da folha obtidas do resultado da

interação de quatro fatores: Porta Enxerto (Siciliano (S) e Poncirus (P)); Face da

folha (Abaxial (AB) e Adaxial (AD)); Método de inoculação (Com ferimento (CF) e

sem ferimento (SF)) e Tipo de Inoculação (Disco (DIS) e Suspensão

(SUS))...................................................................................................................... 31

xiv

Figura 5 – Lesões (cm2) em ramos de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata ‘Kryder’

inoculados com Phytophthora citrophthora com o método de imersão dos ramos em

suspensão de zoósporos......................................................................................... 33

CAPÍTULO 2

Figura 1 – Inoculação de Phytophthora citrophthora por infestação do substrato com

ferimento no coleto da planta: A. Plantas de citros; B. Suspensão de zoósporos; C.

Retirada se 50% do substrato do saco de polietileno e misturado com a suspensão

de zoósporos; D. Ferimentos no coleto da planta com auxilio de uma agulha

histológica; E. Devolução do substrato infestado ao saco; F. Plantas

inoculadas............................................................................................................... 42

Figura 2 – Plantas de citros inoculadas com Phytophthora citrophthora pelo método

de injeção de zoósporos e disco de cultura. A. Planta testemunha do método de

inoculação com injeção de zoósporos; B. Poncirus trifoliata ‘Kryder’ inoculado com

injeção de zoósporos; C. limoeiro ‘Cravo’ inoculado com injeção de zoósporos; D.

Tangerineira ‘Sunki’ Tropical inoculado com injeção de zoósporos; E. Planta

testemunha do método de inoculação de disco de cultura; F. P. trifoliata ‘Kryder’ com

disco de cultura; G. limoeiro ‘Cravo’ inoculado com disco de cultura; H. Tangerineira

‘Sunki’ Tropical com disco de cultura...................................................................... 45

Figura 3 – Avaliações realizadas aos 120 dias após as inoculações em tangerineira

sunki ‘tropical’, inoculadas com Phytophthora citrophthora por infestação do

substrato com e sem ferimento no coleto da planta: A. Amostras de solo da

tangerineira sunki ‘tropical’ inoculadas com e sem ferimentos; B. Presença de P.

citrophthora em plaqueamento no meio Corn meal Ágar; C. Raiz de tangerineira

sunki ‘tropical’; D. P. citrophthora em plaqueamento de raiz no meio Corn meal Ágar;

E. Cultura pura de P. citrophthora........................................................................... 47

Figura 4 – Médias obtidas através dos métodos de inoculação de disco de micélio e

suspensão de zoósporos......................................................................................... 49

xv

Figura 5 – Comparação das médias dos porta-enxertos inoculados com

Phytophthora citrophthora....................................................................................... 50

CAPÍTULO 3

Figura 1 – Avaliação do experimento. A. Retirada do floema da muda cítrica até ser

visualizada a alteração da coloração (amarronzada) do tecido afetado no cambio; B.

Lesão, de cada genótipo, foi colada em folhas de papel ofício A4; C. Quantificação

da área lesionada por meio do programa Assess.................................................. 61

xvi



ENXERTOS À GOMOSE DOS CITROS

EXTRATO

A citricultura brasileira possui grande importância no agronegócio nacional e

internacional, porém enfrenta graves problemas fitossanitários, entre os quais a

Gomose, doença causada por Phytophthora spp. As doenças levaram a uma

mudança radical na produção de mudas, obrigando a execução da prática em

ambiente protegido. Nos programas de melhoramento, a busca por métodos

precoces de avaliação para seleção de genótipos resistentes é constante. No Brasil,

P. citrophthora tem sido a espécie associada às perdas mais significativas

provocadas pela Gomose, sendo a espécie usada neste trabalho. Os objetivos

foram: i) testar a inoculação em partes destacadas de plantas cítricas folhas e

segmentos de galhos, além de frutos para desenvolver um método de inoculação

precoce para avaliar resistência à Gomose; ii) testar os métodos de inoculação em

híbridos de citros; iii) avaliar quanto a resistência a P. citrophthora 23 porta-enxertos

e 19 combinações copa/porta-enxertos de citros desenvolvidos pelo PMG de citros

da Embrapa Mandioca e Fruticultura, onde os experimentos foram desenvolvidos.

Os métodos testados no primeiro objetivo foram: a inoculação em partes destacadas

de plantas cítricas folhas e segmentos de galhos, além de frutos, com 10µL de

suspensão na concentração de 5x105 zoósporos/ml ou disco de cultura (3mm)

contendo estruturas do patógeno, com ferimento (causado por abrasivo) e sem

ferimento na superfície dos frutos e nas faces abaxial e adaxial das folhas. Os ramos

foram inoculados com suspensão de zoósporos aplicada através de gotas ou por

imersão durante 20, 40 e 60 minutos e por disco de cultura com ferimentos. Todos

os métodos diferenciaram Limão siciliano de Poncirus trifoliata ‘Kryder’, os dois

porta-enxertos usados, e o método de inoculação em folhas destacadas sem

ferimento pode ser usado para uma avaliação precoce de porta-enxertos. Ramos

destacados imersos por 40 minutos em suspensão de zoósporos também podem ser

usados. Para o segundo objetivo plantas de limoeiro ‘Cravo’, P. trifoliata ‘Kryder’ e

de Tangerineira ‘Sunki’ Tropical com dois anos de idade, 5,0 a 7,0 mm de diâmetro

do caule e 0,60 m de altura foram inoculadas com P. citrophthora através de:

infestação do substrato sem ferimento no coleto das plantas ou com leves

xvii

perfurações; Injeção de suspensão de zoósporos no caule; e deposição de disco de

cultura. A área das lesões nas plantas inoculadas no caule foi medida pelo programa

Assess 60 DAI. Nas plantas inoculadas com infestação do substrato constatou-se a

presença de P. citrophthora nas raízes e no solo aos 90 e 120 DAI, porém não

houve manifestação de sintomas da Gomose. Maiores lesões foram formadas nas

plantas dos porta-enxertos pelo método de inoculação de disco de cultura do

patógeno. O genótipo P. trifoliata ‘Kryder’ comportou-se como resistente. No terceiro

objetivo, 23 porta-enxertos híbridos foram testados pelos métodos de inoculação em

folhas e em caules, e apresentaram ampla variação na reação a P.citrophthora.

Inoculações em folhas destacadas sem ferimentos separaram bem os genótipos

suscetíveis dos intermediários e resistentes. Houve correlação positiva entre o

método de inoculação de caule, mais comumente usado e o de inoculação em folhas

destacadas sem ferimento, mostrando a utilidade deste último. Os porta-enxertos

Citrandarin ‘Indio’ e ‘Riverside’, TSKC x TRDF - 006, HTR - 051 e P. trifoliata

‘Benecke’ apresentaram as menores porcentagem de área lesionada. As

combinações copa x porta-enxerto também reagiram de forma variável,

comprovando que há interação copa x porta-enxerto. Este trabalho trouxe boa

contribuição ao melhoramento genético dos citros.

Palavras-chave: Citrus spp., avaliação precoce, metodologia de inoculação,

tolerância

xviii

METHODS OF INOCULATION OF Phytophthora citrophthora TO EVALUATE

RESISTANCE OF ROOTSTOCKS AND SCION/ROOTSTOCK COMBINATIONS TO

CITRUS GUMMOSIS

EXTRACT

Brazilian citriculture has great importance in the national and international

agribusiness, but faces serious phytosanitary problems, including gummosis, a

disease caused by Phytophthora spp. The diseases led to a radical change in

seedling production, forcing the practice to be executed in protected environment. In

breeding programs, the search for early evaluation methods to select resistant

genotypes is constant. In Brazil, P. citrophthora has been the species associated with

the most significant losses caused by gummosis and it was used in the present

study. The objectives were: i) to test inoculation in detached parts of citrus plants,

leaves and branch segments, besides fruits, to develop an early inoculation method

to evaluate the resistance to gummosis; ii) to test inoculation methods in citrus

hybrids; iii) to evaluate, regarding the resistance to P. citrophthora, 23 rootstocks and

19 combinations of citrus scion/rootstocks developed by the citrus PMG (Genetic

Improvement Program) of Embrapa Cassava & Tropical Fruits, where the

experiments were conducted. The methods tested in the first objective were:

inoculation in detached parts of citrus plants, leaves and branch segments, besides

fruits, with 10 µL of suspension at the concentration of 5x105 zoospores/mL, or

culture disc (3 mm) containing pathogen structures, with wound (caused by abrasive)

and without wound on the surface of the fruits and on abaxial and adaxial surfaces of

the leaves. Branches were inoculated with zoospore suspension applied by drops or

immersion for 20, 40 and 60 minutes and by culture discs with wound. All methods

differentiated Sicilian lemon from Poncirus trifoliata ‘Kryder’, the two rootstocks used,

and the method of inoculation in detached leaves without wound can be used for

early evaluation of rootstocks. Detached branches immersed for 40 minutes in

zoospore suspension can also be used. For the second objective, 2-year-old plants

of ‘Cravo’ lemon, P. trifoliata ‘Kryder’ and ‘Sunki’ Tropical Mandarin with 5,0 - 7,0 mm

stem diameter and 0.60 m height were inoculated with P. citrophthora through:

substrate infestation without wound in plant collar or with slight perforations; injection

of zoospore suspension in the stem; and deposition of culture disc. Lesion area in

plants inoculated in the stem was measured by the program Assess, 60 days after

xix

inoculation (DAI). In plants inoculated by substrate infestation, P. citrophthora was

found in roots and soil at 90 and 120 DAI, but there was no manifestation of

gummosis symptoms. Larger lesions were formed in the plants of the rootstocks by

the inoculation method of pathogen culture disc. The genotype P. trifoliata ‘Kryder’

behaved as resistant. In the third objective, 23 hybrid rootstocks were tested by the

methods of inoculation in leaves and stems, and showed wide variation in the

reaction to P. citrophthora. Inoculations in detached leaves with no wound separated

well susceptible genotypes from intermediate and resistant ones. Positive correlation

was found between the stem inoculation method, more commonly used, and the

inoculation in detached leaves with no wound, showing the utility of the latter. The

rootstocks Citrandarin ‘Indio’ and ‘Riverside’, TSKC x TRDF - 006, HTR - 051 and P.

trifoliata ‘Benecke’ showed the lowest percentages of injured area. The

scion/rootstock combinations also reacted in a variable manner, proving that there is

interaction between scion and rootstock. This study brought great contribution to

citrus genetic improvement.

Key words: Citrus spp., early evaluation, inoculation methodology, tolerance

1

1. INTRODUÇÃO GERAL

A citricultura constitui uma das mais importantes atividades do agronegócio no

Brasil (Neves et al., 2010). O Brasil é o maior produtor de laranja e exportador de

suco de laranja do mundo, bem como um grande produtor de tangerinas e de limas

ácidas (Fundecitrus, 2017). No entanto, ocorre baixa diversidade de variedades de

copa e de porta-enxertos cultivados no país, o que restringe as possibilidades de

mercado e aumenta os riscos fitossanitários associados ao cultivo de citros em geral

(Almeida e Passos, 2011). No Estado de São Paulo, maior produtor nacional,

apenas cinco variedades de laranja representam 95% do total cultivado enquanto

que, no Estado da Bahia, terceiro produtor, a laranjeira „Pera‟ [Citrus sinensis (L.)

Osbeck] basicamente ainda é a única cultivada comercialmente (Fundecitrus, 2016;

França et al., 2016). Apenas no Rio Grande do Sul o cultivo de tangerinas é

relativamente mais diversificado, prevalecendo as mexericas (C. deliciosa Tenore),

enquanto que a tangerina Ponkan (C. reticulata Blanco) é a cultivar predominante

nas demais regiões, e, para as limeiras ácidas, basicamente se dispõem de apenas

dois clones comerciais de Tahiti [C. latifolia (Yu.Tanaka) Tanaka] (PIO et al., 2005;

PASSOS et al., 2013).

Apesar das plantas cítricas serem cultivadas em todos os estados brasileiros,

aproximadamente 92% da produção procede dos Estados se São Paulo, Bahia,

Sergipe e Minas Gerais (DONADIO et al., 2005).

A produção de laranjas do Brasil deve aumentar 34% na safra 2017/2018 e

chegar a 471 milhões de caixas. Com o maior volume de laranjas para

processamento, a produção de suco deve aumentar 55% atingindo 1,257 milhão de

toneladas. Na principal área citrícola do Brasil, entre São Paulo e Minas Gerais,

estima-se uma produção de 364,5 milhões de caixas de laranja. A produtividade é

estimada em 2,08 caixas por árvore, um aumento de 34% em relação à safra

2

2016/2017 (Fundecitrus, 2017). Segundo o IBGE (Instituto Brasileira de Geografia e

Estatística) a safra de laranja de 2017 teve um aumento de 1.100.617 toneladas

quando comparada com a de 2016, com uma variação de 6,9% e com 682.167

hectares colhidos (IBGE 2017).

O alcance desses números pode ser dificultado pela presença de fatores

bióticos limitantes aos citros representados principalmente pelas doenças

Huanglongbing (HLB), Clorose Variegada dos Citros (CVC), Canco Cítrico, Leprose,

Gomose de Phytophthora, Pinta Preta, Podridão Floral dos Citros (PFC), Tristeza,

Declínio e Morte Súbita dos Citros (MSC), além de diversas pragas (VILLA, 2010).

A Gomose, causada por diferentes espécies de Phytophthora, é uma

importante doença e está associada ao solo, pois os oomicetos também são

habitantes do solo. Essa interação solo-planta-patógeno aliada a variabilidade do

potencial genético das plantas possibilita a presença, no ecossistema, de plantas

hospedeiras cítricas com diferentes níveis de resistência ao patógeno (Fourie, 2004;

Medina Filho et al., 2003). Os danos provocados por Phytophthora spp. em citros

são estimados em 10 a 30% da produção mundial, causando prejuízos de milhões

de dólares, uma vez que afetam todas as fases de desenvolvimento dos citros e,

assim, a sua produção (TIMMER; GARNSEY; GRAHAM, 2000).

Há uma busca incessante por um método de inoculação de Phytophthora spp.

em plantas cítricas que não seja tão invassivo, que expresse a realidade dos

genótipos e que possa correlacionar com os dados da doença em plantas no campo.

Esses métodos precisam ser rápidos, eficientes e eficazes, para que se possa

selecionar uma gama de genótipos híbridos de citros, em sua maioria desenvolvida

na Embrapa Mandioca e Fruticultura quanto à resistência a Phytophthora

citrophthora (RE Sm. & EH Sm.) Leonian. Assim, este trabalho teve como objetivos:

i) testar partes destacadas de plantas cítricas folhas e segmentos de galhos, além

de frutos para desenvolver um método de inoculação visando testar em larga escala

genótipos de citros quanto à resistência a P. citrophthora um dos agente da gomose

dos citros; ii) testar quatro métodos de inoculação em três híbridos de citros quanto à

resistência a P. citrophthora; iii) estabelecer um método padrão para testar plantas

cítricas quanto à resistência a P. citrophthora; iv) comparar as respostas de híbridos

3

de citros desenvolvidos pelo PMGC, quanto a inoculação em folhas destacadas em

laboratório e em condições de casa de vegetação (inoculação em caule) para

selecionar aquelas resistentes a P. citrophthora visando sua utilização como porta-

enxerto e v) testar combinações de copa/porta-enxerto de citros, altamente

promissores em produtividade, selecionados pelo PMGC quanto à resistência a P.

citrophthora.

4

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Citricultura

De origem asiática, os primeiros registros datam entre 300 e 400 a.C. As

plantas cítricas foram introduzidas no Brasil pelas primeiras expedições

colonizadoras, provavelmente na Bahia. Entretanto aqui, com melhores condições

para vegetar e produzir do que nas próprias regiões de origem, os citricos se

expandiram para todo o país. Os citros compreendem um grande grupo de plantas

do gênero Citrus e outros gêneros afins (Fortunella Swingle e Poncirus Raf.) ou

híbridos da família Rutaceae, representado, na maioria, por laranjas [C. sinensis (L.)

Osbeck], tangerineiras (C. reticulata Blanco e C. deliciosa Tenore), limões [C. limon

(L.) Burm. f ], limas ácidas como o Tahiti [C. latifolia (Yu. Tanaka) Tanaka] e o

Galego [C. aurantiifolia (Christm.) ], e limas doces como a lima da Pérsia (C.

limettioides Swingle), pomelo (C. paradisi Macfad.), cidra (C. medica L.), laranja-

azeda (C. aurantium L.) e toranjas [C. máxima var. uvacarpa Merrill & Lee)] (LOPES

et al., 2011).

Apesar dessa grande diversidade de gêneros, espécies, cultivares e clones,

os plantios comerciais de citros, notadamente no Nordeste, restringem-se a um

número relativamente pequeno de cultivares com a utilização quase única da

combinação laranjeira „Pera‟ [(C. sinensis (L.) Osbeck]/limoeiro „Cravo‟ (C. Limonia

Osbeck), tornando a citricultura brasileira bastante vulnerável a pragas e doenças

sendo necessária a criação de um programa de diversificação de variedades que

amplie essa base genética em busca da sustentabilidade da cadeia produtiva

(OLIVEIRA et al. 2014).

No Brasil, a laranja Azeda, considerada resistente a Phytophthora spp. foi o

porta-enxerto mais utilizado até a década de quarenta quando, devido a sua

intolerância ao CTV (Citrus Tristeza Vírus), foi substituída pelo limão, constituindo-se

no principal porta-enxerto da citricultura brasileira. O limoeiro „Cravo‟ é o porta-

enxerto presente em cerca de 70% do parque citrícola brasileiro, devido

principalmente à sua tolerância ao CTV à deficiência hídrica, bem como pela

precocidade da produção (Pompeu júnior, 2005; Soares Filho et al., 2003). No

entanto, a presença de doenças que afetam esse porta-enxerto, como a gomose de

Phytophthora spp., o declínio e a morte súbita dos citros (MSC), implica a

5

necessidade de maior diversificação de variedades porta-enxerto no Brasil

(DUARTE et al., 2013).

2.2. Gomose dos citros

As doenças incitadas por Phytophthora spp. em citros são comumente

referidas como gomoses que são conhecidas desde o século X, na Península

Ibérica. A primeira grande epidemia de gomose dos citros ocorreu nas ilhas Açores,

a partir de 1832, tendo sido observada desde 1845 em Portugal, com manifestações

bastante severas. A partir desse foco, alastrou para a Espanha, tendo sido

observada no sul da França em 1851, no norte da Itália em 1855, e, mais tarde na

Grécia. Na América do Norte foi relatada em 1875 na Califórnia, tendo o primeiro

surto importante da doença ocorrido na Flórida quatro anos mais tarde (Fawcett,

1936). Na América do Sul, o primeiro caso documentado ocorreu em 1709 em Lima,

no Peru, e somente em 1917 foi detectada no Brasil (ALENCAR, 1941).

A gomose representa um complexo de doenças que podem ocorrer nos citros,

provocadas por diferentes espécies do gênero Phytophthora. Em nível mundial, são

citadas 12 espécies de Phytophthora ocorrendo em citros, mas no Brasil

Phytophthora nicotianae e P. citrophthora são as mais encontradas em pomares e

viveiros (Laranjeira, 2005). Para esse complexo de doenças, gomose constitui-se no

principal sintoma que ocorre no campo: caracteriza-se pela morte de tecidos da

casca e internos do lenho, evoluindo para fendilhamento e com frequente exsudação

de goma. Num estágio mais avançado da doença pode ocorrer a podridão de raízes

e radicelas e, geralmente, resulta em morte da planta (TIMER et al., 2000).

A gomose tornou-se doença importante para citricultura no Brasil após a

substituição do porta-enxerto laranja „Azeda‟, suscetível ao vírus da tristeza, pelo

limoeiro „Cravo‟ suscetível a Phytophthora. Estima-se que 90% dos pomares

brasileiros foram formados com plantas enxertadas com este porta-enxerto

(Laranjeira, 2005). Com a troca de porta-enxerto, a gomose se espalhou para as

principais regiões produtoras de citros. Segundo Feichtenberger (2001), as copas e

os porta-enxertos de citros apresentam grandes variações em sua suscetibilidade às

infecções por espécies de Phytophthora. Em árvores formadas sobre porta-enxertos

6

suscetíveis são comuns as podridões na base do tronco e nas raízes principais, logo

abaixo do nível do solo.

2.3. O gênero Phytophthora

O gênero Phytophthora (“destruidor de plantas”), foi estabelecido por Anton

de Bary em 1876, ao descrever P. infestans (Mont.) de Bary como o agente

responsável por devastações nos batatais irlandeses, principal fonte alimentícia da

população. Em consequência deste fato houve a morte de aproximadamente um

milhão de irlandeses e a imigração de um milhão e meio de indivíduos da Irlanda

para a América do Norte, entre os anos de 1845 e 1846 (LUZ; MATSUOKA, 2001).

Mais recentemente, estudos baseados em características estruturais, bioquímicas,

fisiológicas e moleculares, reconhecem que o gênero Phytophthora pertence ao

Reino Straminipila, filo Oomycota, classe Peronosporomycetes, ordem

Peronosporales, família Peronosporaceae (RIETHMÜLLER et al., 2002; MARTIN et

al., 2014).

O gênero Phytophthora está amplamente distribuído em todas as áreas

geográficas do mundo e segundo Luz e Matsuoka (2001), é comum o assinalamento

de novos hospedeiros para as espécies existentes, principalmente entre plantas

nativas ou a observação de novas doenças causadas por este patógeno em plantas

cultivadas. Ainda segundo estes autores, as espécies de Phytophthora, em sua

maioria, são fitopatogênicas e, muitas delas, bastante destrutivas às culturas de

importância econômica. Embora as espécies de Phytophthora sejam importantes

patógenos da parte aérea, são, também, patógenos habitantes de solo, atacando as

raízes e o coleto de plantas de inúmeras culturas que elas têm se notabilizado.

