Programa de Pós-Graduação em Genética · 2016-06-21 · Vetores plasmidiais de clonagem e...

Programa de Pós-Graduação em Genética

Universidade Federal de Pernambuco

Centro de Ciências Biológicas

Departamento de Genética

Construção de vetores para modificação

genética de linhagens industriais de

Saccharomyces cerevisiae

Fernanda Cristina Bezerra Leite

Recife, PE

Março - 2008

FERNANDA CRISTINA BEZERRA LEITE

Construção de vetores para modificação

genética de linhagens industriais de


Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Genética da Universidade Federal

de Pernambuco, como parte dos requisitos

necessários para a obtenção do grau de Mestre em

Genética.

Orientador: Prof. Dr. Marcos Antonio de Morais

Júnior. Núcleo de Engenharia Metabólica, Depto. de

Genética, Centro de Ciências Biológicas, UFPE.

Co-orientador: Prof. Dr. Diogo Ardaillon Simões.

Núcleo de Engenharia Metabólica, Depto. de

Bioquímica, Centro de Ciências Biológicas, UFPE.

Recife, PE

Março – 2008

Leite, Fernanda Cristina Bezerra Construção de vetores para modificação genética de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae / Fernanda Cristina Bezerra Leite – Recife: O Autor, 2008. 81 folhas : il., fig. tab.

Dissertação (mestrado) – UFPE. CCB. Genética, 2008.

Inclui bibliografia.

1. Saccharomyces cerevisiae – Potencial biotecnológico 2. Fungo – Biotecnologia 3. Fungo – Modificação genética I. Título.

582.282.23 CDU (2.ed.) UFPE 579.562 CDD (22.ed.) CCB – 2008- 052

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus pais, Betânia e Severino,

e meus irmãos, Flávia, Fernando e Flávio,

por todo o apoio incondicional e alicerce

concedido.

Esta conquista é nossa!

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela oportunidade e coragem concedidas para a conclusão de mais

esta etapa em minha vida.

Aos meus orientadores Prof. Marcos Morais e Prof. Diogo Simões, pela oportunidade

de participar deste grupo de pesquisa, pela confiança, pelo conhecimento compartilhado e por

todo o aprendizado por mim adquirido. Muito obrigada!

Aos meus pais, Severino e Betânia, pelo amor incondicional, pelo alicerce concedido,

pela compreensão em muitos momentos e pelo exemplo de família que tenho todos os dias.

Não há palavras que descrevam minha admiração por vocês.

Aos meus irmãos, Flávia, Fernando e Flavinho, pela compreensão, alicerce e por

tornarem meus dias bem mais felizes.

A George, meu namorado, por seu apoio, paciência e compreensão em todos os

momentos, por todo o amor a mim dedicado. Com você por perto, tudo se torna bem mais

fácil.

Aos meus familiares, avós, tios e primos, que estiveram na torcida para que este

trabalho fosse concluído.

Aos amigos do Núcleo de Engenharia Metabólica, Carla, Elainy, Rute e Guilherme,

pela preciosa amizade, pelo conhecimento compartilhado, colaboração durante este trabalho

Aos amigos do Grupo Genética de Microrganismos, Brígida, Rochane, Mariland,

Meiriana, Theresa, Rodrigo, Felipe Alecrim e Billy e do Grupo HPV, Helder, Eliane, André,

Júlia, Filipe e Mirela, pela amizade, pelas contribuições profissionais ou não e pela leveza do

convívio diário.

SUMÁRIO

Página

Lista de Figuras i

Lista de Tabelas ii

Lista de Abreviações iii

Resumo 1

Abstract 2

1. Introdução 3

2. Revisão bibliográfica 4

2.1. Informações sobre a levedura Saccharomyces cerevisiae 4

2.2. A levedura Saccharomyces cerevisiae na Biotecnologia 5

2.3. Exemplos de aplicações utilizando a tecnologia do DNA recombinante 7

2.4. Modificação genética de linhagens industriais de S. cerevisiae 8

2.5. Engenharia genética de S. cerevisiae 9

2.5.1. Vetores plasmidiais de clonagem e expressão 10

i. Características gerais 11

ii. Replicação e manutenção dos vetores em células de leveduras 12

iii. Marcas de seleção e integração genômica 13

iv. Promotores e sítios de clonagem 18

v. Sistemas comerciais de clonagem e expressão 19

2.5.2. Elementos genéticos de integração 21

2.6. OGMs, biossegurança e patentes 23

2.6.1. A tecnologia “limpa” e o sistema de modificação genética proposto 24

2.6.2. A possibilidade de pedido de patente 26

3. Referências Bibliográficas 28

4. Manuscrito do Artigo Científico 37

5. Anexos 64

5.1. Número de acesso das seqüências nos bancos de dados NCBI e SGD 65

5.2. Seqüência completa do vetor pFB-LAC12 66

5.3. Seqüência completa do vetor pFB-LAC4 69

5.4. Desenho esquemático da construção dos vetores pFB’s 73

5.5. Mapa físico dos vetores utilizados neste trabalho 74

5.6. Informações complementares 78

i

LISTA DE FIGURAS

Página

Revisão bibliográfica

Figura 1. Remoção da marca Kanr mediada pela expressão da enzima Cre recombinase 16

Figura 2. Estrutura do rDNA em S. cerevisiae 17

Figura 3. Vetores comercializados pela Invitrogen 21

Figura 4. Vetores pESC comercializados pela Stratagene 21

Figura 5. Métodos de integração cromossômica por recombinação homóloga 23

(A) Método clássico de integração 23

(B) Método “pop-in/pop-out” de integração 23

(C) Método “ends-out” para integração 23

Manuscrito

Figura 1. Mapa físico do vetor pBASE mostrando sítios de restrição 46

Figura 2. Digestão dos vetores resultantes da clonagem dos fragmentos no vetor

pGEM-T easy 47

Figura 3. Digestão dos vetores intermediários da construção do pFB 48

Figura 4. Seqüência de nucleotídeos do promotor CYC-GAL presente nos vetores

pMR4 e pMR11 49

Figura 5. Digestão do vetor pFB-LAC4 50

Figura 6. Etapas da construção do pFB-LAC12 52

Figura 7. Seqüência do DNA ribossomal de S. cerevisiae e fragmentos rDNA1 e

rDNA2 53

Figura 8. Cassetes de integração derivados dos vetores pFB's 54

Figura 9. Mapa físico dos vetores pFB-LAC4 e pFB-LAC12 mostrando sítios de

restrição 58

Anexos

Figura 1. Desenho esquemático da construção dos vetores pFB’s 73

Figura 2. Mapa físico do vetor pYX212-GapN 74

Figura 3. Mapa físico do vetor pGEM-T Easy (Promega) 74

Figura 4. Mapa físico do vetor pM4296 (HO-poly-HO) 75

Figura 5. Mapa físico do vetor pUC19 e destaque do sítio de clonagem 75

ii

Figura 6. Mapa físico do vetor pMR4 76

Figura 7. Mapa físico do vetor pMR11 76

Figura 8. Mapa físico do vetor pUG6 77

Figura 9. Amplificação dos fragmentos rDNA1, rDNA2, TPI, CYCGAL-LAC4 e

CYCGAL-LAC12 para construção dos vetores pFB's 78

Figura 10. Etapas da construção do vetor pBASE 78

Figura 11. Etapas da construção do vetor pBASE-rDNA1 79

Figura 12. Etapas da construção do vetor pBASE-TPI 79

Figura 13. Etapas da construção do vetor pFB 80

Figura 14. Etapas da construção do vetor pFB-LAC4 80

Figura 15. Etapas da construção do vetor pFB-LAC12 81

iii

LISTA DE TABELAS

Página

Manuscrito

Tabela 1. Seqüência dos primers utilizados na construção dos vetores pFB's 44

Anexos

Tabela 1. Número de acesso às seqüências depositadas nos bancos de dados NCBI e SGD utilizadas neste trabalho 65

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ADH Álcool desidrogenase

ARS Seqüência de replicação autônoma

CAN Canavanina

Cre Cre recombinase

DNA ácido desoxirribonucléico

Kb Kilobases

GRAS Reconhecido como seguro

HIS Histidina

LB Meio de cultura Luria-Bertani

LEU Leucina

Mb Megabase

MCS Sítio múltiplo de clonagem

OGM Organismo geneticamente modificado

ORF Quadro aberto de leitura

PGK Fosfoglicerato quinase

rDNA DNA ribossomal

TPI Triose fosfato isomerase

TRP Triptofano

URA Uracila

UAS Seqüência ativadora (transcrição)

URS Seqüência repressora (transcrição)

RESUMO

Sistemas de expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae têm sido descritos, porém

apresentam algumas desvantagens quando utilizados em linhagens industriais: (1) a marca de

seleção é baseada em supressão de auxotrofia ou resistência a compostos químicos; (2) a

marca de seleção nem sempre é excisável; (3) o alvo de integração geralmente não é multi-

cópia; (4) os vetores ainda possuem seqüência bacteriana. Neste trabalho, construímos um

novo sistema para modificação de linhagens industriais de S. cerevisiae que obedecem aos

requisitos para utilização de OGM’s na indústria: linhagem modificada sem marca de

resistência a antibióticos, não portadora de seqüências de origem bacteriana e seqüências

integradas derivadas de organismos GRAS (Generally recognized as safe). Este sistema pFB,

composto por dois vetores pFB-LAC4 e pFB-LAC12, combina o método de seleção por

complementação metabólica para lactose com a utilização do DNA ribossomal como alvo de

integração por recombinação homóloga resultando num sistema de modificação com seleção

“limpa” (ecologicamente correta), de integrações estáveis e re-utilizável numa mesma

linhagem. Este sistema permite a modificação genética de linhagens industriais de S.

cerevisiae para expressão heteróloga e/ou modificações de vias metabólicas permitindo o

melhoramento ou introdução de vias bioquímicas nestas linhagens.

Palavra-chave: Saccharomyces cerevisiae, linhagem industrial, transformação, vetores,

seleção “limpa”, DNA ribossomal.

LEITE, F. C. B. Construção de vetores para modificação genética de linhagens industriais de S. cerevisiae.

2

ABSTRACT

Heterologous expression systems in Saccharomyces cerevisiae have been described, but have

some disadvantages when used in industrial strains: (1) the selectable markers are based on

auxotrophic markers or chemical-resistance markers, (2) the selectable markers aren’t

excisable, (3) the target of integration generally isn’t multi-copy; (4) the vectors still have

bacterial sequence. In this work, we built a new system for modification of industrial strains

of S. cerevisiae that assemble the requirements for use of GMO in the industry: modified

strain without drug-resistance markers, without DNA sequences from bacterial origin and

integrated DNA sequences derived from organisms GRAS (Generally recognized as safe).

This system pFB, composed of two vectors, pFB-LAC4 and pFB-LAC12, combines the

selectable method of metabolic complementation for lactose with the use of ribosomal DNA

sequence as a target for integration by homologous recombination resulting in a heterologous

expression/modification system with a "clean" selectable marker ( ecologically correct), stable

integrations and re-usable systems in the same strains. It allows genetic modification of

industrial strains of S. cerevisiae for heterologous expression and / or changes in metabolic

pathways allowing the introduction or enhancement of biochemical pathways in these strains.

Keyword: Saccharomyces cerevisiae, industrial strain, transformation yeast, vector, "clean"

selectable mark, ribosomal DNA.


3

1. INTRODUÇÃO

A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido aplicada como microrganismo

catalisador em vários processos industriais, como as indústrias alimentícia e farmacêutica e

produção de álcool combustível. Estas linhagens industriais são organismos altamente

especializados e adaptados a estes ambientes possuindo certas características genéticas que

lhes conferem tal vantagem adaptativa.

Linhagens industriais de S. cerevisiae de diferentes processos industriais têm sido

isoladas segundo sua capacidade fermentativa e de dominância populacional e assim

constituem potenciais linhagens hospedeiras para expressão de genes heterólogos dentro do

contexto industrial, tais como aqueles relacionados com a produção de enzimas hidrolíticas,

de antibióticos, além de genes que possam modificar a fisiologia celular no intuito de

aumentar a produção de um composto ou de fazê-las produzir novos compostos.

Sistemas de expressão heteróloga em S. cerevisiae têm sido descritos. Porém,

apresentam algumas desvantagens quando utilizados em linhagens industriais: (1) a marca de

seleção é baseada em supressão de auxotrofia ou resistência a compostos químicos; (2) a

marca de seleção nem sempre é excisável; (3) o alvo de integração geralmente não é multi-

cópia; (4) os vetores ainda possuem seqüência bacteriana. A partir destes fatos, este trabalho

apresenta a construção de um novo sistema para modificação de linhagens industriais de S.

cerevisiae que obedecem aos requisitos para utilização de OGMs na indústria: linhagem

modificada sem marcas de resistência a antibióticos, não portadora de seqüências de origem

bacteriana e seqüências integradas derivadas de organismos GRAS (Generally recognized as

safe). Este sistema combina o método de seleção por complementação metabólica para lactose

com a utilização do DNA ribossomal como alvo de integração por recombinação homóloga

resultando em um sistema de modificação com seleção “limpa” (ecologicamente correta), de

integrações estáveis e re-utilizável numa mesma linhagem.


4

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Informações sobre a levedura Saccharomyces cerevisiae

A levedura S. cerevisiae é um fungo unicelular que se reproduz assexuadamente por

brotamento, é anaeróbico facultativo e apresenta fenótipo Crabtree positivo, ou seja, é capaz

de produzir etanol na presença de oxigênio em altas concentrações de glicose. Esta espécie

possui um genoma relativamente pequeno, um grande número de cromossomos com poucas

seqüências de DNA repetitivo e número pequeno de introns (Oliver, 1996; Querol et al.,

2003). As linhagens haplóides possuem aproximadamente 12 a 13 megabases de DNA

nuclear distribuídos em 16 cromossomos lineares de tamanhos variáveis entre 250 a 2000 Kb

(Pretorius, 2000). O seqüenciamento completo do genoma desta levedura definiu cerca de

6.608 quadros abertos de leitura (ORFs - Open Reading Frames), dos quais cerca de 5.795

seqüências são genes já verificados como codificadores de proteínas (SGD -

www.yeastgenome.org). Estudos indicam que o genoma de S. cerevisiae foi duplicado após o

processo de divergência a partir de um ancestral comum dos gêneros Saccharomyces e

Kluyveromyces. Alguns genes foram perdidos e outros sofreram uma reorganização estrutural,

resultado de episódios de translocação recíproca entre cromossomos. Isto parece ter resultado

na duplicação de genes que proporcionam o excelente desempenho fermentativo de linhagens

de S. cerevisiae em relação a outras espécies de leveduras (Wolfe and Shields, 1997).

A publicação do genoma completo de Saccharomyces cerevisiae e avanços na

compreensão de sua fisiologia tornaram este microrganismo eucarioto modelo para aplicações

da biologia molecular. Isto, associado ao crescente desenvolvimento da tecnologia do DNA

recombinante, tem viabilizado o melhoramento genético de linhagens possibilitando um

melhor aproveitamento deste microrganismo no campo da biotecnologia (Schüller and Casal,

2005).


5

2.2. A Levedura Saccharomyces cerevisiae na Biotecnologia

A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido utilizada em vários processos

industriais como microorganismo catalisador de processos fermentativos para a produção de

pão, vinho, cerveja, cachaça e álcool combustível e atualmente vem sendo utilizada na

indústria farmacêutica (Walker, 1998; Ostergaard et al, 2000). Esta levedura é um

microrganismo bastante atraente para estas aplicações biotecnológicas por não ser patogênica

e por sua longa história de aplicação na produção de produtos consumíveis como o pão, as

bebidas fermentadas (cervejas e vinhos) e destiladas (whisky, cachaça, rum, etc.) e até pelo

seu uso como probióticos, sendo assim classificada como organismo GRAS (generally

recognized as safe) (Walker, 1998; Ostergaard et al, 2000). Dentre os representantes da

família Saccharomycetaceae, o gênero Saccharomyces recebe maior destaque por sua

aplicação biotecnológica. O nome Saccharomyces significa “fungo do açúcar”. Muitos

membros desse gênero são bastante utilizados, como S. cerevisiae na produção de pão,

cerveja e vinho, S. bayanus e S. uvarum na produção de vinhos, S. pastorianus, S.

carlsbergensis e S. monacensis na produção de cervejas e S. boulardii que é utilizado como

probiótico e na suplementação alimentar. Estas leveduras são geralmente poliplóides, com

algumas linhagens industriais apresentando diferentes graus de aneuploidia. As leveduras de

cerveja são separadas em dois grupos: as linhagens “Ale” (S. cerevisiae) e as linhagens

“Lager” (S. pastorianus e S. carlsbergensis). Estas linhagens “Lager” são classificadas como

híbridos interespecíficos de S. cerevisiae e S. bayanus e são freqüentemente referidas como

leveduras de baixa fermentação (“bottom fermenting yeasts”). Em contraste, as leveduras

“Ale” são referidas como leveduras de alta fermentação (“top fermenting yeasts”) (Walker,

1998; Ostergaard et al, 2000).

