UNIVERSIDADE DO MINHO

Cintica de crescimento de Saccharomyces cerevisiaeLaboratrios de BioprocessosCatarina Lobo, 52485; Filipa Caldeira, 56442; Maura Guimares. 53823; Pedro Rocha, 53711 Data realizao da actividade: 1/04/2011 e 8/04/2011 Data de entrega do relatrio: 29/04/2011

Este estudo baseou-se na avaliao da cintica de crescimento de Saccharomyces cerevisiae, em sistema fechado, tendo por base a construo da curva de crescimento e a determinao dos seus parmetros cinticos. Para tal, recorreu-se ao mtodo de espectofotometria para, a partir das absorvncias registadas, determinar os parmetros cinticos. Similarmente, os mtodos de HPLC e DNS permitiram aferir a concentrao dos acares redutores, e consequentemente estimar a produtividade de etanol e o rendimento em biomassa e produto. O nosso estudo demonstrou que o clculo da taxa especifica de crescimento mais exacto quando feito atravs da curva de crescimento expressa em n clulas/mL (0,516h-1). O tempo de duplicao, calculado pelas curvas de crescimento expressas em clulas/mL e [celular] (g/L), mostra-se prximo entre si (1,34h-1 e 1,06h-1) mas longe do valor esperado (2h-1).

2

ndice

INTRODUO CRESCIMENTO MICROBIANO TAXA ESPECIFICA DE CRESCIMENTO: TEMPO DE DUPLICAO: RENDIMENTO DE SUBSTRATO EM BIOMASSA: RENDIMENTO DE SUBSTRATO EM PRODUTOS (ETANOL): PRODUTIVIDADE EM ETANOL PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL CURVA DE CRESCIMENTO MICROBIANO DETERMINAO DA CONCENTRAO EM BIOMASSA APRESENTAO DE RESULTADOS CURVA DE CRESCIMENTO CELULAR TAXA ESPECFICA DE CRESCIMENTO EXPONENCIAL E TEMPO DE DUPLICAO DAS CLULAS CURVA DA CONCENTRAO DE SUBSTRATO AO LONGO DO TEMPO: RENDIMENTOS DE SUBSTRATO EM BIOMASSA E PRODUTO: PRODUTIVIDADE EM ETANOL: DISCUSSO E CONCLUSO ANEXOS EXEMPLOS DE CLCULOS BIBLIOGRAFIA

4 4 7 7 8 8 8 10 10 11 12 12 13 15 16 16 18 21 25 27

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IntroduoNa produo de alimentos recorre-se frequentemente ao uso de leveduras, nomeadamente na produo de po. Contudo o potencial destes microrganismos no se resume apenas a esta indstria. Por exemplo, devido aos problemas energticos que a nossa sociedade vem a enfrentar, tm-se investigado o uso de leveduras na produo de etanol, composto este que ser utilizado como combustvel .[1] De todas as leveduras disponveis, a mais utilizada a Saccharomyces cerevisiae, existem uma vez que a fcil ter manipul-la em conta geneticamente e o seu cultivo em laboratrio acarreta baixos custos. Laboratorialmente vrios aspectos relativamente ao meio em que se ir inocular as leveduras. Os meios de cultura so muito variados, contudo para o cultivo de leveduras o meio YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) o mais indicado [2]

Crescimento Microbiano

importante

esclarecer

que,

em microbiologia, o

termo

crescimento relaciona-se com o crescimento populacional e no com o crescimento celular de um s individuo. Isto acontece, porque os microrganismos funcionam em colnias e no tanto como seres individuais. O crescimento populacional uma consequncia de sucessivas divises celulares dos individuos constituintes. [3] O crescimento microbiano influenciado por diferentes factores, como os fsicos, relacionados com a temperatura, pH, presso osmtica, etc, ou os factores qumicos, como a concentrao de nutrientes, de gua, oxignio, e outros constituintes [4]. 4

