Tarsila Vieceli – AD 2017 – Genética Humana: Prova I

ESTRUTURA DO GENOMA HUMANOO código genético humano encontra-se em dois lugares: o núcleo (DNA nuclear) e a mitocôndria (DNA mitocondrial).

Embora haja muitas semelhanças entre os dois tipos de DNA, cada um tem suas particularidades.

DNA NUCLEARO DNA nuclear não é inteiramente codificante: ele pode ser dividido em gênico (sequências que irão ser traduzidas

em proteínas) e extra gênico.

Genes nucleares:O DNA nuclear contem cerca de 30 mil genes. A distribuição deles varia muito conforme a região cromossômica e o

cromossomo em si (ex: os cromossomos 19 e 22 são ricos em genes, enquanto o 4 e o 18 não o são).Esses genes podem ser:

Genes de copia única (“genes simples”) Famílias multigênicas: grupos de genes com estrutura similar (famílias clássicas de genes – observadas em DNA codificante de RNA ribossômico) ou com função similar (superfamílias de genes, como os genes HLA e receptores das células T.)Pseudogenes (genes silenciosos, que não são codificantes – podem ter sido silenciados por mutações ou pela inserção de genes pela transcriptase reversa).

Os genes nucleares podem codificar RNA mensageiro (que será traduzido em proteínas) ou outros tipos de RNA, como tRNA, rRNA, snRNA (que codificam DNA de spliceossomo), microRNA (que atua na regulação da expressão genica), genes relacionados à inativação do cromossomo X e snoRNA (RNA que promove a clivagem de RNA)

DNA extragênico:A maior parte do genoma humano é formado por sequências repetitivas que não serão transcritas. A maior parte

desse DNA é chamado de “DNA sucata”, mas uma parte dele tem papel na regulação e expressão genica.

a) Sequências de DNA repetidas em tandemUma sequência repetida em tandem é uma sequência não-codificante repetida em blocos. Ela divide-se em 3 grupos:

DNA satélite: corresponde a 15% do DNA repetitivo e consiste em séries muito grandes de DNA simples repetidas e transcricionalmente inativas. Elas são agrupadas ao redor dos centrômeros de alguns cromossomos.

DNA minissatélite: consiste em duas famílias pequenas de DNA repetitivo em tandem: o DNA telomérico, que dá estabilidade cromossômica e o DNA minissatélite hipervariável, composto por sequências de DNA altamente polimórficas, formando um “fingerprinting”. Esse tipo DNA é utilizado em testes de paternidade.

DNA microssatélite: repetições de di-, tri-, tetra- e de nucleotídeos únicos situadas pelo genoma. Elas raramente ocorrem dentro de uma sequencia codificante, mas as repetições de trinucleotídeos perto dos genes estão associadas a alguns distúrbios.

b) Sequências de DNA repetitivo intercalar altamente repetidoCorrespondem a um terço do genoma. Dividem-se em:

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Elementos nucleares curtos intercalados (SINEs): são as chamadas sequências Alu: cerca de 750 mil repetições de uma sequência com cerca de 280pb. Eles estão associados com reconhecimentos de enzimas de transcrição. Há também os transposons, que são sequências curtas que podem se mover espontaneamente pelo genoma.

Elementos nucleares longos intercalados (LINEs): os LINEs são sequências longas (com cerca de 7kpb) que podem ter ou não uma função transcricional. O elemento mais comum dos LINEs, o LINE-1, codifica uma transcriptase reversa. Também são chamadas de sequências Kpn.

DNA MITOCONDRIALO genoma mitocondrial é muito compacto e pouco repetitivo. Ele codifica cerca de 37 genes: 2 tipos de rRNA, 22

tRNAs e 13 subunidades de proteínas para enzimas (como citocromo B e citocromo oxidase). 93% do genoma mitocondrial é codificante. Os outros 7% são compostos por regiões regulatórias.

As mutações mitocondriais podem se apresentar de duas maneiras: em homoplasmia e heteroplasmia.Homoplasmia: quando todas as mitocôndrias da célula apresentam aquela mutaçãoHeteroplasmia: quando uma ou poucas mitocôndrias apresentam a mutação.

MUTAÇÕES GÊNICASAs mutações são mudanças estruturais no código genético. Elas podem ser espontâneas ou induzidas, mas não é

explicada pela variabilidade genética dada pela meiose.Elas podem ser classificadas da seguinte forma:

As mutações gênicas são mais comumente encontradas pois dificilmente acarretam em grandes fenótipos – muitas

mutações cromossômicas e genômicas são incompatíveis com a vida, pois modificam muito o código genético do individuo.Nas mutações genicas, a alteração é dada a nível de nucleotídeos. O gene ainda permanecerá lá, mas com dois alelos: o

alelo normal e o alelo mutante.

As mutações gênicas subdividem-se em 3 tipos principais:

a) Mutações Pontuaissão alterações em um único nucleotídeo.

Nessa mutação, um nucleotídeo se altera, modificando o nucleotídeo complementar e consolidando a mutação. Se a mutação substituir uma purina por uma purina (A por G) ou uma pirimidina por outra pirimidina (C por T), ela é

chama da de transição. Se a substituição modificar o tipo de nucleotídeo, ela é chamada de transversão. As transições são mais comuns que as transversões.

Ela pode ou não apresentar fenótipo, e isso depende do local da mutação:

- Íntron: pode apresentar alteração (caso ela modifique o início ou fim do íntron)

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- Promotor do gene: pode aumentar ou reduzir expressão gênica- Sítios de Splicing: pode diminuir/aumentar/ignorar éxon ou diminuir estabilidade do RNAm

- Mutação pontual no éxon: pode causar as seguintes alterações:Mutação sinonímia ou conservativa: a mutação preserva o aminoácido (ex: CAC -> CAU: ambos codificam a histidina).

Em raros casos, isso pode alterar o dobramento da proteína.Mutação com sentido trocado: troca a base e o aminoácido (anemia falciforme)Mutação sem sentido: cria códon de parada

b) DeleçõesUma deleção envolve a perda de um ou mais nucleotídeos. Caso o numero de nucleotídeos perdidos não seja múltiplo

de três, haverá modificação na matriz de leitura. Grandes deleções podem gerar deleções parciais ou totais de genes, e podem surgir por crossing desigual entre sequências repetidas.Exemplo de doença por deleção: fibrose cística

c) Inserções Uma inserção consiste na adição de um ou mais nucleotídeos em um gene. Da mesma forma que a deleção, se

envolver um numero de nucleotídeos que não é múltiplo de três, isso irá modificar a matriz de leitura e modificar completamente a proteína produzida.Exemplo de doença por inserção: epilepsia mioclônica progressiva

Além da alteração da matriz de leitura, as inserções e deleções podem criar mutações sem sentido e aumentar ou diminuir consideravelmente o material genético.

Consequências das mutações:a) Perda de função – diminuição da proteína produzida (mutação hipomorfa), perda do produto gênico (amorfa ou alelo nulo) ou formação de proteína não-funcional. Em caso de heterozigose, em que a produção de metade dos níveis normais do produto gênico acarreta em fenótipo, é chamada de mutação de haploinsuficiência.A mutação de perda de função é comum em genes de enzimas. Essas mutações são geralmente herdadas de modo recessivo ligado ao X.Ex: fenilcetonúria.

b) Ganho de função – consiste no desenvolvimento de uma nova função para o produto gênico ou modificação estrutural do tecido. Essas doenças são herdadas dominantemente.Ex: doença de Huntington.

Efeito dominante negativo: uma mutação dominante negativa é aquela na qual um gene mutante no estado heterozigoto interfere na função do produto gênico normal do alelo correspondente. Sendo assim, a proteína formada terá uma subunidade sadia e uma mutada, mas não conseguirá exercer sua função normalmente em decorrência da subunidade mutada.

De um modo geral, as mutações ocorrem mais frequentemente em íntrons e pseudogenes (mutações em éxons são frequentemente suprimidas por seleção natural)

Causa das mutações:Espontâneas:- tautomerismo (reposição de um átomo de H no nucleotídeo -> uma T pode virar uma G)- desaminação (ocorre por hidrolise: pode formar uma xantina no lugar de uma base normal)- depurinação (perda da base inteira: deleção)- metilação da C (gera uma C reativa)- erros de replicação (são corrigidos em 99,9% - ocorrem principalmente nas repetições em tandem)

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Induzidas:a) radiação ionizante (seus efeitos são cumulativos): raios X, alfa, beta, gama... – forma íons reativos e radicais livres; altera as bases e pode promover quebras simples ou duplas de cadeiab) radiação não-ionizante (luz UV): forma dímeros de pirimidina -> figurac) Análogos de base (são incorporados ao DNA ao invés das bases normais)d) Agentes desaminantes (ácido nitroso)e) Agentes alquilantes (nitrosaminas)f) Agentes intercalantes (brometo de etídio)

Se a mutação ocorre nas células somáticas de um individuo, ele poderá desenvolver doenças como as neoplasias. Se ela ocorre em células gaméticas, as gerações futuras poderão desenvolver doenças.

Se uma mutação não acarreta em grandes consequências para o individuo e ocorre de forma comum na população, ela é chamada de polimorfismo e é classificada como fonte de variabilidade genética.

Mecanismos de reparo do DNA Reparo pós-replicação (varredura) Excisão de base (X, HX – bases danificadas) Fotorreativação (em dímeros de pirimidinas) Excisão de nucleotídeos Reparo de quebras de fita Síntese de DNA translesão

TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR1. PCR convencional

O PCR convencional consiste na amplificação de um fragmento de DNA. Ele é sintetizado milhões de vezes em poucas horas. Para a reação, são necessários:

Fita molde de DNA, primers (que irão restringir o fragmento de interesse), nucleotídeos, um tampão, cloreto de magnésio e a enzima polimerase.

Na PCR, a reação é submetida a vários ciclos. Um ciclo consiste em três temperaturas diferentes:

desnaturação do DNA (abertura da dupla-fita) anelamento dos primers (os primers precisam ter temperaturas de anelamento

similares) extensão da polimerase (síntese de DNA)

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O produto final da PCR é então submetido a eletroforese e analisado. Por não podermos precisar a quantidade de material ao final da reação, a PCR tradicional é um bom método quando buscamos um resultado qualitativo (presença ou não de determinado material).

2. rtPCRO rtPCR (não confundir com real-time!!) é o PCR acoplado a uma transcriptase reversa. Sendo assim, ela não parte

do DNA, e sim do RNAm do tecido:

Tanto na PCR tradicional quanto na rtPCR, só conseguimos analisar o produto final da reação.

3. Real-Time PCRA PCR em tempo real nos mostra a quantidade de produto ao longo

da reação. Nesse método, há uma sonda fluorescente ligada a um inibidor da fluorescência. Essa sonda está ligada à fita-molde de DNA. Quando a polimerase sintetiza a fita complementar, ela quebra a sonda, separando o fluoróforo do agente inibidor da fluorescência. A fluorescência é então liberada.

Essa sonda pode ser especifica (método Taqman) ou inespecífica, ligando-se a qualquer DNA presente na reação (SYBR Green). A desvantagem da sonda inespecífica é que ela irá detectar falso DNA em caso de contaminação.

As cores diferentes da sonda nos darão uma ideia de genótipo (ex: podemos usar uma sonda verde para um genótipo A e uma sonda vermelha para um genótipo a. Um resultado amarelo indica heterozigose)

4. EletroforeseA eletroforese é usada para analisar o produto da PCR convencional e rtPCR. Ela consiste na inserção do material em

um gel de agarose ou poliacrilamida (que irão oferecer resistência às moléculas de DNA). É então submetido um campo elétrico ao gel, o que faz com que o DNA (que é uma molécula negativa) migre até o campo positivo.

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As moléculas maiores de DNA sofrerão mais resistência por parte do gel e migrarão menos. Aí, então, podemos analisar a presença e o tamanho do produto:

Na eletroforese capilar, o DNA é separado em capilares, que são preenchidos com matriz de baixa viscosidade. As bandas de DNA são lidas por absorção ultravioleta ou fluorescência induzida por laser. Esse processo é automatizado, diferentemente da eletroforese tradicional, que é manual.

Aplicações da PCR e da eletroforese: diagnostico de doenças infecciosas (presença/ausência de antígeno e quantificação de carga viral) diagnostico de doenças genéticas estudos de expressão gênica

5. SequenciamentoO sequenciamento é usado para determinar sequências de ácidos nucléicos (DNA, RNA, produto de PCR...). O método mais usado é o método enzimático ou dideóxi. Nesse processo, a síntese da fita complementar do DNA é

constantemente interrompida pela adição de um dideoxinucleotídeo, que emite fluorescência característica (cada nucleotídeo emitira fluorescência em uma cor diferente). Sendo assim, ao final da reação, teremos a sequência do fragmento de interesse.

Na segunda figura: no primeiro sequenciamento, temos o genótipo CC; no segundo, o heterozigoto CT e no terceiro, o genótipo TT.

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6. Enzimas de RestriçãoAs enzimas de restrição são usadas principalmente na detecção de genótipos. A enzima irá clivar um dos alelos e

então analisaremos o tamanho final do produto.

7. MicroarrayO microarranjo é um processo totalmente automatizado que consiste na inserção do

DNA em microplacas (situadas em um chip) que já contêm uma sonda complementar a um fragmento de interesse. São usadas duas cores diferentes de fluoróforos, que emitirão fluorescência em caso de ligação. Após isto, a placa é lavada para remover o DNA que não se ligou às sondas. O resultado é então analisado.

(na imagem ao lado, o genótipo Z, em amarelo, é o genótipo heterozigoto, pois o DNA ligou-se a ambas as sondas)

Uso das técnicas:Análise de expressão gênica:

RNA -> rtPCR -> DNA -> PCR especifica para gene de interesse -> eletroforese (analise semi-quantitativa) Real-time PCR: análise quantitativa Microarray: analise de inúmeros genes simultaneamente

Analise de mutações/polimorfismos: DNA -> PCR -> eletroforese (mutações ins/Del) DNA -> PCR -> clivagem com enzima de restrição (mutações pontuais ou ins/Del) DNA -> Real-time PCR (mutações pontuais ou ins/Del) DNA -> PCR -> sequenciamento (todos os tipos de mutações) DNA -> microarray (varias mutações simultaneamente)