RELATÓRIO DE ESTÁGIO E MONOGRAFIA MESTRADO ......8.1.1. Aspirina e Clopidogrel, antiagregantes...

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE FARMÁCIA

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

E MONOGRAFIA

MESTRADO EM ANÁLISES CLINÍCAS

RUTE FILIPA DIAS NOGUEIRA

LISBOA, 2016

Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa

Rute Nogueira 2

O PRESENTE RELATÓRIO FOI ESCRITO AO ABRIGO DO ANTIGO

ACORDO ORTOGRÁFICO.


Rute Nogueira 3

Índice

Índice ................................................................................................................................ 3

Agradecimentos ................................................................................................................ 5

Resumo ............................................................................................................................. 6

Abstract ............................................................................................................................. 7

Índice – Parte I .................................................................................................................. 9

Índice de Figuras ............................................................................................................ 10

Índice de Tabelas ............................................................................................................ 10

Lista de Abreviaturas ...................................................................................................... 11

Introdução ....................................................................................................................... 13

1. Fase Pré-Analítica: Triagem e colheitas ................................................................. 14

1.1. Colheita de outros produtos biológicos............................................................ 16

1.2. Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTGO) .................................................. 19

1.3. Triagem de amostras ........................................................................................ 20

2. Fase Analítica ......................................................................................................... 21

2.1. Hematologia ..................................................................................................... 21

2.1.1. Equipamentos ........................................................................................... 21

2.2. Microbiologia ................................................................................................... 34

2.2.1. Equipamentos ........................................................................................... 34

2.2.2. Técnicas manuais ...................................................................................... 37

2.3. Imunologia ....................................................................................................... 45

2.3.1. Equipamentos ........................................................................................... 45


2.4. Bioquímica ....................................................................................................... 50

2.4.1. Equipamentos ........................................................................................... 50


3. Controlo de Qualidade ............................................................................................ 56

4. Fase Pós-Analítica .................................................................................................. 58

Bibliografia – Parte I ...................................................................................................... 59

Índice – Parte II .............................................................................................................. 62

Resumo ........................................................................................................................... 63

Abstract ........................................................................................................................... 64




Rute Nogueira 4

Introdução ....................................................................................................................... 67

Objectivos ....................................................................................................................... 69

5. Plaquetas ................................................................................................................. 70

5.1. Fisiologia: Estrutura, formação e funções das plaquetas ................................. 70

5.2. Papel na inflamação ......................................................................................... 83

5.3. Alterações quantitativas ................................................................................... 87

5.4. Alterações qualitativas ..................................................................................... 90

5.5. Aplicação das Análises Clínicas no diagnóstico de patologias plaquetárias ... 91

6. Doenças vasculares ................................................................................................. 94

6.1. Doenças Arteriais ............................................................................................. 94

6.1.1. Doença das artérias coronárias ................................................................. 94

6.1.2. Doença das artérias periféricas ................................................................. 96

6.2. Doenças Venosas ............................................................................................. 98

6.2.1. Trombose das veias profundas ................................................................. 98

7. Aplicação da patologia plaquetária e da cirurgia vascular ..................................... 99

7.1. Trombocitopenia na sequência de doenças vasculares – Caso Clínico ........... 99

8. Abordagens Terapêuticas ..................................................................................... 104

8.1. Tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção de AVC em pacientes

com doenças vasculares associadas .......................................................................... 104

8.1.1. Aspirina e Clopidogrel, antiagregantes plaquetários em utilização na

prevenção de doenças vasculares ......................................................................... 104

8.2. Monitorização/Controlo laboratorial da terapêutica ...................................... 105

8.3. Novos agentes antiplaquetários...................................................................... 106

Conclusões e Perspectivas ............................................................................................ 108

Bibliografia – Parte II ................................................................................................... 109


Rute Nogueira 5

Agradecimentos

À Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e a todos os docentes que

participaram nesta edição do Mestrado em Análises Clínicas, por todos os conhecimentos

transmitidos.

À Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e a todos os docentes que

acompanharam o meu percurso ao longo da Licenciatura em Bioquímica, que em tanto

me foi útil durante estes dois últimos anos e que o será para todo o meu percurso

profissional ao longo da vida.

À Dra. Isabel Bettencourt, minha orientadora, por toda a compreensão, por todo o

acompanhamento, disponibilidade, carinho e apoio prestados ao longo da elaboração

deste trabalho.

À Dra. Fátima Consciência, Dra. Noélia Piteira, Dra. Alexandra Moutinho e

restantes colaboradoras do Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas no qual realizei o

estágio profissional, por todos os ensinamentos transmitidos ao longo destes meses.

À Dra. Rita Matos por todo o apoio e prontidão de resposta sempre que me

surgiam dúvidas no âmbito dos assuntos académicos.

Aos meus pais, por todo o amor, por todos os ensinamentos que me têm

transmitido ao longo da vida, por todo o apoio, por toda a compreensão, por toda a força

que sempre me transmitiram, impulsionando-me sempre a alcançar os meus objectivos e

por todo o acompanhamento que fazem de mim a pessoa que sou hoje.

À minha avó Maria José, por toda a força e preocupação que sempre teve comigo.

Ao Ricardo Ambrósio, por todo o amor, carinho, apoio e compreensão que tanto

foram importantes nesta recta final.

À Maria Inês, Marisa, Andreia e Beatriz pela amizade que nos une, por todos os

momentos e por toda a força que sempre me deram.

Ao Cláudio, pela força que me foi transmitida para atingir os meus objectivos.

A todas as pessoas, amigos e família, que me acompanharam e me deram forças

para chegar até aqui.

A todos os que acreditaram sempre em mim e fizeram de mim uma pessoa mais

forte.


Rute Nogueira 6

Resumo

Este trabalho encontra-se dividido em duas partes distintas: relatório de estágio e

monografia. Na primeira parte é apresentado o relatório de estágio profissional realizado

no Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas. Neste relatório são descritos os

equipamentos e respectivas técnicas manuais utilizadas durante o estágio, nas áreas de

bioquímica, microbiologia, hematologia e imunologia.

Na fase pré-analítica abordou-se as secções de triagem e colheita de produtos

biológicos. Na triagem dos produtos biológicos há que ter vários aspectos em conta, pois

é a partir desta fase que os produtos são analisados e encaminhados para dar os resultados

aos utentes. É muito importante verificar se os produtos estão em condições de serem

analisados, ou seja, se estão na conformidade necessária à execução analítica. Caso isto

não aconteça é necessário que haja uma rejeição da amostra e será pedido ao utente que

venha repetir noutro dia, consoante a urgência. Existem situações em que a amostra pode

vir a ser utilizada, mesmo não estando em conformidade, quando existe indicação médica

para tal. Por outro lado, no que diz respeito à colheita dos produtos biológicos, também

há que ter uma elevada atenção, de modo a que a colheita seja o mais eficaz possível,

tanto no que diz respeito à satisfação do utente, como na obtenção de um produto

conforme para o laboratório.

No que diz respeito à fase analítica, ao longo desta primeira parte do trabalho,

descrevem-se os vários equipamentos que foram utilizados durante o estágio profissional,

tendo todos uma manipulação diferente e seguindo um controlo de qualidade muito

rigoroso. Para além disso, foram também realizadas várias técnicas manuais ainda em

utilização neste laboratório, imprescindíveis para uma boa obtenção de resultados

analíticos.

Para finalizar, aborda-se os princípios do controlo de qualidade posto em prática

no laboratório, sendo o seu cumprimento de grande importância para a obtenção de

resultados de elevada fiabilidade. A fase pós-analítica integra a validação biopatológica

pela directora técnica do laboratório, sem a qual a entrega dos resultados aos utentes não

é possível.

Palavras-chave: Estágio; Laboratório; Analítica; Biológico


Rute Nogueira 7

Abstract

This work is divided into two distinct parts: the internship report and the

monograph. On the first part it's presented the professional internship report held at

Biolabor, Clinical Analysis Laboratory. In this report, it's described the equipment and

manual techniques used during the internship in biochemistry, microbiology, hematology

and immunology.

In the pre-analytical phase it was focused the sections of screening and harvest of

biological products. Screening of biological products it's necessary to take various aspects

into account, since it's from this stage on that the products are analyzed and forwarded to

give the results to users. It's very important to check if the products are under the right

conditions to be analyzed, i.e., whether they are under the conformity to the required

analytical process. If this is not the case it's necessary to reject the sample and it will be

requested the user to come again to repeat the sampling another day, depending on the

urgency. There are situations where the sample might be used, even if it's not in

conformity. Such cases occur when there is medical indication for such. On the other

hand, regarding the harvest of the biological products, there should also be given high

attention, so that the harvest is as effective as possible, both with regard to the satisfaction

of the user, and with the obtainment of the product according to a laboratory analysis.

Regarding the analytic phase, during this first part of the work, it's described the

various equipment that were used during the professional internship, all with different

handling and following a very rigorous quality control. Besides this, it was also performed

various manual techniques still used in laboratory, essential for obtaining good analytical

results.

Finally, it’s discussed the principles of quality control implemented in the

laboratory and its application of great importance to obtain highly reliable results. The

post-analytical phase integrates biopathologic validation by the laboratory's technical

director, without which the delivery of results to the users would not be possible.

Keyword: Internship, Laboratory; Analytical; Biological


Rute Nogueira 8



RELATÓRIO DE ESTÁGIO

ORIENTADO PELA DOUTOURA FÁTIMA CONSCIÊNCIA



LISBOA, 2016


Rute Nogueira 9

Índice – Parte I

Índice ................................................................................................................................ 3

Agradecimentos ................................................................................................................ 5

Resumo ............................................................................................................................. 6

Abstract ............................................................................................................................. 7

Índice – Parte I .................................................................................................................. 9


Índice de Tabelas ............................................................................................................ 10


Introdução ....................................................................................................................... 13

1. Fase Pré-Analítica: Triagem e colheitas ................................................................. 14

1.1. Colheita de outros produtos biológicos............................................................ 16

1.2. Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTGO) .................................................. 19

1.3. Triagem de amostras ........................................................................................ 20

2. Fase Analítica ......................................................................................................... 21

2.1. Hematologia ..................................................................................................... 21

2.1.1. Equipamentos ........................................................................................... 21

2.2. Microbiologia ................................................................................................... 34

2.2.1. Equipamentos ........................................................................................... 34


2.3. Imunologia ....................................................................................................... 45

2.3.1. Equipamentos ........................................................................................... 45


2.4. Bioquímica ....................................................................................................... 50

2.4.1. Equipamentos ........................................................................................... 50


3. Controlo de Qualidade ............................................................................................ 56

4. Fase Pós-Analítica .................................................................................................. 58

Bibliografia – Parte I ...................................................................................................... 59


Rute Nogueira 10

Índice de Figuras

Figura Página

Figura 1: ADVIA 2120i, Sistema de Hematologia 20

Figura 2: Citograma de Peroxidase 22

Figura 3: Citograma BASO 22

Figura 4: Visão clássica da Cascata de Coagulação 24

Figura 5: Visão actual da Cascata de Coagulação 25

Figura 6: ADAMS A1C HA-8160 27

Figura 7: VESMATIC 30/30 PLUS 28

Índice de Tabelas

Tabela Página

Tabela 1: Resultados possíveis do BK directo 38

Tabela 2: Resultados possíveis do BK cultural 38


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Lista de Abreviaturas

ALT – Alanina Aminotransferase

ANC – Bactérias Anaeróbias e Corinebactérias

APTT – Tempo de Tromboplastina Parcial Activado

AST – Aspartato Aminotransferase

AST – Teste de Sensibilidade aos Antibióticos

BASO – Basófilos

BCL – Bacilos Gram Positivos Formadores de Esporos

CBC – Corinebactérias

CHGM – Concentração Globular Média de Hemoglobina

CK – Creatinina Cinase

CMI – Concentração Mínima Inibitória

CO2 – Dióxido de Carbono

CQI – Controlo de Qualidade Interno

CTFF – Capacidade Total de Fixação do Ferro

DIC – Coagulação Intravascular Disseminada

EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

ELFA – Enzyme Linked Fluorescent Assay

ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay

G.S.G.C. – Meio de Gelose, Sabouraud, Gentamicina, Cloranfenicol

GGT – Gamaglutamiltranspeptidase

GN – Cocos e Bacilos Gram Negativos e Não Fermentadores

GP – Cocos e Bacilos Gram Positivos Formadores de Esporos

HbA1C – Hemoglobina Glicada

HDL – Lipoproteína de Alta Densidade

HGB – Hemoglobina

HGM – Hemoglobina Globular Média

HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Pressão

Ht – Hematócrito

INR – Razão Normalizada Internacional

ISI – International Sensity Index

IT – Instruções de Colheita

LAC – Laboratório de Análises Clínicas

LDH – Lactato Desidrogenase


Rute Nogueira 12

NH – Neisseria Haemophilus

OMS – Organização Mundial de Saúde

PCR – Proteína C Reactiva

PDF – Produtos de Degradação de Fibrina

PEROX – Peróxidos

Plt – Plaquetas

PSM – Process Systems Manager

PTGO – Prova de Tolerância à Glicose Oral

RBC – Eritrócitos

Retic – Reticulócitos

SI – Sistema Informático

SYSMEX – Sysmex automated blood coagulation analyzer

TASO – Anti-estreptolisina O

TIBC – Capacidade Total de Ligação do Ferro

TP – Taxa de Protrombina

TPA – Activador Tecidular do Plasminogénio

UFC – Unifluidics

VDRL – Veneral Disease Research Laboratory

VGM – Volume Globular Médio

VIDAS – Vitek Immuno Diagnostic Assay System

VS – Velocidade de Sedimentação

YST – Leveduras


Rute Nogueira 13

Introdução

O relatório de estágio que se segue foi baseado no estágio profissional realizado

no Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas, no âmbito do Mestrado em Análises

Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.

Este laboratório encontra-se sob a direcção técnica da Dra. Fátima Consciência,

farmacêutica especialista em Análises Clínicas. O laboratório encontra-se dividido em

diferentes áreas: recepção, zona de colheitas, área de microbiologia, área de hematologia,

área de imunologia/endocrinologia, área de bioquímica e zona de triagem.

Sendo um laboratório pequeno, durante o estágio tive oportunidade de contactar

com todas as áreas nele existente, desde a colheita de produtos biológicos, passando pela

recepção, por todas as áreas analíticas e pela triagem de amostras.


Rute Nogueira 14

1. Fase Pré-Analítica: Triagem e colheitas

O processo pré-analítico tem como objectivo descrever todo o processo desde o

atendimento aos utentes até à obtenção de amostras biológicas adequadas à execução

analítica, aplicando-se a todas as etapas do processo pré-analítico: atendimento, colheitas

e triagem.

No núcleo das análises clínicas, entende-se por cliente os utentes/doentes e

qualquer entidade com as quais o laboratório possui contractos de fornecimento de

serviços e que solicitem os serviços de análises clínicas. Por outro lado, existem também

os médicos prescritores (clientes intermédios), os quais definem parte dos requisitos do

serviço, sendo necessária, em determinadas circunstâncias, a comunicação entre o

laboratório e estes.

A fase pré-analítica engloba uma série de procedimentos para os quais é necessário

um bom entendimento de algumas noções:

Plasma: é o sobrenadante livre de células obtido após a centrifugação do sangue

contendo anticoagulante.

Soro: é a porção extracelular do sangue não diluída após coagulação completa e

adequada. A coagulação é considerada completa quando as amostras são deixadas

pelo menos 20 a 30 minutos à temperatura ambiente (ou tempo inferior se o tubo

for adicionado de gel ou aditivo acelerador).

Anticoagulante: aditivo que inibe a coagulação sanguínea e que é utilizado para

assegurar que os parâmetros a serem medidos são alterados o menos possível antes

da execução analítica.

O utente é recepcionado no Laboratório de Análises Clínicas (LAC) por ordem de

chegada, onde são colocadas algumas questões sobre o seu estado, tendo em conta as

análises prescritas e as respectivas condições necessárias para a execução da colheita, de

acordo com o Manual de Colheitas. Caso não se verifique a conformidade necessária à

execução analítica, deve pedir-se ao utente que se dirija ao LAC noutro dia, nas devidas

condições, salvo por indicação médica contrária. Nas situações em que exista a

necessidade de instruir o utente previamente do modo de proceder, a recepcionista deve

entregar-lhe a respectiva instrução de colheita (IC).

Durante o processo de abertura de ficha no Sistema Informático (SI), é atribuído

um número a cada utente, ao qual vão estar associadas as respectivas análises requisitadas,

identificação esta que se vai manter até que o Boletim de Análises seja emitido. Por outro

lado, cada utente vai ter um número de identificação, o qual o vai identificar no LAC,


Rute Nogueira 15

independentemente do número de processos abertos para este doente. Em situações

excepcionais em que não haja sistema informático por qualquer razão, o utente é

identificado com pelo menos três nomes e é preenchido um impresso específico que lhe

atribui um número, sendo entregue um talão manual para levantamento dos resultados.

Em situações específicas, a ordem de atendimento pode ser alterada no caso de

existirem na sala de espera pessoas às quais deve ser concedida prioridade: pessoas com

deficiência, pessoas diabéticas, grávidas, crianças com menos de três anos e utentes com

Provas de Tolerância à Glucose Oral (PTGO).

Situações há em que o doente se dirige ao LAC sem requisição, pedindo

verbalmente o que pretende e devendo para isso preencher uma Requisição de Análises

Particular, com as análises pedidas (como nos casos em que o utente é abrangido por

algum tipo de seguro). No entanto, há análises que o doente não pode solicitar sem

requisição médica, como é o caso de análises em que seja necessário a administração de

solutos, medicamentos ou outros, por via oral ou parentérica.

Durante o atendimento ao utente, há que verificar a entidade pelo qual este está

abrangido (credencial) tendo em conta os requisitos particulares da mesma.

As salas de colheita devem ser devidamente preparadas no dia anterior, com todo

o material que possa ser necessário. Para análises específicas, devem ser colocados, no

frigorífico de amostras, tubos de EDTA-gel, seringas de 10 e 20 mL e tubos para soro

com gel ou grânulos. Por outro lado, na estufa a ± 37ºC devem estar seringas de 10 e 20

mL e tubos secos para soro. O material colocado no frigorífico deve ser mudado

periodicamente para não expirar a validade e o que é colocado na estufa deve ser mudado

diariamente para que não haja o risco de se alterar ou contaminar.

A colheita de sangue (ou de outro produto biológico que o justifique) é efectuada

com material esterilizado e não reutilizável. A cada recipiente é atribuída uma etiqueta

com código de barras, antes da colheita, com a respectiva identificação do utente. Tanto

a hora da colheita de sangue como a da centrifugação devem ser registadas. As horas da

colheita das urinas tipo II, uroculturas e diversos devem ser igualmente registadas. Na

listagem das urinas de 24 horas, o volume deve ser registado, com respectiva confirmação

deste e da análise a efectuar. A hora a que os produtos biológicos são semeados é registada

nas listas de trabalho de microbiologia.

Na punção venosa, o garrote deve ser colocado cerca de 8 a 10 cm da zona de

punção. Depois efectua-se a palpação da veia mais adequada (veias medianas, veia

basílica e veia cefálica), desinfecta-se bem o local a puncionar e, no fim da extracção de


Rute Nogueira 16

sangue, desaperta-se o garrote e pressiona-se bem o local da punção. A agulha deve ser

descartada em contentor próprio para perfurantes. A ordem de distribuição do sangue

pelos tubos deve ser sempre respeitada para evitar contaminações: hemoculturas, soro,

citrato, heparinato e Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Numa punção cutânea,

a grande diferença para a punção venosa é o local a puncionar, o qual deve ser sempre

bem desinfectado (lóbulo da orelha, polpa do dedo, calcanhar).

Para a obtenção de soro, os tubos devem estar pelo menos 30 minutos à

temperatura ambiente, de modo a ser feita a coagulação completa. Após este processo,

centrifuga-se pelo menos 10 minutos a uma velocidade mínima de 2500 rpm. A

centrifugação deve ser efectuada de preferência até 60 minutos após a colheita, uma vez

que a cada hora há perda de aproximadamente 10% de glucose, sendo aceitável um

intervalo de 2 horas entre a colheita e a separação do soro. Um contacto do soro com as

células do coágulo para além de 2 horas pode causar alterações significativas de

constituintes como glucose, potássio, fósforo, creatinina, Aspartato aminotransferase

(AST) e Alanina aminotransferase (ALT).

Para a obtenção de plasmas, o sangue (citratado, EDTA e heparinizado) deve ser

centrifugado durante 15 minutos a 2000-3000 rpm. Os tubos citratados não devem ser

centrifugados nos postos de colheita.

1.1. Colheita de outros produtos biológicos

Tal como já foi referido, para além da colheita de sangue, existem outros produtos

biológicos que podem ser colhidos, de acordo com as respectivas IT’s, respeitando-se

sempre as regras de protecção individual adequada (bata, luvas, óculos e máscara de

protecção, de acordo com o que se justifique):

Colheita para exames bacteriológicos, micológicos e parasitológicos: A

colheita deve ser efectuada com zaragatoa estéril ou seringa de acordo com o local

prescrito para exame microbiológico; sempre que possível, a amostra deve ser

colhida no laboratório, ou ser enviada o mais rapidamente ao laboratório em meio

de transporte adequado.

◦ Exsudado amigdalino: O utente deve estar sentado com a cabeça

ligeiramente inclinada para trás, boca bem aberta e língua baixa. A colheita

é feita com zaragatoa na zona das amígdalas incidindo nas zonas

vermelhas e pontos brancos quando existentes.

◦ Exsudado auricular: Com o utente sentado, a colheita é feita com a


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zaragatoa a nível do ouvido direito, esquerdo ou ambos (uma zaragatoa

por ouvido).

◦ Exsudado faríngeo, orofaríngeo ou rinofaríngeo: Com o utente sentado

com a cabeça ligeiramente inclinada para trás e língua baixa, a zaragatoa

é colocada na zona da rinofaringe.

◦ Exsudado nasal: O utente deve estar sentado com a cabeça ligeiramente

inclinada para trás. Com a zaragatoa a nível da narina esquerda e direita,

esta deve ser introduzida cuidadosamente até à parte superior da narina,

até encontrar resistência (até as lágrimas virem aos olhos). Na

identificação de portadores de Staphylococcus aureus, não é necessária a

introdução muito profunda da zaragatoa.

◦ Exsudado nasofaríngeo: O utente deve estar sentado com a cabeça

ligeiramente inclinada para trás. A colheita é feita com zaragatoa flexível

ao nível da narina esquerda e direita. A zaragatoa deve introduzir-se

cuidadosamente através do nariz, o mais profundo possível.

◦ Exsudado ocular: O utente deve estar sentado, com a zaragatoa a nível do

olho direito, esquerdo ou em ambos de acordo com a prescrição médica

(uma zaragatoa por olho). A colheita é feita na parte interna da pálpebra

inferior.

◦ Exsudado vaginal: A utente tem de estar deitada em posição ginecológica.

Com a zaragatoa de alginato de cálcio ou de Dacron, a colheita é feita na

zona de maior exsudado ou do fundo do saco vaginal posterior e colo do

útero com o auxílio de um espéculo (excepto em crianças e mulheres

virgens). A operação é repetida com uma segunda zaragatoa. A primeira

zaragatoa destina-se à realização do esfregaço no acto da colheita,

enquanto a segunda se destina à sementeira.

◦ Pesquisa de Neisseria Gonorreia (Gonococcus): A colheita é feita com

zaragatoa ao nível do endocolo, glândulas de Skène ou de Bartholin, uretra

ou eventualmente ânus.

◦ Pesquisa de Chlamydia Trachomatis: Remover bem o excesso de muco

com uma zaragatoa larga de alginato de cálcio ou de Dacron. Inserir uma

segunda zaragatoa no canal endocervical, evitando o contacto com a

mucosa vaginal e rodando vigorosamente durante 15-30 segundos.

◦ Pesquisa de Mycoplasma e Ureoplasma: É feita com amostras de


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exsudado vaginal, cervical ou uretral. Deve efectuar-se bem a raspagem da

mucosa, com zaragatoa, para colher o maior número de células possível.

Colocar imediatamente a zaragatoa no frasco, com meio de transporte (do

Kit).

◦ Pesquisa de Streptococcus Hemolíticos do grupo B: Com a zaragatoa

e sem espéculo, colher uma amostra no terço inferior da vagina. Em

situações em que seja também pedida a pesquisa anal, colher outra

zaragatoa na zona rectal.

◦ Exsudado Uretral: No homem, a colheita deve efectuar-se de manhã,

antes da primeira micção ou no mínimo 3 horas depois da última micção e

antes de se lavar. Limpar a mucosa circundante com gaze esterilizada. Por

pressão do pénis fazer aparecer uma gota de secreção e colher com a

zaragatoa. Se não existir gota matinal, fazer a colheita introduzindo uma

zaragatoa fina na uretra e rodando suavemente. Na mulher, a colheita deve

efectuar-se antes de qualquer lavagem local, com zaragatoa a nível da

uretra.

◦ Hemoculturas: Com o utente sentado ou deitado (como na punção

venosa), a colheira é feita por punção venosa no início do pico febril. A

desinfecção do local a puncionar deve ser feita com Betadine e álcool a

70º e o frasco da hemocultura deve ser o primeiro a ser colhido. A tampa

do frasco da hemocultura deve ser previamente desinfectada com álcool a

70º. Volume em adultos: 8 a 10 mL; crianças: 1 a 3 mL.

◦ Pus em supurações superficiais: Colheita com zaragatoa ou agulha e

seringa. Limpar primeiro o local com solução salina estéril. Retirar pus,

secreções ou tecidos desvitalizados. Colher o pus localizado na parte mais

profunda da ferida.

◦ Pus em supurações fechadas: Colheita com agulha e seringa. Transportar

a seringa sem agulha.

Lesões cutâneas: Durante a colheita da amostra, todo o equipamento de

segurança e protecção individual deve ser utilizado. Antes da colheita, deve

limpar-se a lesão cutânea para evitar vestígios de qualquer medicamento. Se a

lesão for seca e descamativa, recolhem-se as escamas, de preferência na zona

periférica da lesão, com um bisturi esterilizado. Se a lesão for exsudativa, utiliza-


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se uma zaragatoa estéril para a recolha. Para a pesquisa de pitiríase versicolor,

utiliza-se a técnica da fita adesiva transparente, colocando sobre a pele a fita

adesiva e, de seguida, sobre a lâmina de vidro. Na pesquisa de dermatófitos,

colocam-se algumas escamas cutâneas entre lâmina e lamela com potassa (de 20

a 40%) para observação microscópica, devendo a observação ser feita após meia

hora, depois da montagem da preparação.