Há relatos de várias espécies de Phytophthora como patógenos de citros: P.

boehmeriae Saw., P. cactorum (Lebert & Cohn) Srhröter, P. capsici Leonian

(somente em plantas inoculadas artificialmente), P. cinnamomi Rands, P. citricola

Saw., P. citrophthora (Sm. & Sm.) Leonian, P. drechsleri Tucker, P. hibernalis Carne,

P. megasperma Drechsler, P. palmivora (Butler) Butler, P. nicotianae [(sin. P.

parasitica) Dastur) Breda de Haan e P. parasitica var. nicotianae (Dastur)

Waterhouse], e P syringae (Kleb.)Kleb. De todas as espécies de Phytophthora

relatadas em citros, apenas duas, P. nicotianae e P. citrophthora, estão identificadas

7

como causadoras da maioria das doenças do complexo Citrus-Phytophthora

(ERWIN e RIBEIRO, 1996; ROSETI, 2001).

2.4. Morfologia do patógeno

As principais espécies de Phytophthora causadoras de gomose são P.

nicotianae e P. citrophthora. Os esporângios dessas duas espécies são papilados,

mas P. citrophthora apresenta também esporângios bipapilados. Os esporângios de

P. nicotianae apresentam forma ovóide ou piriforme. Os esporângios de P.

citrophthora são mais alongados, apresentam formas variadas ou distorcidas. No

interior dos esporângios são produzidos os zoósporos que são esporos assexuais

desprovidos de parede celular e dotados de dois flagelos. P. nicotianae produz

clamidósporos (estrutura de sobrevivência) em abundância, enquanto que esses

esporos não são formados pela maioria dos isolados de P. citrophthora.

Apresentam estruturas sexuais femininas (oogônio) e masculinas (anterídeo) e

formam os oósporos, no interior dos oogônios, no entanto, as duas espécies são

heterotálicas e, portanto, os esporos sexuais só são formados quando dá presença

de dois talos compatíveis sexualmente (A1 e A2) (WATANABE, 1994; ERWIN e

RIBEIRO, 1996; FEICHTENBERGER, 2001).

Os esporângios e zoósporos (esporos dotados de flagelos que conferem

mobilidade) são os principais responsáveis pela infecção e pelo rápido

desenvolvimento da doença, sendo capazes de germinar em água livre e infectar a

planta quando atraídos por exsudados das raízes e radicelas da planta, e são mais

predominantes no solo durante o verão (Graham e Timmer, 1992). Os oósporos e,

principalmente, os clamidósporos, são as mais importantes estruturas de

sobrevivência do patógeno, atuando como inóculo primário de infecção sendo

encontrados no solo e em restos de cultura principalmente no inverno (LUTZ e

MENGE, 1991).

A diferenciação das espécies de Phytophthora associadas à gomose dos

citros pode ser feita por métodos morfológicos, moleculares e pela curva de

crescimento „in vitro‟ em diferentes temperaturas. Isolados de P. nicotianae crescem

em temperaturas superiores a 35oC, sendo o ótimo entre 30-32oC, enquanto que

8

isolados de P. citrophthora não apresentam crescimento à 35oC, possuindo

crescimento ideal entre 24 a 28oC (GRAHAM,1990).

2.5. Sintomatologia

A gomose com exsudação de goma é o principal sintoma que ocorre no

campo, e é caracterizada pelo escurecimento e morte dos tecidos internos da casca

e do lenho na região das lesões, formação de calo nas bordas das lesões,

exsudação de goma em lesões no tronco e no colo, seca e fendilhamento da casca,

podridão do colo e radicelas. Como sintomas reflexos observa-se o amarelecimento

uniforme e progressivo de folhas, redução do desenvolvimento de folhas novas,

murcha e queda de folhas, frutificação frequentes e espontâneas, produção de frutos

pequenos, morte progressiva dos ponteiros, seca de ramos e morte da planta

(FEICHTENBERGER et al., 2005; LARANJEIRA et al., 2005).

No tronco, o sintoma característico é uma lesão deprimida, com eliminação de

goma, iniciada nos tecidos do porta-enxerto, podendo se expandir para a região da

copa acima do ponto de enxertia (Siviero et al., 2002b). A presença de fluxos de

goma na região afetada da planta se deve a um mecanismo da planta ante a

destruição dos vasos condutores de seiva. Abaixo da região da casca observa-se

uma descoloração na região cambial, que se torna amarronzada resultando em

tecidos lesionados. Essas lesões podem aparecer também no tronco e nos ramos,

separadamente. Na parte aérea da planta observa-se um amarelecimento das folhas

na projeção do caule afetado, ou em toda a planta quando a lesão ou as lesões do

colo afetam toda a circunferência da zona cambial do tronco anelando esta região

impedindo a circulação da seiva e consequentemente de alimentos necessários à

planta. Essas folhas amarelecem, com descoloração também das nervuras, depois

secam e caem (ROSSETTI, 2001).

Tanto o porta-enxerto como a copa da variedade enxertada podem ser

atacados pelo oomiceto, e essas lesões podem ser exsudativas em ambas as

regiões, porém raramente essas exsudações ocorrem em ramos. A exsudação de

goma ás vezes não é percebida porque a goma se dissolve na água do solo, na

água de irrigação ou na água da chuva. Ás vezes pode haver cicatrização das

lesões de tronco e de ramos, se as condições se tornarem desfavoráveis ao

9

oomiceto (Laranjeira et al., 2005). Quando as lesões ocorrem em radicelas, comuns

em plantas no viveiro ou em pomares novos, elas podem passar despercebidas. O

agravamento dos sintomas em um pomar pode acontecer devido á utilização de

mudas infectadas, ou também devido ao excesso de água na irrigação e em casos

de chuvas abundantes. A doença é mais grave quando atinge as raízes principais ou

a região do colo, próxima ao solo. Essas lesões são geralmente provocadas pela

entrada do oomiceto através de ferimentos e, quando atingem grandes áreas,

podem interromper o fluxo de seiva elaborada para as raízes, provocando a sua

morte (MELO e ANDRADE, 2006; FALDONI, 2011; FEICHTENBERGER, 2001).

Quando as lesões se desenvolvem muito, circundando grande parte do caule

ou das raízes, a planta entra em rápido declínio, devido á destruição do floema,

restringindo o fluxo de seiva elaborada da copa para o sistema radicular e

provocando a morte da planta (FEICHTENBERGER, 2001; ROSSETI, 2001).

2.6. Mecanismos de defesa da planta

Embora em a natureza as plantas estejam expostas ao ataque de

microrganismos, a resistência mostra-se como a regra, enquanto a suscetibilidade,

como a exceção (PASCHOLATI; LEITE, 1994).

As plantas possuem mecanismos de defesa constitutivos ou pré-formados e

induzíveis ou pós-formados. Os mecanismos constitutivos estão presentes nas

plantas antes do contato com o patógeno, entre eles cutícula, tricomas, estômatos,

compostos fenólicos, alcalóides e terpenóides. Os mecanismos induzíveis estão

ausentes ou presentes em baixos níveis nas plantas antes da infecção. A síntese de

fitoalexinas, o fortalecimento da parede celular pelo depósito de calose e lignina, a

produção de enzimas líticas como Glucanases e Quitinases, e a reação de

hipersensibilidade são exemplos deste tipo de mecanismo (Pascholati e Leite, 1995).

A resistência induzida envolve a ativação de mecanismos latentes de resistência de

uma planta através do tratamento com agentes eliciadores bióticos ou abióticos

(Pascholati e Leite, 1995 e Métraux, 2007). A possibilidade de ativação dos genes

responsáveis por este mecanismo de resistência, sob condições especiais, tornando

as plantas mais resistentes abriu as portas para os estudos sobre resistência

induzida em plantas. Nas últimas décadas a quantidade de trabalhos científicos

10

envolvendo o fenômeno da resistência induzida tem crescido enormemente

(Pascholati et al., 2004). Uma interação é dita compatível quando a planta não

consegue se defender do ataque de patógenos, manifestando sintomas típicos da

doença. Esta situação ocorre porque as defesas pré formadas da planta são

inapropriadas, não conseguindo detectar a presença do patógeno ou ativar os

mecanismos de defesa em tempo hábil. Neste caso o patógeno é considerado

virulento e a planta, suscetível (Hammond-Kosack e Jones, 2000). Numa interação

incompatível o patógeno não consegue se instalar na planta hospedeira e provocar

doença. Assim, a planta é considerada resistente e o patógeno, avirulento, e ocorre

um rápido reconhecimento molecular, seguido de várias reações de defesa do

hospedeiro a tempo de impedir que o patógeno se estabeleça (HAMMOND-

KOSACK e JONES, 2000).

A diferença entre resistência e suscetibilidade está na capacidade da planta

em reconhecer o patógeno invasor e ativar de maneira rápida e efetiva seus

mecanismos de defesa (Guzzo, 2004 e Schwan-estrada; Stangarlin; Pascholati,

2008). A ativação rápida e coordenada de genes que governam estes mecanismos

possibilita a expressão da resistência através da restrição do crescimento do

patógeno, em uma pequena área ao redor do local de penetração.

Matheron e Matejka (1992) descreveram três fatores responsáveis pelos

conflitos na classificação de genótipos de citros quanto à resistência e/ou

suscetibilidade a Phytophthora: tipo de patologia em estudo (gomose ou podridão de

radicelas), espécie de Phytophthora envolvida no estudo (P. nicotianae e P.

citrophthora) e fatores bióticos e abióticos envolvidos no patossistema citros-

Phytophthora. Para compensar ou minimizar a influência dos diversos efeitos ligados

ao patossistema citros-Phytophthora, os autores sugerem que experimentos em

laboratório, casa de vegetação e campo devem ser conduzidos em diferentes

localidades, variando vigor, nutrição e idade da planta e empregando-se diferentes

métodos de inoculação e avaliação. Os mesmos autores demonstraram que

resistência à colonização de tecidos vegetais de plantas a Phytophthora spp. varia

de acordo com a estação do ano. Nos EUA, o desenvolvimento de lesões de

Phytophthora spp. nos tecidos é reduzida no inverno e maximizada no verão.

11

Os primeiros testes de resistência a Phytophthora spp. em variedades de

citros foram realizados por Fawcett (1923), o qual estabeleceu a natureza parasítica

do patógeno. Esse método foi subsequentemente usado por outros pesquisadores

(FAWCETT e BITANCOURT, 1940). Mais tarde Rossetti (1947) aperfeiçoou o

método de inserção de discos de micélio do patógeno oriundos de bordas das

lesões de colônias em plantas adultas no campo, Graham (1995) usou suspensão

de zoósporos do patógeno para inocular o solo e na inoculação de mudas. Aguilar-

vildoso & Pompeu jr (1997) introduziu palito de dente, previamente contaminado com

o patógeno, nas hastes das plantas.

Encontrar um método de inoculação que se assemelhe á realidade do campo

e que possa ser usado precocemente para testar os genótipos desenvolvidos pelos

programa de melhoramento genético de plantas cítricas PMGC é um desfio que

deve ser testado, porque ajudaria muito os PMGC e permitiria descartar plantas sem

resistência rapidamente, ganhando tempo e espaço nos viveiros e casas de

vegetação. Através do PMGC da Embrapa Mandioca e Fruticultura foram

desenvolvidos diversos híbridos que necessitam ser testados como porta-enxerto e

também na interação porta-enxerto/copa.

12

3. CAPÍTULO 1

MÉTODOS DE INOCULAÇÃO PARA AVALIAÇÃO PRECOCE DE RESISTÊNCIA

NO PATOSSISTEMA CITROS/Phytophthora spp.

RESUMO

Nos programas de melhoramento a busca por métodos precoces para

avaliação da resistência de citros à gomose é constante visando simplicidade,

facilidade e rapidez de resposta. No Brasil, Phytophthora citrophthora e P. nicotianae

são os principais agentes da gomose dos citros. O trabalho objetivou testar a

inoculação em partes destacadas de plantas cítricas, folhas e segmentos de ramos,

frutos para desenvolver um método de inoculação quanto à resistência de híbridos

de citros a P. citrophthora. Em campo foram coletados folhas, frutos e ramos em

estágio intermediário de desenvolvimento de limoeiro Siciliano e Poncirus trifoliata

„Kryder‟ e realizada a assepsia em laboratório. As folhas e os frutos foram

inoculados com 10µL de suspensão na concentração de 5x105 zoósporos/mL ou

disco de cultura BDA (3mm) contendo estruturas do patógeno, com ferimento

(causado por abrasivo) e sem ferimento na superfície dos frutos e nas faces abaxial

e adaxial das folhas. Os ramos foram inoculados imediatamente após à coleta e

desinfestação superficial, utilizando-se três métodos: Inoculação com gotas da

suspensão de zoósporos, inoculação por imersão em suspensão de zoósporos

durante 20, 40 e 60 minutos e inoculação por disco de cultura do patógeno. As

avaliações foram feitas no programa Assess e a análise e testes de médias pelo

programa estatístico R. Dos 17 isolados testados, o LRS 45/17 de P. citrophthora

mostrou-se ativo e patogênico à folhas e frutos de limoeiro siciliano tendo sido usado

em todos os demais experimentos. Independente do método de inoculação, tipo de

inóculo, da presença ou ausência de ferimento, as inoculações em folhas

destacadas e pedaços de ramos permitiram a diferenciação entre os dois genótipos,

com o limoeiro siciliano apresentando as maiores lesões. As inoculações em frutos

provocaram necrose total. Para o método de folhas destacadas a inoculação com

suspensão de zoósporos aplicada na face abaxial das folhas e sem ferimento teve a

melhor combinação. A imersão da extremidade dos ramos na suspensão de

zoósporos por 40 minutos proporcionou melhor resultado que os demais tempos

13

testados. A inoculação em partes destacadas das plantas tem potencial para

avaliação precoce de plantas cítricas quanto a resistência à gomose.

Palavras-chave: Citrus spp., gomose, Phytophthora citrophthora

14

METHODS OF INOCULATION FOR EARLY RESISTANCE EVALUATION IN THE

PATHOSYSTEM CITROS/Phytophthora spp

ABSTRACT

In breeding programs, the search for early methods to evalauate disease

resistance is constant, aiming at simplicity, ease and speed of response. In Brazil,

Phytophthora citrophthora and P. nicotianae are the main agents of citrus gummosis.

This study aimed to test the inoculation in detached parts of citrus plants, leaves and

branch segments, besides fruits, to develop an inoculation method for the resistance

to P. citrophthora in citrus hybrids. The experiments were carried out at the

Phytopathology Laboratory of Embrapa Cassava & Tropical Fruits, in Cruz das

Almas-BA. Leaves, fruits and branches at intermediate stage of development were

collected in plants of Sicilian lemon and Poncirus trifoliata „Kryder‟ in the field and

sanitized at the laboratory. Leaves and fruits were inoculated with 10 µL of a

inoculum suspension at the concentration of 5x105 zoospores/mL or culture disc (3

mm) containing pathogen structures, with wound (caused by abrasive) and without

wound on the surface of the fruits and on abaxial and adaxial leaves surfaces.

Branches were inoculated immediately after collection and superficial disinfection,

using three methods: inoculation with drops of the zoospore suspension, inoculation

by immersion in zoospore suspension for 20, 40 and 60 minutes and inoculation by

culture disc with pathogen structures. Evaluations were made in the program Assess,

while the analysis and means tests were carried out in the statistical program R.

Among the 17 isolates tested, the LRS 45/17 of P. citrophthora proved to be active

and pathogenic to leaves and fruits of Sicilian lemon, and was used in all other

experiments. Regardless of inoculation method, type of inoculum, presence or

absence of lesion, the inoculations in detached leaves and branch segments allowed

to differentiate between both genotypes, and Sicilian lemon had the largest lesions.

Inoculations in fruits caused total necrosis. For the method of detached leaves,

inoculation with zoospore suspension applied on the abaxial surface of the leaves

and without wound proved to be the best combination, although in some cases the

use of culture disc with pathogen structures was also effective. The 40-minute time

for branch tip immersion in zoospore suspension was the best one among the three

15

tested. Inoculation in detached plant parts has potential for early evaluation of citrus

plants regarding the resistance to gummosis.

Key words: Citrus spp., gummosis, Phytophthora citrophthora

16

3.1. INTRODUÇÃO

O gênero Citrus apresenta espécies de importância econômica, incluindo

laranja doce (Citrus sinensis), tangerineiras (C. reticulata), limões (C. limon), limas

(C. aurantium) e pomelos (C. paradisi). Os citros são originários do sudeste asiático,

sendo a espécie frutífera mais plantada no mundo. A cultura dos citros é uma das

mais importantes na economia brasileira sobre pontos de vista econômico e social.

As doenças, entre outros fatores, podem afetar a citricultura causando prejuízos na

produção e demandando recursos para proteção e controle em viveiros e pomares.

Entre as principais doenças estão aquelas causadas por Phytophthora

spp.(SIVIERO 2001).

A Gomose é causada por varias espécies de Phytophthora, porém, no Brasil,

P. nicotianae e P. citrophthora são as espécies predominantes (FEICHTENBERGER

et al., 2001).

A Gomose dos citros é um dos fatores limitantes à citricultura brasileira, sendo

o Brasil o maior produtor de frutas cítricas e líder mundial na exportação de suco de

laranja (NEVES et al., 2010). Encontrar porta-enxertos resistentes a essa doença é

um dos principais objetivos do programa de melhoramento genético dos citros,

realizado pela Embrapa Mandioca e Fruticultura.

Métodos de inoculação artificial devem ser práticos, seguros e estáveis e o

mais possível correlacionar-se com as infecções naturais no campo. Métodos de

avaliação de doenças devem ser voltados prioritariamente a plantas jovens a fim de

contribuir para agilizar o processo de seleção de material (SIVIERO et al., 2002a).

As lesões causadas por Phytophthora em folhas, brotos novos e hastes são

muito frequentes em viveiros (Feichtenberger 2001), porém, na literatura consultada

não foram encontrados estudos com partes destacadas de planta cítricas para testar

à resistência à gomose de Phytophthora spp.

Encontrar um método prático, eficiente e rápido que possa avaliar

precocemente a resistência de materiais genéticos para qualquer patossistema é

sempre de grande ajuda para os programas de melhoramento genético (Magalhães

17

et al., 2016). Sendo assim, há necessidade também de se encontrar um tipo de

método com estas características para o patossistema Citros/Phytophthora spp.

O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um método de

inoculação que permita de forma precoce avaliar à resistência de genótipos de citros

a Phytophthora citrophthora.

3.2. MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Fitopatologia da

Embrapa Mandioca e Fruticultura, em Cruz das Almas-BA, com luz e temperatura

controladas.

Dezessete isolados de Phytophthora das espécies P. nicotianae (10) e P.

citrophthora (7) provenientes de diferentes locais do Estado de São Paulo (Tabela

1), foram cedidos pelo Dr. Eduardo Feichtenberger (Unidade de Pesquisa e

Desenvolvimento de Sorocaba, APTA Regional).

Os isolados de P. citrophthora e P. nicotianae tão logo recebidos foram

ativados (recuperados) em frutos e folhas de limoeiro Siciliano, obedecendo aos

quatro princípios dos postulados de Koch. Apos está etapa de ativação dos isolados

foi realizado um ensaio para seleção dos isolados mais agressivos de P. citrophthora

e P. nicotianae.

Os meios de cultura usados para cultivo dos isolados foram: Agar-Água (20g

de agar e 1000 mL de água) e Cenoura-Agar (20g de agar, 100g de cenoura, batida

no liquidificador e filtrada, completando o volume para 1000 mL de água). Os meios

foram autoclavados a 121°C por 20 minutos.

Frutos e folhas de limoeiro Siciliano em estágio intermediário de maturação

foram coletados nas primeiras horas da manhã, e levados para o laboratório de

Fitopatologia onde, foram lavados em água corrente e imersos em uma solução de

0,5% de hipoclorito de sódio, durante 5 minutos, retirados desta solução e lavados

em água destilada estéril.

18

Para a inoculação, as folhas foram colocadas em caixa plásticas (Gerbox)

medindo 12 cm x 12 cm as quais haviam sido higienizadas com a solução de 0,5%

de hipoclorito de sódio e revestidas com espumas das mesmas dimensões da caixa,

devidamente autoclavadas. As espumas foram arrumadas dentro de cada gerbox e

umedecidas com água estéril, para manter a umidade do material a ser inoculado.

Tabela 1 – Dados dos isolados de Phytophthora citrophthora e P. nicotianae, obtidos para ativação

em folhas e frutos de Limoeiro Siciliano.

Cultura n° Procedência Município

Data

isolamento Espécie

LRS 01/15 Viveiro telado Botucatu-SP 10/03/2015 P. nicotianae

LRS 03/15 Pomar comercial Botucatu-SP 06/04/2015 P. nicotianae

LRS 04/15 Pomar comercial Itapira-SP 06/04/2015 P. nicotianae



LRS 10/15 Viveiro telado Itápolis-SP 05/08/2015 P. nicotianae

LRS 11/15 Viveiro telado Itápolis-SP 05/08/2015 P. nicotianae

LRS 13/15 Pomar comercial São Miguel Arcanjo-SP 13/10/2015 P.citrophthora

LRS 15/15 Pomar comercial São Miguel Arcanjo-SP 13/10/2015 P.citrophthora

LRS 20/15 Pomar comercial São Miguel Arcanjo-SP 13/10/2015 P.nicotianae

LRS 04/16 Pomar comercial Pirapora-MG 13/10/2016 P.nicotianae

LRS 05/16 Pomar comercial Ouroeste-SP 11/11/2016 P.nicotianae

LRS 41/17 Pomar comercial Itapetininga-SP 23/06/2017 P.citrophthora





Cada isolado foi inoculado em duas folhas, sendo uma sem ferimento e outra

com ferimentos (causado com agulha histologica), na sua face abaxial, colocando-se

um fragmento de 0,5cm2 de meio de cultura contendo micélio de um dos isolados de

P. nicotianae ou de P. citrophthora. As folhas foram acomodadas nas caixas

(gerbox), forradas com espuma esterilizada úmida. O experimento seguiu o modelo

experimental inteiramente casualizado, com duas repetições por isolado.

19

Para a inoculação dos frutos, foi retirado um pequeno fragmento do epicarpo

e mesocarpo do fruto, com deposição do micélio em meio de cultura e recobrindo-se

a inoculação com o epicarpo e o mesocarpo retirados. Esses frutos foram mantidos

em câmara úmida (sacos de polietileno) por até 72 horas. O experimento seguiu o

modelo experimental inteiramente casualizado com dois frutos sendo inoculados por

cada isolado (Figura 1).

Figura 1 - Ativação da agressividade dos isolados Phytophthora citrophthora e P. nicotianae em

frutos de limoeiro Siciliano: A. Desinfestação de frutos de limoeiro siciliano; B. Retirada

do disco do meio de cultura contendo estruturas do patógeno; C. Deposição do disco

contendo micélio; D. Fruto inoculado; E. Frutos incubados em saco de polietileno para

efeito de câmara úmida; F. Isolamentos a partir dos frutos inoculados.

