Sara Roberta dos Santos - bdtd.cdtn.br fileSara Roberta dos Santos AVALIAÇÃO DE...

Comissão Nacional de Energia Nuclear

Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear

Programa de Pós Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais

Sara Roberta dos Santos

AVALIAÇÃO DE APTÂMEROS MARCADOS COM 99m

Tc PARA

IDENTIFICAÇÃO DE FOCOS INFECCIOSOS DE Staphylococcus aureus

Belo Horizonte

2014

Sara Roberta dos Santos

AVALIAÇÃO DE APTÂMEROS MARCADOS COM 99m

Tc PARA

IDENTIFICAÇÃO DE FOCOS INFECCIOSOS DE Staphylococcus aureus

Belo Horizonte

2014

Dissertação apresentada ao curso de Pós

Graduação em Ciência e Tecnologia das

Radiações, Minerais e Materiais, como requisito

parcial à obtenção do Grau de Mestre.

Área de concentração: Ciência e Tecnologia das

Radiações

Orientador: Dr. Antero Silva Ribeiro de Andrade

Co-orientadora: Dra. Cristiane Rodrigues Corrêa

Dedico este trabalho a minha mãe Miriam e

ao Otávio pelo apoio e carinho.

AGRADECIMENTOS

A Deus,

Ao meu orientador Antero pela oportunidade, ensinamentos e confiança,

A minha coorientadora Cristiane pelos ensinamentos e constante apoio durante todo o projeto,

Aos professores Valbert e Simone pela colaboração e acolhida no Laboratório de

Radioisótopos, permitindo assim que este projeto fosse possível,

Ao professor André pela colaboração, ensinamentos e paciência,

A professora Rogéria Serakides pela colaboração,

Ao Leonardo pela colaboração e treinamentos,

Aos colegas do Laboratório de Radioisótopos/UFMG,

Aos colegas do Laboratório de Radiobiologia/CDTN,

Ao laboratório de Histopatologia e Imunohistoquímica do setor de Patologia do departamento

de Clínica e Cirurgia Veterinária da UFMG,

As técnicas Natália e Leimar do laboratório de Histopatologia e Imunohistoquímica pela

ajuda na elaboração das lâminas histológicas,

Aos funcionários do biotério Adelaide e Batista,

Aos funcionários do LIG/CDTN,

Aos professores da pós-graduação pelos ensinamentos,

Aos colegas do CDTN,

Aos familiares e amigos pelos momentos de descontração,

A CNEN/CDTN pelo apoio financeiro,

A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram neste projeto.

RESUMO

Staphylococcus aureus é uma espécie de grande importância médica, pois está

frequentemente associado com diversas infecções em seres humanos. Essa bactéria pode

causar doenças que vão desde infecções simples, até infecções potencialmente letais como

endocardite, pneumonia, meningite, síndrome do choque tóxico, septicemia, osteomielite,

entre outras. O S. aureus é o agente mais comumente encontrado em infecções na pele e

tecidos moles, infecções ósseas e de próteses ósseas. Tendo em vista a dificuldade de

identificação destes focos infecciosos torna-se importante o desenvolvimento de novas

técnicas diagnósticas. O diagnóstico por cintilografia apresenta vantagens sobre outros

métodos, pois é capaz de identificar tecidos doentes sem a necessidade de procedimentos

invasivos e é capaz de realizar um diagnóstico precoce antes mesmo de haver modificações

anatômicas. Assim, a medicina nuclear poderia contribuir para um diagnóstico preciso de

infecções bacterianas, desde que radiofármacos específicos fossem desenvolvidos. Aptâmeros

são oligonucleotídeos que apresentam alta afinidade e especificidade para seus alvos

moleculares e vem se apresentado como uma classe de moléculas promissoras para o

desenvolvimento de radiofármacos. Aptâmeros radiomarcados, específicos para os agentes

infecciosos, poderiam dar uma contribuição significativa para o diagnóstico de infecções

através da cintilografia. Neste estudo, aptâmeros selecionados para S. aureus foram marcados

com 99m

Tc e utilizados para identificação desta bactéria em ensaios in vitro e in vivo. Os

aptâmeros foram inicialmente marcados com 32

P e incubados com células de S. aureus em

ensaio in vitro, mostrando alta afinidade pelas células de S. aureus quando comparados com a

biblioteca de oligonucleotídeos com sequências aleatórias, utilizada como controle. Os

aptâmeros foram marcados com 99m

Tc e incubados com células de S. aureus em ensaio in

vitro e demostraram afinidade pelas células de S. aureus quando comparados com a

biblioteca, porém ligações inespecíficas foram também verificadas. A estabilidade da

marcação foi avaliada e os aptâmeros radiomarcados foram estáveis em solução salina 0,9%,

em plasma de camundongos Swiss e em excesso de cisteína. Em ensaios in vivo em modelo

experimental com camundongos Swiss, com infecção intramuscular na coxa direita, os

aptâmeros marcados com 99m

Tc injetados por via intravenosa, foram capazes de identificar a

infecção causada por S. aureus, apresentando uma relação alvo/não alvo de 4,035 ± 0,46 após

4 h da injeção do radiomarcado. Foram utilizados como controle camundongos infectados

com C. albicans, que apresentaram uma relação alvo/não alvo de 2,02 ± 0,42 e camundongos

com inflamação asséptica induzida por zimosan nos quais a relação alvo/não alvo foi de 1,146

± 0,226. Imagens cintilográficas mostraram uma elevada captação do radiofármaco pelos rins

e eliminação pela bexiga em todos os grupos. O grupo infectado por S. aureus apresentou

maior captação na coxa direita infectada sendo visível a diferença em relação a coxa esquerda

(controle) no tempo de 1 h. Para os outros grupos (C. albicans e zimosan) não foram

visualizadas diferenças. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que aptâmeros

marcados diretamente com 99m

Tc são promissores no diagnóstico de infecção pela

cintilografia.

Palavras-Chave: aptâmeros; infecção; Staphylococcus aureus; 99m

Tc.

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is specie of great medical importance because it is often associated

with many infections in humans. This bacterium can cause diseases ranging from simple

infections to life-threatening infections such as endocarditis, pneumonia, meningitis, toxic

shock syndrome, septicemia, osteomyelitis, among others. S. aureus is the most commonly

agent found in infections of the skin and soft tissues, bone infections and bone prostheses.

The difficulty in early detection of specific foci caused by bacteria has raised the need to

search for new techniques for this purpose. Diagnosis by scintigraphy has advantages over

other methods because it is able to identify damage tissues without the need of invasive

procedures and is able to perform an early diagnosis even before anatomic changes. Thus,

nuclear medicine could contribute to an accurate diagnosis of bacterial infections, since

specific radiopharmaceuticals were developed. Aptamers are oligonucleotides that have high

affinity and specificity for their molecular targets and are emerging as a new class of

molecules for radiopharmaceuticals development. Radiolabeled aptamers specific to the

infectious agents, could give a significant contribution to the infection diagnosis by

scintigraphy. In this study, aptamers selected to S. aureus were labeled with 99m

Tc and used

for the bacteria identification in vitro and in vivo. The aptamers labeled with 32

P and

incubated in vitro with S. aureus cells showed high affinity for the bacterial cells when

compared with the library of oligonucleotides with random sequences used as control. The

aptamers labeled with 99m

Tc also showed affinity for S. aureus cells when compared with the

library, but unespecific binding was also verified. The 99m

Tc labelled aptamers were stable in

0.9% saline, plasma of Swiss mice and in excess of cysteine. The in vivo biodistribution

studies using Swiss mice with intramuscular infection in the right thigh showed that the

aptamers labeled with 99m

Tc were able to identify the infection foci caused by S. aureus

displaying a target/non-target ratio of 4,035 ± 0.46 after 4 h. Mice infected with C. albicans

presented a target/non-target ratio of 2.02 ± 0.42 while mice with aseptic inflammation

induced by zymosan showed a target/non-target ratio of 1,146 ± 0,226. Scintigraphic images

revealed a high uptake of the radiopharmaceutical by the kidneys and fast elimination by the

bladder. The images also showed higher uptake in the right thigh (infected) in relation to the

left (control) for the S. aureus infected mice. In the control groups (C. albicans e zymosan)

was not possible to visualize any difference. The results indicate the radiolabeled aptamers as

a promising alternative for the development of radiopharmaceuticals for infection.

Keywords: aptamers; infection; Staphylococcus aureus; 99m

Tc.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Staphylococcus aureus em imagem de microscopia convencional......... 24

Figura 2: Causas comuns de infecções associadas a prótese..................................

25

Figura 3: Biofilme de S. aureus em infecção de prótese........................................

26

Figura 4: Gerador 99

Mo/99m

T..................................................................................

28

Figura 5: Diagrama do decaimento do 99

Mo em 99m

Tc...........................................

28

Figura 6: Mecanismo da Resposta Inflamatória.....................................................

31

Figura 7: Prótese direita de quadril infectada.........................................................

38

Figura 8: Estruturas de aptâmeros...........................................................................

39

Figura 9: Esquema da metodologia SELEX...........................................................

42

Figura 10: Diagrama da metodologia SELEX........................................................

43

Figura 11: Esquema da metodologia CELL-SELEX com o passo de seleção

negativa....................................................................................................................

46

Figura 12: Aptâmeros SA20, SA23 e SA34........................................................... 58

Figura 13: Diagrama esquemático da cromatografia em camada delgada..............

61

Figura 14: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de

aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m

Tc em camundongos Swiss

infectados na coxa direita com S. aureus.................................................................

84




infectados na coxa direta com C. albicans...............................................................

85




com uma inflamação desenvolvida por administração de zimosan na coxa direita.

86

Figura 17: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em

microscopia óptica....................................................................................................

89

Figura 18: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em


89

Figura 19: Fotomicrografia de infeção intramuscular de C. albicans em


90



91



91

Figura 22: Fotomicrografia de inflamação intramuscular induzida por zimosan

em microscopia óptica..............................................................................................

92

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Sensibilidade e Especificidade em diagnóstico de próteses de joelho e

quadril utilizando imagens de leucócitos marcados com 99m

Tc...............................

37

Tabela 2: Eluentes utilizados na CCD.....................................................................

61

Tabela 3: EC50 para células de S. aureus da linhagem ATCC 8325-4..................

68

Tabela 4: Determinação da radioatividade incorporada aos pellets de S. aureus

da linhagem ATCC 25923........................................................................................

68

Tabela 5: Estabilidade em solução salina 0,9%......................................................

69

Tabela 6: Estabilidade no plasma............................................................................

70

Tabela 7: Estabilidade em excesso de cisteína.......................................................

70

Tabela 8: Estabilidade dos coligantes tricina e EDDA em solução salina 0,9%....

70

Tabela 9: Rendimento da marcação dos aptâmeros SA20, SA23, SA34 e da

biblioteca com 99m

Tc................................................................................................

72

Tabela 10: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e

SA34, marcados com 99m

Tc no grupo infectado por S. aureus (n=6) obtidos no

tempo de 4h..............................................................................................................

74



Tc no grupo infectado por C. albicans (n=6) obtidos no

tempo de 4h..............................................................................................................

75



Tc, no grupo com a indução de inflamação estéril por

zimosan (n=6), obtidos no tempo de 4h...................................................................

76

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1: Ensaio de ligação do aptâmero SA20 marcado com 32

P a células de

S. aureus...................................................................................................................

66


P a células de S.

aureus.......................................................................................................................

67


P a células de S.

aureus.......................................................................................................................

67

Gráfico 4: Ensaio de ligação dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcado com 99m

Tc a células de S. aureus.....................................................................................

71

Gráfico 5: Perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m

Tc

em camundongos Swiss (n=6) no grupo infectado com S. aureus em

%ID/g.......................................................................................................................

78


Tc

em camundongos Swiss (n=6) no grupo infectado com C. albicans em

%ID/g.......................................................................................................................

78


Tc

em camundongos Swiss (n=6) no grupo com o desenvolvimento de inflamação

por zimosan em %ID/g.............................................................................................

79

Gráfico 8: Comparação da %ID/g nas coxas infectadas (S. aureus e C. albicans)

e inflamada (zimosan)..............................................................................................

