Análise das placas de transformação

A transformação de leveduras consiste na introdução de moléculas de DNA em células vivas. No nosso caso, trataram-se células intactas com sais de lítio seguindo-se um tratamento com PEG. Os iões de lítio afetam a permeabilidade da parede celular, enquanto que a adição de uma molécula de DNA de cadeia simples não codificante (DNA carrier ) ao DNA exógeno que se pretende introduzir na levedura (que neste caso é DNA plasmidico) aumenta a eficiência da transformação. O PEG, faz com que o DNA exógeno e o DNA carrier se concentrem à superfície da célula o que facilita a respetiva entrada para o interior da célula.

Neste trabalho foram usados dois plasmídeos (pFL44L e pZWF1). Plaqueámos seis caixas de Petri de forma a verificar se houve sucesso na transformação. O DNA plasmidico a utilizar na transformação da levedura deve possuir marcadores de seleção conhecidos. Neste caso usou-se o Uracilo como marcador. Deste modo, três das caixas realizadas eram Ura + (o meio de crescimento continha uracilo) e três delas eram Ura- (o meio tinha deficiência de Uracilo).

É esperado que nas caixas Ura+ cresçam todo o tipo de leveduras, visto que há uracilo no meio, pelo que tanto leveduras capazes de produzir uracilo como as que não tem o gene que codifica para a produção de uracilo são capazes de crescer pois retiram uracilo do meio.

Já nas caixas Ura- espera-se que apenas as leveduras transformadas sejam capazes de crescer visto que estas contém o plasmídeo com o gene que codifica para a síntese de uracilo ao contrario das leveduras não transformadas que tal como foi referido acima são incapazes de produzir esta base azotada.

Na figura que se encontra abaixo são apresentadas as placas de transformação obtidas na aula.

Legenda:

Placa 1 – Meio CAA Ura- , estirpe ZWF1Δ + pZWF1

Placa 2 – Meio CAA Ura Ura +, estirpe ZWF1Δ + pZWF1

Placa 3 – Meio CAA Ura -, estirpe ZWF1Δ + pFL44L

Placa 4 – Meio CAA Ura + , estirpe ZWF1Δ + pFL44L

Placa 5 – Meio CAA Ura - , sem plasmídeo (só DNA carrier)

Placa 6 – Meio CAA Ura+, sem plasmídeo (só DNA carrier)

Iremos então analisar as placas. Na placa 1, o meio utilizado foi Ura- e foi inoculado ZWF1Δ + pZWF1. Observou-se apenas uma colonia de transformantes e algumas colonias de bactérias contaminantes. Era esperado crescimento de transformantes visto que o plasmídeo pZWF1 tem o gene codificante para a produção de uracilo e experimentalmente isso foi observado, embora com um pequeno numero de transformantes. O numero reduzido de colonias transformantes pode ter sido devido à existência de pouco DNA plasmidico o que se verificou no gel de eletroforese visto que não apareceram bandas.

Na placa 2, o meio usado foi Ura+ e foi inoculado ZWF1Δ + pZWF1. Neste caso é de esperar que cresçam ambas colonias transformantes e não transformantes pois o meio tem uracilo pelo as colonias de levedura que não produzem uracilo podem ir busca-lo ao meio. Experimentalmente o resultado foi concordante. Esta placa serve de controlo da viabilidade das células, e como houve uma elevada taxa de crescimento de células podemos concluir que as células se encontravam viáveis. Deste modo se não tivesse ocorrido crescimento na placa 1 saberíamos que era por as células não estarem transformadas e não por estarem inviáveis.

Na placa 3, o meio usado foi Ura- e foi inoculado ZWF1Δ + pFL44L. Era esperado crescimento apenas de colonias transformantes tal como na placa 1, pois o plasmídeo Pfl4L tem o gene codificante para a produção de uracilo. Experimentalmente foram observadas algumas colonias de transformantes e colonias contaminantes que têm forma e textura diferente das colonias de levedura. Nesta placa tivemos maior numero de colonias transformantes o que pode ser explicado pelo facto do plasmídeo pfl44l ser mais pequeno que o pzwf1 pelo que tem mais facilidade em entrar na célula e autoreplicar-se.

Na placa 4, foi usado meio Ura+ e inoculado ZWF1Δ + pFL44L. Era esperado que tal como na placa 2 crescessem colonias transformantes e não transformantes. Isto foi verificado experimentalmente com um grande crescimento de colonias e concluímos assim que as células eram viáveis.

Na placa 5, foi usado meio Ura- e inoculado apenas DNA carrier. Neste caso espera-se que não cresça nada pois o DNA carrier não tem genes codificantes para a produção de uracilo, pelo que as leveduras não são capazes de produzir uracilo. De facto, isto foi observado experimentalmente pois não crescerem colonias transformantes, apenas se observaram alguns contaminantes que se conseguem identificar pois tem forma e textura diferentes das colonias de levedura.

Na placa 6, usou-se meio Ura+ e foi inoculado apenas DNA carrier. Aqui já seria de esperar crescimento pois temos uracilo no meio pelo que mesmo que as leveduras não o consigam produzir podem ir busca-lo ao meio. O resultado experimental foi concordante.

Podemos concluir que a transformação foi bem sucedida e mesmo não se observando bandas na eletroforese como o processo de transformação e mais sensível concluímos que tínhamos de facto colonias transformantes.