As folhas e frutos do teste de agressividade foram avaliados com 48 e 72

horas após a inoculação pelo programa Assess, calculando a área lesionada em

cm2. Os frutos e folhas que apresentaram sintomas típicos da doença foram

coletados e utilizados para reisolamento do patógeno em placas de Petri contendo

meio Agar-Água e após o crescimento do patógeno, repicados para o meio Cenoura-

Agar.

20

A presença dos patógenos foi confirmada com base nas características

morfológicas apresentadas pelas culturas no reisolamento, facilmente observadas a

olho nú e através de visualização de estruturas do patógeno em lâminas temporárias

sob microscópio óptico.

3.2.1. Avaliação de métodos de inoculação de Phytophthora com material

destacado de plantas cítricas

3.2.1.1. Material vegetal

Em campo foram coletados folhas e ramos em estágio intermediário de

desenvolvimento. Os ramos de limoeiro Siciliano e Poncirus trifoliata „Kryder‟ foram

seccionados em pedaços de 10 cm de comprimento e frutos em estágio médio de

maturação. Os matériais vegetais foram lavadas em água corrente com detergente,

imersos em uma solução de 0,5% de hipoclorito de Sódio, durante 5 minutos, com

posterior lavagem em água destilada estéril.

Caixas plásticas (Gerbox) medindo 12 cm x 12 cm e espumas com as

mesmas dimensões, foram lavadas com detergente, enxaguadas em água corrente,

lavadas em água destilada estéril e posteriormente imersos em uma solução de

0,5% de hipoclorito de sódio e secados sobre a bancada. As espumas foram

arrumadas dentro de cada gerbox e colocado 10 mL de água estéril em cada, para

manter a umidade do material a ser inoculado.

3.2.1.2. Inóculo

O isolado LRS 45/17 (P. citrophthora), foi repicado para meio de cenoura –

agar (Ca) e mantido em BOD com florescência constante por sete dias para

inoculação dos discos de cultura contendo estruturas do patógeno.

Para o preparo da suspensão de zoósporos as culturas do isolado LRS 45/17

(P. citrophthora) foram cultivadas em CA e incubadas no escuro contínuo. Após 7

dias de incubação, o meio de cultura contendo micélio foi cortados em tiras paralelas

de 4 mm de largura, em seguida as tiras foram transferidas para placas de Petri

contendo meio de cultura liquido de CA (200g de cenoura para 1000 mL de água

21

destilada), sendo mantidas à 25°C, sob luz continua (fluorescente), durante 48

horas. Os esporângios foram submetidos a um choque térmico com água gelada

para induzir a formação de zoósporos (Luz et al., 2008). A suspensão de zoósporos

foi ajustadas para a concentração de 5x105 zoósporos/mL.

3.2.1.3. Inoculação com suspensão de zoósporo em folhas sem ferimento

e com ferimento

As folhas do tratamento com ferimento foram tratadas com abrasivo

(carborundum), esfregado levemente na face abaxial e adaxial das folhas, depois

removendo o abrasivo com água abundante, e enxugando as folhas com um papel

toalha. As folhas com ferimento e sem ferimento receberam 10µL de suspensão na

concentração de 5x105 zoósporos/mL em um único ponto do limbo foliar na face

abaxial e adaxial. As testemunhas também foram feridas com abrasivo ou não e

inoculadas com 10µL de água estéril.

3.2.1.4. Inoculação com disco de micélio em folhas com e sem ferimento

Foi depositado um disco de cultura (3 mm) de diâmetro em CA, aos 7 dias de

idade, contendo estruturas do patógeno na face abaxial e adaxial, nas folhas sem

ferimento e em folhas lesionadas com o abrasivo (carborundum). As testemunhas

foram inoculadas com um disco de CA (Figura 2).

As folhas foram acomodadas nas caixas plásticas (Gerbox), forradas com

espuma esterilizada umedecida, mantidas durante 14 dias na banca do laboratório,

sob fotoperíodo de 12 h luz e 12 h escuro. As avaliações foram feitas sete e 15 dias

após as inoculações (DAI) usando o programa Assess, sendo mantidas na bancada

do laboratório até 15 DAI para observação das folhas sem ferimentos.

O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com seis repetições,

quatro fatores em estudo: inoculação em dois genótipos de citros, na face abaxial e

adaxial da folha, com ferimento e sem ferimento, pelos métodos de disco de cultura

e suspensão de zoósporos, perfazendo um fatorial 2x2x2x2, totalizando 16

tratamentos. Os dados experimentais foram submetidos à análise de variância e

testes de médias com auxílio do programa estatístico R (R CORE TEAM, 2017).

22

Figura 2 – Inoculação de Phytophthora citrophthora pelo o método de disco de micélio em folhas de

citros: A. Deposição no abrasivo na folha; B. Abrasivo sendo friccionado sobre a folha;

C. Folhas sendo lavadas para retirar o abrasivo; D. Retirada do disco do meio de cultura

contendo estruturas do patógeno; E. Disco de micélio sendo depositado sobre a folha; F.

Folhas inoculadas na face abaxial e adaxial.

3.2.1.5. Inoculação em frutos

Os frutos foram inoculados com ferimento (causados por abrasivo

carborundum) e sem ferimento, através de suspensão de zoósporos (10 µL na

concentração de 5x105 zoósporos/mL) e disco de cultura (3 mm) de diâmetro

contendo estruturas do patógeno (micélio, esporângios e zoósporos). As lesões

foram envolvidas com algodão estéril e fita crepe.

Os frutos foram acomodados em sacos plásticos de polietileno, para criar um

efeito de câmara úmida. O experimento seguiu o modelo experimental inteiramente

casualizado com três repetições por tratamento, com os frutos sendo mantidos

durante 10 dias sobre a banca do laboratório. As avaliações foram feitas sete dias

após as inoculações.

3.2.1.6. Inoculação em ramos de citros

Os ramos de limoeiro Siciliano e P. trifoliata „Kryder‟ foram inoculados

imediatamente após à coleta e desinfestação superficial, utilizando-se três métodos:

23

Inoculação com gotas da suspensão de zoósporos, inoculação por imersão em

suspensão de zoósporos e inoculação por disco de cultura.

Para a inoculação com gotas da suspensão, foi feito um ferimento com um

furador de 3 mm de diâmetro no ramo da planta e ali depositados 10 µL de

suspensão na concentração de 5x105 zoósporos/mL, com posterior devolução da

casca para o local de origem, sendo a região inoculada envolvida com algodão

umedecido.

Figura 3 – Inoculação de Phytophthora citrophthora em pedaços de ramos de limoeiro siciliano e

Poncirus trifoliata „Kryder através do método de disco de cultura: A. Ramos de limoeiro

siciliano e P. trifoliata „Kryder medindo 10 cm; B. Furo de 3 mm de diâmetro para

retirada da casca; C. Furo com as mesma dimensões em placa contendo culturas do

patógeno; D. Retirada do disco do meio de cultura contendo estruturas do patógeno;

E. Deposição do disco de micélio em ramos de citros e devolução da casca.

Na inoculação por imersão em suspensão de zoósporos, em uma das

extremidades dos ramos usou-se vaselina como cicatrizante local, ajudando o ramo

a recuperar mais rápido e manter fungos e bactérias afastados, posteriormente a

24

outra extremidade foi mergulhada, até 2 cm, em suspensão na concentração de

5x105 zoósporos/mL, durante períodos 20, 40 e 60 minutos.

Para a inoculação usando disco de cultura, foi feito um ferimento com um

vasador de cortiça (3mm) de diâmetro no ramo e ali depositado um disco de cultura

com as mesmas dimensões sobre a lesão, com posteriormente devolução da casca,

sendo esta região envolvida com algodão úmido.

Em todos os tratamentos, após as inoculações os ramos foram acomodados

em caixas (gerbox), forradas com espuma esterilizada umedecida (Figura 3) e as

caixas mantidas durante dez dias sobre a bancada do laboratório. As avaliações

foram feitas dez dias após as inoculações.

O experimento seguiu o modelo experimental inteiramente casualizado com

três gerbox, contendo oito ramos em cada, totalizando 24 repetições por tratamento.

3.3. RESULTADOS

3.3.1. Avaliação da agressividade de isolados de Phytophthora spp.

Todos os 17 isolados recebidos da Unidade de Pesquisa e desenvolvimento

de Sorocaba, São Paulo, foi patogênico em folhas e frutos de limoeiro siciliano, que

variaram em folhas de 0,3 a 3,9 cm2, enquanto em frutos as variações foram de 2,1

a 7,1 cm2. Portanto, constatou-se ampla variação na agressividade dos isolados aos

órgãos vegetais testados (Tabela 2).

Na impossibilidade de utilizar vários isolados nos experimentos seguintes, foi

selecionado o isolado LRS 45/17 usado para as inoculações dos experimentos

posteriores.

3.3.2. Inoculações em folhas destacadas

Para as inoculações em folhas destacadas os fatores porta-enxerto, face da

folha, método de inoculação (sem e com ferimento) e tipo de inóculo (disco de

cultura do patógeno ou suspensão de zoósporos), bem como 5 das interações entre

eles foram altamente significativas (Tabela 3), as exceções foram as interações:

25

(face da folha x método de inoculação); (face da folha x tipo de inóculo); (método de

inoculação x tipo de inóculo); (porta-enxerto x face da folha x método de inoculação)

e (porta-enxerto x método de inoculação x tipo de inóculo).

Tabela 2 – Lesões causadas por isolados de Phytophthora citrophthora e P. nicotianae, ativados em

folhas e frutos de Limoeiro Siciliano.

Isolados Espécies Folhas Frutos

Média (cm2)

LRS 01/15 P. nicotianae 0,3 2,1







LRS 06/15 P. nicotianae 0,95 5



LRS 43/17 P.citrophthora 2,2 5,3

LRS 41/17 P.citrophthora 2,4 5






Para o método de inoculação também houve diferença significativa sendo que

o tratamento com ferimento apresentou maiores lesões em folhas de limoeiro

siciliano, quando comparado com folhas inoculadas sem ferimentos.

Considerando que não houve lesão em Poncirus, quando inoculado sem

ferimento, o desdobramento da interação porta-enxerto com os demais fatores está

sendo apresentado apenas para face da folha inoculada e tipo de inóculo utilizado

(Tabela 4).

As lesões em limoeiro siciliano foram maiores para três das interações a

exceção foi para o tratamento inoculação com disco de cultura na face adaxial da

folha quando não diferiram as lesões em ambos porta-enxertos.

26

Tabela 3 – ANAVA para o experimento de inoculação em folhas (cm2).

Fatores de variação GL SQ QM Fc Pr>Fc Pr(>F)

Porta-enxerto 1 35384,00 35384,00 136,19 0,0000 **

Face da folha 1 3370,00 3370,00 12,97 0,0005 **

Método de inoculação 1 8912,00 8912,00 34,30 0,0000 **

Tipo de inóculo 1 16561,00 16561,00 63,74 0,0000 **

Porta-enxerto: Face da folha 1 3133,00 3133,00 12,06 0,0008 **

Porta-enxerto: Método de inoculação 1 3279,00 3279,00 12,62 0,0006 **

Face da folha: Método de inoculação 1 317,00 317,00 1,22 0,2730 Ns

Porta-enxerto: Tipo de inóculo 1 19125,00 19125,00 73,61 0,0000 **

Face da folha: Tipo de inóculo 1 633,00 633,00 2,44 0,1226 Ns

Método de inoculação: Tipo de inóculo 1 400,00 400,00 1,54 0,2186 Ns

Porta-enxerto: Face da folha: Método de inoculação 1 395,00 395,00 1,52 0,2214 Ns

Porta-enxerto: Face da folha: Tipo de inóculo 1 1520,00 1520,00 5,85 0,0178 *

Porta-enxerto: Método de inoculação: Tipo de inóculo 1 876,00 876,00 3,37 0,0701 Ns

Face da folha: Método de inoculação: Tipo de inóculo 1 5306,00 5306,00 20,42 0,0000 **

Porta-enxerto: Face da folha: Método de inoculação: Tipo de inóculo 1 3481,00 3481,00 13,40 0,0005 **

Resíduo 80 20786,00 260,00

Total 95 123475,74

CV (%)

70,12

No desdobramento das interações para o fator face da folha inoculada, só

houve diferença significativa nas medias de lesões causadas em limoeiro siciliano

inoculado com ferimento com o disco de cultura e para o limoeiro siciliano inoculado

com suspensão de zoósporos sem ferimento na folha, onde as lesões na face

abaxial foram bem maiores que quando comparados com a face adaxial das folhas

(Tabela 5). Os demais tratamentos envolvendo o limoeiro siciliano e P. trifoliata

„Kryder‟ não diferiram estatisticamente entre si. O limoeiro siciliano inoculado com

disco de cultura sem ferimento não apresentou lesão na face abaxial da folha,

fugindo a regra dos demais.

Analisando a tabela 6, sobre o desdobramento do método de inoculação com

ferimento e sem ferimento, nota-se que só houve diferença estatística para dois

tratamentos em limoeiro siciliano, quando se inóculou com disco de cultura na face

abaxial da folha e inoculação na face adaxial de planta com suspensão de

zoósporos. Observou-se que quando se utilizou disco de micélio sem ferimento, não

houve lesão para o tratamento limoeiro siciliano inoculado na face abaxial, mas para

suspensão de zoósporos lesões se formaram nas mesmas condições, embora

27

menores como seria esperado que no tratamento com ferimentos. Isto reforça que a

inoculação com suspensão de zoósporos é mais eficiente que o disco de cultura.

Tabela 4 – Valores médios da porcentagem de lesão provocadas por P. citrophthora , obtidas das

folhas de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata „Kryder‟, em função da face da folha abaxial e

adaxial, do método de inoculação com e o tipo de inoculação em disco e suspensão.

Face da

folha Método de inoculação Tipo de inóculo

Porta-enxerto

Limoeiro siciliano Poncirus trifoliata „Kryder‟

Abaxial CF Disco 40,06 a 12,79 b

Abaxial CF Suspensão 90,86 a 3,22 b

Adaxial CF Disco 10,65 a 6,30 a

Adaxial CF Suspensão 89,09 a 8,02 b

Médias seguidas de mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de significância. Método de

inoculação; Com ferimento (CF).

Tabela 5 – Valores médios da porcentagem de lesão provocada P. citrophthora, obtidas das folhas de

limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata „Kryder‟ em função de: porta-enxerto limoeiro

siciliano e P. trifoliata „Kryder‟, método de inoculação com ferimento e sem ferimento e

tipo de inoculação através de disco de micélio e suspensão de zoósporos.

Porta-enxerto Método de inoculação Tipo de inóculo Face da folha

Abaxial Adaxial

Limoeiro siciliano CF Disco 40,06 a 10,65 b

Limoeiro siciliano CF Suspensão 90,86 a 89,09 a

Limoeiro siciliano SF Disco 0,00 a 9,04 a

Limoeiro siciliano SF Suspensão 84,38 a 13,41 b

Poncirus trifoliata „Kryder‟ CF Disco 12,79 a 6,30 a

Poncirus trifoliata „Kryder‟ CF Suspensão 3,22 a 8,02 a


inoculação; Com ferimento (CF); Sem ferimento (SF).

Dados expostos na tabela 7 demonstram que quando comparados os tipos de

inóculo disco de cultura ou suspensão de zoósporos, diferenças significativas foram

obtidas apenas para o limoeiro siciliano inoculado na face abaxial das folhas com e

sem ferimento e na face adaxial da folha com ferimento. Nos três tratamentos o

método de inoculação com suspensão de zoósporos foi superior ao de disco de

cultura com estruturas do patógeno, proporcionando ao patógeno causar maiores

lesões.

28

Tabela 6 – Valores médios da porcentagem de lesões provocada P. citrophthora, obtidas das folhas

de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata „Kryder‟ em função dos porta-enxertos limoeiro

siciliano e P. trifoliata „Kryder‟, face da folha abaxial ou adaxial com os tipo de inoculação

através de disco de micélio e suspensão de zoósporos.

Porta-enxerto Face da folha Tipo de inóculo Método de inoculação

Com ferimento Sem ferimento

Limoeiro siciliano Abaxial Disco 40,06 a 0,00 b

Limoeiro siciliano Abaxial Suspensão 90,86 a 84,38 a

Limoeiro siciliano Adaxial Disco 10,65 a 9,04 a

Limoeiro siciliano Adaxial Suspensão 89,09 a 13,41 b

Poncirus trifoliata „Kryder‟ Abaxial Disco 12,79 a 0,00 a

Poncirus trifoliata „Kryder‟ Abaxial Suspensão 3,22 a 0,00 a

Poncirus trifoliata „Kryder‟ Adaxial Disco 6,30 a 0,00 a

Poncirus trifoliata „Kryder‟ Adaxial Suspensão 8,02 a 0,00 a

Médias seguidas de mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de significância.

Como os quatros fatores foram altamente significativos pelo teste f,

considerou-se a anava da análise fatorial (desdobramentos) também para a

interação quádrupla (porta-enxerto x face da folha x método de inoculação x tipo de

inóculo).

Tabela 7 - Valores médios da porcentagem de lesões provocada P. citrophthora, obtidas das folhas

de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata „Kryder‟ em função dos porta-enxertos limoeiro

siciliano e P. trifoliata „Kryder‟, face da folha abaxial ou adaxial com os método de

inoculação com ferimento e sem ferimento.

Porta-enxerto Face da folha Método de inoculação Tipo de inóculo

Disco Suspensão

Limoeiro siciliano Abaxial CF 40,06 b 90,86 a

Limoeiro siciliano Abaxial SF 0,00 b 84,38 a

Limoeiro siciliano Adaxial CF 10,65 b 89,09 a

Limoeiro siciliano Adaxial SF 9,04 a 13,41 a

Poncirus trifoliata „Kryder‟ Abaxial CF 12,79 a 3,22 a

Poncirus trifoliata „Kryder‟ Adaxial CF 6,30 a 8,02 a


inoculação (Met-inoc); Com ferimento (CF); Sem ferimento (SF); Porta-enxerto (PE); Face da folha (FF) e Tipo

de inoculação (TI).

29

Em folhas de limoeiro siciliano, a combinação inoculação na face abaxial com

disco de micélio sem ferimento, foi a única que não desenvolveu lesão. Em todas os

outros tratamentos envolvendo o limoeiro siciliano houve formação de lesões. As

maiores lesões ocorreram em folhas de limoeiro siciliano inoculadas com suspensão

de zoósporos na face abaxial das folhas com (S.AB.CF.SUS) ou sem ferimento

(S.AB.SF.SUS) e inoculadas com suspensão de zoósporos na face adaxial das

folhas com ferimento (S.AD.CF.SUS) (Figura 4). Nestas três condições as médias

não diferiram entre si.

Para o método de inoculação em disco de micélio a melhor combinação foi a

inoculação em folhas na face abaxial de limoeiro siciliano, com ferimento

(S.AB.CF.DIS) (Figura 4).

Figura 4 - Comparação de médias da lesão da folha obtidas do resultado da interação de quatro fatores:

Porta Enxerto (Siciliano (S) e Poncirus (P)); Face da folha (Abaxial (AB) e Adaxial (AD));

Método de inoculação (Com ferimento (CF) e sem ferimento (SF)) e Tipo de Inoculação (Disco

(DIS) e Suspensão (SUS)). Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste

Tukey a 5% de significância.

Nas inoculações em folhas de Poncirus os quatros tratamentos sem

ferimentos não geraram lesões (P.AB.SF.SUS, P.AD.SF.SUS, P.AB.SF.DIS e

30

P.AD.SF.DIS). Só ocorreram lesões nas inoculações com ferimento sendo que dois

tratamentos (P.AD.CF.DIS e P.AB.CF.SUS) não diferiram significativamente dos

tratamentos em que não apareceram lesões.

Para Poncirus não houve diferença estatística para tipo de inoculação com

suspensão de zoósporos ou disco de cultura do patógeno nem para face de

deposição do inóculo na folha, com uso de ferimento.

O fato de P. trifoliata „Kryder‟ só desenvolver lesões na presença de ferimento

nas folhas, sugere a existência de algum mecanismo físico relacionado à resistência

P. citrophthora nas folhas que precisa ser melhor estudado.

3.3.3. Inoculações em frutos

Os frutos de limoeiro siciliano e P. trifoliata „Kryder‟ foram avaliados sete dias

após a inoculação. Todos os frutos apresentaram lesão, independente do

tratamento. Porém, como as inoculações só foram feitas de forma drástica, aos 7

dias os frutos se encontravam completamente lesionados, não permitindo a tomada

de dados. Portanto conclui-se que o método testado não serve para avaliar a

resistência dos genótipos, pelo menos no período usado para avaliação (7 dias).

3.3.4. Inoculações em pedaços de ramos

Para a inoculação de pedaços de ramos três métodos foram testados:

imersão de ramos, inoculações com disco de cultura ou suspensão de zoósporos.

3.3.4.1. Imersão dos ramos

Nos tratamentos com imersão dos ramos de limoeiro siciliano e P. trifoliata

„Kryder‟, houve diferença significativa entre os genótipos. O limoeiro Siciliano

sabidamente suscetível a Phytophthora spp., apresentou lesões maiores quando

comparado com o P. trifoliata „Kryder‟ o que já era esperado, uma vez que os P.

trifoliata são usados como padrão de resistência em experimentos que visam testar

a resistência de genótipos de citros à gomose de Phytophthora (Figura 5).

Os ramos de limoeiro siciliano e P. trifoliata „Kryder‟, imersos por 40 minutos

em suspensão de zoósporos apresentaram maiores lesões que nos demais tempos

31

de imersão (Tabela 8). A imersão dos ramos durante o tempo de 20 minutos

apresentou lesões pequenas, sem diferença significativa entre os porta-enxertos, o

que não é desejável em avaliações precoces.

Figura 5 – Lesões (cm2) em ramos de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata

„Kryder‟ inoculados com Phytophthora citrophthora com o método de

imersão dos ramos em suspensão de zoósporos.

Constatou-se que em todos os tempos de avaliação o limoeiro siciliano

apresentou lesões maiores quando comparado com o P. trifoliata „Kryder‟.