80

Gráfico 9: Relação alvo/não alvo (coxa infectada/coxa não infectada) nos grupos

S. aureus, C. albicans e Zimosan.............................................................................

82

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

%ID/g- Percentual da dose injetada por grama de tecido

111In- Índio 111

123I- Iodo 123

18F- Flúor 18

32P- Fósforo 32

99Mo- Molibdênio-99

99mTc –Tecnécio-99 metaestável

99mTcO2- Tecnécio-99 metaestável hidrolisado

99mTcO4

- - Tecnécio-99 metaestável livre

A. fumigatus- Aspergillus fumigatus

ATP- Trifosfato de adenosina

C. albicans- Candida albicans

cAMP- Amp cíclico

CCD- Cromatografia de camada delgada

CD71- Receptores de transferrina

CELL SELEX- SELEX para células

células NK- Células natural killers

CNTs- Nanotubos de carbono

Cpm- Contagem por minuto

Cpm/g- Contagem por minuto por grama de tecido

DNA- Ácido desoxirribonucleico

DOTA-Ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-tetraacético

dsDNA- DNA fita dupla

DTPA- Ácido dietilenotriaminopentacético

EDDA- Ácido etilenodiaminoacético

EDTA- Ácido etilenodiamino tetra-acético

EGF- Fator de crescimento epitelial

FDA- Food and drug administration

FDG- Fluorodesoxiglicose

HIG- Imunoglobulina G policlonal humana

HIV- Vírus da imunodeficiência humana

hLF- Lactoferrina humana

HMPAO- Hexametil propilenamina

HNP 1-3- Peptídeo neutrofílico humano

HYNIC- Ácido hidrazinonicotínico

IAEA- Agência Internacional de Energia Atômica

ICAMs- Moléculas de adesão intercelular

IL-1- Interleucina-1


IL-1ra- Receptor antagonista IL-1 radiomarcado



Kd- Constante de dissociação

KDa- Quilodalton

mAbs- Anticorpos monoclonais

MAG2- Acetil mercapto diglicina

MAG3- S-acetil-mercaptoacetiltriglicina

Na99m

TcO4- Pertecnetato de sódio

NPs- Nanopartículas metálicas

PCR - Polimerase Chain Reaction

PDGF- Fator de crescimento derivado de plaquetas

PET- Tomografia por Emissão de Pósitrons

PMSA- Antígeno de membrana próstata específico

QDs-quantum dots

RNA- Ácido ribonucléico

S. aureus- Staphylococcus aureus

SDS- Dodecil Sulfato de Sódio

SELEX- Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment

SPECT- Tomografia computadorizada por emissão de fóton único

ssDNA- DNA fita simples

TSST-1- Toxina da síndrome do choque tóxico

UBI 29-41- Fragmento do peptídeo ubiquicidina

VEGF- Fator de crescimento endotelial vascular

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO..................................................................................................

19

2- OBJETIVOS....................................................................................................... 21

2.1) Objetivo geral.................................................................................................... 21

2.2) Objetivos específicos........................................................................................ 21

3- JUSTIFICATIVA...............................................................................................

22

4- REFERENCIAL TEÓRICO............................................................................. 24

4.1) Staphylococcus aureus...................................................................................... 24

4.2) Diagnóstico por Cintilografia............................................................................ 27

4.2.1) Tecnécio-99m (99m

Tc).................................................................................... 28

4.2.2) Características ideais de um radiofármaco..................................................... 29

4.3) Infecção x Inflamação - Técnicas diagnósticas por imagem............................ 30

4.3.1) Radiofármacos atualmente utilizados em diagnóstico de infecção................ 32

4.3.1.1) 67

Ga-citrato................................................................................................. 32

4.3.1.2) Citocinas e Quimiocinas............................................................................. 32

4.3.1.3) Peptídeos antimicrobianos.......................................................................... 33

4.3.1.4) Vitaminas.................................................................................................... 33

4.3.1.5) Anticorpos monoclonais (mAbs) antigranulócitos..................................... 34

4.3.1.6) Imunoglobulina G policlonal humana......................................................... 34

4.3.1.7) 99m

Tc-albumina nanocolóide....................................................................... 35

4.3.1.8) 18

F-Fluoro-desoxi-glicose (18

F-FDG)......................................................... 35

4.3.1.9) Antibióticos radiomarcados........................................................................ 35

4.3.1.10) Agentes antifúngicos radiomarcados........................................................ 36

4.3.1.11) Leucócitos radiomarcados......................................................................... 36

4.3.2) Considerações................................................................................................ 38

4.4) Aptâmeros........................................................................................................ 39

4.4.1) A Técnica SELEX.......................................................................................... 40

4.4.2) Alvos para SELEX......................................................................................... 44

4.4.3) A técnica SELEX para células (CELL SELEX)............................................ 45

4.4.4) Propriedades dos aptâmeros........................................................................... 47

4.4.5) Aplicações dos aptâmeros.............................................................................. 49

4.4.5.1) Aplicações em terapia................................................................................. 49

4.4.5.1.1) Aplicações em angiogênese..................................................................... 49

4.4.5.1.2) Aplicações em oncologia......................................................................... 50

4.4.5.1.3) Aplicações como agentes anticoagulantes............................................... 51

4.4.5.1.4) Aplicações em tratamento de inflamação................................................ 51

4.4.5.1.5) Aplicação no tratamento de doenças infecciosas..................................... 52

4.4.5.1.6) Aplicações em diabetes............................................................................ 53

4.4.5.2) Aplicações em diagnóstico.......................................................................... 53

4.4.5.2.1) “Beacons” competitivos........................................................................... 53

4.4.5.2.2) Sensores eletroquímicos........................................................................... 54

4.4.5.2.3) Diagnóstico com conjugados de aptâmeros a nanopartículas.................. 54

4.4.5.2.4) Diagnóstico por cintilografia utilizando aptâmeros................................. 55

5) MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................

58

5.1) Aptâmeros......................................................................................................... 58

5.2) Microrganismos e condições de cultura............................................................ 59

5.3) Animais............................................................................................................. 59

5.4) Marcação dos aptâmeros com 32

P..................................................................... 59

5.5) Ensaio de ligação dos aptâmeros marcados com 32

P a células de S. aureus..... 59

5.6) Detecção da Radioatividade por Cintilação Líquida......................................... 60

5.7) Marcação dos aptâmeros com 99m

Tc................................................................ 60

5.8) Testes de estabilidade dos aptâmeros marcados............................................... 61

5.8.1) Teste de estabilidade em solução salina......................................................... 62

5.8.2) Teste de estabilidade em excesso de cisteína................................................ 62

5.8.3) Teste de estabilidade no plasma..................................................................... 62

5.9) Ensaio in vitro de afinidade dos aptâmeros marcados com 99m

Tc.................... 62

5.10) Estudos de Biodistribuição e Cintilografia..................................................... 63

5.11) Histologia........................................................................................................ 64

5.12) Análise Estatística........................................................................................... 65

6-RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................

66


P para células de S. aureus 66

6.2) Marcação com 99m

Tc e avaliação da estabilidade dos aptâmeros marcados..... 69


Tc.................... 71

6.4) Biodistribuição.................................................................................................. 72

6.5) Cintilografia...................................................................................................... 84

6.6) Histologia.......................................................................................................... 88

6.6.1) Grupo 1:Infectado com S. aureus.................................................................. 88

6.6.2) Grupo 2: Infectado com C. albicans.............................................................. 90

6.6.3) Grupo 3: Zymosan......................................................................................... 92

7- CONCLUSÕES..................................................................................................

93

8- PERSPECTIVAS...............................................................................................

94

9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................

95

ANEXO-A............................................................................................................... 108

19

1- INTRODUÇÃO

Staphylococcus aureus é uma espécie de grande importância médica, pois está

frequentemente associado com diversas infecções em seres humanos. O S. aureus pode causar

desde infecções simples até infecções potencialmente letais como endocardite, septicemia,

pneumonia, meningite, síndrome do choque tóxico e osteomielite (SANTOS et al, 2007). Essa

bactéria é o agente mais comum em infecções de pele e tecidos moles, sendo frequentemente

isolado em feridas cirúrgicas infectadas que podem ser focos para o desenvolvimento de

infecções sistêmicas (ROBERT & CHAMBERS, 2005). Além disso, S. aureus está entre as

espécies mais prevalentes em infecções pós-artroplastias de joelho e quadril, correspondendo

a 75% dos casos de infecções de próteses perioperatórias e a 50 % dos casos de infecção por

via hematógena (MUNHOZ et al 2004; GEMMEL et al, 2012). As infecções ósseas e de

próteses caracterizam-se pela dificuldade de diagnóstico e tratamento, podendo incluir

intervenções cirúrgicas e longos períodos de antibioticoterapia (GEMMEL et al, 2012 ).

Assim, a identificação precoce de focos infecciosos provocados por S. aureus é crucial para o

sucesso do tratamento. A erradicação incompleta destes focos pode provocar reincidências,

aumentando as taxas de mortalidade. O diagnóstico é geralmente difícil devido à ausência de

sintomas e dificuldade na diferenciação entre inflamação (asséptica) e infecção (séptica)

(FIDEL et al, 2010).

O diagnóstico por cintilografia é uma modalidade da Medicina Nuclear que emprega técnica

de imageamento molecular com o uso de radiofármacos. O imageamento molecular permite a

visualização, caracterização e quantificação de processos biológicos em nível celular e

molecular em organismos vivos. Essa técnica diagnóstica apresenta vantagens sobre outros

métodos, pois é capaz de caracterizar tecidos doentes sem a necessidade de procedimentos


anatômicas. A cintilografia permite a visualização de uma imagem de corpo inteiro,

evidenciando assim, a localização das áreas afetadas (GOMES et al, 2011).

Os radiofármacos atualmente empregados no diagnóstico de infecções apresentam uma série

de limitações, pois muitos não são capazes de diferenciar processos sépticos de assépticos e,

de forma geral, não são capazes de identificar o agente responsável pela infecção.

Radiofármacos como 67

Ga-citrato, citocinas e quimiocinas marcadas, o 18

F-FDG, vitaminas e

99mTc-albumina nanocolóide não são específicos para infecção. Os leucócitos e peptídeos

antimicrobianos marcados são específicos para a infecção, mas não são capazes de identificar

20

o agente responsável pela infecção. Imagens tardias (24 h) de leucócitos radiomarcados são

capazes de diferenciar infecção de inflamação e ainda são consideradas o padrão ouro em

medicina nuclear para o diagnóstico de infecções, mas a preparação do radiofármaco é

laboriosa e requer a manipulação de sangue potencialmente contaminado. Os antibióticos e

agentes antifúngicos marcados são potencialmente capazes de identificar o agente responsável

pela infecção, mas a especificidade desses radiofármacos tem sido amplamente discutida e os

resultados tem se apresentado controversos (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).

Aptâmeros são oligonucleotídeos que apresentam alta afinidade e especificidade para seus

alvos moleculares e vem se apresentado como uma classe de moléculas promissoras para o

desenvolvimento de radiofármacos (CIBIEL et al, 2012). Aptâmeros radiomarcados,

específicos para os agentes infecciosos, poderiam dar uma contribuição significativa para o

diagnóstico de infecções através da cintilografia. Neste estudo, aptâmeros selecionados para

S. aureus foram marcados com 99m

Tc e utilizados para identificação desta bactéria em ensaios

in vitro e in vivo.

A proposta do presente projeto, de utilização de aptâmeros radiomarcados para a identificação

por cintilografia de infecções bacterianas, é inédita. Embora os aptâmeros estejam sendo

intensamente pesquisados para utilização como radiofármacos, a utilização destes para

detecção de focos de infecção é original, não existindo na literatura trabalhos nesta direção.

21

2- OBJETIVOS

2.1) Objetivo geral

-Avaliar aptâmeros marcados com 99m

Tc para a identificação de infecção causada por

S. aureus em modelo experimental;

2.2) Objetivos específicos

-Marcar os aptâmeros com 32

P e avaliar a ligação destes as células de S. aureus;

-Marcar aptâmeros com 99m

Tc;

-Avaliar a estabilidade dos aptâmeros marcados com 99m

Tc em salina, plasma e

excesso de cisteína;

-Avaliar, em ensaios in vitro, a ligação dos aptâmeros marcados com 99m

Tc em células

de S. aureus;

-Avaliar a biodistribuição dos aptâmeros marcados com 9m

Tc após administração

intravenosa em camundongos Swiss com infecção experimental por S. aureus e

Candida albicans e inflamação experimental com zimosan.

-Obter imagens cintilográficas após a administração intravenosa dos aptâmeros

marcados com 9m

Tc em camundongos com infecção experimental por S. aureus e C.

albicans e inflamação experimental com zimosan.

-Avaliar o desenvolvimento da infecção e inflamação intramuscular por meio de

análises histológicas.

22

3- JUSTIFICATIVA

O diagnóstico precoce e específico de infecções bacterianas é essencial para a sobrevida dos

pacientes. Tendo em vista a dificuldade de diagnóstico de infecções ósseas e de próteses,

torna-se importante o desenvolvimento de novas técnicas diagnósticas. De acordo com dados

da literatura, as bactérias Gram-positivas são predominantes nas contaminações das próteses

articulares, em especial S. aureus, estando entre as bactérias mais prevalentes em infecções

pós-artroplastias de joelho e quadril (GEMMEL et al, 2012).

Revisões da literatura internacional revelam que 1 à 5% dos implantes de próteses articulares

tornam-se infectados. No entanto, implantes de próteses articulares, principalmente de quadril

e joelho, vêm se tornando cada vez mais frequente ao longo dos anos, devido ao aumento na

expectativa de vida da população. Além disso, a infecção é considerada a mais devastadora

das complicações dos implantes, resultando em sintomas dolorosos e persistentes, internações

prolongadas com longos períodos de antibioticoterapia, intervenções cirúrgicas repetidas e até

a perda definitiva do implante, com encurtamento do membro afetado, deformidades, e

eventualmente óbito. Os principais fatores de risco para tal complicação são: idade avançada,

imunossupressão, desnutrição, obesidade, diabetes melito, infecção pelo HIV em estágio

avançado, presença de foco infeccioso à distância e antecedente de artroscopia ou infecção em

artroplastia prévia. Além disso, tempo cirúrgico prolongado (superior a 150 minutos),

transfusão sanguínea e realização de artroplastia bilateral em um mesmo tempo cirúrgico são

outros fatores relacionados a maior ocorrência de infecção (LIMA & OLIVEIRA, 2010).