Oniquias: Nas oniquias, na colheita de unhas infectadas, deve raspar-se a zona

atingida e recolher os fragmentos para uma placa de Petri. Na pesquisa de

dermatófitos, colocam-se algumas escamas cutâneas entre lâmina e lamela com

potassa (de 20 a 40%) para observação microscópica, devendo a observação ser

feita após duas horas. Se existir perioníquia, colhe-se o pus com uma zaragatoa

esterilizada.

Pêlos/couro cabeludo: Na colheita de pêlos, estes devem ser colhidos nas zonas

de queda ou alopecia. Colhem-se escamas e cotos resultantes da fragmentação de

cabelos parasitados, pressionando a superfície da lesão com pinça esterilizada.

Quando se pesquisa dermatófitos, colocam-se alguns cabelos entre lâmina e

lamela com potassa (de 20 a 40%), para observação microscópica. Esta

preparação deverá ser observada imediatamente.

1.2. Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTGO)

Nas provas de tolerância oral à glucose existem dois tipos distintos: Prova de

O'Sullivan e PTGO. Na prova de O'Sullivan a colheita é feita em jejum e ocorre a ingestão

de 50 g de glucose dissolvida em 200 mL de água, havendo nova colheita ao fim de 60

minutos. Na PTGO, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), em grávidas, a

colheita é feita em jejum, com ingestão de 75 g de glucose dissolvida em cerca 300 mL

de água. Faz-se colheita de sangue aos 60 e 120 minutos após ingestão do soluto. Fora do

contexto de gravidez, na prova de despiste de diabetes, faz-se a colheita de sangue em

jejum, seguida da ingestão de 75 g de glucose dissolvida em 250 a 300 mL de água e a

colheita de sangue é realizada 120 minutos após o início da ingestão do soluto. Em

crianças com menos de 42 kg, a ingestão de glucose é de apenas 1,75 g de glucose por

cada kg de peso da criança dissolvidos em 200 mL de água, sendo a colheita feita de igual

modo aos 60 e aos 120 minutos. A prova deve ser efectuada após jejum de 8 horas mas

não superior a 14 horas. Nos 3 dias que antecedem o teste de tolerância à glucose o

paciente deve ter uma actividade física regular e uma dieta não restrita (cerca de 150 g de


Rute Nogueira 20

hidratos de carbono diários). Durante a prova o paciente não deve fumar, comer ou beber

(excepto um pouco de água), devendo permanecer em repouso. As PTGO não estão

indicadas em pacientes com valores de glicemia em jejum superiores a 140 mg/dL,

devendo-se sempre fazer um despiste da glicemia em jejum, salvo se tivermos um

histórico recente do doente. A pesquisa de drogas é um procedimento sobre o qual recai

muita atenção uma vez que é um processo de elevada responsabilidade. Num primeiro

momento, o utente deve preencher a Cadeia de Custódia e assiná-la. A urina tem de ser

colhida no LAC/Posto de colheitas, sempre na presença de um técnico, para dois

recipientes próprios. Estes recipientes são selados na presença do utente e devidamente

etiquetados. Um dos recipientes destina-se a ser congelado durante um período de 3

meses, para o caso de ser necessária uma contraprova. Os testes são realizados por ensaio

imunológico, para a detecção qualitativa de drogas.

Depois das colheitas, independentemente do produto biológico colhido, as

amostras e respectivos tubos são levados para a sala de triagem de amostras. Todas as não

conformidades que possam ocorrer durante a colheita são registadas, para que se possa

avaliar a necessidade de rejeição da amostra.

1.3. Triagem de amostras

Na sala de Triagem e amostras, com o auxílio do Process Systems Manager

(PSM), as amostras são preparadas e distribuídas de acordo com o procedimento:

Os tubos secos ou com gel, para a obtenção do soro, são centrifugados e

encaminhados para a secção de Bioquímica/Imunologia;

Os tubos de coagulação, para a obtenção do plasma, são centrifugados e

encaminhados para a secção de Hematologia;

Os tubos que vão ser enviados para laboratório exterior são devidamente

separados e acondicionados;

Os restantes tubos são distribuídos pelas secções conforme especificidade da

análise a efectuar.

Se a amostra não se encontrar de acordo com as especificações definidas é

rejeitada (volume insuficiente, amostras com coágulos, amostras com hemólise,

lipémicas, amostras não identificadas, entre outras).

As condições de segurança para o transporte das amostras são definidas tendo em

conta uma adequada termoestabilização, de acordo com as características da análise a


Rute Nogueira 21

realizar, atendendo ao tempo e à distância (temperatura, protecção da luz, precauções com

a vedação) e, ainda, requisitos para minimizar o risco de troca de amostras definido pelo

Manual de Colheitas. Todas as amostras que se destinem a análises que devem ser

realizadas de imediato não podem ser obtidas nos postos de colheita.

De acordo com o protocolo de colaboração entre o LAC e laboratórios exteriores,

as amostras são preparadas e devidamente identificadas tendo em conta as especificações

dadas pelos mesmos. As amostras são posteriormente recolhidas por uma empresa de

transporte rápido (entregas no próprio dia) ou enviadas pelo correio. As listas de trabalho

enviadas para o laboratório exterior contêm a identificação do doente e respectivas

amostras, as análises solicitadas e observações com informações gerais (sempre que isso

se justifique).

2. Fase Analítica

2.1. Hematologia

A secção de Hematologia estuda, em grande parte, os elementos figurados do

sangue: hemácias (glóbulos vermelhos), leucócitos (glóbulos brancos) e plaquetas. Por

outro lado, a produção desses elementos e os órgãos onde eles são produzidos (órgãos

hematopoiéticos) também são estudados nesta secção. Para além do estado de

normalidade dos elementos sanguíneos e dos órgãos hematopoiéticos, também as doenças

a eles associados são aqui estudadas.

2.1.1. Equipamentos

2.1.1.1. ADVIA 2120i

O Advia é um analisador de hematologia com uma plataforma única: módulo

electrónico e compressor integrado (Figura 1). O funcionamento do aparelho pode ocorrer

através de três modos de aspiração diferentes: autosampler tubo fechado, manual tubo

fechado e manual tubo aberto. O modo autosampler funciona utilizando uma ou mais

racks, tem capacidade para 150 tubos, de diferentes tamanhos e não necessita de

adaptadores.

Figura 1: ADVIA 2120i, Sistema de Hematologia (Retirado de (1))


Rute Nogueira 22

Os reagentes a bordo têm capacidade para 1950 testes CBC/DIFF e 600 testes para

os reticulócitos. A tecnologia uniFluidics (UFC) utilizada pelo aparelho tem fiabilidade

hidráulica, manutenção reduzida e é fácil de usar. Não existe substituição de tubos e a

lavagem é feita diariamente de forma automática.

Com a determinação da Hemoglobina (HGB), do Hematócrito (Ht) e da contagem

de eritrócitos é possível calcular o Volume Globular Médio (VGM), a Hemoglobina

Globular Média (HGM) e a Concentração de Hemoglobina Globular Média (CHGM), ou

seja, os índices eritrocitários. Todos estes parâmetros são calculados pelo equipamento e

fazem parte do hemograma. Para além de anemias, uma diversidade de outras patologias

podem ser detectadas através da realização dos hemogramas.

No início de cada dia, depois das manutenções diárias, deve-se passar um sangue

como primer. De seguida, devem ser colocados os controlos e só depois dos resultados

destes estarem dentro dos valores das cartas de controlo é que se pode iniciar o trabalho

das amostras para realizar os hemogramas.

Durante o funcionamento do aparelho, a válvula cerâmica divide a amostra em

cinco alíquotas, distribuídas para os diferentes canais e métodos. Os reagentes empurram

a amostra que se encontra nos segmentos desta válvula, que vão ser enviados para as

diferentes câmaras de reacção, misturando e homogeneizando. As cinco câmaras de

reacção/canais são:

Canal HGB – Hemoglobina: A lise dos eritrócitos ocorre, havendo libertação

de hemoglobina. O ferro pertencente ao grupo hemo da hemoglobina é

oxidado, passando do estado ferroso para o estado férrico, sendo depois

combinado com o cianeto do reagente para formar o produto da reacção, cuja

transmitância vai ser lida a 546 nm.

Canal RBC/Plt – Eritrócitos e Plaquetas: O reagente ADVIA contém

dodecil sulfato de sódio (SDS) e glutaraldeído que provoca a esferificação

isovolumétrica do eritrócito, sendo o factor de variação da interpretação

eliminado. As plaquetas e os eritrócitos são fixados.

Canal Retic – Reticulócitos: O reagente ADVIA autoRetic contém um

detergente surfactante que esferifica isovolumetricamente os eritrócitos. Por

outro lado, contém um corante vital, oxazine 750, que cora as células de

acordo com o seu conteúdo de RNA.

Canal PEROX – Peroxidase: Em conjunto com o stress térmico, os

surfactantes provocam a lise dos eritrócitos. O formaldeído fixa os leucócitos.


Rute Nogueira 23

O meio hipertónico causa alguma contracção e crenação dos leucócitos,

incrementando o índice de refracção das células e melhorando a detecção dos

linfócitos. No citograma PEROX (Figura 2), as células absorvem a luz

proporcionalmente à quantidade de coloração da peroxidase presente,

enquanto as células dispersam a luz proporcionalmente ao seu tamanho.

Quando os dados de dispersão da luz e de absorção são traçados, formam-se

clusters distintos. A análise de clusters identifica cada população com base na

sua posição, área e densidade. De seguida, é processado o número de células

de cada população.

Canal BASO: O reagente ADVIA BASO contém ácido ftálico e um

surfactante, ocorrendo a lise dos eritrócitos e das plaquetas. No citograma

BASO (Figura 3), a dispersão da luz relativa à configuração do núcleo é

traçada no eixo x e a dispersão da luz relativa ao tamanho da célula é traçada

no eixo y e formam-se populações ou clusters diferentes.

Figura 2: Citograma de Peroxidade (Retirado de (14))

Figura 3: Citograma BASO (Retirado de (14))


Rute Nogueira 24

2.1.1.2. SYSMEX CA-500

O Sysmex automated blood coagulation analyzer (SYSMEX) da série CA-500 é

um dispositivo compacto e totalmente automatizado com capacidade para análise de 5

parâmetros aleatórios para utilização em diagnóstico in vitro. É um equipamento utilizado

na avaliação da coagulação sanguínea, onde se determina a taxa de Protrombina (TP), a

razão normalizada internacional (INR), o tempo de Tromboplastina Parcial Activado

(APTT) e o fibrinogénio, pelo método da coagulação. Para esta determinação é necessário

sangue colhido em citrato de sódio na proporção 1/10.

A coagulação plasmática conduz à transformação do fibrinogénio insolúvel, em

fibrina solúvel. Na realidade, a hemostase primária e a coagulação começam praticamente

ao mesmo tempo e estão interligadas. A activação da coagulação é desencadeada in vivo

por lesões que expõem o subendotélio ao sangue e também, pelas feridas dos tecidos, as

quais introduzem na circulação uma substância pró-coagulante, o factor tecidular

(tromboplastina). Na coagulação intervêm vasos, plaquetas e factores plasmáticos da

coagulação. Neste mecanismo, os proenzimas dão origem a enzimas e todo o processo de

activação desenvolve-se através de interacções moleculares, de modo a que o fenómeno

se potencialize (tais reacções são moduladas por inibidores fisiológicos). Esta sequência

de acontecimentos designa-se por cascata da coagulação. A activação da coagulação pode

ser feita por duas vias: pela via intrínseca, por contacto do sangue com uma superfície

carregada negativamente (subendotélio, in vivo, vidro ou caolina, in vitro), ou pela via

extrínseca, devido à introdução de factor tecidular no sangue. As duas vias conduzem à

conversão do factor X em Xa (início da via comum), que provoca a formação de trombina

que, por sua vez, transforma o fibrinogénio em fibrina.

A via intrínseca é desencadeada pela fixação dos factores XI e XII, pré-calicreína

e Quininogénio de Alto Peso Molecular (HMWK) sobre toda a superfície electronegativa.

In vivo, esta superfície pode ser constituída por plaquetas agregadas. O factor XIIa

transforma, por cisão proteolítica, o XI em XIa, e a pré-calicreína em calicreína. Há

activação recíproca entre estes dois factores. O factor XIa, em presença do cálcio (Ca2+)

activa o IX por proteólise. O IXa vai activar o X, graças a um complexo formado pelo

IXa, o VIIIa, o Ca2+ e uma superfície fosfolipídica (da membrana da célula endotelial).

Na via extrínseca vai ocorrer primeiramente a interacção entre o VII e o factor tecidular

em presença do Ca2+, seguido de proteólise do VII. O factor VIIa activa o X, e vice-versa.

Na via comum ocorre a activação do factor II (pró-trombina), a qual se faz graças a um

complexo chamado pró-trombinase (que inclui o Xa, o V, o Ca2+ e fosfolípidos, sejam


Rute Nogueira 25

plaquetários ou endoteliais). Os factores II, Xa e V fixam-se sobre os fosfolípidos. O

factor Xa transforma o II em IIa (trombina). Esta ataca as regiões terminais aminadas do

fibrinogénio, libertando duas moléculas de fibrinopéptido A e duas de fibrinopéptido B.

O fibrinogénio transforma-se em monómeros de fibrina, que se agregam

espontaneamente entre eles, resultando num polímero de fibrina solúvel que é

estabilizado pelo XIII, previamente activado pela trombina. Os factores XIIa e o IXa

podem activar o VII, que por sua vez activa o IX.

A Fibrinólise é o processo de destruição do coágulo através de um sistema de

enzimas que lisam a fibrina, dissolvendo o coágulo. É mediada pela formação de um

enzima proteolítico, a plasmina, através da activação do plasminogénio. Durante a

coagulação, o plasminogénio e a trombina ficam enredados no trombo formado. O

Plasminogénio é activado pelo Activador Tecidular do Plasminogénio (TPA) e forma-se

a plasmina. A lise química da fibrina pela plasmina resulta na produção de fragmentos

chamados Produtos de Degradação da Fibrina (PDF). A Plasmina actua sobre estes

fragmentos para formar PDF cada vez menores. Os produtos finais são eliminados pelo

sistema retículo-endotelial.

Figura 4: Visão clássica da Cascata de Coagulação. Cascata de coagulação quando o sangue é

exposto a uma superfície carregada negativamente (via intrínseca) ou quando é exposto ao factor

tecidual (via extrínseca). Legenda: HMWK – cininogénio de alto peso molecular, Fp –

fibrinopeptídeo, Pho – fosfolípidos, FT – Factor tecidual. (Retirado de (13))


Rute Nogueira 26

O TP avalia a via extrínseca da cascata da coagulação bem como a subsequente

via comum. Reflecte alterações em três dos factores dependentes da vitamina K (factor

II, VII e X), do fibrinogénio e do factor V. É utilizado na monitorização dos

anticoagulantes orais. Consiste na adição de uma tromboplastina completa (equivalente à

tromboplastina tecidual) a plasma citratado e na avaliação do tempo de coagulação após

adição de cálcio. Não requer activação por contacto pelo que é independente da via

intrínseca. Na tentativa de obviar a enorme discrepância entre os diferentes tipos de testes

que avaliam o TP, a OMS propôs que as tromboplastinas fossem padronizadas segundo

uma preparação de referência internacional e criou o International Sensitivity Index (ISI).

Após a determinação do ISI da tromboplastina, os resultados podem ser referenciados

como INR (razão entre o TP do paciente e o TP de referência, em segundos). A variação

normal do INR é entre 0,9 e 1,2. Um INR prolongado pode traduzir deficiência dos

Figura 5: Visão actual da Cascata da Coagulação. A cascata inicia-se pela via extrínseca após exposição (pela lesão

vascular) ou expressão (induzida por mediadores inflamatórios) do factor tecidual que conduz à activação do FVII. O

complexo FVIIa/FT activa os factores IX e X. Há medida que os níveis de FXa aumentam, o complexo FVIIa/FT é

inactivado pelo TFPI. A coagulação é mantida pelas reacções da via intrínseca iniciadas pelo FXIa. Ambas as vias

intrínseca e extrínseca convergem para a via comum na qual a pró-trombina é convertida em trombina que catalisa o

fibrinogénio em fibrina. Esta é estabilizada pelo FXIIIa. Legenda: Pho – fosfolípidos, FpA – Fibrinopeptídeo, FT –

Factor tecidual, TFPI – Inibidor da Via do Factor Tecidual. Activação → Amplificação ●-----● Inibição (Retirado

de (13))


Rute Nogueira 27

factores I, II, V, VII e X, deficiência de vitamina K, terapêutica com anticoagulantes ou

com heparina em doses elevadas, doença hepática grave, síndrome nefrótico, transfusões

sanguíneas densas. O INR pode estar diminuído em estados pró-trombóticos (como nos

períodos pós-parto ou pós-cirúrgico). Em doentes a fazer heparina, o INR deve variar

entre 2 e 3 na doença tromboembólica venosa não complicada, entre 3 e 3,5 na trombose

recorrente ou no Lúpus anticoagulante e entre 2,5 e 3,5 na trombose recorrente ou nos

doentes com prótese valvular.

O APTT avalia a via intrínseca da cascata da coagulação pelo que testa a pré-

calicreína, o cininogénio de alto peso molecular e os factores XII, XI, IX e VIII. Avalia

também a via comum (factores X, V, II e I). Utiliza-se na detecção de anticorpos lúpicos

e para a monitorização laboratorial da heparina. Neste teste utilizam-se substitutos de

fosfolípidos plaquetários como a cefalina ou a inositina que são tromboplastinas parciais,

incapazes de activar a via extrínseca. O plasma é colocado em presença de um destes

fosfolípidos pró-coagulantes, de um activador por contacto e de cálcio, sendo registado o

tempo que o plasma leva a coagular. A variação normal dos resultados obtidos pelo

Método de Manchester é de 36-48 segundos. O APTT pode estar prolongado em situações

como a deficiência dos factores I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII, pré-calicreína e HMWK,

doença hepática, coagulação intravascular disseminada (DIC) e transfusões sanguíneas

densas, terapêutica com heparina, anticoagulantes orais (doses altas) e trombolíticos. O

APTT pode estar diminuído em qualquer estado de hipercoagulabilidade.

O fibrinogénio é uma glicoproteína presente no plasma numa concentração de 2 a

4g/L. É sintetizado no fígado (1,7 a 5 g/dia) e nos megacariócitos e tem um tempo de

semivida de cerca de 3-5 dias. O doseamento do fibrinogénio é um teste para

determinação quantitativa in vitro dos níveis de fibrinogénio em plasma citratado. A

transformação do fibrinogénio em fibrina é induzida por adição de uma solução de

trombina cálcica em excesso. A concentração de fibrinogénio é directamente proporcional

ao tempo de coagulação. Este equipamento dá o valor de fibrinogénio através de um

cálculo interno do equipamento.

2.1.1.3. ADAMS HA-8160

No nosso LAC, este aparelho está integrado na secção de hematologia, sendo neste

caso utilizado sangue total. No entanto é necessário ter em atenção que em muitos

laboratórios esta análise é feita no Integra.

O HA-8160 (Figura 6) efectua a medição de hemoglobina glicada (HbA1c) e


Rute Nogueira 28

fornece as informações necessárias para o controlo do açúcar no sangue em pessoas

diabéticas. Pode medir HbA1c, HbA1, HbF estáveis e padrões fraccionados. Desde que o

analisador seja configurado para tal, também pode ser efectuada a medição de HbA2. As

medições efectuadas são precisas uma vez que HbA1c lábil, Hb carbamilato Hb e Hb

acetil são eluídos em separado do pico HbA1c estável.

A hemoglobina glicada é formada por reacções não enzimáticas entre a

hemoglobina e a glucose. A formação desta hemoglobina é irreversível, sendo que a sua

concentração sanguínea depende da vida média dos glóbulos vermelhos (120 dias) e da

concentração sérica de glucose.

O analisador utiliza a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) para o

doseamento destas hemoglobinas, através da utilização de uma coluna composta por

resina de troca iónica de carácter catiónico de fase reversa. As fracções obtidas são lidas

a 415 nm e 500 nm: HbA1c, HbA1, HbF, HbA2 e hemoglobinas variantes. Este aparelho

é capaz de diluir, hemolisar e remover a base de Schiff (resultado da reacção responsável

pela formação da hemoglobina glicada) automaticamente, sendo esta remoção feita com

tetrapolifosfato (pH 6,0) durante 2 minutos a 48ºC. Após 4,2 minutos obtém-se o

cromatograma.

Os valores normais da hemoglobina glicada situam-se entre os 4% e os 6%.

Valores acima de 7% podem estar associados a um maior risco de complicações crónicas.

O uso de pressões elevadas permite uma redução no diâmetro das partículas da

fase estacionária, localizada no interior da coluna cromatográfica, promovendo uma

separação mais eficiente dos componentes da amostra. Essa "miniaturização" das

partículas da coluna permite o uso de colunas menores, menores volumes de amostras e

um gasto menor de fase móvel. Assim sendo, em cromatografia líquida de alta pressão

trabalha-se na faixa dos microlitros (μL).

Figura 6: ADAMS A1C HA-8160 (Retirado de (2))


Rute Nogueira 29

2.1.1.4.VESMATIC 30/30 PLUS

Este equipamento (Figura 7) utiliza-se na determinação da velocidade de

sedimentação globular, possibilitando a determinação simultânea da velocidade de

sedimentação (VS) em 30 amostras de sangue. Ainda que a determinação seja automática,

os resultados são comparáveis aos resultados obtidos pelo método de Westergren (método

de referência). Os resultados são obtidos em 25 minutos (com homogeneização da

amostra). Caso seja necessária a utilização de ciclos rápidos, o tempo de análise pode ser

reduzido para 10 e 15 minutos para a primeira e segunda hora, respectivamente.

A VS globular é a velocidade a que os eritrócitos sedimentam, em amostra de

sangue anti coagulado, num determinado espaço de tempo. Quando uma amostra de

sangue anti coagulado fica em repouso, os eritrócitos vão-se aproximando uns dos outros

e agregam-se, formando estruturas cilíndricas semelhantes a pilhas de moedas

(Rouleaux). Numa primeira fase a VS é muito lenta (formação dos agregados), na fase

intermédia verifica-se uma sedimentação rápida ("descida" dos empilhamentos) e a fase

final é, novamente, mais lenta (compressão das formações de Rouleaux). Deste modo,

quanto mais comprido for o tubo, mais tempo o segundo período pode durar e maior a VS

pode ser, tal como no método de Westergren.

A amostra para este teste é sangue total anti coagulado com citrato de sódio 1/5.

O teste deve ser efectuado nas 2 horas após a colheita do sangue ou 6 horas se o sangue

for mantido a 4°C.

A VS representa a fase de resposta aguda a um estado inflamatório. Este valor é

medido num período de tempo específico e é bastante influenciado pela concentração de

algumas proteínas, cuja concentração plasmática varia na presença de processos

inflamatórios ou outras patologias. O valor é também afectado por algumas propriedades

dos eritrócitos e por situações de anemia. Valores elevados de VS podem acontecer em

situações como mieloma múltiplo, leucemia, linfomas, cancro da mama e pulmão, artrite

Figura 7: VESMATIC 30/30 Plus (Retirado de (3))


Rute Nogueira 30

reumatóide, falha pulmonar, metástases no fígado e doenças inflamatórias agudas e

crónicas.

2.1.2. Técnicas manuais

2.1.2.1.Coombs directo e indirecto

O teste de Coombs tem como objectivo identificar a existência de anticorpos que

actuam contra os glóbulos vermelhos no organismo, sendo que estes anticorpos se podem

ligar às hemácias e provocar a sua destruição prematura (hemólise). Este teste pode ser

feito de forma directa ou indirecta.

O Coombs directo vai permitir detectar a existência de anticorpos que estão

ligados à superfície dos glóbulos vermelhos. Esta detecção é possível porque o sistema

imunitário produz anticorpos quando detecta algo que possa vir a ser prejudicial para o

organismo, de modo a tentar destruir esse agente prejudicial. Em casos em que a detecção

que o sistema imunitário faz está incorrecta, os anticorpos produzidos também não vão

ser capazes de destruir o agente prejudicial, o que pode causar graves problemas de saúde.

Por sua vez, em alguns casos, estes anticorpos vão atacar os glóbulos vermelhos,

destruindo-os e levando a uma anemia hemolítica. Este exame é muito útil na presença

de eritroblastose fetal em recém-nascidos ou em casos em que existe incompatibilidade

ABO + Rh.

O Coombs indirecto é útil na identificação de anticorpos circulantes na amostra

de soro, os quais vão actuar contra uma série de glóbulos vermelhos, mas que ainda não

estão ligados. Geralmente, este exame é utilizado em rastreios pré-natal em mulheres

grávidas, na detecção de anticorpos anti-D circulantes em mães Rh negativas

sensibilizadas ou em testes de sangue antes de uma transfusão de sangue.

Um resultado negativo indica que o utente está normal, enquanto um resultado

positivo indica que o utente tem anticorpos que actua contra as próprias células do

organismo, devido a diversas razões.

O teste de Coombs pode ser usado para colaborar numa diversidade de

diagnósticos: anemia hemolítica auto-imune, anemia hemolítica induzida por drogas,

eritroblastose fetal, mononucleose infecciosa, infecção por micoplasma, sífilis, leucemia

linfocítica crónica ou outra doença linfoproliferativa, lúpus eritematoso sistémico, entre

outras.


Rute Nogueira 31

2.1.2.2. Grupos sanguíneos

Os grupos sanguíneos ABO são normalmente feitos, colocando os eritrócitos com

soro Anti-A e Anti-B. Os anticorpos monoclonais exibem um alto grau de potência,

avidez e especificidade, pelo que se deve ter muito cuidado de modo a evitar

contaminações cruzadas. Os reagentes Anti-A, Anti-B e Anti-AB têm como objectivo a

detecção e identificação in vitro dos grupos sanguíneos humanos ABO, por aglutinação

directa.

2.1.2.3. Factor RhD

O estabelecimento de um grupo correcto RhD é fundamental na execução de

transfusões seguras. Alguns indivíduos exibem uma redução quantitativa na expressão do

seu antigénio RhD e são classificados como D fracos (Du). Outros apresentam uma

variação qualitativa na expressão do antigénio D e são referidos como D parcial.

Indivíduos que sejam D fraco também podem ser D parcial.

Esta técnica destina-se à detecção in vitro e identificação de grupos sanguíneos

RhD humanos em amostras de doentes por aglutinação directa, e em amostras de dadores

e neonatais por teste anti globulina indirecto.

2.1.2.4. Factor Du

Na determinação do Factor Du, prepara-se uma suspensão de 3-5% de glóbulos

vermelhos a testar (lavados 3 a 4 vezes com soro fisiológico), adicionando-se, por

exemplo, 50 µL de glóbulos com 950 µL de soro fisiológico. Em tubo marcado coloca-

se uma gota de reagente anti-D (IgG + IgM) e junta-se uma gota da suspensão preparada.