Tabela 8 – Comparação entre as áreas médias de lesões causadas pela imersão de ramos de

limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata „Kryder‟ em suspensão de zoósporos de

Phytophthora citrophthora durante os tempos de 20, 40 e 60 minutos.

Tempos Média (cm2)

40 minutos 11,95a

60 minutos 9,16ab

20 minutos 8,73b

Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de significância.

Assim, o tempo de 40 minutos foi eficiente para discriminar os genótipos de

citros quanto a sua resistência/suscetibilidade. Dentre os tempos testados, ele é o

Poncirus trifoliata ‘Kryder’ Limoeiro Siciliano

5,80 b

14,09 a

Genótipos de citros

32

mais indicado para avaliar e pré-selecionar porta-enxertos de citros quanto

resistência à Gomose de Phytophthora, caso este método venha a ser utilizado.

3.3.4.2. Inoculação com disco de cultura e suspensão de zoósporos

Quando comparados os dois métodos de inoculação, sem efeito de genótipos,

o método de disco de micélio apresentou lesões maiores (10,87 cm2) do que o de

gotas da suspensão de zoósporos (7,26 cm2).

O limoeiro siciliano apresentou lesões bem significativa independente do

método de inoculação, seja com disco de cultura ou suspensão de zoósporos, já o

P.trifoliata „Kryder‟ apresentou lesões pequenas em ambos os métodos de

inoculação.

Quando avaliamos os porta-enxertos dentro dos métodos de inoculação

(Tabela 9), o limoeiro siciliano e P. trifoliata „Kryder‟ apresentaram maiores lesões

em ramos com a inoculação de disco de cultura. Sabe-se que a suspenção de

zoósporo é mais precisa por estimar a quantidade de inóculo depositada no local da

inoculação, porém a inoculação com disco de cultura contendo micélio e

esporângios também é eficiente, uma vez que apresentou resultados semelhantes á

inoculação com suspensão de zoósporos.

Tabela 9 - Análise da inoculação de ramos de limoeiro siciliano e Poncirus trifoliata „Kryder‟ com

Phytophthora citrophthora nos métodos de suspensão de zoósporos e disco de cultura.

Método de inoculação Limoeiro siciliano Poncirus trifoliata ‘Kryder’

Média (cm2)

Suspensão de zoósporos 7,99 a 6,52 b

Disco de cultura 13,71 a 8,03 b

Médias seguidas de mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste Tukey a 5% de significância

3.4. DISCUSSÃO

Apesar do numero de repetições ter sido baixo (apenas duas unidade de cada

órgão por isolado) foi possível observar que P. citrophthora, apresentou lesões

superiores a 2,0 cm em folhas e iguais ou superiores a 5,0 cm em frutos.

33

Destacaram-se os isolados LRS 15/15; 44/17, 42/17 e 45/17 por apresentarem

sintomas nas folhas no 2º dia após a inoculação e nos frutos no 4º dia após a

inoculação. Caixeta et al., (2013) testando a patogenicidade de 21 isolados de

Phytophthora spp., sendo 20 de (P. nicotianae) e um de (P. citrophthora), inoculados

em mudas de limão „Cravo‟ no caule pelo método de inserção de disco de meio de

cultivo contendo micélio, observou que todos os isolados foram patogênicos às

plantas, onde causaram sintomas característicos de gomose, em diferentes

intensidades: formação de lesões necróticas no caule, com presença abundante de

goma e amarelecimento de folhas, mas os isolados PR20 (P. citrophthora), PR14 e

PR6 (P. nicotianae) apresentaram alta virulência (lesões medindo de 13 a 16 mm de

comprimento). Tem sido observado nas últimas décadas a predominância de

isolamentos de P. citrophthora, em relação às demais espécies que causam gomose

em plantas cítricas. Portanto, a escolha desta espécie para o desenvolvimento

destas pesquisas foi oportuna.

O fato de terem sido encontradas diferenças significativas estatisticamente

entre os porta-enxertos limoeiro siciliano apresentaram maiores lesões do que as de

P. trifoliata „Kryder‟, independente do método de inoculação adotado, está

inteiramente de acordo com a literatura. Há o pressuposto de que esse porta-enxerto

é resistente a Phytophthora spp. Pelo menos em relação a P. citrophthora os

resultados aqui apresentados confirmam está informação (Tabela 4 e Figuras 4-5).

O que também foi observado por Feichtenberger (2001) ao afirmar que o porta-

enxerto P. trifoliata apresenta boas características fitossanitárias como alta

resistência a gomose, aos nematóides, ao vírus da tristeza dos citros e a xiloporose,

no entanto possui aspectos negativos como suscetibilidade ao exocorte, intolerância

ao declínio. Pesquisas anteriores já haviam comprovado a suscetibilidade do

limoeiro siciliano (Rossetti, 1947). Siviero (2002a) testou cinco genótipos para serem

usados como padrões à inoculações com P. Nicotianae (P. Parasítica) e assim

classificou-os: P. trifoliata „Rubidoux‟ e „Davis A‟ (altamente resistentes); limoeiro

„Cravo‟ (moderadamente resistente) e o limoeiro „Siciliano‟ e a tangerineira „Sunki‟

(altamente suscetíveis).

Na face abaxial das folhas de plantas cítricas encontra-se a maior quantidade

de estômatos, que são considerados aberturas naturais para penetração de muitos

patógenos (MACHADO et al., 2005). No presente trabalho inoculações foram feitas

34

nas duas faces das folhas quando se utilizou folhas destacadas para os testes de

inoculação precoce visando testar resistência a P. citrophthora. Constatou-se que

surgiram lesões maiores na face abaxial das folhas, independente do método de

inoculação, da presença ou ausência de ferimento e do porta-enxerto utilizado,

Quanto ao tipo de inoculo utilizado, discos de cultura contendo estruturas do

patógeno ou suspensão de zoósporos, o que se tem observado é que normalmente

para outros patossistemas, como por exemplo para o cacaueiro (Theobroma cacao

L.) x Phytophthora spp. (Luz e Mitchell, 1995 a e b) e para o pimentão (Capsicum

annum L.) x P. capsici (Bowers et al., 2007) as inoculações com suspensão de

zoósporos, são as mais eficientes, por simular com maior precisão o que ocorre

naturalmente em campo. Além disso, os zoósporos estão entre os tipos de inóculo,

que ocorrem com maior abundância em condições naturais, levando em

consideração que um esporângio pode produzir até mais de 30 zoósporos

(Feichtenberger et al., 2005). Como P. citrophthora em citros, raramente produz

clamidósporos (Feichtenberger, 2001) é possível prever que também para o

patossistema citros/Phytophthora os zoósporos sejam os principais propágulos

infectivos.

As inoculações com disco de cultura apresentando estrutura do patógeno,

provocaram maiores lesões. Smith et al. (1987), avaliaram a resistência de cultivares

de laranja doce e diversos porta-enxertos a Phytophthora e concluíram que o

método do disco apresenta maior potencial de inóculo se comparado com métodos

que utilizam zoósporos ou clamidósporos, pois apresentou lesões de tamanho maior

em inoculações experimentais. Anos depois Smith et al. (1991) estudaram a

influência do potencial de inóculo e de diversos métodos de inoculação com

Phytophthora para medir a suscetibilidade de genótipos a gomose, inoculando

plantas jovens em casa de vegetação e concluíram que o método do disco é muito

severo devido a alta densidade de inoculo, o que pode afetar a suscetibilidade da

planta ao patógeno.

Inoculações usando suspensão de zoósporos são mais eficientes, uma vez

que pode-se quantificar o inóculo utilizado, podendo ser usada a mesma

concentração em todos os testes realizados, além de ser, provavelmente. o tipo de

inoculo que irá propiciar as infecções na plantas no campo.

35

O uso de ferimentos para inoculações com Phytophthora é controvertido, pois

em vários patossistemas envolvendo espécies deste gênero e plantas cultivadas, a

penetração ocorre de forma direta (Luz; Matzuoka, 1997; VAZ et al. 2011 e 2015).

Foi verificado nesta pesquisa que Em Poncirus trifoliata apenas se desenvolveram

lesões nas folhas inoculadas com ferimento, independente da face em que o inóculo

foi depositado, tendo a maior lesão em folhas deste genótipo ocorrido para a

combinação P.AB.CF.DIS (Figura 4). Para o limoeiro siciliano também só ocorreram

lesões nas inoculações com disco de micélio na face abaxial da folha, em presença

de ferimento (Tabela 6, Figura 4)). Isto demonstra que os ferimentos servem para

acelerar a colonização do patógeno, mas podem quebrar os mecanismos de defesa

existentes na superfície da folha (Vaz et al., 2011). Santos et al., (1999) testando a

interação Phytophthora capsici Leonian com a seringueira (Hevea brasiliensis (Wild

ex Adr. Juss.) Mull. Arg., observaram que os folíolos maduros inoculados sem

ferimentos reagiram diferentemente às inoculações. Na face abaxial, constatou-se

desde ausência de sintomas até a presença de pontuações escuras ou lesão; na

face adaxial não se verificaram sintomas até 120 horas, após a inoculação. No

entanto os autores, verificaram, em ambas as faces com ferimentos, o aparecimento

de sintomas cerca de 30 horas após a inoculação e constaram a ocorrência de maior

esporulação nas lesões da face abaxial, o que nem sempre ocorreu nas lesões da

face adaxial. Voltando aos dados por nós apresentados, no caso do P. trifoliata, tido

como genótipo resistente, observa-se perfeitamente que houve quebra na folha de

algum mecanismo físico que impedia a penetração do patógeno e, uma vez

eliminado o impedimento, ocorreu a colonização e formação da lesão. Afirma-se,

portanto, que ferimentos não devem ser realizados em folhas para avaliação de

resistência a P. citrophthora em plantas cítricas.

Fawcett (1923) diz que a princípio, qualquer parte da planta pode ser

infectada e avaliada para resistência ao patógeno e que a escolha do seu órgão a

ser inoculado e avaliado deve levar em consideração o tipo da doença, ou seja, se é

foliar, um método de inoculação usando as folhas da planta deve ser empregado.No

entanto, o método de avaliação em folhas destacadas ou discos de folhas, foi

testado com sucesso para avaliação de resistência em outros patossistemas

envolvendo patógenos vasculares, como Ceratocystis cacaofunesta em cacaueiro e

36

patógenos que atacam diversas partes da planta como Phytophthora spp. também

em cacaueiro (Magalhães et al., 2016; Santos et al., 2011; Bahia et al., 2015).

De tudo que foi exposto para inoculação em folhas se infere que, o método

consegue diferenciar entre genótipos resistentes e suscetíveis a P. citrophthora; que

os zoósporos são o tipo de inóculo que deve ser utilizado; que as suspensões de

zoósporos devem ser aplicadas na face abaxial das folhas; e que para testar

resistência em diferentes materiais genéticos usando o método de folha destacada

não se deve fazer ferimentos nas folhas para não quebrar os mecanismos físicos de

resistência que existem, muito provavelmente nas folhas, uma vez que a presença

de ferimento acelera a colonização do patógeno, produzindo lesões maiores.

Os experimentos em laboratório usando partes destacadas da planta cítricas

vêm demonstrando bons resultados, quando comparados com inoculações em

plantas inteiras. Avaliações em laboratório são realizadas em curto tempo e

abrangem maior número de genótipos, economizando custos, mão de obra e tempo

nas seleções de genótipos de citros resistente/tolerante a Gomose de Phytophthora.

37

4. CAPÍTULO 2

SELEÇÃO DE MÉTODO DE INOCULAÇÃO PARA Phytophthora citrophthora EM

HÍBRIDOS DE CITROS.

RESUMO

Sendo a gomose considerada uma doença de grande importância para a

citricultura no Brasil e em nível mundial, encontrar resistência a ela é fundamental.

Phytophthora citrophthora é uma das espécies prevalente no Brasil como agente

etiológico dessa doença. Este trabalho objetivou testar métodos de inoculação em

plantas cítricas para avaliação da resistência a P. citrophthora. O experimento foi

desenvolvido em Laboratório de Fitopatologia, casa vegetação e câmara de

inoculação da Embrapa Mandioca e Fruticultura, em Cruz das Almas-BA. Plantas de

limoeiro „Cravo‟, Poncirus trifoliata „Kryder‟ e de Tangerineira „Sunki‟ Tropical que

apresentavam dois anos de idade e 5,0 a 7,0 mm de diâmetro do caule e altura

média de 0,60 m, foram inoculadas com o isolado LRS 45/17 (P. citrophthora), com

os seguintes tratamentos: a) infestação do substrato sem ferimento no coleto da

planta; b) infestação do substrato com leves perfurações no coleto da planta; c)

Injeção de zoósporos no caule da planta e; d) deposição de disco de cultura

contendo estruturas do patógeno. A área das lesões nas plantas inoculadas no

caule, foi medida pelo programa Assess, 60 DAI. Na infestação do substrato as

avaliações foram através de plaqueamento de substrato e das raízes aos 60, 90 e

120 dias da inoculação. O modelo experimental foi inteiramente casualizado em

fatorial 4x3, sendo quatro métodos de inoculações, com três genótipos e 20 plantas

de cada genótipo para cada método de inoculação além das testemunhas de cada

genótipo para cada método. Nos métodos com infestação do substrato aos 60 dias

constatou-se a presença do patógeno só no solo, mas aos 90 e 120 dias P.

citrophthora foi recuperada tanto as raízes quanto do solo. Maiores lesões foram

formadas nas plantas dos porta-enxertos pelo método de inoculação através de

disco de cultura do patógeno, quando comparado ao método de injeção da

suspensão de zoósporos. O genótipo P. trifoliata „Kryder‟ comportou-se como

resistente/tolerante, conforme o esperado, a tangerineira „Sunki‟ Tropical apresentou

maior suscetibilidade que aos demais porta-enxertos.

38

Palavras-chave: Rutaceae, resistência, Podridão do colo, Gomose.

39

SELECTION OF A METHOD FOR Phytophthora citrophthora INOCULATION IN

CITRUS HYBRIDS.

ABSTRACT

Since gummosis is considered as a disease of great importance for citriculture

in Brazil and on a global level, finding resistance to it is fundamental. Phytophthora

citrophthora is one of the prevalent species in Brazil as etiological agent of this

disease. This study aimed to test inoculation methods in citrus plants to evaluate the

resistance to P. citrophthora. The experiment was carried out at the Phytopathology

Laboratory, greenhouse and inoculation chamber of Embrapa Cassava & Tropical

Fruits, in Cruz das Almas-BA. Two-year-old plants of „Cravo‟ lemon, Poncirus

trifoliata „Kryder‟ and „Sunki‟ Tropical Mandarin with 5.0-7.0 mm stem diameter and

0.60 m height were inoculated with the isolate LRS 45/17 (P. citrophthora), with the

following treatments: a) substrate infestation without lesion in plant collar; b)

substrate infestation with slight perforations in plant collar; c) zoospore injection in

the stem; and d) deposition of culture disc containing pathogen structures. Lesion

area in plants inoculated in the stem was measured by the program Assess, 60 days

after inoculation (DAI). For substrate infestation, evaluations were made by plating of

substrate and roots at 60, 90 and 120 DAI. The experiment was completely

randomized in 4 x 3 factorial scheme, corresponding to four inoculation methods,

with 3 genotypes and 20 plants of each genotype for each inoculation method,

besides controls of each genotype for each method. In the methods with substrate

infestation at 60 DAI, the pathogen was found only in the soil, but at 90 and 120 DAI

P. citrophthora was recovered from both roots and soil. Larger lesions were formed in

the plants of the rootstocks by the inoculation method of pathogen culture disc, when

compared with the method of zoospore suspension injection. The genotype P.

trifoliata „Kryder‟ behaved as resistant/tolerant, as expected, and the „Sunki‟ Tropical

Mandarin showed higher susceptibility in comparison to the other rootstocks.

Key words: Rutaceae, resistance, Foot rot, Gummosis.

40

4.1. INTRODUÇÃO

A incidência e a severidade das doenças em citros (Citrus spp.) causadas por

Phytophthora nicotianae Breda de Haan var. nicotianae (Dastur) Waterhouse e P.

citrophthora (Sm. & Sm.) Leonian têm aumentado muito nas últimas décadas,

(GRAHAM, 1990) constituindo-se em um dos principais problemas da cultura não só

no Brasil como em vários países produtores (MATHERON et al., 1998).

Os primeiros testes de resistência a Phytophthora spp. em variedades de

citros foram realizados por Fawcett (1923), o qual estabeleceu a natureza parasítica

do patógeno. Klotz e Fawcett (1930), utilizando o método de inoculação artificial do

patógeno no tronco e avaliação da área da lesão resultante, investigaram a

resistência de espécies e variedades de Citrus spp. e gêneros relacionados. Esse

método foi subsequentemente usado por outros pesquisadores (Rossetti, 1947).

Os mecanismos de resistência dos citros às infecções de Phythophthora, não

estão ainda totalmente esclarecidos, mas é possível que vários mecanismos estejam

envolvidos, devido às grandes diferenças observadas no tipo de resposta às

infecções, em função do tipo e idade do tecido infectado (Feichtenberger, 2001). Em

programas de melhoramento de porta-enxertos, onde se busca associar, em

híbridos, diversas características de interesse agronômico como adaptabilidade

edafoclimática e resistência a doenças, um dos primeiros critérios de seleção é o

nível de resistência a Phytophthora spp.

Diversas metodologias para avaliação de resistência à gomose em porta-

enxertos de citros vêm sendo utilizadas, tais como: inserção de pedaços e discos de

micélio do patógeno em frutos, ramos e tronco de plantas no campo (Klotz e

Fawcett, 1930); inserção de disco de micélio do patógeno sob a casca de plantas,

semelhante ao processo de borbulhia de gemas (Siviero, 2001; Furr e Carpenter,

1961; Afek e Sztejnberg; 1990); injeção de suspensão de zoósporos em incisões

realizadas na base das plantas (Whiteside, 1974; Smith et al., 1991); e inserção de

agulha infestada com o patógeno in vitro e em plântulas (Siviero, 2002a).

A avaliação das lesões resultantes de inoculações de Phytophthora spp.

podem ser feita medindo-se a área das lesões com o auxílio de planímetro (Klotz e

Fawcett, 1930); pela estimativa da porcentagem de anelamento do tronco (Smith et

41

al., 1987); ou pela medida do comprimento e da largura das lesões e quantificação e

goma (Fawcett, 1923).

Klotz e Fawcett (1930) ressaltam que a simples multiplicação da medida do

comprimento pela largura da lesão visando estimar a área de lesão provocada por

Phytophthora spp. gera erros superestimando a área real entre 25 e 50%.

O presente trabalho teve como objetivo testar métodos de inoculação em

híbridos de citros para avaliar à resistência a P. citrophthora e selecionar um método

padrão.


O experimento foi desenvolvido em Laboratório de Fitopatologia, casa

vegetação e câmara de inoculação com luz e temperatura controladas, da Embrapa

Mandioca e Fruticultura, em Cruz das Almas-BA.

Sementes do limoeiro „Cravo‟, P. trifoliata „Kryder‟ e de Tangerineira „Sunki‟

Tropical foram tratadas com fungicida, semeadas em tubetes contendo substrato de

textura média. Após quatro meses as plântulas foram transferidas para sacos de

polietileno de 2 kg contendo fibra de coco, sendo adubadas com torta de mamona e

solução foliar de reposição e irrigadas diariamente.

As inoculações foram realizadas quando as plantas estavam com dois anos

de idade e apresentaram caules com 5,0 a 7,0 mm de diâmetro e altura média de

0,60 m.

4.2.1. Preparo do inóculo

O isolado LRS 45/17 (P. citrophthora), foi repicado para meio de cenoura –

Agar (CA) e mantido em BOD por sete dias para inoculação dos disco de micélio

contendo estruturas do patógeno.

Para o preparo da suspensão de zoósporos utilizou-se culturas do isolado

LRS 45/17 (P. citrophthora) cultivado em CA e incubadas no escuro contínuo. Após

sete dias de incubação, o meio de cultura contendo micélio foi cortado em tiras

paralelas de 4 mm de largura, em seguida as tiras foram transferidas para placas de

42

Petri contendo meio de cultura liquido de CA (200g de cenoura para 1000 mL de

água destilada), sendo mantidas à 25°C, sob luz continua (fluorescente), durante 48

horas. Os esporângios foram submetidos a um choque térmico com água gelada

para induzir a liberação de zoósporos (Luz et al., 2008) a suspensão de zoósporos

foi ajustada para a concentração de 5x105 zoósporos/mL.

4.2.2. Inoculação

Para subsidiar o programa de melhoramento de citros, foram testado os

seguintes métodos de inoculação: infestação do substrato sem ferimento no coleto

da planta; Infestação do substrato com leves perfurações feitas com agulha

histológica no coleto das plantas; injeção de zoósporos no caule da planta e

deposição de disco de cultura contendo estruturas do patógeno no caule da planta

4.2.2.1. Método 1: infestação do substrato sem ferimento no coleto da planta

Retirou-se 50% o substrato do saco onde as plantas estavam, adicionando ao

mesmo 10 mL de suspensão na concentração de 5x105 zoósporos/mL de P.

citrophthora (LRS 45/17), e incorporando ao solo manualmente, revolvendo todo o

solo, até tornar-se homogêneo. O solo infestado com Phytophthora foi devolvido ao

saco. Está metodologia foi adaptado daquele desenvolvido por GRAHAM e TIMMER

(1992).

4.2.2.2. Método 2: infestação do substrato e leves perfurações feitas com

agulha histológica no coleto das plantas

Consistiu na retirada de 50% do substrato do saco, ao qual foi incorporado 10

mL de suspensão na concentração de 5x105 zoósporos/mL de P. citrophthora,

conforme descrito no item anterior (Graham e Timmer 1992), com uma agulha

histológica foram feitos três ferimentos no coleto da planta, cada ferimento com três

centímetros longitudinais. A finalidade dos ferimentos foi proporcionar aberturas para

a entrada do patógeno. O solo infestado com Phytophthora foi devolvido ao saco

(Figura 1).

43

Figura 1 – Inoculação de Phytophthora citrophthora por infestação do substrato com

ferimento no coleto da planta: A. Plantas de citros; B. Suspensão de

zoósporos; C. Retirada de 50% do substrato do saco de polietileno e misturada

suspensão de zoósporos; D. Ferimentos no coleto da planta com auxilio de

uma agulha histológica; E. Devolução do substrato infestado ao saco; F.

Plantas inoculadas.