As próteses articulares podem ser infectadas através de três vias distintas: implantação direta,

hematogênica e reativação de infecção latente. A penetração de microrganismos durante a

cirurgia pode ocorrer a partir de fontes endógenas e exógenas. São exemplos a microbiota

cutânea do paciente e dos membros da equipe cirúrgica; o ambiente; e até implantes

contaminados. As bacteremias, a partir de focos à distância, podem gerar contaminação da

prótese por via hematogênica. Os focos mais frequentemente relatados na literatura mundial

são: trato respiratório, cutâneo, urinário, dentário e gastrointestinal (LIMA & OLIVEIRA,

2010).

A diferenciação entre próteses perdidas por mecanismos assépticos e sépticos é importante

para que se possa direcionar o tratamento correto e ainda é um desafio pela dificuldade no

diagnóstico.

23

Dentre as técnicas de diagnóstico por imagens disponíveis, a radiografia simples não

apresenta sensibilidade nem especificidade. A tomografia computadorizada e a ressonância

magnética apresentam limitações com a produção de artefatos devido a presença do implante

metálico. Já cintilografia não apresenta essas limitações, sendo a melhor opção para

diagnóstico de infecções prostéticas desde que radiofármacos específicos estejam disponíveis

(TRAMPUZ & ZIMMERLI, 2005). O diagnóstico por cintilografia apresenta a vantagem de

ser um procedimento não invasivo e é capaz de realizar um diagnóstico precoce, pois permite

a caracterização e quantificação de processos biológicos em nível celular e molecular em

organismos vivos (GOMES et al, 2011).

Dentre os radiofármacos atualmente disponíveis para o diagnóstico de infecções, muitos não

são específicos, indicando apenas um aumento na permeabilidade vascular. Alguns são

específicos como leucócitos e peptídeos antimicrobianos marcados, mas não são capazes de

identificar o agente responsável pela infecção. A diferenciação entre infecção bacteriana e

fúngica é também importante visto que drogas diferentes, antibióticos ou antifúngicos, são

utilizadas, respectivamente, em cada caso.

Os aptâmeros poderiam ser utilizados para o diagnóstico de infecções por cintilografia, pois

são altamente específicos para os seus alvos. A especificidade e afinidade dos aptâmeros são

comparáveis aos anticorpos monoclonais além de apresentarem vantagens adicionais como

serem produzidos rapidamente em condições in vitro, serem facilmente modificado para

adicionar propriedades desejáveis como a incorporação de bioconjugados (ex: metais

radioativos, biotina, drogas) ou alterações que interferem em sua estabilidade e

biodistribuição. Os aptâmeros são ainda estáveis à temperatura ambiente, não são

imunogênicos e circulam livremente pelo sangue apresentando rápida depuração plasmática.

Pelo fato dos aptâmeros apresentarem as características de alta afinidade e especificidade para

seus alvos, radiofármacos baseados em aptâmeros podem levar a imagens mais definidas e

consequentemente contribuir para um diagnóstico precoce (YOU et al, 2003; MISSAILIDIS

& PERKINS, 2007).

24

4- REFERENCIAL TEÓRICO

4.1) Staphylococcus aureus

O Staphylococcus aureus é uma bactéria Gram-positiva do grupo dos cocos com

aproximadamente 0,5 a 1,5µm de diâmetro, imóveis, não-esporulados, geralmente não-

encapsulados e catalase positivos. Essa bactéria pode apresentar diversas formas, que vão

desde cocos isolados, aos pares, em cadeias curtas ou agrupamentos irregulares (com aspecto

de cacho de uvas) (Figura 1). O S. aureus pertence à família Micrococcae e o gênero

Staphylococcus possui 33 espécies, sendo que S. aureus é a espécie de maior importância

médica, pois está frequentemente associada com diversas infecções em seres humanos. As

linhagens de S. aureus crescem em meios comuns, caldo ou ágar simples, pH 7, à temperatura

ótima de 37°C (SANTOS et al, 2007).

O S. aureus é encontrado naturalmente na pele e nas fossas nasais de pessoas saudáveis.

Entretanto, pode provocar um amplo espectro de doenças que vão desde infecções simples

(espinhas, furúnculos e celulites) até infecções potencialmente letais como endocardite,

septicemia, pneumonia, meningite, síndrome do choque tóxico e osteomielite (SANTOS et al,

2007). Essa bactéria está entre as mais prevalentes em infecções pós-artroplastias de joelho e

quadril (MUNHOZ et al 2004; GEMMEL et al, 2012). As bactérias Gram-positivas

correspondem a 65% dos casos de infecções de próteses de joelho e quadril (Figura 2A)

(GEMMEL et al, 2012 ). As próteses atualmente são formadas de combinações de metais

Figura 1: Staphylococcus aureus em imagem de microscopia convencional. Coloração de

gram em aumento de 1000x. (Fonte: Trinidad Sabalete ©) Disponível em: http://fundacionio.org/img/bacteriology/cont/Staphylococcus_aureus.html

25

(cobalto-crômio ou titânio) e plástico (polietileno) e quando implantadas são cercadas por

osso e membrana de tecido fibroso. Em caso de infecção essa membrana se torna espessa e o

microrganismo forma um biofilme que permanece protegido da ação de antibióticos e do

sistema imune (Figura 2B).

A)

B)

O S. aureus corresponde a 75% dos casos de infecções de próteses perioperatórias, em que

ocorre a inoculação do microrganismo durante a cirurgia de implantação e corresponde a 50%

dos casos de infecção por via hematógena, em que o microrganismo invade a prótese estéril

por um processo de bacteremia. As infecções ósseas e de próteses caracterizam-se pela

dificuldade de tratamento que pode incluir intervenções cirúrgicas e longos períodos de

antibioticoterapia (GEMMEL et al, 2012 ).

A distribuição desse microrganismo é ampla devido à capacidade de resistência à dessecação

e ao frio, podendo permanecer viável por longos períodos em partículas de poeira. O

S. aureus encontrado na pele ou fossas nasais pode, a partir desses sítios, alcançar outras

regiões da pele e mucosas e caso essas barreiras estejam comprometidas por trauma ou

cirurgia, essa bactéria pode alojar no tecido e provocar uma infecção. A colonização nasal é

assintomática e o indivíduo não desenvolve infecção, mas pode ser veículo de transferência da

bactéria no mecanismo de infecções por contato (SANTOS et al, 2007). Assim, em hospitais,

o hospedeiro assintomático pode ser um paciente, um visitante ou um profissional de saúde,

trazendo riscos para outros pacientes e em especial aos pacientes que fazem diálise,

queimados, diabéticos, HIV positivos, imunossuprimidos e com intervenções cirúrgicas

Figura 2: Causas comuns de infecções associadas a prótese. A) Principais agentes de infecções de

próteses de joelho e quadril. B) Formação do biofilme. (Fonte: Adaptado de GEMMEL et al, 2012)

26

recentes (LOWY, 1998). O S. aureus é o agente mais comum em infecções de pele e tecidos

moles, sendo frequentemente isolado em feridas cirúrgicas infectadas que podem ser focos

para o desenvolvimento de infecções sistêmicas (ROBERT & CHAMBERS, 2005).

As doenças provocadas por S. aureus podem ser decorrentes da invasão direta dos tecidos, de

bacteremia primária ou, exclusivamente, ser devidas as toxinas que a bactéria produz. A

bacteremia pode causar infecções em sítios anatômicos distantes, como endocardites,

osteomielites, abscessos metastáticos em tecidos subcutâneos, pulmões, fígado, rins e cérebro.

A relação de S. aureus com infecções ósseas é devido à produção de adesinas que são

proteínas que permitem a adesão aos componentes da matriz óssea. Além disso, o S. aureus

pode formar biofilmes, na superfície de materiais estranhos ao organismo como cateteres

endovenosos e próteses (Figura 3). As toxinas estafilocócicas são responsáveis pela necrose

epidérmica tóxica (síndrome da pele escaldada) e pela síndrome do choque tóxico. As

enterotoxinas produzidas por S. aureus são responsáveis pelas intoxicações alimentares

(SANTOS et al, 2007; DINGES et al, 2000).

A capacidade de colonização e a patogenicidade de S. aureus são consequências de seus

fatores de virulência que são classificados em 3 categorias: a) fatores relacionados com a

aderência às células do hospedeiro ou à matriz extracelular; b) fatores relacionados com a

evasão da defesa do hospedeiro, como diversas enterotoxinas, toxina da síndrome do choque

tóxico (TSST-1), proteína A, lipases e cápsula; c) fatores relacionados a invasão na célula e

penetração nos tecidos ou adesão a superfícies de cateteres e próteses incluindo toxinas α, β, γ

e δ-hemolisinas (SANTOS et al, 2007) .

Figura 3: Biofilme de S. aureus em infecção de prótese. Setas indicam células

aderidas a superfícies do metal. Micrografia eletrônica (25000x) com barra de

escala 1 µm. (Fonte: TRAMPUZ & ZIMMERLI, 2005).

27

Dessa forma, devido à patogenicidade de S. aureus, a identificação rápida e precisa da

infecção é crucial para o sucesso do tratamento. A erradicação incompleta destes focos pode

provocar reincidência após a interrupção do tratamento, aumentando as taxas de mortalidade.

O diagnóstico destes focos infecciosos é geralmente difícil devido à ausência de sintomas ou

sinais (FIDEL et al, 2010).

O diagnóstico correto é essencial para evitar o uso indiscriminado de antibióticos que podem

levar a seleção de linhagens resistentes de S. aureus como pôde ser observado ao longo das

últimas décadas (LEVY, 2000).

O diagnóstico tardio de infecções associados a linhagens resistentes levam ao aumento do

tempo de hospitalização requerendo um alto custo de internação quando comparado a um

tratamento de uma infecção precoce (SYDNOR & PERL, 2011).

Portanto, é essencial o diagnóstico correto e precoce para que o tratamento seja específico e

eficaz. Para que isto ocorra é imprescindível a pesquisa de novas técnicas diagnósticas.

4.2) Diagnóstico por Cintilografia

O diagnóstico por cintilografia é uma modalidade da Medicina Nuclear que emprega técnica

de imageamento molecular com o uso de radiofármacos. O imageamento molecular permite a

visualização, caracterização e quantificação de processos biológicos em nível celular e

molecular em organismos vivos (GOMES et al, 2011). A maior vantagem do imageamento

molecular é a habilidade de caracterizar tecidos doentes sem a necessidade de procedimentos


anatômicas.

A tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT) é uma técnica sensível

de imageamento nuclear que fornece uma distribuição espacial 3D de radionuclídeos

emissores de fóton único dentro do corpo do paciente. A detecção dos raios gama é feita com

o uso de uma gama câmara que consiste de um cristal de cintilação, opticamente acoplado a

um conjunto de tubos fotomultiplicadores, que converte os raios gama em sinais elétricos.

Várias imagens em 2D, também chamados de projeções, são adquiridas a partir de múltiplos

ângulos ao redor do paciente, e subsequentemente reconstruídas para gerar imagens

transversais da distribuição interna das moléculas injetadas. O SPECT detecta os raios gama

diretamente no local de acumulação dos traçadores. A técnica SPECT utiliza radionuclídeos

com energias na faixa de 30 e 300 Kev. Os radionuclídeos comumente utilizados em SPECT

28

são 99m

Tc, 111

In, 131

I, 123

I, 67

Ga. O 99m

Tc é o mais utilizado deles devido suas propriedades

físicas (GOMES et al, 2011).

4.2.1) Tecnécio-99m (99m

Tc)

O 99m

Tc possui uma meia vida curta de 6h, sendo emissor gama puro com energia de 140

Kev, características que contribuem para níveis reduzidos de radiação ao paciente. Além

disso, o 99m

Tc é facilmente obtido em gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m que apresenta

um baixo custo de obtenção (Figura 4) (WELCH & REDVANLY, 2003).

O gerador Molibdênio-99/Tecnécio-99m consiste em uma coluna de alumina em que o 99

Mo

encontra-se adsorvido. O 99

Mo possui meia vida de 66 h decai por decaimento beta (β) em

99mTc (Figura 5). O

99mTc não possui afinidade pela coluna de alumina e então é eluído com

uma solução estéril de cloreto de sódio 0,9% na forma de pertecnetato de sódio (Na99m

TcO4).