Depois de bem misturada, incuba-se a 37ºC durante 15 minutos. Lava-se duas vezes com

soro fisiológico e rejeita-se o sobrenadante na última lavagem. Junta-se duas gotas de

globulina anti-humana de Coombs, mistura-se bem e centrifuga-se a 1000 rpm durante

cerca de 20 segundos. Agitando o tubo com cuidado, observa-se macroscopicamente ou

microscopicamente, verificando a existência de aglutinação (Du positivo) ou a ausência

(Du negativo).

2.1.2.5. Teste de Falciformação

A anemia falciforme é uma doença hereditária que se caracteriza pela alteração

dos glóbulos vermelhos, fazendo-os semelhantes a uma foice (falciforme). Tendo a sua

membrana alterada, estas células rompem-se mais facilmente, provocando a anemia.


Rute Nogueira 32

No Biolabor, existem dois métodos diferentes através dos quais se detecta a

presença de células falciformes: sem ou com agente redutor (metabisulfito de sódio a

2%), com posterior observação ao microscópio.

Para que o teste de falciformação seja positivo é necessário que a concentração de

hemoglobina S seja pelo menos de 20% da hemoglobina total.

2.1.2.6. Tempo de coagulação

O tempo de coagulação é uma técnica manual em que se determina os valores do

tempo de coagulação do doente. Insere-se em dois tubos de hemólise, em vidro calibrado,

sangue total acabado de colher por punção venosa, até cerca de metade da sua altura. Os

tubos são colocados em banho-maria, verticalmente, a 37ºC e, de 2 em 2 minutos, deve

inclinar-se cuidadosamente um dos tubos, verificando se a coagulação já se iniciou. A

partir do 6º minuto, a verificação deve ser feita de minuto a minuto. A partir do momento

em que o processo de coagulação tiver início, começa a inclinar-se o segundo tubo, de 30

em 30 segundos, até que haja a formação completa do coágulo, sendo que o valor

verdadeiro do tempo de coagulação corresponde a este 2º tubo. Consideram-se valores

normais de tempo de coagulação, valores entre 7 e 12 minutos.

2.1.2.7. Tempo de Hemorragia pelo Método de Duke

Para o cálculo do tempo de hemorragia, após desinfecção do lóbulo da orelha do

utente (sem esfregar), faz-se uma ligeira incisão com uma lanceta. Depois, sem se tocar

na orelha com os dedos e sem apertar ou esfregar, absorve-se o sangue que vai escorrendo,

com um pedaço de papel absorvente. O tempo de hemorragia corresponde exactamente

ao tempo que medeia entre o aparecimento da primeira e da última gota de sangue,

considerando-se valores normais de tempo de hemorragia entre 1 e 5 minutos.

2.1.2.8. Retracção do coágulo

No fim da colheita de sangue, deve ser colocada uma quantidade certa de sangue

total (5 mL, por exemplo) num tubo graduado de vidro, seco e bem limpo, e registar a

quantidade. De seguida, colocar o tubo na estufa ou em banho-maria a 37ºC e deixar que

a coagulação se proceda totalmente, sem nunca agitar o tubo. Quando a coagulação estiver

completa, regista-se o volume ocupado pelo coágulo no tubo. O valor da retracção do

coágulo, expresso em percentagem, calcula-se através da seguinte fórmula, considerando-

se como valores normais de retracção do coágulo 48% a 90%.


Rute Nogueira 33

% Retracção do coágulo = A ×100

B

A corresponde ao volume ocupado pelo coágulo no tubo graduado.

B corresponde ao volume total de sangue total colocado no tubo graduado.

2.1.2.9. Velocidade de sedimentação (micrométodo)

Em situações específicas, como no caso de colheitas em crianças ou em adultos

em que a punção venosa é difícil, pode recorrer-se ao micrométodo para efectuar a

determinação da velocidade de sedimentação. Nesta técnica, deve pipetar-se citrato de

sódio até à primeira marca da pipeta (correspondente ao valor 70 na escala de leitura) e,

de seguida, pipetar o sangue total (em EDTA) até à última marca da pipeta. De modo a

misturar bem o citrato com o sangue, deve escoar-se o conteúdo da pipeta para uma

lâmina e pipetar novamente o sangue citratado até à marca zero na escala de leitura. Sendo

um método manual, demora mais algum tempo que o método automático, devendo

esperar-se uma hora até se efectuar a leitura.

2.1.2.10. Pesquisa de Eosinófilos

O objectivo desta pesquisa é a observação de eosinófilos, em exsudados faríngeos

ou nasais, calculando-se a sua percentagem em relação aos outros glóbulos presentes na

lâmina. A observação é feita com a objectiva de imersão. De acordo com o pedido feito

pelo médico, deve ser preparada uma lâmina para o exsudado faríngeo e duas para o

exsudado nasal (direito e esquerdo). As lâminas obtidas são coradas com os corantes de

hematologia (HEMACOLOR – MERCK). Podem haver situações em que o médico pede

para que a pesquisa seja feita na expectoração, situação em que se devem fazer dois

esfregaços finos da zona mais purulenta da expectoração.

2.1.2.11. Estudo morfológico do sangue periférico

Quando é feito o pedido para o estudo morfológico do sangue periférico, procede-

se à picada da ponta do dedo do utente, com lanceta própria, fazendo-se a recolha de uma

gota de sangue para uma ou mais lâminas, fazendo-se um esfregaço fino. Depois de seca,

a lâmina é corada com os corantes HEMACOLOR – MERCK:

HEMACOLOR Solução 1: 5 x 1 segundo




Rute Nogueira 34

Lavar com solução tampão (diluição de uma ampola de Titrisol pH 7.2

com água destilada até perfazer 1000 mL): 45 segundos

Deixar secar ao ar

De seguida, é feita a observação ao microscópio com a objectiva de imersão e

registam-se as características da série eritrocitária, plaquetária e leucocitária observada.

2.2. Microbiologia

2.2.1. Equipamentos

2.2.1.1.VITEK

O Vitek 2 é um sistema que utiliza cartões com reagentes colorimétricos, os quais

vão ser inoculados com uma suspensão microbiana de cultura pura. O perfil de

desenvolvimento é reproduzido automaticamente.

Os cartões reactivos têm 64 poços, sendo que cada um contém um único substrato

de teste. Com estes substratos são medidas várias actividades metabólicas como a

acidificação, a basificação, hidrólise enzimática e o desenvolvimento em presença de

inibidores. As placas são seladas em ambos os lados com uma película transparente que

impede o contacto entre as diferentes misturas de substrato por microorganismos,

enquanto permite a transmissão de um nível apropriado de oxigénio. Cada cartão tem um

tubo inserido antes da transferência para a inoculação. Todas as placas inseridas no

aparelho têm códigos de barras que contêm informações sobre o tipo de produto, lote,

data de validade e um identificador específico que pode ser ligado com a amostra, quer

antes ou quer depois de carregar o cartão para o sistema.

Existem quatro tipos de cartas de identificação de diferentes tipos de organismos:

ANC: Bactérias anaeróbias e corinebactétias

BCL: Bacilos Gram Positivos formadores de esporos (indústria)

CBC: Corinebactéria (indústria)

GN: Cocos e Bacilos Gram Negativos e Não-fermentadores

GP: Cocos e Bacilos Gram Positivas formadoras de esporos

NH: Neisseria Haemophilus

YST: Leveduras e organismos

Depois de se seleccionar as colónias isoladas de uma placa primária, faz-se uma

subcultura do microorganismo a ser testado em meio gelosado apropriado e incuba-se.

Depois, transfere-se para dentro de um tubo com solução salina estéril um número

suficiente de colónias morfologicamente similares, que correspondam a densidades de


Rute Nogueira 35

acordo com cada carta. O tempo de espera da suspensão não deve exceder os 30 minutos

antes da inoculação da carta.

A carta ANC baseia-se em métodos bioquímicos estabelecidos e em substratos

recentemente desenvolvidos. Existem 36 testes bioquímicos que medem a utilização da

fonte de carbono e a actividade enzimática. Os resultados finais estão disponíveis em

aproximadamente seis horas. A carta de identificação ANC utiliza-se para a identificação

automática das espécies de microrganismos anaeróbios e Corynebacterium de maior

relevância clínica. A suspensão de microrganismo homogénea deve ter uma densidade

equivalente a um padrão McFarland nº 2,70 e 3,30, usando o DensiChek.

A carta de identificação BCL é apenas aplicada à indústria e utiliza-se para a

identificação automatizada de microrganismos aeróbios formadores de endósporos da

família Bacillaceae, sendo que o seu uso clínico não está autorizado. O mesmo acontece

com a carta de identificação CBC que é utilizada na identificação de corinebactérias

(género Corynebacterium e géneros relacionados).

A carta de identificação GN é usada para a identificação automática dos bacilos

gram-negativos fermentadores e não-fermentadores de maior relevância clínica. A carta

GN baseia-se em métodos bioquímicos estabelecidos e substratos recentemente

desenvolvidos, que medem a utilização da fonte de carbono, a resistência e a actividade

enzimática. Existem 47 testes bioquímicos e um poço de controlo negativo. O poço de

Controlo Negativo para a descarboxilase (poço 52) é usado como referência do valor de

base para os poços de teste descarboxilase. Os resultados finais estão disponíveis em

aproximadamente dez horas ou menos. Para a utilização desta carta, a suspensão de

microorganismo tem de ter uma densidade equivalente a um padrão de McFarland nº 0,50

a 0,63, usando o DensiChek.

A carta de identificação GP usa-se na identificação automática dos

microrganismos gram-positivos de maior relevância clínica. A carta GP baseia-se em

métodos bioquímicos estabelecidos e em substratos recentemente desenvolvidos. Existem

43 testes bioquímicos que medem a utilização da fonte de carbono, a resistência e a

actividade enzimática. Os resultados finais estão disponíveis em aproximadamente oito

horas ou menos. A suspensão de microorganismo homogénea tem de ter uma densidade

equivalente a um padrão de McFarland nº 0,50 a 0,63, usando o DensiChek.

A carta de identificação NH usa-se na identificação automática dos

microrganismos fastidiosos de maior relevância clínica. A carta NH baseia-se em

métodos bioquímicos e substratos recentemente desenvolvidos, que medem a utilização


Rute Nogueira 36

da fonte de carbono e a actividade enzimática. Existem 30 testes bioquímicos e os

resultados finais da identificação estão disponíveis em aproximadamente seis horas. A

suspensão de microrganismo homogénea deve ter uma densidade equivalente a um

padrão McFarland nº 1,80 a 2,20, usando um DensiChek.

A carta de identificação YST usa-se na identificação automática das leveduras e

microrganismos similares de maior relevância clínica. A carta YST baseia-se em métodos

bioquímicos estabelecidos e em substratos recentemente desenvolvidos. Existem 46 testes

bioquímicos que medem a utilização da fonte de carbono, a utilização da fonte de

nitrogénio e a actividade enzimática. Os resultados finais estão disponíveis em

aproximadamente dezoito horas. A suspensão de microrganismo homogénea deve ter

uma densidade equivalente a um padrão McFarland nº 1,80 a 2,20, usando o DensiChek.

Na utilização desta carta há que ter em atenção que as espécies filamentosas podem

recolher pequenas quantidades de glucose proveniente dos meios de isolamento, o que

pode levar à ocorrência de falsos positivos. Assim, é de evitar raspar ou esfregar a gelose

durante a preparação da suspensão do microrganismo. No que se refere às estirpes que

não formam rapidamente uma suspensão suave em solução salina, recomenda-se a

utilização de uma zaragatoa húmida para realizar a suspensão, sendo que não se deve

esfregar a superfície da gelose quando estiver a preparar uma suspensão com uma

zaragatoa húmida.

Os Testes de Sensibilidade aos Antibióticos (AST) são utilizados nos testes

automatizados, quantitativos ou qualitativos, da sensibilidade de colónias isoladas da

maior parte dos bacilos aeróbios Gram-negativos de relevância clínica, Staphylococcus

spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., S.pneumoniae e leveduras.

Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer microrganismo que

contribua para um processo infeccioso que justifique uma terapia antimicrobiana. Os

testes de sensibilidade são, maioritariamente, aconselhados quando se considera que o

microrganismo encontrado possa pertencer a uma espécie que mostre resistência aos

agentes mais usados. As colónias isoladas de cada tipo de microrganismo que possa

desempenhar um papel patogénico são seleccionadas da placa de gelose e testadas quanto

à sensibilidade. Estes testes são então examinados e a concentração mínima inibitória

(CMI) é determinada. A CMI obtida com um teste de diluição pode indicar ao médico a

concentração de um agente antibiótico necessária no local da infecção para inibir o

microrganismo infeccioso. A CMI é então determinada a partir da concentração mais

baixa em que ocorre inibição do crescimento. Um critério de interpretação (sensível,


Rute Nogueira 37

intermédio ou resistente) pode então ser atribuído a um resultado da CMI, para ajudar na

orientação da terapêutica. Para alguns antibióticos, como a gentamicina e a

estreptomicina de alto nível, é criado um resultado qualitativo. Os procedimentos padrão

e de referência baseiam-se em testes de sensibilidade que requerem 16 a 24 horas de

incubação para as bactérias e 24 a 48 horas para as leveduras.


2.2.2.1. Coloração de Gram

A coloração de Gram permite diferenciar as bactérias em dois grandes grupos,

tendo por base a sua reactividade aos corantes de Gram: Gram-Positivo e Gram-

Negativo. Revela grande importância clínica, uma vez que permite obter informação

valiosa sobre as bactérias que causam determinada doença e, ao mesmo tempo, a

reactividade ao Gram ajuda também a dirigir e seleccionar os testes necessários à

identificação das bactérias.

2.2.2.2. Coloração de Ziehl (modificada)

A coloração de Ziehl modificada é uma coloração de bactérias mais agressiva que

a coloração de Gram e é utilizada com bactérias que coram mal com o Gram. O

fundamento desta técnica de coloração é a álcool-ácido-resistência das bactérias, depois

da exposição a um corante básico (por exemplo, micobactérias). Esta característica de

álcool-ácido-resistência deve-se à existência de lípidos estruturais, como o ácido

micólico, que sendo bastante longos e com grande número de ligações cruzadas,

complexam-se facilmente com os corantes básicos, resistindo à acção removedora por

parte dos ácidos.

2.2.2.3. Coloração de azul-de-metileno

A coloração de azul-de-metileno tem como objectivo realizar o exame a fresco

das fezes para pesquisa de leucócitos e eritrócitos.

2.2.2.4. BK directo e BK cultural

As amostras mais utilizadas neste procedimento são a expectoração e a urina

asséptica. Numa primeira parte, as amostras utilizadas devem ser descontaminadas. As

expectorações que forem consideradas “saliva” podem ser aceites para o exame mico-

bacteriológico. Se for uma urina, apenas os sedimentos devem ser utilizados. A


Rute Nogueira 38

descontaminação das amostras é feita segundo o Kit respectivo. Deve ser adicionado o

tampão de neutralização para que se atinja um pH próximo de 6,8 e a centrifugação deve

ser feita em tubos de Falcon. Antes de destapar os tubos, devem aguardar-se alguns

minutos, decantando depois o sobrenadante para um contentor com lixívia a 5% preparada

no dia. O sedimento obtido é usado para a preparação de lâminas para coloração ou para

a sua cultura.

BK directo (Tabela 1): Preparam-se os esfregaços, em duplicado e em lâminas

novas, com uma gota de albumina bovina, para facilitar a adesão. As lâminas não devem

ser expostas à luz solar ou UV. Depois de secas e fixadas com o bico de Bunsen, são

coradas pela coloração de Ziehl-Neelsen modificado (bacilos álcool-ácido resistentes

corados de vermelho). Depois utiliza-se fucsina filtrada e evita-se a secagem do esfregaço

durante a coloração com fucsina, obedecendo aos tempos recomendados. O exame de

cada esfregaço deve ser feito durante 5-15 min e 100 campos antes de dar o resultado

negativo. O resultado positivo deve ser dado como “Presença de BAAR“ e em +++.

Tabela 1: Resultados possíveis do BK directo

Resultado ZN (1000x)

Não se observaram BAAR 0

Número exacto de BAAR 1-9/ 100 Campos

+ 10-99/ 100 Campos

++ 1-10/ Campo

+++ >10/ Campo

BK cultural (Tabela 2): O sedimento obtido após tratamento da amostra é semeado

(cerca de 200 µl) em meio de Lowenstein-Jensen e incubado a 37ºC durante 60 dias. Os

tubos devem estar inclinados durante 3-4 dias a cobrir a superfície, colocando-se depois

na vertical. A incubação deve ser com 10% de CO2. Os tubos devem ser examinados 1 a

2 vezes/semana. Se for detectado crescimento, realiza-se um esfregaço para confirmação

de BAAR. Se o for crescimento positivo, deve-se quantificar as colónias:

Tabela 2: Resultados possíveis para o BK cultural

Resultado Número de colónias

+ < 10 colónias

++ 10-100 colónias

+++ > 100 colónias

++++ Incontáveis


Rute Nogueira 39

2.2.2.5. Marcação de placas dos meios de cultura

A marcação de placas é um procedimento tão ou mais importante que todos os

restantes procedimentos, uma vez que um bom resultado obtido depende de uma boa

identificação das placas, de modo a não gerar erros nem trocas de resultados.

Todas as placas com meios de cultura para exames bacteriológicos são marcadas,

no verso, com o número do tubo, o nome do utente, a data da sementeira, o produto

semeado e o número da amostra, no caso de se tratarem de amostras múltiplas. Por outro

lado, todas as placas com meios de cultura que tenham sido preparados e distribuídos no

laboratório devem conter sempre o nome do meio de cultura e a respectiva data de

validade.

2.2.2.6. Exsudado vaginal e uretral

A partir do exsudado vaginal podem ser feitos dois tipos de exames: o exame

directo e o exame cultural. O exame directo engloba o exame citológico, o exame

parasitológico e a coloração de Gram. Por outro lado, no exame cultural utilizam-se os

meios de gelose de sangue, gelose de chocolate (atmosfera CO2) e Sabouraud.

Para a identificação das estirpes utilizam-se testes auxiliares de identificação e/ou

as cartas de identificação do aparelho VITEK. Na identificação de leveduras efectua-se a

prova de filamentação.

Existem também alguns testes específicos para este exsudado. O teste do

Mycoplasma permite a cultura, identificação, numeração e testes de susceptibilidade aos

antibióticos dos micoplasmas urogenitais (Mycoplasma hominis e Ureaplasma

urealyticum). O teste da Chlamydia permite a pesquisa directa da Chlamydia trachomatis

no exsudado, através do teste rápido imunocromatográfico para detecção do antigénio.

2.2.2.7. Pesquisa de Treponema

A colheita para esta pesquisa é efectuada ao nível das lesões. A observação ao

microscópio é feita juntando uma gota de tinta-da-china. Os treponemas aparecem móveis

e com espirais regulares, sendo o resultado dado como positivo ou negativo.

2.2.2.8. Pesquisa de Leishmania

Para esta pesquisa são feitos dois esfregaços finos de sangue periférico, em

lâminas de vidro, as quais são coradas com coloração HEMACOLOR. A observação é


Rute Nogueira 40

feita ao microscópio com objectiva de imersão, de forma a detectar a eventual presença

do parasita.

2.2.2.9. Pesquisa de estreptococos do grupo B

O produto a analisar é colhido com zaragatoa de Dacron e semeado em meio

gelosado de isolamento e em identificação de estreptococos do grupo B (Meio Granada)

ou para meio de cultura de gelose de sangue. O meio é incubado durante 24 horas em

anaerobiose e, no caso de não serem observadas colónias suspeitas, incubar mais 24 horas.

As placas semeadas lêem-se do seguinte modo:

a. Meio de Granada: Qualquer intensidade de pigmentação laranja das

colónias é considerada como resultado Positivo.

b. Meio de gelose de sangue: No caso de suspeita da presença de

estreptococos (colónias isoladas, Gram +, catalase negativa) proceder à

sua identificação no VITEK.

Também é possível colocar o produto num caldo de enriquecimento selectivo

(Todd-Hewit) e depois efectuar uma repicagem para um meio de isolamento e

identificação de estreptococos do grupo B.

2.2.2.10. Pesquisa de Plasmodium

Com uma lanceta própria picar a ponta do dedo do utente e recolher uma gota de

sangue, pressionando um pouco se necessário, para uma ou mais lâminas, fazendo um

esfregaço fino. Depois de secas, corar com a coloração HEMACOLOR e observar ao

microscópio com a objectiva de imersão (40x e 100x), verificando a presença ou ausência

de Plasmodium. Caso se observe a presença do parasita, sempre que possível, este deve

ser classificado com base nas suas características morfológicas.

Em situações em que é pedida a técnica da gota espessa devem ser colocadas

duas gotas de sangue sem anticoagulante em cada lâmina e espalhar com movimentos

circulares durante 1-2 minutos para desfibrinizar o sangue. Deixar secar bem na estufa a

37ºC durante 1 hora ou 24 horas à temperatura ambiente. Após a secagem deve-se

deshemoglobinizar a gota espessa com água destilada e proceder à coloração referida no

caso anterior.


Rute Nogueira 41

2.2.2.11. Pesquisa de Gonococos

O produto colhido é semeado em gelose de chocolate e incubado na estufa a

37ºC, durante 48 h, em atmosfera de CO2. Depois, é feita a observação das placas e

identificação das colónias suspeitas (diplococos Gram-, catalase +, oxidase +), dando o

resultado como positivo ou negativo.

2.2.2.12. Pesquisa de estreptococos beta-hemolíticos

A sementeira é feita em gelose de sangue e incubada a 37ºC durante 24 a 48

horas e incubada na estufa a 37ºC, durante 24 a 48 horas. Pela observação da placa é

possível detectar a presença ou ausência de hemólise do tipo beta. Caso esta hemólise

esteja presente confirmar a presença de Estreptococos Beta-Hemolíticos (Gram +,

cadeias, catalase negativa). O resultado é dado como Positivo ou Negativo.

2.2.2.13. Expectoração

O exame directo é feito pela coloração de Gram e pela coloração de Ziehl. O

exame cultural faz-se em meio de gelose de sangue (24 a 48 horas, 37ºC), gelose de

chocolate (48 horas em atmosfera de CO2, a 37ºC), Sabouraud (quando requisitado exame

micológico) e Meio Löwenstein-Jensen (quando requisitado exame cultural de BK).

Na identificação das estirpes, são utilizadas as cartas de identificação do VITEK

e posteriormente fazem-se as cartas de susceptibilidade (antibiogramas) também no

mesmo aparelho.

2.2.2.14. Hemoculturas

Na colheita: Desinfectar a borracha do frasco de hemocultura com álcool a 70%,

desinfectar a área a puncionar em dois tempos (Limpar com álcool a 70% e desinfectar a

pele com betadine), não voltar a palpar a veia, colher cerca de 5 a 10 mL de sangue,

inocular o frasco com a máxima assepsia possível. Não é necessário mudar de agulha

antes de introduzir o sangue no frasco. Quando se realiza a colheita para outros exames

analíticos em simultâneo, o frasco de hemocultura tem de ser o primeiro a ser inoculado,

desinfectar novamente a tampa do frasco com álcool a 70%. O momento ideal da colheita

é no estado de “calafrio” (antes da subida da temperatura).

No exame cultural, o sangue recolhido é inoculado no meio de cultura Hemoline

Performance Diphasique que vai a incubar na estufa a 37ºC durante o tempo necessário

à conclusão da análise.


Rute Nogueira 42

Repicagem: Columbia + 5% sangue de carneiro, 37ºC, 24 a 48 horas e

Chocolate + Polivitex, 37ºC , 48 horas em atmosfera de CO2 (GENBOX CO2).

Para a identificação da estirpe, faz-se a coloração de Gram das colónias isoladas,

testes auxiliares de identificação (ID color Catalase) e eventualmente Cartas de

identificação do sistema automatizado VITEK. Depois, efectuam-se cartas de

susceptibilidade do sistema automatizado VITEK.

2.2.2.15. Uroculturas

No exame directo, faz-se a observação microscópica do sedimento urinário, para

avaliação dos elementos presentes (células epiteliais, leucócitos, piócitos, eritrócitos,

cristais, granulações, bactérias, leveduras e, eventualmente, elementos parasitários), a

coloração de Gram (se leucocitúria e/ou bactériúria) e a coloração de Ziehl (quando

pedido ou se existe discrepância citobacteriológica).

No exame cultural, faz-se a inoculação da urina com ansa calibrada de 10 mL,

para contagem de colónias, em meio selectivo para cultivo de urinas (meio CPS ID,

CLED ou outro) e a incubação na estufa a 37ºC durante 18 a 24 horas. O meio Columbia

+ 5% sangue de carneiro pode ser semeado sempre que haja pedido específico que o

justifique, fazendo-se incubação na estufa a 37ºC durante 24 a 48 horas. O meio

Lowenstein-Jensen é utilizado sempre que haja pedido de exame cultural de BAAR ou de

BK. O meio Sabouraud-Gentamicina-Cloranfenicol utiliza-se quando é pedido exame

micológico.

A identificação das estirpes faz-se através de meio de cultura CPS ID e é possível

a identificação directa ou presuntiva de algumas estirpes bacterianas:

o Colónias rosa (-glucuronidase +) e Indole (+) = E. coli

o Colónias castanho claro /escuro, TDA (+) e Indole (-) = Proteus mirabilis

o Colónias castanho claro /escuro, TDA (+) e Indole (+) = Proteus

indolagene, Monganella, Providencia

o Colónias azul turquesa (-glucosidase +), cocos = Enterococcus

No meio Columbia + 5% sangue de carneiro, com auxílio da coloração de Gram

e do teste auxiliar de identificação ID color catalase pode-se orientar a identificação do

seguinte modo:

o Bacilos Gram (+), catalase (+)..................................Corinebacterium ?

o Bacilos Gram (+), catalase (+) , com β-hemólise às 48 h ...Listeria ?

o Bacilos Gram (+), catalase (-) ........................................... Lactobacilos ?


Rute Nogueira 43

o Cocos Gram (+), catalase (-) ........................................... Streptococcus ?

o Cocos Gram (+), catalase (+).........................................Staphylococcus ?

Através dos testes auxiliares de identificação ou das cartas de identificação do

sistema automático VITEK, é possível identificar correctamente todas as estirpes que não

tenham sido identificadas directamente a partir do meio de cultura CPS ID. Depois de

tudo isto, fazem-se cartas de susceptibilidade no VITEK, antifungigrama do sistema

automatizado e eventualmente antibiograma manual em galerias.

2.2.2.16. Coprocultura

É o exame bacteriológico das fezes e o seu pedido engloba a pesquisa de

Salmonella, Shigella e Campylobacter, excepto em pedidos específicos de

Staphylococcus.

No exame directo, faz-se exame a fresco, com ou sem Azul-de-metileno, para

pesquisa de eritrócitos e leucócitos e coloração de Gram (quando as fezes são diarreicas),

para avaliação da riqueza da flora intestinal, o equilíbrio ou desequilíbrio entre as

proporções de germes Gram (+) e Gram (-).

No exame cultural, as fezes líquidas são usadas directamente para o exame a

fresco e para a sementeira. As fezes sólidas são suspensas em soro fisiológico, antes de

proceder ao exame directo e à sementeira. As fezes em meio de transporte devem ser

semeadas directamente do meio. Os meios de cultura usados para a sementeira são SS ou

SM2/HEKT, Campylosel (Gelose Columbia 5% sangue em substituição do Campylosel),

Rappaport (com posterior passagem para o meio de SS às 24 horas) e Chapman ou

Columbia (se pedido específico para Staphylococcus). As amostras devem ser semeadas

até 1 hora após a colheita ou, caso isto não seja possível, devem estar em meio de

transporte à temperatura ambiente (devido ao Campylobacter).

Os meios de cultura são colocados a 37ºC durante 24 a 48 horas. O meio de

Campylosel deve ser colocado de imediato em atmosfera de CO2, durante 48 a 72 horas.

Na identificação das estirpes utilizam-se os testes auxiliares e cartas de

identificação do VITEK, fazendo-se também os respectivos antibiogramas.

2.2.2.17. Exames bacteriológicos de exsudados

O exame directo é feito com a coloração de Gram. Para o exame cultural semeia-

se em meio de gelose de sangue (24 a 48 horas), em meio de chocolate (48 horas em


Rute Nogueira 44

atmosfera de CO2) e em meio de Sabouraud (quando requisitado exame micológico). No

exsudado nasal também pode ser utilizado o meio de Chapman. As estirpes são

identificadas a partir de cartas de identificação do VITEK, o qual também efectua o

respectivo antibiograma.

2.2.2.18. Exames micológicos

No caso dos exsudados, a sementeira é feita em meio de Gelose Sabouraud

Gentaminicina Cloranfenicol (G.S.G.C.) efectuada directamente com a zaragatoa

utilizada na colheita das amostras (incubação a 35ºC durante 72 horas).

No caso das fezes, se forem fezes moldadas, suspender aproximadamente 8 mg

de fezes com 1 mL de soro fisiológico e inocular por inundação, cerca de 125 µl da

suspensão em meio de G.S.G.C. Se forem fezes líquidas, diluir 1 gota de fezes em 4 mL

de soro fisiológico (25 mg/ 4mL) e inocular por inundação, 200 µl da suspensão em meio

de G.S.G.C. A incubação é de igual modo feita a 37ºC durante 72 horas. A contagem de

colónias faz-se através do seguinte cálculo: Nº de colónias na placa de Petri x 103 UFC/

g de fezes.

Nas faneras (pêlos, unhas e pele), a sementeira faz-se directamente do produto

no meio de G.S.G.C, em duplicado (duas placas de Petri ou uma placa de Petri e um tubo).

Um dos meios (Placa de Petri) é colocado a 35ºC durante 72 horas, para identificação de

leveduras e fungos de crescimento rápido e o outro (Placa de Petri ou tubo) colocado à

temperatura ambiente durante 4 a 5 semanas, para identificação de Dermatófitos.

Nas micoses profundas (expectoração, pus, etc.), a sementeira da amostra é feita

directamente, com auxílio de ansa, em meio de G.S.G.C. em duplicado, incubando-se

uma placa a 35ºC e outra à temperatura ambiente, durante 72 horas.

Nas urinas, faz-se a sementeira de 10 µL de urina sem centrifugação em meio de

G.S.G.C. e incuba-se a 35ºC durante 72 horas.

2.2.2.19. Exame parasitológico

Nas expectorações, uma pequena parte da expectoração, previamente

homogeneizada, é observada entre lâmina e lamela, com ou sem adição de uma gota de

Lugol. Podem-se encontrar parasitas como: Entamoeba histolytica, Pneumocystus carini,

Echinococcus granulosus, Ascaris lumbricóides, Strongyloides stercolaris, Ancylostoma

duodenale/Necator americanus, Schistosoma, Fasciola hepática e Paragonimus

westermani.


Rute Nogueira 45

O exame parasitológico de uma urina é efectuado no sedimento que resulta da

sua centrifugação. A observação microscópica pode ser feita com ou sem adição de uma

gota de Lugol (o movimento das Trichomonas vaginalis é maior sem o Lugol). Depois,

pode corar-se lâminas com a coloração HEMACOLOR para melhor apreciação da

morfologia dos parasitas eventualmente presentes, os quais podem ser Trichomonas

vaginalis, Schistosoma haematobium (urina recolhida após o utente ter corrido e saltado

durante algum tempo), Microfilárias e Enterobius vermicularis (oxiuros).

No caso de exsudados vaginais e uretrais, o exame parasitológico consiste na

observação microscópica a fresco.

No caso do sangue, exsudados nasais, faríngeos, oculares, auriculares, o exame

parasitológico consiste na observação microscópica, com objectiva de imersão, de

esfregaços de sangue corados pelo HEMACOLOR.

No exame parasitológico das fezes (pesquisa de ovos, quistos e parasitas), devem

observar-se atentamente as amostras de fezes, para detectar a possível presença de

parasitas visíveis a olho nu, que possam ter sido eliminados parcial ou totalmente

(oxiuros, Ascaris lumbricóides, anéis de ténia...). Depois, retira-se uma pequena porção

de fezes (de vários locais, caso as fezes sejam moldadas), para um tubo de vidro e

adiciona-se água comum ou soro fisiológico. Após a obtenção de uma suspensão, deixa-

se repousar durante 5 minutos e muda-se para um outro tubo cerca de 3 quartos da

suspensão, (de preferência para um tubo com fundo cónico), adicionando umas gotas de

ácido acético e um pouco de éter e tapar o tubo. Depois da centrifugação, rejeita-se todo

o sobrenadante e agita-se bem o sedimento, com posterior observação ao microscópio

directamente ou após a adição de Lugol. Para a pesquisa dos oocistos do Cryptosporidium

nas fezes devem ser feitos esfregaços finos das fezes que são corados pela coloração de

Ziehl. Estes oocistos aparecem corados de vermelho vivo, quando observados ao

microscópio com a objectiva de imersão.

2.3. Imunologia

2.3.1. Equipamentos

2.3.1.1. Cobas e411 Roche

O cobas e411 é um aparelho de alta fiabilidade, que utiliza a excelência analítica

da electroquimioluminescência, originando um excelente sistema de imunoensaios. Tem

disponíveis dezoito parâmetros de imunologia, oferecendo uma elevada disponibilidade

e tempos de resposta de 9 a 18 minutos. As células de leitura utilizam a amplificação de


Rute Nogueira 46

sinal para a determinação de concentrações muito reduzidas de analito, eliminando assim

o número de repetições e permitindo resultados de qualidade à primeira.

É um equipamento multifacetado, que automatiza os imunoensaios dos

laboratórios. Com um amplo menu de testes, permite executar parâmetros de rotina e

especiais na mesma plataforma analítica. No caso do nosso LAC, não usufruímos de todas

as opções deste aparelho, sendo apenas utilizadas as de maior relevância clínica para a

população em causa e também as economicamente mais rentáveis:

Tiróide: TSH, T3, T4, FT3, FT4, Anti-Tg, Anti-TPO.

Hormonas de Fertilidade: ACTH, Cortisol, Estradiol, FSH, -HCG, LH,

Progesterona, Prolactina, Testosterona.

Marcadores tumorais: AFP, CA 125II, CA15-3, CA 19-9, CEA, PSA livre, PSA

total.

Anemia: Ferritina, Ácido Fólico, Vitamina B12

Alergias: IgE.

Hepatites: Anti HBc IgM, Anti HBs, HBsAg, Anti HCV.

Retrovírus: HIV combi.

TORCH: Rubeola IgG, Rubeola IgM, Toxoplasma IgG, Toxoplasma IgM, CMV

IgG, CMV IgM.

Este equipamento não possui carry over, uma vez que utiliza pontas e cuvetes

descartáveis para a execução de todos os ensaios. Existe ainda a possibilidade de

calibração automática após a violação do controlo de qualidade, o que oferece confiança

a cada resultado.

O manuseamento fácil e seguro dos reagentes é outra das vantagens deste

equipamento, uma vez que se encontram fechados durante a operação, diminuindo assim

a exposição a agentes externos. Por outro lado, esta característica permite aumentar a

estabilidade a bordo dos reagentes e das calibrações.

2.3.1.2. UNICAP (PHADIA 100)

Este equipamento é o mais pequeno dos Phadia Laboratory Systems,

proporcionando a máxima flexibilidade a pequenos laboratórios.

O Phadia 100 foi concebido para a realização de testes de alergia e auto-

imunidade, bem como para a entrega de resultados de testes clinicamente relevantes. Tem

um processamento automatizado de ensaios EliA e ImmunoCAP, um painel de alergénios


Rute Nogueira 47

para a detecção de sensibilizações a 650 alergénios e 90 componentes alergénicos. Tem

um menu de auto-imunidade abrangente que cobre os marcadores de auto-imunidade

clinicamente relevantes para a avaliação das doenças auto-imunes mais comuns, como é

o caso da artrite reumatóide, da doença celíaca e das doenças do tecido conjuntivo. A

possibilidade de medir todos os testes a partir de uma amostra facilita a sua utilização e

rentabilidade.

Tem um rendimento de 48 resultados num único ensaio, fazendo o processamento

em lotes e permitindo guardar as curvas de calibração durante 28 dias. Caso sejam

necessárias, o aparelho faz automaticamente as diluições, de forma interna. Pode

funcionar como unidade autónoma ou ser integrado num grupo.

A fiabilidade do aparelho, baseada na excelente consistência ao longo do tempo e

entre países, sistemas, laboratórios e utilizadores, funciona como um ponto a favor da

utilização e credibilidade deste aparelho.

2.3.1.3. HYDRASIS

O Hydrasis é um sistema analítico multiparamétrico e semiautomático. Ainda que

o sistema funcione de modo integrado, existem módulos que podem funcionar de forma

independente. O aparelho comtempla vários programas de migração (fase de aplicação,

migração e secagem) e de coloração (fase de coloração, descoloração e secagem) para

técnicas de electroforese e imunofixação. Deste modo, é neste aparelho que se realizam

as técnicas de electroforese e de imunofixação em suporte de gel de agarose, a partir de

amostras biológicas (no nosso caso, de soro).

A electroforese baseia-se na diferença de mobilidade que as moléculas proteicas

possuem, de acordo com as suas cargas eléctricas, tamanho e forma. Depois, em meio

alcalino tamponado e num suporte poroso de gel de agarose são submetidas a um campo

eléctrico de corrente contínua durante um determinado intervalo de tempo, originando

um electroforetograma com diferentes fracções proteicas, as quais vão migrando do

cátodo para o ânodo.

A imunoprecipitação e a fixação são efectuadas com anti-soros de especificidades

diferentes. Após a imunofixação, as proteínas são reveladas por um corante específico. O

resultado semi-quantitativo obtém-se por densitometria (percentagem relativa de cada um

das fracções proteicas), como ocorre na realização de imunoelectroforeses.


Rute Nogueira 48

2.3.1.4.VIDAS

O VIDAS (Vitek Immuno Diagnostic Assay System) é um sistema

multiparamétrico de imunoanálise e de detecção de sondas nucleicas. Compreende um

módulo analítico, composto por cinco secções independentes, podendo cada uma realizar

seis testes de protocolos compatíveis. Os reagentes são apresentados sob a forma de

barretes de 60 ou 30 testes unitários com os cones e as barretes, fazendo-se acompanhar

dos consumíveis necessários (calibrador, controlos e diluente). A calibração é fornecida

numa ficha de especificações (cartão MLE).

Este equipamento permite a realização em série ou teste a teste das análises de

serologia, imunoquímica, detecção de antigénios, microbiologia industrial e detecção de

reacções de amplificação (VIDAS PROBE). Tem como vantagens a qualidade dos

resultados, a flexibilidade de utilização e a rapidez de execução das análises.

No aparelho VIDAS, a técnica utilizada, aplicável a numerosos parâmetros, é a

combinação do método ELISA com uma leitura final em fluorescência azul (ELFA –

Enzyme Linked Fluorescent Assay). A enzima utilizada neste aparelho é a fosfatase

alcalina. O substrato é o 4-metil umbeliferil fosfato (4-MUP) que é hidrolisado em 4-

metil umbeliferona (4-MU). A umbeliferona tem a propriedade de reemitir a luz a 450

nm após excitação a 370 nm. A temperatura de análise é de 37ºC no interior do aparelho.

Cada aparelho tem duas sondas térmicas de controlo por secção, para conservar a

temperatura constante.

A barrete simples do VIDAS (única utilizada no nosso laboratório) contém dez

poços. O primeiro poço é destinado a receber a amostra. Os oito poços intermédios

contêm os reagentes necessários à análise (conjugado, diluente, tampão de lavagem). O

último poço é uma cuvete de leitura na qual se mede a fluorescência do substrato. Uma

lingueta pequena permite posicionar devidamente a barrete na calha. O cone é o suporte

sólido da reacção imunológica. As suas faces internas são geralmente cobertas com

anticorpos ou antigénios consoante o parâmetro a dosear. É um suporte de pipetagem das

amostras e dos reagentes. Esse suporte permite, por conseguinte, que não haja nenhum

contacto entre fluído e aparelho. Assim a manutenção é fácil, porque não existe nenhum

tubo, seringa ou braço.


Rute Nogueira 49


2.3.2.1. Crioglobulinas

As crioglobulinas são proteínas anormais no sangue (anticorpos). Estas proteínas

anormais tornam-se espessas e sólidas a temperaturas frias e, quando engrossam, ficam

semelhantes a um gel, podendo levar ao bloqueio de qualquer vaso sanguíneo. As

complicações vão desde erupções cutâneas à insuficiência renal. A existência de um

precipitado leva ao envio para o laboratório externo, neste caso, o Laboratório Dr.

Joaquim Chaves.

2.3.2.2.Reacções de Widal, Weil Felix e Huddleson

A reacção de Widal é um teste serológico que permite detectar a infecção por

bactérias do género Salmonella, em geral pedido para indivíduos que apresentam

sintomas de febre tifóide ou de brucelose. O teste consiste em verificar a aglutinação de

anticorpos numa amostra de soro após a adição dos antigénios Typho O, Typho H,

Paratypho A-H e Paratypho B-H.

A reacção de Weil Felix é um teste serológico utilizado no diagnóstico de

infecções provocadas por Rickettsias. Os antigénios utilizados são Proteus OX2, OX19,

OXK.

A reacção de Huddleson é um teste serológico que permite fazer o diagnóstico da

brucelose. O antigénio utilizado é Brucella abortus.

O procedimento para todas estas reacções é semelhante, diferindo apenas os

antigénios utilizados. Inicialmente, utilizam-se 40 µL do soro do doente, correspondente

a um título de 1/40. Depois de 1 minuto de agitação, observa-se a formação de

aglutinação. Se não houver aglutinação, utiliza-se 80 µL de soro, correspondente a um

título de 1/20. Se houver aglutinação com o título 1/40, procede-se a mais diluições,

colocando 20, 10, 5 µL de soro na placa. O título vai corresponder à diluição do último

círculo onde se observar aglutinações de 1/80, 1/160, 1/360, respectivamente.

2.3.2.3. Reacção de Wright

A reacção de Wright é um teste utilizado na detecção da Brucella, à semelhança

do teste de Huddleson, tendo um fundamento teórico diferente: preparam-se 8 tubos de

plástico num suporte; dispensa-se 1,9 mL de soro fisiológico no primeiro tubo e 1 mL nos

restantes; dispensar 100 µL do soro do doente no primeiro tubo e agitar bem, pipetar 1

mL do primeiro tubo e dispensar no segundo tubo, agitando bem; continuar este


Rute Nogueira 50

procedimento até ao sétimo tubo e rejeitar 1 mL deste tubo; no oitavo tubo manter só

solução salina como controlo; de seguida, agitar bem o reagente Brucella, adicionar uma

gota em cada tubo e agitar bem, incubando a 37ºC durante 24 horas. O tubo de controlo

não deve ter aglutinação. O título corresponderá ao tubo com aglutinação. Os tubos de 1

a 7 contêm soro na diluição de 1/20 e 1/1280.

2.3.2.4. Reacção VDRL

A reacção de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) é um exame que

permite diagnosticar a sífilis, doença de transmissão sexual, servindo também para

acompanhar a doença em doentes que sejam portadores.

Em casos em que o resultado é reactivo, pode não significar que a pessoa tem

sífilis, sendo o resultado positivo por causa de doenças como a brucelose, a hepatite,

malária, asma, tuberculose, cancro, entre outras, originando um resultado falso-positivo.

No que diz respeito à gravidez, o teste deve ser realizado no início do pré-natal,

repetindo-se no segundo trimestre, mesmo que o primeiro teste realizado tenha sido não

reactivo. Em resultados reactivos durante a gravidez, o tratamento deve ser aplicado de

imediato e seguida a evolução, garantindo a eliminação total da bactéria causadora da

sífilis, pois a mãe pode transmitir a doença ao bebé, provocando-lhe problemas

neurológicos. O tratamento é feito com penicilina.

2.4. Bioquímica

2.4.1. Equipamentos

2.4.1.1. Clinitek Atlas Automated Urine Chemistry Analyser

O Clinitek Atlas é um analisador automático de amostras de urina, que combina

os princípios de espectroscopia por refletância com um formato de reagentes que permite

disponibilizar resultados qualitativos e semi-quantitativos. O aparelho permite efectuar o

exame físico (pH e densidade) e o exame bioquímico (determinação qualitativa ou semi-

quantitativa das proteínas, glucose, corpos cetónicos, pigmentos biliares, hemoglobina,

urobilinogénio, nitritos e esterease leucocitária). O equipamento utiliza um rolo reagente

que é composto por um rolo de plástico ao qual estão presas 490 tiras reagentes. Cada tira

contém nove zonas reactivas independentes, impregnadas de substâncias químicas para a

análise de substâncias presentes na urina pela mudança da cor do reactivo. O equipamento

analisa, a comprimentos de onda definidos, a cor e intensidade da luz reflectida por uma

zona reactiva após a reacção. Adicionalmente, cada tira tem uma zona não reactiva


Rute Nogueira 51

utilizada para a determinação da cor da amostra. O equipamento determina também a

densidade da amostra utilizando o método do índice refractário e a turvação pela medição

da transmissão e dispersão da luz que passa pela amostra. No fim da análise completa

pelo aparelho, surge um alarme com as amostras de urina que têm algum parâmetro

alterado. Neste momento, essas amostras são centrifugadas e é feita a respectiva análise

do sedimento urinário. Pode, em alguns casos, ser necessário confirmar através de tiras

teste alguns parâmetros como o pH, as proteínas ou a glucose.

2.4.1.2. Cobas Integra Plus 400

O Cobas Integra 400 plus é totalmente automatizado e analisador de múltiplos

analitos. Este sistema utiliza quatro tecnologias diferentes: absorção de fotometria,

imunoteste de polarização fluorescente, imuno turbidimetria e potenciometria. Devido às

múltiplas tecnologias empregadas, o sistema pode acomodar um amplo menu com mais

de 100 tipos de ensaios a bordo.

São utilizados sensores de pressão altamente sensíveis que detectam uma

pipetagem incorrecta, mesmo com um volume de amostra de 2 µL. Tem um sistema que

detecta amostras coaguladas, o que melhora a eficácia do aparelho e dos resultados

obtidos. Os sistemas de lavagem de alta pressão foram optimizados para remover

completamente os restos de coágulos da pipeta, evitando qualquer interrupção do fluxo

de trabalho.

O desenho das cassetes impede a evaporação e a degradação dos reagentes,

assegurando a estabilidade a longo prazo e intervalos de calibração longos.

O software verifica automaticamente as necessidades de manutenção e alerta o

utilizador quando é necessária alguma acção.

O aparelho efectua quase todas as análises bioquímicas realizadas no laboratório

ALP, AST, GGT, lípase, bilirrubina total e directa, cálcio, LDH, colesterol LDL, HDL e

total, triglicéridos, magnésio, fósforo, amílase, ferro, transferrina, CK, PCR, PCR ultra

sensível, TASO, IgG, IgA, IgM, C3, C4, Microalbuminúria na urina, Clearance de

Creatinina.


2.4.2.1.Determinação do grau de digestão das fezes

No exame macroscópico, deve observar-se:

A forma (moldada ou não moldada).


Rute Nogueira 52

A consistência (dura, média, mole, líquida...).

A cor, externa e internamente (quando a consistência o permita).

A presença de muco, de sangue, de pus, de parasitas, de restos de alimentos,

restos de medicamentos, matéria gorda, etc..

No exame microscópico, deve-se preparar uma suspensão de fezes, misturando

com soro fisiológico (excepto se estas tiverem consistência líquida) e colocar uma gota

desta suspensão em três lâminas. Na primeira, colocar a lamela e não adicionar qualquer

reagente. Na segunda adicionar uma gota de Lugol bastante concentrado e colocar a

lamela (o amido cru cora de azul-violeta escuro, o amido cozido cora de avermelhado e a

flora iodófila cora de azul). Na terceira, adicionar uma gota de uma solução de Sudan III

(as gorduras neutras coram de vermelho alaranjado e os sabões e ácidos gordos coram de

rosa a negro).

Estas lâminas permitem observar:

Proteínas (normalmente apenas se deve encontrar uma pequena quantidade de

fibras musculares, bem digeridas, não devendo encontrar-se tecido conjuntivo

(fibras musculares não digeridas);

Gorduras (normalmente 92 a 96 % da matéria gorda ingerida é utilizada pelo

organismo, pelo que não devemos encontrar nas fezes senão pequenas

quantidades de glóbulos de gordura neutra, agulhas de ácidos gordos ou sabões);

Hidratos de carbono (normalmente não se deve observar a presença de amido

cozido nas fezes. A celulose digerível deve aparecer em muito pequena

quantidade, enquanto a quantidade de celulose não digerível depende do tipo de

alimentação);

Cristais (oxalato de cálcio);

Elementos de origem intestinal

o Muco (que geralmente se vê a olho nu)

o Glóbulos vermelhos

o Glóbulos brancos

o Cristais (fosfato de amoníaco magnesiano, Charcot-Leyden, etc.)

O pH das fezes é determinado molhando a ponta de uma tira de papel indicador

de pH. A cor obtida é comparada com as diferentes cores do mostruário que acompanha

o papel indicador, sendo a cor mais semelhante a que corresponderá assim ao valor

aproximado do pH das fezes. Normalmente o pH das fezes varia entre 6,8 e 7,4. Distúrbios


Rute Nogueira 53

na digestão das proteínas originam valores de pH 7,4 e, por seu lado, distúrbios na

digestão dos hidratos de carbono originam valores de pH 4.

2.4.2.2.Capacidade total de fixação do ferro (CTFF)

A CTFF pode ser determinada de duas formas diferentes, considerando-se como

valores normais valores entre 254-457 µg/dL:

Saturação da transferrina através da técnica descrita na bula (TIBC), seguida

da determinação do ferro, do sobrenadante obtido. O valor do ferro obtido

anteriormente (expresso em µg/dL) é multiplicado pelo factor 3, obtendo-se o

valor da CTFF.

Determinação da transferrina e posterior multiplicação desse valor pelo factor

1,43.

2.4.2.3. Magnésio Eritrocitário

Para a determinação do magnésio eritrocitário, depois da centrifugação da

amostra, elimina-se o plasma e efectua-se a hemólise e a desproteinização, utilizando para

isso tungstato de sódio e ácido sulfúrico. Depois disso, aguardar 5 minutos à temperatura

ambiente e centrifugar o preparado de novo. O doseamento é feito através da

determinação de magnésio no equipamento de bioquímica. O valor obtido é multiplicado

por 200, sendo os valores de referência entre 40 e 60 mg/L.

2.4.2.4.Índice de saturação do ferro

O índice de saturação do ferro pode ser determinado pela fórmula:

Ferro sérico

CTFF × 100

Na fórmula descrita, tanto a capacidade total de fixação do ferro como o ferro

sérico são expressos em µg/dL. O índice de saturação do ferro é expresso em

percentagem. Considera-se como valores normais de índice de saturação de ferro, valores

entre 25 e 50%.

2.4.2.5. Isoenzimas da fosfatase alcalina

A determinação das duas principais isoenzimas da fosfatase alcalina (fracção

óssea e fracção hepática) baseia-se no facto de a fracção óssea ser desnaturada pela acção

do calor (fracção termolábil) ao contrário da fracção hepática (fracção termorresistente).


Rute Nogueira 54

Primeiro que tudo, determina-se a fosfatase alcalina do soro a analisar. Depois

aquece-se a amostra em banho-maria e deixa-se arrefecer à temperatura ambiente e faz-

se nova determinação da fosfatase alcalina. Sabendo que a fracção óssea da fosfatase

alcalina foi destruída pelo calor, o valor encontrado corresponde à fracção hepática da

fosfatase alcalina, podendo-se calcular facilmente o valor da fracção óssea.

Fosfatase alcalina total = fracção óssea + fracção hepática

Consideram-se como valores normais das isoenzimas da fosfatase alcalina:

Hepática: 60 – 70 % da fosfatase alcalina total

Óssea: 30 - 40 % da fosfatase alcalina total

2.4.2.6. Contagem de ADDIS

A contagem de ADDIS (contagem minutada) da urina permite estabelecer para

cada elemento figurado da urina (leucócitos, eritrócitos e cilindros), o seu débito por

minuto. Em geral, esta contagem é feita numa urina de 3 horas (180 minutos). Do volume

total da urina são medidos 10 mL que são depois centrifugados. Desses 10 mL, são

retirados 9 mL do sobrenadante que são rejeitados. O volume restante de urina (1 mL),

deve ser bem homogeneizado e colocado na câmara de contagem. O número de elementos

figurados eliminados por minuto é calculado pela fórmula:

N = n × 100 ×V

180

V é o volume total da urina emitida nas 3 horas (180 minutos), em mL.

N é o nº total de elementos figurados eliminados por minuto (leucócitos/min,

eritrócitos /min ou cilindros /min).

n é o nº de elementos contados na câmara (nº de elementos num mL de urina

concentrada 10 vezes), que multiplicado por 100 representa então o nº de

elementos figurados por cada mL de urina emitida.

2.4.2.7.Pesquisa da Proteína de Bence Jones

A proteína de Bence Jones é uma imunoglobulina, composta por dímero de

cadeias leves (kappa ou lambda) de baixo peso molecular, sintetizada por plasmócitos. É

produzida em grande quantidade, excedendo a capacidade de metabolismo pelo rim, o

que leva à sua perda pela urina. A produção prolongada desta proteína leva a uma lesão

tubular com insuficiência renal. A pesquisa desta proteína tem como objectivo o

diagnóstico do mieloma múltiplo.


Rute Nogueira 55

Esta pesquisa é efectuada na urina de 24 horas. Deve verificar-se o pH da urina

com papel indicador: se o pH for superior a 5, junta-se ácido acético a 2%, gota a gota,

até se obter um valor de mais ou menos 5. Depois, coloca-se 5 mL desta urina num tubo

de ensaio e aquece-se em banho-maria a 60ºC durante cerca de 5 minutos. Verifica-se se

a urina tem turvação: se esta for fraca ou nula, junta-se 5 mL de ácido sulfosalicílico a

5%, gota a gota, mantendo a temperatura de 60ºC. Se a acidificação não provocar

qualquer turvação, a pesquisa considera-se negativa e o resultado é dado como: Não

revelou. Se, pelo contrário, a acidificação tiver provocado o aparecimento de um

precipitado deve aquecer-se a urina a 100ºC. A redissolução do precipitado leva a

considerar a pesquisa como Positiva.

Podem ocorrer situações em que aparecem falsos negativos. Para evitar esta

situação, se antes ou depois da acidificação se formar um precipitado muito intenso, que

não se dissolva com o aquecimento a 100ºC, deve diluir-se a urina acidificada com urina

normal até que a quantidade de precipitado seja normal e repetir os procedimentos

anteriores.


Rute Nogueira 56

3. Controlo de Qualidade

O processo analítico vai desde a execução do sistema analítico até à posterior

validação técnica dos resultados. Nesta fase inclui-se o Controlo da Qualidade Interno

(CQI), um conjunto de procedimentos postos em prática no LAC com vista a permitir um

controlo da qualidade dos resultados das análises à medida que as mesmas são executadas.

Todos os dias, no início da execução analítica dos vários equipamentos e técnicas

manuais, faz-se a determinação do controlo interno da qualidade. Os critérios de

aceitação/rejeição de resultados são analisados caso a caso. Considera-se que os

resultados das amostras de controlo estão dentro dos limites definidos se os resultados do

CQI estiverem nos limites estabelecidos, se não houver alarmes instrumentais, se os

valores de cada parâmetro não estiverem fora da especificação/valores de referência e se

as condições de execução analítica estiverem em conformidade com os procedimentos e

MBPL. Sempre que uma das condições anteriores não se verifique, as análises serão

repetidas. Após a execução analítica, os materiais reutilizáveis são encaminhados para a

secção de lavagem e os materiais descartáveis são recolhidos em recipientes apropriados

e eliminados. Todas as instalações, pavimentos, superfícies de trabalho e bancadas são

limpas diariamente, com produtos de limpeza adequados. Qualquer contaminação

acidental com sangue ou líquidos orgânicos, culturas bacteriológicas ou fúngicas deve ser

removida de imediato e as superfícies descontaminadas com desinfectante apropriado.

O controlo de qualidade interno tem como objectivo controlar os parâmetros

analisados, para que se possam detectar eventuais anomalias e avaliar erros, procedendo-

se à sua imediata correcção, assegurando a qualidade dos resultados durante a fase

analítica.

Para o controlo da exactidão e da precisão são utilizados soros comerciais. O tipo

de controlo utilizado e a frequência de utilização dependem do tipo de análise,

equipamento usado e número de amostras a analisar. Os soros controlo comerciais

liofilizados são divididos em alíquotas de uso único, após a hidratação, sendo conservadas

em condições que preservem a sua qualidade.

A precisão é avaliada pelas cartas de controlo de Levey-Jensen, as quais utilizam

a média e o desvio padrão (das bulas ou calculados no laboratório, sempre que o número

de análises assim o permita).

Na detecção de erros sistemáticos, os quais afectam a exactidão, deve verificar-

se:

Concentração atribuída aos calibradores;


Rute Nogueira 57

Deterioração de reagentes ou calibradores;

Reagentes mal preparados;

Erros sistemáticos de pipetagem;

Modificação de temperaturas de incubação;

Mudança de operador.

Por outro lado, na detecção de erros aleatórios, os quais afectam a precisão, deve

verificar-se:

Repetibilidade de pipetagem;

Repetibilidade de detecção;

Homogeneização de reagentes;

Bolhas de ar no sistema;

Temperaturas instáveis;

Corrente eléctrica instável.

Quando se trabalha com os valores do desvio padrão dos fornecedores, na

validação do CQI, não se aceitam mais do que dois pontos consecutivos se excederem

m+2s ou m-2s (detecção rápida de erros sistemáticos); não se aceita um ponto se exceder

+2s e este for precedido de um ponto no -2s e vice-versa (detecção de erros aleatórios) e

não se aceitam pontos se excederem m+3s ou m-3s.

Por outro lado, na validação do CQI, quando se trabalha com a média e desvio

padrão do laboratório, e o erro total do método esteja bem, não se aceitam mais do que

dois pontos consecutivos se excederem m+2s ou m-2s (detecção de erros sistemáticos) e

não se aceitam pontos se excederem m+3s ou m-3s.


Rute Nogueira 58

4. Fase Pós-Analítica

Depois de todo o processamento analítico, é necessária a validação biopatológica

para posterior entrega do boletim de resultados ao utente.

Na validação biopatológica, é necessário ter em atenção a coerência dos resultados

obtidos, tendo em conta o estado clínico do utente, os tratamentos/medicação de que foi

alvo e dos resultados obtidos anteriormente. Devem ser registadas todas as ocorrências

como as repetições de resultados, rejeição de amostras, etc. O boletim de resultados

entregue ao utente, tem de ser validado pelo especialista.

No que diz respeito aos boletins de resultados enviados dos laboratórios

exteriores, estes são anexados ao boletim do Biolabor, sendo arquivadas cópias destes.

O boletim de resultados pode ser entregue a terceiros mediante a autorização do

utente, tendo que ficar registado quem levantou o mesmo.

Os resultados das análises realizadas ao utente podem ser comunicados ao médico

prescritor quando solicitados, ou quando se trata de uma situação em que é um

prognóstico vital. Os boletins de resultados da medicina do trabalho são entregues à

empresa requisitante.


Rute Nogueira 59

Bibliografia – Parte I

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2. Laboratorio San Giuseppe, Ematologia, [Online], Data de publicação desconhecida,

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3. Diesse, Vesmatic 30, [Online], Data de publicação desconhecida, [citado 22 de

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2015]; Obtido de: http://www.tuasaude.com/exame-vdrl/

12. Manual de Colheitas do Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas

13. Amaral, E. Aula “Hemostase”, Leccionada no âmbito das aulas de Hematologia I do

Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 22

de Novembro de 2013

http://www.healthcare.siemens.com/hematology/systems/advia-2120-hematology-system-with-autoslide

http://www.healthcare.siemens.com/hematology/systems/advia-2120-hematology-system-with-autoslide

http://www.labsangiuseppe.it/images/ha-8160-2.jpg

http://www.labsangiuseppe.it/images/ha-8160-2.jpg

http://www.diesse.it/esr/ves30.php

http://www.plugbr.net/teste-de-coombs-direto-e-indireto-para-que-serve-jejum-resultado-negativo-e-positivo/

http://www.plugbr.net/teste-de-coombs-direto-e-indireto-para-que-serve-jejum-resultado-negativo-e-positivo/

http://fisiologia.med.up.pt/Textos_Apoio/sangue/Hemostase.pdf%2009-05-2015

http://fisiologia.med.up.pt/Textos_Apoio/sangue/Hemostase.pdf%2009-05-2015

http://www.alvaro.com.br/exame/visualizar/proteina-bence-jones-pesquisa-bence

http://www.alvaro.com.br/exame/visualizar/proteina-bence-jones-pesquisa-bence

http://www.roche.pt/sites-tematicos/infocancro/index.cfm/tipos/mieloma-multiplo/mm-diagnostico/

http://www.roche.pt/sites-tematicos/infocancro/index.cfm/tipos/mieloma-multiplo/mm-diagnostico/

https://pt.wikipedia.org/wiki/Reac%C3%A7%C3%A3o_de_Widal

https://en.wikipedia.org/wiki/Weil%E2%80%93Felix_test

http://www.tuasaude.com/exame-vdrl/


Rute Nogueira 60

14. Gominho, JL. Aula “Análises de citogramas e de Histogramas da Séria Leucocitária”,

Leccionada no âmbito das aulas de Hematologia II do Mestrado em Análises Clínicas,

Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 3 de Julho de 2014


Rute Nogueira 61



PLAQUETAS E AS SUAS IMPLICAÇÕES NAS DOENÇAS

VASCULARES

MONOGRAFIA ORIENTADA PELA PROFESSORA DOUTOURA

ISABEL BETTENCOURT MOREIRA DA SILVA



LISBOA, 2016


Rute Nogueira 62

Índice – Parte II

Índice – Parte II .............................................................................................................. 62

Resumo ........................................................................................................................... 63

Abstract ........................................................................................................................... 64



Introdução ....................................................................................................................... 67

Objectivos ....................................................................................................................... 69

5. Plaquetas ................................................................................................................. 70

5.1. Fisiologia: Estrutura, formação e funções das plaquetas ................................. 70

5.2. Papel na inflamação ......................................................................................... 83

5.3. Alterações quantitativas ................................................................................... 87

5.4. Alterações qualitativas ..................................................................................... 90

5.5. Aplicação das Análises Clínicas no diagnóstico de patologias plaquetárias ... 91

6. Doenças vasculares ................................................................................................. 94

6.1. Doenças Arteriais ............................................................................................. 94

6.1.1. Doença das artérias coronárias ................................................................. 94

6.1.2. Doença das artérias periféricas ................................................................. 96

6.2. Doenças Venosas ............................................................................................. 98

6.2.1. Trombose das veias profundas ................................................................. 98

7. Aplicação da patologia plaquetária e da cirurgia vascular ..................................... 99

7.1. Trombocitopenia na sequência de doenças vasculares – Caso Clínico ........... 99

8. Abordagens Terapêuticas ..................................................................................... 104

8.1. Tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção de AVC em pacientes

com doenças vasculares associadas .......................................................................... 104


prevenção de doenças vasculares ......................................................................... 104

8.2. Monitorização/Controlo laboratorial da terapêutica ...................................... 105

8.3. Novos agentes antiplaquetários...................................................................... 106

Conclusões e Perspectivas ............................................................................................ 108

Bibliografia – Parte II ................................................................................................... 109


Rute Nogueira 63

Resumo

A segunda parte deste relatório consiste numa monografia sobre o tema “Plaquetas

e as suas implicações nas doenças vasculares“, onde é feita uma revisão bibliográfica

sobre o assunto, sendo um dos objectivos encontrar uma justificação para um caso clínico

real.

Inicialmente, é feita uma introdução ao tema das plaquetas, abordando não só a

sua fisiologia (estrutura, formação e funções das plaquetas) como também o seu papel na

inflamação e as alterações quantitativas e qualitativas que podem ocorrer nas plaquetas e

que podem levar a distúrbios patogénicos no organismo humano. Para finalizar este

grande capítulo, são abordadas algumas aplicações das análises clínicas no diagnóstico

de patologias plaquetárias. Neste subcapítulo dá-se especial importância ao PFA-100, um

novo método de avaliação da função plaquetária que apresenta vantagens significativas

em comparação com o tempo de hemorragia.

Tal como o título indica, as doenças vasculares também são um dos grandes

capítulos deste trabalho, sendo essencial a sua compreensão para criar uma relação entre

as plaquetas e as doenças vasculares. Assim, são abordadas as doenças arteriais (doença

das artérias coronárias e doença das artérias periféricas) e as doenças venosas (trombose

das veias profundas). Não são abordadas todas as doenças arteriais e venosas existentes,

dando-se maior relevância às que são importantes para a compreensão da relação entre as

plaquetas e as doenças vasculares.

Sendo uma das principais motivações deste trabalho, é descrito um caso clínico

real que relaciona a trombocitopenia como consequência de doenças vasculares, sendo

feita uma descrição cronológica dos acontecimentos que têm ocorrido ao longo dos anos

e da conclusão de cada um dos procedimentos aplicados até agora.

Em forma de conclusão, são descritas algumas abordagens terapêuticas, como os

tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção do AVC em pacientes com doenças

vasculares, a monitorização/controlo laboratorial da terapêutica e os novos agentes

antiplaquetários que estão a começar a ser utilizados no mercado farmacêutico.

Palavras-chave: Plaquetas; Doenças Vasculares; Trombose; Trombocitopenia


Rute Nogueira 64

Abstract

A monograph entitled "Platelets and its implications for vascular diseases" is

presented in the second part of this document. A literature review about this subject was

made aiming to find a justification for a real clinical case.

An introduction about platelets was made, addressing not only their physiology

(structure, formation and function of platelets) as well as its role in inflammation and the

quantitative and qualitative alterations that may occur in platelets and that can lead to

pathogenic disorders in the human organism. To end this big chapter, it’s discussed some

applications of medical tests in the diagnosis of platelet disorders. In this sub-chapter it’s

given great importance to PFA, a new method for the evaluation of platelet function that

has significant advantages compared with the time of bleeding.

As the title indicates, vascular diseases are also one of the biggest chapters of this

work, being essential their understanding to create a relationship between platelets and

vascular diseases. Thus, arterial diseases (coronary artery disease and peripheral artery

disease) and venous disease (deep venous thrombosis) are addressed. Not all existing

arterial and venous diseases are addressed, giving much more relevance to those that are

important to understand the relationship mentioned above.

Being one of the main objectives of this work, it’s described a real clinical case

relating thrombocytopenia as the consequence of vascular diseases, with a chronological

description of the events that have occurred over the years and the conclusions reached

with each of the procedures until now.

In conclusion, some therapies are described, such as antiplatelet treatments,

applied as a prevention of an AVC on patients with vascular diseases, the laboratorial

monitorization/control of the therapeutics and the new antiplatelet agents that are

beginning to be used in the pharmaceutical market.

Keyword: Platelets; Vascular Diseases; Thrombosis; Thrombocitopenia


Rute Nogueira 65

Índice de Figuras

Figura Página

Figura 8: Megacarioblasto 70

Figura 9: Megacariócito basófilo 71

Figura 10: Megacariócito plaquetário 71

Figura 11: Plaquetas 72

Figura 12: Plaquetas activadas 72

Figura 13: Plaqueta em repouso 72

Figura 14: Estrutura das plaquetas 73

Figura 15: Desenvolvimento de megacariócitos e produção de

plaquetas

76

Figura 16: Modelo da regulação da produção de plaquetas pela TPO 77

Figura 17: Esquema ilustrado do processo que ocorre durante a ruptura

de vasos

79

Figura 18: Visão actual da cascata da coagulação 82

Figura 19: Os neutrófilos humanos formam armadilhas de neutrófilos

extracelulares em resposta a sinais das plaquetas activadas, em adição

a outro tipo de estímulos

85

Figura 20: As plaquetas são efectoras da lesão inflamatória e imune,

na evolução da aterosclerose e em complicações tromboinflamatórias

agudas desencadeadas pela ruptura da placa bacteriana

86

Figura 21: Trombocitose essencial 88

Figura 22: Diferença entre um valor normal de plaquetas e a

trombocitopenia

89

Figura 23: Esfregaço de sangue normal 90

Figura 24: Agregados plaquetários 91

Figura 25: Satelitismo plaquetário 91

Figura 26: Observação ao microscópio de um esfregaço sanguíneo 92


Rute Nogueira 66

Lista de Abreviaturas

ADP – Adenosina difosfato

ET – Trombocitemia essencial

HMWK – High Molecular Weight Kinogen; Cininogénio de alto peso molecular

IDT – Inibidores directos da trombina

IL – Interleucina

NETs – Neutrophil extracelular traps

OCS – Open Canalicular System; Sistema canalicular aberto

PCT – Plaquetócrito

PDF – Produtos de degradação de fibrina

PDW – Índice de anisocitose plaquetária (Platelet Distribution Width)

PF3 – Factor plaquetário 3

PMN – Leucócitos polimorfonucleares

PTI – Púrpura Trombocitopenica Idiopática

TF – Factor tecidual (Tissue Factor)

TLR – Receptor Toll-like

TPA – Tecidual Plasminogen Activator; Activador do Plasminogénio Tecidual

TPO – Trombopoietina

VPM – Volume plaquetário médio


Rute Nogueira 67

Introdução

As plaquetas são formadas a partir de células precursoras que se encontram na

medula óssea, num processo denominado Trombocitopoiese. Neste processo, ocorre uma

poliploidização, na qual a duplicação intracelular de DNA forma vários tipos celulares de

ploidia 2N – 32N (64N) (1).

Muita discussão há sobre o facto de as plaquetas dos mamíferos serem

consideradas células ou elementos figurados do sangue (fragmentos do citoplasma de

uma célula precursora). Alguns autores afirmam que as plaquetas são células anucleadas

que derivam dos megacariócitos. Por outro lado, outros autores defendem que as

plaquetas não são células, mas sim elementos figurados do sangue, uma vez que não

possuem núcleo e derivam do megacariócito, resultando da fragmentação do seu

citoplasma. Dada esta discussão, as plaquetas serão designadas ao longo desta

monografia, consoante a designação que lhe é dada nas respectivas fontes utilizadas.

Na população normal, o valor médio de plaquetas é de 219x109/l (2) e varia entre

as 150x109/l e as 450x109/l. Esta contagem varia consoante o grupo étnico em questão,

sendo semelhante dentro do mesmo. O valor do plaquetócrito (PCT) varia entre os 0,17 e

os 0,29 %, o Volume Plaquetário Médio (VPM) varia entre 7 e 10,5 fL e o Índice de

Anisocitose Plaquetária (PDW) entre os 10,5 e os 17,5%. As plaquetas têm uma vida

média de 7 a 10 dias (3).

Apesar do seu tamanho e fragilidade, as plaquetas têm várias funções de elevada

importância no organismo humano:

Protecção do endotélio vascular.

Intervenção na formação do trombo plaquetário.

Intervenção na formação de fibrina.

Intervenção na retracção do coágulo.

Intervenção no processo inflamatório (3).

A hemostase é um processo fisiológico que mantém o equilíbrio entre o risco de

uma hemorragia e o risco de uma trombose, combinando mecanismos celulares e

bioquímicos de modo a manter o sangue fluído no seio das veias e artérias. Para além de

prevenir hemorragias, após a lesão dos vasos sanguíneos, também tem como funções

prevenir tromboses, restabelecendo o fluxo sanguíneo uma vez colmatada a lesão do vaso.

Quando ocorre ruptura em vasos de menor calibre, a paragem da hemorragia é feita pelo

processo de hemostase primária. Quando ocorre num vaso de calibre médio, a formação


Rute Nogueira 68

de um trombo plaquetário não é suficiente e é necessário que ocorra a coagulação. Quando

se tratam de vasos de grande calibre, tem que ocorrer a sutura do vaso (83).

As plaquetas são as principais células efectoras na hemostase. Para além disso,

são células inflamatórias multifacetadas com funções que abrangem, de forma contínua,

desde as respostas imunitárias inatas até à imunidade adaptativa. As plaquetas activadas

têm actividades trombo-inflamatórias essenciais numa variedade de distúrbios vasculares

e vasculopatias. Recentemente, foram identificadas actividades inflamatórias e

imunológicas que fornecem dados importantes sobre a biologia destes elementos e que

são directamente relevantes para as doenças vasculares humanas (5).

As alterações quantitativas em plaquetas podem indicar patologias hemorrágicas

e dar uma orientação ao médico na detecção de outras condições relacionadas com a

imunidade, uma vez que estas apresentam como sintoma primário a diminuição destes

elementos (6).

No que diz respeito às alterações que podem existir quanto à quantidade de

plaquetas, podem distinguir-se dois grandes grupos:

Trombocitose (aumento do número de plaquetas)

Trombocitopenia (diminuição do número de plaquetas)

Por outro lado, as plaquetas podem também apresentar alterações qualitativas,

situações em que a pessoa pode ter a contagem plaquetária normal, não significando isso

que não seja portadora de uma outra patologia relacionada com a hemostase. Assim

sendo, quando se faz a observação de um esfregaço de sangue periférico, há que ter em

atenção três aspectos essenciais: o tamanho, a distribuição e a granulação (83).

Uma doença vascular é uma doença que altera a integridade dos vasos sanguíneos.

Este tipo de doenças pode ser causado por herança familiar ou genética, por hábitos de

vida nocivos, pela vida profissional, por medicações e por traumas acidentais que podem

comprometer os vasos sanguíneos (7).

A baixa dose de Aspirina na terapia antiplaquetária continua a ser o medicamento

de escolha na prevenção de eventos cardiovasculares. No entanto, a protecção que a

Aspirina oferece para as pessoas com alto risco de eventos cardiovasculares é apenas

relativamente moderada. A evidência disponível através destes estudos mostra que o uso

de Clopidogrel com a Aspirina está associado a uma redução do risco de eventos

cardiovasculares em comparação com a Aspirina isolada em pacientes com síndrome

coronária aguda, sem elevação do segmento ST. Em pacientes com alto risco de doenças


Rute Nogueira 69

cardiovasculares, os benefícios e riscos do tratamento combinado são ainda muito fracos

(65).

Em outro estudo feito, a comparação entre a monoterapia com Aspirina e a

combinação entre Clopidogrel e Aspirina, em doentes com doença arterial periférica

sintomática, revelou um benefício adicional no que respeita à redução dos riscos

vasculares e dos eventos trombóticos. Por outro lado, não existe uma evidência disponível

para pacientes que sofreram um acontecimento vascular sob o efeito de Aspirina, que os

resultados de alterem quando se começa a aplicar uma terapia com Clopidogrel

adicionalmente (64).

Os agentes antiplaquetários são os pilares no tratamento e prevenção do

tromboembolismo. Agentes antitrombóticos, como a Aspirina, o Clopidogrel, antagonista

da vitamina K e Foundaparinux (inibidor directo do factor Xa) já foram incorporados na

prática clínica rotineira dos serviços de terapia intensiva. Recentemente tem-se

demonstrado grande interesse nos agentes que inibem selectivamente o factor Xa e a

trombina. Estes apresentam estrutura molecular pequena e inibem simultaneamente o

factor da coagulação livre no plasma e ligado ao trombo. De entre os novos

anticoagulantes orais, Dabigatran, Rivaroxaban e Apixaban são os que apresentam

estudos clínicos em fases mais avançadas e o uso na prática clínica já é feito em alguns

países (8).

Objectivos

Uma das motivações deste trabalho prende-se com a patologia de um familiar

próximo, tentando encontrar abordagens teóricas que consigam explicar os

acontecimentos ocorridos. Fazendo uma abordagem inicial do que se vai expor

posteriormente, inicialmente foi descoberta uma baixa muito acentuada de plaquetas e,

alguns anos depois, foi revelado o entupimento da artéria femoral esquerda, com

gravidade.

Por outro lado, outra motivação que conduziu ao presente trabalho surge devido à

consciencialização da elevada importância das plaquetas no âmbito das análises clínicas

e da relação existente entre estas e as doenças vasculares.


Rute Nogueira 70

5. Plaquetas

5.1.Fisiologia: Estrutura, formação e funções das plaquetas

As plaquetas são formadas a partir de células precursoras que se encontram na

medula óssea, num processo denominado Trombocitopoiese. Neste processo, ocorre uma

poliploidização, na qual a duplicação intracelular de DNA forma vários tipos celulares de

ploidia 2N – 32N (64N). Os tipos celulares referidos correspondem a diferentes graus

funcionais e podem-se distinguir três diferentes tipos de células (1).

Existe uma grande discussão sobre o facto de as plaquetas serem consideradas

células ou elementos figurados (fragmentos do citoplasma). Alguns autores afirmam que

as plaquetas são células anucleadas que derivam dos megacariócitos, com tempo de vida

média entre os 7 a 10 dias. Por outro lado, outros autores defendem que as plaquetas não

são células mas sim elementos figurados do sangue, uma vez que não possuem núcleo e

derivam do megacariócito sob a forma de fragmentos do citoplasma. Dada esta discussão,

as plaquetas serão designadas ao longo deste trabalho consoante a designação que lhe é

dada nas respectivas fontes utilizadas.

Megacarioblasto: Célula sensivelmente maior que o pró-eritroblasto, na maioria

das vezes (Figura 8). Existe um desvio da relação núcleo-plasma em favor do

núcleo e a densidade da cromatina nuclear varia. Os nucléolos, embora sejam

numerosos, são quase sempre ocultados. As células mononucleadas predominam,

ainda que existam também algumas com dois ou quatro núcleos. Apresenta um

citoplasma muito basófilo, pouco abundante e sem granulações, podendo

apresentar projecções nas margens (1).

Pró-megacariócito: Produto da poliploidização dos megacarioblastos,

apresentando maiores dimensões que estes. Núcleos gigantes pouco lobulados

(Figura 9). A cromatina nuclear apresenta-se de forma predominante em malha

fina e os nucléolos presentes estão frequentemente ocultados. Com 40-60 µm de

Figura 8: Megacarioblasto (medula óssea)

(Retirado de (9))


Rute Nogueira 71

diâmetro, esta célula apresenta citoplasma mais abundante e muito basófilo, com

numerosas granulações azurófilas, o que indica o início da actividade

trombopocitopoiética. Evidente aumento da largura do citoplasma (1).

Megacariócito maduro: Em condições normais, trata-se da maior célula da

hematopoiese na medula óssea (Figura 10). Ocorre a formação da configuração

típica dos núcleos e do pontilhado azurófilos finíssimo do plasma, representando

os preparativos para a libertação das plaquetas. Uma pequena porção dos

megacariócitos apresenta uma redução do diâmetro celular e presença de

pequenos núcleos, isolados ou duplos, de forma redonda ou oval. Estes elementos

celulares também apresentam actividade trombopoiética (1).

Fase de libertação das plaquetas: O citoplasma do megacariócito maduro, até

então íntegro, começa a apresentar prolongamentos irregulares e desintegração

progressiva, com formação de numerosas macropartículas e, logo a seguir,

micropartículas com finos grânulos azurófilos – as plaquetas. Os núcleos

remanescentes, desprovidos de plasma, persistem no interior da medula óssea até

que ocorra a sua destruição pelos macrófagos. Assim, as plaquetas são pequenos

e simples fragmentos do citoplasma dos megacariócitos, que vão ser libertados no

sangue (1).

Plaqueta: A plaqueta apresenta uma forma discóide (em repouso) ou estrelada

(activada), como se pode observar nas figuras 12 e 13, respectivamente. Com um

Figura 9: Megacariócito basófilo (medula

óssea) (Retirado de (9))

Figura 10: Megacariócito plaquetário (medula óssea)

(Retirado de (9))


Rute Nogueira 72

diâmetro de 2-4 µm e uma espessura de ± 1 µm, a plaqueta é a menor estrutura

encontrada no esfregaço de sangue (corresponde entre ¼ a 1/5 das dimensões do

eritrócito). Resulta da fragmentação do citoplasma do megacariócito plaquetário.

É formada por um citoplasma de coloração basófila clara (hialómero) e

granulações azurófilas (granulómero), como se pode observar na figura. Pode

ocorrer a auto-aglutinação fisiológica em esfregaços sem a adição de EDTA, o

que resulta em agregados de plaquetas no esfregaço (1,9,10).

Como de seguida apresenta a figura 14, a membrana plaquetária é constituída por:

Figura 11: Plaquetas (sangue periférico), por microscopia óptica

(Retirado de (16))

Figura 12: Plaquetas activadas, microscopia

electrónica de varrimento (Retirado de (75))

Figura 13: Plaqueta em repouso, microscopia

electrónica de transmissão (Retirado de (76))


Rute Nogueira 73

Camada externa de natureza glicoproteica (glicocálice):

Glicosaminoglicanos, ácido siálico e numerosas aberturas – sistema

canicular aberto.

Dupla camada fosfolipídica.

Proteínas integrais (Glicoproteínas – GPIa, GPIb, GPIIa, GPIIb, GPIIIa,

GPIV, GPV, GPIX)

As plaquetas têm quatro propriedades biológicas (1,11):

Adesão: Capacidade de fixação a superfícies estranhas com libertação de

fosfolípidos da membrana plaquetária.

Secreção: Segregam todos os constituintes dos grânulos, os quais são

eliminados através dos canalículos (OCS), processo favorecido pela

actividade contráctil dos microfilamentos de actina/miosina.

Agregação: Por interacção do complexo membranar GPIIb/GPIIIa com o

fibrinogénio e o factor de Von Willebrand, as plaquetas adjacentes agregam-

se, formando-se um trombo plaquetário capaz de colmatar a área endotelial

lesionada.

Actividade pró-coagulante: Formação de microvesículas fosfolipídicas, na

sequência do rearranjo dos fosfolípidos da membrana (fenómeno de flip-flop),

com exposição dos fosfolípidos membranares (PF3) que ficam disponíveis

para duas reacções da cascata da coagulação (11).

Figura 14: Estrutura das plaquetas (Adaptado de (77))


Rute Nogueira 74

As plaquetas têm na sua composição cerca de 60% de proteínas (como

fibrinogénio, trombostenina, factores plaquetários, factores de coagulação, aminas

vasoconstritoras e enzimas), 15% de lípidos (como fosfolípidos, colesterol, lipoproteínas

e prostaglandinas), 8,5% de glúcidos (glicogénio e glicoproteínas) e nucleótidos (como

AMP, ADP, ATP) (11).

As plaquetas são activadas pelo aumento do cálcio citosólico, uma vez que os iões

cálcio (Ca2+) constituem um mensageiro intracelular, afectando a actividade enzimática e

as interacções proteína-proteína.

A contagem de plaquetas é um parâmetro analisado nas “análises de rotina” de

qualquer indivíduo ao longo da sua vida. No entanto, esta análise é maiss frequente e

significativa quando existem alterações que derivam de outras condições fisiológicas ou

de doenças. Não existem dados que indiquem que os valores de plaquetas são alterados

pelas variações diurnas mas, por outro lado, apresentam variações na gravidez e durante

o ciclo menstrual de algumas mulheres. Inicialmente, estudos feitos com a contagem de

plaquetas apontavam para um valor constante em indivíduos até aos 18 meses (12). Por

outro lado, foram feitos estudos recentes que apontam para uma variação não superior a

10% ao longo de 40 anos (3).

Na população normal, a contagem normal de plaquetas é de 219x109/l (2) e varia

entre as 150x109/l e as 450x109/l. Esta contagem varia dependendo do grupo étnico em

questão, mas é semelhante dentro do mesmo. O valor do PCT varia entre os 0,17 e os

0,29 %, o VPM varia entre 7 e 10,5 fL e o PDW entre os 10,5 e os 17,5%. As plaquetas

têm uma vida média de 7 a 10 dias (3).

A grande variação do número de plaquetas é compensada por diferenças no VPM.

É muito importante perceber que o corpo humano conserva a massa, mas não o número

de plaquetas. A demonstração prática deste princípio é comprovada quando o tamanho

do baço é alterado. Normalmente, o baço sequestra um terço da massa de plaquetas do

corpo, como se fosse uma reserva permutável com massa de plaquetas circulantes (13).

Numa experiência em que ratinhos foram injectados com metilcelulose, eles

desenvolveram vários tipos de esplenomegalia e trombocitopenia, sendo que a gravidade

da trombocitopenia foi directamente proporcional ao aumento do tamanho do baço

(14,15). Por outro lado, quando foi retirado o baço aos ratinhos, estes ficaram com

trombocitose. Quando finalmente foi medida a massa de plaquetas nos três grupos de

animais (normal, esplenomegálico e esplénico), verificou-se que todos tinham a mesma

massa total de plaquetas no corpo. Mais recentemente, foram relatados resultados


Rute Nogueira 75

semelhantes com seres humanos (13). Estes dados levam à comprovação da massa de

plaquetas pelo rato de Belgrado (b/b) (16). Este rato é autossómico recessivo, tem

hipocromia severa, anemia microcítica, uma redução de 49% em megacariócitos e uma

redução em 34% na contagem de plaquetas. No entanto, a massa total de plaquetas

permanece normal, devido a um aumento de 50% no tamanho das plaquetas (16).

Os megacariócitos da medula óssea respondem às mudanças na massa de

plaquetas através da variação no seu número, tamanho e poliploidia. O aumento dos

megacariócitos, não só em tamanho como em número, tem sido um aspecto muito útil no

diagnóstico clínico da púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) (3).

Resumindo, é importante ter em conta os seguintes princípios da fisiologia

plaquetária:

A contagem de plaquetas permanece constante ao longo da vida (excepto

em situações de patologia);

A contagem “normal” de plaquetas varia muito entre os indivíduos;

O tamanho das plaquetas é inversamente proporcional à contagem de

plaquetas;

O corpo conserva a massa, mas não o número de plaquetas;

Os megacariócitos da medula óssea respondem à s mudanças na massa de

plaquetas pela variação em número, tamanho e poliploidia (3).

Em algumas situações, pode haver um aumento da necessidade de plaquetas,

situações em que ocorre a libertação prematura de plaquetas de maiores dimensões. O

tamanho e o número de plaquetas libertadas pelos megacariócitos variam consoante o

grau de poliploidia e o estado de maturação dos respectivos citoplasmas.

As plaquetas podem ser libertadas a partir de uma poliploidia de 8N (estádios de

pró-megacariócito, megacariócito granuloso ou megacariócito plaquetário), sendo tanto

maiores quanto menor for o grau de poliploidia e tanto mais numerosas quanto maior for

o grau de maturação do citoplasma (Figura 15) (3).


Rute Nogueira 76

A regulação da trombocitopoiese, ou seja, da produção de plaquetas, é da

responsabilidade de trombopoietina (TPO) (3). A TPO é uma hormona glicoproteica,

produzida sobretudo no fígado e no rim, mas também na medula óssea e no baço. No

fígado, a sua produção é estimulada pela IL-6. A regulação da trombocitopoiese é levada

a cabo pela ligação da trombopoetina ao receptor MPL (C-MPL, CD110, TPOR), receptor

este que está presente em células CD34+, megacariócitos e plaquetas (3).

A fisiologia da TPO tem em conta princípios específicos que revelam a

importância desta hormona. Em estudos feitos em ratinhos com trombocitopenia foi

demonstrado que a TPO leva, até 24 horas para atingir o máximo da sua produção, após

o início agudo da trombocitopenia. Por outro lado, também se constatou que os níveis

circulantes de TPO são inversamente proporcionais à contagem de plaquetas em modelos

de trombocitopenia aguda ou amegacariocítica (17,18).

Os níveis de TPO diminuem exponencialmente com o aumento das plaquetas.

Existem uma relação linear e logarítmica entre os níveis de TPO e a contagem de

plaquetas, em modelos de trombocitopenia. Está também provado que a TPO nativa tem

um tempo de semivida em circulação de 45 minutos (18).

A presença do receptor da TPO (MPL, TPOR), característica que lhes permite a

ligação e remoção da TPO livre em circulação. Este processo foi provado por experiências

Figura 15: Desenvolvimento de megacariócitos e produção de plaquetas - cada unidade

nuclear possui dois conjuntos cromossómicos (N, número de conjuntos cromossómicos ou

"ploidia") (Adaptado de (11))


Rute Nogueira 77

em que o receptor foi bloqueado e no qual não ocorreu o processo de ligação e remoção

da TPO por parte das plaquetas (19,20). A produção hepática da TPO não é alterada pela

mudança na massa de plaquetas (21).

Todos os princípios referidos anteriormente deram origem a um modelo para a

regulação da produção de plaquetas pela TPO (Figura 17). A TPO é sintetizada no fígado

e entra para a circulação, onde interage com o receptor da TPO (MPL) presente nas

plaquetas, sendo o complexo internalizado e degradado. Se a massa de plaquetas for

normal, a maior parte da TPO é eliminada pelas plaquetas e um pequeno nível basal

mantém o ritmo normal da produção de plaquetas a partir dos megacariócitos na medula

óssea. Por outro lado, quando há uma redução na capacidade da massa de plaquetas

circulantes em remover a TPO, devido à diminuição do número de plaquetas, os níveis

de TPO sobem, os megacariócitos são estimulados e há um aumento da produção de

plaquetas. Assim, é a própria massa de plaquetas que regula directamente os níveis de

TPO na circulação (3).

Tendo por base o modelo de fisiologia da TPO apresentado, existem algumas

implicações patológicas que se sobressaem (Figura 16):

Os níveis de TPO são inversamente proporcionais à taxa de produção de

plaquetas.

A produção de TPO pode ser alterada por distúrbios patológicos ou por

outras moléculas.

Os efeitos da TPO podem ser alterados por alterações patológicas no

receptor dos megacariócitos ou nos eventos de sinalização após os

receptores.

A remoção da TPO pode ser alterada por desordens patológicas ou por

outras moléculas (3).

Figura 16: Modelo da regulação da produção de plaquetas pela TPO (Adaptado

de (17))


Rute Nogueira 78

Cerca de 20% das plaquetas são destruídas ao acaso e consumidas pelas células

do endotélio ou da túnica íntima. O processo de envelhecimento faz com que as plaquetas

sejam sequestradas e fagocitadas pelos macrófagos do baço, do fígado e da medula óssea

(3).

Apesar do seu tamanho e fragilidade, as plaquetas têm várias funções de elevada

importância no organismo humano:

Protecção do endotélio vascular.

Intervenção na formação do trombo plaquetário.

Intervenção na formação de fibrina.

Intervenção na retracção do coágulo.

Intervenção no processo inflamatório (3).

As plaquetas contribuem para o processo hemostático de duas maneiras distintas.

Num primeiro momento, põem em prática as suas funções adesivas e coesivas que levam

à formação de um trombo plaquetário. Depois disso, ocorre a activação de mecanismos

de coagulação por meio da exposição de uma superfície fosfolipídica adequada, actuando

como local catalítico para o desenvolvimento da coagulação e a consolidação do tampão

hemostático. Para promover a hemostase correcta, as plaquetas devem, idealmente,

manter as suas propriedades adesivas e pró-coagulantes (3).

As plaquetas também possuem funções secretoras importantes. Durante o

processo de activação, as plaquetas expressam as proteínas da membrana interna e

libertam proteínas adesivas e factores de coagulação e crescimento. Algumas das

proteínas facilitam a comunicação das plaquetas com os leucócitos e as células

endoteliais. Assim, as plaquetas desempenham um papel muito importante em eventos

inflamatórios e proliferativos, tendo um papel crítico na remodelação de tecidos e

cicatrização de feridas (3).

A hemostase é um processo fisiológico que mantém o equilíbrio entre o risco de

uma hemorragia e o risco de uma trombose e combina mecanismos celulares e

bioquímicos de modo a manter o sangue fluído no seio das veias e artérias. Para além de

prevenir hemorragias, após a lesão dos vasos sanguíneos, tem também como funções

prevenir tromboses, restabelecendo o fluxo sanguíneo uma vez colmatada a lesão do vaso.

Quando ocorre ruptura em vasos de menor calibre, a paragem da hemorragia é feita pelo

processo de hemostase primária. Quando ocorre num vaso de calibre médio, a formação


Rute Nogueira 79

de um trombo plaquetário não é suficiente e é necessário que ocorra a coagulação (Figura

17). Quando se tratam de vasos de grande calibre, tem que ocorrer a sutura do vaso (83).

Neste processo intervêm uma série de factores como os vasos, as plaquetas, os

iões cálcio, o factor de Von Willebrand, os fosfolípidos de origem plaquetária, as

proteínas de coagulação, a trombina, os inibidores da coagulação e os factores do sistema

fibrinolítico (4).

A célula endotelial sintetiza antiagregantes plaquetários como a prostaciclina

(PGI2) e moléculas pró-agregantes, pró-coagulantes e anti-fibrinolíticas em resposta a

estímulos (3).

Os vasos têm uma dupla função na hemostase: desencadear a formação do trombo

plaquetário e activar as duas vias da coagulação de modo a formar o coágulo estável.

A hemostase pode dividir-se em três fases:

Hemostase primária – Sistema vascular (constrição do vaso lesado) e

tempo plaquetário (formação do trombo plaquetário).

Hemostase secundária (coagulação) – Formação de fibrina.

Hemostase terciária (fibrinólise) – Destruição do coágulo de fibrina e

manutenção da permeabilidade do vaso.

A hemostase primária é o processo inicial da coagulação desencadeado pela lesão

vascular. Logo após a lesão, os mecanismos locais produzem vasoconstrição, alteração

da permeabilidade vascular com produção de edema, vasodilatação dos vasos tributários

da região em que ocorreu a lesão e adesão das plaquetas. Assim, a vasoconstrição diminui

o fluxo de sangue no local de hemorragia, tornando preferencial o fluxo pelos ramos

colaterais dilatados. Simultaneamente, a formação de edema intersticial diminui o

gradiente de pressão entre o interior do vaso lesado e a região adjacente, produzindo um

tamponamento natural e auxiliando a hemostase. Em condições normais, os vasos

Figura 17: Esquema ilustrado do processo que ocorre durante a ruptura de vasos

(Retirado de (4))


Rute Nogueira 80

sanguíneos devem constituir um sistema tubular não trombogénico capaz de desencadear

por mecanismos locais, os processos que iniciam a coagulação e que, após a recuperação

da lesão anatómica, possam remover o coágulo e restabelecer a circulação local

(fibrinólise) (83).

O endotélio tem uma elevada importância no controlo de vários aspectos da

hemostase pois, além da capacidade de secretar substâncias tais como a prostaciclina

(PGI2), um potente vasodilatador com actividade antiagregante plaquetária, é responsável

pelas características não trombogénicas da superfície interna dos vasos sanguíneos.

Por outro lado, tanto a lesão anatómica quanto os distúrbios funcionais do

endotélio aumentam o risco de ocorrência de tromboses, com frequência variável, em

qualquer segmento da rede vascular. A remoção do endotélio, por qualquer mecanismo,

expõe o sangue ao contacto com o colagénio da região subendotelial, o que por si só

promove a adesão das plaquetas na presença do factor Von Willebrand (VIII:vWF).

Quando isto ocorre, as plaquetas tornam-se activadas e libertam o conteúdo dos grânulos

citoplasmáticos (4). Entre outras substâncias, estes grânulos contêm adenosina-difosfato

(ADP), serotonina e tromboxano A2 (TXA2). O ADP é responsável pela activação de

outras plaquetas e pela modificação da sua forma, que passa de discóide para esférica com

aparecimento de pseudópodes. Estas plaquetas activadas vão-se agregar umas às outras

formando um tampão que fornecerá a superfície adequada ao processo de coagulação do

sangue, produzindo um coágulo resistente. Neste estado, as plaquetas exteriorizam uma

lipoproteína denominada factor plaquetário 3 (PF3), que desempenha um papel de

superfície fosfolipídica (superfície activadora) que participa de inúmeras reacções da

cascata de coagulação (4).

A hemostase secundária ou coagulação é um processo multifactorial e dinâmico

com proteólise limitada que culmina na formação de trombina em quantidades suficientes

para a conversão do fibrinogénio em fibrina. A fibrina forma uma rede de fibras elásticas

que consolida o tampão plaquetário e transforma-o em coágulo. A coagulação caracteriza-

se por uma série de reacções químicas entre várias proteínas que convertem proenzimas

em enzimas (proteases). Essas proenzimas e enzimas são denominadas factores de

coagulação. A activação destes factores é provavelmente iniciada pelo endotélio activado

e finalizado na superfície das plaquetas activadas e tem como produto essencial a

formação de trombina que promoverá modificações na molécula de fibrinogénio

libertando monómeros de fibrina na circulação. Estes últimos vão unindo as suas

terminações e formando um polímero solúvel (fibrina S) que, sob a acção do factor XIIIa


Rute Nogueira 81

(factor XIII activado pela trombina) e iões cálcio, produz uma base de fibras que mantêm

estável o agregado de plaquetas previamente formado (22).

A clássica cascata da coagulação foi introduzida em 1964, por Macfarlane (23,24).

Neste modelo a activação de cada factor da coagulação leva a activação de outro factor

até a eventual formação da trombina. Esses factores são numerados de I ao XIII, com seus

respectivos sinónimos. O número correspondente para cada factor foi designado

considerando a ordem de sua descoberta e não do ponto de interacção com a cascata. O

factor VI, que foi utilizado para designar um produto intermediário na formação da

tromboplastina, não possui mais qualquer designação. O factor III é a tromboplastina

tecidual, chamada actualmente de factor tecidual ou tissular (TF). O factor IV é utilizado

para designar o cálcio iónico (Ca++), que deve ser mantido na concentração sérica acima

de 0,9 mM/L para a optimização da formação do coágulo (25).

Este modelo da cascata dividiu a sequência da coagulação em duas vias: a via

intrínseca na qual todos os componentes estão presentes no sangue e na via extrínseca na

qual é necessária a presença da proteína da membrana celular subendotelial, o TF (26).

Os eventos comuns da coagulação (via final comum), quer sejam iniciados pela

via extrínseca ou intrínseca, são a activação do factor X (Xa), a conversão de trombina a

partir da protrombina pela acção do factor Xa, formação de fibrina estimulada pela

trombina e estabilização da fibrina pelo factor XIIIa (22).

A coagulação, pela via intrínseca, é desencadeada quando o factor XII é activado

pelo contacto com alguma superfície carregada negativamente (por exemplo, colagénio

ou endotoxina). Além do factor XII, estão envolvidos neste processo o factor XI, a pré-

calicreína e o cininogénio de alto peso molecular (HMWK = high molecular weight

kinogen). Tanto o factor XI quanto a pré-calicreína necessitam da HMWK para efectuar

a adsorção à superfície em que está ligado o factor XIIa. Da interacção destes elementos

é activado o factor XI, que transforma o factor IX em IXa. O factor IXa e o factor VIIa

associam-se à superfície fosfolipídica através de uma "ponte" de cálcio estimulando a

conversão de factor X para Xa (23).

De modo mais simples, na via extrínseca, a coagulação é desencadeada quando os

tecidos lesados libertam o TF (tromboplastina tecidual), que forma um complexo com o

factor VII, mediado por iões cálcio. Este complexo age sobre o factor X estimulando sua

conversão em Xa. A partir deste ponto, as duas vias encontram um caminho comum em

que ocorre a conversão de protrombina em trombina que, por sua vez, estimula a

transformação de fibrinogénio em fibrina (23).


Rute Nogueira 82

O sistema de coagulação foi considerado, por muito tempo, como sendo

constituído apenas por factores de coagulação e plaquetas. Actualmente considera-se um

sistema multifacetado, extremamente equilibrado, no qual participam componentes

celulares e moleculares. O modelo clássico da cascata da coagulação foi um grande

avanço para compreender a formação do coágulo in vitro e para a monitorização

laboratorial, porém várias falhas foram detectadas em observações clínicas in vivo. Por

exemplo, embora deficiências de cininogénio de alto peso molecular, pré-calicreína e

factor XII prolonguem o tempo de tromboplastina parcial, elas não causam alterações

significativas na hemorragia. Assim como esta, outras alterações da coagulação não

conseguiam ser explicadas com o modelo clássico da cascata. Investigadores na área da

coagulação concluíram que a via intrínseca não tem um verdadeiro papel fisiológico na

hemostase (27). O complexo formado pelo TF e factor VII (TF/FVII) iniciador da via

extrínseca pode também activar o factor IX da via intrínseca. Outra importante descoberta

foi que a trombina é activadora fisiológica do factor XI, “saltando” as reacções iniciais

induzidas pelo contacto. Estas descobertas permitiram concluir que a activação do

complexo TF/FVII é o principal evento desencadeador da hemostase (28).

Em condições normais, coagulação e fibrinólise encontram-se em equilíbrio

dinâmico de tal forma que, ocorrendo simultaneamente, enquanto a primeira interrompe

Figura 18: Visão actual da Cascata da

Coagulação. A cascata inicia-se pela

via extrínseca após exposição (pela

lesão vascular) ou expressão

(induzida por mediadores

inflamatórios) do factor tecidual que

conduz à activação do FVII. O

complexo FVIIa/FT activa os factores

IX e X. Há medida que os níveis de

FXa aumentam, o complexo

FVIIa/FT é inactivado pelo TFPI. A

coagulação é mantida pelas reacções

da via intrínseca iniciadas pelo FXIa.

Ambas as vias intrínseca e extrínseca

convergem para a via comum na qual

a pró-trombina é convertida em

trombina que catalisa o fibrinogénio

em fibrina. Esta é estabilizada pelo

FXIIIa. Legenda: Pho – fosfolípidos,

FpA – Fibrinopeptídeo, FT – Factor

tecidual, TFPI – Inibidor da Via do

Factor Tecidual. Activação →

Amplificação ●-----● Inibição

(Retirado de (82))


Rute Nogueira 83

a perda sanguínea, a última remove a fibrina formada em excesso e o sangue volta a fluir

normalmente no interior do vaso restaurado.

A plasmina, proteína que lisa a rede de fibrina é derivada do plasminogénio que

está ligado internamente à rede de fibrina. O activador tecidual do plasminogénio (TPA:

tissue plasminogen activator), libertado pelo endotélio que circunda a área da lesão é

responsável pelo desencadeamento do processo que limita a progressão desnecessária da

trombose (25).

A antiplasmina, presente no plasma, combina-se com o excesso de plasmina

libertada, impedindo o aparecimento de fibrinólise generalizada. Esta proteína está

presente na circulação numa concentração plasmática 10 vezes maior do que a plasmina

(25).

A plasmina não restringe a sua acção apenas sobre a fibrina. Também é capaz de

cindir o fibrinogénio ou agir directamente sobre a fibrina, quer seja polimerizada ou não,

formando os produtos de degradação da fibrina (PDFs). Os PDFs são removidos da

circulação principal pelo fígado e pelo sistema retículo endotelial. Entretanto, se a

produção de PDFs superar a capacidade de clearance, ocorre a acumulação do excedente

produzido, podendo atingir níveis tais que passam a inibir a coagulação normal, através

da interferência com a polimerização da fibrina e induzindo alteração funcional das

plaquetas (25).

5.2. Papel na inflamação

As plaquetas são as principais células efectoras na hemostase. Para além disso,

são células inflamatórias multifacetadas com funções que abrangem, de forma contínua,

desde as respostas imunitárias inatas até à imunidade adaptativa. As plaquetas activadas

têm actividades tromboinflamatórias essenciais numa variedade de distúrbios vasculares

e vasculopatias. Recentemente, foram identificadas actividades inflamatórias e

imunológicas que fornecem dados importantes sobre a biologia destes elementos e que

são directamente relevantes para as doenças vasculares humanas (5).

Tal como foi anteriormente referido, as plaquetas são altamente especializadas na

hemostase, auxiliando o organismo em situações de lesão vascular endotelial e de ruptura,

sendo esta a função mais conhecida das plaquetas. No entanto, as plaquetas também são

células efectoras inflamatórias e têm actividades em todo o espectro de inflamação aguda

na imunidade adaptativa (29).


Rute Nogueira 84

Existem evidências que as especializações inflamatórias de plaquetas, assim como

as suas especializações para a hemostase, são adaptações evolutivas que facilitam a defesa

do hospedeiro, a reparação tecidual e a protecção contra agentes patogénicos (30).

Para além disso, as plaquetas fornecem ligações fundamentais entre os membros

hemostáticos e inflamatórios do sistema de defesa do hospedeiro, contribuindo para a

integridade vascular, para a reparação de feridas e para a manutenção da integridade do

tecido (30–32).

As plaquetas humanas respondem com múltiplas actividades efectoras de

imunidade inata quando há sinalização por agonistas endógenos gerados ou lançados

durante os processos de hemostase e inflamação por toxinas microbianas ou por outros

agentes patogénicos microbianos. As funções chave das plaquetas nas actividades de

imunidade inata incluem a liberação de quimiocinas, citocinas e outros mediadores e

interacções com células endoteliais, monócitos e neutrófilos, os quais também têm uma

resposta crítica na imunidade inata e na inflamação aguda (29,30,33–36)

Por outro lado, as plaquetas activadas operam de forma contínua no sistema

imunológico e têm um arsenal substancial de actividades no sistema imunitário adaptativo

(29,33). Estas actividades incluem a síntese e libertação de mediadores imunes

pleiotrópicos, incluindo a interleucina (IL)-1β, o ligando CD40 (CD40L) e/ou a

quimiocina CCL5 e interacção com subclasses de linfócitos e células dendríticas (30).

São também recém-conhecidas actividades inflamatórias das plaquetas, incluindo

as respostas mediadas pelo receptor toll-like (TLR) e a capacidade de accionar a formação

de armadilhas de neutrófilos (NETs: neutrophil extracelular traps) (30) (Figura 19).


Rute Nogueira 85

Assim sendo, o estudo das actividades das plaquetas em doenças vasculares e

vasculopatias tem sido alvo de grande atenção. Para além das já conhecidas funções na

hemostase e trombose, sabe-se hoje que as plaquetas activadas têm também um papel

relevante na resposta inflamatória (30,37). A trombina e o fibrinogénio são factores pró-

inflamatórios muito importantes, para além de serem muito importantes os componentes

da cascata de coagulação (38,39). Sendo assim, as actividades tromboinflamatórias das

plaquetas contribuem para um grande número de doenças vasculares.

As plaquetas têm vários receptores de superfície que, para além de regularem e

induzirem a resposta hemostática por parte das plaquetas, muitos deles também activam

as plaquetas para uma resposta pro-inflamatória, em conjunto com a activação da cascata

pro-trombótica de sinalização (30).

As plaquetas activadas têm diversos mecanismos de sinalização inflamatória e

intracelular, assim como conseguem a transferência de factores biologicamente activos e

de informação molecular (30,33). A desgranulação rápida e a secreção de factores pré-

formados solúveis são clássicas respostas de activação das plaquetas (29,30).

As plaquetas funcionam como mediadores da inflamação em doenças vasculares.

Apesar dos agentes patogénicos, LPS e outras toxinas microbianas podem induzir

directamente as características patológicas da sepsis vascular. Há evidências substanciais

de que as plaquetas são efectoras celulares cruciais (Figura 20) (29,30,34,40).

Figura 19: Os neutrófilos humanos formam armadilhas de neutrófilos extracelulares (NETs) em

resposta a sinais das plaquetas activadas, em adição a outro tipo de estímulos. Os NET têm funções

antimicrobianas mas também medeiam a lesão tecidual e a inflamação vascular (Adaptado de (5))


Rute Nogueira 86

O sequestro das plaquetas activadas ligadas à fibrina e leucócitos pode contribuir

para a trombocitopenia em sepsis. A sinalização dependente das plaquetas do TLR pelo

LPS e outros factores bacterianos fornece um mecanismo de activação plaquetária na

sepsis (41–46). Por outro lado, a activação de plaquetas por factores do hospedeiro

gerados em sepsis, incluindo a trombina fornecem um segundo mecanismo. As respostas

patológicas dadas pelas plaquetas, incluindo a desgranulação, a secreção e a síntese

podem contribuir para a função da barreira endotelial alterada, a qual é central para a

sepsis e para o envolvimento de múltiplos órgãos, incluindo os pulmões, em diversos

síndromes sépticos de plaquetas (32,47–49).

O transcriptoma plaquetário é alterado na sepsis e pode potencialmente transmitir

alterações patológicas no proteoma das plaquetas, para além de assinaturas de

diagnóstico. Algumas micropartículas derivadas das plaquetas podem amplificar a

inflamação sistémica e a trombose (29).

A aterosclerose, doença crónica, que afecta os vasos de forma segmentar como

veremos mais à frente em pormenor, está num outro extremo do espectro de vasculopatias

inflamatórias e imunes. A inflamação da parede do vaso é central para a aterogénese. A

maioria das actividades inflamatórias das plaquetas e o seu reportório imunológico foram

implicados na iniciação e progressão das placas ateroscleróticas e em consequências

tromboinflamatórias da ruptura da placa. Ainda que não esteja completamente delineado

este aspecto, a actividade das plaquetas na imunidade imune inata e adaptativa pode

Figura 20: As plaquetas são efectoras da lesão inflamatória e imune, na evolução da

aterosclerose e em complicações tromboinflamatórias agudas desencadeadas pela ruptura

da placa bacteriana. PMN: linfócitos polimorfonucleares. (Adaptado de (5))


Rute Nogueira 87

contribuir para a evolução das lesões provocadas pela aterosclerose (50). As evidências

existentes para a contribuição das plaquetas activadas na iniciação e progressão de lesões

aterosclerótidas, incluem observações experimentais e clínicas de que as plaquetas

geralmente aderem a estrias de gordura e a placas existentes e que as plaquetas são

activadas por mediadores bioquímicos que se pensam ser importantes na aterogénese,

incluindo lipoproteínas oxidadas de baixa densidade (50).

Várias observações apoiam a existência de contribuições importantes das

plaquetas na iniciação e evolução de placas (50,51). Vários estudos clínicos sugerem a

persistente activação das plaquetas na aterosclerose e em condições que aumentam o risco

desta síndrome (37,50). Em contrapartida, muitas observações indicam que a activação

de plaquetas, as interacções célula-célula e os sinais inflamatórios são centrais nas

síndromes coronárias agudas e em outras complicações tromboinflamatórias da ruptura

de placas e em repostas nas intervenções vasculares, incluindo a angioplastia (37,52–55).

Assim, as plaquetas activadas podem ser células efectoras ubíquas em todas as fases de

inflamação vascular na aterosclerose.

Em suma, muito ainda está por descobrir sobre o repertório das plaquetas, não só

no que diz respeito à inflamação, como em muitos outros aspectos, havendo desde já a

certeza de que estas representam um papel chave na inflamação e, em particular, as

doenças vasculares.

5.3. Alterações quantitativas

As alterações quantitativas em plaquetas podem indicar patologias hemorrágicas

e dar uma orientação ao médico na detecção de outras condições relacionadas com a

imunidade, uma vez que estas apresentam como sintoma primário a diminuição destes

elementos (6).

No que diz respeito às alterações que podem existir quanto à quantidade de

plaquetas, podem distinguir-se dois grandes grupos:

Trombocitose

Trombocitopenia

A trombocitose ocorre quando existe um aumento do número de plaquetas

(superior a 400x109/L). Pode ser essencial (primária) ou reactiva (secundária).

Na trombocitose essencial ou primária, o número de plaquetas aumenta muito

significativamente (contagem superior a 1000x109/L). As principais causas da

trombocitose essencial são a trombocitemia essencial (ET) ou doenças


Rute Nogueira 88

mieloproliferativas como a leucemia mielóide crónica, mielofibrose ou policitemia vera

(56,57).

As doenças mieloproliferativas são patologias em que as células que produzem

células sanguíneas (células precursoras) crescem e se reproduzem anormalmente na

medula óssea ou então são expulsas da mesma, devido a um desenvolvimento excessivo

do tecido fibroso. A TE integra o grupo das síndromes mieloproliferativas, cromossoma

Philadelphia negativas. Esta patologia caracteriza-se pela hiperproliferação

megacariocítica, com consequente ocorrência de trombocitose periférica e favorecendo

os fenómenos trombo-hemorrágicos. Para além da trombocitemia essencial, existem

outras doenças mieloproliferativas que podem desencadear a trombocitose essencial. A

mielofibrose tem como característica principal o envolvimento dos fibroblastos (células

que produzem tecido fibroso ou conectivo), que não são células precursoras dos

elementos sanguíneos. No entanto, os fibroblastos parecem ser estimulados por células

precursoras anormais, possivelmente megacariócitos. Nesta patologia existe um excesso

de tecido fibroso e a quantidade de glóbulos vermelhos e brancos imaturos e deformados

é elevada. Na policitemia vera, sendo também uma perturbação das células sanguíneas

precursoras que origina um excesso de glóbulos vermelhos, caracteriza-se também por

uma quantidade elevada de precursores eritróides. É uma perturbação rara e que,

geralmente, se manifesta na faixa etária dos 60 anos. Finalmente, a leucemia mielóide

crónica é uma patologia na qual uma célula que se encontra na medula óssea se transforma

em cancerosa e produz um número elevado de granulócitos anormais. Nesta doença,

existe uma quantidade elevada de mielócitos (precursores de granulócitos, um tipo de

glóbulos brancos) e uma quantidade elevada de granulócitos maduros e imaturos (6,58).

Figura 21: Trombocitose essencial (sangue periférico) (Retirado

de (78))


Rute Nogueira 89

Contrariamente à trombocitose, podem

ocorrer situações em que existe uma baixa de

plaquetas, designada por trombocitopenia, em

que os valores são inferiores a 150x109/L. Em

quantidades de plaquetas inferiores a

30x109/L, podem ocorrer hemorragias

anormais, ainda que, geralmente, este

problema não se observe até que as plaquetas

desçam abaixo das 10x109/L. Existem muitas

patologias que podem estar na origem da

diminuição da quantidade de plaquetas, mas em muitos casos não se detecta uma causa

específica. Ainda assim, conseguem distinguir-se quatro causas principais que levam a

uma diminuição na quantidade de plaquetas: produção insuficiente na medula óssea, o

sequestro das plaquetas em consequência de um baço grande, o aumento do seu uso, da

sua destruição ou, finalmente, a sua diluição no sangue (6).

Um dos primeiros sinais da diminuição na quantidade de plaquetas é a hemorragia

cutânea. Podem também ocorrer lesões punctiformes purpúreas na parte inferior das

pernas e é possível que as gengivas sangrem e se detecte sangue nas fezes ou urina. Nas

mulheres, a menstruação pode ser anormalmente intensa. Dada a dificuldade em estancar

as hemorragias, cirurgias ou acidentes podem ser perigosos. Em casos de diminuição do

número de plaquetas, a vigilância torna-se fundamental, uma vez que quanto menor for

este número, mais intensa se torna a hemorragia. Pessoas com plaquetas entre os 5x109/L

e 10x109/L de sangue correm o risco de perder grandes quantidades de sangue no aparelho

gastrointestinal ou de desenvolver hemorragias cerebrais mortais, mesmo sem existir

qualquer pancada (50,59).

A púrpura trombocitopénica idiopática é uma perturbação em que existe uma

diminuição de plaquetas que, sem causa aparente, produz uma hemorragia anormal. A

causa desta patologia é desconhecida, mas neste processo participa uma reacção

imunitária anormal (reacção auto-imune), pela qual os anticorpos destroem as plaquetas.

Embora neste caso a medula óssea aumente a produção de plaquetas para compensar a

sua destruição, a produção é inferior à procura (6,60).

Existem também situações em que a trombocitopenia é causada por uma doença.

A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH) causa com frequência

trombocitopenia, aparentemente porque os anticorpos contra o vírus também destroem as

Figura 22: Diferença entre um valor normal

de plaquetas e a trombocitopenia (Retirado de

(79))


Rute Nogueira 90

plaquetas. Outras doenças também podem causar trombocitopenia como o lúpus

eritematoso sistémico, que diminui a quantidade de plaquetas por meio da produção de

anticorpos, a coagulação intravascular disseminada, que forma pequenos coágulos em

todo o organismo que consomem precocemente as plaquetas e os factores de coagulação.

Existe também a púrpura trombótica trombocitopénica, que é uma perturbação não muito

frequente, que apresenta risco letal em que formam, de forma repentina, pequenos

coágulos de sangue em todo o organismo, levando a uma diminuição muito acentuada de

plaquetas e glóbulos vermelhos, assim como febre e lesões disseminadas em vários

órgãos (6).

5.4. Alterações qualitativas

Para além de alterações quantitativas que podem ocorrer, as plaquetas podem

também apresentar alterações qualitativas, situações em que a pessoa pode ter a contagem

plaquetária normal, não significando isso que não seja portadora de uma outra patologia

relacionada com a coagulação. Assim sendo, quando se faz a observação de um esfregaço

de sangue periférico, há que ter em atenção três aspectos essenciais: o tamanho, a

distribuição e a granulação.

Quanto ao tamanho, as plaquetas podem ser de tamanho normal, com cerca de ¼

ou menos do glóbulo vermelho; podem ser macroplaquetas com cerca de metade do

glóbulo vermelho ou, em última hipótese, podem ser plaquetas gigantes, onde o tamanho

corresponde a aproximadamente ao tamanho do glóbulo vermelho (6).

Quanto à distribuição, as plaquetas podem estar dispersas, em agregados

plaquetários ou em satelitismo plaquetário.

No que diz respeito à granulação, esta pode ser normal ou desgranulada.

Figura 23: Esfregaço de sangue periférico normal

(Retirado de (80))


Rute Nogueira 91

5.5. Aplicação das Análises Clínicas no diagnóstico de patologias plaquetárias

Tal como em muitas outras áreas da

medicina, as análises clínicas têm um papel

fundamental no diagnóstico de patologias

plaquetárias.

Doentes que sofrem contusões e hemorragias

anormais estão predispostos à presença de

trombocitopenia. Deste modo, todos os doentes que

aparentam ter perturbações que possam originar uma quantidade de plaquetas inferior à

normal, são sistematicamente controlados, através de análises clínicas. Em algumas

situações, a presença de trombocitopenia detecta-se por meio de análises de sangue

realizadas por outras razões, em doentes que carecem de sintomas de hemorragia. É

sempre fundamental que o médico consiga detectar a causa da trombocitopenia. Por

exemplo, os doentes normalmente têm febre quando a trombocitopenia é produto de uma

infecção, de uma doença auto-imune (lúpus eritematoso sistémico, púrpura trombótica

Figura 25: Satelitismo plaquetário (sangue periférico)

(Retirado de (82))

Figura 24: Agregados plaquetários (sangue

periférico) (Retirado de (82))

Figura 26: Observação ao microscópio de

um esfregaço sanguíneo (Retirado de (81))


Rute Nogueira 92

trombocitopénica). Por outro lado, a presença de febre não é se verifica quando a causa é

a trombocitopenia idiopática ou o uso de medicamentos. Durante o controlo clínica feito

pelo médico, pode também ser detectada a presença de um baço grande, o que sugere que

o baço está a capturar as plaquetas e que a trombocitopenia é produto de uma perturbação

que origina um aumento do baço (6).

De modo a determinar a gravidade da trombocitopenia e detectar-se as suas

possíveis causas, a amostra de sangue pode ser examinada ao microscópio ou então

avaliar-se de forma automatizada o volume e a quantidade de plaquetas. Por outro lado,

uma amostra de medula óssea (obtida por aspiração) pode fornecer informações sobre a

produção de plaquetas (6).

No diagnóstico da trombocitemia, a contagem de plaquetas é superior a 500x109/L

de sangue e, muitas vezes, ultrapassa 1000x109/L. Na análise ao microscópio, a amostra

de sangue apresenta plaquetas anormalmente grandes, grupos de plaquetas anormais e

fragmentos de megacariócitos. A distinção entre a trombocitemia primária e a secundária

pode ser feita através da pesquisa de outras doenças que possam estar a causar o aumento

da quantidade de plaquetas, sendo também útil nestes casos uma biopsia da medula óssea

(6,57).

Actualmente, na avaliação da função plaquetária é utilizado o teste de screening

da função plaquetária (PFA-100). Este teste veio substituir o tempo de hemorragia, como

teste de função plaquetária. Ainda que em muitos laboratórios este teste ainda não esteja

a ser utilizado, como no caso do laboratório do estágio descrito na primeira parte deste

trabalho, tem vindo a ser cada vez mais implementado. Este sistema tem uma velocidade

de fluxo sanguíneo muito elevada que vai dos 5000 a 6000 s-1. Neste teste não existe

interferência das células endoteliais, ao contrário do que acontece no tempo de

hemorragia em que o endotélio vascular é lesado. No sistema PFA-100 (Siemens), o

sangue anti coagulado com citrato é colocado num cartucho contendo uma membrana

revestida com colagénio/ADP ou colagénio/epinefrina. As plaquetas vão fazer a oclusão

de uma abertura da membrana por um pequeno trombo plaquetário. Este teste avalia

apenas a função das plaquetas (82).

No que diz respeito à mielofibrose, esta não costuma produzir sintomas durante

anos. Ao fim de já algum tempo, a anemia causa fraqueza e cansaço, os doentes perdem

peso e não se sentem bem. O facto de o baço e o fígado poderem aumentar, pode causar

dores abdominais (6).


Rute Nogueira 93

Aquando da existência de mielofibrose, na observação ao microscópio, os

glóbulos vermelhos encontram-se deformados e imaturos e, para além disso, observa-se

a presença de anemia. No entanto, é sempre exigida uma biopsia da medula óssea de

modo a se obter a confirmação do diagnóstico (6).

A policitemia vera normalmente é diagnosticada através de análises de sangue de

rotina, mesmo antes de a pessoa ter qualquer tipo de sintoma. Os valores de hemoglobina

(proteína que transporta o oxigénio nos glóbulos vermelhos) e os valores de hematócrito

(percentagem de glóbulos vermelhos no volume total de sangue) são anormalmente altos.

Ainda que um valor de hematócrito superior a 54% no homem ou 49% na mulher possa

indicar policitemia, não se pode chegar a um diagnóstico apenas com este dado. Para

avaliar a quantidade de glóbulos vermelhos no organismo, é útil a realização de um exame

com glóbulos vermelhos marcados com radioactividade, facilitando o diagnóstico. Em

algumas raras situações, é necessário efectuar uma biopsia da medula óssea. Um valor de

hematócrito elevado também pode indicar uma policitemia relativa, ou seja, uma

perturbação em que a quantidade de glóbulos vermelhos é normal, mas a proporção de

líquido no sangue é baixa (6,58).

Uma policitemia secundária apresenta um excesso de glóbulos vermelhos causado

por outras doenças, como por exemplo se existir uma baixa concentração de oxigénio no

sangue, que por sua vez vai estimular a medula óssea a produzir uma maior quantidade

de glóbulos vermelhos. Por exemplo, as pessoas que sofrem de doenças pulmonares

crónicas ou cardíacas, os fumadores e as que vivem a grandes altitudes podem apresentar

um número elevado de glóbulos vermelhos. A policitemia vera pode ser distinguida de

outras formas de policitemia secundária através da medição da concentração de oxigénio

numa amostra de sangue extraída de uma artéria. Situações em que os valores de oxigénio

se encontrem anormalmente baixos podem levar à suspeita de policitemia secundária (6).

Os valores de eritropoietina no sangue, uma hormona que estimula a produção de

glóbulos vermelhos por parte da medula óssea, também podem ser quantificados e

diferem na policitemia vera e na secundária. Na policitemia vera, os valores de

eritropoietina são extremamente baixos, enquanto na policitemia secundária apresentam-

se normais ou elevados. Em casos raros, os quistos no fígado ou nos rins e os tumores do

fígado ou do cérebro produzem eritropoietina, pelo que pessoas que sofrem destas

doenças apresentam valores elevados desta hormona e podem contrair uma policitemia

secundária (6).


Rute Nogueira 94

6. Doenças vasculares

As doenças vasculares alteram a integridade dos vasos sanguíneos e podem ser

causadas por herança familiar ou genética, por hábitos de vida prejudiciais, por hábitos

da vida profissional e por uma série de outros factores que podem causar o

comprometimento dos vasos sanguíneos (7).

Algumas doenças hereditárias podem causar a formação de coágulos, que podem

tanto afectar o fluxo de sangue num só local como podem deslocar-se pela corrente

sanguínea e alojar-se em outros órgãos, como é o caso dos pulmões. Nestes casos, o

diagnóstico familiar precoce é fundamental na sua prevenção (7).

A degradação acentuada dos hábitos de vida, com o avançar da sociedade, está

cada vez mais a ter uma influência negativa sobre o nosso organismo. Em consequência

disto, o aumento do colesterol LDL leva à sua infiltração dentro da parede dos vasos, o

que, a longo prazo, se transforma em placas de gordura e cálcio. Este processo gera uma

patologia denominada aterosclerose, referida com mais pormenor num capítulo à frente.

A acumulação das placas em diversos vasos podem levara à obstrução dos mesmos

aquando da ocorrência do desprendimento destas placas. Como forma de prevenção desta

patologia devem ser adoptados hábitos de vida mais saudáveis, uma actividade física

regular e uma alimentação mais variada (7).

Por outro lado, trabalhar de pé ou numa posição fixa pode levar a uma redução do

fluxo de sangue nas partes do corpo que se encontram mais longe do coração, podendo

levar ao aparecimento de varizes. A prevenção passa pela mudança de hábitos no local de

trabalho, mudando de movimentos e posições, tanto quanto possível, estimulando a

circulação. Medicações, como anticoncepcionais, alteram também o fluxo normal do

sangue (7).

Em suma, este tipo de patologias pode ser evitado se existir um conhecimento do

estado de saúde de todo o corpo, dependendo também dos hábitos de vida adoptados (61).

Em seguida vão ser referidos mais em pormenor os diferentes tipos de doenças

arteriais e doenças venosas existentes.

6.1.Doenças Arteriais

6.1.1. Doença das artérias coronárias

As artérias coronárias têm como função promover a irrigação e distribuição de

sangue arterial para todo o músculo cardíaco, levando o sangue que provém da artéria

aorta, directamente para artérias menores dentro do coração, irrigando as células


Rute Nogueira 95

cardíacas. Quando ocorre a interrupção do fluxo nestas artérias, ocorre a doença das

artérias coronárias (62).

O processo anterior ocorre gradualmente e designa-se por aterosclerose. As fases

iniciais da aterosclerose iniciam com a disfunção do endotélio. Esta disfunção facilita a

deposição do colesterol e a formação de placas (63). A aterosclerose afecta as artérias do

cérebro, do coração, dos rins, de outros órgãos vitais e dos braços e das pernas. Quando

a aterosclerose se desenvolve nas artérias carótidas pode ocorrer um AVC. Por outro lado,

ao desenvolver-se nas artérias coronárias pode ocorrer um enfarte do miocárdio (7).

A aterosclerose tem início quando os monócitos migram da corrente sanguínea

para o interior da parede da artéria e transformam-se em células que acumulam

substâncias gordas. Com o tempo, estes monócitos carregados de gordura acumulam-se

e produzem espessamentos, distribuídos irregularmente pelo revestimento interno da

artéria. Cada placa aterosclerótica ou de ateroma enche-se de uma substância formada por

diversas substâncias gordas, principalmente colesterol, células musculares lisas e células

de tecido conjuntivo. Em geral, os ateromas formam-se nos locais onde as artérias se

ramificam (7).

As artérias afectadas perdem a sua elasticidade e vão-se tornando mais estreitas à

medida que os ateromas crescem. Para além disso, as artérias acumulam depósitos de

cálcio que se podem tornar frágeis e rebentar. Assim, o sangue pode entrar num ateroma

rebentado, aumentando o seu tamanho e diminuindo ainda mais o lume arterial. Um

ateroma rebentado também pode desencadear a formação de um coágulo sanguíneo. O

coágulo estreita ainda mais a artéria, podendo provocar a sua oclusão ou desprender-se e

alcançar uma artéria mais pequena, onde causará uma oclusão (embolia) (7,63).

Em geral, a aterosclerose só causa sintomas a partir do momento em que a artéria

fica gravemente estreita ou até que cause uma obstrução súbita, dependendo muito do

local onde se desenvolve. Quando há o estreitamento de uma artéria, pode ocorrer uma

dor ou uma cãibra nos momentos em que o fluxo de sangue é insuficiente para satisfazer

as necessidades de oxigénio. Há medida que o ateroma aperta a artéria, estes sintomas

vão-se desenvolvendo gradualmente. Por outro lado, quando ocorre uma obstrução

subida, os sintomas aparecem de imediato (7,63).

O risco de desenvolvimento da aterosclerose aumenta com a hipertensão arterial,

com os altos valores de colesterol, com o tabagismo, a diabetes, a obesidade, a falta de

exercício e a idade avançada (7).


Rute Nogueira 96

Eliminar os factores de risco controláveis que contribuem para a aterosclerose é

uma forma de a prevenir. O hábito de fumar é um dos hábitos que devem ser reduzidos

ou mesmo eliminados. Para além de diminuir a concentração de HDL, aumenta a

concentração de LDL. Por sua vez, o colesterol também aumenta o valor do monóxido de

carbono no sangue, o que pode aumentar o risco de lesões do revestimento da parede

arterial e, além disso, contrair as artérias já estreitadas pela aterosclerose, diminuindo a

quantidade de sangue que chega aos tecidos (62). Por outro lado, o hábito de fumar

aumenta a tendência de coagulação do sangue, o que aumenta o risco de doença arterial

periférica, doença das artérias coronárias, AVC e obstrução de um enxerto arterial depois

de uma intervenção cirúrgica (7).

Como seria de esperar, a doença das artérias coronárias pode levar a

consequências graves, como é o caso da angina de peito e do enfarte agudo do miocárdio.

A angina de peito é o nome dado a uma sensação de desconforto torácico originada

no coração e causada pela falta de oxigénio para as células cardíacas. As necessidades do

coração em oxigénio dependem do esforço que se está a efectuar, pelo que, ao aumentar

a actividade do coração é necessário mais oxigénio. Se as artérias estão mais estreitas ou

existe uma obstrução que impede o aumento da chegada de sangue ao músculo cardíaco

para compensar a maior necessidade de oxigénio, vai ocorrer uma isquemia e, como

consequência, dor (64).

Por sua vez, o enfarte agudo do miocárdio ocorre quando parte do fluxo sanguíneo

que chega ao coração é reduzida ou interrompida de uma forma brusca e grave,

produzindo-se a morte do miocárdio por insuficiência em oxigénio. O coágulo sanguíneo

é, geralmente, a causa mais frequente da interrupção de uma artéria coronária (7,64).

6.1.2. Doença das artérias periféricas

A doença arterial oclusiva inclui a doença das artérias coronárias, que pode

levar a um enfarte, e a doença arterial periférica, que afecta a aorta abdominal e os seus

ramos principais, assim como as artérias das pernas. Ainda que existam outras doenças

vasculares periféricas, neste trabalho vão apenas ser referidas as mais relevantes para o

caso em estudo, tal como referido logo no início desta exposição (7).

Em geral, pessoas com doença arterial periférica têm aterosclerose. No entanto,

uma oclusão arterial parcial ou completa pode ser o resultado de outras causas, como um

coágulo sanguíneo. Quando ocorre o estreitamento de uma artéria, as partes do organismo

que ela irriga recebem um fluxo insuficiente. A consequente diminuição da provisão de


Rute Nogueira 97

oxigénio (isquemia) pode manifestar-se subitamente (isquemia aguda) ou de forma

gradual (isquemia crónica) (7,65).

A prevenção desta patologia passa pela redução dos factores de risco da

aterosclerose, já referidos anteriormente. Quando a doença arterial periférica se

manifesta, o objectivo principal é o tratamento das complicações (cãibras nas pernas ao

caminhar, angina de peito, arritmias, insuficiência cardíaca, enfarte, icto e insuficiência

renal) (7).

A obstrução da aorta abdominal pode ocorrer de forma súbita e completa, em

geral,quando um coágulo transportado pela corrente sanguínea se incrusta numa artéria

(embolia), quando se forma um coágulo (trombose) numa artéria estreitada ou quando se

rompe a parede arterial (dissecação aórtica) (7,65).

Uma obstrução súbita e completa da artéria mesentérica superior, o ramo

principal da aorta abdominal que alimenta grande parte do intestino, é muito grave. No

início, aparecem habitualmente vómitos e evacuações diarreicas e o abdómen pode estar

levemente distendido. Pode aparecer sangue nas fezes e, por último, diminui a pressão

arterial e a pessoa sofre um choque ao mesmo tempo que o intestino gangrena (7).

Quando ocorre um estreitamento gradual de uma artéria das pernas, o principal

sintoma é a sensação dolorosa, cãibras ou cansaço nos músculos da perna com a

actividade física (claudicação intermitente). Em geral, a dor localiza-se na barriga da

perna, mas depende muito do local onde ocorreu o estreitamento, podendo as dores ser

aliviadas quando existe repouso. A curto prazo e com o consequente agravamento da

doença, a distância que a pessoa consegue caminhar sem sentir dor torna-se menor. A

longo prazo, a claudicação começa a ocorrer em repouso. O pé, com o afluxo de sangue

acentuadamente diminuído, arrefece e fica entorpecido. Uma obstrução grave pode causar

a morte dos tecidos (7).

O tratamento depende muito do estado do doente. Doentes com claudicação

intermitente devem caminhar pelo menos 30 minutos por dia, interrompendo a caminhada

quando existe dor. Desta forma, existem melhorias pois o exercício melhora a função

muscular e provoca o aumento de outros vasos sanguíneos que alimentam os músculos.

Por outro lado, o hábito tabágico deveria ser completamente eliminado. Dormir numa

posição mais elevada também vai ajudar, pois aumenta a irrigação sanguínea das pernas.

No que diz respeito a fármacos, a administração de Pentoxifilina para aumentar a

distribuição do oxigénio aos músculos também é usual, assim como a utilização de

antagonistas do cálcio ou a Aspirina (7).


Rute Nogueira 98

6.2.Doenças Venosas

As doenças que ocorrem ao nível das veias designam-se por doenças venosas e

atingem aproximadamente mais de 50% da população portuguesa com diferentes

localizações e graus de gravidade (7).

As veias são vasos sanguíneos com a função de levar o sangue de todos os órgãos

até ao coração. No entanto, podem ocorrer diversos problemas como a inflamação, a

coagulação ou a dilatação das veias que levam à ocorrência de patologias venosas (7).

As pernas contêm dois grupos principais de veias: as superficiais, localizadas na

camada subcutânea, rica em tecido adiposo por debaixo da pele, e as profundas,

localizadas nos músculos. Em geral, a pressão do sangue em todas as veias é baixa, sendo

que nas pernas esta pressão pode representar um problema. Em situações normais, quando

uma pessoa está de pé, o sangue deve circular das veias das pernas para cima, em direcção

ao coração, sendo que as veias profundas desempenham um papel crucial ao fazer a

propulsão do sangue para cima, dada a sua localização dentro dos músculos da barriga

das pernas, pois são profundamente comprimidas em cada passada. Estas veias

transportam 90% ou mais do sangue que vai das pernas para o coração. Cada válvula, de

sentido único, é formada por duas cúspides cujos bordos fazem contacto entre si. O

sangue empurra as cúspides, que se abrem como um par de portas giratórias, mas quando

o sangue tende a regressar na direcção oposta, forçado pela gravidade, empurra as

cúspides de modo a que estas se fechem (7,66,67).

As veias superficiais têm o mesmo tipo de válvulas, mas não estão sujeitas a

qualquer tipo de pressão, uma vez que não se encontram rodeadas por músculos. Assim

sendo, o sangue das veias superficiais flui mais lentamente do que o sangue das veias

profundas (7,68).

6.2.1. Trombose das veias profundas

A trombose das veias profundas resulta da coagulação do sangue nas veias

profundas. À formação de um coágulo num vaso sanguíneo denomina-se trombo. Ainda

que se possam formar trombos nas veias superficiais e profundas da perna, apenas os

trombos das veias profundas podem ser perigosos. A trombose das veias profundas pode

ser perigosa na medida em que o trombo se pode desprender, parcial ou integralmente,

deslocando-se pela corrente sanguínea e alojando-se numa artéria pulmonar, obstruindo

o débito sanguíneo. Alguns trombos podem estar em movimento em forma de êmbolo.


Rute Nogueira 99

Quanto menor for a inflamação à volta do trombo, menos ele vai aderir à parede venosa

e maior é a probabilidade de se transformar num êmbolo. A pressão que os músculos da

barriga da perna exercem, pode levar ao desprendimento do trombo, sobretudo quando

uma pessoa convalescente começa a realizar cada vez mais actividade (7,68).

Os êmbolos originados nas veias das pernas vão obstruir uma ou mais artérias dos

pulmões, provocando uma embolia pulmonar. A gravidade desta patologia depende do

tamanho e da quantidade de êmbolos (7).

A trombose das veias profundas pode ter como causas principais causas as lesões

do revestimento interno da veia ou a hipercoagulabilidade associada a algumas formas de

cancro (7,69).

Cerca de metade dos casos de tromboses das veias profundas não têm sintomas.

A dor no peito causada por uma embolia pulmonar pode ser uma das primeiras indicações

da perturbação. Em casos em que a trombose das veias profundas causa inflamações

substanciais e obstrução da corrente sanguínea, a barriga da perna incha e pode doer,

sentir dor ao tacto e estar quente. O tornozelo, o pé ou a coxa também podem inchar em

função das veias afectadas. Alguns trombos tratam-se através da transformação em tecido

cicatricial, o que pode lesionar as válvulas das veias. Em consequência disto, vai haver

acumulação de líquido e consequente inchaço da coxa, edema este que vai piorando ao

longo do dia, devido ao efeito da gravidade. Por outro lado, durante a noite, o edema vai

desaparecer em consequência da posição horizontal das pernas, que leva ao esvaziamento

das veias. Por vezes, pode ocorrer o aparecimento de uma cor castanha na pele,

geralmente por cima do tornozelo. Esta alteração da cor deve-se ao facto de um número

significativo de glóbulos vermelhos saírem para fora das veias dilatadas. A pele

pigmentada é vulnerável e uma lesão menor, como um rasgão ou um corte podem rompê-

la e provocar uma úlcera (7,67).

7. Aplicação da patologia plaquetária e da cirurgia vascular

7.1.Trombocitopenia na sequência de doenças vasculares – Caso Clínico

Tal como foi referido na introdução deste trabalho, um dos seus objectivos prende-

se com uma patologia de um familiar próximo, tentando encontrar abordagens teóricas

que consigam explicar os acontecimentos ocorridos. Fazendo uma abordagem inicial do

que se vai expor de seguida, inicialmente foi descoberta uma baixa muito acentuada de

plaquetas e, alguns anos depois, foi revelado um entupimento grave da artéria femoral

esquerda.


Rute Nogueira 100

2008 - Após uma ida de urgência ao hospital devido a uma infecção nos

dentes, as análises estavam todas normais excepto os parâmetros de

infecção e as plaquetas, que tinham um valor de 76x109/L de sangue. Na

altura, esta situação não foi considerada significativa, a nível hospitalar.

2011 - As queixas de dores e cansaço começaram a agravar-se cada vez

mais e, após ida ao médico de família, este recomendou a realização de

análises de rotina para perceber se estava tudo bem. Os resultados das

análises, feitas no dia 15 de Novembro de 2011, permitiram verificar que

o valor de plaquetas era de 44x109/L, com registo de trombocitopenia e

observação de macroplaquetas. Esta situação, despertou, de imediato um

alerta médico, tendo o paciente sido reencaminhado, de urgência, para o

hospital. De seguida, logo no dia 24, após ida ao hospital de urgência (com

carta da médica de família), houve lugar à repetição de análises com um

valor de plaquetas de 65x109/L. A reavaliação médica levou ao início da

terapêutica com Lepicortinolo. Este medicamento tem como substância

activa a Prednisolona, glucocorticóide que pode inibir a infiltração de

leucócitos no local da inflamação, interferir com os mediadores de

resposta inflamatória e suprimir as respostas humorais. Existe assim uma

redução da reacção inflamatória, pois a Prednisolona limita a dilatação

capilar e da permeabilidade das estruturas vasculares. Uns dias depois,

logo a 30 de Novembro, as análises foram repetidas e as plaquetas

encontravam-se com um valor de 126x109/L, já sob o efeito de medicação.

A 11 de Dezembro, por indicação médica, o hemograma foi repetido a

nível hospitalar, com o objectivo de reavaliar a trombocitopenia. Por esta

altura, o valor de plaquetas era de 54x109/L, a hemoglobina de 16,9 g/L,

leucocitose de 11,4x109/L e PCR de 0,60 mg/L. A função renal e as

transaminases encontravam-se sem alterações. Neste mesmo dia foi

recomendado o estudo de doenças auto-imunes, hematológicas e

infecciosas em ambulatório, de modo a averiguar uma possível causa para

a trombocitopenia. Após 4 dias, houve uma repetição de análises que

demonstrou novamente trombocitopenia de 58x109/L, ainda com

observação de macroplaquetas. Foram realizados o teste de HIV, Reacção

de Widal, Reacção de Hudlesson e VDRL, tendo todos dado resultados

negativos. A análise feita aos anticorpos anti-nucleares (ANA) obteve


Rute Nogueira 101

resultado positivo, em titulação de 1/160 com padrão mosqueado fino. No

âmbito destas mesmas análises foi feita a Proteína C de alta sensibilidade,

obtendo-se um resultado de 3,20 mg/L, o que representa um alto risco

cardiovascular. Todos os marcadores de hepatite deram negativos.

A 26 de Dezembro de 2011, o paciente começou a ser seguido por outra

médica e, após a realização de análises, as plaquetas subiram ligeiramente,

tendo sido encontrado um valor de 84x109/L com o PDW alterado, o que

sugeria uma alteração qualitativa ao nível das plaquetas existentes. Após

algumas análises efectuadas no serviço de imunohemoterapia do Curry

Cabral, verificou-se que a pesquisa de anticorpos antiplaquetários foi

negativa e ANA positivo com titulação de 1/320, de padrão fino granulado.

2012 - A 20 de Julho, o paciente começou a ser seguido por um especialista

em doenças auto-imunes, realizando análises no hospital que apresentaram

as plaquetas a 36x109/L, com PDW de 21,60%, ou seja, ainda muito

elevado. O anticoagulante lúpico deu um resultado fracamente positivo.

Os ANA permaneceram positivos, com titulação de 1/640 e padrão

mosqueado. A medicação continuou a mesma (Lepicortinolo). A 19 de

Setembro houve repetição dos ANA, com resultado positivo com titulação

de 1/320 e padrão mosqueado.

A 31 de Outubro, a equipa médica assistente, decidiu fazer despiste de

leucemia, fazendo um mielograma. O resultado foi o seguinte: amostra

com grumos mas com alguma destruição celular. Celularidade normal.

Série mielóide sem alterações morfológicas e/ou maturativas

significativas. Série eritróide sem alterações morfológicas e/ou

maturativas significativas. Série megacariocítica: em número ligeiramente

superior ao normal, alguns megacariócitos morfologicamente normais mas

de dimensões mais reduzidas, alguns megacariócitos igualmente de

dimensões reduzidas mas com citoplasma de contornos lisos, mais

basófilo e menos granular. Alguns macrófagos. Não se observaram células

estranhas à medula óssea nem parasitas. Trombocitopenia muito

provavelmente de causa central. Nesse momento, e com o resultado do

mielograma negativo, continuando a causa da trombocitopenia por

descobrir.


Rute Nogueira 102

2013 - A 5 de Abril, o paciente foi transferido para outro especialista,

tendo nesta altura as plaquetas um valor de 83x109/L e o PDW de 15,40%.

Um mês depois, as plaquetas aumentaram para 109x109/L e o paciente

apresentava leucocitose, mantendo-se o PDW. Começava-se a notar

alguma instabilidade nos valores da trombocitopenia que, apesar de terem

aumentado com a cortisona, mantiveram-se muito oscilantes. A 24 de

Julho foi feito o despiste de artrite reumatóide, tendo o anticorpo anti-

citrulina dado resultado negativo.

Após o estudo de várias causas possíveis para a trombocitopenia, a médica

assistente decidiu enviar o paciente para o Hospital dos Capuchos, para o

serviço de hematologia, de modo a ser acompanhado por uma especialista

em hematologia. Nesta altura, as plaquetas encontravam-se com um valor

de 96x109/L e foi tomada a decisão de se começar a fazer o “desmame” da

cortisona de modo a poder ser feito um estudo mais aprofundado da

situação clínica do paciente, sem a interferência da medicação. Na consulta

seguinte e após análises de rotina, o paciente teve alta, com um valor de

plaquetas de 79x109/L, não tendo sido efectuado qualquer tipo de exame

mais aprofundado. Foi recomendado que apenas voltasse ao serviço caso

as plaquetas descessem para 20x109/L. Em análise feita no Instituto

Português do Sangue e da Transplantação, a 31 de Outubro, os anticorpos

antiplaquetários deram positivos.

Após tantas análises e exames, a médica acabou por diagnosticar

Trombocitopenia idiopática imune, dada a inexistência de uma causa para

a patologia encontrada.

2014 - A 25 de Janeiro, após um episódio de urgência devido a uma

infecção respiratória, as plaquetas desceram para 23x109/L, com PCR a

7,80 mg/L, o que levou ao internamento imediato do paciente, por risco de

hemorragia. Após dias com administração de altos níveis de cortisona, o

paciente teve alta com um valor de plaquetas de 72x109/L e a PCR a 0,92

mg/L.

Poucos dias depois, a 2 de Fevereiro, o paciente deixou de conseguir andar

e foi de urgência para o hospital. Nesta altura as plaquetas subiram para

162x109/L por elevado excesso de medicação, com consequências graves

para o organismo, que impossibilitavam o doente de se locomover


Rute Nogueira 103

correctamente. Dias depois, as plaquetas voltaram aos valores habituais de

77x109/L, com PDW elevado. Para além da trombocitopenia, o paciente

sempre se queixou muito com dores nas pernas, dificuldade na locomoção,

cansaço e apneia. Com base nestas queixas, sempre lhe foi dito que eram

sintomas esperados devido à trombocitopenia apresentada. A 27 de Maio,

o paciente foi de novo à urgência, com queixa de claudicação intermitente.

Foi pedido um doppler, com o seguinte resultado: oclusão completa da

artéria femoral superficial esquerda (não havendo fluxo vascular) e

parcialmente ao nível da artéria femoral superficial direita. Com este

resultado, a médica assistente começou a relacionar os dois problemas

existentes. Muito provavelmente, e apesar de não ser muito comum, as

plaquetas estariam em baixo número como uma reacção de defesa do

organismo para que a artéria não ficasse ainda mais ocluída, tentando

evitar a formação de coágulos.

Nessa altura e após estudo do caso clínico, a abordagem médica passou

pela realização de uma cirurgia a 17 de Junho. Verificou-se presença de

isquemia grau III do membro inferior esquerdo; claudicação intermitente

do membro inferior esquerdo de agravamento progressivo e com três

meses de parestesias e dor em repouso. Sem feridas. Foi, então, realizado

um bypass e o paciente começou a fazer outro tipo de medicação:

Clopidogrel, Pentoxifilina e analgésicos.

A 29 de Outubro foi efectuada uma angio TAC que demonstrou a oclusão

do bypass femoral, tendo esta situação sido justificad pelo PDW alterado,

que fez com que as plaquetas do organismo rejeitassem um objecto

estranho como o bypass e o voltassem a ocluir. Apesar de ocluído, o

bypass pareceu resolver parcialmente a situação, pois as plaquetas

começaram a ter valores mais elevados, de 128x109/L, mas ainda com

PDW alterado e elevado.

2015 - Uma vez que a artéria voltou a ocluir, a médica assistente resolveu

recorrer a uma angioplastia à perna esquerda, com recurso a contraste, a 1

de Setembro. No final de 2015, as plaquetas mantinham-se estabilizadas e

já se observava circulação sanguínea na artéria femoral esquerda. Há

previsão de angioplastia à perna direita para 2016.


Rute Nogueira 104

8. Abordagens Terapêuticas

8.1.Tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção de AVC em pacientes

com doenças vasculares associadas


prevenção de doenças vasculares

O Clopidogrel pertence a um grupo de medicamentos denominados antiagregantes

plaquetários. Ao impedir a agregação das plaquetas, este medicamento reduz a

possibilidade de formação de coágulos sanguíneos (trombose). É utilizado em adultos

para prevenir a formação de coágulos sanguíneos (trombos vermelhos) que se formam

em vasos sanguíneos endurecidos (artérias), um processo conhecido como aterotrombose,

que pode conduzir a acidentes vasculares aterotrombóticos (70). No que diz respeito ao

seu mecanismo de acção, o Clopidogrel é um bloqueador irreversível do receptor de ADP

das plaquetas, o qual é fundamental na sua activação e agregação. Não tem efeitos a nível

dos prostanóides (mecanismo da Aspirina), sendo um avançado antagonista do receptor

de ADP que inibe a agregação plaquetária (70).

Por sua vez, a Aspirina contém ácido acetilsalicílico em baixas dosagens e

pertence a um grupo de medicamentos chamados antiagregantes plaquetários, que ajudam

a prevenir a agregação das suas plaquetas sanguíneas, prevenindo a formação de coágulos

(trombos) sanguíneos. É utilizado para ajudar a prevenir a formação de trombos em

doentes que tiveram acidente vascular cerebral, ataque cardíaco, cirurgia de bypass,

obstrução de um vaso sanguíneo ou que tenham angina de peito. Apesar de ser um

importante anti-inflamatório quando utilizado em altas concentrações, em baixas

concentrações funciona como antiagregante plaquetário, sendo a sua utilização mais

concentrada nesta aspecto (71). Como já é sabido, as plaquetas são responsáveis por

iniciar o processo de coagulação. A Aspirina tem como função inibir a agregação das

plaquetas, tornando o processo inicial da coagulação mais difícil de ocorrer. Em geral, é

prescrita em conjunto com outro antiagregante plaquetário (como o Clopidogrel) para

potencializar a inibição das plaquetas (72).

A baixa dose de Aspirina na terapia antiplaquetária continua a ser o medicamento

de escolha na prevenção de eventos cardiovasculares. No entanto, a protecção que a

Aspirina oferece para as pessoas com alto risco de eventos cardiovasculares é apenas

relativamente moderada. A evidência disponível através destes estudos mostra que o uso

de Clopidogrel com a Aspirina está associado a uma redução do risco de eventos

cardiovasculares em comparação com a Aspirina isolada em pacientes com síndrome


Rute Nogueira 105

coraniana agudo, sem elevação do segmento ST. Em pacientes com alto risco de doenças

cardiovasculares, os benefícios e riscos do tratamento combinado são ainda muito fracos

(73).

Em outro estudo feito, a comparação entre a monoterapia com Aspirina e a

combinação entre Clopidogrel e Aspirina, em doentes com doença arterial periférica

sintomática, revelou um benefício adicional no que respeita à redução dos riscos

vasculares e dos eventos trombóticos. Por outro lado, não existe uma evidência disponível

para pacientes que sofreram um acidente vascular sob o efeito de Aspirina, que os

resultados de alterem quando se começa a aplicar uma terapia em associação com

Clopidogrel (72).

8.2. Monitorização/Controlo laboratorial da terapêutica

Ainda que a Aspirina e o Clopidogrel sejam utilizados na prevenção e tratamento

de doenças vasculares, há que ter alguma atenção aos diversos problemas secundários que

podem surgir da sua administração.

No caso do Clopidogrel, tem de se ter elevada atenção a situações que possam

levar a um risco de hemorragia, tais como hemorragias internas, cirurgias recentes ou até

mesmo cirurgias que estejam a ser planeadas. Por outro lado, doenças dos rins ou do

fígado devem também ser vigiadas. No caso de desenvolver Púrpura Trombocitopénica

Trombótica, a qual inclui febre e nódoas negras debaixo da pele que podem parecer como

minúsculos pontos vermelhos, com ou sem cansaço extremo inexplicável, confusão,

amarelecimento da pele e/ou olhos, o médico deverá ser informado de modo a avaliar a

continuação ou não do tratamento com Clopidogrel. Uma vez que o medicamento actua

ao evitando a possibilidade de se formarem coágulos de sangue, se houver um corte ou

ferimento, o tempo que leva a estancar a hemorragia poderá ser mais elevado. Para além

de tudo isto, o médico assistente deve pedir análises periódicas como forma de controlo

da terapêutica (70).

Relativamente à Aspirina, é necessário ter em atenção algumas patologias que

podem definir a possibilidade de continuar ou não com a terapêutica. No caso da

existência de diabetes, de problemas renais ou do fígado, de deficiência em glucose-6-

fosfatase desidrogenase é necessário um controlo mais apertado da toma da Aspirina. Por

outro lado, se está prevista uma cirurgia num prazo de 7 dias, o médico assistente deve

ser contactado. Grávidas e idosos não devem tomar Aspirina (enquanto antiplaquetário).

No seguimento disto, crianças com idade inferior a 16 anos também não devem tomar


Rute Nogueira 106

Aspirina, uma vez que a sua utilização parece estar associada a uma doença muito rara

em crianças designada por Síndrome de Reye, que pode ser fatal (71).

Em suma, é necessário ter alguma atenção à toma deste tipo de medicamentos,

uma vez que, ainda que sejam benéficos para a patologia para a qual estão designados,

podem levar ao aparecimento de outro tipo de patologias ou agravar algumas já existentes,

sendo importante o controlo e monitorização constantes.

8.3. Novos agentes antiplaquetários

Os agentes antiplaquetários são os pilares no tratamento e prevenção do

tromboembolismo. Agentes antitrombóticos, como a Aspirina, o Clopidogrel, antagonista

da vitamina K e Foundaparinux (inibidor directo do factor Xa) já foram incorporados na

prática clínica rotineira dos serviços de terapia intensiva. Recentemente tem-se

demonstrado grande interesse nos agentes que inibem selectivamente o factor Xa e a

trombina. Estes apresentam estrutura molecular pequena e inibem simultaneamente o

factor da coagulação livre no plasma e ligado ao trombo. De entre os novos

anticoagulantes orais, Dabigatran, Rivaroxaban e Apixaban são os que apresentam

estudos clínicos em fases mais avançadas e o uso na prática clínica já é feito em alguns

países (8).

Os inibidores directos da trombina (IDT) bloqueiam a actividade da trombina em

dois sítios, ou seja, livre no plasma e ligada ao trombo. Consequentemente impedem a

conversão do fibrinogénio em fibrina, interferindo sobre as fases de amplificação e

propagação consideradas no modelo celular da coagulação pela diminuição da geração da

trombina. Estes inibidores têm também como vantagem a propriedade de não se ligarem

às proteínas plasmáticas. Os IDT apresentam uma estabilidade plasmática constante e

dispensam a necessidade de monitorização laboratorial. Têm um rápido pico de acção, a

eliminação é feita predominantemente de forma renal e por não serem neutralizados pelo

factor plaquetário tipo 4 (FPT4), evitam a ocorrência de síndrome clínica resultante do

efeito adverso do uso de heparinas. Pode haver uma divisão em dois grupos: os compostos

que se ligam de forma bivalente à trombina, à hirudina e à bivalirudina e os compostos

que se ligam à trombina de forma univalente (somente o sítio activo) (8).

Os inibidores directos do factor Xa (IDFXa) são uma classe de antitrombóticos

que se ligam directamente ao factor Xa, sem a necessidade da participação da

antitrombina. A actividade antitrombótica destes agentes é específica para o factor Xa,

sem nenhuma interacção ou efeito sobre outros factores das vias intrínseca e extrínseca


Rute Nogueira 107

da coagulação e sem efeitos indesejáveis, como a trombocitopenia. Estes compostos têm

como principais vantagens o tamanho das moléculas (baixo peso molecular), a forma de

administração (uso oral) e a sua capacidade de inactivar formas circulantes e ligadas do

factor Xa. A inibição é feita de maneira estequiométrica, ou seja, uma molécula do IDFXa

inactiva uma molécula do factor Xa. Teoricamente, tem a capacisade de inibir o factor Xa

no complexo protrombinase, assim como coágulos ligados ao factor Xa, exercendo maior

controlo sobre a formação e a progressão de trombos, o que lhe confere uma maior

eficácia clínica (8).

Actualmente, a variedade de anticoagulantes utilizados na profilaxia e no

tratamento de diversas situações trombóticas em unidades de terapia intensiva é muito

ampla. Por outro lado, apesar de todos os estudos feitos até agora, ainda não se dispõe de

um anticoagulante ideal, com farmacocinética e farmacodinâmica previsíveis, posologia

simplificada, reduzida interacção medicamentosa, antídoto específico e sem necessidade

de monitorização laboratorial. Assim, o desenvolvimento de novos anticoagulantes, como

os inibidores do factor Xa e os inibidores directos da trombina, mostram-se muito

importantes no tratamento destas patologias. Entretanto, são necessárias novas evidências

para que se encontre uma alternativa para o seu cuidado de forma integral, minimizando

a ocorrência de reacções secundárias (8,74).


Rute Nogueira 108

Conclusões e Perspectivas

Muito ainda há a fazer na área das plaquetas e cirurgia vascular. Apesar de um dos

objectivos iniciais ter sido encontrar uma justificação para a relação que a equipa médica

deu ao problema do paciente, isso não se verificou possível. Neste momento, e apesar da

revisão bibliográfica feita, o facto de a formação de trombos que estão a obstruir a artéria

femoral estarem a causar uma diminuição do número de plaquetas em circulação, parece

ainda a justificação mais plausível. A reacção do organismo em baixar o número de

plaquetas nesta situação funcionou como uma reacção de defesa do mesmo, pois desta

forma, a probabilidade de se formarem novos trombos era menor. Assim sendo, o facto

de o número de plaquetas ter aumentado após a cirurgia vascular também corrobora esta

observação. Este aumento teve também na origem a administração de Clopidogrel e

Aspirina 100 mg em associação o que, como foi explicado, tem uma relação de benefício

para o doente.

Ainda há muito a fazer nesta área pois, apesar de ter existido um aumento do

número de plaquetas, este não é uniforme e ainda não atingiu o número mínimo de

plaquetas considerado normal, estando ainda ligeiramente abaixo dos 150x109/L. Deste

modo, conclui-se que ainda existe algum facto desconhecido que está a provocar esta

descida e que, ao ser descoberto, pode melhorar em muito a qualidade de vida deste

paciente.

Em suma, a relação existente entre as plaquetas e a cirurgia vascular é ainda muito

pouco conhecida, havendo muitos factos que provocam patologias plaquetárias, no

seguimento de desordens vasculares e que ainda não são relacionadas desta forma. Por

outro lado, é cada vez mais importante a descoberta de uma maior gama e mais eficaz de

agentes antiplaquetários, que possam melhorar a qualidade de vida dos doentes com este

tipo de patologias.


Rute Nogueira 109

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Rute Nogueira 115

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Farmácia da Universidade de Lisboa, 21 de Novembro de 2013

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http://www.microscopiadigital.com/

http://www.biolabor.pt/

RELATÓRIO DE ESTÁGIO E MONOGRAFIA MESTRADO ......8.1.1. Aspirina e Clopidogrel, antiagregantes...

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