4.2.2.3. Método 3: injeção de zoósporos no caule da planta

Este método foi desenvolvido por Whiteside (1974) e consiste em provocar

um ferimento na parte basal do caule da planta com um vasador de cortiça de 3 mm

de diâmetro e acrescentou-se 10µL de uma suspensão de inóculo na concentração

de 5x105 zoósporos/mL de P. citrophthora. Em seguida a casca foi devolvida ao local

ferido, envolvida com algodão umedecido e fita adesiva, para que o ponto de

inoculação permanecesse umedecido e protegido contra o ressecamento que pode

inviabilizar a infecção e o desenvolvimento da doença.

44

4.3.2.4. Método 4: deposição de disco de cultura contendo estruturas do

patógeno no caule da planta

Consistiu em perfurar a casca da planta com vasador de cortiça de 3mm de

diâmetro, retirar o disco da casca da planta e depositar no local um disco de cultura

de Ca contendo estruturas do patógeno, do mesmo diâmetro, retirado de colônias

com sete dias de idade. A seguir a casca foi devolvida ao local de origem e este

local envolvido com algodão umedecido e fita de PVC. Este método foi, descrito

detalhadamente por Rossetti (1947), e continua sendo o mais utilizado em

inoculações para estudos de gomose em condições controladas e no campo.

O experimento foi montado no modelo experimental inteiramente casualizado

em fatorial 4x3, sendo quatro métodos de inoculações, com três genótipos e 20

repetições, pois foram usados 20 plantas de cada genótipo para cada método de

inoculação e 10 plantas como testemunhas de cada genótipo para cada método,

totalizando 360 plantas avaliadas no experimento.

4.2.3. Avaliação

4.2.3.1. Avaliação das plantas inoculadas pelos métodos 1 e 2

Nas plantas inoculadas com infestação do substrato avaliou-se através de

isolamento de solo e raízes, 10 plantas de cada tratamento com 60 dias, cinco

plantas de cada tratamento com 90 dias e outras cinco plantas de cada tratamento

com 120 dias.

4.2.3.2. Avaliação das plantas inoculadas pelos métodos 3 e 4

Para as plantas inoculadas no caule, a avaliação foi feita com 60 dias após as

inoculações. Para a tomada das medidas das lesões, retirou-se com um bisturi o

floema da muda cítrica até ser visualizada a alteração da coloração (amarronzada)

do tecido afetado no câmbio (Figura 2 A-H). Com uma fita adesiva transparente e

um marcador tipo piloto, decalcou-se a lesão diretamente na superfície do lenho, os

desenhos obtidos, para cada genótipo, foram colados em folha de papel A4 e

45

quantificada a área lesionada por meio do programa Assess, e realizado a análise

estatística no programa R, através do pacote de dados ExpDes.pt.

4.2.4. Isolamento de amostras do solo das plantas inoculadas pelos métodos 1

e 2

Foi utilizado para isolamento do patógeno a partir de amostras do solo

infestado o meio de cultura Corn meal Agar (17 g de Corn meal Agar HIMEDIA REF

1000 mL de água purificada) autoclavado a 121°C por 20 minutos. Foram usadas

placas de Petri descartáveis com 90x15mm.

Figura 2 – Plantas de citros inoculadas com Phytophthora citrophthora pelo método de injeção

de zoósporos e disco de cultura. A. Planta testemunha do método de inoculação com

injeção de zoósporos; B. Poncirus trifoliata „Kryder‟ inoculado com injeção de

zoósporos; C. limoeiro „Cravo‟ inoculado com injeção de zoósporos; D. Tangerineira

„Sunki‟ Tropical inoculado com injeção de zoósporos; E. Planta testemunha do

método de inoculação de disco de cultura; F. P. trifoliata „Kryder‟ com disco de

cultura; G. limoeiro „Cravo‟ inoculado com disco de cultura; H. Tangerineira „Sunki‟

Tropical com disco de cultura.

46

Como em geral, durante a esterilização do meio de cultura, por autoclavagem,

ocorre uma queda do pH de cerca de 0,1 a 0,3 unidades, foi necessário realizar a

leitura do pH após a esterilização do meio de cultura e como o pH obtido foi 6,0± 0,2,

foi usada uma solução ácida para chegar até o pH 5,0.

Em cada período de avaliação (60, 90 e 120 dias) das plantas inoculadas

pelos método 1 e 2 foi retirado uma amostra de 20g de solo de cada saco contendo

uma planta. Estas amostras foram acondicionadas em saco plástico e levadas ao

laboratório para isolamento.

Em laboratório foram pesadas 10g de cada solo, e cada amostra foi

colocada em um erlenmeyer ao qual foi adicionado 90 mL de água estéril. O

erlenmeyer foi tampado com papel alumínio e levado ao agitador por 20 minutos

na velocidade de 160. Com uma micropipeta retirou-se 1000µL da suspensão

de cada erlenmeyer para placas de Petri descartáveis contendo o meio sólido

Corn meal Agar e com uma alça de Drigalski a suspensão foi distribuída

uniformemente por toda a superfície do meio.

4.2.5. Isolamento do patógeno das raízes das plantas inoculadas pelos

métodos 1 e 2.

Foram coletadas raízes de cada planta e em laboratório foram lavadas em

água corrente e depois imersas por dois minutos em um becker contendo álcool

70%, transferidas para uma solução de hipoclorito de sódio a 0,5% durante dois

minutos e depois lavadas em água estéril. As raízes foram fracionadas com o

auxilio de um bisturi e distribuidas em placa de Petri descartável (90x15mm)

contendo meio Agar-Água (20g – 1000 mL respectivamente).

4.3. RESULTADOS

As plantas inoculadas no substrato pelos métodos 1 e 2, avaliadas com 60, 90

e 120 dias não apresentaram sintomas de Gomose nem de podridão radicular.

Através de plaqueamento do solo e de raizes, constatou-se que o patógeno

estava presente no substrato, porém não foi encontrado nas raízes na avaliação

realizada 60 dias após a inoculação. Nas avaliações realizadas aos 90 e 120 dias

47

após as inoculações, através do plaqueamento no meio Corn meal Agar, constatou-

se a presença de P. citrophthora nas raízes e no solo (Figura 3 A-E).

Figura 3 – Avaliações realizadas aos 120 dias após as inoculações em tangerineira

sunki „tropical‟, inoculadas com Phytophthora citrophthora por infestação do

substrato com e sem ferimento no coleto da planta: A. Amostras de solo da

tangerineira sunki „tropical‟ inoculadas com e sem ferimentos; B. Presença

de P. citrophthora em plaqueamento no meio Corn meal Agar; C. Raiz de

tangerineira sunki „tropical‟; D. P. citrophthora em plaqueamento de raiz no

meio Corn meal Agar; E. Cultura pura de P. citrophthora.

Os resultados obtidos demostram que houve infecção das raízes na aplicação

do inóculo de forma mais natural, no entanto, ainda no tempo máximo de avaliação

120 DAI que receberam ou não ferimentos na altura do coleto, não houve expressão

dos sintomas na parte aérea das plantas.

Por não ser possível quantificar a doença pelos dois métodos com infestação

do solo; para análise estatística dos dados foram usados apenas aqueles obtidos

nas inoculações usando os métodos de disco de micélio e suspensão de zoósporos

no caule da planta (Tabela 1).

48

A ANOVA revelou que os efeitos Porta-enxerto e Método de inoculação foram

significativos, porém a interação não foi significativa. Nesse caso cada efeito foi

avaliado em separado.

Tabela 1 - Quadro da analise de variância dos tratamentos e métodos de inoculações.

GL SQ QM Fc Pr>Fc

Porta-enxertos 2 31.703 158.517 172.170 0.000*

Método de inoculação 1 0.930 0.9296 10.097 0.002*

Porta-enxerto*Método de inoculação 2 0.243 0.1214 1.318 0.272

Resíduo 86 7.918 0.0921

Total 91 40.794

CV 20.51%

Observou-se que maiores lesões ocorreram quando da inoculação com

discos de cultura contendo estruturas do patógeno do que com a aplicação de

suspensão de zoósporos (Figura 4).

Figura 4 – Médias obtidas através dos métodos de inoculação de disco de cultura e

suspensão de zoósporos. Médias seguidas da mesma letra não diferem

estatisticamente em 5% de significância pelo teste de Tukey.

Disco de cultura Injeção de zoósporos

65,72a

63,93b

Métodos de inoculação

49

Os genótipos apresentaram diferentes reações às infecções de caule

causadas por Phytophthora (Figura 5), sendo Tangerina sunk tropical a mais

resistente dos três porta-enxertos e Poncirus trifoliata o mais suscetivel. As plantas

inoculadas com os método 3 e 4 apresentaram exsudação de goma 15 DAI oriundas

do ponto de inoculação.

O importante seria observar se cada método de inoculação seria capaz de

diferenciar os porta-enxertos usados em relação à resistência, o que não foi

possível verificar porque não houve interação método/porta-enxerto.

Figura 5 – Comparação das médias dos porta-enxertos inoculados com Phytophthora

citrophthora. Médias seguidas da mesma letra não diferem estatisticamente

em 5% de significância pelo teste de Tukey.

4.4. DISCUSSÃO

É difícil a obtenção de culturas puras de Phytophthora spp. em plaqueamento

de solo em meio de cultura que não seja seletivo, além de ser uma atividade

trabalhosa. Broadbent (1977) isolando Phytophthora spp. das raízes, radicelas,

casca infectada e solo em meio de cultura também concluiu que não é uma tarefa

Lesõ

es

em

cm

2

Porta-enxertos

45,92 a

68 b

Tangerina Sunki 'Tropical'

Limoeiro Cravo'

Poncirus trifoliata 'Kryder'

90,88 c

Tangerina Sunki 'Tropical'

Limoeiro Cravo'

Poncirus trifoliata 'Kryder'

50

simples devido ao aparecimento de grande número de contaminantes, mesmo

sendo os meios seletivos recomendados, juntamente com iscas de frutos de

hospedeiros suscetíveis para isolamento de espécies de Phytophthora do solo e de

raízes (TSAO, 1983; ERWIN e RIBEIRO, 1996). Os meios de cultura específicos

recomendados para isolamento de Phytophthora de solo são complexos, exigem

antibióticos e reagentes nem sempre disponíveis em laboratórios que rotineiramente

trabalham com oomicetos.

Constatou-se a presença de P. citrophthora no solo e nas raizes (Figura 3 A-

E) das plantas inoculadas com os métodos 1 e 2 aos 120 DAI, mesmo não

apresentando sintomas na parte área, segundo o pressuposto estabelecido por

Rossetti (2001) que observou que o ataque do oomiceto pode ocorrer em radicelas

de plantas, em viveiros e em pomares (Silva et al., 2008), e pode passar

despercebido por em alguns casos não apresentar sintomas reflexos logo após a

infecção. Segundo os autores, a doença é mais grave quando atinge as raízes

principais, podendo interromper o fluxo de seiva elaborada para as raízes, ou a

região do colo, provocando lesões 20 a 30 cm abaixo e acima do solo, que também

são portas de entrada para fungos através dos ferimentos, podendo provocar a

morte da planta. Ainda segundo Silva et al., (2008) quando todo o diâmetro do

tronco é atingido pelo patógeno, a planta morre por estrangulamento devido ao

ataque do cambio ou floema, que interrompe o fluxo descendente de seiva. No caso

específico da doença denominada podridão de raízes e/ou radicelas dos citros os

porta-enxertos são classificados como tolerantes e não tolerantes com relação a

reação a Phytophthora. Nesse caso, a tolerância do porta-enxerto está relacionada

diretamente à sua capacidade de emitir novas raízes/radicelas frente ao ataque do

patógeno no solo, ou pela limitação da conversão de propágulos do patógeno em

infecções devido ao mecanismo bioquímico de plantas resistentes (Graham, 1995).

A infestação do solo com propágulos do patógeno tem sido eficiente para

testar resistência em outros patossistemas como por exemplo Nicotiana tabacum L.

x Phytophthora nicotianae Breda de Haan var. nicotianae (Dastur) Waterhouse,

Ibanez (2010) e Capsicum annum L. x P. capsici (BOWERS et al., 2007). No

entanto, é certo que trata-se de um método trabalhoso e que requer o uso de meio

51

seletivo, conforme ressaltado por Broadbent (1977). É o que está mais perto da

realidade das infecções que ocorrem em campo.

Os métodos de inoculação 3 e 4 desenvolvidos respectivamente por Rosseti

(1947) e Whiteside (1974) são invasivos e quebram qualquer barreira à penetração

do patógeno, permitindo a colonização imediata dos tecidos, no entanto, mesmo

assim, foi possível separar a reação de genótipos ao patógeno, que no caso do

presente trabalho foi P. citrophthora.

Considerando-se o método de inoculação testado (Figura 4), observou-se

que, sem levar em conta o genótipo avaliado as áreas de lesões provocadas pelo

método de disco de cultura do patógeno foram significativas maiores aquelas obtidas

com a aplicação de suspensão de zoósporos. Smith et al. (1987) ao avaliar a

resistência de porta-enxertos de citros à gomose concluíram que o método do disco

de meio de cultura + micélio foi mais eficiente resultando em lesões de tamanho

maior que os métodos que usaram zoósporos ou clamidósporos, portanto,

coincidindo com os resultados por nós encontrados no presente trabalho.

Em relação aos porta-enxertos utilizados constatou-se que a tangerineira

„Sunki‟ Tropical foi mais suscetível que o limoeiro cravo „santa cruz‟, sendo o P.

trifoliata „Kyder‟ o mais resistente entre os três porta-enxertos testados por

apresentar as menores áreas de lesão (Figura 5). Os P. trifoliata de fato, são

considerados resistentes à gomose dos citros, segundo dados de pesquisas

anteriores, como o que observado por Medina filho et al (2004) ao dizer que o P.

trifoliata, sabidamente, apresenta reduzida taxa de infecção em condições de campo

e viveiro, assim como em resposta a inoculações experimentais de tronco e raízes.

As observações em campo por Soares-Filho et al (2002), com relação à

planta matriz da seleção tangerineira „Sunki‟ Tropical (pé-franco), indica, que a

mesma possui maior tolerância à gomose de Phytophthora em relação a outras

seleções dessa tangerineira, sem levar em consideração o método de inoculação

usado, uma vez que a resistência dos citros à gomose é mais fácil de ser avaliada

do que a podridão de radicelas, sendo que o patógeno causador da gomose

necessita de ferimento para causar infecção nas plantas,uma vez que a resistência

52

dos citros à gomose é de caráter quantitativo, sendo controlada por poligenes

(SIVIERO, 2001).

A escolha do método de inoculação de Phytophthora em citros depende da

idade das plantas. No estádio de plântulas, o método in vitro e o da agulha

podem ser adotados para avaliação da gomose. A inoculação de plantas com

mais de 4,0 mm de diâmetro pode ser feita pelo método do disco ou por inserção

sob casca (Siviero, 2001) e, a avaliação, pela medida da área, comprimento da

lesão e sobrevivência. O método do disco tem sido o preferido para estudos de

resistência e controle químico no campo. A doença pode ser quantificada pela

medida da área da lesão, obtida por diversos métodos, ou pela determinação do

comprimento da lesão.

O método de injeção de zoósporos no caule, no entanto é menos invasivo

que o de colocação de disco de cultura e, é provável, que necessite de mais

tempo para que as lesões se desenvolvam na planta, uma vez que os sintomas

no campo demoram a aparecer.

O uso de discos de cultura do patógeno teve a desvantagem de não

quantificar o inóculo que esta sendo aplicado, uma vez que apenas se tem

certeza de que os discos contêm micélio do patógeno. Para o momento, no

entanto, ainda é o método mais fácil de ser usado.

53

5. CAPÍTULO 3

MÉTODOS DE INOCULAÇÃO PARA AVALIAÇÃO DE PORTA-ENXERTOS E

AVALIAÇÃO DE COMBINAÇÕES COPA/PORTA-ENXERTO DE CITROS PARA

RESISTENTE A Phytophthora citrophthora.

RESUMO

No Brasil, Phytophthora citrophthora tem sido a espécie associada às perdas

mais significativas provocadas pela gomose dos citros. Para o controle desta

importante doença o uso de porta-enxertos e combinações copa/porta-enxertos

tolerantes, é o melhor controle. O presente trabalho teve como objetivo, testar porta-

enxertos e combinações copa/porta-enxertos de citros desenvolvidos pelo PMG de

citros da Embrapa Mandioca e Fruticultura para resistência a P. citrophthora e

comparar os métodos de folhas destacadas com as inoculações no caule em porta-

enxertos de citros. Os experimentos foram desenvolvidos nas dependências da

Embrapa Mandioca e Fruticultura, em Cruz das Almas-BA. Folhas destacadas e

mudas de 23 genótipos de citros foram inoculadas com o isolado LRS 45/17 (P.

citrophthora) pelo método de disco de cultura do patógeno. Para as folhas a

inoculação ocorreu na face abaxial com e sem ferimento e nas mudas foram

inoculadas no caule. No segundo experimento plantas de onze genótipos foram

enxertadas com duas variedades copa sendo elas: limeira ácida „Tahiti‟ e laranjeira

Pera e nove genótipos foram enxertados com três variedades copa: limeira ácida

„Tahiti‟, laranjeira Pera e laranjeira Valência, a inoculação foram feitas no porta-

enxerto, com a mesma metodologia das mudas. Foi provocado um ferimento, com

vasador de cortiça de (3mm) de diâmetro, retirada casca da planta e depositado o

disco de cultura contendo estruturas do patógeno e devolvida a casca. A área da

lesão nas folhas foi avaliada sete dias após as inoculações (DAI) e nas mudas com

60 DAI. Inoculações sem ferimentos nas folhas separaram bem os genótipos

suscetíveis dos intermediários e resistentes. Houve correlação positiva entre o

método de inoculação no caule, mais comumente usado e o de inoculação em folhas

destacadas sem ferimento, mostrando a utilidade deste último. Comprovou-se que

há variação em alguns porta-enxertos quanto ao comportamento à inoculação com

P. citrophthora, porém, não foi a regra geral. As combinações copa x porta-enxerto

54

também reagiram de forma variável, comprovando que há interação copa x porta-

enxerto, avaliadas quanto à resistência a P. citrophthora.

Palavras-chave: Citrus, Gomose, pé franco, tolerância.

55

COMPARISON OF INOCULATION METHODS TO EVALUATE CITRUS

ROOTSTOCKS AND SCION/ROOTSTOCK COMBINATIONS RESISTANT TO

Phytophthora citrophthora.

ABSTRACT

In Brazil, Phytophthora citrophthora has been associated with the most

significant losses caused by citrus Gummosis. This important disease is best

controlled using tolerant rootstocks and scion/rootstock combinations. The present

study aimed to test citrus rootstocks and scion/rootstock combinations developed by

the PMG (Genetic Improvement Program) of Embrapa Cassava & Tropical Fruits for

resistance to P. citrophthora and compare the method of detached leaves with the

inoculations in the stem of citrus rootstocks. The experiments were carried out at the

Embrapa Cassava & Tropical Fruits, in Cruz das Almas-BA. Detached leaves and

seedlings of 23 citrus genotypes were inoculated with the isolate LRS 45/17 (P.

citrophthora) by the method of pathogen culture disc. Leaves were inoculated on the

abaxial surface with and without lesion, whereas seedlings were inoculated in the

stem. In the second experiment, plants of 11 genotypes were grafted with two scion

varieties, namely: „Tahiti‟ lime and „Pera‟ orange, and nine genotypes were grafted

with three scion varieties: „Tahiti‟ lime, „Pera‟ orange and „Valencia‟ orange.

Inoculations were made in the rootstock using the same methodology as in the

seedlings. A lesion was caused using a 3-mm-diameter cork borer and plant bark

was removed. Then, the culture disc containing pathogen structures was deposited

and the bark was put back in place. Lesion area on the leaves was evaluated at 7

days after inoculation (DAI) and in the seedlings at 60 DAI. Inoculations with no

lesion on the leaves separated well susceptible genotypes from intermediate and

resistant ones. Positive correlation was found between the stem inoculation method,

more commonly used, and the inoculation in detached leaves with no lesion, showing

the utility of the latter. The results proved that there is variation in some rootstocks

regarding the response to inoculation of P. citrophthora, but it was not the general

rule. The scion/rootstock combinations also reacted in a variable manner, proving

that there is interaction between scion and rootstock, evaluated for the resistance to

P. citrophthora.

56

Key words: Citrus spp., Gummosis, non-grafted seedling

57

5.1. INTRODUÇÃO

Atualmente, cerca de 80% das plantas cítricas brasileiras estão enxertadas

sobre o limão „Cravo‟ (Almeida e Passos, 2011). Esse fato representa um perigo à

citricultura nacional, visto que, surgimento de novas pragas e doenças, como está

ocorrendo com a morte súbita dos citros, pode provocar enormes prejuízos à

citricultura, caso as plantas estejam enxertadas sobre praticamente um único porta-

enxerto. Há necessidade, portanto, da diversificação de porta-enxertos de citros no

Brasil (BOAVA et al.,2003).

O estudo das doenças provocadas por Phytophthora em citros está

intimamente ligado ao estudo de porta-enxerto. O porta-enxerto exerce grande

influência e modificações na cultivar-copa como vigor, produção, qualidade dos

frutos, nutrição e resistência a pragas e doenças (SIVIERO et al., 2002b).

Segundo Pompeu Junior (1991) são muitas as alterações provocadas pelo

porta-enxerto na copa, exercendo influencia sobre: crescimento, altura, precocidade

de produção, produção, maturação e peso dos frutos, coloração da casca e do suco;

teor de açúcares, de ácidos e de outros componentes do suco; permanência dos

frutos na planta e sua conservação após a colheita (Feichtenberger 2001); fertilidade

do pólen; absorção, síntese e utilização de nutrientes; transpiração e composição

química das folhas; resposta a produtos de abscisão dos frutos e folhas; tolerância à

salinidade, à seca, ao frio, a doenças e pragas (Augustí 2003). As influências da

copa sobre o porta-enxerto são menos visíveis, mas ocorrem no desenvolvimento do

sistema radicular, resistência ao frio, à seca e a doenças e pragas

(FEICHTENBERGER, 2001).