Diversos trabalhos têm demonstrado a diversidade de linhagens de S. cerevisiae

envolvidas nestes processos industriais como produção de álcool combustível, cachaça


6

artesanal, produção de vinho, cerveja e de outras bebidas fermentadas como saquê e run

(Pataro et al, 2000; Guerra et al., 2001; Longo and Vezinhet, 1993; Schuller et al., 2004;

Wheals et al., 1999; Antunovics et al., 2005; Silva-Filho et al., 2005a; Silva-Filho et al.,

2005b). Diferentes linhagens industriais de S. cerevisiae têm sido isoladas segundo sua

capacidade fermentativa e de dominância populacional e assim constituem potenciais

hospedeiros para expressão de genes heterólogos de interesse industrial a partir dos próprios

processos industriais, tais como a fermentação alcoólica ou mesmo os cultivos aeróbios para a

produção de biomassa.

As linhagens industriais, quando comparadas às linhagens de laboratório, são

geneticamente mais complexas e não possuem estabilidade em seu estado haplóide, sendo as

aneuploidias comuns em leveduras industriais (Walker, 1998). Por outro lado, estas linhagens

têm evoluído para uma melhor adaptação a diferentes ambientes ou nichos ecológicos

modificados ou não pela atividade humana. Este processo é denominado “domesticação” e

pode ser responsável por certas características genéticas das linhagens industriais como, por

exemplo, número variado de ploidia (aneuploidias parciais, diploidia ou poliploidia) e

polimorfismo cromossômico (Dunham et al., 2002; Querol et al, 2003; Colson et al., 2004;

Lucena et al., 2007). A modificação da constituição genética das linhagens industriais para

uma melhor adaptação ao ambiente industrial ocorre através de eventos como recombinação

mitótica entre seqüências homólogas (Rachidi et al, 1999), crossing-over mitótico e

conversões gênicas (Puig and Perez-Ortin, 2000). Estas mudanças tendem a ser fixadas numa

linhagem como resultado de uma pressão seletiva para as características genéticas que melhor

satisfazem àquelas condições ambientais (Querol et al, 2003).

Na fermentação alcóolica, por exemplo, as aneuploidias parciais e poliploidias em

células de S. cerevisiae podem conferir vantagens adaptativas a diferentes condições de

estresse (baixo pH, escassez de açúcar, alto teor de álcool, etc) pela remoção de elementos


7

repressores ou pelo aumento da dosagem de alguns genes importantes das vias fermentativas

(Dunham et al, 2002). Os constantes rearranjos cromossômicos também constituem uma fonte

de modificações genéticas naturais que podem contribuir para a adaptação celular aos

processos fermentativos (Lucena et al, 2007).

Devido ao longo processo de “domesticação”, as linhagens industriais têm acumulado

uma alta complexidade genômica. Esta complexidade tem dificultado a aplicação de técnicas

moleculares rotineiras para modificação genética facilmente aplicáveis a linhagens

laboratoriais haplóides. Portanto, algumas adaptações nos procedimentos correntes de

modificação genética são necessárias quando se pretende manipular linhagens industriais.

2.3. Exemplos de aplicações utilizando a tecnologia do DNA recombinante

A disponibilidade de conhecimentos científicos acerca da fisiologia, da capacidade de

expressão heteróloga e a disponibilidade de vetores de clonagem tornaram S. cerevisiae um

organismo hospedeiro atrativo para a produção de proteínas heterólogas. Isto tem sido

aplicado na indústria biotecnológica para a produção de enzimas, vacinas e agentes

terapêuticos. Como exemplo, pode-se citar a vacina para hepatite B, interferon humano e a

produção de insulina. Este microrganismo pode ainda constituir uma fonte de proteínas e

vitamina B para suplemento nutricional de alimentos para consumo humano e ração animal

(Horri and Oettrer, 1998). Raskin and Clements (1991) demonstraram a produção de insulina

humana por leveduras e que o seu efeito clínico no tratamento de pacientes diabéticos foi

semelhante àquele que utilizou a insulina semi-sintética. A levedura foi capaz de produzir

insulina estruturalmente idêntica àquela produzida no pâncreas em humanos. O hormônio

paratireóideo humano também tem sido produzido por leveduras S. cerevisiae (Kang et al.,

1998). As vacinas contra hepatite B, Engerix-B e FENDrix, são produzidas por S. cerevisiae


8

geneticamente modificadas (Keating and Noble, 2003; Kundi, 2007). A vacina FENDrix

(GlaxoSmithKline Biologicals) por exemplo, contém como substância ativa o antígeno

recombinante de superfície do vírus da hepatite B produzido em leveduras S. cerevisiae. A

Glutationa, utilizada como composto farmacêutico, aditivo alimentício e na indústria de

cosméticos, tem sido produzida por S. cerevisiae recombinantes em escala industrial pela

expressão de genes de E. coli envolvidos nesta via de biossíntese (Li et al., 2004).

Além desses produtos citados, as modificações genéticas podem contribuir para

aumentar a produção de metabólitos da própria célula, como aminoácidos, vitaminas, ácidos

orgânicos e álcoois. Atualmente, estas modificações genéticas são programadas a partir de um

conjunto de dados bioquímicos e fisiológicos que mostram os cenários metabólicos e suas

variações a partir das modificações genéticas. Este conjunto tecnológico é denominado de

Engenharia Metabólica, a qual permite a introdução ou melhoramento de vias bioquímicas em

linhagens de leveduras com o uso da tecnologia do DNA recombinante, tornando esta

linhagem hábil a metabolizar determinado composto (Ostergaard et al, 2000). Linhagens de S.

cerevisiae capazes fermentar pentoses como D-xilose e D-arabinose foram construídas

resultando em linhagens com elevados rendimentos de conversão a etanol (Jeppsson et al,

2002; Roca, 2003; Van Maris et al., 2006; Wisselink et al., 2007). Outras linhagens

recombinantes de S. cerevisiae são capazes de metabolizar lactose (Kumar et al, 1992; Rubio-

Teixeira et al, 2000) e melibiose (Vincent et al, 1999; Ostergaard et al, 2000).

2.4. Modificação genética de linhagens industriais de S. cerevisiae

O melhoramento genético de linhagens industriais por genética clássica (mutagênese

ou fusão de protoplastos) foi sucedido nos últimos anos pelo uso da tecnologia do DNA

recombinante (Schüller and Casal, 2005) e tem possibilitado a construção de linhagens


9

industriais mais especializadas através da expressão de genes heterólogos e alterações na

dosagem gênica, seja por super-expressão ou deleção de genes.

Para aplicações industriais é necessário que os vetores de expressão, além de

demonstrar uma alta eficiência em transformação, sejam estáveis por muitas gerações sendo

capazes de se manter na célula sob cultivo não-seletivo (Takahashi et al, 2003). Porém, para

uso em linhagens industriais, os sistemas já descritos ainda apresentam algumas

desvantagens:

a) a marca de seleção é baseada, principalmente, em supressão de auxotrofia ou marca de

resistência a compostos químicos;

b) nem sempre a marca de seleção é excisável o que impossibilita a re-utilização do

sistema para múltiplas modificações numa mesma linhagem;

c) o alvo de integração nem sempre é multicópia, impossibilitando também a re-

utilização do sistema;

d) os vetores ainda não são totalmente isentos de seqüências bacterianas.

Nas linhagens industriais de levedura, as modificações introduzidas também não

devem alterar as características essenciais da célula hospedeira no processo de fermentação

(Schüller and Casal, 2005), como por exemplo, desempenho fermentativo e velocidade de

crescimento.

2.5. Engenharia genética de S. cerevisiae

Atualmente têm-se buscado o melhoramento genético de linhagens industriais de S.

cerevisiae visando, principalmente, o aumento no rendimento do produto e/ou melhoria na

produtividade. Isto é possível pelo desenvolvimento de uma série de ferramentas capazes de

promover a modificação de genes existentes no genoma do organismo-alvo bem como a


10

transferência de genes entre os organismos. Para a levedura S. cerevisiae, particularmente,

estas técnicas já são bastante utilizadas para a modificação de linhagens de laboratório. Já

existe um conjunto de plasmídeos de clonagem e expressão que permitem a produção de

enzimas e peptídeos bioativos em níveis industrialmente aceitáveis. As técnicas de

transformação genética já estão bem estabelecidas, com altas eficiências na introdução de

DNA exógeno nas células da levedura (Ausubel et al, 1998). Aliada a esta alta eficiência de

transformação, o uso de fragmentos de DNA com extremidades homólogas tem

proporcionado tanto a inserção de genes heterólogos como a deleção de genes homólogos no

genoma da levedura. Este processo se beneficia da alta freqüência de recombinação do

genoma de S. cerevisiae. Isto possibilitou, por exemplo, a construção de bancos de linhagens

mutantes para cada ORF identificada a partir do seqüenciamento do genoma de S. cerevisiae

com o objetivo de se estudar a função biológica de cada um dos genes ou supostos genes. A

EUROSCARF (European Saccharomyces cerevisiae Archive for Funcional Analysis)

disponibiliza várias destas coleções de mutantes. Este conjunto metodológico está muito bem

aprimorado para as linhagens de laboratório de S. cerevisiae, mas algumas adaptações devem

ser feitas nos métodos e ferramentas para permitir altas eficiências na modificação das

linhagens industriais. Os principais elementos da engenharia genética de S. cerevisiae são

descritos a seguir.

2.5.1. Vetores plasmidiais de clonagem e expressão

Para a expressão heteróloga em leveduras, algumas características para a escolha do

vetor a ser utilizado devem ser consideradas. Dentre estas estão a marca de seleção, o alvo de

integração cromossômica e o promotor para expressão do gene desejado.


11

i. Características gerais

Em experimentos de engenharia genética de leveduras, várias etapas durante a

construção do vetor recombinante são realizadas utilizando a bactéria E. coli como

microrganismo hospedeiro. Isto só é possível através do uso de vetores “shuttle” os quais são

capazes de se propagar e serem selecionados em ambos, leveduras e E. coli (Gellissen and

Hollenberg, 1997). Para isto, estes vetores para levedura devem possuir uma seqüência

bacteriana contendo uma origem de replicação e uma marca de seleção para E. coli. Estas

características permitem que estes vetores sejam manipulados in vitro e in vivo em células da

bactéria E. coli antes de sua utilização nas células de leveduras.

Diversos sistemas para modificação genética de leveduras têm sido descritos e são

bastante eficientes em manipulações genéticas de linhagens laboratoriais. Os vetores de

clonagem e expressão devem combinar o adequado número de cópias do gene para a

expressão desejável e a estabilidade mitótica sob condições não-seletivas (Gellissen and

Hollenber, 1997). Geralmente, os vetores não conseguem combinar estas duas características.

Há, basicamente, três classes de vetores para levedura: vetores epissomais (YEp),

replicativos (YRp) e integrativos (YIp).

(I) Os vetores epissomais são aqueles que possuem replicação autônoma não

dependendo da replicação cromossômica e assim podem apresentam um elevado número de

cópias por célula, porém sua manutenção celular é bastante instável dependendo da condição

seletiva do meio. A replicação da molécula de DNA desses vetores depende da presença da

origem de replicação do plasmídeo natural de levedura 2µm (2 µm ori) sinalizando uma

origem replicativa em levedura (Gellissen and Hollenberg, 1997). Estes vetores podem, ainda,

apresentar a seqüência STB que assegura a estabilidade mitótica e a correta segregação destas

moléculas extra-cromossômicas. A maioria destes vetores apresenta sistemas de seleção por


12

supressão auxotrófica e devido à homologia destes genes marcadores com o alelo mutante na

levedura, pode haver inserção do vetor inteiro no cromossomo da levedura por recombinação

homóloga;

(II) Os vetores replicativos também replicam-se independentemente da replicação

cromossômica devido à presença do componente ARS (Autonomously Replicating Sequence) e

contém ainda o elemento CEN que serve como centrômero assegurando estabilidade mitótica

porém com um baixo número de cópias por célula.

(III) Os vetores integrativos não são auto-replicáveis e integram-se no genoma da

levedura por recombinação homóloga, o que assegura alta estabilidade. Entretanto, estes

vetores estão presentes em um baixo número de cópias, geralmente em integrações

cromossômicas únicas.

ii. Replicação e manutenção de vetores em células de leveduras

Para possibilitar a replicação de vetores em leveduras, dois tipos de origens de

replicação são empregados nos vetores epissomais ou replicativos. O primeiro tipo consiste na

origem de replicação do plasmídeo 2 µm, que é de ocorrência natural em levedura (Souza-Jr

and Morais-Jr, 2000). O segundo consiste de origens de replicação isoladas de DNA

cromossomal denominadas ARS (Autonomously Replicating Sequence). A presença das

seqüências de origem de replicação do plasmídeo de 2 µm ou do tipo ARS asseguram uma

replicação em múltiplas cópias na levedura hospedeira . Quanto à estabilidade da manutenção

destes vetores, outras duas seqüências são utilizadas. A primeira é uma seqüência

centromérica, denominada CEN, que é capaz de conferir estabilidade mitótica aos vetores e

promove uma única replicação por ciclo celular, sendo assim mantidos em cópia única na

levedura. Esta seqüência centromérica permite que os vetores sejam segregados de modo


13

preciso durante a mitose e meiose, mecanismo este semelhante ao dos cromossomos

(Hadfield, 1994). Por outro lado, a seqüência STB além de conferir estabilidade mitótica aos

vetores ainda assegura a correta segregação de vetores multi-cópias nas células hospedeiras

(Xiao, 1991).

iii. Marcas de seleção e integração genômica

A seleção de células modificadas só é possível uma vez que uma marca de seleção

fenotípica esteja presente no vetor. Muitas marcas de seleção têm sido descritas para uso em

leveduras baseadas na complementação nutricional de mutantes auxotróficos (supressão de

auxotrofia) e na resistência a antibióticos (Pronk, 2002).

A utilização de supressão de auxotrofia como marca de seleção se deve ao fato de que

linhagens laboratoriais são haplóides possibilitando uma construção relativamente fácil de

linhagens auxotróficas por possuírem apenas uma cópia de cada gene.

Os genes marcadores utilizados são alelos tipo selvagem de genes de leveduras que

codificam enzimas essenciais nas vias metabólicas a eles relacionadas. O uso destes genes

como marca de seleção é restrito a linhagens hospedeiras que são auxotróficas para o

nutriente em questão devido à ausência de uma cópia cromossômica funcional do gene

marcador (Pronk, 2002). Quando o vetor portando a cópia funcional do gene é introduzido na

célula, a levedura torna-se capaz de se propagar em meio de cultura sem o nutriente

relacionado ao gene marcador. As marcas auxotróficas mais utilizadas são LEU2, TRPI,

URA3 e HIS3 e HIS4 aplicadas a linhagens auxotróficas que não são capazes de sintetizar

leucina, triptofano, uracil e histidina, respectivamente (Çakar et al, 1999; Mallissard et al,

1999; Ugolini et al, 2002).


14

A poliploidia das linhagens industriais impossibilita ou inviabiliza a utilização destes

tipos de seleção para células transformadas devido ao seu fenótipo prototrófico e a dificuldade

de construir linhagens industriais auxotróficas visto que não há apenas uma cópia do alelo a

ser inativado para um determinado gene (Hashimoto et al, 2005).

Quanto à utilização de marcas de resistência a compostos químicos, os genes

marcadores mais utilizados são CYH2, ble, Kan, natNT2 e hphNT1 que conferem resistência

às drogas cicloheximida, fleomicina, geneticina, estreptomicina e higromicina B,

respectivamente (Schuller and Casal, 2005; Taxis and Knop, 2006). Para a seleção de células

modificadas com vetores portando uma destas marcas, o antibiótico a ela relacionado é

adicionado ao meio de cultivo. As células modificadas utilizando marcas de resistência a

antibióticos são, entretanto, indesejáveis no meio industrial por haver uma preocupação em

torno do evento de transferência gênica entre microrganismos do ambiente industrial, pelo

efeito da presença do antibiótico sobre as funções celulares e devido ao alto custo para

aplicação de antibióticos no processo industrial (Adam et al, 1999a; Pronk, 2002).

Outra questão associada a marcas de seleção, seja ela supressora de auxotrofia ou

resistência a compostos químicos, é a inviabilidade de sua re-utilização numa mesma

linhagem em sucessivos eventos de transformação, tendo em vista, muitas vezes, a

impossibilidade de sua remoção. Pesquisas têm sido desenvolvidas com a intenção de reduzir

a quantidade de DNA exógeno em modificações de linhagens industriais (Walker et al, 2005).

A excisão da marca de seleção é possível em construções que possuem seqüências

idênticas repetidas flanqueando o gene marcador. Sauer (1994) descreveu o sistema de

recombinação Cre-LoxP do bacteriófago P1 que tem se mostrado bastante eficiente na

recombinação entre as seqüências LoxP flanqueando genes marcadores em leveduras,

resultando na excisão desta marca de seleção. Esta seqüência loxP é formada por 34 pares de

bases, sendo uma seqüência de 13 pb repetidas invertidas e separadas por uma região


15

espaçadora assimétrica de 8 pb. A recombinação sítio-específica entre estas seqüências LoxP

é mediada pela enzima Cre-recombinase do bacteriófago P1 (Figura 1).

No sistema de deleção gênica descrito por Gueldener et al. (1996), a marca Kan está

ladeada pela seqüência loxP resultando no cassete de deleção loxP-Kan-loxP. A reação de

PCR com primers contendo seqüências homólogas ao gene alvo de deleção nas extremidades

5´ amplifica este cassete com integração direcionada ao gene a ser deletado. O sistema de

recombinação Cre-LoxP excisa a marca de seleção e esta pode ser re-utilizada na mesma

linhagem (Figura 1).

Um outro sistema de excisão de marca de seleção URA3 foi descrito por Alani et al.

(1987). Voth et al. (2001) utilizou este sistema para a construção do vetor integrativo para

expressão heteróloga no lócus HO com marca URA3 excisável. A partir da clonagem do gene

a ser expresso no vetor pM4366, o cassete HO-hisG-URA3-gene-HO resultante é utilizado

para transformar células de leveduras. O cassete hisG-URA3-hisG confere às células

transformadas fenótipo prototrófico, mas a recombinação entre as seqüências hisG repetidas

resulta na perda da marca de seleção URA3 tornando as células novamente auxotróficas para

a uracila.


16

Figura 1 - Remoção da marca de seleção Kan baseada no sistema Cre-LoxP mediada pela enzima Cre-recombinase

presente no vetor pSH47 (Guldener et al, 1996).

A integração de vetores dirigidos a sítios homólogos no genoma de leveduras ocorre

através de recombinação mitótica, um processo que envolve várias enzimas. Estes eventos de

recombinação estão fortemente relacionados aos mecanismos de reparo de quebras DNA fita-

dupla (Klinner and Schaäfer, 2004).

O processo de integração sítio-específica possibilitou trabalhos de modificações

genéticas de leveduras por introdução de genes heterólogos no genoma celular. Este método

tornou-se mais atraente devido a sua estabilidade genômica e descarte da necessidade de


17

manutenção da linhagem modificada em meio seletivo. Voth et al (2001) descreve um

exemplo deste tipo de integração no lócus HO do genoma de S. cerevisiae.

Para suprir a necessidade de alto número de cópias integradas e múltiplas integrações

no genoma da levedura, faz-se necessário que o alvo de integração apresente múltiplas cópias

no genoma do microrganismo. A seqüência de DNA ribossomal tem sido utilizada para este

fim.

O DNA ribossomal de S. cerevisiae é codificado pelo lócus RDN1 que consiste de

uma região de aproximadamente 1-2 Mb. Esta região, localizada no braço direito do

cromossomo XII, apresenta entre 100 e 200 cópias repetidas de uma seqüência de 9,1 Kb que

contém os genes codificadores dos rRNAs 5S, 5.8S, 25S e 18S (RDN5, RDN58, RDN25 e

RDN18, respectivamente) e três tipos de regiões espaçadoras: espaçador transcrito interno

(ITS1e ITS2), espaçador transcrito externo (5’ETS e 3’ETS) e espaçador não-transcrito (NTS1

e NTS2) como pode-se observar na figura 2 (Venema and Tollervey, 1999).

Figura 2 - Estrutura do rDNA em S. cerevisiae (Venema and Tollervey, 1999).

Trabalhos anteriores relataram o uso de determinada seqüência no lócus RDNA1 como

região alvo de integração (Fujii et al, 1990; Lopes et al, 1991; Adam et al, 1999b; Rubio-

Teixeira et al, 1998).


18

Lopes et al (1989) construiu o vetor pMRY2 contendo uma região do DNA

ribossomal de S. cerevisiae e o gene marcador LEU2d. A utilização deste vetor para

expressão de genes em levedura demonstrou um alto número de cópias integradas e níveis de

expressão comparáveis àqueles atingidos com vetores epissomais. A região do rDNA

utilizada nas construções dos vetores descritos por Lopes et al (1989), Adam et al (1999b) e

Rubio-Teixeira et al (1998) compreende as seqüências entre os genes RDN25 e NTS2. Para o

vetor construído por Fujii et al (1990), a seqüência compreende os genes RDN58 e RDN25.

iv. Promotores e sítios de clonagem

A escolha de promotores adequados é uma etapa importante no desenho de vetores de

expressão. A seqüência heteróloga deve ser fusionada a um elemento promotor que controla a

expressão constitutiva ou induzida por algum componente específico presente no meio de

cultura (Gellissen and Hollenber, 1997). Em muitos casos, promotores de genes que

codificam para enzimas da via glicolítica (ADH1, TPI1 e PGK2) são muito utilizados pelo

alto nível de expressão desses genes (Schüller and Casal, 2005).

Os promotores dos genes GAL1, GAL7e GAL10 são exemplos de promotores

induzidos por galactose utilizados em S. cerevisiae (Li, 2007; St John et al, 1981). O

promotor PHO5 é induzido na presença de fosfato inorgânico sendo utilizado para controle da

expressão gênica (Vogel and Hinner, 1990). Promotores reprimíveis em presença de glicose

têm sido utilizados, mas apresentam uma desvantagem para aplicação industrial: a dificuldade

de manter o meio em condições limitantes de glicose uma vez que ela é fundamental para a

obtenção de alta densidade celular (Malissard et al, 1999). Entretanto, os promotores ADH2

(Price et al, 1990) e CYC1 (Guarante et al, 1982) têm sido utilizados quando a repressão por

glicose é desejada. A expressão de genes clonados sob o controle do promotor CUP1 é


19

induzida por diferentes concentrações de íons de cobre dependendo da resistência ao cobre da

linhagem hospedeira (Etcheverry, 1990).

A regulação da expressão gênica é mediada pela interação proteína-DNA. Proteínas

reguladoras positivas e negativas ligam-se a regiões especificas no DNA estimulando ou

inibindo a transcrição do gene sob o controle do promotor em questão. Em leveduras S.

cerevisiae, por exemplo, o fator de transcrição GAL4p regula a expressão dos genes

envolvidos no metabolismo da galactose. Os promotores GAL1 e GAL10 estão orientados em

sentido opostos e separados por 680 pb que contém uma seqüência de nucleotídeos

denominada UASG (GAL upstream activating sequence) necessária para a ligação das

proteínas reguladoras. As proteínas GAL4 e GAL80, expressas constitutivamente,

desempenham funções antagônicas na regulação destes genes GAL. Em presença de

galactose, a GAL4p liga-se a seqüência UASG ativando a transcrição dos genes GAL1 e

GAL10 enquanto na ausência de galactose, a GAL80p liga-se a GAL4p bloqueando sua ação

e impedindo a transcrição dos genes GAL (Johnston and Davis, 1984; West Jr. et al., 1984).

Para possibilitar a clonagem de genes sob o controle do promotor presente num vetor

de expressão, um conjunto de sítios de restrição (MCS – multiple cloning site) é posicionado

na porção 3’ do promotor. A disponibilidade de sítios de restrição e sua utilização para

clonagem dependem da ausência destes sítios na seqüência a ser clonada.

v. Sistemas comerciais de clonagem e expressão

Alguns sistemas de expressão para leveduras S. cerevisiae são comercializados por

empresas de biologia molecular, como a Invitrogen e a Stratagene, e outros já são bastante

difundidos entre a comunidade científica.


20

O vetor pYD1 (Invitrogen) é um vetor epissomal projetado para expressão e secreção

de proteínas na superfície extracelular de S. cerevisiae. Este vetor contém o gene TRP1

como marca de seleção, a seqüência CEN6/ARS4 para manutenção estável e replicação do

vetor, possui o promotor GAL1 para expressão gênica e, ainda, uma cauda poli-histidina

para purificação da proteína expressa (Figura 3A).

A Invitrogen também comercializa a coleção de vetores YES. Esta coleção

disponibiliza dois vetores, pYES e pYC, que diferem entre si pela seqüência da origem de

replicação que possuem. O vetor pYES possui a seqüência 2µm possibilitando a manutenção

de um alto número de molécula(10 a 40 cópias) por célula (Figura 3B). O vetor pYC contém a

seqüência CEN/ARSH4 assegurando a manutenção do número de cópias do vetor

recombinante. Dentre as características desta coleção estão: expressão controlada pelo

promotor indutível GAL1, gene URA3 ou TRP1 como marca de seleção de recombinantes e

cauda poli-histidina para identificação e purificação de proteínas recombinantes.

A Stratagene dispõe de uma coleção de vetores epissomais denominados pESC. Estes

vetores contêm a origem de replicação 2µm e os promotores GAL1 e GAL10 dispostos em

orientações opostas permitindo a clonagem e expressão de dois genes simultâneos numa

célula hospedeira. Os vetores pESC diferem apenas quanto as marcas de seleção para

leveduras podendo conter os genes marcadores HIS, TRP1, LEU2 ou URA3 (Figura 4).


21

Figura 3 - Vetores comercializados pela Invitrogen. (A) Vetor pYD1. (B) Vetor pYES2.

Figura 4 - Vetores pESC comercializados pela Estratagene.

2.5.2. Elementos genéticos de integração

Diferentes métodos têm sido utilizados para integrar genes heterólogos no

cromossomo de leveduras. Os vetores integrativos possuem seqüências homólogas ao

cromossomo da levedura com deleções nas extremidades 5’e 3’. Estas seqüências permitem a


22

integração do vetor, por recombinação homóloga, neste sítio. Estes tipos de vetores são

linearizados por digestão com enzimas de restrição com sítio único interno à seqüência

homóloga que direciona o alvo da integração. Esta integração resulta em duas cópias não

idênticas da região alvo de integração flanqueando o gene heterólogo inserido (Figura 5A)

(Mallisard et al, 1999). O método pop-in/pop-out está representado na figura 5B. Neste

método, o evento de recombinação pode ser revertido, através do mecanismo pop-out que

consiste num segundo evento de recombinação entre as seqüências duplicadas no

cromossomo resultando na excisão do vetor que havia sido integrado, restando apenas uma

cópia do gene no cromossomo que pode ser a cópia original ou a cópia mutante (Pâques and

Harber, 1999). Este mecanismo “pop-out”, muitas vezes, apresenta-se como uma

desvantagem de sistemas de integração que resultam em cópias duplicadas do alvo de

integração, pois a recombinação entre estas seqüências excisa o fragmento de DNA integrado

contendo o gene heterólogo (Rosthstein, 1991). Por fim, é possível, ainda, introduzir

seqüências de DNA numa levedura por transformação com um fragmento linear que contenha

uma marca de seleção pelo método de recombinação “ends-out” (Figura 5C). Este método é

frequentemente utilizado para interrupções ou deleções gênicas ou ainda para integrações de

cassetes de integração contendo um gene heterólogo a ser expresso. Este método consiste em

construir fragmentos lineares de DNA contendo seqüências homólogas ao alvo de integração

nas extremidades 5’e 3’. Os cassetes de integração podem ser construídos por PCR ou por

engenharia genética (Wach et al., 1994; Gueiros, 2006; Gueldener et al, 2002; Basílio, 2007).


23

Figura 5 - Métodos de integração cromossômica por recombinação homóloga. (A) Método clássico de integração. (B)

método “pop-in/pop-out” de integração. (C) Método “ends-out” para integração cromossômica.

2.6. OGMs, biossegurança e patentes

A Lei nº 11.105, de 24 de Março de 2005, estabeleceu as normas de segurança e

mecanismos de fiscalização de atividades que envolvam organismos geneticamente

modificados – OGM (organismo geneticamente modificado) e seus derivados, criou o

Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS, e reestruturou a Comissão Técnica Nacional

de Biossegurança – CTNBio.

A CTNBio, integrante do Ministério da Ciência e Tecnologia, presta apoio técnico e

assessoria ao Governo Federal na formulação, atualização e implementação da Política

Nacional de Biossegurança para OGM e seus derivados, atuando ainda no estabelecimento de

normas técnicas de segurança e de pareceres técnicos referentes à autorização para atividades


24

que envolvam pesquisa e uso comercial de OGM e seus derivados, com base na avaliação de

seu risco zoofitossanitário, à saúde humana e ao meio ambiente.

A utilização de leveduras geneticamente modificadas na indústria requer concordância

com a legislação vigente, avaliação de segurança e impacto ambiental. As linhagens

modificadas construídas com material derivado da própria linhagem (Self-clonig) ou de

organismo GRAS (Generally recognized as safe), são mais facilmente aceitas e liberadas para

aplicação na indústria (Querol et al, 2003).

A presença de seqüências bacterianas na linhagem de levedura modificada não é

conveniente na tentativa de obtenção de autorização da CTNBio para a utilização desta

linhagem em ambiente industrial, por temer-se a eventual transferência horizontal deste gene

para bactérias ou outro microrganismo presente naquele ambiente. Adam et al (1999a)

verificou que a transmissão horizontal espontânea de genes cromossômicos de linhagens de

leveduras geneticamente modificadas para bactérias deve provavelmente ser muito rara, visto

que, mesmo quando testada in vitro em condições ideais de transformação bacteriana com

lisado de células de leveduras (células bacterianas hospedeiras altamente competentes e

procedimento de transformação altamente eficiente), esta transferência ocorre numa

freqüência baixa, cerca de 50 transformantes por µg de DNA.

2.6.1. A tecnologia “limpa” e o sistema de modificação genética proposto

Assim, o sistema desejável para transformação de linhagens industriais de leveduras

requer, principalmente, ausência de genes de resistência a antibióticos, independência do grau

de ploidia das linhagens industriais e possibilidade de re-utilização do sistema de

transformação numa mesma linhagem em eventos sucessivos.


25

Este trabalho propôs um sistema para modificação genética de linhagens industriais de

S. cerevisiae composto por dois vetores. Para sua construção, foi necessário considerar certas

características como alvo de integração, marca de seleção e promotor para expressão do gene

clonado.

A levedura S. cerevisiae não é capaz de fermentar lactose por não possuir os genes que

codificam para as enzimas lactose permease e β-galactosidase. Linhagens de Kluyveromyces

lactis metabolizam naturalmente a lactose por possuir os genes LAC4 e LAC12 que

codificam, respectivamente, a lactose permease e a β-galactosidase. A ausência destes genes

em S. cerevisiae possibilita o uso dos mesmos como marca de seleção para modificação de

linhagens. Então, as células modificadas adquirem a capacidade de metabolizar lactose e

podem ser facilmente isoladas em meio seletivo contendo lactose como única fonte de

carbono.

Linhagens de S. cerevisiae capazes de metabolizar lactose têm sido construídas por

diversas abordagens geralmente com o objetivo de produzir biomassa a partir do soro de

queijo, rico em lactose (Sreekrishna and Dicksin, 1985; Kumar et al, 1992; Porro et al, 1992;

Rubio-Teixeira et al, 1998). Para estas construções, foram adotadas estratégias de expressão

heteróloga utilizando plasmídeos multi-cópias ou ainda cassetes integrativos, ambos contendo

marcas auxotróficas para a seleção das linhagens modificadas.

Os vetores integrativos são preferencialmente utilizados para modificações de

linhagens industriais de leveduras por sua maior estabilidade genômica por se tratar de uma

integração cromossômica não necessitando de um cultivo em meio seletivo para garantir sua

manutenção na linhagem hospedeira.

O lócus escolhido para integração não deve ser essencial à viabilidade celular nem

comprometer o desempenho pelo qual a linhagem hospedeira foi selecionada, por exemplo, o

desempenho fermentativo de linhagens industriais isoladas de destilarias.


26

Portanto, o ideal é que a linhagem possua múltiplas cópias do lócus alvo.

Para a construção aqui descrita, utilizou-se o DNA ribossomal como seqüência alvo de

integração tendo por base a seqüência utilizada nos vetores pMIRY2 (Lopes et al, 1989) e

PMR’s (Rubio-Teixeira et al, 1998).