Figura 5: Diagrama do decaimento do 99

Mo em 99m

Tc. (Fonte: MARQUES et al, 2001)

Figura 4: Gerador 99

Mo/99m

Tc. (Fonte: OLIVEIRA et al, 2006)

29

O tecnécio é um metal de transição da família VIIB com número atômico igual a 43. Não há

na natureza um isótopo de tecnécio estável. O estado ground do tecnécio, 99

Tc, possui meia

vida de 2,5 x105 anos. O tecnécio pode existir em 8 estados de oxidação (-1 a +7). Os

estados +7 e +4 são os estados mais estáveis e existem em óxidos, sulfetos, haletos e

pertecnetatos. Os estados de oxidação mais baixos (-1, +1, +2, +3) são estabilizados na

complexação com ligantes. O número de coordenação do complexo-99m

Tc pode variar de 4 a

9 (ZOLLE, 2007).

O tecnécio obtido no gerador na forma de íon pertecnetato (99m

TcO4- ) apresenta o estado de

oxidação igual a +7 e portanto, não é uma espécie reativa. Assim, é necessário reduzir o

estado de oxidação do tecnécio para que se possa combinar com uma variedade de grupos

doadores de elétrons como –COO-, -OH

-, -NH2

-, -SH, formando uma ligação covalente

coordenada. Vários agentes redutores podem ser empregados como cloreto estanoso, citrato

de estanho, tartarato de estanho, ácido clorídrico concentrado, sulfato ferroso. Dentre esses

agentes, o cloreto estanoso é o agente redutor mais comumente utilizado (ZOLLE, 2007). O

99mTc é reduzido no estado +4 por cloreto estanoso em meio concentrado de HCl, conforme a

equação abaixo:

O tecnécio reduzido, por sua vez, pode se ligar a molécula de interesse constituindo assim um

radiofármaco. Um radiofármaco é um composto radioativo que apresenta dois componentes:

um radionuclídeo e um fármaco. Pode ser utilizado em diagnóstico e tratamento de doenças.

Em medicina nuclear, 95% dos radiofármacos são usados em diagnóstico (ZOLLE, 2007). Os

radiofármacos possuem mínimo efeito farmacológico, pois é utilizado em quantidades traços,

sendo também chamados de radiotraçadores. Os radiofármacos administrados em humanos

devem ser estéreis e livre de pirogênios (SAHA, 2010).

4.2.2) Características ideais de um radiofármaco

Um radiofármaco ideal deve ser produzido facilmente, deve ser de baixo custo e prontamente

disponível em uma instalação de medicina nuclear. O radionuclídeo deve apresentar uma

baixa meia vida que não deve ser maior que o tempo necessário para a execução do estudo.

Além disso, o radionuclídeo com finalidade de diagnóstico não deve emitir partículas α e β,

pois essas partículas podem causar um dano maior ao tecido que a radiação gama. Um

299m

TcO4- +16H

+ +3Sn

+2 2

99mTc

+4 +3Sn

+4 +8H2O

30

radiofarmáco ideal deve ainda, apresentar uma alta relação alvo/não alvo, rápida depuração

plasmática e ter máxima eficácia no diagnóstico com mínima radiação ao paciente (SAHA,

2010).

4.3) Infecção x Inflamação - Técnicas diagnósticas por imagem

Inicialmente, uma inflamação não é sinônimo de infecção. A inflamação é uma resposta do

organismo a uma lesão, seja ela causada por bactérias, traumas, agentes químicos, calor ou

qualquer outro fenômeno. Já a infecção é causada estritamente por um patógeno (vírus,

bactérias, fungos, etc). Uma infecção é comumente acompanhada por uma inflamação aguda

que dura cerca de horas a dias, permanecendo até que seja eliminado o organismo patogênico

(SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).

A inflamação caracteriza-se por dilatação dos vasos sanguíneos locais; aumento da

permeabilidade dos capilares, permitindo a saída de grande quantidade de líquido para os

espaços intersticiais; migração de grande quantidade de granulócitos e monócitos para os

tecidos. Dentre os agentes causadores dessas reações estão a histamina, bradicinina,

serotonina, prostaglandinas, diversos produtos do sistema do complemento (GUYTON &

HALL, 2006).

Os macrófagos são a primeira linha de defesa inata contra a infecção e quando ativados pelos

produtos da infecção e da inflamação deixam de ser sésseis e se soltam de suas fixações e

passam a ser móveis, sendo então mobilizados aos locais necessários. A segunda linha de

defesa são os neutrófilos e dentro da primeira hora após o início da inflamação, grande

número de neutrófilos invadem a área inflamada. Os macrófagos ativados secretam

quimiocinas, como por exemplo, a interleucina-8 (IL-8) que tem o papel de recrutar células

para os locais da infecção. As quimiciocinas não atuam sozinhas no recrutamento celular. O

recrutamento de fagócitos ativados aos locais de infecção é mediado pelas moléculas de

adesão que são induzidas na superfície do endotélio dos vasos sanguíneos locais. Essas

moléculas de adesão por sua vez são induzidas pelas citocinas TNF-α. Entre os exemplos de

moléculas de adesão estão as selectinas e as moléculas de adesão intercelular (ICAMs) que

são induzidas no endotélio ativado promovendo a interação com o leucócito permitindo o

extravasamento destes do interior dos vasos para os locais de infecção. O processo de

migração dos leucócitos para o exterior dos vasos é chamado de diapedese (Figura 6)

(JANEWAY et al, 2002).

31

Os alvos para diagnóstico de infecção e inflamação são: a) os patógenos; b) macromoléculas

que acumulam nos tecidos inflamados; c) os leucócitos e granulócitos; d) células endoteliais

ativadas, citocinas e mediadores do processo (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).

Diversas técnicas podem ser utilizadas em diagnóstico por imagem de infecções. Técnicas

radiológicas de imagem como o ultrassom, tomografia computadorizada e ressonância

magnética possuem uma alta sensibilidade, mas uma baixa especificidade (SIGNORE &

GLAUDEMANS, 2011). Para o diagnóstico de infecções em próteses de joelho e quadril,

radiografias simples não são sensíveis nem específicas, não conseguindo diferenciar infecção

de inflamação. As técnicas de tomografia computadorizada e ressonância magnética em

diagnóstico de infecções de próteses de joelho e quadril têm valor limitado, pois ocorre a

formação de artefatos devido à presença dos implantes metálicos (GEMMEL et al, 2012).

As técnicas de medicina nuclear, ao contrário, permitem detectar alterações fisiopatológicas

precoces antes que haja alterações anatômicas, características importantes para o diagnóstico

de infecções, pois é crucial um diagnóstico precoce para a sobrevida dos pacientes. Além

Figura 6: Mecanismo da Resposta Inflamatória. A ativação de citocinas induzem a expressão

de moléculas de adesão no endotélio (selectinas e integrina-ICAM). Os neutrófilos se unem

então ao endotélio por intermédio das moléculas de adesão permitindo o extrasavamento

destes do interior dos vasos para os locais de infecção por diapedese. Os macrófagos ativados

secretam quimiocinas que tem o papel de recrutar células para os locais de infecção.

Disponível em: http://musclegeek.wordpress.com/2012/02/09/what-the-heck-is-inflammation-

and-how-does-it-affect-me/

http://musclegeek.wordpress.com/2012/02/09/what-the-heck-is-inflammation-and-how-does-it-affect-me/

http://musclegeek.wordpress.com/2012/02/09/what-the-heck-is-inflammation-and-how-does-it-affect-me/

32

disso, as técnicas de Medicina Nuclear permitem avaliar a eficácia da terapia, monitorando a

evolução de cura dos pacientes e possíveis reincidências (SIGNORE & GLAUDEMANS,

2011).

Mesmo com as vantagens das técnicas da Medicina Nuclear sobre as técnicas radiológicas no

diagnóstico de infecções, muitos dos radiofármacos utilizados atualmente não são capazes de

diferenciar processos sépticos de assépticos e, de forma geral, não são capazes de identificar o

agente responsável pela infecção. Assim, há a necessidade de desenvolvimento de novos

radiofarmácos específicos e capazes de diagnosticar o agente responsável, como bactérias e

fungos.

4.3.1) Radiofármacos atualmente utilizados em diagnóstico de infecção

4.3.1.1) 67

Ga-citrato

O 67

Ga-citrato se liga na forma iônica a transferrina plasmática que é uma glicoproteína que

transporta o íon ferro. Ele utiliza os receptores de transferrina (CD71) para acessar a célula e

depois se torna altamente estável dentro dela. O aumento do fluxo sanguíneo e da

permeabilidade vascular resulta no acúmulo de transferrina ligada ao 67

Ga. O 67

Ga também se

liga a lactoferrina que está presente em altas concentrações nos focos infecciosos. O

radiofármaco 67

Ga-citrato apresenta baixa especificidade, pois acumula tanto em áreas

inflamadas quanto infectadas e apresenta uma longa meia vida (78 h) e alta energia gama,

características desfavoráveis para a imagem cintilográfica além de causar um aumento da

dose absorvida pelo paciente. A melhor relação alvo/não alvo é obtida em 48-72h

(BEKERMAN et al, 1984).

4.3.1.2) Citocinas e Quimiocinas

Citocinas são proteínas e glicoproteínas com importante papel no controle homeostático do

sistema imune. Elas podem atuar de forma autócrina, afetando o comportamento das células

que liberam as citocinas, ou de forma parácrina, afetando o comportamento de células

adjacentes. As citocinas liberadas pelos macrófagos ativados são interleucina-1 (IL-1),

interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12), TNF-α e a quimiocina interleucina-8 (IL8). As

quimiocinas são uma classe de citocinas que apresentam propriedades quimioatraentes,

induzindo células com receptores apropriados a migrarem através do gradiente de quimiocina.

33

As quimiocinas são liberadas por fagócitos e atuam como quimioatraentes para leucócitos

recrutando-os para os locais de infecção.

Durante um processo infeccioso ou inflamatório ocorre um aumento na expressão de

citocinas. A IL-1 (pró-inflamatória) e a IL-8 marcadas com 123

I e 99m-

Tc, apresentaram rápida

depuração plasmática e alta afinidade por receptores específicos. Porém, não foram

específicas para a infecção, pois não distinguiram inflamação de infecção. A 123

I- IL-1

acumulou em áreas infectadas, porém, apresentou efeitos colaterais de cefaleia e hipotensão

mesmo em baixas doses, impedindo aplicações clínicas em seres humanos (BARRERA et al,

1998). Um receptor antagonista IL-1 radiomarcado (IL-1ra) foi desenvolvido com a mesma

afinidade para receptores IL-1, mas sem atividade biológica. Com o IL-1ra marcado com 123

I

pôde-se observar a captação em focos infecciosos, mas a captação foi similar aos agentes não

específicos marcados (VAN DER LAKEN et al, 1998).

4.3.1.3) Peptídeos antimicrobianos

Os peptídeos antimicrobianos são produzidos por fagócitos, células endoteliais e outros tipos

celulares, sendo um importante componente do sistema imune inato. A expressão desses

peptídeos é induzida em consequência ao contato com microrganismos ou com produtos da

atividade microbiana, como lipopolissacarídeos ou citocinas pró-inflamatória. Vários

peptídeos antimicrobianos têm sido investigado como radiofármacos como a lactoferrina

humana (hLF), fragmento do peptídeo ubiquicidina (UBI 29-41), peptídeo neutrofílico

humano (HNP 1-3), peptídeos bacteriófagos e peptídeos sintéticos (SIGNORE &

GLAUDEMANS, 2011).

O fragmento do peptídeo ubiquicidina (UBI 29-41) marcado com 99m

Tc ligou-se

preferencialmente, a bactérias e fungos em ensaios in vitro e acumulou em locais de infecção

em ensaios com animais experimentais, mostrando uma rápida depuração renal, mínima

excreção hepatobiliar e capacidade de detectar focos infecciosos em humanos. O agente foi

rapidamente eliminado, mas a captação nas lesões infecciosas e a relação alvo/não alvo foram

baixas (MENDELEZ et al, 2004).

4.3.1.4) Vitaminas

As avidinas são uma família de proteínas presentes nos ovos de aves, anfíbios e répteis. A

biotina (vitamina B7) é um composto de baixo peso molecular que se liga a avidina com alta

afinidade. A avidina/111

In-biotina é um radiofármaco não específico que se acumula em locais

34

com aumento da permeabilidade vascular. A avidina é injetada previamente e após 4 h a

biotina marcada é injetada por injeção intravenosa. A biotina irá, portanto se ligar a avidina

nos locais onde houve acúmulo devido ao aumento da permeabilidade vascular. O

radiofármaco avidina/111

In-biotina é rapidamente eliminado pelos rins e apresenta baixa

captação em tecidos normais. A relação alvo/não alvo é boa e podem-se obter imagens em

menor tempo, mas não é um radiofármaco específico para infecção (RUSCKOWSKI et al,

1992).

4.3.1.5) Anticorpos monoclonais (mAbs) antigranulócitos

A utilização de mAbs para receptores de superfície em granulócitos permite o estudo direto

dessas células in vivo. No entanto, estudos têm demonstrado que somente a menor

porcentagem do anticorpo injetado realmente liga diretamente às células. A maior parte

concentra na área infectada por ligações não específicas como resultado do aumento da

permeabilidade (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).

Resultados controversos foram obtidos utilizando 99m

Tc-suleomab (LeukoScan®). BECKER

et al (1994), obteve uma cintilografia com o uso de LeukoScan® que mostrou rápida

localização em infecções ósseas e de tecidos moles. Em outros estudos, no entanto, foram

apurados menor especificidade para diagnóstico de infecções músculo-esqueléticas que o

imageamento com leucócitos marcados (GRATZ et al, 2003). HARWOOD et al (1999),

realizaram um estudo com pacientes diabéticos com úlceras no pé, no qual o 99m

Tc-suleomab

mostrou alta sensibilidade (91%), mas baixa especificidade (56%).

O 99m

Tc-besilesomab (Scintimun®) têm sido utilizado no estudo de endocardite, abscesso

pulmonar, infecção em pé diabético e em infecções de prótese de joelho e quadril. Infecções

ósseas periféricas podem ser visualizadas, mas a sensibilidade diminui quando a infecção é

localizada próxima a coluna, por causa da absorção fisiológica da medula (PELTIER et al,

1993). Assim, o 99m

Tc-besilesomab é menos adequado para diagnóstico de osteomielite

vertebral. Para doenças inflamatórias na medula esse método é menos acurado que leucócitos

radiomarcados devido a captação não específica da medula.

4.3.1.6) Imunoglobulina G policlonal humana

A Imunoglobulina G policlonal humana (HIG) é um anticorpo IgG específico não antigênico

que pode ser marcado com 99m

Tc ou 111

In por Kits diagnósticos comercialmente disponíveis.

O mecanismo da captação em áreas infectadas não está completamente elucidado, uma vez

35

que se acumula em focos de infecção ao acaso. O acúmulo parece ser principalmente,

resultado do aumento da permeabilidade vascular, não sendo assim, específico para infecção


4.3.1.7) 99m

Tc-albumina nanocolóide

Nanocolóides são partículas pequenas de 30-80 nm de diâmetro derivados da albumina. Após

entrarem nas áreas infectadas por extravasamento nos tecidos, eles acumulam por fagocitose

no interior dos macrófagos no sistema reticulo-endotelial. Os nanocolóides são caracterizados

por rápida depuração sanguínea e uma relação alvo/não alvo satisfatória. É facilmente

produzido e de baixo custo, mas não é específico para infecção (LIBERATORE et al, 1992).

4.3.1.8) 18

F-Fluoro-desoxi-glicose (18

F-FDG)

O 18

F-FDG é um análogo da glicose que apresenta o 18

F no lugar do grupo hidroxila do

carbono 2. O 18

F-FDG é fosforilado, pela hexoquinase, e então é transportado para dentro da

célula. Entretanto, em contraste com a glicose, o metabolismo não prossegue além da

fosforilação, devido ao grupo (-OH) ser indispensável na etapa seguinte. Assim, o 18

F-FDG-

6P acumula na célula proporcionalmente a atividade glicolítica, evidenciando o metabolismo

celular. O 18

F-FDG é comumente utilizado em diagnóstico tumoral, pois as áreas neoplásicas

habitualmente têm um metabolismo mais intenso (WELCH & REDVANLY, 2003).

No entanto, o 18

F-FDG pode ser utilizado em diagnóstico de infecção devido à alta absorção

por granulócitos ativados. O 18

F tem uma meia vida de 110 minutos e, portanto é adequado

para imagem após 60 minutos de injeção. Contudo, o 18

F-FDG não é um traçador específico

porque ele evidencia alta atividade glicolítica de qualquer célula e pode, portanto fornecer

resultados falso-positivos. Outra desvantagem é o alto custo e disponibilidade limitada


4.3.1.9) Antibióticos radiomarcados

Antibióticos radiomarcados apresentam a vantagem de serem radiofármacos específicos para

infecção, pois o alvo desses radiofármacos são bactérias e assim poderiam diferenciar

infecção bacteriana de inflamação estéril.

O agente mais utilizado é o 99m

Tc-ciprofloxacina (Infecton ®), sendo um antibiótico de amplo

espectro do grupo das fluoroquinolonas. Esse antibiótico se aplica tanto para bactérias Gram-

positivas quanto Gram-negativas inibindo a síntese de DNA pela ligação à DNA girase. A

36

99mTc-ciprofloxacina é excretada pelos rins e possui baixa absorção intestinal. Em um estudo

coordenado pela Agência Internacional de Energia Atômica (IAEA), a 99m

Tc-ciprofloxacina

mostrou ser bastante sensível e específica a infecções (BRITTON et al, 2002). Alguns anos

depois, sua especificidade foi extensivamente discutida, pois sua capacidade de discriminar

infecção de doença asséptica foi duvidosa (SOLANKI et al, 2003). Em geral, não há provas

convincentes de sua eficácia.

Outros antibióticos têm sido marcados com 99m

Tc, como alafosfalina, cefoperzaona,

ceftizoxima, ceftriaxona, enrofloxacina, pefloxacina, norfloxacina, canamicina, maioria da

classe das quinolonas (SIGNORE & GLAUDEMANS, 2011).

4.3.1.10) Agentes antifúngicos radiomarcados

Seguindo a mesma abordagem de antibióticos marcados, novos traçadores têm sido propostos

para a visualização específica de infecções fúngicas. O fluconazol marcado com 99m

Tc se liga

ao citocromo P450 fúngico, foi desenvolvido para a detecção de C. albicans e Aspergillus

fumigatus em camundongos. Ele acumula preferencialmente em infecções por C. albicans,

enquanto que a acumulação em bactérias, A. fumigatus e inflamação estéril foi

significativamente menor em estudos in vivo (LUPETTI et al, 2002).

A quitinase é uma enzima que hidrolisa a ligação glicosídica da quitina. Essa enzima foi

marcada com 123

I para a detecção de células fúngicas. A captação parece estar correlacionada

com o número de células viáveis, mas os radioligantes foram desalogenados, resultando em

alta captação da tireóide e estômago (GEMMEL et al, 2009).

4.3.1.11) Leucócitos radiomarcados

Leucócitos radiomarcados ainda são considerados o padrão ouro em medicina nuclear para o

diagnóstico de infecções e inflamação aguda. Pertencendo ao grupo de leucócitos estão os

neutrófilos correspondendo a 59% do grupo, linfócitos (34%), monócitos (4%), eosinófilos

(3%) e basófilos (0,5%).

A técnica de marcação ex vivo de leucócitos radiomarcados com 99m

Tc foi desenvolvida em

1976. Uma amostra de sangue de 50 mL é coletada do paciente e os leucócitos são separados

das células vermelhas em condições in vitro. Esses leucócitos são então marcados com 99m

Tc-

exametazina (HMPAO) ou com 111

In-oxina e são reinjetados no paciente. Os leucócitos

radiomarcados são caracterizados por alta especificidade, pois só acumulam em consequência

37

da migração ativa em áreas inflamadas e permanecem no local em casos de infecção


Imagens tardias (24 h) de leucócitos radiomarcados aumentam a acurácia do diagnóstico,

sendo possível a diferenciação de infecção de inflamação asséptica. O 111

In é indicado para

imagens tardias por apresentar uma meia vida mais longa de 67 h e energia de 173 e 247 Kev,

enquanto o 99m

Tc apresenta uma meia vida curta de 6 h com energia de 140 Kev (DATZ,

1994).

A imagem feita após 24 h da injeção de leucócitos marcados com 111

In-oxina possui uma

sensibilidade para infecção de 95%, enquanto que em imagens de 4 h a sensibilidade é de

33%. A captação é mais intensa em imagens de 24 h do que em imagens de 4 h (DATZ,

1994).

Infecções crônicas apresentam um infiltrado de células mononucleares como macrófagos e

linfócitos. Vários estudos demonstram que a sensibilidade do diagnóstico de leucócitos

marcados diminui para infecções crônicas. Entretanto, em um estudo feito por DATZ &

THORNE (1986), com 155 pacientes, sendo que 89 apresentavam infecção crônica (mais de

duas semanas) a sensibilidade foi de 90% para infecções agudas e 86% para infecções

crônicas. Portanto, essas diferenças não são estatisticamente significativas.

Em diagnóstico de infecções de prótese de joelho e quadril, LARIKKA et al (2001) mostrou

que a sensibilidade e a especificidade aumentam em imagens tardias com leucócitos marcados

com 99m

Tc, conforme os dados da tabela abaixo:

Tabela 1: Sensibilidade e Especificidade em diagnóstico de próteses de joelho e quadril

utilizando imagens de leucócitos marcados com 99m

Tc.

Imagem de 4 h Imagem tardia (24 h)

Prótese Quadril Joelho Quadril Joelho

Sensibilidade 50% 87% 83% 100%

Especificidade 90% 77% 100% 82%

38

Além de ocorrer um aumento na especificidade e sensibilidade, a imagem apresenta maior

reprodutibilidade em imagens tardias no diagnóstico de infecções de prótese de joelho e

quadril, conforme pode ser observado na Figura 7.

Apesar da acurácia no diagnóstico com a utilização de leucócitos radiomarcados, a preparação

do radiofármaco é laboriosa, devendo ser realizada em condições estéreis, envolvendo um

procedimento complicado e demorado que leva aproximadamente 3 h de preparo por

profissionais treinados. Além disso, a manipulação de sangue potencialmente contaminado

pode ser perigosa para técnicos envolvidos no preparo e pacientes.

4.3.2) Considerações

Muitos dos radiofármacos atualmente disponíveis para o diagnóstico de imagem de infecções

não são específicos para a infecção, como 67

Ga-citrato, citocinas e quimiocinas marcadas,

18F-FDG, vitaminas e

99mTc-albumina nanocolóide.

Os leucócitos e peptídeos antimicrobianos marcados são específicos para a infecção, mas não

são capazes de identificar o agente responsável pela infecção. Os antibióticos e agentes

antifúngicos marcados são capazes de identificar o agente responsável pela infecção, mas essa

classe de radiofármacos apresenta ainda controvérsias no diagnóstico, pois a especificidade

desses radiofármacos é amplamente discutida. Portanto, a pesquisa de novos radiofármacos

capazes de diferenciar infecção de inflamação e de identificar o microrganismo causador da

infecção é uma necessidade premente. Aptâmeros poderiam dar uma contribuição

significativa para o diagnóstico de infecções, devido as suas características de alta

Figura 7: Prótese direita de quadril infectada. Imagens de leucócitos

marcados com 99m

Tc nos tempos de 4 h (esquerda) e 24 h (direita). Setas

indicam a captação de leucócitos que pode ser melhor visualizada na

imagem de 24 h. (Fonte: GEMMEL et al, 2012).

39

especificidade para o seu alvo, podendo assim diagnosticar uma infecção bacteriana

específica, como a identificação de infecções causadas por S.aureus proposta neste projeto.

4.4) Aptâmeros

Aptâmeros são oligonucleotídeos que apresentam alta especificidade e afinidade para uma

determinada molécula alvo. O nome (do inglês, “aptamers”) deriva do latim “aptus”, ou seja,

apto para ligar-se (ELLINGTON & SZOSTAK, 1990). Eles podem se ligar a uma série de

moléculas alvo como proteínas, peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, drogas, vitaminas,

compostos orgânicos e inorgânicos (YOU et al, 2003). Os aptâmeros podem ser de DNA fita

simples (ssDNA), RNA ou bases modificadas contendo entre 50-100 bases (FERREIRA &

MISSAILIDIS, 2007). Eles formam estruturas tridimensionais caracterizados por lopps,

grampos (do inglês hairpins), triplexos, G-quadruplexos, pseudoknots, caules (do inglês

stems), protuberâncias (do inglês bulges) (Figura 8). Baseados em suas estruturas

tridimensionais, os aptâmeros podem se ligar apropriadamente a uma variedade de alvos. A

ligação do aptâmero ao alvo resulta de compatibilidade estrutural, empilhamento de anéis

aromáticos, interações eletrostáticas e de Van de Waals, ligações de hidrogênio ou a

combinação desses efeitos (STOLTENBURG et al, 2007).

Figura 8: Estruturas de aptâmeros. A) grampo; B) pseudoknot; C) G-quadruplexo;

D) Representação tridimensional do aptâmeros anti-malachita complexado com

seu ligante representado em verde. (Fonte: RANDOM et al, 2013).

40

A afinidade e especificidade dos aptâmeros são comparáveis aos anticorpos monoclonais e

podem ser gerados para uma grande variedade de alvos, incluindo compostos tóxicos e

moléculas não imunogênicas, para as quais anticorpos não podem ser gerados. Além disso, os

aptâmeros são de dez a cem vezes menores que os anticorpos e não são imunogênicos,

características importantes para o desenvolvimento de agentes diagnósticos e terapêuticos

(JAYASENA, 1999; MISSAILIDIS & HARDY, 2009).

O conceito de seleção in vitro de ácidos nucléicos como ligantes a alvos moleculares é

creditado a três grupos de pesquisadores diferentes que publicaram seus achados em 1990.