Não existe um porta-enxerto perfeito e por isso a sua escolha deve se basear

nas condições limitantes de cada região citrícola, como clima, tipo de solo, variedade

da cultivar e intenção de uso do cultivo (fruto fresco ou processado). Dessa forma, a

seleção do porta-enxerto é de fundamental importância para o sucesso do pomar,

pois apresenta diversas outras funções além de suportar a copa. Para que ocorra

uma combinação bem sucedida é necessária a instalação do pomar em ecossistema

apropriado, o recebimento de tratos culturais e o harmônico relacionamento entre

copa e porta-enxerto (POMPEU JUNIOR, 2005).

58

Devido à importância econômica e ocorrência praticamente universal da

gomose e da podridão das raízes, muitas investigações têm sido conduzidas no

sentido de avaliar porta-enxertos de citros quanto à resistência a Phytophthora spp.

O uso de porta-enxertos resistentes ou tolerantes constitui uma importante forma de

controle das doenças causadas por Phytophthora spp., visto que a maioria das

copas comerciais exibe relativa suscetibilidade às mesmas (Siviero et al., 2002b). De

maneira geral os porta-enxertos podem ser agrupados quanto à suscetibilidade às

infecções do tronco por P. citrophthora e P. parasítica em: alta suscetibilidade

(laranjas doces e limões „Rugosos‟), moderada suscetibilidade (limões „Cravo‟ e

„Volkameriano‟, tagerinas „Sunki‟ e „Cleópatra‟, tangelo „Orlando‟ e citranges „Troyer‟

e „Carrizo‟), baixa suscetibilidade (laranja „Azeda‟ e C. Macrophylla), e muito baixa

suscetibilidade (trifoliata e citrumelo „Swingle‟) (FEICHTENBERGER, 2001).

Trabalhos de genética e melhoramento dos citros têm sido realizados visando

à seleção de cultivares de citros superiores e principalmente associados à obtenção

de materiais resistentes às principais doenças dos citros. No entanto, ainda não

foram encontrados estudos específicos relacionados à herança da resistência no

patossistema citros-Phytophthora (SIVIERO 2002a).

O presente trabalho teve como objetivos: i) comparar as respostas de híbridos

de citros desenvolvidos pelo PMGC, quanto a inoculação em folhas destacadas em

laboratório e em condições de casa de vegetação (inoculação em caule) para

selecionar aquelas resistentes a P. citrophthora visando sua utilização como porta-

enxerto ii) testar combinações de copa/porta-enxerto de citros, altamente

promissores em produtividade, selecionados pelo PMGC quanto à resistência a P.

citrophthora.


Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Fitopatologia, casa

vegetação e câmara de inoculação com luz e temperatura controladas da Embrapa

Mandioca e Fruticultura, em Cruz das Almas-BA.


caule de porta-enxertos híbridos de citros

59

No campo foram coletadas sementes de 23 genótipos (Tabela 1), foram

tratadas com fungicida, semeadas em tubetes (120cm3), com substrato de textura

média dispostos em bandejas contendo 96 tubetes cada uma. Após quatro meses as

plântulas foram transferidas para sacos de polietileno de 2 kg contendo fibra de coco

e fertilizante de liberação lenta (Osmocote 8m 15-9-12), sendo adubadas com torta

de mamona e solução foliar de reposição e irrigadas diariamente.

Tabela 1 – Porta-enxertos de citros, avaliados em dois tipos de métodos de inoculação: em folhas e

caule.

Porta-enxertos

Citrandarin „Indio‟

Citrandarin „San Diego‟

Citrandarin „Riverside‟

TSKFL x CTSW – 004

LCR x CTSW – 009

Tangerineira „Sunki‟ Comum

TSKC x CTSW – 028

TSKC x CTSW – 041

TSKC x TRFD – 003

TSKC x TRFD – 006

TSKC x (LCR x TR) – 001

TSKC x (LCR x TR) – 059

HTR – 208

HTR – 051

HTR – 069

LVK x LCR – 010

LVK x LCR – 038

Limoeiro 'Cravo Santa Cruz'

LCR x TR – 001

LRF x (LCR x TR) – 005

Poncirus trifoliata „Benecke‟

Tangerineira „Sunki‟ Tropical

Limoeiro 'Siciliano'

60

5.2.1.1. Inoculação em folhas

Folhas dos genótipos em estágio intermediário de maturação foram coletadas

em telados de produção de mudas, nas primeiras horas da manhã, e levadas para o

laboratório de Fitopatologia onde foram lavadas em água corrente e imersas em

uma solução de 0,5% de hipoclorito de sódio, durante 5 minutos e posteriormente

lavadas em água destilada estéril.

Para a inoculação, as folhas foram colocadas em caixa plásticas (Gerbox)

medindo 12 cm x 12 cm as quais haviam sido higienizadas com a solução de 0,5%

de hipoclorito de sódio e revestidas com espumas das mesmas dimensões da caixa,

devidamente autoclavadas. As espumas foram arrumadas dentro de cada gerbox e

umidificadas com água estéril, para manter a umidade do material a ser inoculado.

As folhas dos 23 genótipos de citros foram inoculadas na face abaxial com

disco de cultura do patógeno com sete dias de idade em meio de cenoura contendo

estruturas do patógeno usando dois métodos de inoculação: Com ferimento causado

por abrasivo (carborundum), e sem ferimento. Nas inoculações com ferimento o

abrasivo foi esfregado levemente na face abaxial das folhas depois removido com

água abundante, e enxugadas as folhas com um papel toalha. As folhas com

ferimento e sem ferimento receberam um disco de cultura de (3mm) de diâmetro do

isolado LRS 45/17 (P. citrophthora). As testemunhas foram inoculadas com um disco

de CA.

As folhas foram acomodadas nas caixas plásticas (Gerbox), sobre as

espumas esterilizadas e umedecidas. O modelo experimental usado foi o

inteiramente casualizado com três gerboxs, contendo duas folhas em cada,

totalizando seis repetições por tratamento.

Sete DAI foi avaliada a porcentagem da área lesionada calculada através do

programa Assess. A análise estatística foi realizada no programa R, através do

pacote de dados ExpDes.pt.

61

5.2.1.2. Inoculação em Porta-enxertos

Plantas dos 23 genótipos, quando atingiram dois anos de idade, 5,0 a 7,0 mm

de diâmetro do caule e altura média de 0,60 m, foram inoculadas com o isolado LRS

45/17 (P. citrophthora), repicado em meio de cenoura/Agar (200g - 20g

respectivamente para 1L de água) e mantido em BOD por sete dias.

A inoculação consistiu em provocar um ferimento de (3mm) de diâmetro no

caule da planta com vasador de cortiça, retirada do disco da casca da planta,

deposição de um disco, do mesmo diâmetro, de cultura do patógeno LRS 45/17 (P.

citrophthora), com sete dias de idade e devolução da casca. As lesões foram

envolvidas com algodão umedecido e fita PVC ROSSETTI (1947). O experimento

seguiu o modelo experimental inteiramente casualizado com dez repetições por

genótipos, totalizando 230 plantas.

A avaliação foi realizada aos 60 DAI. Para medir a área das lesões, com um

bisturi, retirou-se a casca das mudas cítricas até ser visualizada a alteração da

coloração (amarronzada) do tecido afetado no câmbio (Figura 1A). Com uma fita

adesiva transparente e um marcador tipo piloto, decalcou-se a lesão diretamente na

superfície do lenho (Figura 1B). Os desenhos obtidos para cada genótipo foram

colados em folha de papel ofício A4 e quantificada a área lesionada em cm2 por

meio do programa Assess (Figura 1C). A análise estatística foi realizada pelo

programa R, através do pacote de dados ExpDes.pt.

5.2.2. Experimento 2: Inoculação em porta-enxertos com duas variedade copa

de citros.

No campo foram coletadas sementes de 11 genótipos (Tabela 2), as

sementes foram tratadas com fungicida, semeadas em tubetes (120cm3), com

substrato de textura média dispostos em bandejas contendo 96 tubetes cada uma.

Após quatro meses as plântulas foram transferidas para sacos de polietileno de 4 kg

contendo fibra de coco e fertilizante de liberação lenta (Osmocote 8m 15-9-12),

sendo adubadas com torta de mamona e solução foliar de reposição e irrigadas

diariamente.

62

Tabela 2 – Porta-enxerto de citros enxertados com duas variedades copas e avaliados em relação a


Porta-enxertos

HTR - 051

HTR - 069

Poncirus trifoliata „Kryder‟

LCR x CTSW - 009

LRF x (LCR x TR) - 005

Tangerineira „Sunki‟ Comum

TSKC x (LCR x TR) - 059

TSKC x TRFD - 003

TSKC x TRFD - 006

TSKC x TRFD - 007

TSKFL x CTSW - 004

Plantas dos genótipos, quando atingiram dois anos de idade e 5,0 a 7,0 mm

de diâmetro do caule e altura média de 0,60 m, foram enxertadas 30 plantas de cada

porta-enxerto com a técnica do T invertido usando material propagativo (borbulhas),

sendo 15 com a variedade copa limeira ácida „Tahiti‟ e 15 com a variedade copa

laranjeira Pera. As plantas foram mantidas em viveiro de produção de mudas até as

copas atingirem espessura de 5,0 a 7,0 mm de diâmetro do caule.

Com 30 messes de idade as plantas foram inoculadas no caule (do porta-

enxerto) com o isolado LRS 45/17 (P. citrophthora), seguindo a mesma metodologia

de inoculação do experimento 1. O delineamento utilizado para os porta-enxertos

enxertados com duas copas foi o inteiramente casualizado, com oito repetições para

cada combinação copa/porta-enxerto, onze porta-enxertos e duas variedades copa

totalizando 22 tratamentos e 176 plantas inoculadas e 20 plantas usadas como

testemunhas.

Os dados experimentais foram analisados com o programa estatístico R (Rk

Imtest, 2017) análise de variância e testes de médias.

63

Figura 1 - Avaliação do experimento. A. Retirada do floema da muda cítrica até ser visualizada

a alteração da coloração (amarronzada) do tecido afetado no cambio; B. Lesão, de

cada genótipo, foi colada em folhas de papel ofício A4; C. Quantificação da área

lesionada por meio do programa Assess.

As avaliações das plantas inoculadas no caule, foram feitas com 60 dias após

as inoculações, seguindo a mesma metodologia do experimento 1.

5.2.3. Experimento 3: Inoculação em porta-enxertos com três variedades copa

de citros.

Os nove genótipos utilizados nesta inoculação (Tabela 3) tiveram suas

sementes tratadas com fungicida, semeadas em tubetes que receberam o mesmo

tratamento indicado no item 5.2.2. e foram enxertadas 45 plantas de cada genótipo

com a técnica do T invertido usando material propagativo (borbulhas), sendo 15 com

a variedade copa limeira ácida „Tahiti‟, 15 com a variedade copa laranjeira Pera e 15

com a variedade copa laranjeira Valência. Essas plantas foram mantidas em viveiro

de produção de mudas até as copas atingirem espessura de 5,0 a 7,0 mm de

diâmetro do caule.

64

Tabela 3 – Porta-enxerto de citros enxertados com três variedades copas e avaliados em relação a


Porta-enxertos

Citrandarin „Indio‟

Citrandarin „Riverside‟

Citrandarin „San Diego‟

HTR - 208

Limoeiro 'Cravo Santa Cruz'

Tangerineira „Sunki‟ Tropical

TSKC x CTSW - 028

TSKC x CTSW - 041

As inoculações e avaliações ocorreram como descritas no item anterior. O

delineamento utilizado para este experimento foi o inteiramente casualizado, com

oito repetições para cada combinação copa/porta-enxerto, nove porta-enxertos e

três variedades copa totalizando 27 tratamentos e 216 plantas inoculadas e 20

plantas usadas como testemunhas.

5.3. RESULTADOS


caule de porta-enxertos híbridos de citros

5.3.1.1. Inoculações em folhas

Para as inoculações em folhas foram altamente significativo (p≥0,01) os

fatores genótipo e método de inoculação, bem como a interação genótipo/método

(Tabela 4). Com isso considerou-se a ANAVA da análise fatorial (desdobramentos) e

desconsiderou as análises de variância para genótipos e métodos e os posteriores

testes de médias em separado.

Houve ampla variação no comportamento dos porta-enxertos em relação as

inoculações em folhas com e sem ferimento. Nas inoculações sem ferimento as

percentagem médias de área lesionada agrupadas pelo teste de Scott Knott (p≥0,05)

65

foram formados apenas 2 grupos, enquanto para as inoculações sem ferimento os

porta-enxertos testados dividiram-se em quatro grupos (Tabela 5).

Tabela 4 - Análise de variância das lesões em folhas de 23 genótipos de citros, avaliados em dois

tipos de métodos de inoculação: com ferimento (CF) e sem ferimento (SF).

FV GL SQ QM Fc Pr>Fc

Genótipos 22 30155,00 1370,70 10,28 0,0000

Métodos 1 19071,00 19071,20 142,97 0,0000

Genótipos*Métodos 22 10439,00 474,50 3,56 0,0000

Resíduo 92 12272,00 133,40

Total 137 71938,00

CV (%) 50,73

As lesões nas folhas provenientes das inoculações com ferimento variaram de

2,07 (Citrandarin „Indio‟) a 64,63% da área foliar, enquanto para as inoculações sem

ferimento a variação foi de 0,0 (diversos genótipos não apresentaram lesão) a

43,13% da área foliar (limoeiro siciliano).

Os maiores valores referentes à porcentagem de lesão nas folhas inoculadas

com ferimento foram observados nos genótipos TSKC x (LCR x TR) - 059,

limoeiro 'cravo santa cruz', LCR x CTSW - 009 e LVK x LCR - 010 que diferiram

inclusive do limoeiro siciliano tido como suscetível a gomose.

Enquanto que os porta-enxertos Citrandarin „Indio‟, TSKC x TRDF - 006, HTR

-051 E Poncirus trifoliata „Benecke‟ apresentaram as menores porcentagem de área

lesionada.

Em relação às inoculações em folhas sem ferimento, apenas cinco genótipos

distinguiram-se dos demais, formando o grupo de suscetível foram eles: limoeiro

'siciliano', LCR x CTSW - 009, limoeiro 'cravo santa cruz', LCR x TR - 001, HTR - 069

e tangerineira „Sunki‟ Tropical com valores que variaram de 20,83 a 43,13% de área

da folha lesionada. Os genótipos, citrandarin „Indio‟, citrandarin „San Diego‟,

citrandarin „Riverside‟, TSKC x TRFD - 003, TSKC x TRFD - 006, HTR - 051, LRF x

(LCR x TR) - 005 e P. trifoliata „Benecke‟ não apresentaram lesões nas folhas

quando inoculados com P. citrophthora sem ferimento e os demais genótipos TSKFL

x CTSW - 004, LVK x LCR - 038, TSKC x CTSW - 041, tangerineira „Sunki‟ Comum,

66

LVK x LCR - 010, HTR - 208, TSKC x (LCR x TR) - 001 e TSKC x CTSW - 028

apresentaram valores baixos para a porcentagem de lesão nas inoculações sem

ferimento, variando de 0,4 (TSKFL x CTSW - 004) a 14,16% (TSKC x CTSW - 028).

Tabela 5 - Médias da porcentagem de lesão nas folhas de 23 genótipos, avaliados em dois tipos de

inoculações: com ferimento (CF) e sem ferimento (SF).

Porta-enxertos Métodos

CF SF

Citrandarin „Indio‟ 2.07 aA 0.00 aB

Citrandarin „San Diego‟ 21.30 bA 0.00 aB

Citrandarin „Riverside‟ 12.43 aA 0.00 aB

TSKFL x CTSW – 004 45.25 cA 0.40 aB

LCR x CTSW – 009 62.70 dA 38.85 bB

Tangerineira „Sunki‟ Comum 42.41 cA 3.77 aB

TSKC x CTSW – 028 40.04 cA 14.16 aB

TSKC x CTSW – 041 42.04 cA 2.88 aB

TSKC x TRFD – 003 20.85 bA 0.00 aB

TSKC x TRFD – 006 2.47 aA 0.00 aB

TSKC x (LCR x TR) – 001 23.82 bA 10.74 aB

TSKC x (LCR x TR) – 059 64.63 dA 0.00 aB

HTR – 208 27.68 bA 9.53 aB

HTR – 051 5.35 aA 0.00 aB

HTR – 069 44.57 cA 32.98 bB

LVK x LCR – 010 58.05 dA 4.84 aB

LVK x LCR – 038 33.76 cA 1.64 aB

Limoeiro 'Cravo Santa Cruz' 63.37 dA 36.42 bB

LCR x TR – 001 39.93 cA 33.08 bB

LRF x (LCR x TR) – 005 50.26 cA 0.00 aB

Poncirus trifoliata „Benecke‟ - padrão de alta resistência 7.39 aA 0.00 aB

Tangerineira „Sunki‟ Tropical 37.48 cA 20.83 bB

Limoeiro 'Siciliano' - padrão de baixa resistência 46.17 cA 43.13 bB

Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna pertencem ao mesmo grupo pelo teste

Scott Knott a 5% de significância. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas, em cada linha,

não diferem entre si pelo teste F, a 5% de probabilidade.

TSKFL, TSKC, LCR, TR, CTSW, TRFD, HTR, LVK e LRF correspondem a, respectivamente,

tangerineiras „Sunki da Flórida‟ e „Sunki‟ comum (Citrus sunki Hort. ex Tan.), limoeiro „Cravo‟ (C.

limonia Osbeck), Poncirus trifoliata, citrumelo „Swingle‟ (C. paradisi Macfad. x P. trifoliata), P. trifoliata

seleção „Flying Dragon‟, híbrido trifoliolado, limoeiro „Volkameriano‟ (C. volkameriana V. Ten. & Pasq) e

limoeiro „Rugoso (C. jambhiri Lush.) da Flórida‟.

67

As inoculações com ferimento permitiram melhor discriminação entre os

genótipos quanto a sua resistência/suscetibilidade quando comparado com o

método de inoculação sem ferimento. No entanto, este último separa bem os

genótipos suscetíveis dos intermediários e resistentes.

Reação semelhante aos dois tipos de inoculação em folhas foram observados

entre genótipos altamente suscetíveis para o LCR x CTSW - 009,

limoeiro 'cravo santa cruz' mas também HTR - 069, LCR x TR - 001, tangerineira

„Sunki‟ Tropical e limoeiro siciliano foram altamente suscetíveis para as inoculações

sem ferimento e ficaram no grupo b para inoculações com ferimento.

5.3.1.2. Inoculações no caule dos porta-enxertos.

Todos os 23 genótipos apresentaram lesões nas inoculações no caule e

houve diferença estatística entre eles.

O limoeiro siciliano, usado como padrão de suscetibilidade, começou a

apresentar sintomas de murcha e amarelecimento 15 dias após as inoculações,

chegando à morte de todas as plantas aos 45 DAI.

O teste de Scott Knott possibilitou a separação dos genótipos em dois grupos

distintos, onde os genótipos tangerineira „Sunki‟ Comum, LVK x LCR - 010,

citrandarin „Indio‟, TSKC x CTSW - 028, LCR x CTSW - 009, HTR - 069, LVK x LCR -

038 e tangerineira „Sunki‟ Tropical expressaram menor resistência a P. citrophthora

quando comparados com os genótipos TSKC x (LCR x TR) - 001, limoeiro 'cravo

santa cruz', TSKC x CTSW - 041, citrandarin „Riverside‟, TSKC x (LCR x TR) - 059,

citrandarin „San Diego‟, P. trifoliata „Benecke‟, LCR x TR - 001, TSKFL x CTSW -

004, HTR - 208, LRF x (LCR x TR) - 005, TSKC x TRFD - 007, TSKC x TRFD - 003,

HTR - 051 e TSKC x TRFD - 006 (Tabela 6).

5.3.1.3. Correlação entre os métodos de inoculação em folhas com e sem

ferimento e caules de porta-enxertos.

Para correlação dos dados das folhas inoculadas com e sem ferimento e

lesão no caule, foi preciso reduzir para seis o numero de repetições das planta

inoculadas no caule.

68

Tabela 6 - Comparação de médias de 23 porta-enxertos de citros com relação á Gomose de


Porta-enxertos Médias

Cm

TSKC x TRFD – 006 0.71 a

HTR – 051 0.84 a



LRF x (LCR x TR) – 005 0.99 a

HTR – 208 1.01 a

TSKFL x CTSW – 004 1.06 a

LCR x TR – 001 1.13 a

Poncirus trifoliata „Benecke‟ - padrão de alta resistência 1.14 a

Citrandarin „San Diego‟ 1.19 a

Citrandarin „Riverside‟ 1.23 a

TSKC x (LCR x TR) – 059 1.23 a

TSKC x CTSW – 041 1.28 a

Limoeiro 'Cravo Santa Cruz' 1.46 a

TSKC x (LCR x TR) – 001 1.56 a

Tangerineira „Sunki‟ Tropical 1.72 b

LVK x LCR – 038 1.83 b

HTR – 069 1.86 b

LCR x CTSW – 009 1.92 b

TSKC x CTSW – 028 2.03 b

Citrandarin „Indio‟ 2.18 b

LVK x LCR – 010 2.24 b

Tangerineira „Sunki‟ Comum 2.86 b

Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna pertencem ao mesmo grupo pelo

teste Scott Knott a 5% de significância. Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas, em

cada linha, não diferem entre si pelo teste F, a 5% de probabilidade. TSKFL, TSKC, LCR, TR,

CTSW, TRFD, HTR, LVK e LRF correspondem a, respectivamente, tangerineiras „Sunki da

Flórida‟ e „Sunki‟ comum (Citrus sunki Hort. ex Tan.), limoeiro „Cravo‟ (C. limonia Osbeck),

Poncirus trifoliata, citrumelo „Swingle‟ (C. paradisi Macfad. x P. trifoliata), P. trifoliata seleção

„Flying Dragon‟, híbrido trifoliolado, limoeiro „Volkameriano‟ (C. volkameriana V. Ten. & Pasq) e


69

Os valores da Correlação de Spearman foram significativos para lesões no

caule de porta-enxerto e folhas destacadas sem ferimento a 0,5%, e significativo a

1% quando correlacionado lesões nas folhas com e sem ferimento (Tabela 7).

Não houve correlação entre a inoculação em folhas com ferimento e lesões

no caule de plantas com dois anos de idade aproximadamente.

Tabela 7 - Valores de correlação de Spearman entre os métodos de inoculação em folhas (com e sem

ferimento) e no caule de mudas.