2.6.2. A possibilidade de pedido de patente

Alguns vetores e sistemas de transformação estão patenteados e depositados em

bancos de dados. Um busca por vetores para leveduras S. cerevisiae nos bancos do INPI

(Brasil) e European Patent Office mostrou que os vetores utilizam marcas auxotróficas ou que

conferem resistência à compostos químicos como métodos de seleção para as células

modificadas (Howard, 2001; Bauer, 2003; Song, 2005).

Duas outras patentes abordam um tipo de seleção diferente. A primeira utiliza genes

da via metabólica para o arabitol como marcador de seleção conferindo às células modificadas

a vantagem seletiva de metabolizar o arabitol sobre a célula não-modificada. Este mesmo

exemplo aplica-se para genes das vias metabólicas do ribitol e manitol (Parrot, 2001). O

segundo método de seleção utiliza o gene CAN1 como marcador integrando o cassete neste

lócus inativando este gene na levedura modificada. Linhagens de levedura com o alelo

funcional CAN1 são sensíveis ao aminoácido análogo da arginina, a L-canavanina. Desta

forma, a seleção das linhagens modificadas com este sistema é possível pelo cultivo em meio

contendo L-canavanina devido a resistência promovida para interrupção deste gene (Camargo,

2000).

O sistema pFB propõe um método de seleção baseado no metabolismo da lactose e,

apesar da já haver algumas construções de linhagens S. cerevisiae portando os genes LAC4 e

LAC12, a sua utilização como genes marcadores de seleção ainda não foi abordada. Assim,


27

julgamos possível o pedido de patente do sistema pFB resultante deste trabalho, para

utilização em linhagens industriais de S. cerevisiae, devido a sua construção isenta de

seqüências bacterianas e obedecendo as orientações da CTNBio para liberação no meio

ambiente de organismos geneticamente modificados.


28

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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37

4. MANUSCRITO DO ARTIGO CIENTÍFICO

Construção de vetores para modificação genética de linhagens industriais de


Manuscrito a ser enviado para a revista: Plasmid (Elsevier, Netherland. ISSN: 0147-619X

Fator de impacto: 1.956).


38

Construção de vetores para modificação genética de linhagens industriais de


Fernanda Cristina Bezerra Leitea, Rute Salgues Gueirosa, Guilherme Felipe Carvalho Leala,

Diogo A. Simõesb, Marcos A. de Morais Jra*

a Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco

b Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Pernambuco

* Autor para correspondência Endereço: Av. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária. Recife – PE CEP: 50670-901 FAX/FONE: 55 81 21268522 E-mail: [email protected]


39

Resumo

Sistemas de expressão heteróloga em S. cerevisiae têm sido descritos, porém apresentam

algumas desvantagens quando utilizados em linhagens industriais: (1) a marca de seleção é

baseada em supressão de auxotrofia ou resistência a compostos químicos; (2) a marca de

seleção nem sempre é excisável; (3) o alvo de integração geralmente não é multi-cópia; (4) os

vetores ainda possuem seqüência bacteriana. Neste trabalho, construímos um novo sistema

para modificação de linhagens industriais de S. cerevisiae que obedecem aos requisitos para

utilização de OGM’s na indústria: linhagem modificada sem marca de resistência a

antibióticos, não portadora de seqüências de origem bacteriana e seqüências integradas

derivadas de organismos GRAS (Generally recognized as safe). Este sistema pFB, composto

por dois vetores pFB-LAC4 e pFB-LAC12, combina o método de seleção por

complementação metabólica para lactose com a utilização do DNA ribossomal como alvo de

integração por recombinação homóloga resultando num sistema de modificação com seleção

“limpa” (ecologicamente correta), de integrações estáveis e re-utilizável numa mesma

linhagem. Este sistema permite a modificação genética de linhagens industriais de S.

cerevisiae para expressão heteróloga e/ou modificações de vias metabólicas permitindo o

melhoramento ou introdução de vias bioquímicas nestas linhagens.

Palavra-chave: Saccharomyces cerevisiae, linhagem industrial, transformação, vetores,

seleção “limpa”, DNA ribossomal.


40

1. Introdução

A levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido utilizada em vários processos

industriais como microrganismo catalisador de processos fermentativos para a produção de

pão, vinho, cerveja, cachaça e álcool combustível (Ostergaard et al, 2000). Diversos trabalhos

demonstrando a diversidade de linhagens de S. cerevisiae envolvidas nestes processos têm

possibilitado a seleção de linhagens industriais de S. cerevisiae segundo sua capacidade

fermentativa e de dominância populacional constituindo, assim, potenciais hospedeiros para

expressão de genes heterólogos de interesse industrial (Silva Filho et al., 2005a; Pataro et al.,

2000; Guerra et al., 2001; Longo e Vezinhet, 1993; Schuller et al., 2004; Antunovics et al.,

2005). Quando comparadas às linhagens de laboratório, estas linhagens industriais são

geneticamente mais complexas e não possuem estabilidade em seu estado haplóide, sendo

comuns as aneuploidias e poliploidias (Querol et al, 2003).

Diversos sistemas para modificações genéticas de leveduras têm sido descritos e são

bastante eficientes para manipulação genética de linhagens laboratoriais, porém nem sempre é

possível sua aplicação a linhagens industriais. Isto se deve ao fato de que muitas marcas de

seleção utilizadas em leveduras são baseadas na complementação nutricional de mutantes

auxotróficos (supressão de auxotrofia) ou na resistência a antibióticos (Pronk, 2002). As

marcas auxotróficas nem sempre são de fácil aplicação às linhagens industriais devido ao

variado grau de ploidia destas células, pois podem conter mais de uma cópia para determinado

gene, e as marcas de resistência a compostos químicos são indesejáveis para aplicação

industrial por questões ambientais. As marcas auxotróficas mais utilizadas são LEU2, TRPI,

URA3, HIS3 e HIS4 aplicadas a linhagens auxotróficas que não são capazes de sintetizar

leucina, triptofano, uracil e histidina, respectivamente (Çakar et al, 1999; Mallissard et al,

1999; Ugolini et al, 2002). Os genes marcadores que conferem resistência às drogas são

CYH2, ble, Kan, natNT2 e hphNT1 referentes aos compostos cicloheximida, fleomicina,


41

geneticina, estreptomicina e higromicina B, respectivamente (Shuller and Casal, 2005; Táxis

and Knop, 2006).

Neste trabalho, construímos um sistema para modificações de linhagens industriais de

S. cerevisiae isento do uso de marcas auxotróficas ou de resistências a compostos químicos. O

sistema pFB aqui descrito é composto por dois vetores, pFB-LAC4 e pFB-LAC12, e utiliza a

complementação metabólica para lactose como método de seleção para as células

modificadas. A re-utilização desta marca de seleção numa mesma linhagem é possível pela

associação deste método de seleção ao sistema Cre-LoxP de recombinação para excisar o

gene marcador descrito por Sauer (1994) e utilizado por Guldener et al (1996). Combinada a

estas características, este sistema ainda possibilita múltiplas integrações por utilizar uma

seqüência do DNA ribossomal como alvo de integração contrapondo a maioria dos vetores

descritos que tem o número de integrações limitado ao número de cópias do alelo alvo, por

exemplo, os vetor pM4297 descrito por Voth et al (2001) que tem a integração direcionada ao

lócus HO e o vetores descritos por Mirisola et al (2007) com integração no lócus TYR1.

2. Materiais e Métodos

2.1.Linhagens e meio de cultura

A linhagem TOP10 de Escherichia coli foi utilizada nos procedimentos de

manipulação genética para a construção dos vetores, manutenção e amplificação dos

plasmídeos. Esta linhagem foi cultivada em meio LB (1% triptona, 0,5% extrato de levedura,

0,5% NaCl e 0,1% NaOH 1N) acrescido de ampicilina 100µg/ml. Para meios sólidos foi

utilizado 2% de ágar.


42

2.2. Manipulação genética

Para as amplificações, foram utilizadas a Taq Polimerase (Invitrogen) e Tli polimerase

(Promega). As enzimas de restrição foram obtidas dos fabricantes New England Biolabs e

Invitrogen. A T4 DNA ligase utilizada foi fabricada pela Promega e Invitrogen. A fosfatase

alcalina (CIAP) foi obtida da Promega e a T4 DNA polimerase foi obtida da Invitrogen. Os

primers e adaptadores foram fabricados por IDT Technologies. Os fragmentos de PCR foram

purificados com o kit Wizard® PCR Preps DNA Purification System (Promega) e para as

purificações a partir do gel de agarose foi utilizado o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean up

system (Promega). Para as extrações de plasmídeos utilizou-se o kit Wizard® Plus SV

Minipreps DNA Purification Systems (Promega).

2.3. Construção dos vetores pFB’s

A construção dos vetores pFB’s foi executada em cinco etapas principais: Construção

do vetor pBASE que contém as seqüências ORI e AmpR de origem bacteriana; Amplificação

e clonagem dos fragmentos rDNA1, rDNA2, TPI-MCS, CYCGal-LAC4 e CYCGal-LAC12

no vetor de passagem pGEM-T Easy (Promega); Construção do vetor pFB que contém as

seqüências rDNA1, TPI-MCS e rDNA2 clonadas no pBASE ordenadamente; Construção do

vetor pFBLAC4; Construção do vetor pFBLAC12.

2.3.1.Construção do vetor pBASE

O desenho dos primers e a escolha das enzimas de clonagem foram feitos baseados

nas seqüências dos genes depositadas no banco de dados NCBI e pela disponibilidade de

sítios de clonagem presentes nos plasmídeos pUC19 e pM4296 (pHO-poly-HO ) (Voth et al,


43

2001) e ausentes nas seqüências alvos de amplificação analisadas no programa disponível on-

line NEB Cutter (New England Biolabs). O fragmento contendo sítios de clonagem do

plasmídeo pUC19 foi amplificado por PCR com Tli polimerase (Promega) com os primers

MCSpUC19FOR (5´-TTGATATCCACCATATGCGGTGTGAAATAC) e MCSpUC19REV

(5´-AAGATATCAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTC) que anelam nos sítios NdeI e

PvuII presentes no pUC19, gerando fragmento com extremidades cegas. O vetor pM4296 foi

digerido com PvuII e o fragmento de 2,762 pb foi purificado de gel de agarose. Após ser

purificado, o fragmento MCS-pUC19 foi clonado no fragmento purificado do pM4296

resultando no vetor pBASE.

Os primers para amplificação de todos os fragmentos foram desenhados a partir das

seqüências depositadas no Banco de dados NCBI, exceto para o promotor CYC-GAL que

controla a expressão dos genes LAC4 e LAC12. Para a amplificação dos fragmentos CYC-

GAL-LAC4 e CYC-GAL-LAC12, o primer CYCGalfor foi construído após seqüenciamento

deste promotor. Os fragmentos foram amplificados por PCR em reações com Taq Polimerase

(Invitrogen) usando como moldes o DNA genômico de S. cerevisiae para as seqüências

rDNA1 e rDNA2, dos vetores pMR4 e pMR11 (Rubio-Teixeira et al, 1998) para os

fragmentos CYC-GAL-LAC12 e CYC-GAL-LAC4, respectivamente, e do vetor pYX212-

GapN (gentilmente cedido por Jochen Foster, Fluxome Sciences, Dinamarca) para o promotor

do gene TPI. Os primers estão listados na tabela 1. Nas seqüências dos primers foram

inseridos sítios de clivagem para enzimas de restrição convenientes aos passos posteriores da

montagem dos vetores pFB’s (Tabela 1). Para amplificar o fragmento rDNA1, foram

utilizados os primers rDNA1for e rDNA1rev; para o fragmento rDNA2 foram utilizados os

primers rDNA2for e rDNA2rev; para a amplificação do promotor TPI, utilizou-se os primers

TPIfor e TPIrev, este último contendo os sítios que formarão o MCS (multiple cloning site)

nos vetores pFB’s. Todos os fragmentos amplificados foram clonados no vetor pGEM-T Easy


44

(Promega) e resultaram nos seguintes plasmídeos: pGEM-rDNA1, pGEM-rDNA2, pGEM-

TPI, pGEM-LAC4 e pGEM-LAC12. As técnicas de biologia molecular adotadas estão

descritas em Sambrook et al (1989) ou foram realizadas segundo orientações dos fabricantes.

Tabela 1 - Seqüência dos primers utilizados na construção dos vetores pFB's

Primer Seqüência 5’- 3’ (* ) Sítios de restrição

rDNA1for TTGAATTCATCGAATGGTAGGTTAGTT EcoRI

rDNA1rev TTCATATGAAAGTGACAGGTGCCCCGGGTA NdeI, SmaI

rDNA2for TTCAGCTGTACCCGGGGCACCTGTCACTTT PvuII, SmaI

rDNA2rev TTGGTACCGTTAACTCAGGTCTCTCTGCTGCCGGA KpnI, HpaI

TPIfor TTGTTTAAACTTGGGGATCTACGTATGGTCA PmeI

TPIrev TTGTCGACGCGGCCGCGGATCCGCTAGCCTCGAGCTGTATGTGTTTTT

TGTAGT

SalI, NotI, BamHI,

NheI, XhoI

CYCgalfor TTGATATCTTCGATCAAAAATCATCGCTTC EcoRV

LAC12-Rev TTGATATCATGGCTTTAAACAGATTCTGC EcoRV

LAC4-Ver GATCTCGCTTTTGAATAA (Rubio-Teixeira et al, 1998) -

(*) sublinhado: região de anelamento

2.3.2. Construção do pFB

Por vetor pFB entende-se o vetor contendo os fragmentos rDNA1, o promotor TPI

seguido do MCS (multiple cloning site) e rDNA2 clonados nesta ordem.

Para a clonagem do fragmento rDNA1, os vetores pBASE e pGEM-rDNA1 foram

digeridos com as enzimas NdeI e EcoRI. O fragmento rDNA1 NdeI/EcoRI purificado foi

clonado no vetor pBASE resultando no vetor pBASE-rDNA1. Em seguida, os vetores pGEM-

TPI e pBASE-rDNA1 foram digeridos com EcoRI, o fragmento TPI EcoRI foi purificado do

gel de agarose e o vetor pBASE-RDNA1 linearizado foi desfosforilado com enzima fosfatase

alcalina CIAP (Promega). A ligação destes fragmentos resultou no vetor pBASE-TPI e a

correta orientação da clonagem foi verificada por digestão com com as enzimas NdeI e PmeI.


45

Os vetores pGEM-rDNA2 e pBASE-TPI foram então digeridos com KpnI e PvuII. O

fragmento rDNA2 KpnI/PvuII purificado foi clonado no vetor pBASE-TPI KpnI/PvuII

resultando no vetor pBASE-rDNA2, agora denominado pFB.

2.3.3. Construção dos vetores pFB-LAC4 e pFB-LAC12

Os vetores pGEM-LAC4 e pFB foram digeridos com NotI, o fragmento CYCGal-

LAC4 NotI foi purificado e o vetor pFB linearizado com NotI foi desfosforilado com enzima

fosfatase alcalina CIAP (Promega). O fragmento CYCGal-LAC4 foi clonado no vetor pFB

resultando no vetor pFB-LAC4.

O vetor pGEM-LAC12 foi digerido com enzima XhoI e teve este sítio inativado por

preenchimento das extremidades com T4 DNA Polimerase (Invitrogen) e re-ligado em reação

com T4 DNA ligase (Promega). O vetor pGEM-LAC12 foi então digerido com EcoRV e o

fragmento CYCGal-LAC12 sem o sítio XhoI foi purificado do gel de agarose 0,8% com kit

Clean-up Gel (Promega). O vetor pUG6 (Guldener el al, 1996) foi digerido com enzimas

XbaI e XhoI. Os adaptadores AdaptadorFor (5´ - TCGATCACCCGGGTAC) e AdaptadorRev

(5´ - CTAGGTACCCGGGTGA) foram utilizados em reação de ligação para inativar os sítios

XbaI e XhoI. O sítio SmaI interno a estas seqüências dos adaptadores foi utilizado para

linearizar o vetor pUG6. O fragmento CYCGal-LAC12 purificado foi então clonado no vetor

pUG6, resultando no vetor pUG6-LAC12. Em seguida, os vetores pUG6-LAC12 e pFB foram

digeridos com as enzimas SalI e HpaI, e o fragmento LoxP-CYCGalLAC12-LoxP foi

purificado e clonado no vetor pFB resultando no vetor pFB-LAC12.


46

3. Resultados

3.1. Construção do vetor pBASE

O vetor pBASE foi obtido por clonagem do fragmento de 474 pb que contém a região

MCS do pUC19 no vetor pM4296, inserindo assim uma série de sítios de restrição ordenados

satisfatoriamente para a construção dos vetores pFB’s (Figura 1).

O fragmento obtido pela digestão com PvuII do vetor pM4296 representa a porção do

vetor que contém o gene de resistência a ampicilina (AmpR) e a origem de replicação em

bactéria, necessários para a amplificação e manutenção dos vetores em E. coli. Esta seqüência

bacteriana estará disposta nos vetores pFB’s de forma que seja removida quando da digestão

do plasmídeo para obtenção dos cassetes de integração, tornando este cassete uma seqüência

“limpa”, isenta de quaisquer seqüências bacterianas.

Figura 1 - Mapa físico do vetor pBASE mostrando sítios de restrição

Os fragmentos amplificados para construção dos vetores pFB’s e clonados no vetor

pGEM-T easy (Promega) resultaram nos vetores pGEM-rDNA1, pGEM-rDNA2, pGEM-TPI,


47

pGEM-LAC4 e pGEM-LAC12. As digestões com enzimas de restrição específicas para cada

fragmento confirmaram a clonagem correta dos fragmentos no vetor pGEM-T easy (Figura 2).

Os fragmentos rDNA1, TPI, rDNA2, CYCGal-LAC4 e CYCGal-LAC12 contêm 1276 pb,

961 pb, 782 pb, 3732 pb e 2418 pb, respectivamente. Os sítios de reconhecimento para estas

enzimas de restrição haviam sido inseridos nas porções 5’ dos primers ou estavam contidos no

vetor pGEM-T easy.

Figura 2 – Digestão dos vetores resultantes da clonagem dos fragmentos no vetor pGEM-T easy. (A) linha 1:

Marcador λ HindIII; linha 2: pGEM-rDNA1; linha 3: pGEM-rDNA1 digerido com EcoRI e NdeI; linha 4:

Marcador 1 Kb. (B) linha 1: Marcador 1 Kb; linha 2: pGEM-rDNA2 digerido com PvuII e KpnI; linha 3: pGEM-

rDNA2. (C) linha 1: pGEM-TPI; linha 2: pGEM-TPI digerido com EcoRI; linha 3: Marcador 1 Kb. (D) linha 1:

pGEM-LAC4; linha 2: pGEM-LAC4 digerido com NotI; linha 3: Marcador 1 Kb. (E) linha 1: Marcador λ

HindIII; linha 2: pGEM-LAC12; linha 3: pGEM-LAC12 linearizado por digestão com XhoI.

O vetor pBASE-rDNA1, resultante da clonagem do fragmento purificado rDNA1-

EcoRI/NdeI no vetor pBASE, foi confirmado por digestão com EcoRI e NdeI verificando-se,

em gel de agarose, a liberação de um fragmento de 1.276 pb correspondente ao rDNA1


48

(Figura 3A). Em seguida, a presença da seqüência de 961 pb do promotor do gene TPI

clonada no vetor intermediário pBASE-TPI foi também confirmada por linearização com

enzima PmeI (Figura 3B). Como esta é uma clonagem bi-direcional, envolvendo apenas uma

enzima de restrição, a disposição desta seqüência poderá apresentar duas orientações. Assim,

a correta orientação da clonagem da seqüência TPI foi extremamente importante devido à

disposição dos sítios de restrição que seriam utilizados nos próximos passos desta construção.

As enzimas NdeI e PmeI foram utilizadas nesta verificação de orientação deste fragmento em

relação à seqüência rDNA1 (Figura 3B). Como esperado, obteve-se um fragmento de 1.281

pb após a digestão com as duas enzimas que indicou sua clonagem correta na posição 3´ da

seqüência rDNA1. O vetor intermediário obtido foi, então, denominado pBASE-TPI.

A clonagem do fragmento rDNA2 no vetor pBASE-TPI também foi confirmada por

digestão com as enzimas PvuII e KpnI, que resultou na liberação de um fragmento de 782 pb

correspondendo àquela seqüência inserida corretamente no plasmídeo (Figura 3C).

Figura 3 - Digestão dos vetores intermediários da construção do pFB. (A) linha 1: Marcador 1 Kb; linha 2:

pBASE-rDNA1digrido com EcoRI; linha 3: pBASE-rDNA1 digerido com NdeI; linha 4: pBASE-rDNA1

digerido com EcoRI e NdeI; linha 5: pBASE-rDNA1. (B) linha 1: pBASE-TPI digerido com NdeI; linha 2:

pBASE-TPI; linha 3: pBASE-TPI digerido com PmeI; linha 4: pBASE-TPI digerido com NdeI e PmeI; linha 5:

Marcador 1Kb. (C) linha 1: pFB-rDNA2 digerido com PvuII e KpnI; linha 2: Marcador 1 Kb.


49

3.2. Seqüenciamento do promotor CYC-Gal

O genes LAC4 e LAC12 utilizados neste trabalho estão clonados sob controle do

promotor híbrido CYC-GAL (Rubio-Teixeira et al 1998). Desta forma, a expressão desses

genes é induzida pela presença de galactose, na ausência de glicose, e é reprimida pela

presença de glicose no meio. Entretanto, a seqüência deste promotor não estava descrita na

literatura ou disponível nos bancos de dados de seqüências. Portanto, foi necessário realizar o

seqüenciamento deste fragmento tanto para a correta amplificação dos cassetes de expressão

como também para determinar as enzimas de restrição a serem inseridas no sítio de clonagem

(MCS) do vetor pFB-LAC12. A seqüência do promotor CYC-GAL está apresentada na

Figura 4.

Figura 4: Seqüência de nucleotídeos do promotor CYC-GAL presente nos vetores pMR4 e pMR11 descritos por

Rubio-Teixeira et al (1998). Submetido para o NCBI e registrado no GenBank sob o número EU450468.

3.3. Construção do vetor pFB-LAC4

A clonagem da seqüência CYC-GAL-LAC4 no vetor pFB, resultando no vetor pFB-

LAC4 foi confirmada em gel de agarose por digestão com a enzima SmaI. Esta digestão

resulta em dois fragmentos que correspondem ao cassete de integração rDNA1-CYCGAL-

LAC4-rDNA2 de 6751 pb e a seqüência bacteriana Amp/ORI de 2765 pb, respectivamente

(Figura 5).

GATCAAAAATCATCGCTTCGCTGATTAATTACCCCAGAAATAAGGCTAAAAAACTAATCGCATTATCATCCTA

TGGTTGTTAATTTGATTCGTTCATTTGAAGGTTTGTGGGGCCAGGTTACTGCCAATTTTTCCTCTTCATAACC

ATAAAAGCTAGTATTGTAGAATCTTTATTGTTCGGAGCAGTGCGGCGCGAGGCACATCTGCGTTTCAGGAACG

CGACCGGTGAAGACGAGGACGCACGGAGGAGAGTCTTCCTTCGGAGGGCTGTCACCCGCTCGGCGGCTTCTAA

TCCGTACTTCAATATAGCAATGAGCAGTTAAGCGTATTACTGAAAGTTCCAAAGAGAAGGTTTTTTTAGGCTA

ATCGACCTCGAGCAGATCCGCCAGGCGTGTATATAGCGTGGATGGCCAGGCAACTTTAGTGCTGACACATACA

GGCATATATATATGTGTGCGACGACACATGATCATATGGCATGCATGTGCTCTGTATGTATATAAAACTCTTG

TTTTCTTCTTTTCTCTAAATATTCTTTCCTTATACATTAGGTCCTTTGTAGCATAAATTACTATACTTCTATA

GACACGCAAACACAAATACACACACTAAATTACCGGATCAATT

Legenda:

Seqüência GAL, Seqüência CYC1, Sítio XhoI, UASg, URSg A, URSg B, URSg C


50

Figura 5 – Digestão do vetor pFB-LAC4. Linha 1: pFBLAC4; linha 2:

pFBLAC4 digerido com NotI; linha 3: Marcador 1 Kb.

3.4. Construção do vetor pFB-LAC12

Na região entre o promotor CYC-GAL e o gene LAC12 há um sítio de restrição

reconhecido pela enzima XhoI. No desenho destes vetores, o sítio XhoI foi incluído no MCS

do vetor pFB-LAC12. Logo, este sítio no plasmídeo pGEM-LAC12 foi inativado pela

digestão do plasmídeo com a enzima XhoI seguido da reação de preenchimento das

extremidades coesivas com a enzima T4 DNA polimerase e posterior ligação das

extremidades cegas formadas. Os plasmídeos modificados sem o sítio XhoI foram

identificados pela falha na digestão com esta enzima. Posteriormente, este plasmídeo foi

digerido com a enzima EcoRV para remoção e purificação do fragmento de 2.418 pb referente

ao cassete de expressão CYC-GAL-LAC12. Em paralelo, o plasmídeo pUG6 foi digerido com

XbaI e XhoI para remoção da seqüência do gene Kan que confere resistência a geneticina. Os

oligonucleotídeos adaptadorFor e adaptadorRev foram hibridados in vitro para formar

fragmentos que apresentavam uma região interna em cadeia dupla, correspondente ao sítio

para a enzima SmaI, e duas extremidades coesivas para os sítios XbaI e XhoI. Este adaptador


51

foi ligado ao pUG6 digerido com XhoI e XbaI, introduzindo um sítio SmaI no vetor.

Entretanto, no desenho dos oligonucleotídeos foi adicionada uma base diferente do sítio

original XhoI e XbaI. Portanto, o emparelhamento das seqüências em cadeia simples nas

extremidades do adaptador com as extremidades coesivas do pUG6 introduziu um mismatch

que levou à inativação dos dois sítios. A posterior digestão deste plasmídeo com SmaI

produziu um fragmento único de 4.021 pb que contém extremidades cegas capazes de ligarem

ao fragmento CYC-GAL-LAC12 digerido com EcoRV. Esta construção localizou o cassete

CYC-GAL-LAC12 entre duas seqüências loxP, resultando no cassete loxP-CYC-GAL-

LAC12-loxP. Esta é também uma clonagem bi-direcional, porém a orientação desta clonagem

é indiferente, pois o gene LAC12 já está abaixo do seu promotor CYC-GAL e assim a direção

de clonagem desta seqüência não interfere na transcrição do gene. Além disso, a ligação

EcoRV-SmaI inativou os dois sítios nas duas extremidades da clonagem, o que impede a

remoção do gene LAC12 do vetor. O fragmento loxP-CYC-GAL-LAC12-loxP obtido por

digestão do vetor pUG6-LAC12 com enzimas SalI e HpaI foi clonado no vetor pFB

resultando no vetor pFB-LAC12 (Figura 6).


52

Figura 6 - Etapas da construção do pFB-LAC12. (A) Linha 1: Marcador λ HindIII; linha 2: pFB; linha 3: pFB

digerido com SalI e HpaI. (B) Linha 1: Marcador λ HindIII; linha 2: pUG6-LAC12; linha 3: pUG6-LAC12

digerido com SalI; linha 4: pUG6-LAC12 digerido com HpaI; linha 5: pUG6-LAC12 digerido com SalI e HpaI.

(C) Linha 1: pFB-LAC12; linha 2: pFB-LAC12 digerido com SmaI; linha 3: Marcador λ HindIII.

4. Discussão

4.1. Escolha da região cromossômica como alvo de integração

Nos vetores integrativos clássicos de S. cerevisiae os genes de cópia única tais como

URA3, TRP1, HIS3 e LEU2 são utilizados como alvo de integração homóloga resultando em

integração com baixo número de cópia, geralmente uma ou duas cópias por célula (Romanos

et al, 1992). Para aumentar o número de cópias integradas do gene desejado, seqüências

repetitivas no genoma de leveduras têm sido usadas como região alvo de recombinação

homóloga (Oliveira et al, 2007). Trabalhos anteriores abordando integrações multi-cópias


53

para expressão de proteínas heterólogas foram realizados utilizando como região-alvo as

seqüências δ que são os sítios de integração do retrotransposon Ty1 em S. cerevisiae (Wang et

al, 1996; Sakay et al, 1990) ou o DNA ribossomal (Lopes et al, 1991; Rubio-Teixeira et al,

1998; Nieto et al, 1999; Wang et al, 2004).

A seqüência do DNA ribossomal utilizada neste trabalho também foi utilizada por

Lopes et al (1989) e Rubio-Teixeira et al (1998) como região alvo de integração e

apresentando bons resultados quanto à integração e estabilidade genômica. Esta seqüência

possui um sítio único de restrição para a enzima SmaI que permite a clivagem da seqüência

do rDNA em dois fragmentos que são utilizados como alvos de recombinação para integração

cromossômica dos vetores. Nessas construções anteriores, a digestão por SmaI apenas

lineariza o vetor que é então totalmente integrado no cromossomo da levedura. Na construção

descrita no presente trabalho, a seqüência do rDNA foi amplificada em duas partes chamadas

de rDNA1 (1.276 pb) e rDNA2 (782 pb) (Figura 7) de forma a conter o sítio SmaI nos dois

fragmentos. A clonagem destes fragmentos no vetor pBASE posiciona a seqüência bacteriana

derivada do vetor pM4296 (HO-MCS-HO) entre os sítios SmaI contidos em cada um destes

fragmentos. Assim, após a clonagem do gene de interesse no vetor pFBLAC12, a digestão

com SmaI para obtenção dos cassetes de integração derivados do pFBLAC4 e pFBLAC12

excisa a seqüência bacteriana da construção tornando o cassete de integração uma seqüência

“limpa”, isenta de seqüências bacterianas (Figura 8).

Figura 7 - Sequência do DNA ribossomal de S. cerevisiae e fragmentos rDNA1 e rDNA2 amplificados para construção dos vetores pFB's. 1: primer rDNA1for; 2: primer rDNA1rev; 3: primer rDNA2for; 4: rDNA2rev.


54

Figura 8 - Cassetes de integração derivados dos vetores pFB's.

Segundo Lopes et al (1996) a estabilidade da integração no rDNA depende do

tamanho do fragmento a ser integrado, não devendo ser superior a unidade repetitiva do

rDNA (9.1 kb), e da natureza do fragmento do rDNA presente no cassete como seqüência

para recombinação. O fragmento do rDNA utilizado nesta construção foi baseado no

fragmento contido no vetor pMIRY descrito em Lopes et al (1996). O cassete de integração

extraído do vetor pFB-LAC12 apresenta 5.623 pb, sendo possível, para assegurar melhor

estabilidade da integração, clonagem de genes com até 4.400 pb. A integração de várias

cópias ou vários genes parece possível já que o rDNA contém cerca de 100 a 200 cópias de

uma seqüência de 9.1Kb repetidas em tandem. (Lopes et al, 1989; Fujii , 1990; Lopes et al,

1991).

4.2. Escolha da marca de seleção

A seleção das células modificadas só é possível uma vez que uma marca de seleção

seja integrada junto ao fragmento de DNA de interesse. Muitas marcas de seleção têm sido


55

descritas para uso em leveduras baseadas em resistência a antibióticos ou compostos químicos

e complementação nutricional (supressão de auxotrofia) (Pronk, 2002).

As marcas de supressão de auxotrofia não são convenientes para aplicações em

linhagens industriais devido à carência de linhagens industriais auxotróficas. A construção de

linhagens industriais auxotróficas nem sempre é possível visto que dependendo do seu grau

de ploidia, as células terão várias cópias do gene marcador em questão a serem inativadas. As

marcas de resistência a antibióticos não devem ser utilizadas em linhagens industriais pelo

risco de transferência de genes entre microrganismos presentes em processos industriais e por

não ser permitida a liberação de um microrganismo portador de resistência a antibiótico no

meio ambiente natural. Outros tipos de marcas de seleção têm sido descritas, tais como a

utilização de genes da via metabólica para o arabitol como marcador de seleção. Neste caso, a

célula modificada apresenta a vantagem seletiva de metabolizar o arabitol sobre a célula não-

modificada. Este mesmo exemplo aplica-se para genes das vias metabólicas do ribitol e

manitol (Parrot, 2001).

Um outro método de seleção descrito por Camargo and Vicente (2000) utiliza uma

seqüência o gene CAN1 como marca de seleção. O vetor utilizado nesse método possui as

extremidades do gene CAN1 de S. cerevisiae interrompidas pelo gene a ser integrado. Quando

o cassete é integrado no locos CAN1 este gene é inativado. Linhagens de levedura com o alelo

funcional CAN1 são sensíveis ao aminoácido análogo da arginina, a L-canavanina, um

inibidor de crescimento de muitos microrganismos. Assim, a seleção das linhagens

modificadas com este sistema é possível pelo cultivo em meio contendo L-canavanina devido

a resistência promovida para interrupção deste gene.