ROBERTSON & JOYCE (1990) publicaram seus resultados mostrando que é possível mutar

e selecionar a ribozima de Tetrahymena para ter a capacidade de clivar uma sequência de

ssDNA. Após vários ciclos de mutação e amplificação, eles identificaram a primeira

sequência de RNA gerada in vitro capaz de clivar uma molécula de DNA específica

(ROBERTSON & JOYCE, 1990). Após essa publicação, TUERK & GOLD (1990)

publicaram seus dados, mostrando que randomizando oito nucleotídeos de RNA em “stem-

loop” conhecidos por se ligarem a polimerase T4 de bacteriófago, e realizando a seleção para

a ligação nesta proteína, obteve-se em uma sequência de RNA com afinidade aumentada. Esta

foi a primeira publicação que introduziu o termo SELEX (Systematic Evolution of Ligands by

Exponential Enrichment) (TUERK & GOLD, 1990). Ao mesmo tempo, ELLINGTON E

SZOSTAK (1990) publicaram seus dados com a seleção in vitro de RNA que se ligava a

corantes orgânicos. Ao contrário dos outros grupos, esse trabalho envolveu o uso de uma

biblioteca de RNA completamente aleatória como ponto de partida, que não era baseada em

nenhuma sequência conhecida (ELLINGTON & SZOSTAK, 1990). Essa abordagem é o que

várias pessoas conhecem como seleção in vitro e o grupo introduziu o termo aptâmero para o

produto dessa seleção. Com esses resultados ficou claro que a técnica SELEX e os aptâmeros

apresentavam grande potencial e uma ampla gama de aplicações (BUNKA et al, 2010).

4.4.1) A Técnica SELEX

Os aptâmeros são obtidos através da técnica SELEX (do inglês “Systematic Evolution of

Ligands by Exponential Enrichment”) (TUERK & GOLD, 1990). A SELEX se inicia com a

obtenção de uma biblioteca de sequências de fita simples de nucleotídeos aleatórios (DNA ou

RNA) como uma diversidade entre 1014

a 1015

sequências diferentes. A biblioteca é

constituída por oligonucleotídeos contendo uma região aleatória (20-80 nucleotídeos)

flanqueada por uma região conservada. A região conservada permite a ligação de iniciadores

41

específicos para uma reação de PCR (do inglês “Polimerase Chain Reaction”)

(STOLTENBURG et al, 2007; BANERJEE & NILSEN-HAMILTON, 2013).

O pool de oligonucleotídeos é incubado com uma molécula alvo na presença de um tampão de

escolha. Durante a incubação uma pequena fração de moléculas tende a se ligar ao alvo. Os

oligonucleotídeos que se ligaram devem ser selecionados do restante da biblioteca através de

uma técnica padrão de separação física. Durante os últimos anos vários autores descreveram

diferentes métodos de separação como eletroforese capilar (MENDONSA & BOWSER,

2004; TANG et al, 2006), citometria de fluxo (DAVIS et al, 1997), centrifugação (RHIE et

al, 2003; HOMANN & GORINGER, 1999), cromatografia de afinidade com a imobilização

do alvo em sepharose ou agarose (LIU & STORMO, 2005; TOMBELLI et al, 2005),

ultrafiltração com filtros de nitrocelulose (BIANCHINI et al, 2001, TUERK & GOLD, 1990).

Após esta etapa, a separação do complexo alvo-aptâmero pode ser feita por diferentes

métodos, como tratamento com calor (STOLTENBURG et al, 2005), adição de uréia, SDS ou

EDTA (BIANCHINI et al, 2001; THEIS et al 2004; WEISS et al, 1997), eluição com ligantes

competidores (BRIDONNEAU et al, 1999). Para a quantificação dos oligonucleotídeos

enriquecidos pode ser utilizado isótopos radioativos (ELLINGTON & SZOSTAK, 1990; SHI

et al, 2002) ou marcadores fluorescentes (STOLTENBURG et al, 2005; RHIE et al, 2003).

A população de sequências de oligonucleotídeos que se ligaram ao alvo é isolada e

amplificada por PCR para a obtenção de uma nova biblioteca. Esta biblioteca estará

enriquecida com sequências mais aptas para ligação na molécula alvo. Após a reação de PCR

o pool enriquecido está na forma de DNA fita dupla (dsDNA). Se a biblioteca é de RNA deve

ser utilizado a RNA polimerase T7 para a transcrição do dsDNA em RNA. Se a biblioteca é

de DNA pode ser utilizado diferentes métodos como a estreptavidina/biotina em que a biotina

é adicionada a fita não desejada e em seguida utiliza-se a eletroforese para distinguir ambas as

fitas. Outro método é a utilização de primers com modificações na fita indesejada para criar

diferenças de tamanho entre as fitas. Pode ser utilizado um primer com a adição de uma ribose

na ponta 3´(riboU) ou um primer com um espaçador de hexaetilenoglicol (HEGL) e uma

cauda poli A. A diferença de tamanho é visível em eletroforese e então a banda desejada é

cortada e processada (STOLTENBURG et al, 2007).

O pool enriquecido é incubado novamente com o alvo havendo assim, outros ciclos de seleção

e amplificação até que se obtenha um ligante específico de alta afinidade. Para a maioria dos

alvos, o enriquecimento é obtido entre 8 a 15 ciclos (Figura 9). Quando o ponto de saturação

42

for atingido, ou seja, a realização de novos ciclos de seleção e amplificação não aumenta a

afinidade, os aptâmeros obtidos devem ser clonados em vetores bacterianos e sequenciados

para posterior caracterização (TUERK & GOLD, 1990; MISSAILIDIS & PERKINS 2007).

As sequências individuais são então pesquisadas para se determinar a habilidade de se ligar à

molécula alvo. Normalmente, cinquenta ou mais sequências de aptâmeros podem ser

analisadas por alinhamentos de sequência em programas na internet como o CLUSTAL W.

Esta técnica permite identificar sequências homólogas separando os aptâmeros em grupos.

Padrões de sequência e regiões altamente conservadas são indicativos de locais envolvidos na

ligação com o alvo. A análise da estrutura secundária também fornece informações relevantes

e podem ser obtidas utilizando o programa mfold que também pode ser acessado pela internet.

O programa pode determinar que regiões consenso estão normalmente localizadas em stem-

loops, G-quadruplexos, psedoknots (STOLTENBURG et al, 2007).

Uma vez identificada uma sequência de interesse esta poderá ser sintetizada quimicamente.

Após a síntese, estudos de ligação para a determinação da especificidade e afinidade do

aptâmero devem ser feitos e a determinação do Kd (constante de dissociação) é primordial.

A afinidade dos oligonucleotídeos para os seus alvos podem ser influenciados pela

estringência das condições selecionadas. A estringência é aumentada progressivamente no

curso do processo SELEX. Além disso, pode ser atingida reduzindo a concentração do alvo

Figura 9: Esquema da metodologia SELEX. (Fonte: Modificado de LEE et al, 2010).

43

nos últimos ciclos da SELEX ou modificando as condições de ligação e lavagem (composição

do tampão, volume e tempo de incubação). Os aptâmeros selecionados podem ser submetidos

a modificações pós-SELEX com a finalidade de aumentar a estabilidade (STOLTENBURG et

al, 2007).

A técnica SELEX apresenta particularidades quando é feita a partir de uma biblioteca de

RNA. O processo de amplificação envolve a transcrição reversa de sequências de RNA em

DNA seguidas de PCR (RT-PCR). Um primer na ponta 5´seguido da sequência do promotor

T7 e um primer reverso é necessário para converter a biblioteca de ssDNA em biblioteca de

dsDNA por PCR. O DNA fita dupla (dsDNA) gerado é então submetido a transcrição in vitro

pela RNA polimerase T7 que regenera o RNA original em grande quantidade (Figura 10)

(YOU et al, 2003).

Figura 10: Diagrama da metodologia SELEX.

44

4.4.2) Alvos para SELEX

No processo da SELEX podem ser utilizados diferentes tipos de alvos como moléculas

orgânicas e inorgânicas, peptídeos, proteínas, carboidratos, antibióticos, alvos complexos

como mistura de alvos, células inteiras e organismos (STOLTENBURG et al, 2007).

Em uma revisão da literatura STOLTENBURG et al (2007) relata os alvos já descritos para a

obtenção de aptâmeros. Dentre os alvos já utilizados têm-se como exemplo, compostos

inorgânicos como Zn+2

e Ni+2

(CIESIOLKA et al, 1995 ; HOFMANN et al, 1997), pequenas

moléculas orgânicas como corantes orgânicos e dopamina (ELLINGTON & SZOSTAK,

1990; MANNIRONI et al, 1997), nucleotídeos e derivados como adenina, ATP e cAMP

(MELI et al, 2002; SASSANFAR & SZOSTAK, 1993; SAZANI et al 2004; KOIZUMI &

BREAKER, 2000), cofatores como cianocolabamina, riboflavina, coenzima A, FAD, NAD

(LORSCH & SZOSTAK, 1994; LAUHON & SZOSTAK, 1995; SARAN et al, 2003;

BURGSTALLER & FAMULOK, 1994; LAUHON & SZOSTAK, 1995), ácidos nucléicos

como elemento de RNA de TAR de HIV-1, RNA 5S de E. coli (BOIZIAU et al, 1999; KO et

al, 2001), aminoácidos como L-arginina, L- citrulina, L-valina (GEIGER et al, 1996;

FAMULOK, 1994; MAJERFELD & YARUS, 1994), carboidratos como a celobiose (YANG

et al, 1998), antibióticos como canamicina A, estreptomicina, neomicina, tetraciclina,

cloranfenicol (LATO et al, 1995; WALLACE & SCHROEDER, 1998; WALLIS et al, 1995;

BERENS et al 2001; BURKE et al, 1997), peptídeos e proteínas como a T4 DNA polimerase,

α-trombina, interferon-γ, VEGF, HIV-1 RT, vasopressina, marcador tumoral MUC-1, L-

selectina (TUERK & GOLD, 1990; BOCK et al, 1992; KUBIK et al, 1997; JELLINEK et al,

1994; TUERK et al, 1992; WILLIAMS et al, 1997; FERREIRA et al, 2006; HICKE et al,

1996), estruturas complexas como esporos de anthrax (BRUNO & KIEL, 1999).

A variedade de diferentes alvos usados nos experimentos com SELEX implica que a seleção

de aptâmeros é possível, virtualmente, para qualquer alvo. No entanto, há alguns pré-

requisitos para que o alvo em potencial selecione aptâmeros com alta especificidade e

afinidade. As moléculas do alvo devem estar presentes em quantidade suficiente e com alta

pureza. Isto ajuda a minimizar o enriquecimento de oligonucleotídeos com ligações

inespecíficas e aumenta a especificidade da seleção (STOLTENBURG et al, 2007).

A seleção de aptâmeros é facilitada por alvos que apresentam grupos carregados

positivamente (ex: grupo amino), presença de grupos doadores e aceptores de ligação de

hidrogênio e grupos planares (ex: compostos aromáticos). A seleção de aptâmeros é mais

45

difícil para alvos com caráter hidrofóbico e com grupos carregados negativamente (ex: grupo

fosfato) (STOLTENBURG et al, 2007).

Os aptâmeros ligam aos seus alvos por uma combinação de complementariedade na forma,

interações de emparelhamento entre compostos aromáticos e as nucleobases de aptâmeros,

interações eletrostáticas entre grupos carregados ou ligações de hidrogênio. Na presença do

alvo e na formação do complexo, os aptâmeros sofrem mudanças conformacionais

adaptativas. O enovelamento desses em estruturas tridimensionais permite aos aptâmeros

encapsular completamente pequenas moléculas-alvo com a geração de uma bolsa de ligação

específica. Em alvos com alto peso molecular como proteínas, diferentes subestruturas na

superfície molecular estão envolvidas na ligação do aptâmero como, por exemplo, as cadeias

laterais de aminoácidos que são responsáveis pelas ligações de hidrogênio (RANDOM et al,

2013).

4.4.3) A técnica SELEX para células (CELL SELEX)

Os aptâmeros selecionados pela técnica SELEX in vitro descrita anteriormente são obtidos

contra um alvo purificado. A utilização de alvos purificados apresenta a vantagem de alcançar

facilmente enriquecimento durante o processo de seleção se o alvo assume uma conformação

estável. No entanto, se os alvos estão presentes em estado modificado, em conformação não

nativa, ou se o alvo é mascarado em um contexto fisiológico como uma modificação pós-

traducional, os aptâmeros podem não reconhecer estes alvos (YE et al, 2012). Um exemplo

dessa situação é um aptâmero que foi selecionado contra o ectodomínio não glicosilado

EGFRvIII de Escherichia coli. Esse aptâmero mostrou alta afinidade e especificidade em

condições in vitro, mas não foi capaz de se ligar em EGFRvIII expresso na superfície de

células eucarióticas, possivelmente devido a modificações pós-traducionais (LIU et al, 2009).

A SELEX para células (CELL SELEX) foi desenvolvida para evitar essa desvantagem de

selecionar aptâmeros contra alvos em conformação não nativa. Assim, os aptâmeros

selecionados usando células inteiras serão capazes de se ligarem em alvos com conformação

nativa, mostrando, portanto um grande potencial em diagnóstico de células específicas e

terapia (KONG & BYUN, 2013).

Para gerar aptâmeros contra células inteiras, devem-se utilizar células alvo (seleção positiva) e

células não alvo (seleção negativa) no processo. Antes da incubação com o alvo, as células

são lavadas para a remoção do meio de cultura. Após a lavagem, as células são incubadas com

46

o pool de oligonucleotídeos em um shaker por um tempo e temperatura específicos. Os

aptâmeros que não se ligaram são descartados e os que se ligaram são eluídos por

desnaturação por calor por 15 minutos à 95°C e amplificados por PCR. As células não alvo,

que são utilizadas como controle negativo, são incubadas com esse pool amplificado e as

sequências que não se ligaram são separadas por centrifugação e amplificadas por PCR (YE et

al, 2012). Novos ciclos são realizados até que se obtenham aptâmeros com alta afinidade e

especificidade (Figura11).

Diferentes alvos já foram descritos em CELL-SELEX para a obtenção de aptâmeros. YE et al,

(2012), em uma revisão da literatura menciona alguns desses alvos, como células de

glioblastoma da linhagem U251 (DANIELS et al, 2003), células endoteliais da linhagem

YPEN-1 (BLANK et al, 2001)), células de linfoma Burkitt da linhagem Ramos

(MALLIKARATCHY et al, 2007), células T de leucemia linfoblástica CCRF-CEM

(SHANGGUAN et al, 2008). SHOJI OHUCHI (2012), em uma revisão de literatura,

menciona outros alvos como Trypanosoma brucei (HOMANN & GORINGER, 1999),

Trypanosoma cruzi (ULRICH et al, 2002), células hepáticas tumorais (MI et al, 2010),

células B humanas de leucemia (WU et al, 2003), células tronco de camundongo (GUO et al,

2007).

Figura 11: Esquema da metodologia CELL-SELEX com o passo de seleção negativa.

(Fonte: Modificado de SHOJI OHUCHI, 2012).

47

4.4.4) Propriedades dos aptâmeros

Os aptâmeros apresentam pequeno tamanho (aproximadamente 1-2 nm), usualmente com

menos de 100 nucleotídeos de extensão e com uma média de peso molecular de 10 KDa,

podendo variar de 7.5-32 KDa, enquanto que os anticorpos apresentam um tamanho bem

maior, de aproximadamente 10 nm e 155 KDa (JAMES W., 2000; LEE J. et al, 2010). Os

aptâmeros são estáveis à temperatura ambiente, podendo ser estocados e transportados a essa

temperatura (MISSAILIDIS & PERKINS, 2007).

Os aptâmeros apresentam alta afinidade para os seus alvos (RAY et al, 2013). A afinidade de

ligação entre um ligante e um receptor pode ser expressa pela constante de dissociação (Kd)

para um receptor. A constante de dissociação é definida como a concentração necessária de

mensageiro para que a metade dos receptores da superfície da célula esteja ocupada pelo

ligante. Assim, receptores com alta afinidade tem uma constante de dissociação baixa e

receptores com baixa afinidade tem constante de dissociação alta (MOYES C. & SCULTE,

2010). A constante de dissociação no equilíbrio (kd) dos aptâmeros varia entre poucos

picomoles por litro até no máximo poucos nanomoles por litro. A afinidade destas moléculas

por alvos específicos chega a ser maior do que as apresentadas pelos anticorpos monoclonais

(MISSAILIDIS & PERKINS, 2007).

Aptâmeros para aminoácidos como citrulina e arginina apresentam afinidade de 0.3 a 65 µM,

aptâmeros para ATP e xantina são de 6 e 3,3 µM respectivamente, para dopamina e vitamina

B12 são de 2.8 µM e 90 nM respectivamente. Aptâmeros para ácidos nucléicos tem afinidades

na faixa de nanomolar como, por exemplo, o aptâmero para a integrase retroviral que

apresenta afinidade na faixa de 10-800 nM e o aptâmero para a transcriptase reversa que

apresenta afinidade na faixa de 0,3-20 nM. Afinidades na faixa nanomolar e subnanomolar

são encontradas em aptâmeros para proteínas como, por exemplo, o aptâmero para trombina

com afinidade de 25 nM, VEGF com afinidade de aproximadamente 100 pM, fator de

crescimento de queratinócito com afinidade de aproximadamente 1 pM (JAMES, 2000).

Os aptâmeros apresentam alta especificidade para os seus alvos. Diferentes enzimas com

atividades semelhantes podem ser distinguidas como, por exemplo, a α-trombina pode ser

diferenciada da γ-trombina (PABORSKY et al, 1993) e duas isozimas de proteína quinase C

diferenciadas em apenas 23 resíduos podem ser distinguidas (CONRAD et al, 1994). Além

disso, os aptâmeros podem identificar pequenas modificações estruturais em moléculas alvos,

tais como, grupos metil (BRIDONNEAU et al, 1999), hidroxil (MANNIRONI et al, 1997),

48

D- ou L-enantiomeros (GEIGER et al, 1996). Moléculas pequenas, como dopamina

(MANNIRONI et al, 1997), aminoácidos (GEIGER et al, 1996), antibióticos (WALLACE &

SCHOEDER, 1998 ), nucleotídeos (HALLER & SARNOW, 1997), peptídeos (WILLIANS et

al, 1997), cofatores (WILSON & SZOSTAK, 1998) e mesmo íons metálicos (HOFMANN et

al, 1997) podem ser reconhecidos por aptâmeros. Estas propriedades capacitam os aptâmeros

como um potencial substituto para os anticorpos monoclonais, pois apresentam baixo custo de

produção quando comparados aos anticorpos monoclonais, por serem facilmente produzidos

em condições in vitro, enquanto que a produção dos anticorpos é laboriosa requerendo

condições in vivo. (MISSAILIDIS & PERKINS, 2007). Além disso, os aptâmeros não são

imunogênicos, apresentam rápida depuração por via renal, são bem menores que os anticorpos

e não são sensíveis a temperatura como os anticorpos. A síntese dos aptâmeros é feita com

extrema precisão e reprodutibilidade não havendo variações entre os lotes, enquanto que a

síntese dos anticorpos pode haver variações (YOU et al, 2003).

Os aptâmeros podem ser modificados quimicamente para se tornar mais resistentes a ação de

nucleases, normalmente encontradas nos fluídos biológicos. Uma modificação comumente

usada é a utilização de pirimidinas com substituição de amina (NH2) ou flúor (F) na posição

2’ da ribose ou desoxirribose. Estes nucleotídeos modificados são substratos das DNA

polimerases usadas em PCR e, portanto não comprometem o processo da SELEX. Foi

demonstrado também que modificações nas extremidades 3´ou 5´ aumentam a resistência dos

aptâmeros à degradação por nucleases, aumentando sua meia vida no plasma sanguíneo de

minutos para horas (FERREIRA & MISSAILIDIS, 2007). Têm-se como exemplos de

modificações das extremidades 3´e 5´ a adição de bases invertidas ou ainda a adição de grupo

amino, flúor ou grupo metil (MISSAILIDIS & PERKINS, 2007). Normalmente, aptâmeros de

DNA são mais resistentes que de RNA. Os aptâmeros permitem ainda, a conjugação de

moléculas como o PEG que tem a propriedade de aumentar o tempo de circulação sanguínea

ou podem também ser conjugados a nanopartículas como nanopartículas de ouro, quantum-

dots, nanotubos de carbono (PIEVE et al, 2012; LEE et al, 2010).

Os aptâmeros podem ser marcados usando grupos reativos fluorescentes, como a fluoresceína

ou biotina. Além disso, os aptâmeros podem ser marcados com diferentes tipos de

radioisótopos como 99m

Tc, 18

F, 125

I e 32

P entre outros. Eles estão surgindo como ferramentas

promissoras no desenvolvimento de novos radiofármacos. Os aptâmeros apresentam a

propriedade de circularem livremente pelo sangue, apresentando rápida depuração plasmática,

49

sendo características importantes para o desenvolvimento de radiofármacos (MISSAILIDIS &

PERKINS, 2007).

As propriedades dos aptâmeros os capacitam para aplicação direta na detecção e quantificação

de moléculas. Estes são requisitos importantes para o desenvolvimento de radiofármacos para

cintilografia. A rápida farmacocinética dos aptâmeros desperta também o interesse para sua

utilização na Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET).

4.4.5) Aplicações dos aptâmeros

Os aptâmeros apresentam ampla aplicação incluindo pesquisa básica na área médica e

farmacêutica e no desenvolvimento de drogas em diagnóstico e terapia. Os aptâmeros são

moléculas promissoras no desenvolvimento de novos agentes em terapia e diagnóstico devido

as suas propriedades de alta afinidade e especificidade, facilidade para modificação química e

produção in vitro, além das vantagens sobre os anticorpos.

4.4.5.1) Aplicações em terapia

A maioria dos aptâmeros aplicados em terapia age como inibidores de seus alvos, mas alguns

agem como agonistas de receptores (RANDOM et al, 2013). Têm-se como exemplos de

aptâmeros inibidores de seus alvos os aptâmeros contra a nucleolina (BATES et al, 2009),

fator IXa (RUSCONI et al, 2002), ligante 12 de quimiocina (SAYYED et al, 2009), PDGF

(GREEN et al, 1996) e trombina (WATERS et al, 2011).

4.4.5.1.1) Aplicações em angiogênese

Em 1971, FOLKMAN sugeriu que o controle da angiogênese poderia ser útil no controle do

crescimento tumoral. Esse conceito de antiangiogênese foi aplicado a outras doenças e vem

sendo estudado extensivamente nos últimos anos. A angiogênese é um fenômeno complexo

no qual participam inúmeras moléculas que estimulam e inibem a formação dos neovasos

(DAMICO, 2007).

O aptâmero Macugen (pegaptanib da Eyetech) (GRAGOUDAS et al, 2004) , para o

tratamento de doença macular degenerativa, foi o primeiro aptâmero a chegar ao mercado e é

o único aprovado pelo FDA. O aptâmero inibe o receptor VEGF que é um regulador positivo

de angiogênese. Assim, o medicamento tem o papel de reduzir o crescimento do tumor e sua

vascularização (JANJIC et al, 2000; ADAMIS et al, 2006).

50

Em adição ao VEGF, outro fator de crescimento com papel na proliferação celular e

angiogênese é o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Aptâmeros de DNA

contra PDGF e PDGF-B foram desenvolvidos (JANJIC & GOLD, 1997; PIETRAS et al,

2004). Com a inibição de PDGF ocorre uma sinalização para o estroma de células tumorais

que levam a diminuição da pressão do fluido intersticial, que pode consequentemente

estimular o transporte de drogas quimioterápicas para o tumor.

O aptâmero NOX-A12, contra quimiocina angiogênica, implicada na vascularização

patológica está em desenvolvimento para o tratamento de retinopatia diabética (SAYYED et

al, 2009).

O aptâmero ARC1905 se liga ao componente 5 do sistema de complemento (C5), que

apresenta papel importante em doença macular degenerativa relacionada a idade. O C5 é um

agente pró-inflamatório e é encontrado na retina de pacientes com essa doença (BIESECKER

et al, 1999).

4.4.5.1.2) Aplicações em oncologia

A oncologia é um grande campo de desenvolvimento em termos de terapêutica e apesar disto

apenas alguns aptâmeros têm sido desenvolvidos nessa área. O aptâmero chamado de AS1411

se liga a nucleolina que é uma proteína localizada no nucléolo, mas que pode ser translocada

para a superfície de certas células cancerígenas (BATES et al, 2009). AS1411 não afeta

diretamente a nucleolina, mas apresenta efeito de internalização do complexo nucleolina-

AS1411, desestabilização de mRNA da proteína anti-apoptótica Bcl-2 e inibição do fator de

transcrição NFκB. Incialmente, ensaios em camundongos nude com xenotransplantes de

tumor de próstata com células da linhagem DU145, foram realizados, havendo uma redução

significativa no crescimento tumoral, mostrando assim um efeito citostático ao invés de

citotóxico. Posteriormente, o aptâmero AS141 entrou em fase I de ensaio clínico, incluindo

17 pacientes, sendo confirmada a ausência de toxicidade em doses maiores que 10mg/kg/dia.

Atualmente, esse aptâmero está em fase II de ensaios clínicos (CIBIEL et al, 2012).

Outro aptâmero aplicado como agente anti-tumoral é o aptâmero de RNA inibidor de CTLA-4

usado com a finalidade de aumentar a imunidade, modulando o sistema imune. CTLA-4 é um

receptor de membrana expresso em células antigênicas responsável por uma regulação

negativa atenuando a ativação de células T. O aptâmero então se liga ao receptor CTLA-4,

inibindo assim a inativação de células T. A injeção desse aptâmeros em camundongos em

51

combinação com a irradiação das células levou a inibição do crescimento tumoral, mas pode

aumentar o risco do desenvolvimento de uma doença autoimune (SANTULLI et al, 2003).

Outros dois aptâmeros contra os receptores 4-1BB e OX40, expressos em células T, também

permitem a inibição do crescimento do tumor in vivo estimulando a resposta imune

(MCNAMARA et al, 2008; DOLLINS et al, 2008). Ao invés de inibir o alvo, esses

aptâmeros agem como agonistas ativando os receptores e aumentando a resposta imune de

células T.