Outro fator muito importante no crescimento microbiano est relacionado com o meio de cultura escolhido. Este deve permitir determinadas condies como: - um inculo vivel, - uma fonte de energia, - os nutrientes necessrios populao em estudo, - a no existncia de factores inibidores do crescimento populacional, - a preservao dos factores fsico-qumicos favorveis. Quando estas condies so asseguradas, a partir de um tempo de latncia caracterstico, a densidade populacional cresce de forma exponencial, e com a manuteno destas, possvel observar um crescimento equilibrado, levando a uma taxa caracterstica de crescimento constante. [3] No entanto, quando o crescimento microbiano providenciado num sistema fechado, esta taxa de crescimento apresenta um comportamento similar ao representado na figura 1.

Figura Figura1: Grfico representativo da curva de crescimento microbiano em sistema fechado. [1]

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Na figura, vsivel a diviso da curva de crescimento em 6 fases diferentes: - fase de latncia: durante esta fase, os microrganismos adaptam-se s novas condioes do meio, estando ainda imaturos e no capazes de se dividir; - fase de acelerao: depois da adaptao, o crescismento microbiano comea a aumentar; - fase exponencial: nesta fase, o crescimento exponencial, e a duraao desta fase depende sobretudo da concentrao dos nutrientes fundamentais fase de colnia. O crescimento fase, nesta fase corresponde equao: desacelerao: esta consecutiva exponencial, resulta da diminuio da concentrao dos nutrientes assim como a acumulao de metabolitos residuais provenientes da actividade celular que tm actividade inibidora de crescimento; - fase estacionria: acontece com o esgotamento de vrios nutrientes essenciais, existindo tanto clulas a dividir-se como clulas em fase de morte; - fase de declnio: ocorre quando o nmero de clulas mortas excede o nmero de clulas em diviso. [3,4]

O controlo do crescimento microbiano importante, uma vez que permite aferir a reaco celular quando as clulas so expostas a diferentes condies ambientais ou diferentes meios de cultura. [3] Por outro lado, permite a formao de colnias sustentveis de individuos, que so utilizados em estudos a outros nveis, como a investigao na rea alimentar ou na rea farmacutica.

6

Para conta:

analisar

a

cintica

de

crescimento

microbiano,

principalmente na fase exponencial, existem vrios aspectos a ter em

Taxa especifica de crescimento: influenciada pelas condies ambientais e permite prever a evoluo do crescimento microbiano. A velocidade de crescimento igual concentrao de clulas em cada instante: (Equaes 1 e 2) Integrando

O parmetro representa a taxa especfica de crescimento. [5]

Tempo de duplicao: definido como o tempo necessrio para que uma clula se divida. [6] (Equao 3)

O objectivo de uma determinada indstria pode ser fazer variar significativamente o ambiente em que se faz crescer as leveduras de forma a que o metabolismo ocorra na direo desejada. Por exemplo na formao de fermento de padeiro o objectivo ser converter substrato em biomassa, e quando se utiliza o fermento na panificao o objectivo passa a ser a converso de substrato nos produtos, nomeadamente o CO2.

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O clculo dos rendimentos de substrato em biomassa e produto so tambm muito importantes na anlise do crescimento celular.

Rendimento de substrato em biomassa: dado pela quantidade de biomassa obtida por unidade de massa de substrato consumido. (Equao 4)

[

]]

Rendimento de substrato em produtos (Etanol): dado pela quantidade de produto obtido por unidade de massa de substrato consumido. (Equao 5)

[

]

[

]

Em ambos os rendimentos, ART refere-se aos acares redutores totais, determinados pelo mtodo DNS, apresentado em anexo.

Produtividade em etanol: Traduz a produo de etanol que obtida em determinado processo batch. (Equao 6) [ ]

8

Nesta actividade laboratorial efectuou-se o clculo de todos os parmetros cinticos explicados. Traou-se a curva de crescimento microbiano assim como de consumo de substrato e de variao do pH.

