Relatório final p.ines
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Ensino de Biologia e Geologia
Princpios de Microbiologia Quinta-feira 11h-13h00
ANTIBITICOS Relatrio P9
RESUMO
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Os antibiticos so substncias qumicas produzidas por
microorganismos que em concentraes muito baixas inibem
selectivamente outros microorganismos. Neste trabalho experimental
testar-se-o os efeitos de alguns antibiticos sobre trs estirpes bacterianas.
Os resultados obtidos permitiram-nos concluir que
OBJECTIVO
O objectivo deste trabalho verificar a susceptibilidade de E.coli, de
Rhizobium e Actinomices aos antibiticos inibidores de sntese proteica.
INTRODUO
As estirpes microbianas frequentemente inibem o crescimento umas
das outras. Para alm de excretarem produtos finais resultantes do
metabolismo como lcoois e cidos, que podem limitar o crescimento de
alguns microorganismos, produzem substncias qumicas mais complexas e
bastante diferentes das restantes, tambm com efeito inibidor do
crescimento: os antibiticos. Os antibiticos so produtos microbianos ou
seus derivados que em concentraes muito baixas matam ou inibem
selectivamente outros microorganismos. Ao contrrio dos desinfectantes e
anti-spticos, que so aplicados a matrias inertes ou nos tecidos externos,
os antibiticos podem ser aplicados internamente.
Alguns antibiticos so produzidos por bactrias como actinomicetas
do gnero Streptomyces e outros por fungos, particularmente estirpes de
Penicillium e Aspergillus.
Os antibiticos constituem um grupo diversificado de compostos que
se podem agrupar em famlias com estrutura qumica semelhante. Assim,
antibiticos do mesmo grupo, normalmente tm tipos de actividade
semelhante e so usados na prtica para fins semelhantes. Em traos gerais
os antibiticos podem dividir-se quanto ao seu modo de aco em trs
grupos: Inibio da sntese da parede celular (penicilina), danificao da
membrana citoplasmtica, inibio da sntese proteica (estreptomicina),
inibio da sntese dos cidos nucleicos, inibio do metabolismo celular.
A sensibilidade dos microorganismos a antibiticos varia bastante. As
bactrias Gram positivas so normalmente mais sensveis a antibiticos do
que as Gram negativas, embora existam antibiticos que s actuem nestas
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ltimas. Um antibitico que actue contra estes dois tipos de bactrias um
antibitico de largo espectro, normalmente mais usado para fins clnicos.
Neste trabalho experimental, para verificar a susceptibilidade de um
microorganismo a antibiticos, utilizou-se o mtodo do disco em placa
(mtodo de difuso). Neste mtodo colocam-se discos de papel de feltro
impregnados com vrios tipos de antibitico, superfcie de um meio onde
foi inoculado o microorganismo que se pretende estudar. Os discos de
antibitico so colocados na superfcie do meio com o auxlio de uma pina
esterilizada. Atravs de um antibiograma possvel avaliar a
susceptibilidade do microorganismo ao antibitico. O microorganismo ir
crescer durante a incubao, mas volta do disco embebido em antibitico
no se observar crescimento caso seja sensvel ao antibitico. O tamanho
da zona de inibio (Halo de inibio) causada pela difuso de um
antibitico no meio, est directamente relacionada com o grau de
susceptibilidade do microorganismo ao antibitico em causa. Quanto maior
for o Halo de inibio maior a susceptibilidade do microorganismo ao
antibitico. O dimetro do halo depende outros factores como a
concentrao inicial de antibitico, a quantidade de inoculo, tempo de
incubao, taxa de difuso do antibitico atravs do Agar, entre outros.
Assim, os antibiticos devem ser incubados nas mesmas condies. Outro
aspecto a ter em conta, o facto de substncias qumicas diferentes
difundirem-se a taxas diferentes podendo ser inactivadas em graus
diferentes pelo meio de cultura. Portanto no se pode analisar o dimetro da
zona de inibio para comparar directamente a eficcia de dois antibiticos
diferentes.
A concentrao mais baixa de um frmaco que impede o crescimento
de um determinado agente denominado por concentrao mnima
inibitria (CMI). Assim, cada disco deve ter uma concentrao especfica
de acordo com o antibitico que possui . A concentrao mais baixa de um
frmaco que destri o agente designa-se por concentrao mnima letal
(CML).
No trabalho experimental realizado, utilizou-se soluo salina para
controlo positivo e utilizaram-se como antibiticos a Kanamicina, a
Estreptomicina e a Espectinomicina, todos eles antibiticos
aminoglicosdeos inibidores de sntese proteica. Estes antibiticos actuam
ao nvel dos ribossomas, provocando um erro na leitura do RNA
mensageiro, ou seja bloqueiam a etapa inicial do processo de traduo,
conduzindo morte das clulas. As bactrias utilizadas para estudar a sua
sensibilidade aos antibiticos supra referidos, foram a E.coli, Rhizobium e
Actinomices. A Escherichia coli uma bactria que est presente na nossa
flora intestinal, Gram negativa e trata-se de um microorganismo
anaerbio facultativo. O Rhizobium uma bactria do solo, Gram negativo
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e aerbio estrito. Por fim, Actinomices um microorganismo presente no
solo, Gram positivo e anaerbio.
Palavras-chave: Antibitico, Estreptomicina, Espectinomicina,
Kanamicina.
MATERIAL E REAGENTES
Material:
- Rolhes de algodo estril
- Discos de papel esterilizado
- Placas de Petri com agar nutritivo (3)
- Estufa de incubao
Reagentes:
- Cultura de E. coli - Cultura de Rhizobium - Cultura de Actinomices - Soluo de Kanamicina - Soluo de Estreptomicina - Soluo de Espectinomicina - Soluo salina
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Inoculao em massa
1. Transferimos 10 ml de soluo salina estril sobre a placa com crescimento bacteriano de E. coli
2. Espalhmos com uma pipeta de Pasteur 3. Suspendemos as bactrias com auxilio de um rolho de algodo estril e
inoculmos, humedecendo uniformemente, a superfcie do agar de uma
placa nova com o rolho.
4. Deixmos secar na estufa durante cerca de 10 minutos
Teste de susceptibilidade
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5. Retirmos um disco de papel embebido de cada soluo de antibitico,
assim como de soluo salina e colocmo-los, identificando-os, na placa.
6. Repetimos os cinco passos anteriores para a cultura de Rhizobium e de
Actinomices
7. Deixmos a incubar na estufa com as seguintes temperaturas:
a. E. coli 37C b. Rhizobium e Actinomices 30C
8. Observmos e medimos os crculos de inibio, registando os resultados
RESULTADOS
Kan- kanamicina
STR- Estreptomicina
EPC- Espectinomicina
Salino- soluo salina estril
Zona de inibio de crescimento
E.coli
Disco
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Actinomices
Rhizobium
ANTIBITICO Dimetro de inibio [cm]
E. coli Rhizobium Actinomices
Kanamicina 2,9 3,3 2,8
Estreptomicina 2,8 3,5 3,4
Espectinomicina 3,3 2,8 2,7
Soluo salina 2,2 1,0 1,5 Tabela 1: Registo de resultados dos crculos de inibio
Grau de sensibilidade
Resistncia Maior Intermdia Menor
E. coli Espectinomicina Kanamicina Estreptomicina ?
Rhizobium Estreptomicina Kanamicina Espectinomicina ?
Actinomices Estreptomicina Kanamicina Espectinomicina ? Tabela 2: Registo de sensibilidade aos antibiticos
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Discusso dos resultados e concluso
Os halos de inibio, so como o prprio nome indica, zonas onde
no se verifica crescimento de microorganismos. Nesta actividade
verificou-se a formao de halos de inibio, ou seja o antibitico difundiu-
se prevenindo o crescimento de bactrias. Em alguns casos observaram-se
dois halos (Rhizobium). O halo interior corresponde a uma zona onde no
h crescimento bacteriano, o halo exterior corresponde a uma zona em que
houve algum crescimento devido ao aparecimento de bactrias mutantes.
Para uma melhor compreenso dos resultados convm relembrar que a
E. coli e a Rhizobium so Gram + e a actinomices Gram -, sendo a
primeira anaerbia facultativa, a segunda aerbia restrita, e a ltima
anaerbia. Os trs antibiticos utilizados so antibiticos aminoglicosdeos
inibidores de sntese proteica. Estes antibiticos actuam ao nvel dos
ribossomas, provocando um erro na leitura do RNA mensageiro, ou seja
bloqueiam a etapa inicial do processo de traduo, conduzindo morte das
clulas. Embora os nossos resultados estejam por vezes incorrectos, devido
a contaminaes, mau manuseamento do material, e outros erros aos quais
fomos alheios, recorremos comparao com valores de outros grupos e
podemos chegar a algumas concluses. O SPC um antibitico de pequeno
espectro, o STR de grande espectro, porque conseguiu penetrar na
camada de peptidoglicano das Gram + como nas Gram -. Em toda a
experincia a soluo salina deveria ter funcionado como controlo positivo,
mas tal no foi possvel porque num dos grupos anteriores ocorreu
contaminao contudo ainda apresentava um halo de inibio pequeno em
relao aos outros antibiticos. Conclumos que a E. coli mais susceptvel
ao SPC e menos susceptvel ao STR. Rhizobium e Actinomices
apresentaram maior sensibilidade ao STR e menor sensibilidade ao SPC .
como j foi referido o Rhizobium apresentava contaminao, pois era
possvel observar crescimento filamentoso tpico de fungos filamentosos.
Embora no tenha sido observado, era de esperar que o Actinomices fosse
o mais sensvel, visto tratar-se de uma bactria Gram +, como explicado
na introduo.
Para finalizar convm relembrar que todas estas concluses s foram
possveis atravs da comparao de resultados dos vrios grupos, visto que
os dados tericos no se concretizaram na prtica.
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Brock Biology of Microorganisms. Madigan, Martinko e Parker.
Prentice Hall, 8th ed., 1997
Manual da disciplina e apontamentos da aula
Microbiology- Concepts and Applications. Pelczar, Chan e Krieg. McGraw-Hill, 1993.
Microbiology. Prescott, Harley e Klein. WCB, 5th ed., 2002.
Protocolo experimental Condies ambientais de crescimento microbiano (P9)
http://soils.(ses.ut.ede/ch/biol4684/microbes/rizobium.html
www.fmv.utl.pt/democ/sft/toxicelogia/toxclin.PDF
www.epa.gov/opptintr/biotech/fra/fra002.htm
www.micro.msb.le.ac.uk/video/Gram.html