Variáveis Lesão caule Lesão folha com ferimento Lesão folha sem ferimento

Lesão caule 1.00

Lesão em folha com ferimento 0.34ns 1.00

Lesão em folha sem ferimento 0.48* 0.52** 1.00

5.3.2. Experimento 2: Inoculação em porta-enxertos com duas variedades copa

de citros.

A análise estatística dos dados mostrou que houve variação da reação a

inoculação com P. citrophthora para porta-enxerto e a interação copa x porta-enxerto

que é o mais interessante avaliar (Tabela 8).

Tabela 8 - Análise de variância referente a área lesionada de onze porta-enxertos de citros

enxertados com duas copas distintas (laranjeira „Pera‟ e limeira ácida „Tahiti‟) em relação a



Porta-enxerto 10,00 31,19 3,12 10,10 0,0000

Copa 1,00 0,64 0,64 2,08 0,1517

Porta-enxerto*Copa 10,00 11,39 1,14 3,69 0,0002

Resíduo 154,00 47,54 0,31

Total 175,00 90,76

CV (%)

46,69

Desdobrando a interação porta-enxerto x copa (Tabela 9), foi possível

observar que para a copa Pera apenas a Tangerineira „Sunki‟ Comum diferiu dos

demais porta-enxertos por apresentar área de lesão maior.

70

Para as mesmas variedades de porta-enxertos enxertados com a copa limeira

ácida „tahiti‟, houve uma discriminação maior, com a formação de três grupos, sendo

os porta-enxertos HTR - 069, TSKC e TSKC x (LCR x TR) - 059, alocados no grupo

c apresentando lesões maiores e os porta-enxertos TSKC x TRFD - 003 e LRF x

(LCR x TR) - 005 alocados no grupo a, apresentando as menores lesões.

O genótipo P. trifoliata „Kryder‟ não foi enxertado com a copa limeira ácida

„tahiti‟.

Os porta-enxertos HTR - 051, LCR x CTSW - 009, LRF x (LCR x TR) - 005,

tangerineira „Sunki‟ Comum, TSKC x TRFD - 003, TSKC x TRFD - 006, TSKC x

TRFD - 007 e TSKFL x CTSW - 004 não diferiram estatisticamente quando

comparados entre as variedades copa laranjeira Pera e limeira ácida „tahiti‟.

Tabela 9 - Comparação de médias da área de lesão (cm2) lesionada de onze porta enxertos de citros

enxertados com duas copas distintas (laranjeira „Pera‟ e limeira ácida „Tahiti‟) em relação

a Phytophthora citrophthora.

Porta-enxerto COPA

PERA TAHITI

HTR – 051 0.83 aA 1.28 bA

HTR – 069 1.10 aB 1.87 cA

Poncirus trifoliata „Kryder‟ 0.81 a -

LCR x CTSW – 009 1.03 aA 1.20 bA

LRF x (LCR x TR) – 005 1.03 aA 0.55 aA

Tangerineira „Sunki‟ Comum 2.32 bA 2.02 cA

TSKC x (LCR x TR) – 059 0.90 aB 1.73 cA

TSKC x TRFD – 003 1.18 aA 0.85 aA

TSKC x TRFD – 006 0.85 aA 1.33 bA

TSKC x TRFD – 007 1.06 aA 1.42 bA

TSKFL x CTSW – 004 1.32 aA 1.53 bA

Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna, pertencem ao mesmo grupo pelo teste


não diferem entre si pelo teste F, a 5% de probabilidade. TSKFL, TSKC, LCR, TR, CTSW, TRFD,

HTR e LRF correspondem a, respectivamente, tangerineiras „Sunki da Flórida‟ e „Sunki‟ comum

(Citrus sunki Hort. ex Tan.), limoeiro „Cravo‟ (C. limonia Osbeck), Poncirus trifoliata, citrumelo

„Swingle‟ (C. paradisi Macfad. x P. trifoliata), P. trifoliata seleção „Flying Dragon‟, híbrido trifoliolado e


71

A copa de limeira ácida „tahiti‟ induziu uma maior suscetibilidade aos porta-

enxertos HTR - 069 e TSKC x (LCR x TR) - 059, apresentando lesões maiores

quando comparados com a copa de laranjeira Pera.

O genótipo LRF x (LCR x TR) - 005 enxertado com as variedades copa

laranjeira Pera e limeira ácida „tahiti‟ apresentou lesões menores, lhe conferindo uma

certa resistência.

5.3.3. Experimento 3: Inoculação em porta-enxertos com três variedades copa

de citros

Através das análises dos dados referente à área lesionada de nove porta-

enxertos de citros enxertados com três copas distintas em relação a P. citrophthora,

podemos concluir que houve diferenças significativas entre os porta-enxertos as

copas e a interação porta-enxertos x copa.

Tabela 10 - Análise de variância referente a área lesionada de nove porta-enxertos de citros

enxertados com três copas distintas (laranjeira „Pera‟, limeira ácida „Tahiti‟ e laranjeira

valência) em relação a Phytophthora citrophthora.


Porta-enxerto 8 26,68 3,34 4,09 0,0002

Copa 2 9,54 4,77 5,85 0,0034

Porta enxerto*Copa 16 43,54 2,72 3,34 0,0000

Resíduo 189 154,02 0,81

Total 215 233,79

CV (%) 67,25

Todas as plantas de limoeiro siciliano independente da copa enxertada,

morreram antes da avaliação do experimento.

Os genótipos tangerineira „Sunki‟ tropical, TSKC x CTSW - 028 e TSKC x

CTSW - 041 apresentaram lesões maiores, diferindo estatisticamente dos demais

porta-enxertos enxertados com a variedade copa laranjeira Pera. Já para a

variedade copa limeira ácida „tahiti‟, os genótipos que apresentaram maiores lesões

foram os citrandarins „Riverside‟ e „San Diego‟, HTR - 208, TSKC x CTSW - 028,

TSKC x CTSW - 041e limoeiro 'cravo santa cruz'.

72

Para a variedade copa laranjeira valência enxertada nos porta-enxertos HTR -

208 e tangerineira „Sunki‟ Tropical apresentaram as maiores lesões.

Na comparação do comportamento de cada porta-enxerto em relação às três

copas que lhes foram enxertadas, só houve diferença estatística para o porta-

enxerto TSKC x CTSW - 028 enxertado com a copa de laranjeira Pera que

apresentou uma lesão maior, diferindo estatisticamente da enxertia com a copa de

laranjeira valência em combinação com o qual apresentou lesões menores. Já a

combinação TSKC x CTSW - 028 com a copa de limeira ácida „tahiti não diferiu

estatisticamente das demais copas.

Tabela 11 - Comparação de médias da área lesionada de nove porta enxertos de citros enxertados

com três copas distintas (laranjeira „Pera‟, limeira ácida „Tahiti‟ e laranjeira valência) em

relação a Phytophthora citrophthora.

Porta-enxerto COPA

PERA TAHITI VALÊNCIA

Citrandarin „Indio‟ 0,65 aA 0,70 aA 1,06 aA

Citrandarin „Riverside‟ 1,06 aA 1,34 bA 1,35 aA

Citrandarin „San Diego‟ 0,95 aA 1,16 bA 1,66 aA

HTR - 208 1,26 aA 1,72 bA 2,26 bA

Limoeiro 'Cravo Santa Cruz' 1,17 aA 1,70 bA 1,70 aA

Tangerineira „Sunki‟ Tropical 1,82 bA - 2,70 bA

TSKC x CTSW - 028 2,47 bA 1,61 bAB 1,10 aB

TSKC x CTSW - 041 1,74 bA 1,24 bA 1,68 aA

Médias seguidas pelas mesmas letras minúsculas na coluna, pertencem ao mesmo grupo pelo teste


não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. TSKC, CTSW e HTR correspondem

a, respectivamente, tangerineiras „Sunki‟ comum (Citrus sunki Hort. ex Tan.), citrumelo „Swingle‟ (C.

paradisi Macfad. x P. trifoliata), e híbrido trifoliolado.

5.3.1.4. DISCUSSÃO

Apesar do coeficiente de variação do experimento (50,7%) ter sido um pouco

alto, as inoculações em folhas apresentaram ótimos resultados, porém, se o número

de repetições (folhas) utilizadas nos experimentos fosse maior, é possível que o

coeficiente de variação do experimento caisse e isso poderia proporcionar melhor

73

distinção entre os genótipos pelo método de inoculação de folhas sem ferimento,

permitindo a distinção entre genótipos de baixa e muito baixa suscetibilidade. Todos

os porta-enxertos inoculados com P. citrophthora nas folhas com ferimento

apresentaram lesões (Tabela 5), sendo que as maiores lesões foram observadas

nas folhas inoculadas com ferimento, as folhas inoculadas sem ferimento

apresentaram pequenas lessões e em alguns casos não apresentaram lesões, isso

é facilmente explicável uma vez que o patógeno penetra nos tecido das plantas por

aberturas naturais denominados de estômatos, porém quando tem algum ferimento

não espontâneo, a penetração do patógeno se dá através deste e a colonização é

mais rápida, o que também foi constatado por (REED e HYRANO 1931; COSTA

2000).

O método de inoculação em folhas destacadas sem ferimento,pode ser usado

para uma avaliação precoce de porta-enxertos tão logo as folhas definitivas sejam

lançadas e haja um número razoável delas (10 por exemplo) nas plantas, o que

apresenta um ganho para o PMGC não necessitar esperar que as plantas

completem 2 anos para serem avaliadas, e poder testar simultaneamente um

número maior de genótipos. Aqueles que mostrassem alta suscetibilidade por este

método poderiam ser descartados, logo, não prosseguindo a ocupar espaço nos

telados, pelo menos para os testes de resistência à gomose e podridão das raízes

causadas por P. citrophthora. É necessário testa-lo para plantas quanto à resistência

a P. nicotianae para ver se resultados similares são encontrados.

No presente estudo encontramos resultados similares aos observados em

experimentos anteriores por Torres et al., (2016), inoculando P. citrophthora em

mudas cítricas. Os autores constataram que o genótipo P. trifoliata Beneke,

inoculado em folhas com ou sem ferimento, tanto quanto para inoculações em caule,

mostrou sempre ter uma baixa suscetibilidade a está espécie de Phytophthora. Eles

ainda observaram também reações similares para os genótipos LVK x LCR - 010 e

limoeiro siciliano, o primeiro apresentando sempre lesões grandes ou alta % de área

da folha infectada e o segundo usado como controle suscetível, onde todas as

plantas morreram, como ocorreu no presente experimento.

Para os porta-enxertos (pé franco) com dois anos de idade, inoculadas com

P. citrophthora no caule, o teste de Scott Knott possibilitou a separação dos

74

genótipos em dois grupos distintos, sendo que as áreas de lessões dentro do grupo

a variaram de 0,71 a 1,56 e no grupo b de 1,72 á 2,86 (Tabela 6). BOAVA et al.

(2003) estudaram cinco genótipos usados como padrão, ou seja, P. trifoliata (2),

limão Cravo, limão Siciliano e tangerina „Sunki‟ e observaram que estes

apresentaram médias de 8,6; 9,9; 11,9; 15,9; e 33,0 mm de comprimento da lesão,

respectivamente, semelhante ao que foi encontrado nesse experimento, onde os

genótipos de P. trifoliata, Limoeiro 'Cravo Santa Cruz', e a tangerina „Sunki‟

apresentaram médias de 1,14; 1,46 e 2,86 cm2 de área das lesões, respectivamente,

e as plantas de limoeiro siciliano morreram todas antes da inoculação.

Os genótipos LRF x (LCR x TR) - 005 e HTR - 051 apresentaram uma alta

resistência quando inoculados com P. citrophthora em fase de mudas, avaliadas

com 60 dias após as inoculações, o mesmo resultado foi encontrado por Souza et al.

(2013), quando inóculou pelo mesmo método P. parasítica nos mesmos matérias e

avaliou 25 dias após as inoculações.

Apesar da eficiência dos métodos em discriminar as reações de

resistência/suscetibilidade, pôde-se observar, em pesquisas anteriores (Siviero et al

2002b; Boava et al., 2003), que os resultados, muitas vezes, se mostraram com alta

variabilidade dentro do mesmo genótipo. Para esse fato, podem-se considerar duas

possibilidades: a primeira seria em função dos métodos de inoculação utilizados,

que poderiam apresentar problemas em manter as mesmas condições para todas as

repetições de cada genótipo. A segunda seria por questões genéticas, já que Citrus

apresenta variações na produção de mudas a partir de sementes, pois a maioria das

variedades é apomítica e poliembriônica (FROST & SOOST, 1968). Uma grande

variabilidade na resistência à gomose tem sido observada entre genótipos de citros

usados como porta-enxertos, tanto em condições de infecção natural como sob

inoculação artificial (Rossetti, 2001). Em vários trabalhos pode-se notar diferenças

na classificação de genótipos quanto à resistência a Phytophthora spp. Um mesmo

genótipo pode ser classificado em mais de uma categoria de

resistência/suscetibilidade, fato que pode estar relacionado a diversos fatores como

ambiente, espécie e isolado do patógeno, patogenicidade do isolado, presença ou

ausência de outros patógenos na planta, método de inoculação e avaliação

empregados, estado de vegetação do hospedeiro, idade da planta e aspecto

75

nutricional, salinidade e pH do solo, grau de dormência da planta, suculência e vigor

dos tecidos envolvidos no patossistema citros-Phytophthora (SIVIERO, 2001).

O programa de melhoramento genético de citros da Embrapa em pesquisa

desenvolvidas ao longo de mais de dez anos, comprovou que o porta-enxerto pode

exercer influência sobre a copa (Soares Filho 2002), devido a isso, no referido

trabalho, foram testadas varias combinações copa x porta-enxertos de citros (Tabela

9 e 11). Em pesquisas desenvolvidas por (Soares Filho 2002), foi comprovado que a

copa de copa de limeira ácida „tahiti‟ induziu uma maior suscetibilidade aos porta-

enxertos, enquanto que a copa de laranjeira Pera induziu maior resitência. Isso foi

observado no presente estudo com os porta-enxertos HTR - 069 e TSKC x (LCR x

TR) - 059. Estudos desenvolvidos por Carvalho et al., 2016 com porta-enxertos

promissores, alternativos ao limoeiro 'Cravo', nos tabuleiros costeiros de Sergipe

observaram que o híbrido TSKC x (LCR x TR) – 059, proporcionou á copa da

laranjeira „Pera‟, pouca perda de água por evapotranspiração e eficiência no uso da

água para assimilação de CO2 acima da média geral.

Para os demais porta-enxerto as três copas não diferiram estisticamente, foi o

que ocorreu inclusive para o limoeiro 'cravo santa cruz' (Tabela 11), diferente do que

foi constatado por Brieger e Moreira (1945) ao dizer que a laranja „Pera‟, quando

enxertada sobre o limoeiro „cravo‟ confere certa „resistência‟ ao porta-enxerto em

relação a gomose. Já os citrandarins „Indio‟, „Riverside‟ e „San Diego‟ apresentaram

lesões pequenas, porém não diferiram estatisticamente para a comparação entre as

variedades copa enxertadas. Os citrandarins tem P. trifoliata em seu cruzamento, o

que provavelmente lhes conferiu resistência. Carvalho (2000) e Campos (2010)

detectaram que P. trifoliata é resistente às infecções de tronco e tolerante às

infecções de raízes provocadas por Phytophthora spp., e que este genótipo

transmite aos descendentes mais acentuadamente a característica de resistência à

gomose e de tolerância à podridão de radicelas quando comparado com a laranja

„Azeda‟. Isto constitui um fator de grande importância para programas de

melhoramento da cultura. Embora desde a década de 1970 a literatura esteja repleta

de trabalhos envolvendo a identificação e caracterização de genótipos resistentes e

suscetíveis a Phytophthora spp. (Broadbent, 1977) nota-se uma escassez de

estudos relacionados à herança da resistência a gomose, o que até o presente

momento é um fato.

76

Medina filho et al., 2003 estudando alguns híbridos de citros constatou que

os híbridos entre tangerina Sunki, limão Cravo e laranja Azeda apresentaram as

maiores médias de área de lesão. Resultados bem semelhantes foram observados

neste experimento, onde os híbridos de tangerina Sunki também apresentaram a

maior média de área de lesão, exceto aqueles em que um dos genitores é o P.

trifoliata. É notório entre as variedades, a superioridade do P. trifoliata a qual se

expressa por uma reduzida área de lesões. Os trifoliatas são conhecidos como

porta-enxertos resistentes à gomose de Phytophthora spp., e os resultados aqui

obtidos confirmam plenamente os anteriores com esse porta-enxerto (Medina filho et

al., 2003 ), que o avaliaram quanto a resistência à infecção de tronco causada por P.

parasitica, através da área da lesão provocada pelo patógeno após inoculação dupla

no tronco das plantas.

Loureiro et al., 2016 avaliando o volume médio de copa (V3), notaram

inicialmente, interações similares entre os porta-enxertos com as combinações de

limoeiro „Siciliano‟ sobre seis porta-enxertos ( T1 - limoeiro „Cravo Santa Cruz‟; T2 –

Híbrido 059 [C. sunki x (limoeiro „Cravo‟ x (P. trifoliata)] ; T3 - citrandarin „Indio‟; T4 -

citrandarin „Riverside‟; T5 - citrumeleiro 'Swingle' e T6 – tangerineira „Sunki Tropical‟)

aos 18 meses, com a supremacia da citrandarin „Riverside‟, que mesmo sendo

semelhante ao limoeiro „Cravo Santa Cruz‟, citrandarin „Indio‟ e citrumeleiro 'Swingle'

em alguns momentos, ao final do estudo, demonstrou ser o porta-enxerto que

melhor estimula a formação de copas com maior volume de biomassa no limoeiro

„Siciliano‟. Apesar do estudo desenvolvido por Loureiro et al., 2016, ter apresentado

bons resultados referente ao volume médio da copa em cruzamentos usando o

limoeiro siciliano, foi comprovada a alta suscetibilidade do limoeiro siciliano a P.

citrophthora por todos os métodos testados no presente trabalho.

GRAHAM (1990) demonstrou que o desenvolvimento da gomose é

influenciado pelo estado de vegetação da planta. Segundo o autor, as plantas que

se apresentam ativas fisiologicamente, ou seja, com brotações novas, maior vigor

vegetativo, e expressiva circulação nos vasos da casca produzem maiores lesões de

Phytophthora spp. Siviero (2001) afirma que as variações nos tamanhos de lesões

provocadas em inoculações de Phytophthora observadas entre e dentro de plantas

cítricas da mesma cultivar podem ser atribuídas à atividade fisiológica da casca no

local de inoculação.

77

Como ainda não foram feitas avaliações em campo, não é possível comprovar

a observação dos autores citados o que se pode dizer é que reações diferentes

foram observadas em dois genótipos usados como porta-enxerto em função da copa

utilizada, comprovando que há interação copa x porta enxerto conforme mencionado

por FEICHTENBERGER (2001) e POMPEU JUNIOR (2005).

Comprovou-se também que há variação em alguns porta-enxertos quanto ao

comportamento à inoculação com P. citrophthora, porém, não foi regra geral. O

método de inoculação testado permitiu separar porta-enxertos quanto a

suscetibilidade à espécies de Phytophthora testadas. Matheron e Matejka (1992)

ressaltam que os resultados obtidos sobre a resistência de genótipos a Phytophthora

em testes artificiais (laboratório e casa de vegetação) nem sempre correspondem à

resistência de genótipos no campo. Os autores encontraram maiores lesões

provocadas por Phytophthora em inoculações de laranja „Azeda‟ quando

comparadas com lesões de limão rugoso em teste controlado. No campo a situação

se inverteu, as lesões de Phytophthora foram sempre maiores nas inoculações em

limão rugoso.

78

6. REFERENCIAS

AFEK, U. & SZTEJNBERG, A. A rapid method for evaluating citrus seedlings for

resistance to foot rot caused by Phytophthora citrophthora. Plant Disease 74:66-68.

1990.

ALENCAR, J. Podridão do pé dos citros. Boletim nº 6, Escola Superior de

Agricultura de Minas Gerais, Viçosa. 1941.

ALMEIDA, C. O. de; PASSOS, O. S. Citricultura brasileira em busca de novos

rumos: Desafios e oportunidades na região nordeste. Cruz das Almas, BA: Embrapa

Mandioca e Fruticultura, 2011. p.145.

AUGUSTÍ, M. Citricultura. Madrid: Ediciones Mundi-Prensa, 2003. 422p.

BAHIA, R. DE. C.; AGUILAR-VILDOSO, C. I.; Luz, E. D. M. N.; LOPES, U. V.;

MACHADO, R. C. R.; CORRÊA, R. X. Resistance to Black Pod Disease in a

Segregating Cacao Tree Population. Tropical Plant Pathology , v. 40, p. 13-18,

2015.

BOAVA, L.P., SIVIERO A., MASUDA Y., FURTADO E.L., MACHADO M.A.,

Resistência de citrandarins e citranges a Phytophthora nicotianae, Laranja 24 (1)

(2003) 135–144.

BOWERS, J. H. ; MARTIN, F. N. ; TOOLEY, P. W. ; LUZ, E. D. M. N. . Genetic and

Morphological Diversity of Temperate and Tropical Isolates of. Phytopathology, v.

97, p. 492-503, 2007.

BRIEGER, F.G., MOREIRA, S. Experiências de cavalos para citrus II. Bragantia,

v.5, n.10, p.597-653, 1945.

BROADBENT, P. Phytophthora diseases of citrus: a review. Proc. Int. Soc.

Citricultura., v.3, p.986-92, 1977.

CAIXETA, M. P.; NUNES, W. M. de C.; SANTOS, A. F. dos; TESSMANN, D. J.;

VIDA, J. B. Espécies de Phytophthora associadas à gomose em pomares de citros

79

no Estado do Paraná, Brasil. Summa Phytopathologica, Botucatu, v. 39, n. 4, p.

242-247, 2013.

CAMPOS, T.M.P., YALI, M.C., SANTOS JUNIOR, J.A., SCHINOR, E.H.,

BASTIANEL, M., MACHADO, M.A. Avaliação de Híbridos de Limão Cravo VS

Poncirus trifoliata para resistência à gomose de Phytophtora. Anais do 4° Congresso

Interinstitucional de Iniciação Científica – CIIC. Campinas – SP. 2010.

CARVALHO, L. M. de; CARVALHO, H. W. L. de; SOARES FILHO, W. dos S.;

MARTINS, C. R.; PASSOS, O. S. Porta-enxertos promissores, alternativos ao

limoeiro 'Cravo', nos Tabuleiros Costeiros de Sergipe. Pesquisa Agropecuária

Brasileira, Brasília, v.51, n.2, p.132-141, fev. 2016.