9

Procedimento experimentalCurva de crescimento microbiano Numa parte inicial, transferiu-se assepticamente a subcultura (previamente preparada) para 180 mL de meio fresco, contendo uma concentrao de 20 g/L de glucose. Retirou-se assepticamente uma amostra, relativa ao tempo zero, de 3 mL de cultura e efectuou-se a medida do pH; a leitura da absorvncia a 660 nm para determinao da concentrao de clulas; a anlise da concentrao dos acares redutores pelo mtodo de DNS (aps centrifugao da amostra e filtrao do sobrenadante) e por fim, quantificau-se a glucose e etanol usando o mtodo HPLC. Aps retirada a amostra inicial, o meio em estudo foi colocado numa incubadora temperatura 30C. Todo o processo de anlise das amostras foi repetido para os diferentes tempos: 1,5h; 4,5h; 5h; 6,5h; 7,5h e 8,5h.

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Determinao da concentrao em biomassa

Calibrao da biomassa por peso seco Pesaram-se 5 membranas estreis. Seguidamente, foram retiradas trs amostras de 20 mL de um meio do tipo padro; o meio foi fornecido j preparado. Recorreu-se a um sistema de filtrao, com o objectivo de filtrar individualmente as trs diferentes amostras, lavando a biomassa retida no filtro com 15 mL de gua destilada. De seguida, prepararam-se dois brancos, filtrando 20 mL de gua destilada de cada vez. Colocaram-se as membranas sobre uma folha de alumnio, dentro de uma placa de Petri e procedeu-se secagem numa estufa a 80C at peso constante. Por fim, pesaram-se as membranas.

Calibrao da biomassa por contagem de clulas Com a suspenso de clulas procedeu-se a uma leitura preliminar no espectofotmetro para conferir a necessidade de efectuar diluies das vrias amostras, uma vez que na construo da curva padro os valores das densidades pticas a 620 nm variam entre 0,2 e 0,8. Assim, aps efectuadas as respectivas diluies, leu-se o valor de absorvncia e efectuou-se a contagem de clulas recorrendo a uma cmara de Neubaeur.

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Apresentao de resultadosCurva de crescimento celular Neste ponto, so apresentados dois grficos (figuras 2 e 3) decorrentes dos estudos do crescimento cellular. Estes dois grficos diferem apenas nas unidades do eixo das ordenadas, sendo um apresentado em concentrao celular (g/L) e o outro em clulas/mL. No eixo das abcissas figura o tempo de incubao, em horas.1.2 1 [celular] (g/L) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 tempo (h) 6 8 10

Figura 2: Curva de crescimento celular, em sistema fechado, com unidades em ordenadas em peso seco (g/L).

2.50E+07 2.00E+07 n clulas/mL 1.50E+07 1.00E+07 5.00E+06 0.00E+00 0 2 4 6 tempo (h) 8 10

Figura 3: Curva de crescimento celular, em sistema fechado, com unidades em ordenadas em nmero de clulas por mL.

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Taxa especfica de crescimento exponencial e tempo de duplicao das clulas

Calculado atravs da curva n clulas/mL vs tempo: Este clculo tem por base a equao 2 do presente relatrio. Para se obter o parmetro X0, ajustou-se uma linha de tendncia exponencial aos dados de crescimento celular referentes apenas fase exponencial, uma vez que nesta fase que se avalia a cintica de crescimento.[7] O ajuste exponencial est representado no grfico da figura 4.

2.50E+07 2.00E+07 n clulas /mL 1.50E+07 1.00E+07 5.00E+06 0.00E+00 0 2 4 tempo (h)Figura 4: Representao do ajustamento fase exponencial da curva de crescimento, assim como da sua equao caracteristica.

y = 210718e0.516x R = 0.9745

6

8

10

Em que o valor de X0 advm da equao retirada do grfico da figura 4: 2,1*105 clulas/mL; assim como = 0,516 h-1. De acordo com a equao 3, o tempo de duplicao de 1,34 h-1.

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Calculado atravs da curva [celular] (g/L) vs tempo: O procedimento similar ao atrs descrito mas tendo em conta a curva do grfico da figura 5.1.2 1 [celular] (g/L) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 2 4 tempo (h)Figura 5: Representao do ajustamento fase exponencial da curva de crescimento, assim como da sua equao caracteristica.

y = 0.004e0.655x R = 0.9874

6

8

10

Assim, X0 = 0,004 g/L e = 0,655 h-1, Consequentemente, o tempo de duplicao de 1,06h-1.

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Curva da concentrao de substrato ao longo do tempo: A curva de consumo de substrato (glucose) foi traada tendo em considerao os dados obtidos da concentrao de glucose, pelo mtodo HPLC, e os dados obtidos da concentrao de acares redutores, pelo mtodo DNS. Foram analisadas 3 amostras, mostrando apenas a alterao da concentrao de glucose ao fim de 5; 7,5 e 8,5 horas de incubao.20 18 16 [glucose] (g/L) 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 tempo (h) 8 10 HPLC DNS

Figura 5: Curva de consumo de substrato ao longo do tempo de incubao: dados obtidos pelos mtodos HPLC e DNS.

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Rendimentos de substrato em biomassa e produto: Os valores referentes ao rendimento de substrato em biomassa e em produto encontram-se na tabela 1.Tabela 1: Valores de rendimento de substrato em biomassa e em produto.

rendimento de substrato em biomassa (gclulas/gaucares red) em produto (getanol/gaucaresred) Produtividade em etanol:

0,06223 0,17611

O valor da produtividade em etanol, obtido atravs da equao 6, foi de 0,336 (g/L h). A curva de variao da concentrao de etanol ao longo do tempo de incubao encontra-se representada na figura 6.3 2.5 [etanol] (g/L) 2 1.5 1 0.5 0 0 2 4 tempo (h) 6 8 10

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Curva de variao do pH: A curva de variao do pH do meio de reaco ao longo do tempo de incubao apresenta-se na figura 7.8 7 6 5 pH 4 3 2 1 0 0 2 4 tempo (h)Figura 7: Curva de variao do pH externo ao longo do tempo de incubao, em sistema fechado.

6

8

10

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Discusso e conclusoDe acordo com as figuras 2 e 3 apresentadas, durante o tempo de incubao analisado (8,5 horas) possivel distinguir 2 fases de crescimento (visveis nas celular: duas fase de latncia se e fase exponencial o tempo de curvas). nao No foi consegue para

observar a fase estacionria nem a fase de decaimento porque incubao analisado suficiente recolher dados referentes s fases mencionadas. Os valores da taxa especfica de crescimento calculados atravs dos dados de crescimento celular presentes nas equaes contidas nas figuras 4 e 5 deveriam ser semelhantes, uma vez que apenas se altera as grandezas dos dados utilizados, mas no as condioes de reao. Neste caso, os valores diferem de aproximadamente 0,1 h - 1 . Esta diferena pode ser facilmente explicada pelo erro associado a cada valor, proveniente do ajuste exponencial antecedente. Comparando com o valor 0,5 h - 1 , referido na literatura [8] conclui-se que os valores obtidos no se encontram muito longe deste, significando que os mtodos utilizados para recolher e analisar os dados de crescimento celular foram apropriados e precisos. O tempo de duplicao calculado, tambm ele pelas duas mesmas vias que a taxa especfica de crescimento, encontra -se prximo entre si (1,34 h -1 e 1,06 h - 1 ), demonstrando preciso, mas diferente do valor esperado, 2 h - 1 . [literature onde fui buscar isto]

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A curva de concentrao de substrato ao longo do tempo evidenca um decrscimo da concentrao de glucose, o que vai de encontro ao esperado, uma vez que a glucose est a ser consumida pelas levedura Saccharomyces cerevisiae, para que esta cresca. Ambas as curvas presentes na figura 5 decrescem ao longo do tempo mas nota-se que os valores retirados da anlise concentrao de glucose feita pelo mtodo HPLC so ligeiramente superiores aos valores obtidos pelo mtodo DNS. A razo desta diferena advm do facto de o mtodo de anlise HPLC quantificar a presena de acares redutores, contendo glucose estes, presente glucose, no frutose Assim e outros componentes, analisar a enquanto que o mtodo DNS analisa apenas a quantidade de meio. sen do, para quantidade de substrato presente no meio ao longo do tempo de incubao mais exato o uso do mtodo DNS. A figura 6 mostra o aumento progressivo da concentrao de etanol medida que as clulas crescem, chegando a um valor mximo de produo de etanol (2,85 g/L). Comparativamente a um outro estudo da produtividade de etanol pela levedura Saccharomyces cerevisiae [7], este valor inferior (aproximadamente 4 g/L aps 8 horas de incubao), pelo que se considera que a produtividade obtida seja inferior ao normal. A curva de variao do pH ao longo do tempo de incubao mostra que o valor de pH variou entre valores prximos de 7 e prximos de 5. O esperado seria variar apenas entre 5 e 6 mas no se considera que esta diferena seja significativa ou que interfira no significado ou preciso dos restantes valores analisados. A produtividade em etanol foi menor do que aquela esperada segundo a bibliografia consultada [9], facto que pode ser explicado com o relativo curto espao de tempo em que o nosso estudo decorreu. Considerando que o valor obtido resultado de um 19

depsito dos resduos, neste caso o etanol, que mais visivel na fase de desacelerao, fase que, como anteriormente dito, no foi verificada na nossa curva de crescimento. Se considerarmos a equao estequiomtrica que relaciona a glucose com o etanol:

Temos que para 180 g de glucose devero dar origem a 50 de etanol; numa razo de 3 simples, para 18,28 g/L de glucose teremos 5,078 g/L de etanol. Ora o nosso valor de concentrao de etanol foi de cerca 2,85g/L. Mas para o intervalo de tempo considerado temos que nem toda a glucose foi consumida. Como [glucose] = 12,0264 g/L que d origem a [etanol] = 2,2463 g/L, temos que o valor realmente esperado para a concentrao de etanol era de apenas 3,4141 g/L. Como vsivel, este valor bem mais prximo do obtido, e a diferena com o inicialmente esperado pode ser explicada com a noo que o rendimento de uma reaco qumica real nunca ser de 1, e tambm com o facto de, mais uma vez, a reaco no poder ser considerada concluda uma vez que o consumo de glucose no foi total. O mesmo raciocnio pode ser tido em conta quando analisamos o rendimento em biomassa.

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AnexosNas calibraao seguintes figuras apresentam-se as curvas de da biomassa, construidas a partir dos valores

obtidos na leitura de contagem de clulas e na pesagem dos filtros, assim como da leitura da absorvncia correspondente a cada amostra.

9.00E+06 8.00E+06 (n clulas/mL) 7.00E+06 6.00E+06 5.00E+06 4.00E+06 3.00E+06 2.00E+06 1.00E+06 0.00E+00 0 0.2 0.4 AbsFigura 7: Curva de calibrao da biomassa por contagem de clulas

0.6

0.8

1

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 Abs 0.6 0.8 1

Figura 8: Curva de calibrao da biomassa pelo peso seco.

peso seco (g/L)

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A tabela seguinte revela a quantidade de acares redutores nas amostras retiradas ao longo do tempo de incubao, bem como a absorvncia registada. A concentrao em acares redutores foi calculada atravs da recta de calibrao apresentada de seguida. O mtodo de anlise foi DNS.Tabela2: Valores de absorvncia e respectiva concentrao de acares redutores das amostras estudadas, retiradas ao longo do tempo.

amostra

t3(5h)

t5(7,5h)

t6(8,5h)

[glucose] 18,279 13,751 6,252 (g/L) [etanol] 0,607 1,680 2,854 (g/L) A tabela 3 contm as concentraes das 3 amostras analisadas pelo mtodo HPLC, exprimidas em teor de glucose e etanol. As 3 amostras analisadas foram retiradas ao fim de 5h; 7,5h e 8,5h de incubao.

Equao da recta : y = (0,27180,1937)x - (0,01080,0809)

Tabela 3: Concentraes das 3 amostras em glucose e etanol

tempo 0 1 2 3 4 5 6

Abs 1 0,343 0,334 0,59 0,765 0,373 0,461 0,45

Abs 2 0,318 0,314 0,609 0,787 0,348 0,461 0,497

Abs mdia 0,331 0,324 0,599 0,776 0,361 0,461 0,474

[acares redutores] (g/L) 25,114 24,636 22,454 17,369 20,491 17,358 8,909

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As figuras 9 e 10 apresentam as curvas de calibrao usadas para calcular o teor em glucose e etanol apresentado na tabela 3.

7000 6000 5000

rea (mV*s)

4000 3000 2000 1000 0 0.000

5.000

10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 [etanol] (g/L)

Figura 9: Curva de calibrao do etanol

7000 6000 5000

rea (mV*s)

4000 3000 2000 1000 0 0.000 5.000 10.000 [glucose] (g/L) 15.000

Figura 10: Curva de calibrao do glucose.

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A tabela seguinte resume as equaes de todas as rectas de calibrao usadas nesta actividade laboratorial, bem como os erros associados.

Tabela 4: Equaes das rectas de calibrao e respectivos erros associados

curva Etanol glucose Peso seco N clulas

equao da recta A=245,2*[etanol]+2,0458 A=585,73*[glucose]+263,56 PS=0,6797*Abs-0,0625 nC=9E+06*Abs+519846

erro no declive 12,31 74,40

erro na ordenada na origem 143,83 351,11

0,12 1,06E+06

0,064 5,69E+05

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Exemplos de clculosExtrapolao Todas calibrao. Exemplo: Utilizando a equao da recta da curva de calibrao da biomassa por contagem de clulas, temos: Abs=0.056 (valor da amostra recolhida) N Clulas (clulas/mL) = 9E+06Abs + 519846 (=)N Clulas (clulas/mL) =9E+06*0,056+519846 (=)N Clulas (clulas/mL) 1,02E+06 (clulas/mL) Clculo do tempo de duplicao Calculou-se o tempo de duplicao a partir da seguinte igualdade: as dos valores de concentraoo ao pelas do curvas de calibrao concentraes apresentadas longo relatrio foram calculadas a partir das respectivas curvas de

Exemplo: =0,516

(=)td=1,343

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Clculo da produtividade de etanol A produtividade de etanol foi obtida da seguinte forma: Produtividadeetanol=C[etanol]etanol/tempo incubao (=)Produtividadeetanol= 2,854/8,5= 0,336 (g/L)/h

Clculo do rendimento em biomassa[ ]]

Clculo do rendimento em produto

[

]

[

]

[ [

] ]

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Bibliografia[1] Yan Lin, Shuzo Tanaka, Ethanol fermentation from biomass resources: current state and Prospects, Springer-Verlag, 2005 [2]https://repositorium.sdum.uminho.pt/bitstream/1822/2241/ 1/U1.pdf [3] Schuller, D.(2009), Guia de Laboratorio Laboratorios Integrados de Biologia, Universidade do Minho, Departamento de Biologia, Braga, pg 71 [4] Oliveira, J.R, Crescimento Microbiano, diapositivo 2 [5] http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=233 [6]http://labvirtual.eq.uc.pt/siteJoomla/index.php?option=com_ content&task=view&id=92&Itemid=196 [7] Shafaghat, H, Najafpour, G.D, et al Growth Kinetics and Ethanol Productivity of Saccharomyces cerevisiae PTCC24860 on Various Carbon Sources, 2009. [8]nebm.ist.utl.pt/repositorio/download/1763/8 [9]http://mundodacana.blogspot.com/2010/08/processo-paraobtencao-de-etanol-partir.html

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