A marca de seleção aqui proposta é baseada no metabolismo da lactose. A levedura S.

cerevisiae não é capaz de metabolizar lactose por não possuir os genes codificares para a

lactose permease e β-galactosidase. Em leveduras tais como Kluyveromyces lactis, a lactose


56

permease, codificada pelo gene LAC12, é responsável pelo transporte da lactose extracelular

para o meio intracelular e a enzima β-galactosidase, codificada pelo gene LAC4, catalisa a

hidrólise da lactose em glicose e galactose. A ausência destes genes em S. cerevisiae

possibilita o uso dos mesmos como marca de seleção por “complementação metabólica”

nestas linhagens. Assim, células de S. cerevisiae que portam os dois genes são capazes de

crescer em meio contendo lactose como única fonte de carbono (Adam et al., 1999). Desta

forma, é possível selecionar as células modificadas entre as não-modificadas por simples

semeio em placas contendo meio seletivo para esta nova característica metabólica adquirida,

ou seja, meio contendo lactose como única fonte de carbono.

Linhagens de S. cerevisiae com estes genes têm sido construídas por diferentes

abordagens de engenharia genética (Kumar et al., 1992; Porro et al., 1992; Rubio-Teixeira et

al., 1998; Adam et al, 1999), geralmente com o objetivo de viabilizar a produção de biomassa

ou de etanol a partir de soro de queijo, resíduo da indústria de laticínios rico em lactose.

Os genes LAC4 e LAC12 estão clonados nos vetores pMR4 e pMR11 descritos por

Rubio-Teixeira et al (1998) sob controle de promotor híbrido CYCGAL (Guarante et al,

1982) e, portanto, com expressão induzida por galactose. A utilização deste promotor,

controlando a expressão dos genes marcadores desta construção, apresenta uma vantagem

para este sistema uma vez que não é de interesse da indústria que haja desvio do fluxo de

carbono do processo fermentativo para a produção de qualquer outro produto, de forma que o

rendimento em produto seja o mais próximo do rendimento-teórico possível.

4.3. Escolha do promotor TPI e dos sítios de clonagem

O gene TPI1 codifica para a triose-fosfato isomerase, uma das enzimas-chave da via

glicolítica em S. cerevisiae. Os genes desta via apresentam alta expressão constitutiva, com

pequena indução quando as células são cultivadas em glicose. Portanto, as regiões promotoras


57

desses genes, principalmente dos genes TPI1 e PGK1, se constituem em seqüências muito

utilizadas para a expressão de genes heterólogos em S. cerevisiae (Romanos et al., 1990). O

promotor TPI foi amplificado do vetor pYX212-GapN, tem na porção 5’ do seu primer

reverso seqüências de sítios de restrição que compõe os MCS (multiple cloning site) do vetor

pFB-LAC12. Os sítios NotI, BamHI, NheI e XhoI foram escolhidos após análise de algumas

seqüências de genes a serem clonados em trabalhos desenvolvidos pelo nosso grupo de

pesquisa. Estes sítios permitem a clonagem de seqüências codificadoras de genes sob o

controle do promotor TPI, de expressão constitutiva, no vetor pFB-LAC12 (Figura 9). A

disposição de sítios de restrição no vetor pFBLAC12 permite, ainda, que o promotor possa ser

trocado. Utilizando os sítios PmeI e BamHI ou NheI é possível excisar o promotor TPI do

vetor pFBLAC12 e clonar um outro promotor de interesse, possibilitando escolher a

regulação da expressão do gene a ser clonado.

4.4. O sistema pFB para modificação de linhagens industriais de S. cerevisiae

Este sistema de modificação consiste, então, num conjunto formado por dois vetores:

o pFBLAC4, que contém o gene LAC4, e o pFBLAC12, contendo o gene LAC12. Para

transformar as células de leveduras, serão usados dois cassetes de integração derivados destes

dois vetores (Figura 7). O primeiro evento de modificação é uma co-transformação na qual a

seleção de células modificadas só é possível após uma dupla integração destes dois cassetes

derivados dos dois vetores. Para um segundo evento de modificação, é necessária apenas uma

única integração do cassete contendo o gene LAC12 e o segundo gene de interesse, pois o

gene LAC4 já estará integrado no genoma. Desta forma, é necessário que o gene LAC12 seja

excisável. Nesta proposta, apenas o gene LAC12 foi ladeado pelas seqüências LoxP descritas

por Sauer (1994) e Guldener et al (1996) possibilitando sua excisão após o evento de

transformação celular e integração cromossômica. Assim, num segundo evento de


58

transformação, apenas o vetor de expressão contendo o gene LAC12 precisará ser utilizado.

Isto permite que o sistema de transformação pFB seja utilizado sucessivamente numa mesma

linhagem. A excisão do gene marcador LAC12 é possível com a transformação das células

modificadas de S. cerevisiae utilizando o vetor epissomal pNatCre que contém o gene que

codifica para a enzima Cre recombinase promovendo a recombinação entre as seqüências

LoxP. Este vetor possui como marca de seleção o gene para resistência ao antibiótico CloNat.

Sendo o vetor epissomal, após a excisão do gene LAC12, o cultivo em meio não seletivo (sem

CloNat) resultará na perda deste vetor.

Figura 9 – Mapa físico dos vetores pFB-LAC4 e pFB-LAC12 mostrando sítios de restrição.

Esta marca de seleção é inovadora no sentido de que não estará produzindo

microrganismos resistentes e não necessita da aplicação de antibióticos ou outro composto

químico no meio industrial, podendo ser considerada como uma marca de seleção “limpa”

(ecologicamente correta). Este sistema permite, ainda, a sua aplicação em marcação fenotípica

de linhagens industriais possibilitando o fácil reconhecimento destas linhagens no ambiente

industrial de modo a facilitar o monitoramento de sua persistência no processo. Esta marcação

fenotípica está fundamentada no princípio de um fácil reconhecimento visual através da

coloração adquirida pela linhagem marcada em presença de um substrato cromógeno. O gene


59

LAC4 codifica para a enzima β-galactosidase que catalisa a hidrólise da lactose em glicose e

galactose e a atividade desta enzima pode ser evidenciada através do substrato cromógeno X-

gal, um composto análogo à lactose. Linhagens de S. cerevisiae expressando o gene LAC4

podem ser monitoradas em meio contendo galactose e o substrato cromógeno X-gal (5-

bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo) por apresentarem colônias de coloração azul

devido à hidrólise do X-gal, enquanto as demais linhagens não modificadas apresentarão

coloração branca. Assim, uma vez introduzida numa linhagem industrial de interesse, a marca

LAC4 permitirá monitorar quantitativamente, e de forma simples e rápida, a persistência no

processo industrial da linhagem marcada.

Por fim, a marcação fenotípica poderá ainda ser aplicada para marcar linhagens

selecionadas e modificadas ou não para qualquer fim, seja melhoramento no rendimento em

etanol ou produção de proteínas heterólogas, podendo ser utilizada como uma “assinatura

genética” para proteção da propriedade intelectual destas linhagens construídas.

4.5. Limitação do sistema pFB

O sistema pFB possui um restrito número de sítios de clonagem. Porém, uma posterior

modificação do MCS destes vetores com a utilização de adaptadores desenhados contendo

sítios convenientes, baseados na seqüência dos vetores, poderá aumentar a disponibilidade

destes sítios.

Agradecimentos

Este trabalho foi possibilitado a partir de apoio financeiro das agências CNPq, Capes, Facepe,

FADE-UFPE e da empresa Genetech Bioprodutividade Ltda.


60

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64

5. ANEXOS


65

5.1. Seqüências depositadas nos Bancos de dados NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e

SGD (http://db.yeastgenome.org) utilizadas na construção dos vetores pFB’s.

Tabela 1 - Número de acesso às seqüências depositadas nos bancos de dados NCBI e SGD utilizadas neste trabalho.

Seqüência No de acesso Banco de dados

Vetor pM4296 (HO-poly-HO) AF324727 GenBank

rDNA de S. cerevisiae

ETS1-1

NTS1 - 2

NTS2 - 2

RDN5-1

S000029717

S000029328

S000029706

S000006479

SGD

SGD

SGD

SGD

Promotor TPI S000002457 SGD

Promotor CYC-GAL EU450468 GenBank

Gene LAC4 – Kluyveromyces lactis M84410 GenBank

Gene LAC12 – Kluyveromyces lactis X06997 GanBank


66

5.2. Seqüência completa do vetor pFB-LAC12 - Seqüência construída a partir das seqüências descritas na Tabela 1. 1 CTGGCGTAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC 51 GCAGCCTGAA TGGCGAATGG CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT 101 CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATACGTCAA AGCAACCATA GTACGCGCCC 151 TGTAGCGGCG CATTAAGCGC GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC 201 CGCTACACTT GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC TCCTTTCGCT TTCTTCCCTT 251 CCTTTCTCGC CACGTTCGCC GGCTTTCCCC GTCAAGCTCT AAATCGGGGT 301 GGGCCATCGC CCTGATAGAC GGTTTTTCGC CCTTTGACGT TGGAGTCCAC 351 GTTCTTTAAT AGTGGACTCT TGTTCCAAAC TGGAACAACA CTCAACCCTA 401 TCTCGGGCTA TTCTTTTGAT TTATAAGGGA TTTTGCCGAT TTCGGCCTAT 451 TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT TTAACAAAAA TTTAACGCGA ATTTTAACAA 501 AATATTAACG TTTACAATTT TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG 551 ATGCCGCATA GTTAAGCCAG CCCCGACACC CGCCAACACC CGCTGACGCG 601 CCCTGACGGG CTTGTCTGCT CCCGGCATCC GCTTACAGAC AAGCTGTGAC 651 CGTCTCCGGG AGCTGCATGT GTCAGAGGTT TTCACCGTCA TCACCGAAAC 701 GCGCGAGACG AAAGGGCCTC GTGATACGCC TATTTTTATA GGTTAATGTC 751 ATGATAATAA TGGTTTCTTA GACGTCAGGT GGCACTTTTC GGGGAAATGT 801 GCGCGGAACC CCTATTTGTT TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC 851 CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC TTCAATAATA TTGAAAAAGG 901 AAGAGTATGA GTATTCAACA TTTCCGTGTC GCCCTTATTC CCTTTTTTGC 951 GGCATTTTGC CTTCCTGTTT TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA 1001 AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG TGGGTTACAT CGAACTGGAT 1051 CTCAACAGCG GTAAGATCCT TGAGAGTTTT CGCCCCGAAG AACGTTTTCC 1101 AATGATGAGC ACTTTTAAAG TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTA 1151 TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC GCATACACTA TTCTCAGAAT 1201 GACTTGGTTG AGTACTCACC AGTCACAGAA AAGCATCTTA CGGATGGCAT 1251 GACAGTAAGA GAATTATGCA GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG 1301 CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG GACCGAAGGA GCTAACCGCT 1351 TTTTTGCACA ACATGGGGGA TCATGTAACT CGCCTTGATC GTTGGGAACC 1401 GGAGCTGAAT GAAGCCATAC CAAACGACGA GCGTGACACC ACGATGCCTG 1451 TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT TAACTGGCGA ACTACTTACT 1501 CTAGCTTCCC GGCAACAATT AATAGACTGG ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC 1551 AGGACCACTT CTGCGCTCGG CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA 1601 AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG GTATCATTGC AGCACTGGGG 1651 CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA CGGGGAGTCA 1701 GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC 1751 TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG 1801 ATTGATTTAA AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT 1851 TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT 1901 GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG GATCTTCTTG AGATCCTTTT 1951 TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC 2001 GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA 2051 CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG 2101 TAGTTAGGCC ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC 2151 TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC 2201 TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC CGGATAAGGC GCAGCGGTCG 2251 GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA 2301 CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCA TTGAGAAAGC GCCACGCTTC 2351 CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA 2401 GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG 2451 TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT 2501 CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG CCAGCAACGC GGCCTTTTTA 2551 CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT TTCCTGCGTT 2601 ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 2651 CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA


67

2701 GCGGAAGAGC GCCCAATACG CAAACCGCCT CTCCCCGCGC GTTGGCCGAT 2751 TCATTAATGC AGTTGATATC CACCATATGA AAGTGACAGG TGCCCCGGGT 2801 AACCCAGTTC CTCACTATTT TTTACTGCGG AAGCGGAAGC GGAAAATACG 2851 GAAACGCGCG GGAACATACA AAACATACAA AATATACCTT TCTCACACAA 2901 GAAATATATG CTACTTGCAA AATATCATAC CAAAAAACTT TTCACAACCG 2951 AAACCAAAAC CAACGGATAT CATACATTAC ACTACCACCA TTCAAACTTT 3001 ACTACTATCC TCCCTTCAGT TTCCCTTTTT CTGCCTTTTT CGGTGACGGA 3051 AATACGCTTC AGAGACCCTA AAGGGAAATC CATGCCATAA CAGGAAAGTA 3101 ACATCCCAAT GCGGACTATA CCACCCCACC ACACTCCTAC CAATAACGGT 3151 AACTATTCTA TGTTTTCTTA CTCCTATGTC TATTCATCTT TCATCTGACT 3201 ACCTAATACT ATGCAAAAAT GTAAAATCAT CACACAAAAC ATAAACAATC 3251 AAAATCAGCC ATTTCCGCAC CTTTTCCTCT GTCCACTTTC AACCGTCCCT 3301 CCAAATGTAA AATGGCCTAT CGGAATACAT TTTCTACATC CTAACTACTA 3351 TAAAACAACC TTTAGACTTA CGTTTGCTAC TCTCATGGTC TCAATACTGC 3401 CGCCGACATT CTGTCCCACA TACTAAATCT CTTCCCGTCA TTATCGCCCG 3451 CATCCGGTGC CGTAAATGCA AAACAAATAC CATCTATGTC TTCCACACCA 3501 TCATTTTACT ATGCCTGCCA CCATCCATTT GTCTTTTGCA CCATATCTTC 3551 ATAACCTGTC ACCTTGAAAC TACCTCTGCA TGCCACCTAC CGACCAACTT 3601 TCATGTTCTG TTTCGACCTA CCTCTTGTAA ATGACAAATC ACCTTTTTCA 3651 TCGTATGCAC CTTATTCTCC ACATCACAAT GCACTATTGC TTTTGCTTTT 3701 TCACCTGTCA TATCCTATTG CTATTAGATG AAATATAATA AAAATTGTCC 3751 TCCACCCATA ACACCTCTCA CTCCCACCTA CTGAACATGT CTGGACCCTG 3801 CCCTCATATC ACCTGCGTTT CCGTTAAACT ATCAGATTGC AGCACCTGAG 3851 TTTCGCGTAT GGTCACCCAC TACACTACTC GGTCAGGCTC TTACCAGCTT 3901 AACTACAGTT GATCGGACGG GAAACGGTGC TTTCTGGTAG ATATGGCCGC 3951 AACCTTATTT CTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CTAGTTTCTT 4001 GGCTTCCTAT GCTAAATCCC ATAACTAACC TACCATTCGA TGAATTCGAT 4051 TTGTTTAAAC TTGGGGATCT ACGTATGGTC ATTTCTTCTT CAGATTCCCT 4101 CATGGAGAAA GTGCGGCAGA TGTATATGAC AGAGTCGCCA GTTTCCAAGA 4151 GACTTTATTC AGGCACTTCC ATGATAGGCA AGAGAGAAGA CCCAGAGATG 4201 TTGTTGTCCT AGTTACACAT GGTATTTATT CCAGAGTATT CCTGATGAAA 4251 TGGTTTAGAT GGACATACGA AGAGTTTGAA TCGTTTACCA ATGTTCCTAA 4301 CGGGAGCGTA ATGGTGATGG AACTGGACGA ATCCATCAAT AGATACGTCC 4351 TGAGGACCGT GCTACCCAAA TGGACTGATT GTGAGGGAGA CCTAACTACA 4401 TAGTGTTTAA AGATTACGGA TATTTAACTT ACTTAGAATA ATGCCATTTT 4451 TTTGAGTTAT AATAATCCTA CGTTAGTGTG AGCGGGATTT AAACTGTGAG 4501 GACCTTAATA CATTCAGACA CTTCTGCGGT ATCACCCTAC TTATTCCCTT 4551 CGAGATTATA TCTAGGAACC CATCAGGTTG GTGGAAGATT ACCCGTTCTA 4601 AGACTTTTCA GCTTCCTCTA TTGATGTTAC ACCTGGACAC CCCTTTTCTG 4651 GCATCCAGTT TTTAATCTTC AGTGGCATGT GAGATTCTCC GAAATTAATT 4701 AAAGCAATCA CACAATTCTC TCGGATACCA CCTCGGTTGA AACTGACAGG 4751 TGGTTTGTTA CGCATGCTAA TGCAAAGGAG CCTATATACC TTTGGCTCGG 4801 CTGCTGTAAC AGGGAATATA AAGGGCAGCA TAATTTAGGA GTTTAGTGAA 4851 CTTGCAACAT TTACTATTTT CCCTTCTTAC GTAAATATTT TTCTTTTTAA 4901 TTCTAAATCA ATCTTTTTCA ATTTTTTGTT TGTATTCTTT TCTTGCTTAA 4951 ATCTATAACT ACAAAAAACA CATACAGCTC GAGGCTAGCG GATCCGCGGC 5001 CGCGGTCGAC AACCCTTAAT ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG 5051 TTATTAGGTC TAGGTACCCA TCTTCGATCA AAAATCATCG CTTCGCTGAT 5101 TAATTACCCC AGAAATAAGG CTAAAAAACT AATCGCATTA TCATCCTATG 5151 GTTGTTAATT TGATTCGTTC ATTTGAAGGT TTGTGGGGCC AGGTTACTGC 5201 CAATTTTTCC TCTTCATAAC CATAAAAGCT AGTATTGTAG AATCTTTATT 5251 GTTCGGAGCA GTGCGGCGCG AGGCACATCT GCGTTTCAGG AACGCGACCG 5301 GTGAAGACGA GGACGCACGG AGGAGAGTCT TCCTTCGGAG GGCTGTCACC 5351 CGCTCGGCGG CTTCTAATCC GTACTTCAAT ATAGCAATGA GCAGTTAAGC 5401 GTATTACTGA AAGTTCCAAA GAGAAGGTTT TTTTAGGCTA ATCGACCTCG 5451 ATCGAGTCGA GCAGATCCGC CAGGCGTGTA TATAGCGTGG ATGGCCAGGC 5501 AACTTTAGTG CTGACACATA CAGGCATATA TATATGTGTG CGACGACACA 5551 TGATCATATG GCATGCATGT GCTCTGTATG TATATAAAAC TCTTGTTTTC


68

5601 TTCTTTTCTC TAAATATTCT TTCCTTATAC ATTAGGTCCT TTGTAGCATA 5651 AATTACTATA CTTCTATAGA CACGCAAACA CAAATACACA CACTAAATTA 5701 CCGGATCAAT TCTTGAGCTC AAAATGGCAG ATCATTCGAG CAGCTCATCT 5751 TCGCTGCAGA AGAAGCCAAT TAATACTATC GAGCATAAAG ACACTTTGGG 5801 CAATGATCGG GATCACAAGG AAGCCTTGAA CAGTGATAAT GATAATACTT 5851 CTGGATTGAA AATCAATGGT GTCCCCATCG AGGACGCTAG AGAGGAAGTG 5901 CTCTTACCAG GTTACTTGTC GAAGCAATAT TACAAATTGT ACGGTTTATG 5951 TTTTATAACA TATCTGTGTG CTACTATGCA AGGTTATGAT GGGGCTTTAA 6001 TGGGTTCTAT CTATACCGAA GATGCATATT TGAAATACTA CCATTTGGAT 6051 ATTAACTCAT CCTCTGGTAC TGGTCTAGTG TTCTCTATTT TCAACGTTGG 6101 TCAAATTTGC GGTGCATTCT TTGTTCCTCT TATGGATTGG AAAGGTAGAA 6151 AACCTGCTAT TTTAATTGGG TGTCTGGGTG TTGTTATTGG TGCTATTATT 6201 TCGTCTTTAA CAACAACAAA GAGTGCATTA ATTGGTGGTA GATGGTTCGT 6251 GGCCTTTTTC GCTACAATCG CTAATGCAGC AGCTCCAACA TACTGTGCAG 6301 AAGTGGCTCC AGCTCACTTA AGAGGTAAGG TTGCAGGTCT TTATAACACC 6351 CTTTGGTCTG TCGGTTCCAT TGTTGCTGCC TTTAGCACTT ACGGTACCAA 6401 CAAAAACTTC CCTAACTCCT CCAAGGCTTT TAAGATTCCA TTATACTTAC 6451 AAATGATGTT CCCAGGTCTT GTGTGTATAT TTGGTTGGTT AATCCCAGAA 6501 TCTCCAAGAT GGTTGGTTGG TGTTGGCCGT GAGGAAGAAG CTCGTGAATT 6551 CATTATCAAA TACCACTTAA ATGGCGATAG AACTCATCCA TTATTGGATA 6601 TGGAGATGGC AGAAATAATA GAATCTTTCC ATGGTACAGA TTTATCAAAC 6651 CCTCTAGAAA TGTTAGATGT AAGGAGCTTA TTCAGAACGA GATCGGATAG 6701 GTACAGAGCA ATGTTGGTTA TACTTATGGC TTGGTTCGGT CAATTTTCCG 6751 GTAACAATGT GTGTTCGTAC TATTTGCCTA CCATGTTGAG AAATGTTGGT 6801 ATGAAGAGTG TCTCATTGAA TGTGTTAATG AATGGTGTTT ATTCCATCGT 6851 CACTTGGATT TCTTCAATTT GCGGTGCATT CTTTATTGAT AAGATTGGTA 6901 GAAGGGAAGG TTTCCTTGGT TCTATCTCAG GTGCTGCATT AGCATTGACA 6951 GGTCTATCTA TCTGTACTGC TCGTTATGAG AAGACTAAGA AGAAGAGTGC 7001 TTCCAATGGT GCATTGGTGT TCATTTATCT CTTTGGTGGT ATCTTTTCTT 7051 TTGCTTTCAC TCCAATGCAA TCCATGTACT CAACAGAAGT GTCTACAAAC 7101 TTGACGAGAT CTAAGGCCCA ACTCCTCAAC TTTGTGGTTT CTGGTGTTGC 7151 CCAATTTGTT AATCAATTTG CTACTCCAAA GGCAATGAAG AATATCAAAT 7201 ATTGGTTCTA TGTGTTCTAC GTTTTCTTCG ATATTTTCGA ATTTATTGTT 7251 ATCTACTTCT TCTTCGTTGA AACTAAGGGT AGAAGCTTAG AAGAATTAGA 7301 AGTTGTCTTT GAAGCTCCAA ACCCAAGAAA GGCATCCGTT GATCAAGCAT 7351 TCTTGGCTCA AGTCAGGGCA ACTTTGGTCC AACGAAATGA CGTTAGAGTT 7401 GCAAATGCTC AAAATTTGAA AGAGCAAGAG CCTCTAAAGA GCGATGCTGA 7451 TCATGTCGAA AAGCTTTCAG AGGCAGAATC TGTTTAAAGC CATGATGGGT 7501 GACTCGATAA CCCTTAATAT AACTTCGTAT AATGTATGCT ATACGAAGTT 7551 ATTAGGTGAT ATCAGATCCA CTAGTGGCCT ATGCGCCCGC GGATCTGCCG 7601 GTCTCCCTAT AGTGAGTCGT ATTAATTTCG ATAAGCCAGG TTACCGTTAA 7651 CTCAGGTCTC TCTGCTGCCG GAAATGCTCT CTGTTCAAAA AGCTTTTACA 7701 CTCTTGACCA GCGCACTCCG TCACCATACC ATAGCACTCT TTGAGTTTCC 7751 TCTAATCAGG TTCCACCAAA CAGATACCCC GGTGTTTCAC GGAATGGTAC 7801 GTTTGATATC GCTGATTTGA GAGGAGGTTA CACTTGAAGA ATCACAGTCT 7851 TGCGACCGGC TATTCAACAA GGCATTCCCC CAAGTTTGAA TTCTTTGAAA 7901 TAGATTGCTA TTAGCTAGTA ATCCACCAAA TCCTTCGCTG CTCACCAATG 7951 GAATCGCAAG ATGCCCACGA TGAGACTGTT CAGGTTAAAC GCAAAAGAAA 8001 CACACTCTGG GAATTTCTTC CCAAATTGTA TCTCTCAATA CGCATCAACC 8051 CATGTCAATT AAACACGCTG TATAGAGACT AGGCAGATCT GACGATCACC 8101 TAGCGACTCT CTCCACCGTT TGACGAGGCC ATTTACAAAA ACATAACGAA 8151 CGACAAGCCT ACTCGAATTC GTTTCCAAAC TCTTTTCGAA CTTGTCTTCA 8201 ACTGCTTTCG CATGAAGTAC CTCCCAACTA CTTTTCCTCA CACTTGTACT 8251 CCATGACTAA ACCCCCCCTC CCATTACAAA CTAAAATCTT ACTTTTATTT 8301 TCTTTTGCCC TCTCTGTCGC TCTGCCTTAA CTACGTATTT CTCGCCGAGA 8351 AAAACTTCAA TTTAAGCTAT TCTCCAAAAA TCTTAGCGTA TATTTTTTTT 8401 CCAAAGTGAC AGGTGCCCCG GGTACAGCTG CATTGATATC TT


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5.3. Seqüência completa do vetor pFB-LAC4 – Seqüência construída a partir das seqüências descritas na Tabela 1. 1 CTGGCGTAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC 51 GCAGCCTGAA TGGCGAATGG CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT 101 CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATACGTCAA AGCAACCATA GTACGCGCCC 151 TGTAGCGGCG CATTAAGCGC GGCGGGTGTG GTGGTTACGC GCAGCGTGAC 201 CGCTACACTT GCCAGCGCCC TAGCGCCCGC TCCTTTCGCT TTCTTCCCTT 251 CCTTTCTCGC CACGTTCGCC GGCTTTCCCC GTCAAGCTCT AAATCGGGGT 301 GGGCCATCGC CCTGATAGAC GGTTTTTCGC CCTTTGACGT TGGAGTCCAC 351 GTTCTTTAAT AGTGGACTCT TGTTCCAAAC TGGAACAACA CTCAACCCTA 401 TCTCGGGCTA TTCTTTTGAT TTATAAGGGA TTTTGCCGAT TTCGGCCTAT 451 TGGTTAAAAA ATGAGCTGAT TTAACAAAAA TTTAACGCGA ATTTTAACAA 501 AATATTAACG TTTACAATTT TATGGTGCAC TCTCAGTACA ATCTGCTCTG 551 ATGCCGCATA GTTAAGCCAG CCCCGACACC CGCCAACACC CGCTGACGCG 601 CCCTGACGGG CTTGTCTGCT CCCGGCATCC GCTTACAGAC AAGCTGTGAC 651 CGTCTCCGGG AGCTGCATGT GTCAGAGGTT TTCACCGTCA TCACCGAAAC 701 GCGCGAGACG AAAGGGCCTC GTGATACGCC TATTTTTATA GGTTAATGTC 751 ATGATAATAA TGGTTTCTTA GACGTCAGGT GGCACTTTTC GGGGAAATGT 801 GCGCGGAACC CCTATTTGTT TATTTTTCTA AATACATTCA AATATGTATC 851 CGCTCATGAG ACAATAACCC TGATAAATGC TTCAATAATA TTGAAAAAGG 901 AAGAGTATGA GTATTCAACA TTTCCGTGTC GCCCTTATTC CCTTTTTTGC 951 GGCATTTTGC CTTCCTGTTT TTGCTCACCC AGAAACGCTG GTGAAAGTAA 1001 AAGATGCTGA AGATCAGTTG GGTGCACGAG TGGGTTACAT CGAACTGGAT 1051 CTCAACAGCG GTAAGATCCT TGAGAGTTTT CGCCCCGAAG AACGTTTTCC 1101 AATGATGAGC ACTTTTAAAG TTCTGCTATG TGGCGCGGTA TTATCCCGTA 1151 TTGACGCCGG GCAAGAGCAA CTCGGTCGCC GCATACACTA TTCTCAGAAT 1201 GACTTGGTTG AGTACTCACC AGTCACAGAA AAGCATCTTA CGGATGGCAT 1251 GACAGTAAGA GAATTATGCA GTGCTGCCAT AACCATGAGT GATAACACTG 1301 CGGCCAACTT ACTTCTGACA ACGATCGGAG GACCGAAGGA GCTAACCGCT 1351 TTTTTGCACA ACATGGGGGA TCATGTAACT CGCCTTGATC GTTGGGAACC 1401 GGAGCTGAAT GAAGCCATAC CAAACGACGA GCGTGACACC ACGATGCCTG 1451 TAGCAATGGC AACAACGTTG CGCAAACTAT TAACTGGCGA ACTACTTACT 1501 CTAGCTTCCC GGCAACAATT AATAGACTGG ATGGAGGCGG ATAAAGTTGC 1551 AGGACCACTT CTGCGCTCGG CCCTTCCGGC TGGCTGGTTT ATTGCTGATA 1601 AATCTGGAGC CGGTGAGCGT GGGTCTCGCG GTATCATTGC AGCACTGGGG 1651 CCAGATGGTA AGCCCTCCCG TATCGTAGTT ATCTACACGA CGGGGAGTCA 1701 GGCAACTATG GATGAACGAA ATAGACAGAT CGCTGAGATA GGTGCCTCAC 1751 TGATTAAGCA TTGGTAACTG TCAGACCAAG TTTACTCATA TATACTTTAG 1801 ATTGATTTAA AACTTCATTT TTAATTTAAA AGGATCTAGG TGAAGATCCT 1851 TTTTGATAAT CTCATGACCA AAATCCCTTA ACGTGAGTTT TCGTTCCACT 1901 GAGCGTCAGA CCCCGTAGAA AAGATCAAAG GATCTTCTTG AGATCCTTTT 1951 TTTCTGCGCG TAATCTGCTG CTTGCAAACA AAAAAACCAC CGCTACCAGC 2001 GGTGGTTTGT TTGCCGGATC AAGAGCTACC AACTCTTTTT CCGAAGGTAA 2051 CTGGCTTCAG CAGAGCGCAG ATACCAAATA CTGTCCTTCT AGTGTAGCCG 2101 TAGTTAGGCC ACCACTTCAA GAACTCTGTA GCACCGCCTA CATACCTCGC 2151 TCTGCTAATC CTGTTACCAG TGGCTGCTGC CAGTGGCGAT AAGTCGTGTC 2201 TTACCGGGTT GGACTCAAGA CGATAGTTAC CGGATAAGGC GCAGCGGTCG 2251 GGCTGAACGG GGGGTTCGTG CACACAGCCC AGCTTGGAGC GAACGACCTA 2301 CACCGAACTG AGATACCTAC AGCGTGAGCA TTGAGAAAGC GCCACGCTTC 2351 CCGAAGGGAG AAAGGCGGAC AGGTATCCGG TAAGCGGCAG GGTCGGAACA 2401 GGAGAGCGCA CGAGGGAGCT TCCAGGGGGA AACGCCTGGT ATCTTTATAG 2451 TCCTGTCGGG TTTCGCCACC TCTGACTTGA GCGTCGATTT TTGTGATGCT 2501 CGTCAGGGGG GCGGAGCCTA TGGAAAAACG CCAGCAACGC GGCCTTTTTA 2551 CGGTTCCTGG CCTTTTGCTG GCCTTTTGCT CACATGTTCT TTCCTGCGTT 2601 ATCCCCTGAT TCTGTGGATA ACCGTATTAC CGCCTTTGAG TGAGCTGATA 2651 CCGCTCGCCG CAGCCGAACG ACCGAGCGCA GCGAGTCAGT GAGCGAGGAA 2701 GCGGAAGAGC GCCCAATACG CAAACCGCCT CTCCCCGCGC GTTGGCCGAT


70

2751 TCATTAATGC AGTTGATATC CACCATATGA AAGTGACAGG TGCCCCGGGT 2801 AACCCAGTTC CTCACTATTT TTTACTGCGG AAGCGGAAGC GGAAAATACG 2851 GAAACGCGCG GGAACATACA AAACATACAA AATATACCTT TCTCACACAA 2901 GAAATATATG CTACTTGCAA AATATCATAC CAAAAAACTT TTCACAACCG 2951 AAACCAAAAC CAACGGATAT CATACATTAC ACTACCACCA TTCAAACTTT 3001 ACTACTATCC TCCCTTCAGT TTCCCTTTTT CTGCCTTTTT CGGTGACGGA 3051 AATACGCTTC AGAGACCCTA AAGGGAAATC CATGCCATAA CAGGAAAGTA 3101 ACATCCCAAT GCGGACTATA CCACCCCACC ACACTCCTAC CAATAACGGT 3151 AACTATTCTA TGTTTTCTTA CTCCTATGTC TATTCATCTT TCATCTGACT 3201 ACCTAATACT ATGCAAAAAT GTAAAATCAT CACACAAAAC ATAAACAATC 3251 AAAATCAGCC ATTTCCGCAC CTTTTCCTCT GTCCACTTTC AACCGTCCCT 3301 CCAAATGTAA AATGGCCTAT CGGAATACAT TTTCTACATC CTAACTACTA 3351 TAAAACAACC TTTAGACTTA CGTTTGCTAC TCTCATGGTC TCAATACTGC 3401 CGCCGACATT CTGTCCCACA TACTAAATCT CTTCCCGTCA TTATCGCCCG 3451 CATCCGGTGC CGTAAATGCA AAACAAATAC CATCTATGTC TTCCACACCA 3501 TCATTTTACT ATGCCTGCCA CCATCCATTT GTCTTTTGCA CCATATCTTC 3551 ATAACCTGTC ACCTTGAAAC TACCTCTGCA TGCCACCTAC CGACCAACTT 3601 TCATGTTCTG TTTCGACCTA CCTCTTGTAA ATGACAAATC ACCTTTTTCA 3651 TCGTATGCAC CTTATTCTCC ACATCACAAT GCACTATTGC TTTTGCTTTT 3701 TCACCTGTCA TATCCTATTG CTATTAGATG AAATATAATA AAAATTGTCC 3751 TCCACCCATA ACACCTCTCA CTCCCACCTA CTGAACATGT CTGGACCCTG 3801 CCCTCATATC ACCTGCGTTT CCGTTAAACT ATCAGATTGC AGCACCTGAG 3851 TTTCGCGTAT GGTCACCCAC TACACTACTC GGTCAGGCTC TTACCAGCTT 3901 AACTACAGTT GATCGGACGG GAAACGGTGC TTTCTGGTAG ATATGGCCGC 3951 AACCTTATTT CTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT CTAGTTTCTT 4001 GGCTTCCTAT GCTAAATCCC ATAACTAACC TACCATTCGA TGAATTCGAT 4051 TTGTTTAAAC TTGGGGATCT ACGTATGGTC ATTTCTTCTT CAGATTCCCT 4101 CATGGAGAAA GTGCGGCAGA TGTATATGAC AGAGTCGCCA GTTTCCAAGA 4151 GACTTTATTC AGGCACTTCC ATGATAGGCA AGAGAGAAGA CCCAGAGATG 4201 TTGTTGTCCT AGTTACACAT GGTATTTATT CCAGAGTATT CCTGATGAAA 4251 TGGTTTAGAT GGACATACGA AGAGTTTGAA TCGTTTACCA ATGTTCCTAA 4301 CGGGAGCGTA ATGGTGATGG AACTGGACGA ATCCATCAAT AGATACGTCC 4351 TGAGGACCGT GCTACCCAAA TGGACTGATT GTGAGGGAGA CCTAACTACA 4401 TAGTGTTTAA AGATTACGGA TATTTAACTT ACTTAGAATA ATGCCATTTT 4451 TTTGAGTTAT AATAATCCTA CGTTAGTGTG AGCGGGATTT AAACTGTGAG 4501 GACCTTAATA CATTCAGACA CTTCTGCGGT ATCACCCTAC TTATTCCCTT 4551 CGAGATTATA TCTAGGAACC CATCAGGTTG GTGGAAGATT ACCCGTTCTA 4601 AGACTTTTCA GCTTCCTCTA TTGATGTTAC ACCTGGACAC CCCTTTTCTG 4651 GCATCCAGTT TTTAATCTTC AGTGGCATGT GAGATTCTCC GAAATTAATT 4701 AAAGCAATCA CACAATTCTC TCGGATACCA CCTCGGTTGA AACTGACAGG 4751 TGGTTTGTTA CGCATGCTAA TGCAAAGGAG CCTATATACC TTTGGCTCGG 4801 CTGCTGTAAC AGGGAATATA AAGGGCAGCA TAATTTAGGA GTTTAGTGAA 4851 CTTGCAACAT TTACTATTTT CCCTTCTTAC GTAAATATTT TTCTTTTTAA 4901 TTCTAAATCA ATCTTTTTCA ATTTTTTGTT TGTATTCTTT TCTTGCTTAA 4951 ATCTATAACT ACAAAAAACA CATACAGCTC GAGGCTAGCG GATCCGCGGC 5001 CGCGGGAATT CGATTTGATA TCTTCGATCA AAAATCATCG CTTCGCTGAT 5051 TAATTACCCC AGAAATAAGG CTAAAAAACT AATCGCATTA TCATCCTATG 5101 GTTGTTAATT TGATTCGTTC ATTTGAAGGT TTGTGGGGCC AGGTTACTGC 5151 CAATTTTTCC TCTTCATAAC CATAAAAGCT AGTATTGTAG AATCTTTATT 5201 GTTCGGAGCA GTGCGGCGCG AGGCACATCT GCGTTTCAGG AACGCGACCG 5251 GTGAAGACGA GGACGCACGG AGGAGAGTCT TCCTTCGGAG GGCTGTCACC 5301 CGCTCGGCGG CTTCTAATCC GTACTTCAAT ATAGCAATGA GCAGTTAAGC 5351 GTATTACTGA AAGTTCCAAA GAGAAGGTTT TTTTAGGCTA ATCGACCTCG 5401 AGCAGATCCG CCAGGCGTGT ATATAGCGTG GATGGCCAGG CAACTTTAGT 5451 GCTGACACAT ACAGGCATAT ATATATGTGT GCGACGACAC ATGATCATAT 5501 GGCATGCATG TGCTCTGTAT GTATATAAAA CTCTTGTTTT CTTCTTTTCT 5551 CTAAATATTC TTTCCTTATA CATTAGGTCC TTTGTAGCAT AAATTACTAT 5601 ACTTCTATAG ACACGCAAAC ACAAATACAC ACACTAAATT ACCGGATCAA


71

5651 TTCGAGCTCG ATGTCTTGCC TTATTCCTGA TGTCTTGCCT TATTCCTGAG 5701 AATTTAAGGA ACCCCAAAAA GGTTCACGAA AATAGATTGC CTACTAGGGC 5751 TTACTACTAT GATCAGGATA TTTTCGAATC TCTCAATGGG CCTTGGGCTT 5801 TTGCGTTGTT TGATGCACCT CTTGACGCTC CGGATGCTAA GAATTTAGAC 5851 TGGGAAACGG CAAAGAAATG GAGCACCATT TCTGTGCCAT CCCATTGGGA 5901 ACTTCAGGAA GACTGGAAGT ACGGTAAACC AATTTACACG AACGTACAGT 5951 ACCCTATCCC AATCGACATC CCAAATCCTC CCACTGTAAA TCCTACTGGT 6001 GTTTATGCTA GAACTTTTGA ATTAGATTCG AAATCGATTG AGTCGTTCGA 6051 GCACAGATTG AGATTTGAGG GTGTGGACAA TTGTTACGAG CTTTATGTTA 6101 ATGGTCAATA TGTGGGTTTC AATAAGGGGT CCCGTAACGG GGCTGAATTT 6151 GATATCCAAA AGTACGTTTC TGAGGGCGAA AACTTAGTGG TCGTCAAGGT 6201 TTTCAAGTGG TCCGATTCCA CTTATATCGA GGACCAAGAT CAATGGTGGC 6251 TCTCTGGTAT TTACAGAGAC GTTTCTTTAC TAAAATTGCC TAAGAAGGCC 6301 CATATTGAAG ACGTTAGGGT CACTACAACT TTTGTGGACT CTCAGTATCA 6351 GGATGCAGAG CTTTCTGTGA AAGTTGATGT CCAGGGTTCT TCTTATGATC 6401 ACATCAATTT CACACTTTAC GAACCTGAAG ATGGATCTAA AGTTTACGAT 6451 GCAAGCTCTT TGTTGAACGA GGAGAATGGG AACACGACTT TTTCAACTAA 6501 AGAATTTATT TCCTTCTCCA CCAAAAAGAA CGAAGAAACA GCTTTCAAGA 6551 TCAACGTCAA GGCCCCAGAA CATTGGACCG CAGAAAATCC TACTTTGTAC 6601 AAGTACCAGT TGGATTTAAT TGGATCTGAT GGCAGTGTGA TTCAATCTAT 6651 TAAGCACCAT GTTGGTTTCA GACAAGTGGA GTTGAAGGAC GGTAACATTA 6701 CTGTTAATGG CAAAGACATT CTCTTTAGAG GTGTCAACAG ACATGATCAC 6751 CATCCAAGGT TCGGTAGAGC TGTGCCATTA GATTTTGTTG TTAGGGACTT 6801 GATTCTAATG AAGAAGTTTA ACATCAATGC TGTTCGTAAC TCGCATTATC 6851 CAAACCATCC TAAGGTGTAT GACCTCTTCG ATAAGCTGGG CTTCTGGGTC 6901 ATTGACGAGG CAGATCTTGA AACTCATGGT GTTCAAGAGC CATTTAATCG 6951 TCATACGAAC TTGGAGGCTG AATATCCAGA TACTAAAAAT AAACTCTACG 7001 ATGTTAATGC CCATTACTTA TCAGATAATC CAGAGTACGA GGTCGCGTAC 7051 TTAGACAGAG CTTCCCAACT TGTCCTAAGA GATGTCAATC ATCCTTCGAT 7101 TATTATCTGG TCCTTGGGTA ACGAAGCTTG TTATGGCAGA AACCACAAAG 7151 CCATGTACAA GTTAATTAAA CAATTGGATC CTACCAGACT TGTGCATTAT 7201 GAGGGTGACT TGAACGCTTT GAGTGCAGAT ATCTTTAGTT TCATGTACCC 7251 AACATTTGAA ATTATGGAAA GGTGGAGGAA GAACCACACT GATGAAAATG 7301 GTAAGTTTGA AAAGCCTTTG ATCTTGTGTG AGTACGGCCA TGCAATGGGT 7351 AACGGTCCTG GCTCTTTGAA AGAATATCAA GAGTTGTTCT ACAAGGAGAA 7401 GTTTTACCAA GGTGGCTTTA TCTGGGAATG GGCAAATCAC GGTATTGAAT 7451 TCGAAGATGT TAGTACTGCA GATGGTAAGT TGCATAAAGC TTATGCTTAT 7501 GGTGGTGACT TTAAGGAAGA GGTTCATGAC GGAGTGTTCA TCATGGATGG 7551 TTTGTGTAAC AGTGAGCATA ATCCTACTCC GGGCCTTGTA GAGTATAAGA 7601 AGGTTATTGA ACCCGTTCAT ATTAAAATTG CGCACGGATC TGTAACAATC 7651 ACAAATAAGC ACGACTTCAT TACGACAGAC CACTTATTGT TTATCGACAA 7701 GGACACGGGA AAGACAATCG ACGTTCCATC TTTAAAGCCA GAAGAATCTG 7751 TTACTATTCC TTCTGATACA ACTTATGTTG TTGCCGTGTT GAAAGATGAT 7801 GCTGGTGTTC TAAAGGCAGG TCATGAAATT GCCTGGGGCC AAGCTGAACT 7851 TCCATTGAAG GTACCCGATT TTGTTACAGA GACAGCAGAA AAAGCTGCGA 7901 AGATCAACGA CGGTAAACGT TATGTCTCAG TTGAATCCAG TGGATTGCAT 7951 TTTATCTTGG ACAAATTGTT GGGTAAAATT GAAAGCCTAA AGGTCAAGGG 8001 TAAGGAAATT TCCAGCAAGT TTGAGGGTTC TTCAATCACT TTCTGGAGAC 8051 CTCCAACGAA TAATGATGAA CCTAGGGACT TTAAGAACTG GAAGAAGTAC 8101 AATATTGATT TAATGAAGCA AAACATCCAT GGAGTGAGTG TCGAAAAAGG 8151 TTCTAATGGT TCTCTAGCTG TAGTCACGGT TAACTCTCGT ATATCCCCAG 8201 TTGTATTTTA CTATGGGTTT GAGACTGTTC AGAAGTACAC GATCTTTGCT 8251 AACAAAATAA ACTTGAACAC TTCTATGAAG CTTACTGGCG AATATCAGCC 8301 TCCTGATTTC CCAAGAGTTG GGTACGAATT CTGGCTAGGA GATAGTTATG 8351 AATCATTTGA ATGGTTAGGT CGCGGGCCCG GCGAATCATA TCCGGATAAG 8401 AAGGAATCTC AAAGATTCGG TCTTTACGAT TCCAAAGATG TAGAGGAATT 8451 CGTATATGAC TATCCTCAAG AAAATGGAAA TCATACAGAT ACCCACTTTT 8501 TGAACATCAA ATTTGAAGGT GCAGGAAAAC TATCGATCTT CCAAAAGGAG


72

8551 AAGCCATTTA ACTTCAAGAT TTCAGACGAA TACGGGGTTG ATGAAGCTGC 8601 CCACGCTTGT GACGTTAAAA GATACGGCAG ACACTATCTA AGGTTGGACC 8651 ATGCAATCCA TGGTGTTGGT AGCGAAGCAT GCGGACCTGC TGTTCTGGAC 8701 CAGTACAGAT TGAAAGCTCA AGATTTCAAC TTTGAGTTTG ATCTCGCTTT 8751 TGAATAAATC ACTAGTGAAT TCGCGGCCGC CGTCGACAAA TCACTAGTGA 8801 ATTCGAGCTC GGTACCGTTA ACTCAGGTCT CTCTGCTGCC GGAAATGCTC 8851 TCTGTTCAAA AAGCTTTTAC ACTCTTGACC AGCGCACTCC GTCACCATAC 8901 CATAGCACTC TTTGAGTTTC CTCTAATCAG GTTCCACCAA ACAGATACCC 8951 CGGTGTTTCA CGGAATGGTA CGTTTGATAT CGCTGATTTG AGAGGAGGTT 9001 ACACTTGAAG AATCACAGTC TTGCGACCGG CTATTCAACA AGGCATTCCC 9051 CCAAGTTTGA ATTCTTTGAA ATAGATTGCT ATTAGCTAGT AATCCACCAA 9101 ATCCTTCGCT GCTCACCAAT GGAATCGCAA GATGCCCACG ATGAGACTGT 9151 TCAGGTTAAA CGCAAAAGAA ACACACTCTG GGAATTTCTT CCCAAATTGT 9201 ATCTCTCAAT ACGCATCAAC CCATGTCAAT TAAACACGCT GTATAGAGAC 9251 TAGGCAGATC TGACGATCAC CTAGCGACTC TCTCCACCGT TTGACGAGGC 9301 CATTTACAAA AACATAACGA ACGACAAGCC TACTCGAATT CGTTTCCAAA 9351 CTCTTTTCGA ACTTGTCTTC AACTGCTTTC GCATGAAGTA CCTCCCAACT 9401 ACTTTTCCTC ACACTTGTAC TCCATGACTA AACCCCCCCT CCCATTACAA 9451 ACTAAAATCT TACTTTTATT TTCTTTTGCC CTCTCTGTCG CTCTGCCTTA 9501 ACTACGTATT TCTCGCCGAG AAAAACTTCA ATTTAAGCTA TTCTCCAAAA 9551 ATCTTAGCGT ATATTTTTTT TCCAAAGTGA CAGGTGCCCC GGGTACAGCT 9601 GCATTGATAT CTT


73

5.4. Desenho esquemático da construção dos vetores pFB’s.

Figura 1 - Etapas da construção dos vetores pFB's mostrando os vetores intermediários e alguns sítios de restrição.


74

5.5. Mapa físico dos vetores utilizados neste trabalho.

Figura 2 - Mapa físico do vetor pYX212-GapN que possui o promotor TPI para expressão heteróloga em S. cerevisiae.

Figura 3 - Mapa físico do vetor pGEM-T Easy (Promega)


75

Figura 4 - Mapa físico do vetor pM4296 (HO-poly-HO)

Figura 5 - Mapa físico do vetor pUC19 e destaque do sítio de clonagem (polylinker region).


76

Figura 6 - Mapa físico do vetor pMR4 (Rubio-Teixeira et al, 1998).

Figura 7 - Mapa físico do vetor pMR11 (Rubio-Teixeira et al, 1998).


77

Figura 8 - Mapa físico do vetor pUG6 (Guldener et al, 1996).


78

5.6. Informações complementares

Figura 9 - Amplificação dos fragmentos rDNA1, rDNA2, TPI, CYCGAL-LAC4 e CYCGAL-LAC12 para construção

dos vetores pFB's.

Figura 10 - Etapas da construção do vetor pBASE.


79

Figura 11 - Etapas da construção do vetor pBASE-rDNA1.

Figura 12 - Etapas da construção do vetor pBASE-TPI.


80

Figura 13 - Etapas da construção do vetor pFB.

Figura 14 – Etapas da construção do vetor pFB-LAC4.


81

Figura 15 - Etapas da construção do vetor pFB-LAC12.

Programa de Pós-Graduação em Genética · 2016-06-21 · Vetores plasmidiais de clonagem e...

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