COSTA, M.A.P.C. et al. Análise estomática em híbridos somáticos de citros obtidos

através da fusão de protoplastos. In: CONG. SOC. BOTÂNICA SÃO PAULO, 13.,

2000, São Paulo. Resumos... Sociedade Botânica, 2000. p.27-28.

DONADIO, L.C.; MOURÃO FILHO, F.A.; MOREIRA, C.S. Centros de origem,

distribuição geográfica das plantas cítricas e histórico da citricultura no Brasil. In:

MATTOS JUNIOR, D.; DE NEGRI, J.D.; PIO, R.M; POMPEU JUNIOR, J. Citros.

Campinas: Instituto Agronômico e Fundag. Centro APTA Citros Sylvio Moreira. p.1-

18, 2005.

DUARTE, F. E. V. D. O.; BARROS, D. D. R.; GIRARDI, E. A.; SOARES FILHO, W.

D. S.; PASSOS, O. S. Polyembryony and morphological seed traits in citrus

rootstocks. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 35, n. 1, p. 246-254, 2013.

ERWIN, D.C.; RIBEIRO, O.K. Phytophthora diseases worldwide. St. Paul: The

Americam Phytopathological Society, 1996.

FALDONI, L. Efeito de Biofertilizante no Desenvolvimento de Porta-enxertos de

citros e na indução de resistência à gomose de Phytophthora. São Carlos:

UFSCar, 2011. 64f.

FAWCETT, H.S. & BITANCOURT, A.A. Occurence, pathogenicity and

temperature relations of Phytophthora species on citrus in Brazil and other

South American countries. Arquivos do Instituto Biológico 11:107-121. 1940.

80

FAWCETT, H.S. Citrus disease and their control. 2nd ed. New York. Mcgraw Hill

Co. 1936.

FAWCETT. H.S. Gummosis of citrus. Journal of Agricultural Research v. 24 p.191-

236. 1923.

FEICHTENBERGER, E. Doenças incitadas por Phytophthora em citros. In: Luz, E. D.

M. N.; Santos, A. F.; Matsuoka, K.; Bezerra, J.L. (Eds). Doenças causadas por

Phytophthora no Brasil. Campinas. Livraria e Editora Rural Ltda. 2001. p.283-342.

FEICHTENBERGER, E.; MÜLLER, G.W.; GUIRADO, N. Doenças dos citros (Citrus

spp.). In: KIMATI, H. et al. (eds.). Manual de Fitopatologia. v. 2. Doenças das

plantas cultivadas. 3. ed. São Paulo: Ceres. p. 261-296, 1997.

FEICHTENBERGER, E.; SPÓSITO, M B.; PIO, R. M; CASTRO, J.L. Seleção de

tangerineiras e híbridos de citros para a tolerância à Mancha Marrom de Alternaria

(Alternaria alternata Keissler). Citricultura atual. Cordeirópolis, n. 45, v.8, p. 08-10,

2005.

FOURIE, A. Biochemical mechanisms for tolerance of citrus rootstocks against

Phytophthora nicotianae. 2004. 112 p. Dissertação (Mestrado em Agronomia) –

Faculty of natural and agricultural sciences, Universidade de Pretoria,Petroria, 2004.

FRANÇA, N. O.; AMORIM, M. S.; GIRARDI, E. A.; PASSOS, O. S.; SOARES FILHO,

W. S. Performance of „Tuxpan Valencia‟ sweet orange grafted onto 14 rootstocks in

Northern Bahia, Brazil. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v.38, n.4, e-

684, 2016.

FUNDECITRUS - Fundo de Defesa da Citricultura (2017) https://istoe.com.br/pes-

estima-safra-2017-18-de-laranja-em-38520-mi-de-caixas-alta-de-57/

FUNDECITRUS – Fundo de Defesa da Citricultura, safra 2017/2018. Disponível em:

<http://www.fundecitrus.com.br/comunicacao/noticias/integra/safra-da-laranja-

201718-e-estimada-em--36447-milhoes-de-caixas/540>. Acesso em 05 de novembro

de 2017.

81

FURR, J.R., CARPENTER, J.B. Program for breeding citrus rootstocks tolerant to

Phytophthora root rot. Proc. Flor. State Horticult. Society, v.18, p.18-23, 1961.

GRAHAM, J.H. Evaluation of tolerance of citrus rootstocks to Phytophthora root rot in

chlamydospore infested soil. Plant Disease 74:743-746. 1990.

GRAHAM, J.H. Root regeneration and tolerance of Citrus rootstocks to root rot

caused by Phytophthora nicotianae. Phytopathology, v.85, p.11-17, 1995.

GRAHAM, J.H.; TIMMER, L. W. Phytophthora disease of citrus. In: KUMAR, J.;

CHAUBE, H. S.; SINGH, U S.; MUKHOPADHY, A. N. (Ed.). Plant diseases of

international importance: diseases of fruit crops. Englewood Cliffs: PrenticeHall,

1992. v. 3, p. 250-269.

IBANEZ ,A.J., SCHARTE, J., BONES, P., PIRKL, A., MELDAU, S., BALDWIN, I.T.,

HILLENKAMP, F., WEIS, E., DREISEWERD, K.: Perfil metabólico rápido

de respostas de defesa de Nicotiana tabacum contra Phytophthora

nicotianae usando espectrometria de massa de ionização de dessorção por laser de

infravermelho direto e análise de componentes principais. Plant Methods 2010, v.6

p.14.

IBGE-Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, safra 2016/2017. Acesso em 11

de agosto de 2017.

KLOTZ, L.J. & FAWCETT, H.T.S. The relative resistance of varieties and species of

citrus to Phythiacystis gummosis and other bark diseases. Journal of Agricultural

Research 41:415-425. 1930.

LARANJEIRA. F.F.; AMORIM, L.; BERGAMIN FILHO, A.; AGUILAR-VILDOSO, C. I.;

COLETTA-FILHO, H.D. Fungos, Procariotos e doenças abióticas. In: Mattos Junior,

D.; DE NEGRI, J. D.; PIO, R. M & POMPEU JUNIOR, J. (eds).Citros, Cordeirópolis,

p. 223-277, 2005.

LOPES, J.M.S.; DÉO, T.F.G.; ANDRADE, B J. M.; GIROTO, M.; FELIPE, A.L. S.;

JUNIOR, C.EI.; BUENO, C. E. M.S.; SILVA, T. F.; LIMA, F.C.C..Importância

econômica dos citros no Brasil. Revista Científica Eletrônica de Agronomia.

Garça – SP.20ª Ed. 2011.

82

LOUREIRO, F. L. C.; SOMBRA, K. E. S.; SILVA, A. C. C. e; SANTOS, F. S. S.

dos; PASSOS, O. S.; BASTOS, D. C. Desenvolvimento inicial de limoeiro Siciliano

sobre e porta-enxertos no Semiárido do Ceará. In: FEIRA INTERNACIONAL DA

FRUTICULTURA TROPICAL IRRIGADA - EXPOFRUIT, 2016, Mossoró. Mais

longevidade para você e seus negócios. Mossoró: COEX: SEBRAE: UFERSA, 2016.

LUTZ, A., MENGE, J.A. Population fluctuations and the numbers and types of

propagules of Phytophthora nicotianae that occur in irrigated citrus groves. Plant

Disease., v.75, p.173-9, 1991.

LUZ, E. D. M. N.; MITCHELL, D. J. . Densidade de inóculo de Phytophthora spp. no

solo e infecção de raízes do cacaueiro.. Ilhéus: Ceplac/Cepec, 1995a (Informe de

Pesquisa 1987/1990).

LUZ, E. D. M. N.; MITCHELL, D. J. . Patogenicidade de Phytophthora spp. a raízes,

caules, folhas e frutos de Theobroma cacao.. Ilhéus: Ceplac/Cepec, 1995b (Informe

de Pesquisa 1987/1990).

LUZ, E.D.M.N.; MATSUOKA, K. . Taxionomia e sistemática do gênero Phytophthora.

Revisão Anual de Patologia de Plantas, v. 04, p. 297-328, 1996.

LUZ, E. D. M. N.; SANTOS, A. F. dos; MATSUOKA, K.; BEZERRA, J. L. Doenças

causadas por Phytophthora no Brasil. Campinas: Livraria e Editora Rural, 2001.

754 p.

LUZ, E. D. M. N.; SILVA, S. D. V. M.; BEZERRA, J. L.; SOUZA, J. T. de; SANTOS,

Á. F. dos. Glossário Ilustrado de Phytophthra: técnicas especiais para o estudo

de oomicetos. 1. ed. Itabuna - BA: FAPESB/Centro de Pesquisas do Cacau, 2008.

v. 1. 204p.

MACHADO, E.C., SCHMIDT, P.T., MEDINA, C.L., RIBEIRO, R.V., Respostas da

fotossíntese de três espécies de citros a fatores ambientais. Pesq. agropec. bras.,

Brasília, v.40, n.12, p.1161-1170, dez. 2005

MAGALHÃES, D. M. A.; Luz, E. D. M. N.; LOPES, U. V.; NIELLA, A. R. R.;

DAMACENO, V. O. Leaf disc method for screening Ceratocystis wilt resistance in

cacao. Tropical plant pathol , v. 41, p. 21-27, 2016.

https://www.bdpa.cnptia.embrapa.br/consulta/busca?b=ad&biblioteca=vazio&busca=autoria:%22SANTOS,%20F.%20S.%20S.%20dos%22

https://www.bdpa.cnptia.embrapa.br/consulta/busca?b=ad&biblioteca=vazio&busca=autoria:%22SANTOS,%20F.%20S.%20S.%20dos%22

83

MARTIN, F.N.; BLAIR, J.E.; COFFEY, M.D. A combined mitochondrial and nuclear

multilocus phylogeny of the genus Phytophthora. Fungal Genetics and Biology,

v.66, p.19-32, 2014.

MATHERON, M.E., MATEJKA, J.C. Effects of temPerature on sporulation and

growth of Phytophthora citrophthora and Phytophthora nicotianae and development

of foot and root rot on citrus. Plant Disease., v.76, p.1103-9, 1992.

MATHERON, M.E.; WRIGHT, G.C. & PORCHAS, M. Resistance to Phytophthora

citrophthora and P. nicotianae and nursery characteristics of several citrus

rootstocks. Plant Disease 82:1217-1225. 1998.

MEDINA FILHO, H. P.; BORDIGNON R.; SIQUEIRA, W.J.; FEICHTENBERGER, E.;

CARVALHO, M.R.T; SOBRINHO, J.T. Resistência de clones e híbridos de porta-

enxertos de citros à gomose de tronco causada por Phytophthora nicotianae.

Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.28 n.5, p.534-540, 2003.

MEDINA FILHO, H.P., BORDIGNON, R., SIQUEIRA, W., FEICHTENBERGER, E.,

CARVALHO, M.R.T.: Tolerância de híbridos e de clones de porta-enxertos de citros

à infecção de raízes por Phytophthora nicotianae. Fitopatologia Brasileira 2004,

v.29 p.169-178.

MELO, M.B., ANDRADE, L.N.T. Principais Doenças da Citricultura em Sergipe e

seu controle. In: Aspectos técnicos dos citros em Sergipe / editores, Marcelo Brito

de Melo, Luis Mário Santos de Silva - Aracaju : Embrapa Tabuleiros Costeiros,

Deagro, 2006.

MÉTRAUX, J.P. Induced defenses in plants. In: RODRIGUEZ, F.; ROMEIRO, R.

Indução de resistência em plantas a patógeno. In: REUNIÃO BRASILEIRA SOBRE

INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA A PATÓGENOS, 3., 2007. VIÇOSA. Anais... Viçosa,

2007. P. 7-24.

NEVES, M. F. et al. O retrato da citricultura brasileira.Ribeirão Preto: CitrusBR,

2010. 137 p.

OLIVEIRA, R. P. de; SOARES FILHO, W. dos S.; MACHADO, M. A.; FERREIRA, E.

A.; SCIVITTARO, W. B.;GESTEIRA, A. da S. Melhoramento genético de plantas

84

cítricas. Informe Agropecuário , Belo Horizonte , v. 3 5 , n . 2 8 1 , p . 2 2 - 2 9 , j u l

. / a g o . 2 0 1 4

PACHOLATI, S.F.; LEITE, B. Mecanismos de resistência às doenças. In: WILMAR

C da LUZ. (Org.) Revisão Anual de Patologia de Plantas. Passo fundo,RS: v. 2, p.1-

51, 1994

PASCHOLATI, S.F. Fitopatógenos: Arsenal enzimático. In: BERGAMIN FILHO, A.;

KIMATI, H.; AMORIM, L. (Ed.). Manual de Fitopatologia. Princípios e Conceitos.

São Paulo, Editora Agronômica Ceres, 1995. V.1. 919p.

PASSOS, O. S.; CUNHA SOBRINHO, A. P.; SOARES FILHO, W. S. Cultivares copa.

In: CUNHA SOBRINHO, A. P. da; MAGALHÃES, A. F. de J.; SOUZA, A. da S.;

PASSOS, O. S.; SOARES FILHO, W. dos S. (Org.). Cultura dos citros. Brasília,

DF: Embrapa, , 2013. v.1, p.293-319.

PIO, R. M.; FIGUEREDO, J. O.; STUCHI, E. S.; CARDOSO, S. A. B. Variedades

copa. In: MATTOS JUNIOR, D. NEGRI, J. D.; PIO, R. M.; POMPEU JUNIOR, P.

Citros. Campinas: Fundag, p.37-60, 2005.

POMPEU JUNIOR, J. Porta-enxerto. In: RODRIGUEZ, O.; VIÉGAS, F.; POMPEU

JUNIOR, J.; AMARO, A.S. Citricultura brasileira. Campinas: Fundação Cargill,

1991. v. 1, p. 265-280.

POMPEU JUNIOR, J., Porta - Enxertos. In: Mattos Junior, D. De; De Negri, J.D.; Pio,

R.M.; Pompeu Junior, J. (Ed.). Citros. Campinas: Instituto Agronômico e Fundag, pp.

61-104, 2005.

R CORE TEAM. R: A language and environment for statistical computing. R

Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. 2017. Disponível em:

http://www.R-project.org/

REED, H.S.; HYRANO, E. The density of stomata in citrus leaves. J. Agr. Research,

v.43, p.209-222, 1931.

RIETHMÜLLER, A.; VOGLMAYR, H.; GÖKER, M.; WEIß, M.; OBERWINKLER, F.

Phylogenetic relationships of the downy mildews (Peronosporales) and related

85

groups based on nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycologia, v.94,

n.5, p.834-849, 2002.

ROSSETTI, V. Estudos sobre “gomose de Phytophthora” dos citros I. Suscetibilidade

de diversas espécies cítricas à algumas espécies de Phytophthora. Arquivos do

Instituto Biológico 18:97- 124. 1947.

ROSSETTI, V. V. Manual ilustrado de doenças dos citros. Piracicaba: FEALQ;

FUNDECITRUS, 2001. 207 p. il. color.

SANTOS, A. F. DOS; MATSUOKA, K.; MAFFIA, L. A.; ALFENAS, A. C., Importância

da estrutura da superfície foliar na interação Phytophthora capsici - Hevea

brasiliensis. Boletim de Pesquisa Florestal, Colombo, n. 39, p.67-80, jul./dez. 1999.

SANTOS, E. S. L. ; CERQUEIRA-SILVA C. B. M. ; CLEMENT, D. ; LUZ, E. D. M. N. .

Resistance gradient of black pod disease in cocoa and selection by leaf disk

assay. Crop Breeding and Applied Biotechnology, v. 11, p. 297-303, 2011.

SCHWAN-ESTRADA, K.RF; STANGARLIN,J.R; PASCHOLATI, S.F. Mecanismos

bioquímicos e defesa vegetal. In: PASCHOLATI. S.F.;LEITE. B.; STANGARLIN, J.R.;

CIA, P. (Ed.). INTERAÇÃO Planta-Patógeno: Fisiologia, Bioquímica e Biologia

Molecular. Piracicaba: FEALQ, 2008, cap 6, P 227-248.

SIVIERO A., CRISTOFANI M., BOAVA L.P., MACHADO M.A., Mapeamento de

QTLs associados à produção de frutos e sementes em híbridos de Citrus Sunki vs.

Poncirus trifoliata. Revista Brasileira de

Fruticultura vol.24 no.3 Jaboticabal 2002b.

SIVIERO, A. Avaliação de métodos de inoculação de Phytophthora nicotianae e

mapeamento de QTLs de resistência em híbridos de Citrus sunki vs. Poncirus

trifoliata a gomose. 2001. x, 114 f. Tese (doutorado) - Universidade Estadual

Paulista, Faculdade de Ciências Agronômicas, 2001. Disponível em:

<http://hdl.handle.net/11449/105470>.

SIVIERO, A.; FURTADO, E.L. & MACHADO, M.A. Métodos de inoculação de

Phytophthora nicotianae em citros. Laranja, Cordeirópolis, v.23, n.1, p.203- 219,

2002a.

86

SMITH, G.S., HUTCHISON, D.J. & HENDERSON, T. Comparative use of soil

infested with chlamydospores to screen for relative susceptibility to Phytophthora foot

rot in citrus cultivars. Plant disease v.75 p.402-405. 1991.

SMITH, G.S., HUTCHISON, D.J. & HENDERSON, T. Screening sweet orange citrus

cultivars for relative susceptibility to Phytophthora foot rot. Proceedings Florida State

Horticultural Science v.110 p.64-66. 1987.

SOARES FILHO, W. dos S.; CUNHA SOBRINHO, A. P. da; PASSOS, O.

S. Limoeiro 'Cravo Santa Cruz': variedade com maior número de

sementes. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura, 2003. 4p. il.

SOARES-FILHO, W.S., DIAMANTINO, M.S.A.S., MOITINHO, E.D.B., SOBRINHO,

A.P.C., PASSOS, O.S. (2002) „Tropical‟: a new selection of „Sunki‟ mandarin.

Revista Brasileira de Fruticultura v 24 p.127–132

SOUZA, U.; OLIVEIRA, A. A. R.; PASSOS, O. S.; SOARES FILHO, W. dos S.

Avaliação de combinações copa/porta-enxerto de citros, em fase de mudas, para

resistência a Phytophthora parasítica. In: JORNADA CIENTÍFICA EMBRAPA

MANDIOCA E FRUTICULTURA TROPICAL, 7., 2013, Cruz das Almas. Anais...

Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura, 2013. Publicação online.

TIMMER, L.W.; GARNSEY, S.M.; GRAHAM, J.M. Compendium of citrus diseases.

ST Paul: APS Press, 2000. 80p.

TORRES, M. T. B. L.; SOUZA, U.; SANTOS FILHO, H. P.; SOARES FILHO, W. dos

S. Avaliação da reação de combinações copa/porta-enxerto de citros, em fase de

mudas, a Phytophthora citrophthora. In: JORNADA CIENTÍFICA EMBRAPA

MANDIOCA E FRUTICULTURA, 10., 2016: Cruz das Almas, BA. Traduzindo ciência

para o mundo : resumos. Brasília, DF : Embrapa, 2016.

TSAO, P.H.,. Factors affecting isolation and quantitation of Phytophthora from soil.

In: Erwin DC, Bartnicki-Garcia S, Tsao PH, eds. Phytophthora: Its Biology,

Taxonomy, Ecology, and Pathology. St Paul, MN, USA: The American

Phytopathological Society, 219±36. 1983

87

VAZ, A. B.; Luz, E.D.M.N.; Silva, S.D.V.M.; OLIVEIRA, M.L. . Aspectos

histopatológicos da interação Phytophthora palmivora com a pupunheira.. Tropical

Plant Pathology, v. 36, p. 259-263, 2011.

VAZ, A. B. ; OLIVEIRA, M. L. ; SILVA, M. G. C. P. C. ; LUZ, E. D. M. N. Avaliação de

métodos para inoculação de Phytophthora palmivora em plântulas de pupunheira.

Agrotrópica, v. 27, p. 249-256, 2015.

VILLA, G.A.S. Indução de resistência em citros contra Phytophthora

citrophthora e Phytophthora nicotinae: método de inoculação, seleção de

indutores, aspectos fisiológicos e bioquímicos. Piracicaba: ESALQ/USP.

Dissertação de Mestrado, 2010.

WATANABE, T. Picturial atlas of soil and seed fungi. Boca Raton: CRS

Press:1994. 411p. disponível em: acessado em 08/01/2018,

<https://books.google.com.br/books?hl=ptR&lr=&id=gq8h2Q6KckEC&oi=fnd&pg=PP

1&dq=Pictorial+atlas+of+soil+and+seed+fungi&ots=d8_eLYnHIH&sig=CgE9evLbJsC

NLs9k_kxj3zZAqdE#v=twopage&q=Pictorial%20atlas%20of%20soil%20and%20see

d%20fungi&f=true>.

WHITESIDE, J.O. Zoospore-inoculation techniques for determining the relative

susceptibility of citrus rootstocks to foot rot. Plant Disease, St. Paul, v.58, n.8, p 713-

717, 1974.

WIDMER, T. L., GRAHAM, J.H., MITCHELL, D.J. Histological comparison of fibrous

rootinfection of disease-tolerant and susceptible citrus hosts by Phytophthora

nicotianae and P. palmivora. Phytophatology, v.88, p.389-95, 1998.

http://lattes.cnpq.br/7358040117703978




88

7. CONCLUSÕES GERAIS

O isolado LRS 45/17 de P. citrophthora mostrou-se ativo e patogênico à

folhas e frutos de limoeiro siciliano quando comparado aos demais isolados, sendo

usado em todos os experimentos.

P. citrophthora foi recuperada aos 90 e 120 DAI tanto das raízes quanto do

solo nos métodos com infestação do substrato.

Houve correlação positiva entre o método de inoculação no caule, mais

comumente usado e o de inoculação em folhas destacadas sem ferimento.

O método de folhas destacadas inoculadas com suspensão de zoósporos ou

disco de cultura, sem ferimento, pode ser usado para avaliação precoce de plantas

cítricas quanto à resistência à gomose.

Houve variação na reação dos porta-enxertos a P. citrophthora.

As combinações copa x porta-enxerto também reagiram de forma variável a

inoculação com P. citrophthora, comprovando que há interação copa x porta-

enxerto.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS...

Documents

Transcript of UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS...