REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA...
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REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
DIVISIÓN DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRÍA EN MICROBIOLOGÍA
CARACTERIZACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Y DEL PERFIL
PLASMÍDICO EN CEPAS DE Staphylococcus aureus AISLADAS DE QUESOS ARTESANALES E INDUSTRIALES CONSUMIDOS EN EL MUNICIPIO DE
VALLEDUPAR CESAR-COLOMBIA
Trabajo De Grado Presentado Para Optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología
Autor: Ivonne Acosta Nieves Lcda .en Ciencias Naturales
Tutora: Lorena Atencio de Guiñez M.Sc. En ciencias biológicas
Maracaibo, Junio de 2010
Caracterización de la susceptibilidad a antibióticos y del perfil plasmídico en cepas de Staphylococcus aureus Aisladas de Quesos Artesanales e industriales consumidos en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia
Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Trabajo Especial de Grado presentado por: Lcda. IVONNE ACOSTA NIEVES
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CARACTERIZACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS Y DEL PERFIL PLASMÍDICO EN CEPAS DE Staphylococcus aureus AISLADAS DE QUESOS
ARTESANALES E INDUSTRIALES CONSUMIDOS EN EL MUNICIPIO DE
VALLEDUPAR CESAR-COLOMBIA
____________________________________
Lcda en Ciencias Naturales, Ivonne Acosta Nieves
CI. 49774908
Dirección: Barrio Alfonso López Cra 18 Nº 13B-19 apart 102B. Municipio de Valledupar. Colombia.
Teléfono fijo: 5756952
Teléfono móvil: 3168685707 Dirección electrónica: [email protected]
______________________________________ Tutora: Lorena Atencio de Guiñez
M.Sc. En ciencias Biológicas
Dirección electrónica:[email protected]
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Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Trabajo Especial de Grado presentado por: Lcda. IVONNE ACOSTA NIEVES
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Caracterización de la susceptibilidad a antibióticos y del perfil plasmídico en cepas de Staphylococcus aureus Aisladas de Quesos Artesanales e industriales consumidos en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia
Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Trabajo Especial de Grado presentado por: Lcda. IVONNE ACOSTA NIEVES
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Acosta N., Ivonne P. Caracterización de la susceptibilidad a antibióticos y del perfil Plasmídico en cepas de Staphylococcus aureus Aisladas de Quesos Artesanales e industriales consumidos en el Municipio de Valledupar Cesar-
Colombia. Trabajo de Grado para optar al Grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maestría en Microbiología, Maracaibo, Venezuela, 2010.
76pp.
RESUMEN
En el presente trabajo se caracterizó la susceptibilidad a antibióticos y perfil plasmídico de cepas de Staphylococcus aureus aisladas de quesos artesanales e industriales que
se consumen en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia. Las cepas fueron aisladas de quesos blandos, semiduros y duros de origen artesanal e industrial
escogidos de forma aleatoria en expendios de quesos del municipio. Por el método de Difusión del disco en agar -se determinó la resistencia a antibióticos y con la técnica de lisis alcalina y electroforesis en gel de agarosa el perfil plasmídico. Como resultado se
obtuvo una carga microbiana por encima de 103 UFC/g que esta sobre el valor promedio máximo permitido según la norna covenin 1538-92, el cual indica que se puede desencadenar brotes por intoxicación con estafilocócos. Se demostró la presencia de S. aureus en los quesos costeños blandos (88%), seguidos por los
quesos semiduros (12%) ambos de origen (artesanal), los cuales son de alto consumo en Valledupar. Se establecieron 4 patrones diferentes de resistencia en las cepas de S.
aureus aisladas de los quesos , siendo el patrón TER común para cinco cepas, el resto
de los patrones fueron únicos (PR, CR y EI). Una cepa fue resisente a P productora de β-lactamasas su CMI más alta fue 32µg/ml; todas las cepas mostraron sensibilidad a
oxacilina, gentamicina, ciprofloxacina, cefoxitin, clindamicina, trimetoprim sulfa, vancomicina, rifampin, e imipenen . Hubo bandas plasmídicas con tamaños entre 23kb y los 2kb, encontrándose cepas con 1 y 3 plásmidos. Es el primer aporte en Valledupar que se hace a la biología molecular de los plásmidos en cepas de S. aureus autóctonas
de productos lácteos artesanales y manufacturados.
Palabras claves: Plásmidos, Quesos artesanales e industriales, Resistencia antibiótica, Staphylococcus aureus.
E-mail: [email protected]
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Acosta N., Ivonne P. Characterization of antibiotic susceptibility and the plasmídic profile in strains of Staphylococcus aureus Isolated from artisan cheeses and manufacturers consumed in Municipality of Valledupar Cesar-Colombia. Proyecto
de Trabajo de Grado para optar al grado de Magíster Scientiarum en Microbiología. La Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, División de Estudios para Graduados, Maestría en Microbiología, Maracaibo, Venezuela, 2010. 76 pp.
ABSTRACT
In this study we characterized the susceptibility to antibiotics and plasmid profile of strains of Staphylococcus aureus isolated from artisanal and industrial cheeses that are
consumed in the municipality of Valledupar, Cesar, Colombia. The strains were isolated from soft cheeses, semi-hard and hard to craft and industrial origin randomly selected cheeses in retail shops of the town. the resistance to antibiotic was determined by the
disk diffusion method and plasmid profile, by alkaline lysis and agarose gel electrophoresis. As a result, a microbial load was obtained a bioburden above of 103 CFU / g that this on the average maximum allowed under the regulation covenin 1538-
92, which indicates that it can trigger staphylococcal poisoning outbreaks. It showed the presence of S. aureus in coastal soft cheeses (88%), followed by semi-hard cheeses
(12%) were both from (artisanal), which are of high consumption in Valledupar. There were 4 different resistance patterns in strains of S. aureus isolated from cheese, in a
pattern common TER five strains, the rest were unique patterns (PR, CR and EI). One strain was resistant to P β-lactamase producing its highest CMI was 32μg/ml; all strains
were sensitive to oxacillin, gentamycin, ciprofloxacin, cephoxitin, clindamycin, sulfa trimetoprim, vancomycin, rifampin, imipenem. There plasmid bands with sizes between 23kb and 2kb, being 1 and 3 strains with plasmids. It is the first contribution in Valledupar which makes molecular biology of plasmids in strains of S. aureus native
handicrafts and manufactured dairy products.
Keywords: plasmids, artisanal and industrial cheeses, antibiotic resistance, Staphylococcus aureus.
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DEDICATORIA
A DIOS, por darme la oportunidad de capacitarme y acompañarme en todos los
viajes.
A MIS PADRES, MAURA Y GREGORIO, por brindarme apoyo en todo momento y
ayudarme a cuidar mis hijos.
A MI HIJA DE MI ALMA, DANIELA, por ser dulce y colaboradora cuando tengo
que alejarme de su lado.
A MI BEBE DE MI AMOR, CARLO ALEJANDRO, por brindarme una gran felicidad
al venir a mi vida
A MI ESPOSO, GUSTAVO, por su amor y comprensión.
A MIS HERMANOS SANDRA Y GREGORIO, por ser parte de mi vida.
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AGRADECIMIENTO
A DIOS por permitir que terminara esta maestría.
A MIS PADRES, ESPOSO, HIJOS Y HERMANOS por estar siempre conmigo y
brindarme su apoyo.
A LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA en su figura del CONDES por el financiamiento de
este proyecto.
A MI TUTORA, MSc LORENA ATENCIO, por brindarme tiempo en la corrección de los
trabajos, por sus enseñanzas y creer en mí.
A LA MSc GISELA FUENMAYOR, por brindarme tiempo en las practicas de mi trabajo
y por su dedicación en enseñarme. Muchas gracias.
A LOS COMPAÑEROS DE LABORATORIO DE GENETICA Y BIOLOGIA
MOLECULAR EN VENEZUELA, JOHANDRY, RIXIO y VELINA por ayudarme a
desarrollar mis practicas.
A MIS JURADOS y a todas las personas, que de alguna forma contribuyeron a la
culminación de este trabajo.
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8
INDICE GENERAL
Pág.
RESUMEN 4
ABSTRACT 5
DEDICATORIA 6
AGRADECIMIENTOS 7
INDICE DE FIGURAS 11
INDICE DE GRÁFICOS 12
INDICE DE TABLAS 13
INTRODUCCION 14
2. MARCO TEÓRICO 16
Generalidades 16
Estudios de distribución y transmisión de S. aureus asociados a
alimentos
19
Genética de Staphylococcus aureus 24
Susceptibilidad a los antibióticos 27
3. OBJETIVOS 35
4. MATERIALES Y MÉTODOS 36
4.1 Tipo de investigación. 36
4.2 Población de estudio. 36
4.2.1 Recolección de muestras de quesos 36
4.2.2 Homogenización de la muestra y aislamiento de Staphylococcus-
aureus.
37
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4.2.3 Caracterización de la morfología celular y colonial, bioquímica de
las cepas de Staphylococcus-aureus y preservación de las muestras.
37
4.2.4 Determinación de la susceptibilidad a antibióticos en cepas de S.
aureus
38
4.2.4.1 Determinación de resistencia a los antibióticos por el
método de difusión del disco en agar
38
4.2.4.2 Determinación de la producción de β- lactamasas en cepas
de Staphylococcus aureus, mediante el método de la cefalosporina
cromogénica (Nitrocefina).
39
4.2.4.3 Detección de cepas de Staphylococcus aureus Meticilina
Resistentes (SAMR) mediante la técnica Oxacilina Screening plate.
40
4.2.4.4 Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima a los
antibióticos Oxacilina, Vancomicina y Penicilina G, empleando el
método de dilución en agar.
41
4.2.4.5 Determinación de fenotipos de resistencia a la familia
macrólidos, lincosamidas, estreptograminas B (MLSB ).
41
4.3 Extracción de ADN plasmídico de cepas de Staphylococcus-aureus
mediante lisis alcalina.
42
4.3.1 Extracción y observación de plásmidos crípticos en geles de
agarosa al 0,7% p/v.
43
4.4 Análisis estadístico. 43
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 45
5.1 Aislamiento de S. aureus en quesos artesanales e industriales. 45
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10
5.2 Caracterización e identificación bioquímica de cepas de S. aureus 49
5.3 Fenotipos de susceptibilidad a los antibióticos en los aislados de S.
aureus
50
5.4 Determinación de cepas Staphylococcus aureus Meticilina
Resistentes (SAMR) mediante la técnica Oxacilina Screening plate.
55
5.5 Perfiles de DNA plasmídico en cepas de S. aureus 55
6. CONCLUSIÓN 61
7. RECOMENDACIONES 62
8. BIBLIOGRAFIA
9. ANEXOS
63
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INDICE DE FIGURAS
Figura Pág. Figura 1. Porcentaje de Participación en la Producción de productos
alimenticios y de bebidas en Colombia: Producción bruta por subsectores
(2003) DANE.
15
Figura 2 y 3 Bandas plasmídicas observadas en cepas de S. aureus
............................................................................................................................
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INDICE DE GRÁFICOS
Gráfico Pág.
1. Porcentaje de cepas de Staphylococcus aureus en quesos
46
2. Porcentaje de susceptibilidad a antibióticos en cepas de S. aureus 50
3. Porcentaje de Cepas de Staphylococcus aureus Resistentes a los
antibióticos ensayados
52
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INDICE DE TABLAS
Tabla
Pág.
Tabla 1. Características que distinguen tres especies principales del género
Staphylococcus.
17
Tabla 2.- Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el alimento
involucrado
23
Tabla 3.- Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el agente
involucrado
23
Tabla 4. Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según lugar de
consumo
24
Tabla 5. Rangos para las CIM en S. aureus según el CLSI 41
Tabla 6 Valores promedios y rango de Staphylococcus aureus en quesos 45
Tabla 7-. Nomenclatura y procedencia de las cepas de S. aureus aisladas de
quesos.
47
Tabla 8. Patrón de resistencia en cepas de S aureus aislados de quesos 50
Tabla 9. Perfiles plasmídicos en las cepas de S. aureus aisladas de quesos 60
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INTRODUCCION
La República de Colombia es uno de los países latinoamericanos cuya actividad
pecuaria es el pilar económico fundamental, siendo el Departamento del Cesar uno de
los departamentos colombianos aventajados en este sector por cuanto el crecimiento
de la industria lechera y la cría de ganado de levante son equiparables al aumento de
la población bovina usada para este doble propósito. De acuerdo a datos estadísticos,
la población bovina en el año de 1999 era de 1.416.002 cabezas, hacia el 2003 se
registró una cifra de 1.425.319 cabezas, cuando el número de personas de la cabecera
municipal del departamento alcanzó apenas una cifra de 643.096 habitantes
(Gobernación del Cesar. El Cesar en Cifras 2000-2003 publicado por el diario el
colombiano en el 2003). Por esta razón, se considera este departamento al igual que
su capital Valledupar, como zonas ganaderas por excelencia, esto se refleja en las
diferentes manifestaciones culturales aún en las más íntimas, como por ejemplo el
folclor, ahora muy conocido a nivel mundial. De acuerdo a esto, la prestante economía
del municipio de Valledupar, goza de la presencia comercial de empresas
multinacionales como Nestlé, nacionales como Colanta y regionales como Coolesar y
Klarens, que han impulsado enormemente la industria lechera en la región.
El sector agroindustrial en Colombia según el departamento administrativo
nacional de estadística DANE, se posiciona como el sector más importante de la
industria manufacturera colombiana con una producción bruta de US$ 9.500 millones
en el 2003. Esta cifra representa aproximadamente el 31% del total de la producción
bruta total, seguido de lejos por la fabricación de sustancias y productos químicos que
representa el 14% del total de la producción industrial. Así mismo, este sector
representa el 10,2% del total nacional y genera 110.000 empleos directos. El sector
agroindustrial colombiano está diversificado. El país es un gran productor de lácteos,
bebidas, productos de molinería, cárnicos, aceites, entre muchas otras (Figura 1)
(DANE, 2004).
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No obstante, la producción lechera del Cesar aún se maneja de manera
incipiente en los hatos ganaderos donde la tecnología no ha llegado. Es de preocupar,
de acuerdo a datos obtenidos por el sistema nacional de vigilancia en salud pública
(SIVIGILA., 2005), que reporta casos de enfermedades transmitidas por alimentos ETA
debido al consumos de quesos en Valledupar; Esto hace que la industria de lácteos se
convierta en un riesgo para la salud pública toda vez, que en la mayoría de los casos,
los alimentos son preparados por personas sin la capacitación para su correcta
manipulación en condiciones precarias de higiene, lo que facilita la aparición de las
(ETA) producidas por microorganismos como Salmonella sp., E. coli, Listeria sp.,
Campylobacter, S .aureus y Coliformes (Brooks y col., 2002).
Figura 1. Porcentaje de Participación en la Producción productos alimenticios y de bebidas en Colombia: Producción bruta por
subsectores (2004) DANE.
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2. MARCO TEÓRICO
Generalidades de los Staphylococcus aureus
El género Staphylococcus se ubica dentro de la familia Staphylococcaceae del
orden Bacillales, la cual incluye otros tres géneros: Jeotgalicoccus, Macrococcus y
Salinococcus, caracterizadas por poseer una morfología en coco inmóvil de 0.8 – 1,0
m de diámetro, Gram positivo que se dividen en tres planos para formar racimos
irregulares de células (Sierra y col., 2002; Aranaga, 2006)
La diferenciación de las especies estafilocócicas se basa en su fisiología y
reacciones enzimáticas producidas por cada una de ellas, obteniéndose actualmente
mas de 40 especies (Mac Faddin, 2000). Según Walker, 2.000, los estafilococos se
caracterizan por ser catalasa positiva, un carácter que los diferencia de los
estreptococos que son catalasa negativos.
Durante varias décadas la taxonomía del género Staphylococcus, fue
controversial, ya que los puntos de vista de los microbiólogos clínicos y los que
estudian la sistemática bacteriana son divergentes. Se han registrado al menos trece
especies. Los estafilococos se tiñen fácilmente con colorantes básicos y son
fuertemente Gram positivos (Tabla 1). En las placas de agar, las colonias individuales
son lisas, circulares, convexas-baja, y varían de 1 – 4 mm de tamaño. Las cepas de S.
aureus son de color amarillentas (“aureus”), aunque no todas las colonias de S. aureus
tienen esta característica. La producción de pigmentos (pigmentos carotenoides) que
oscila de naranja a amarillo pálido, pueden observarse mejor por crecimiento en placas
de agar a 37° C por 24 horas, seguida de una incubación a temperatura ambiente
durante unas 24 a 48 horas. No se producen pigmentos en condiciones anaerobias
(Brooks y col., 2002; Mac Faddin, 2000; Walker, 2000).
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Tabla 1
Características que distinguen tres especies principales del género Staphylococcus
S. aureus S. epidermidis S. saprophyticus
Producción de coagulasa (s) + - -
Ácido a partir de manitol
(anaerobio)
+ - -
Producción de toxina alfa + - -
Proteína A en la pared celular + - -
Fosfato de ribitol de tipo ácido
teicoico en la pared celular
+ - +
Fosfato de glicerol de tipo ácido
teicoico en la pared celular
- + V
Crecimiento anaerobio y
fermentación de glucosa
+ + -
Sensibilidad a la novobiocina + + -
Tomado de Lancette y Bennet, 2001. Datos de Hájek y MarŠálek: Baird-Parker: Ann.N: Y: Acad.Sci., 236:7, 1974.V: variable, += 90% cepas positivas, -= 90% de cepas negativas
Los estafilococos pueden aislarse también sobre agar manitol salado, que es un
medio de alta salinidad (7,5% de NaCl) y que contiene manitol como fuente de energía,
S. aureus fermenta manitol y hace que el medio se torne amarillo, aunque los
estafilococos crecen en este medio, su capacidad para fermentar el manitol es muy
variable. Los estafilococos varían respecto a los azúcares que fermentan, pero cuando
se cultivan en tubos de fermentación cada especie produce ácido a partir de los
azúcares aunque sin desprendimiento de gases (Walker, 2000). El Agar Baird-Parker
(BPA) es el medio recomendado para el aislamiento de S. aureus de las fuentes de
alimentos contaminadas. Los agentes selectivos glicina, litio y telurito han sido
utilizados para el aislamiento de S. aureus mientras que inhiben el crecimiento de otros
microorganismos que presentan las muestras de alimentos (CESU, 2001).
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Los estafilococos son aerobios y anaerobios facultativos. Se obtiene crecimiento
más abundante en condiciones aeróbicas; algunas cepas requieren del aumento de
tensión de CO2. Los estafilococos tienen un crecimiento en amplios rangos de
temperaturas que oscilan entre 6,5 a 46° C, cuyo óptimo para S. aureus es de 30 a 37°
C en un medio con pH de 7,0 – 7,5. (Sierra y col., 2002)
Estas bacterias pueden causar infección cuando penetran la piel a través de una
cortadura o una úlcera, o cuando ingresan al cuerpo a través de un catéter, o de un
tubo de respiración, o cuando colonizan directamente las mucosas que están en
contacto con el ambiente externo. S. aureus expresa una amplia gama de potenciales
factores de virulencia como son las proteínas de superficie que promueven la
colonización de tejidos; las invasinas (leucocidina, quinasas, hialuronidasa) que
promueven la expansión bacteriana en el tejido, los factores de superficie (micro
cápsula, proteína A) que inhiben la fagocitosis; las propiedades bioquímicas
(carotenoides, catalasa) que aumentan su supervivencia en los fagocitos; los
“disfraces” inmunológicos (proteína A, factores coagulantes como la estafilocinasa y la
coagulasa); las toxinas destructoras de membranas (hemolisinas, leucotoxina,
leucocidina) que lisan las membranas eucarióticas; las exotoxinas (SE A-G, TSST-1,
ET) que dañan los tejidos o provocan otros síntomas de la infección, y la resistencia
intrínseca o adquirida a los antibióticos (Walker, 2000).
La mayor parte de los seres humanos llevan consigo gran número de
Staphylococcus y organismos relacionados, tanto en la nariz como en la piel.
Staphylococcus epidermidis, es relativamente no patógeno, oportunista, y casi siempre
se encuentra en la flora normal de piel y mucosas de las vías respiratorias y digestivas,
mientras que el patógeno Staphylococcus aureus es componente normal de la
microflora humana autóctona, transportado asintomáticamente en ciertas zonas del
cuerpo. Este comensal persiste en piel, naríz, perineo y vagina (Lancette y Bennet,
2001).
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Aunque S. aureus y S. epidermidis frecuentemente son transportados por
individuos sanos, hay ciertas circunstancias que pueden provocar enfermedades que
pongan la vida en peligro. Debido a su presencia en superficies corporales se hallan en
posición para invadir siempre que las defensas del huésped estén aunque sólo sea
ligeramente perturbada. En consecuencia, son causas frecuentes de infecciones de
heridas traumáticas y quirúrgicas, así como infecciones más superficiales de piel. Al
respecto, una lesión estafilocóccica frecuente y característica es el furúnculo de la piel.
Sin embargo, las bacterias pueden invadir e infectar prácticamente cualquier tejido,
provocando enfermedades tan diversas como osteomielitis, septicemia, neumonía y
enterocolitis (Walker, 2000).
Los estafilococos, son más resistentes a condiciones ambientales adversas que
muchas bacterias no esporuladas (Walker, 2000). Las cepas de S. aureus son
resistentes a muchos fármacos y resisten a la muerte frente a la mayor parte de los
desinfectantes. Las estirpes típicas de S. aureus producen: α-toxinas, coagulasa y
nucleasa termoestables (Walker, 2000).
Estudios de distribución y transmisión de S. aureus asociados a alimentos
La intoxicación alimentaria por estafilococos no es una enfermedad infecciosa
sino una intoxicación resultante de ingestión de alimentos contaminados por toxina
preformada. El origen de la contaminación suele ser la manipulación de los alimentos
por un individuo portador de S. aureus. Los microorganismos crecen con rapidez e
incluso a temperatura ambiente, y pueden acumularse concentraciones peligrosas de
enterotoxinas en los alimentos en unas pocas horas. Como las toxinas son muy
termoresistentes, el calor no hace que los alimentos que contienen enterotoxina sean
seguros para el consumo. Después de la ingestión, al cabo de una a seis horas
aparecen síntomas de náuseas, vómitos y diarrea. La enfermedad es autolimitante;
después de uno o dos días, suele lograrse la recuperación completa (Lancette y
Bennet, 2001).
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En alimentos con un potencial hídrico (aw) de 0,9 a 0,95 o con 5 a 10% de sal, S.
aureus puede dominar, ya que la mayoría de las bacterias no pueden crecer bajo estas
condiciones. La presencia de S. aureus en un alimento usualmente indica
contaminación por la piel, boca, o nariz de los trabajadores que manejan el alimento
(Lancette y Bennet, 2001), pero también una inadecuada limpieza de equipo y
productos de origen animal son fuentes de contaminación (CESU, 2001).
La importancia de los estafilococos de aislados clínicos y alimenticios se debe a
la amplia variedad de virulencia específica que guardan en común (Jabbloski y Boach,
2001).
La intoxicación puede deberse a 6 enterotoxinas estafilocócicas: A, B, C, D E y
F. Se produce toxina suficiente en 4 a 6 horas a 32ºC, pero no con temperatura de
refrigeración, como para producir síntomas de intoxicación por alimentos. De hecho, la
intoxicación estafilocóccica alimentaria (SFP) es una causa persistente de
gastroenteritis en países desarrollados y a nivel mundial, tratarlo puede ser más
costoso, que otros patógenos asociados a alimentos (Lombard y col., 2004).
(Jabbloski y Boach, 2001).
Alimentos que se exponen a la contaminación por S. aureus posterior a su
procesamiento representan un significante riesgo para la salud, porque se han
eliminado microbios que normalmente podrían causar la exclusión de S. aureus por
competencia. El abuso de las temperaturas (es decir, inadecuada temperatura de
almacenamiento) de los alimentos también permite la proliferación de estafilococos
(Jabblonski y Boach, 2001).
Una de las dificultades asociadas con la contaminación estafilocócica es que al
crecer los microorganismos en el alimento, la presencia de estos y sus enterotoxinas,
no causan efectos sobre las características organolépticas y por consiguiente puede
pasar desapercibido (Lombard y col., 2004). (Jabblonski y Boach, 2001), la mayoría de
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los alimentos que normalmente se ven afectados incluyen cremas fustigadas (nata),
huevos, mayonesa y carnes (Lombard y col., 2004). Un criterio para confirmar un caso
de ETA causada por Staphylococcus aureus es el aislamiento de mas de 105 unidades
formadoras de colonias (UFC/g o mL) en el alimento analizado (Ríos, 2003). Los
indicios de intoxicación alimentaria se inician de 1 a 6 horas tras la ingesta de algún
alimento rico en proteína (como pasta rellena, ensalada de jamón, ensalada de pollo,
queso cotagge o carne enlatada) infectado por una cepa de S. aureus productora de
enterotoxina. Los pacientes presentan vómitos y diarrea que duran 6 a 48 horas. La
intoxicación alimentaria por Staphylococcus aureus pone en peligro la vida de personas
de edad avanzada y lactantes, ya que estos se afectan por los cambios de hidratación
(Walker, 2000).
El queso ha estado implicado como vehículo de enfermedades transmitidas por
alimentos (ETA) en varios casos a lo largo de toda América del Sur. En un estudio
realizado sobre alimentos sospechosos de ocasionar incidentes de ETA en Venezuela
desde 1989-1999, se halló que el agente causal encontrado con mayor frecuencia era
S. aureus y en la mayoría de los casos, el queso estaba involucrado (Ríos, 2003).
En el 2001, el Laboratorio de Microbiología del Instituto de Investigación
Nacional (Lima –Perú), obtuvo de 30 muestras de queso fresco artesanal (de leche de
vaca) analizadas, 24 (80%) que presentaban contaje de Staphylococcus aureus por
encima de 102 UFC/g límite máximo establecido por la Norma Técnica Peruana (NTP)
202.087 para el queso fresco producido de manera artesanal (Díaz y Gonzáles, 2001).
Otro estudio realizado en Chile, revela que S aureus fue aislado de las muestras
retrofaríngeas provenientes de 35 de 102 manipuladores de alimentos muestreados, es
decir, que 34% de los manipuladores analizados estaban colonizados por este
microorganismo. No se encontró diferencia significativa entre el número de cepas
aisladas del sexo femenino (17/53) y del sexo masculino (18/49). La producción de
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enterotoxinas se evidenció en 19 de las 35 cepas aisladas (54 %). De estas cepas, 11
produjeron sólo enterotoxina A (58 %), 5 sólo enterotoxina B (26%) y 2 sólo
enterotoxina C (11 %). La producción simultánea de enterotoxina A y B fue observada
en una cepa (5 %). No se detectó la producción de enterotoxina tipo D (Figueroa y col.,
2002).
De igual forma, un análisis de 200 muestras de leche cruda a nivel de cántaras
en receptorias ubicadas en tres zonas (El Laberinto, municipio Jesús Enrique Lossada,
Machiques de Perijá y Costa Oriental del Lago de Maracaibo) de alta producción
lechera del estado Zulia, entidad donde se genera el 40 % del total nacional, se
encontró que 45 muestras (22,5%) de leche analizadas contenían antimicrobianos,
obteniéndose crecimiento bacteriano en 35 de ellas. Se aislaron 100 cepas, que se
distribuyeron en los siguientes géneros: 44 Staphylococcus, 19 Streptococcus, 17
Enterococcus, 9 Bacillus, 4 Micrococcus, 4 Corynebacterium y 3 Lactococcus. La
especie más frecuentemente aislada fue S. aureus, principal agente productor de
mastitis bovina en el estado Zulia, y microorganismo frecuentemente asociado en el
país con intoxicaciones alimentarias vehiculizadas por queso elaborado con leche
cruda (Farías y col., 2002).
En Venezuela desde 1996 hasta mediados de 2002, según la Dirección de
Vigilancia Epidemiológica del Ministerio de salud y desarrollo social MSDS (Ríos,
2003), se ha reportado en sus laboratorios a nivel nacional, que el alimento
responsable en la mayoría de los brotes confirmados de ETA es el queso con un 46,7
% de los casos (Tabla 2), donde el agente etiológico involucrado fue S. aureus en un
65,9 % del total de brotes (Tabla 3). Hogares, escuelas y restaurantes representaron el
lugar de consumo donde se ubicó la responsabilidad de los brotes ocurridos, en un
54,2 %, 40,8 % y 6,3 % respectivamente (Tabla 4). Los datos reportan que en
Venezuela, la situación de salud por ETA es mal cuantificada; encontrándose una
asociación alimentos/agente etiológico más frecuente: Queso/S. aureus. Por tal motivo
deben incrementarse las inspecciones sanitarias a queseras artesanales, ventas
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ambulantes, empresas prestadoras de servicios a comedores escolares y la cadena “de
la granja a la mesa (Ríos, 2003).
Tabla 2
Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el alimento involucrado
Alimento
Brotes (1996 – 2002*) %
Queso 155 46.7
Origen marino 77 23.2
Carnes 25 7.5
Ensaladas 13 3.9
Pollo 13 3.9
Postres 8 2.4
Otros 41 12.3
Total 332
Tomado de Ríos, 2003.
Tabla 3
Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según el agente involucrado
Agente etiológico Brotes (1.996 – 2.002*) %
Staphylococcus aureus 91 65.9
Histamina 13 9.4
Cólera 12 8.7
E. coli 5 3.6
Bacillus cereus 4 2.9
Salmonella 1 0.7
Otros 10 7.2
Total confirmado: 138
Tomado de Rios, 2003.
Mas reciente en un estudio realizado en los municipios de Maracaibo y San
Francisco, se obtuvo la presencia de Staphylococcus aureus en 25/29 de los quesos
estudiados (86,206 %), que incluían quesos industriales y artesanales de diferentes
tipos: Amarillos, Madurados, Mano, Matera, Mozarella, Palmita, Pasteurizado, y
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Semiduro. Asi mismo se obtuvo que los quesos con mayor frecuencia de aislamiento
de S. aureus fueron los quesos Semiduros (20 %) y de Mano (16 %), cuyos quesos son
de preferencia en el consumidor zuliano (Fuentes., 2008)
Tabla 4
Enfermedades Transmitidas por Alimentos. Brotes según lugar de consumo.
Tipo local Brotes (1.996 – 2.002*) %
Hogar 180 54.2
Escuela 49 14.8
Restaurante 21 6.3
Cuartel 15 4.5
Comedor 11 3.3
Albergues 11 3.3
Hospital 4 1.2
Ambulante 4 1.2
Otros 11 3.3
Desconocido 26 7.8
Total: 332
Tomado de Ríos, 2003.
Por su parte, en una investigación realizada para determinar la calidad
microbiológica de los quesos blancos venezolanos, se encontró que ésta era deficiente
por encontrarse microorganismos tales como: Salmonella sp, levaduras, coliformes
totales, coliformes fecales, S. aureus y su enterotoxina (Rodríguez y col., 2009).
Genética de Staphylococcus aureus.
El genoma de Staphylococcus aureus consta de un cromosoma circular sencillo
de aproximadamente 2,7-2,8 mbp, además de una variedad de elementos genéticos
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accesorios cromosomales como: plásmidos conjugativos y no conjugativos, elementos
móviles (IS, Tn, Hi), profagos y otros elementos variables (Mlynarczyk y col., 2001).
Staphylococcus aureus contiene normalmente uno o más plásmidos, de varios
tamaños que oscilan entre 1 a 60 kbp, observándose por lo menos 15 grupos de
incompatibilidad entre los plásmidos. Los plásmidos fueron clasificados por Novick
dentro de tres clases generales y una cuarta clase donde los plásmidos que no se
parecen ni pertenecen a alguna de estas tres fueron provisionalmente colocados
(Novick, 1990, Mlynarezyk y col., 2001).
Plásmidos de clase I: consisten de pequeños plásmidos 1,3-4,6 kbp, en
multicopia (10-55 copias por célula), que son crípticos o transportan un
simple, o raramente, dos determinantes de resistencia. Los plásmidos de
clase I son asignados a cuatro familias según la homología de las funciones
del replicón, estas son: pT181, pC194, pSN2 y pE194 (Novick, 1990,
Mlynarezyk y col., 2001, Velázquez, 2006).
Los plásmidos de clase II: son más grandes, de unos 15-46 kbp y existen en
un número muy bajo de copias de 4-6 por célula, los plásmidos de esta clase
incluyen la mayoría de los plásmidos de penicilinasa, la familia pSK1 de los
plásmidos que confieren resistencia a aminoglicósidos/trimetoprim y varios
plásmidos no clasificados (por ejemplo, pIP630, 22,7 kbp). Los plásmidos de
penicilinasa determinan combinaciones de resistencia a iones metálicos
(cadmio, arsenato, arsenito, antimonio, bismuto, mercurio y órgano mercurio)
y la producción de beta lactamasas (Novick, 1990, Velázquez, 2006).
Los plásmidos de clase III: consiste de grandes plásmidos de 30-60 kbp
que transportan un determinante de transferencia conjugativa (tra) y la
mayoría de ellos, una combinación de marcadores de resistencia, estos
plásmidos se han clasificado en familia pSK41 (pSK41, pG01, pG0400,
pUW3626, pJE1, pSH8, pTZ20 y pCRG1600) y un grupo hasta ahora de
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plásmidos no clasificados: pIP156, pJ3358, pSAJ1, pTZ22, pWBG637 y
pWBG707). Los plásmidos de clase III usualmente poseen uno o dos
transposones y muchas copias de secuencias de inserción (Novick, 1990,
Velázquez, 2006).
La capacidad de los estafilococos para producir enfermedades depende de su
posibilidad de intercambiar con libertad información genética. Muchas características
son transferidas por bacteriófagos, ya sea mediante transducción generalizada o por
conversión de fago, pero también se ha descrito un proceso similar a la conjugación
entre los estafilococos. Ciertas enfermedades corresponden a grupos de fagos
específicos. Los estafilococos llevan muchos plásmidos que codifican la resistencia a
los antibióticos y se demostró que dichos plásmidos se transmiten entre ellos, tanto por
transducción como por conjugación. De este modo, a menudo los estafilococos son
resistentes a los antibióticos y por ello es muy difícil elegir un antibiótico para
combatirlos (Walker, 2000).
El perfil plasmídico de 75 cepas de S. aureus aisladas de muestras de leches y
carnes molidas, reflejó que el 71% de los aislados llevaba entre 1 a 6 plásmidos de
tamaños moleculares que iban de 0,1 a 14,5 kpb (Ombui y Col., 2000).
Para el año 2001 en la ciudad de Maracaibo-Edo Zulia, Álvarez y col., estudiaron
11 muestras de S. aureus escogidas al azar de distintas fuentes, observándose la
presencia de tres bandas plasmídicas cuyos tamaños fueron aproximadamente de
16,30 kb, 30,37 kb, 37,59 kb.
Para el 2002, Álvarez y col., reportan el análisis del perfil plasmídico de tres
cepas de S. aureus multiresistentes a antibióticos sometidas a curación, proveniente de
muestras clínicas donde se obtuvo que la resistencia a penicilina, ampicilina,
kanamicina, tetraciclina y ceftriaxona pudiera estar codificada en un plásmido común
encontrado en las cepas estudiadas, cuyo tamaño era de aproximadamente 29,4 kb.
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Así como también, la resistencia a cefalotina en posibles plásmidos de 37,1 kb, 30,37
kb o 16,30 kb.
En otro análisis en la ciudad de Maracaibo-Edo Zulia, se aislaron 21 cepas de
muestras clínicas, a las cuales se le realizó la determinación del perfil plasmídico
obteniendo la presencia de bandas plasmídicas diferentes que oscilaban entre 1,2 kb y
88,14 kb, los cuales estaban presentes en el 95,24% de las cepas de S. aureus. En el
66,66% de las cepas se encontró un plásmido de aproximadamente 23 kb, que
probablemente le confiere resistencia a la penicilina lo que imposibilita el uso de éste
antimicrobiano para combatir a esta bacteria (Atencio y col., 2005).
En la determinación de plásmidos crípticos de 24 cepas de S. aureus aisladas
de diferentes tipos de quesos de consumo frecuente en el Edo. Zulia, se obtuvo la
presencia de bandas plasmídicas. Se observó que una sola banda plasmídica se
presentó en el 45,83% de las cepas; dos bandas en el 33,33% de las cepas; tres
bandas plasmídicas en el 16,66% y, cuatro bandas en el 4,16%. Los tamaños de estas
bandas oscilaron entre 2,130 kpb y >34,00 kpb (Rivera, 2005)
En la determinación de plásmidos crípticos de 24 cepas de S. aureus aisladas
de diferentes tipos de quesos de consumo frecuente en el Edo. Zulia, se obtuvo la
presencia de bandas plasmídicas. Se observó que una sola banda plasmídica se
presentó en el 30% de las cepas; dos bandas en el 10% de las cepas; tres bandas
plasmídicas en el 50% y, cuatro bandas el 10%. Los tamaños de estas bandas
oscilaron entre >23,130 kpb y >1.407 kpb. (Fuentes, 2008).
Susceptibilidad a los antibióticos
Staphylococcus aureus es un microorganismo que posee características
particulares de virulencia y resistencia a los antibióticos. El principal impacto de este
microorganismo se debe a que las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina
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(SARM), que tradicionalmente se encontraban limitadas al ámbito hospitalario,
produciendo infecciones nosocomiales a nivel mundial. (Nicola y col., 2005); en años
recientes, han aparecido en la comunidad, provocando problemas en muchos países.
Si no se toman las medidas adecuadas para entender y controlar la cambiante
epidemiología y sintomatología clínica, puede convertirse en un importante problema
de salud en un futuro cercano. En años recientes han reemergido las infecciones por S.
aureus. Esto se debe en parte a que la bacteria se ha vuelto resistente a los
antibióticos con los que normalmente se le combate, aunado a diseminación en la
población sana (Nicola y col., 2005).
La prevalencia de cepas de SARM no es homogénea, varía mucho de unos
lugares a otros e incluso dentro de los hospitales, ya que cursa en forma de brotes y
depende mucho del control epidemiológico. Estas cepas resistentes suponen alrededor
del 6% de las infecciones de los enfermos hospitalizados, el 10% de las nosocomiales
y el 25% de las de herida quirúrgica. Colonizan al 40% de los enfermos que están
hospitalizados en una sala donde existan estas cepas, y las infecciones que causan no
sustituyen a las producidas por otros estafilococos sensibles a penicilina, sino que se
suman, y además muchas de estas cepas son multirresistentes a antibióticos como las
penicilinas, los macrólidos, las lincosaminas, los aminoglucósidos y las quinolonas, y
presentan en ocasiones, sensibilidad disminuida a los glucopéptidos (Jones TF y col.,
2002).
El gen que codifica la resistencia a meticilina, mecA, es cromosómico, codifica
una proteína adicional de las llamadas PBP (penicillin binding proteins), la PBP2a, con
baja afinidad por todos los antibióticos betalactámicos, incluyendo penicilinas,
cefalosporinas y carbapenemes. A este gen se pueden asociar otros, portados por
transposones con genes de resistencia a otros antibióticos, que llevan a la aparición de
S. aureus multirresistentes, confiriendo la comentada insensibilidad a los
betalactámicos, aminoglucósidos, macrólidos, lincosaminas, estreptograminas,
tetraciclinas, quinolonas y otros antibióticos. (Zhang, 2001; Archer, 2001; Hiramatsu,
2001).
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Existen factores asociados que favorecen la adquisición nosocomial de infección
por SARM entre los que destacan: i) la manipulación diagnóstico-terapéutica (catéter
intravascular, sondaje vesical, intubación orotraqueal, etc), ii) estancia en Unidades de
Cuidados Intensivos (UCI), iii) enfermedad grave de base, iv) antibioterapia previa, v)
estancia nosocomial prolongada, vi) cirugía previa o herida quirúrgica, vii) úlceras
isquémicas (Kuehnert y col., 2005).
Para tratar a los enfermos con infecciones por S. aureus resistentes a meticilina
y por Enterococcus spp., durante los últimos 20 años se ha incrementado
considerablemente el uso del glucopéptido vancomicina, antibiótico disponible desde el
año 1958, junto con la teicoplanina; ambos eran de confianza en los tratamientos
empíricos (Wilcox, 2003; Lee y col., 2005). Sin embargo, también es posible la
adquisición de resistencia a estos glucopéptidos. Esto ya se había conseguido in vitro
en el laboratorio, pero no se había detectado en cepas procedentes de enfermos
(Woodford, 2001); no obstante, hace 20 años, se empezaron a encontrar algunas
cepas clínicas con sensibilidad disminuida, con la consiguiente alarma. El nombre que
se dió a estas cepas fue el de GISA, del inglés glycopeptide intermediate S. aureus,
aunque también se han designado como VISA (vancomycin intermediate S. aureus),
siendo más correcto el primer término. La primera cepa GISA fue descrita por
Hiramatsu en Japón (Hiramatsu, y col., 2001), aislada en 1996 del exudado de una
herida infectada de un niño sometido a cirugía cardíaca, y con una concentración
inhibitoria mínima (CIM) de vancomicina de 4 a 8 µg/ml (sensibilidad intermedia).
Según el Clinical and Laboratory Standards institute (CLSI, 2008) se consideran cepas
sensibles a vancomicina aquellas que se inhiben con 0,5 a 2 µg/mL, y resistentes ≥ 16
µg/mL. Hasta la publicación del primer caso de infección humana causada por una
cepa de S. aureus resistente a la vancomicina, motivo de este editorial, sólo se habían
detectado 11 casos clínicos con cepas GISA, repartidos entre Japón (el caso ya
citado), Estados Unidos (ocho casos), Francia, Corea y China (Fridkin, 2001), todas
ellas procedentes de enfermos sometidos a tratamientos prolongados con vancomicina
y otros antibióticos, catéteres y graves enfermedades de base, similares al presente
caso.
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A pesar del uso difundido de la vancomicina después de su introducción en
1956, un lapso de 30 años pasó antes de que S. aureus desarrolle resistencia
intermedia a vancomicina (SAVI) y a glicopépticos (SAGI). Las cepas inicialmente
aisladas fueron reportadas con CIM para ambos glicopépticos mayor a 4-16 μg/ml. No
fue hasta 2003 que apareció el primer caso de S. aureus vancomicina resistente
(SAVR) (CIM igual o mayor 16- 32 μg/ml). Aunque la vancomicina permanece como
tratamiento confiable para la gran mayoría de las infecciones estafilocóccicas, aunque
prevalece la susceptibilidad universal a vancomicina y otros glicopéptidos la difusión
potencial de SAGI y SAVR puede adquirir gran importancia (Etienne, 2005).
Un reporte realizado en los Estados Unidos (Sievert y col., 2002) se describe el
primer aislamiento de una cepa de Staphylococcus aureus resistente a vancomicina
(SARV).
Es probable que aumenten las cepas de S. aureus resistentes a los
glucopéptidos y que se diseminen, porque son muchos los factores que incrementan
las infecciones por S. aureus resistentes a los antibióticos, sea por razones asociadas
al propio enfermo o su enfermedad (incremento de los cuidados intensivos médicos,
con rotura de barreras de superficie por el uso de procedimientos diagnósticos o
terapéuticos invasores, enfermedades debilitantes, inmunodepresión, neutropenia), por
el medio ambiente (soporte para su transmisión, incluidos los portadores) o por las
propiedades intrínsecas de la bacteria para poder albergar, adquirir y expresar
mecanismos de resistencia (mutaciones, plásmidos, transposones u otros métodos),
facilitados por el uso continuo de antibióticos ya sean de amplio espectro o específicos,
como es el caso de los glucopéptidos (Miller y col.,2001).
El Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales (National
Nosocomial Infectious Surveillance System, NNIS) de EUA determinó que en pacientes
hospitalizados, la prevalencia de cepas SARM se incrementó del 4% en 1980 a 31,9%
en 1996. En 2001 se tenía un 55% de prevalencia y para el 2003, llegó al 60,7%. En
algunos hospitales se han reportado incidencias hasta del 80% (NNIS 2004) La
prevalencia actual de cepas SARM, está sujeta a variaciones geográficas. Por ejemplo,
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en Europa se tienen porcentajes elevados, como un 58% en Italia y 54% en Portugal,
mientras que en Japón se tiene un 70%. Por otro lado, los países escandinavos tienen
un porcentaje muy bajo de cepas SARM, alrededor del 1% (Kanafani y Fowler, 2006).
En Venezuela se determinó que en pacientes hospitalizados, la prevalencia de cepas
SARM se tiene un 45.5% en los años comprendidos de 2002-2003, la presencia de
SARM es un problema tanto hospitalario como comunitario, por lo que se recomienda
su identificación como parte del diagnóstico bacteriológico (Camarena y Sánchez,
2002). En Colombia de acuerdo al sistema de vigilancia de resistencia bacteriana cerca
del 50 al 60% de las S aureus aislados en cualquier unidad de cuidados intensivos en
Bogotá presenta este perfil de resistencia (Cruz, 2004).
El gen mecA forma parte de una estructura de los elementos del cassette
cromosomal estafilocócico mec (SCCmec) no contienen genes de virulencia y difieren
uno de otro en su repertorio de determinantes de resistencia a los antibióticos. El tipo I,
que se diseminó entre las cepas SAMR aisladas en los años 60, durante los primeros
años de la quimioterapia, sólo contiene la resistencia a los antibióticos que confiere
mecA (Hiramatsu y col., 2001).
En cambio los cassette cromosomales estafilocócicos (SCCmec) tipos II y III,
acarreados en cepas dominantes en los años 80, contienen múltiples genes de
resistencia a diferentes antibióticos. El transposón Tn554 codifica para la resistencia a
eritromicina, el ψTn554 la resistencia a cadmio, la secuencia de inserción IS431 facilita
la adquisición de resistencia a los antibióticos y la resistencia al mercurio, el plásmido
pUB110 codifica la resistencia a tobramicina/ bleomicina y el pT181 codifica la
resistencia a tetraciclina. Tanto el SCCmec tipo IV como el tipo V son elementos
pequeños, ya que les falta el fragmento donde se encuentran los transposones y
plásmidos, por lo tanto, no acarrean resistencia a otros antibióticos diferentes a los β-
lactámicos. Al igual que el tipo I, pero a diferencia del tipo II, los tipos IV y V son
altamente transmisibles (Hiramatsu y col., 2001). Estudios recientes indican que los
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SCCmec tipos II y IV se encuentran circulando en cepas SAMR en México (Velásquez
y col., 2004).
En Colombia, en el año 2005, se utilizó la técnica de amplificación aleatoria de
ADN polimórfico (random amplification of polymorphic DNA, RAPD) para caracterizar
molecularmente cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, aisladas de
operarios de plantas de producción de alimentos. Se presentó una alta diversidad
molecular en cuanto a aislamientos de garganta, nariz y manos de un mismo individuo,
así como en todos los aislamientos analizados, lo cual demuestra que las cepas
enterotoxigénicas de Staphylococci encontradas en los operarios analizados tienen una
alta diversidad molecular (Escartín, 2000).
En los distritos de Nairobi y Kiambu de Kenia, Ombui y col. en el 2000 reportan
la resistencia de 75 cepas de S. aureus aisladas de muestras de leches y carnes
molidas, donde la elevada frecuencia de resistencia fue observada con lincomicina
67,7%, penicilina 66,7% y cotrimoxazol 51%. Un alto porcentaje (76%) de los aislados
fueron susceptibles a minociclina, seguido por eritromicina (57,3%). La mayoría de los
aislados (80,2%) fueron resistentes a 4 o a más antibióticos.
En un estudio sobre la susceptibilidad a antibióticos de 35 cepas de S. aureus
aisladas de la cavidad retrofaríngea de 102 manipuladores de alimentos demostró que
todas las cepas fueron resistentes a penicilina y todas fueron sensibles a la acción de
la oxacilina, vancomicina, clindamicina, kanamicina y linezolid (Figueroa y col., 2002).
Son escasos los trabajos donde se ha estudiado la susceptibilidad a antibióticos
en cepas de S. aureus provenientes de alimentos de consumo frecuente en Venezuela
y Colombia. En el 2005, Rivera señaló que se establecieron 22 patrones diferentes de
resistencia a antibióticos en S. aureus aislados de los quesos de consumo frecuente en
el Edo. Zulia, siendo PenR-OxR-ErI común para dos aislados, el resto de los patrones
fueron únicos. Cepas con resistencia (completa e intermedia) a 2, 3 y 4 antibióticos
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fueron los más comunes con un total de 16, 28 y 24 %, respectivamente. Sólo dos de
las cepas aisladas no presentaron resistencia a ningún antibiótico, una cepa de queso
Pasteurizado (Industrial) y el otro de queso Semiduro (Artesanal). En las 23 cepas
restantes fue común encontrar cepas resistentes a 2, 3 y 4 antibióticos representando
juntas el 68% del total de las cepas. Una cepa tuvo resistencia a 7 antibióticos e
igualmente una cepa tuvo resistencia a un antibiótico. Con resistencia a 5 y 6
antibióticos sólo se encontraron dos cepas para cada caso. El 56% de las cepas
aisladas mostraron resistencia múltiple a los antibióticos, considerando en este estudio
para hablar de múltiresistencia a las cepas con resistencia intermedia o completa, a
tres o más antibióticos de diferentes familias o grupos de antibióticos.
En Latinoamérica entre el año 1993 y 2002 se presentaron 719 brotes debido a
infección estafilocócica que afectaron a 27.693 personas de las cuales 3 fallecieron
(Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis – Organización
Panamericana de la Salud 1993-2002). Staphylococcus aureus es encontrado en la piel
y mucosas de los humanos (Figueroa, y col., 2002), y estos pueden llegar a los
alimentos de muchas fuentes, pueden contaminar los alimentos por conducto de
quienes manejan o preparan los mismos que tengan infecciones piógenas agudas o
por portadores sanos que los albergan en fosas nasales y garganta. Esta presencia en
los alimentos se asocia a una inadecuada manipulación o al empleo de materias primas
contaminadas (ICMSF, 2000).
En Colombia se realizó el primer trabajo en Medellín donde se determinó la
prevalecía de S. aureus resistente a meticilina en el personal de la unidad de terapia
intensiva de la Clínica Universitaria Bolivariana de Medellín. Sus autores muestran que
la prevalecía de SARM fue de 6,7%, afortunadamente baja en comparación con otros
estudios. La región anatómica en la que se obtuvo el mayor número de aislamientos
correspondió a las fosas nasales. De especial importancia es su sugerencia de optar
por esta región anatómica en lugar de la faringe en el momento de tomar muestras en
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el programa de vigilancia epidemiológica, puesto que allí fue encontrada la mayor
prevalencia de S. aureus (85%) (Gómez, 2006).
El segundo trabajo, en torno a la caracterización molecular de 31 cepas
toxigénicas aisladas de garganta, nariz y manos de operarios de la industria alimenticia,
utilizando la técnica de amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD), se trató de
demostrar la fuente de contaminación y las rutas por las cuales el microorganismo es
transmitido al alimento. Los resultados indican que hubo un alto porcentaje de
polimorfismos (86,66%) con el oligonucleótido empleado, indicando que un individuo
puede ser portador de varios tipos de aislamientos diferentes. Con base en estos
hallazgos los autores recomiendan implementar programas de salud ocupacional en las
industrias alimenticias con las herramientas moleculares para asegurar la inocuidad de
los alimentos (Gómez, 2006).
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3. OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar la susceptibilidad a antibióticos y el perfil plasmídico en cepas de S.
aureus aisladas de quesos artesanales e industriales consumidos en el municipio de
Valledupar-Colombia.
Objetivos específicos
Identificar cepas de Staphylococcus aureus aisladas de quesos artesanales e
industriales.
Determinar el patrón de susceptibilidad hacia antibióticos en las cepas de
Staphylococcus aureus aisladas.
Detectar la presencia de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a
meticilina (SARM).
Comprobar la producción de β-lactamasas en las cepas de S. aureus
resistentes a la penicilina.
Detectar la capacidad de inducir resistencia a Clindamicina de las cepas de
S. aureus.
Determinar el número de bandas plasmídicas en cepas de Staphylococcus
aureus con resistencia a los antibióticos.
Comparar los perfiles plasmídicos y de resistencia antibiótica de las cepas
provenientes de diferentes muestras.
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4. MATERIALES Y METODOS
4.1 Tipo de Investigación.
Este trabajo estuvo sujeto a una investigación del tipo descriptiva (Sampieri y
col., 1991), (Bermejo, 2004) ya que determinó la presencia de Staphylococcus aureus
en distintos tipos de quesos, así como, los diferentes fenotipos de resistencia a
antibióticos, y, el número y el tamaño aproximado de los plásmidos presentes en las
mismas.
4.2 Población de estudio.
Se estudiaron 25 cepas de S. aureus aisladas de (6 muestras) de quesos tipo
costeño, de manufactura artesanal. Este número de cepas es estadísticamente
significativo, toda vez que la frecuencia de aislamiento de este género bacteriano fue
comparado con los aislados de 25 cepas de S. aureus a partir de 29 quesos estudiados
(86,206%) por Rivera, 2005 y 35 cepas de S. aureus en 14 muestras (64%) de quesos
de las 22 estudiadas según el trabajo realizado por Fuentes, 2008, trabajos previos
realizados en Venezuela. Las muestras de quesos se obtuvieron de diferentes puntos
de ventas en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia, tomadas de forma aleatoria
del universo presente en cada establecimiento. Se procesaron cuatro tipos de quesos
en total, tres artesanales (costeño blando, costeño duro, costeño semiduro) y uno
industrial (semidescremado). De cada queso se procesaron 3 muestras para un total de
12 muestras.
4.2.1 Recolección de las muestras de quesos.
Constaron de una muestra de 250 grs. de cada tipo de queso, guardadas en
bolsas plásticas estériles con sello hermético debidamente rotuladas con sus datos
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tales como: fecha, tipo de queso, lugar de procedencia, entre otros y mantenidas en
caja de material isotérmico contenidos en cubos de hielo, desde el momento de la
colecta hasta el momento de la preparación homogénea de la muestra (Pinto y
Guimarães 2001), que se realizó al llegar al Laboratorio de Microbiología de la maestría
y al Laboratorio de Genética y Biología Molecular de la Facultad Experimental de
Ciencias-LUZ.
4.2.2 Homogenización de la muestra y aislamiento de Staphylococcus aureus.
De cada muestra se pesó, asépticamente, 25 g de queso y se adicionaron a un
vaso de licuadora estéril que contuvo 225 mL de solución salina peptonada (SSP)
estéril (NaCl 0,85% p/v con 0,1% p/v de peptona), a fin de obtener una dilución inicial
(10-1). Hay que indicar que la muestra se procesó hasta lograr homogenizarla
mecánicamente con el uso de una licuadora estéril de 2 a 3 minutos. Posteriormente 1
ml de esta solución se llevó asépticamente a un tubo con 9 ml de SSP 0,1%, y se
obtuvo una dilución 10-2, tal procedimiento se repitió hasta que se obtuvo las diluciones
10-3, 10-4 y 10-5 (NORMAS COVENIN, 1126-89 y 1292-89) (Pinto y Guimarães 2001).
Para el aislamiento de S. aureus, se extendió con espátula de Drigalsky 0,1 mL
de cada dilución sobre toda la superficie de placas con agar Baird Parker (BPA) por
duplicado. Éstas se incubaron por un período de 24 a 48 horas a 37º C (Pinto y
Guimarães 2001) (Norma Covenin 1292-89).
4.2.3 Caracterización de la morfología celular y colonial, y bioquímica de las cepas de
Staphylococcus aureus así como la preservación de las muestras.
Se tomaron entre 3-5 UFC caracterizadas por ser negras, con borde estrecho
blanquecino y rodeado de un halo claro, típico de cepas de S. aureus crecidas sobre
agar BPA por su capacidad de reducir telurito, producir proteasas y lecitinasas
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respectivamente. Las mismas se sometieron a pruebas bioquímicas confirmativas para
identificar el género y especie en estudio. Estas incluyeron: morfología bacteriana,
tinción de Gram, producción de ácido a partir de manitol, Voges-Poskauer y prueba de
catalasa (Mac Faddin, 2000); y para la evaluación de la patogenicidad del
microorganismo, las pruebas de: coagulasa y nucleasa termoestable (Mac Faddin,
2000).
Las cepas que resultaron positivas para las pruebas bioquímicas confirmativas
de S. aureus, se almacenaron a -20º C en solución de glicerol al 20 % v/v para su
preservación (Atencio y col., 2009), y se activaron en caldo nutritivo para la evaluación
de la susceptibilidad a antibióticos y la determinación del perfil plasmídico.
4.2.4 Determinación de la susceptibilidad a antibióticos en cepas de S. aureus.
La resistencia de las cepas bacterianas a los antibióticos se determinaron por el
método de difusión del disco en agar descrito por Kirby-Baüer (Baüer y col.,1966), así
como la cuantificación de la actividad in vitro a algunos antimicrobianos, determinando
la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de los antibióticos de interés mediante
dilución en placas con agar Müeller-Hinton (CLSI, 2008).
4.2.4. 1 Determinación de resistencia a antibióticos por el Método Difusión del Disco en
Agar.
Primero se activaron las cepas en caldo nutriente e incubaron a 37ºC por 24h
posteriormente se sembraron en medios nutritivos, enriquecidos (agar sangre al 5%) no
selectivos, incubando nuevamente las placas a 37 ºC por 24h para obtener colonias
aisladas, las cuales fueron resuspendidas en solución salina 0,85% estéril hasta que
alcanzaron una turbidez equivalente al tubo estándar 0,5 de McFarland, que contuvo
aproximadamente de 1-2 x 108 UFC/ml. Posterior a la preparación del inóculo, se
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sembraron las cepas en placas conteniendo 4 mm de espesor de agar Müeller-Hinton
(HiMedia® Laboratories) con hisopo estéril, rayando en tres direcciones, rotando las
placas cada vez con giros de 60º. Se colocaron los discos asépticamente con una
pinza esterilizada. Para estas cepas se utilizaron los siguientes antibióticos
manufacturados por BD BBLTM (Sensi-DiscTM): Penicilina (10U/mL), Tetraciclina
(30µg/mL), Trimetoprim/Sulfametoxazol (1,25-23,75µg/mL), Ciprofloxacina (5µg/mL),
Gentamicina (10µg/mL), Cloranfenicol (30µg/mL), Rifampicina (5µg/mL), Vancomicina
(30µg/mL), Clindamicina (2µg/mL), Eritromicina (15µg/mL), Linezolid (30µg/mL),
Oxacilina (1µg/mL), (CLSI, 2008). Para verificar la calidad del antibiograma o de los
discos se empleó la cepa de S. aureus ATCC 25923 como control.
Las placas se incubaron de manera invertida a 37º C en atmósfera aeróbica por
18 horas para medir los halos de inhibición y se determino: Resistencia (R), Resistencia
intermedia (I) o Susceptibilidad (S) de la bacteria frente a cada antibiótico, siguiendo los
criterios de interpretación según (CLSI, 2008). Teniendo en cuenta que VA y OX se
leen a las 24 horas exactas.
4.2.4.2 Determinación de la producción de β-lactamasas en cepas de Staphylococcus
aureus, mediante el método de la cefalosporina cromogénica (Nitrocefina).
La hidrólisis de determinados preparados β-lactámicos da lugar a la formación
de productos, con un espectro de absorción en la región visible, diferente a la del
compuesto inicial. La nitrocefina es una cefalosporina cromogénica de color amarillo
que al ser hidrolizado por la β-lactamasa cambia de color amarillo al rojo intenso. Esta
técnica es de gran sensibilidad (detecta cantidades muy pequeñas de enzima) y se
utiliza frecuentemente (Mac Faddin, 2000; García y col., 2001; Livermore y Brown,
2001).
Para la prueba se utilizaron bastoncillos impregnados con nitrocefina (marca
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OXOID®) que previamente fue humedecida con agua destilada estéril y se rotó sobre
la superficie de la colonia a partir de crecimiento fresco de 24 horas en agar sangre.
Luego se esperó hasta 1 hora el cambio de color (rojo), este efecto es indicativo de una
prueba positiva (Mac Faddin, 2000; Livermore, 2000). Seguidamente, se examinó el
extremo para detectar el cambio de color dentro de los cinco minutos seguidos a la
inoculación. Algunas especies de estafilococos tardan hasta una hora para producir
una reacción positiva (Mac Faddin, 2000; García y col., 2001; Livermore y Brown,
2001).
Este ensayo estuvo controlado con las cepas Staphylococcus aureus ATCC
25923 (ß-lactamasa -) y ATCC 29213 (ß-lactamasa +) (CLSI, 2008).
4.2.4.3. Determinación de cepas S. aureus Resistentes a Meticilina (SARM)
mediante la técnica Oxacilina Screening plate.
La naturaleza heterogénea de la expresión del gen mecA, determinante genético
responsable de la producción de la PBP2a que condiciona la resistencia a la Meticilina,
implica que la mayoría de los métodos descritos para su detección recurren a modificar
las condiciones del cultivo para facilitar la expresión de este mecanismo de resistencia.
Se reduce la temperatura de incubación de 37° C a 30-35° C, se aporta NaCl a los
medios de cultivo o se prolonga hasta 24 horas los tiempos de incubación (CLSI, 2008).
No resultaron cepas resistentes para el antibiótico Oxacilina en la prueba por
difusión en disco, Sin embargo la técnica consiste en cultivar las cepas resistentes a
oxacilina en caldo nutriente a 35° C, hasta una densidad de 0,5 del tubo de Mc.
Farland. Una vez obtenida la densidad requerida se siembran mediante hisopado en
placas con agar Müeller-Hinton suplementado con NaCl (4 %) y 6 μg/mL de Oxacilina e
incubadas a 35° C por 24 horas. El crecimiento de al menos una colonia de las cepas
ensayadas en este medio se relaciona directamente con la expresión del gen mecA,
resultando así una o más cepas SARM (García y col., 2001; CLSI, 2006).
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4.2.4.4. Determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima a los antibióticos
Oxacilina, y Penicilina G, empleando el método de dilución en agar.
Para esto se prepararon tubos con 20mL de agar Müeller Hinton (MH) estériles y
se llevaron a 45° C, luego se les adicionó 1mL del antibiótico en solución con una
concentración conocida, obteniendo al final en la placa ya vertida la concentración que
se desea (CLSI, 2008). Las concentraciones que se utilizaron para esta prueba se
encuentran reflejadas en el anexo 1. (CLSI, 2008).
Los antibióticos que se utilizarán son Oxacilina (Sigma-Aldrich®), y Penicilina G
Sódica® (Bristol-Myers Squibb). Las concentraciones de antibiótico utilizadas se
encuentra dentro de los criterios establecidos por el CLSI, 2008 (Tabla 5). Se utilizó la
cepa de Staphylococcus aureus ATCC 29213 como control negativo (CLSI, 2008).
Tabla 5. Rangos para las CIM en S. aureus según el CLSI.
Antibióticos CIM (ug/mL)
S I R
Oxacilina ≤2 _ ≥4
Penicilina G <0,12 _ ≥0,25
Tomados de CLSI, 2008
Los inóculos se dispusieron como se señaló anteriormente para el protocolo de
difusión en agar, al igual que las condiciones de incubación. La cepa de S. aureus
ATCC 25923 fue utilizada como control (CLSI, 2006).
4.2.4.5. Determinación de fenotipos de resistencia a la familia macrólidos,
lincosamidas, estreptomicina B (MLSB).
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La técnica se realizó siguiendo las recomendaciones del CLSI, 2008. Dicha
técnica consistió en colocar un disco de Eritromicina (15 μ g) y otro de Clindamicina (2
μ g) separados a una distancia entre 15 – 26 mm uno del otro, de borde a borde en una
placa de agar Mueller-Hinton que ha sido previamente inoculada con una suspensión
(0,5 McFarland) del microorganismo. Después de 16-18 h de incubación a 35° C, el
achatamiento en la zona de inhibición de la Clindamicina próxima al disco de
Eritromicina (efecto zona D) indica un fenotipo de resistencia inducible, la resistencia a
Eritromicina y a Clindamicina indica un fenotipo de resistencia constitutivo y la
sensibilidad a Clindamicina es definida por la ausencia de inducción de resistencia a
Clindamicina en la zona próxima al disco de Eritromicina. Las cepas controles fueron S
aureus ATCC® 25923 sensible a ambos antibióticos (No formadora de la zona D). Las
condiciones del ensayo fueron las mismas descritas para la determinación de
resistencia a antibióticos por el Método Difusión del Disco en agar (CLSI, 2008).
4.3 Extracción de DNA plasmídico de cepas de Staphylococcus aureus. mediante lisis
alcalina.
De un cultivo fresco se inoculó la cepa bacteriana en placas de agar nutriente,
por rayado en cuadrícula mediante hisopado. Las placas se incubaron a 37º C durante
24 horas. Para recoger el volumen celular, transcurrido el período de incubación se
adicionó a la placa 0,5 mL de solución salina estéril al 0,85%, esta operación se repitió
una vez más para cosechar la mayor cantidad de colonias posible y se transfirió a
tubos eppendorf.
El volumen celular se centrifugó por 5 minutos a 10.000 r.p.m y se descartó el
sobrenadante. El pellet obtenido se resuspendió en 500 µL de buffer Tris HCl- EDTA-
Glucosa (TES), para nuevamente ser centrifugado por 3,5 minutos a 10.000 r.p.m y se
descartó el sobrenadante. Este nuevo pellet se resuspendió en 500µL de buffer Tris
HCl- EDTA (TE) glucosa y se le agregó 20 µl de lisostafina (0,5 mg/mL). Se incubó a
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37º C por 1 hora, se agrego 75 µL de buffer de lisis y se mezcló suavemente por
inversión. La reacción se incubó a temperatura ambiente por un período de 10 minutos.
Se procedió a adicionar 400 µL de acetato de potasio 5M, se mezcló por inversión el
eppendorf, y se incubó en hielo por 30 minutos. Se centrifugó enseguida por 20
minutos, a temperatura ambiente a 10000 r.p.m. El sobrenadante obtenido fue
transferido a un tubo eppendorf estéril. La obtención del ADN precipitado se llevó a
cabo agregando 555 µL de etanol absoluto frío e incubando toda la noche a -20º C. Se
centrifugó a 10.000 r.p.m por 10 minutos a temperatura ambiente y el sobrenadante se
descartó, el pellet obtenido se lavó con etanol frío al 70%, seguido de 5 minutos de
centrifugación. El lavado del pellet se repitió dos veces, y finalmente se secó a
temperatura ambiente por 15 minutos (Macrina y col., 1980).
4.3.1 Extracción y observación de plásmidos crípticos en geles de agarosa al 0,7% p/v.
La separación y observación de los plásmidos se realizo según especificaciones
de Ausubel y col., (2002) por electroforesis en geles de agarosa al 0,7% con bromuro
de etidio EthBr (hasta una concentración final de 0,5µg/mL) en una cámara horizontal
sumergida a 50 voltios durante 7-8 horas. El ADN fue visualizado en un transiluminador
UVP, Chromato-Vue. El tamaño de los plásmidos se determinó utilizando el programa
computacional ORIGIN versión 6.0 para Windows, basado en la migración de las
bandas de ADN de las muestras en estudio, en comparación con las bandas del
marcador de peso molecular (PM) λ Hindlll, relacionando de esta manera el PM con la
movilidad de cada banda en el gel de agarosa (Mujica y col., 2007).
4.4 Análisis estadístico
Se realizaron cálculos porcentuales para determinar la cantidad de cepas
aisladas de cada queso, las bacterias resistentes por cada antibiótico ensayado, así
como el número de antibióticos a los que es resistente cada cepa. También se
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correlacionaron los aislados de cada queso con los fenotipos de resistencia a
antibióticos, multiresistencia, resistencia a meticilina, producción de β- lactamasa con
los plásmidos presentes en las cepas. Para estas pruebas se aplicó la prueba de
correlación de Pearson con un valor de p>0,05.
Para el cálculo de los tamaños aproximados de las bandas plasmídicas de las
cepas de S. aureus estudiadas se utilizó la aplicación Origin Lab, Origin Pro 7,5 para
Windows (Mujica y col., 2007). Para estos análisis se utilizaron los paquetes
estadísticos Statistic for Windows versión 4,1 (Mujica y col., 2007).
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5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Aislamiento de S. aureus en quesos artesanales e industriales.
En primera instancia se pudo demostrar la presencia de 25 cepas de S. aureus en
6 muestras de quesos (22cepas de queso costeño blando y 3 de queso costeño
semiduro) (50%) de las 12 estudiadas, con un promedio de 1,5x105 UFC/g y un rango
entre <100 y 5,0x106 UFC/g (Tabla 6). El 41,80 % de las muestras estuvo por encima
de 103 y el 8,20% de las muestras sobre 105.
Tabla 6. Valores promedios y rango de Staphylococcus aureus en quesos
Microorganismo Promedio Promedio mínimo Promedio máximo
S. aureus ( UFC/g) 1,5x105 <100 5,0x106
Los resultados obtenidos de las 12 muestras de quesos analizadas para
determinar S. aureus sobrepasan el valor promedio máximo permitido (tabla 6)
(COVENIN 902-87, 1987; COVENIN 1538-92,1992; Diaz y col., 2001), de esta manera
se afirma que el alto recuento de este microorganismo determina las malas practicas
higiénicas en la manipulación, venta y distribución del producto, es decir, de los
quesos. Esto contrasta con los resultados obtenidos en Mérida –Venezuela donde se
encontró que en el 65% de 72 muestras de queso blanco procesados, se determinó la
presencia de S. aureus, confirmando en dicho estudio que es debido a la transferencia
de los portadores sanos durante el procedimiento o manipulación del queso; ademas al
propio proceso de elaboración de los derivados lacteos, su distribución,
almacenamiento y trasporte en malas condiciones de refrigeración que puede
asociarse como factores de riesgos en brotes e intoxicaciones futuras.(Rivero y
González, 2001).
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Los resultados obtenidos durante esta investigación, suponen la presencia de una
virtual situación latente de brotes por intoxicación con estafilocócos, debido al consumo
de los diferentes quesos que han sido objeto de estudio, encontrándose que el 41,80 %
de las muestras contenían cargas bacterianas iguales o superiores a 103 UFC/g, siendo
este valor considerado como crítico en este tipo de producto (COVENIN 902-87, 1987,
COVENIN 1538-92,1992;).
Se observó que los quesos con mayor frecuencia de aislados de S. aureus fueron
quesos costeños blandos (88%), seguidos por los quesos semiduros (12%), ambos de
origen (artesanal), los cuales son de alto consumo en Valledupar –Colombia(Gráfico 1).
En los quesos costeños duros y procesados hubo ausencia de cepas S. aureus.
En las investigaciónes realizadas en la region zuliana por Rivera (2005), se
reportó que el mayor porcentaje de aislados de S. aureus se obtuvo a partir de los
quesos semiduros (20%, Artesanal), y en la efectuada por Fuentes (2008) a partir de
los quesos palmitas se encontraron valores similares a este trabajo (46%, Artesanal),
obteniendose que los mayores porcentajes de aislamientos se obtuvieron a partir de
quesos artesanales.
Gráfico 1. Porcentaje de cepas de Staphylococcus aureus en quesos:
CB
CSd CD
QI
12 %
88 %
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CD: costeño duro; CB: costeño blando; C Sd: costeño semiduro; QI: industrial semidescremado
Tabla 7-.
Nomenclatura y procedencia de las cepas de S. aureus aisladas de quesos.
Cepas Tipo de Queso muestreado
Origen de Manufactura
2QB3DB2 Blando Artesanal
3QB3DB1 Blando Artesanal
4QB4DA1 Blando Artesanal
5QB4BB2 Blando Artesanal
6QB4DB1 Blando Artesanal
7QB2DB1 Blando Artesanal
8QB3DA2 Blando Artesanal
9QB3DA1 Blando Artesanal
10QB2DA2 Blando Artesanal
11QB2DA1 Blando Artesanal
12QB2DB2 Blando Artesanal
13QB2BB1 Blando Artesanal
14QB2BA2 Blando Artesanal
15QB2BB2 Blando Artesanal
16QB1DB1 Blando Artesanal
17QB1DB2 Blando Artesanal
18QB1DB3 Blando Artesanal
19QB1BB2 Blando Artesanal
20QB1BA2 Blando Artesanal
21QB1BA1 Blando Artesanal
22QB2BA1 Blando Artesanal
23QB1BB1 Blando Artesanal
24QSd1AA3 Semiduro Artesanal
25QSd1AA2 Semiduro Artesanal
26QSd1AA1 Semiduro Artesanal
CD: costeño duro; CB: costeño blando; C Sd: costeño semiduro; QI: industrial semidescremado
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La presencia de estafilococos en los alimentos generalmente se debe a la
contaminación directa por manipuladores colonizados. El problema se presenta durante
la manipulación de alimentos ya procesados o cocidos, en los que la flora competitiva
está inhibida o fue eliminada favoreciendo la proliferación de S. aureus (Sandel y
McKillip, 2004).
La presencia de S. aureus en los quesos es evidente, ya que el queso fresco es el
alimento más vulnerable. El calentamiento o tratamiento suave de la leche y otros
productos se ha considerado esencial para la erradicación de enfermedades
infecciosas. Esta práctica preventiva no está generalizada en la producción de quesos.
La pasteurización de la leche se ha convertido, con el paso del tiempo, en esencial
como tratamiento previo a cualquier otro de conservación. Su aplicación se ha
generalizado no sólo a la leche como producto de consumo sino también a la mayoría
de lácteos o derivados (Jiménez y col., 2006).
Sin embargo, la norma no se cumple en todos los casos, en la actualidad se
conserva una preferencia al empleo de leches crudas para la elaborar los quesos. La
razón de esto es que con la pasteurización se desnaturalizan las proteínas endógenas
de la leche y promueve la eliminación de microorganismos propios del área geográfica
indispensables para la maduración y la diferenciación de colores propios de las
diferentes variedades de queso (González, 2002).
Durante el manipuleo, las manos aportan bacterias a la leche. Por ello, resulta
sumamente importante lavar cuidadosamente las manos y las superficies con agua
limpia. Las mejoras en las prácticas sanitarias durante la manipulación y el
procesamiento tradicional de la leche, en especial para la elaboración del queso,
pueden no ser bien recibidas debido a las creencias culturales o, simplemente, a la
falta de tiempo (Pinzón, 2004).
Debe tenerse presente que la leche es un producto biológico obtenido de
animales y, por lo tanto, plantea problemas de origen en su contaminación ya que a la
salida de la glándula mamaria este producto trae presentes microorganismos, por tal
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razón resulta de vital importancia las buenas prácticas de manejo en cada uno de sus
procesos (Pinzón, 2004).
Si bien son incuestionables las cualidades nutritivas de la leche y los productos
lácteos, no es menos cierto que, desde su síntesis en la glándula mamaria hasta su
llegada al consumidor, estas cualidades están sometidas a un gran número de riesgos
que hacen peligrar la calidad original. Estos riesgos son: la contaminación y
multiplicación de microorganismos, contaminación con gérmenes patógenos, alteración
físico-química de sus componentes, absorción de olores extraños, generación de malos
sabores y contaminación con sustancias químicas tales como pesticidas, antibióticos,
metales, detergentes, desinfectantes, partículas de suciedad, etc. Todos éstos, ya sean
en forma aislada o en conjunto, conspiran en forma negativa sobre la calidad higiénica
y nutricional del producto y, consecuentemente, conspiran en contra de la salud pública
(Pinzón, 2004).
5.2 Caracterización e identificación bioquímica de cepas de S. aureus
Las veinticinco (25) cepas seleccionadas (22 cepas procedentes de queso
blando y 3 de quesos semiduros) para la realización de este estudio fueron
caracterizadas como S. aureus (Tabla 7), por ser: Reductoras de Telurito; productoras
de las enzimas: lecitinasa, proteasas (en medio Baird-Parker Agar), catalasa,
coagulasa, y DNasa. Adicionalmente resultaron of-glucosa fermentativo y manitol;
Reacción positiva de Voges-Poskauer por su capacidad de desarrollar un color rojo-
fucsia indicando la presencia de diacetilo, producto de la oxidación de la acetoína .
(COVENIN 1292-89, 1989; Mac Faddin, 2000; Bennet y Lancette, 2001).
En esta investigación, previa confirmación con la prueba de la coagulasa y realización
de la prueba de DNAsa, Staphylococcus aureus estuvo presente en los quesos
analizados según la Norma Venezolana COVENIN 1292-89; esto se ajusta al criterio
microbiológico utilizado que establece la presencia de estafilococos coagulasa positiva,
si los recuentos se encuentran en el limite máximo o por encima de 103 UFC/g, en vista
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de que son productores de toxina estafilocócica. La contaminación bacteriana por
especies del género Staphylococcus en queso elaborado artesanalmente se ve
favorecida por el uso de las manos en la elaboración del producto. Generalmente,
estos microorganismos se eliminan durante la cocción y su presencia en el producto
terminado obedece a contaminación post-elaboración. La inocuidad de estos quesos no
se enuncia con una sola determinación microbiológica, el perfil higiénico-sanitario debe
evaluarse conjuntamente con los demás resultados.
5.3 Fenotipos de susceptibilidad a los antibióticos en los aislados de S. aureus
Se determinaron 4 patrones diferentes de resistencia en las cepas de S. aureus
aisladas de los quesos, PR-TER-EI y CR siendo el patron TER común para cinco cepas
en cada caso,en el resto de los patrones no se observó similitud (Tabla 8).
El 20% de las cepas de S. aureus estudiadas presentaron resistencia
(intermedia y completa) a un (1 antibiótico) y el 4% a 3 antibióticos (Gráfico 2). No se
observó multiresistencia a antibióticos en este trabajo (resistencia a 5 ó mas
antibioticos de grupos diferentes). Estos resultados difieren con los obtenidos por
Rivera (2005), Morales y Ruíz (2006 ), Mujica y col (2007) y Fuentes (2008), en
aislados de alimentos, quienes mostraron patrones de resistencia a antibioticos
variables.
Gráfico 2. Porcentaje de susceptibilidad a antibióticos en cepas de S. aureus
Sensibles
1 3
Antibiótico antibióticos
20%
1 3
4% 76%
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Tabla 8. Patrón de resistencia y producción de β lactamasa en cepas de S aureus
aisladas de quesos
CEPAS PATRÓN DE
RESISTENCIA
DETERMINACIÓN DE β
LACTAMASA
2QB3DB2 -3QB3DB1
6QB4DB1-8QB3DA2
9QB3DA1-10QB2DA2
11QB2DA1-12QB2DB2
13QB2BB1-14QB2BA2
15QB2BB2-16QB1DB1
17QB1DB2-18QB1DB3
19QB1BB2-20QB1BA2
22QB2BA1-23QB1BB1
25QSd1AA2
Sensibles a todos los
antibióticos probados
NA
4QB4DA1-5QB4BB2
7QB2DB1-24QSd1AA3
TER NA
21QB1BA1 PRTEREI +
26QSd1AA1
CR NA
P: Penicilina; TE: Tetracilina; E: Eritromicina; C: Cloranfenicol; R. Resistencia, I. Resistencia Intermedia. NA:No aplica
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Las cepas resistentes provienen de los quesos blandos y semiduros de origen
artesanal. En cuanto a la resistencia por cada antibiótico, se puede observar que el 4 %
de las cepas resultaron con un fenotipo de resistencia frente a la Penic ilina G (gráfico
3), este bajo número de cepas resistentes puede ser debido a que en Valledupar la
medicina veterinaria tiene como principal opción para el tratamiento de la mastitis
bovina la Eritromicina y Tetraciclina ((Ruiz, y col.,2001), estos resultados son diferentes
a los reportados por Rivera (2005), Morales y Ruiz (2006) y fuentes (2008).
La determinación de la producción β-lactamasas se le realizó a una cepa que
resultó resistente a la penicilina la cual resultó positiva para la prueba (Tabla 9). Estos
resultados son semejantes a los conseguidos por Rivera (2005) quien reportó cepas
productoras de β-lactamasa en aislados derivados a partir de muestras de quesos,
empleando el método acidimétrico y Fuentes (2008) que obtuvo 7 cepas productoras
de β-lactamasa en aislados de muestras de quesos y cremas de leche utilizando el
método de la cefalosporina cromogénica (nitrocefina, Difco).
P
TE
C
Gráfico 3. Porcentaje de Cepas de Staphylococcus aureus Resistentes a los
antibióticos ensayados P: Penicilina; TE: Tetracilina; C: Cloranfenicol
El porcentaje de cepas de S. aureus resistentes a la Penicilina se obtuvo a partir
del queso blando artesanal, también es muy frecuente los aislados de S. aureus
resistentes a la Penicilina a partir de muestras clinicas en la región Zuliana, como lo
muestran los reportes de Alvarez y col. (2001, 2002), Atencio y col. (2005) y Vivas
(2006) esto indica la presencia de la contaminación humana durante la preparación del
mismo.
4% 4%
19%
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Con la finalidad de corroborar el fenotipo de resistencia a la Penicilina se
procedió a determinar la CIM a este antibiótico a la cepa 21QB1BA1. Este resultado
también permitirá seleccionar, en futuras investigaciones, aquella concentración del
antibiótico ideal para la inducción de la replicación de los plásmidos involucrados en
dicha resistencia. La concentración mínima obtenida fue de 32 g/mL, catalogándose
dicha cepa como resistente a la penicilina (Tabla 9). El mecanismo de resistencia
utilizado por esta cepa para alcanzar dicho fenotipo es la produccion de β-lactamasa,
enzima detectada en este trabajo mediante tiras de nitrocefina (Tabla 9). Estos
resultados se pueden comparar con los reportes hechos por Rivera (2005), Morales y
Ruiz (2006) y Fuentes (2008).
La resistencia a la penicilina G y ampicilina es de interés epidemiológico ya que
puede indicar un uso indiscriminado de este grupo farmacológico de antibióticos en las
explotaciones lecheras. Además es importante mencionar que en los últimos años se
ha reportado un aumento en el mundo de cepas de Staphylococcus aureus meticilina-
resistentes. Lo que debe hacer tomar conciencia que ante un aislamiento de
Staphylococcus aureus es importante establecer su susceptibilidad a antibióticos para
hacer un control racional y evitar que se desarrollen cepas multiresistentes que podrían
llegar a ser muy difíciles de erradicar (Ruiz, y col.,2001).
Se observó un 19% de cepas resistentes a la Tetraciclina (Gráfico 3). Este
porcentaje se asemeja a los reportados en Venezuela en muestras de queso por
Rivera, 2005 un 12% y Fuentes, 2008 con un 11%, del mismo modo, los resultados
aquí obtenidos concuerdan con los porcentajes de resistencia a Tetraciclinas en S.
aureus aislados de mastitis en bovinos en Noruega, Dinamarca, Suecia, Finlandia,
Suiza, Estados Unidos e Inglaterra (Vintov y col., 2003) de 10 al 12%.
Sólo se observó resistencia intermedia a la Eritromicina en un 4% de las cepas de
S. aureus estudiadas. El mismo porcentaje pero de cepas resistentes se obtuvo ante el
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Cloranfenicol (Gráfico 3), este reporte es similar al obtenido en Venezuela en aislados
de quesos por Rivera (2005) quien obtuvo un 76% y en cremas de leche por Fuentes
(2008) con un 14%. También es semejante al de Kenia en aislados de leche cruda y
carnes (Ombui y col.,(2000) con un 60%, y diferentes a los logrados en Ohio-EUA en
ubre de vacunos (Schultz y col., 2004).
Éstos resultados se relacionan a los reportados con los estudios de S. aureus de
ambiente clínico Colombiano (Vanegas y col., 2009), los cuales señalan que el
Staphylococcus aureus presentó el más alto nivel de sensibilidad al Trimetoprim–
sulfametoxazol, la Cefalexina, Ciprofloxacina. En Colombia el Trimetoprim-
sulfametoxazol continua siendo una excelente elección para el tratamiento de pacientes
con cuadro clínico compatible o confirmado de infección por Staphylococcus aureus
(Vanegas y col., 2009).
En Venezuela en el ámbito clínico zuliano reportaron datos similares (Pineda y
col., 2001; Álvarez y col., 2001; Atencio y col., 2005), estos últimos señalan que todas
las muestras fueron sensibles a Trimetoprim-sulfametoxazol e Imipenem.
Los reportes de S. aureus resistentes en Medicina Veterinaria, son frecuentes y
se han detectado en mastitis bovina. El tratamiento de la mastitis bovina con
antibióticos, es una práctica que debe hacerse con criterios profesionales debido a que
son muchos los factores que intervienen no sólo para una eficiente terapéutica, s ino
también para la prevención en la generación de resistencia bacterial y la presencia de
residuos de antibióticos en leche; problemas que competen no sólo a la salud animal
sino también a la salud humana. Por tales motivos el desarrollo de un programa de
control efectivo requiere un extenso conocimiento de la epidemiología de la mastitis
bovina, incluyendo la evaluación de la susceptibilidad a los antibióticos de los
microorganismos aislados de la glándula mamaria, así como programas de prevención
(Calderon, 2002).
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5.4 Determinación de cepas Staphylococcus aureus Meticilina Resistentes (SAMR)
mediante la técnica Oxacilina Screening plate.
Las cepas de S. aureus aisladas en los quesos estudiados, fueron en un 100%
sensibles a Oxacilina por lo cual no se realizó la prueba Oxacilina Screening plate. La
presencia de cepas de S. aureus con resistencia a la Oxacilina, ya han sido reportados.
Rivera, 2005 obtuvo dos (2) cepas resistentes a oxacilina en muestras de quesos
artesanales y fuentes, 2008 reportó dos cepas; en queso artesanal y en crema de
leche.
Es importante ser vigilantes, en vista que actualmente existe preocupación
mundial acerca de la diseminación de cepas de SAMR (Mendoza y col., 2003; Hsueh y
col., 2004). Esta alarma de salud pública se debe a que su erradicación no es nada
fácil, por su amplia capacidad de multiresistencia a antimicrobianos. Inicialmente se
creía que éstas estaban confinadas a ambientes intrahospitalarios, pero hoy día se
sabe que no se limita a éstos y cada vez se incrementan en ambientes comunitarios y
en otros casos han estado asociadas a enfermedades de origen alimenticio y a
manipuladores de alimentos (Morales y Ruiz, 2006).
5.5 Perfiles de DNA Plasmídico en cepas de S. aureus
Es significativo mencionar que este es el primer trabajo realizado en Colombia
donde se estudia la presencia de plásmidos provenientes de cepas de S. aureus
aisladas de alimentos, ya que la mayoría de los trabajos se abocan a estudiar la
presencia de este microorganismo en hospitales y en la comunidad, determinando solo
los patrones de susptibilidad a antibióticos en dichas bacterias (Londoño y col., 2006;
Tibavizco y col., 2007). Por lo que se considera un estudio pionero dentro del área de la
genética microbiana de alimentos, aportando datos preliminares significativos de gran
utilidad para otros investigadores orientados en esta área. Por esta razón se
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recomiendan estudios que permitan caracterizar la función de los plásmidos en los S
aureus aislados de muestras de quesos.
En relación a la determinacion del perfil de bandas plasmídicas de las 25 cepas
de S. aureus estudiadas, se puede mencionar que el 56% (14 cepas) mostró bandas de
DNA plasmídico, cuyos tamaños oscilaron entre los 23 kb y los 2kb (Tabla 10, Figuras
2 y 3). Estos tamaños coinciden con los reportados por Novick, 1990 en su clasificacion
de los plásmidos en Staphylococcus y por Udo y col., 2006 y Tenover y col., 2006.
Las cepas de S. aureus mostraron entre 1 y 3 bandas de DNA plasmídico, donde
el 48% (12 cepas) mostró sólo una banda, la cual fue de 23 kb encontrándose en el
44% (11 cepas) de las aislados. Sólo en el 4% (1 cepas) la banda manifestada fue de 2
kb. Por otro lado, en el 8% (2 cepas) se obtuvo tres bandas de DNA plasmídico cuyos
tamaños fueron de 23 kb, 2,3-2,1 kb y 2 kb aproximadamante (Tabla 10, figuras 2 y 3).
Estos resultados son similares a los obtenidos por Rivera , 2005 y Fuentes, 2008, en
ambos estudios se obtuvieron cepas que presentaban bandas plasmídicas
aproximadamente de 23kb acompañada de una banda de 2.1kb. De igual forma estos
trabajos presentaron cepas con una, y tres bandas plásmidicas; sin embargo estos
difieren con el presente estudio en que obtuvieron cepas multirresistentes.
Con respecto a la presencia de las bandas plasmídicas y el perfil de resistencia
encontrado en los aislados estudiados, se observa que el 20% de los aislados (5
cepas: QB4DA1, QSd1AA1, QSd1AA3, QB2DB1, QB2BA1)) con alguna resistencia mostró por lo
menos una banda de DNA plasmídico (Tabla 10, Figuras 2 y 3).
De las cepas de S. aureus que mostraron sólo resistencia a la Tetraciclina, el 8%
(2 cepas: QSd1AA3, QB4DA1) reveló una banda única de 23 kb. Mientras que una cepa:
QB4BB2 (4%) no mostró bandas de DNA plasmídico, y en la cepa: QB2DB1 (4%) se
observó sólo la banda de 2 kb . La resistencia a TE se debe a la metilación ARN
ribosomal de la subunidad 50s y la presencia de estaas bandas puede debrse a la
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presencia de plasmídos que le confieran resistencia a la bacteria. Con respecto a la
cepa(QSd1AA1)que mostró resistencia al Cloranfenicol, se encontró que sólo contenía
también una banda de 23 kb (Tabla 10, Figuras 2 y 3).
La única cepa, en que se manifestó resistencia a 3 tres antibioticos tuvo
presencia de una banda de 23 kb. (la cepa: QB2BA1); en la que se logró observar la
presencia de tres bandas de DNA plasmídico (2 cepas: QB2BB1, QB2DA1) no mostraron
resistencia a ninguno de los antibióticos probados (Tabla 10, Figuras 2 y 3).
Como se observa en la Tabla 10 y en las Figuras 2 y 3, no hay coincidencia
entre la presencia de las bandas de DNA plasmídico y el perfil de resistencia
encontrado. Aunque no se demostró durante este estudio que estos elementos
extracromosomales estén involucrados con la resistencia a los antimicrobianos, no se
descarta esta posibilidad, ya que la resistencia para muchos de los antibacterianos
ensayados, se hayan codificadas a nivel plasmídico. La presencia de bandas
plasmídicas en la mayoría de los aislados, permite presumir alguna diseminación de
genes de resistencia en este grupo bacteriano no patógeno (Stuart, 2000).
Los datos obtenidos en esta investigacion no permiten dilucidar la ubicación
genética de los marcadores de resistencia a antibióticos, ni los posibles fenotipos
codificados en dichas bandas de DNA, por tal razon deberán aplicarse otras
metodologías que permitan su estudio adecuado, profundizando el conocimiento del
genotipo de las bacterias autoctonas de la región de Valledupar.
Sin embargo el fenómeno biológico de la resistencia puede depender de la
aparición y conservación de los genes de resistencia, como elementos génicos
cromosómicos y extracromosómico. En pocas palabras es la modificación en el
genoma lo que determina la aparición de dichos genes; estos cambios se clasifican en
microevolutivos y macroevolutivos. Los primeros son el resultado de mutaciones únicas
que comprometen nucleótidos pareados, mientras las macroevolutivas afectan
segmentos de ADN. Los plásmidos y transposones son elementos genéticos móviles
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donde se transportan los genes de resistencia. Los plásmidos son fragmentos de DNA
bacteriano con longitud variable, algunos con capacidad para replicarse independiente
de la maquinaria genética que dispone la célula, lo que les da el apelativo de
conjugativos y no conjugativos según esta capacidad. Por otro lado los transposones
son secuencias de DNA (doble cadena) que pueden ser traslocados entre cromosomas
o de un cromosoma a un plásmido o entre plásmidos, gracias a un sistema de
recombinación propio; esto sumado a la capacidad de los plásmidos de trasladarse de
una célula a otra, durante la conjugación, permite la adquisición de genes de
resistencia entre bacterias de la misma especie o especies distintas lo que facilita la
expansión epidémica de la resistencia (Burke, 2000).
Estudios realizados en aislados de S. aureus provenientes de quesos en la
región Zuliana, se obtuvo que las bandas plasmídicas aisladas estaban relacionadas
con resistencia a a Penicilina y Eritromicina (Rivera, 2005) y (Fuentes, 2006).
Igualmente col y Udo. De 2006, señala que en aislados de Staphylococcus
aureus esistentes a la meticilina provenientes de Infecciones en hospitales y de la
comunidad con resistencia a eritromicina, tetraciclina, trimetoprim, ácido fusídico,
ciprofloxacina, cloranfenicol, rifampicina, mupirocina, acetato de cadmio, cloruro de
mercurio, propamidina isetionato y el bromuro de etidio pero susceptibles a
vancomicina, teicoplanina y linezolid, contenían plásmidos de 1,9, 2,8, 3,0, 4,4, 27 y 38
kb. Donde el plásmido de 38 kb transportaba la información genética para la resistencia
a altos niveles de mupirocina, así como resistencia a a cloranfenicol relacionada con la
presencia de las bandas plasmídicas de 2.8 –4.4 kb, y la resistencia a la eritromicina
con las bandas de 2.8–3.0 kb. Por último, Tenover y col., 2006 señalan que en el
análisis de los plásmidos provenientes de las cepas de Staphylococcus aureus aisladas
de pacientes se observa una banda de DNA de 4,3kb relacionada con la resistencia a
la Tetraciclina.
La determinación de los perfiles plasmídicos en cepas de S. aureus provenientes
de alimentos, es de importancia biológica, clínica y comunitaria, toda vez que estos
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elementos genéticos son fuente de diseminación de múltiples genes de resistencia. Los
datos obtenidos coinciden con los reportados en cepas de S. aureus de aisladas de
muestras clínicas y de alimentos (Álvarez y col., 2002; Atencio y col., 2005, Rivera
2005, Lu y col., 2005; Atencio y col., 2008, Fuentes, 2008).
Figura 2. Bandas plasmídica observadas en las cepas 1: QB3DB2 , 2: QB3DB1, 3: QB4DA1, 6: QB2DB1,
8: QB3DA1, 9: QB2DA2, 10: QB2DA1, 11: QB2DB2, 12: QB2BB1, 18: QB1BB2, 19: QB1BA2. M: λ Hind III.
Figura 3. Bandas plasmídica observadas en las cepas 21: QB2BA1,, 23: QSd1AA3,
25: QSd1AA1
23 kb
2,3 kb
2,1 kb 2 kb
23kb
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Tabla 9. Perfiles plasmídicos en las cepas de S. aureus aisladas de quesos .
Cepas
Perfiles plasmídicos aprox. Perfil de resistencia
QB3DB2 23 kb -
QB3DB1 23 kb -
QB4DA1 23 kb TER
QB4BB2 - TER
QB4DB1 - -
QB2DB1 2 kb TER
QB3DA2 - -
QB3DA1 23 kb -
QB2DA2 23 kb -
QB2DA1 23 kb, 2,3kb y 2 kb -
QB2DB2 23 kb -
QB2BB1 23 kb, 2,1kb y 2 kb -
QB2BA2 - -
QB2BB2 - -
QB1DB1 - -
QB1DB2 - -
QB1DB3 - -
QB1BB2 23 kb -
QB1BA2 23 kb -
QB1BA1 - -
QB2BA1 23 kb PRTEREI
QB1BB1 - -
QSd1AA3 23 kb TER
QSd1AA2 - -
QSd1AA1 23 kb CR
P: Penicilina; TE: Tetracilina; E: Eritromicina; C: Cloranfenicol; R. Resistencia, I.
Resistencia Intermedia.
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6. CONCLUSIONES
1. Se detectó la presencia de Staphylococcus aureus, en los quesos artesanales
de alto consumo en la Ciudad de Valledupar; los cuales estuvieron por encima de los
límites permisibles, donde se evidencia la insuficiente calidad en estos alimentos.
2. Las cepas de Staphylococcus aureus estudiadas solo mostraron resistencia a
los antibióticos Tetraciclina, Cloranfenicol, Penicilina, y Eritromicina, indicando la baja
resistencia a estos fármacos en los aislados provenientes de quesos de alto consumo
en Valledupar.
3. No se manifestó multiresistencia a los antibióticos en las cepas de S. aureus,
siendo la resistencia a Tetraciclina el resultado común en cinco de las cepas
estudiadas.
4. Todas las cepas fueron sensibles a Oxacilina, Gentamicina, Ciproxacilina,
Cefoxitin, Clindamicina, Trimetoprim-sulfa, Vancomicina, Rifampicina e Imipenen, lo
que señala que pueden ser buenos fármacos para el control de brotes epidémicos de
S. aureus por intoxicaciones alimentarias en la Ciudad de Valledupar.
5. La cepa(QB2BA1) de S. aureus resistente a Penicilina (QB2BA1) fue capaz de
producir β-lactamasa expresando esta capacidad como mecanismo de resistencia a
este β-lactámico.
6. No se encontró cepas de SARM, esto es de gran importancia porque
eventualmente se podrian controlar los potenciales brotes de esta bacteria con el uso
racional de este tipo de antibiótico en la región estudiada.
7. Se encontraron bandas plasmídicas en los aislados de S. aureus provenientes
de queso, oscilando sus tamaños entre 23 y 2 kb.
8. No se encontró coincidencia entre la presencia de las bandas de DNA
plasmidico y el perfil de resistencia a antibióticos observado en los aislados de S.
aureus provenientes de quesos de alto consumo en la Ciudad de Valledupar.
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7. RECOMENDACIONES
1. Se recomienda realizar estudios de Genética microbiana, y Biología
molecular (enzimas de restricción, PCR) con la finalidad de profundizar sobre la
presencia y ubicación de genes de resistencia a antibióticos en los aislados de S.
aureus provenientes de quesos de alto consumo en la Ciudad de Valledupar.
2. Se recomienda a la secretaria de salud de la ciudad realizar vigilancia
continua a todos los sitios donde se comercialicen quesos, con el fin de prevenir
enfermedades transmitidas por estos y asegurar el bienestar de los consumidores.
3. Instruir en forma permanente a los manipuladores involucrados en la
producción de alimentos y a los consumidores, en buenas prácticas de
manufactura como estrategia fundamental para prevenir brotes de enfermedades
transmitidas por alimentos por este microorganismo.
4. Sensibilizar a la comunidad médica sobre el uso correcto de los
antibióticos, con el fin de evitar la transmisión de microorganismos con resistencia a
estos fármacos.
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8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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ANEXOS
Caracterización de la susceptibilidad a antibióticos y del perfil plasmídico en cepas de Staphylococcus aureus Aisladas de Quesos Artesanales e industriales consumidos en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia
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ANEXO 1
Régimen para preparar la dilución antimicrobiana
Agentes microbianos que se emplearán en la dilución en agar para pruebas de susceptibilidad
Nota: Este cuadro es modificado por Ericsson, HM., Sherris, JC. Pruebas de sensibilidad a antibióticos.
Informe de estudio y de colaboración internacional. Acta de fotográfica de escaneo microbiológico. 1971;
217 (B Suppl): 1-98 (CLSI 2008).
Solución
antimicrobiana
pasos concentración
(ug/mL)
Fuente Volumen
(mL)
Diluyente
(mL)
Concentración
Intermedia
(ug/mL)
Concentración
Final
At 1:10 dilución
en agar(ug/mL)
Log2
5120 Valor - - 5120 512 9
1 5120 Valor 2 2 2560 256 8
2 5120 Valor 1 3 1280 128 7
3 5120 Valor 1 7 640 64 6
4 640 Paso 3 2 2 320 32 5
5 640 Paso 3 1 3 160 16 4
6 640 Paso 3 1 7 80 8 3
7 80 Paso 6 2 2 40 4 2
8 80 Paso 6 1 3 20 2 1
9 80 Paso 6 1 7 10 1 0
10 10 Paso 9 2 2 5 0.5 -1
11 10 Paso 9 1 3 2.5 0.25 -2
12 10 Paso 9 1 7 1.25 0125 -3
Caracterización de la susceptibilidad a antibióticos y del perfil plasmídico en cepas de Staphylococcus aureus Aisladas de Quesos Artesanales e industriales consumidos en el municipio de Valledupar Cesar-Colombia
Universidad del Zulia. Facultad Experimental de Ciencias. Trabajo Especial de Grado presentado por: Lcda. IVONNE ACOSTA NIEVES
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Laboratorio de Genética y Biología Molecular
Universidad del Zulia
Facultad Experimental de Ciencias 2010