Outro exemplo é o aptâmero anti-4-1BB conjugado com outro aptâmero que se liga ao

antígeno de membrana prostático específico (PMSA), expresso na superfície de alguns

cânceres de próstata, levaram a diminuição do crescimento tumoral (PASTOR et al, 2011).

4.4.5.1.3) Aplicações como agentes anticoagulantes

O aptâmero RB006 conjugado com PEG, que se liga ao fator de coagulação IXa, foi

desenvolvido juntamente com seu antídoto RB007. Ao se ligar ao fator de coagulação IXa o

aptâmero inibe a cascata de coagulação atuando assim como um agente anticoagulante. O

RB007 rompe a estrutura de RB006 e inibe a função anticoagulante. REG-1 é a combinação

de RB006 e RB007, desenvolvido por Regado Biosciences, que está em fase II de ensaios

clínicos e mostrou função anticoagulante em estudos in vivo. (CHAN et al, 2008).

O aptâmero ARC1779 se liga ao domínio A1 do fator von Willebrand e inibe a capacidade

deste domínio se ligar ao receptor de membrana de plaquetas (glicoproteína Ib), induzindo

assim efeitos antitrombóticos (DIENER et al, 2009). Esse aptâmero está em fase II de ensaios

clínicos e é aplicado em pacientes com microangiopatias trombóticas e em pacientes com

doenças na artéria carótida submetidos a endarterectomia carotídea.

O aptâmero NU172 se liga a trombina inibindo assim a sua função na cascata de coagulação.

Esse aptâmero está em fase II de ensaios clínicos e é aplicado pacientes durante

procedimentos cirúrgicos cardiovasculares para evitar a formação de coágulos sanguíneos

(WATERS et al, 2009).

4.4.5.1.4) Aplicações em tratamento de inflamação

A L-selectina apresenta um importante papel na inflamação, estando expressa na superfície de

leucócitos, mediando a adesão às células endoteliais. Um aptâmero de DNA que se liga a L-

selectina foi desenvolvido pela NeXstar Pharmaceuticals. Esse aptâmero apresentava

52

modificações na extremidade 3´ e a conjugação de PEG na ponta 5´ (HICKE et al, 1996). No

entanto, a dose requerida para desencadear o efeito foi considerada muito alta para continuar a

ser desenvolvido. O mesmo grupo desenvolveu assim, outro aptâmero de RNA que se liga ao

mesmo alvo com uma modificação 2´-flúor-ribose-pirimidina (2´-F-Py). Esse aptâmero inibiu

50% do tráfego de linfócitos. Uma dose de 5.4 nmol/Kg mostrou efeito de duração de 11 h

(WATSON et al, 2000).

Outro aptâmero contra P-selectina chamado de ARC5690 também demonstrou atividade

inibitória prevenindo a adesão de leucócitos e a passagem para os tecidos. A P-selectina é

expressa em resposta a um estímulo extracelular como a hipóxia e está presente em altos

níveis em pacientes com anemia falciforme (GUTSAEVA et al, 2010).

O aptâmero RA10-6 selecionado para o receptor A de interleucina 17 (IL-17RA) foi capaz de

reduzir a inflamação sinovial em modelo murinho de osteoartrite experimental. Esse aptâmero

de DNA é capaz de bloquear a ligação da interleucina 17 no receptor IL-17R, diminuindo

assim a expressão de citocinas inflamatórias (CHEN et al, 2011).

4.4.5.1.5) Aplicação no tratamento de doenças infecciosas

O aptâmero de DNA chamado PO RO10-60 selecionado para o receptor 9 do tipo toll

(TLR9), apresenta o efeito de estimular a resposta imune. O receptor TLR9 apresenta a

função de reconhecimento de patógenos e estimulação da resposta imunológica contra esses

agentes. Esse aptâmero administrado por via intranasal (25µg) em camundongos um dia antes

de uma infecção por anthrax retardou a morte do animal. O aptâmero PO RO10-60 pode

assim, ser utilizado em tratamento profilático em caso de ataque bioterrorista, retardando as

consequências letais, permitindo assim o tratamento por antibióticos (WU et al, 2008).

O aptâmero chamado de A22 selecionado contra hemaglutinina (HA) de vírus influenza tem o

papel de bloquear a ligação de HA em receptores de células hospedeiras e, consequentemente

inibir a entrada do vírus na célula. Estudos com camundongos em modelo de infecção viral

demonstraram a redução do título viral no pulmão dos animais tratados com injeção intranasal

de A22 (125 pmol) no mesmo dia, após um dia e após dois dias da inoculação viral (JEON et

al, 2004). Outro aptâmero chamado de NK2 selecionado contra Mycobacterium tuberculosis

teve efeitos semelhantes, aumentando as taxas de sobrevivências em camundongos (CHEN et

al, 2007).

53

Estudos com aptâmeros para componentes do vírus HIV estão sendo realizados. Aptâmeros

para a transcriptase reversa de HIV (GOLD & TUERK, 1996; SCHNEIDER et al, 1996),

proteína GAG HIV-1 (Lochrie & Gold, 1998), proteína nucleocapsídea (ALLEN & GOLD,

1997), integrase (ALLEN & GOLD, 1996), gp 120 (WILSON et al, 2004), proteína TAT

(GOLD & TUERK, 1996) estão em várias fases de desenvolvimento.

Aptâmeros para glicoproteínas (E1 e E2) do vírus de hepatite C, chamados de ZE2, foram

selecionados. Esse aptâmeros se ligam a proteína E2 impedindo em 80% a ligação destas em

células de mamíferos (CHEN et al 2009).

4.4.5.1.6) Aplicações em diabetes

O aptâmero chamado de NOX-E36 se liga a quimiciona-2 (motivo C-C), que é uma proteína

responsável por recrutar monócitos e células T do compartimento vascular para o espaço

extracelular nos locais de inflamação. NOX-E36 é um aptâmero de RNA desenvolvido para o

tratamento de complicações de diabetes tipo II. Esse aptâmero mostrou uma eficiência

significativa em reduzir glomeruloesclerose de diabetes tipo II em modelos murinos

(NINICHUK et al, 2008; MAASCH et al, 2008 ).

4.4.5.2) Aplicações em diagnóstico

Um agente diagnóstico ideal deve apresentar as características de alta especificidade,

sensibilidade, reprodutibilidade, rapidez e facilidade na análise dos resultados. Os aptâmeros

preenchem todos esses requisitos, apresentando um grande potencial como agentes

diagnósticos. Devido as suas propriedades, a detecção de toxinas, drogas, metabólitos,

patógenos pode ser possível em baixas concentrações. Diferentes métodos de diagnóstico têm

sido estudados como “beacons” competitivos, sensores eletroquímicos, conjugados de

aptâmeros a nanopartículas e radiodiagnóstico (RANDOM et al, 2013).

4.4.5.2.1) “Beacons” competitivos

Esse tipo de sensor detecta a energia de ligação dos aptâmeros nos respectivos alvos por sinais

fluorescentes. Um ácido nucléico com um fluoróforo é chamado de “beacon molecular” e se o

ácido nucléico é um aptâmero o termo utilizado é “apta-beacon”. O aptâmero é desenvolvido

com uma estrutura em hairpin e as extremidades do aptâmero são marcadas com um

fluoróforo e um “quencher”. A ligação do aptâmero com o alvo rompe a estrutura em hairpin,

separando o fluoróforo do “quencher”, permitindo que o fluoróforo esteja livre para emitir um

54

sinal fluorescente (RANDOM et al, 2013). Um exemplo da aplicação desse tipo de sensor foi

desenvolvido para avaliar a concentração de elastase de neutrófilos humanos, sendo que esse

sensor foi capaz de detectar concentrações baixas como 0,34 nM de elastase de neutrófilos

humanos (HE et al, 2010).

4.4.5.2.2) Sensores eletroquímicos

Os sensores eletroquímicos quando comparados com apta-beacons oferecem maior

sensibilidade de detecção e baixo custo. Nesse tipo de sensor o aptâmero é imobilizado em

um suporte condutor. Quando o aptâmero se liga ao alvo, ocorre uma mudança

conformacional em sua estrutura que leva a alteração no fluxo de corrente do sistema. Um

exemplo da aplicação desse tipo de sensor é o sensor desenvolvido por SWENSEN et al

(2009), chamado de MECAS (Microfluidic Electrochemical Aptamer-based sensor), que

mede a concentração de cocaína em soro fetal bovino em tempo real. Nesse sistema o

aptâmero é marcado com azul de metileno (grupo redox) e é imobilizado na superfície de um

eletrodo de ouro. Quando o aptâmero se liga a cocaína ocorre uma mudança conformacional

que diminui a distância do grupo redox do eletrodo, promovendo a transferência de elétrons e

consequentemente o aumento da corrente elétrica com mudança da coloração do indicador

(azul de metileno).

4.4.5.2.3) Diagnóstico com conjugados de aptâmeros a nanopartículas

Desenvolvimentos recentes em nanoestruturas têm gerado um grande impacto em vários

campos como nanoeletrônica, fotônica, biologia e medicina. Diferentes tipos de nanomateriais

têm sido aplicados como nanopartículas metálicas (NPs), quantum dots (QDs), nanotubos de

carbono (CNTs) e partículas nanomagnéticas.

Os quantum dots são mais estáveis que os corantes fluorescentes e o comprimento de onda

emitido pode ser controlado modificando o tamanho e a composição da nanopartícula. O

primeiro quantum dot conjugado com aptâmero foi descrito para a detecção de trombina.

Nesse trabalho o aptâmero para trombina conjugado com um quantum dot foi hibridizado com

uma fita complementar de DNA marcada com um quencher na extremidade. Na presença de

trombina, o aptâmero interage com a trombina modificando sua estrutura e libera a fita

complementar contendo o quencher, induzindo assim a emissão de fluorescência (LEVY et

al, 2005).

55

Outro grupo utilizou a detecção múltipla com quantum dots e nanopartículas de ouro

conjugados com aptâmeros para a detecção de adenosina e cocaína. Nesse trabalho agregados

de quantum dots com pico de emissão de 525 nm e nanopartículas (AuNPs) foram formados

com aptâmeros específicos para adenosina. Em paralelo, agregados de quantum dots com pico

de emissão de 585 nm e nanopartículas (AuNPs) foram formados com aptâmeros específicos

para cocaína. A introdução de adenosina e/ou cocaína aumenta a emissão de fluorescência de

QD1 (pico de emissão 525 nm) e QD2 (pico de emissão 585nm). A introdução de analitos

controle (citidina e uridina) não aumentaram a fluorescência dos QDs (LIU et al, 2007).

Quantum dots conjugados com aptâmeros para MUC1 foram desenvolvidos. Estudos in vitro

e in vivo mostraram que o complexo acumula predominantemente no tumor (SAVLA et al,

2011).

Partículas superparamagnéticas de óxido de ferro (TCL-SPION) foram conjugadas com o

aptâmero A10 específico para câncer de próstata. O aptâmero A10 é um aptâmero de RNA

que se liga ao domínio extracelular do antígeno de membrana próstata específico (PMSA), um

marcador tumoral, que apresenta expressão elevada em células tumorais. Estudos mostraram

que o bioconjugado foi capaz de detectar células expressando PMSA com alta sensibilidade

(WANG et al, 2008).

4.4.5.2.4) Diagnóstico por cintilografia utilizando aptâmeros

O primeiro aptâmero descrito para diagnóstico por imagem usando SPECT foi o aptâmero

NX2109 para elastase de neutrófilos. Em resposta a inflamação, os neutrófilos são recrutados

aos locais de inflamação onde secretam grandes quantidades de elastase que se ligam a

superfície de neutrófilos ativados. Inicialmente, com o uso de citometria de fluxo foi

demonstrado que o aptâmero NX2109 podia interagir com a elastase na superfície de

macrófagos ativados. Posteriormente, o aptâmero NX2109 foi marcado com 99m

Tc para

estudos in vivo de imagem em modelo experimental de ratos com indução artificial de

inflamação no membro anterior. O aptâmero foi comparado com um oligonucleotídeo

controle (NX303) e com IgG de rato como controle positivo. O aptâmero NX2109 mostrou

maior intensidade na imagem do que o oligonucleotídeo controle e uma relação alvo/não alvo

de 4.3 ± 0.6 foi obtida 2 h após a administração do aptâmero. O anticorpo IgG específico

levou 3 h para atingir a melhor relação alvo/não alvo de 3.1 ± 0.1 (CHARLTON et al, 1997).

56

Outro aptâmero aplicado em cintilografia é o aptâmero TTA1 marcado com 99m

Tc para

diagnóstico de tumor. O aptâmero TTA1 se liga a proteína da matriz extracelular tenascina-C

que é uma proteína hexamérica. A tenascina está expressa em processos de angiogênese,

crescimento tumoral, cicatrização de feridas, embriogênese. A proteína é continuamente

expressa na neovasculatura e no estroma do tumor. Os tumores conhecidos por apresentarem

superexpressão de tenascina-C são: carcinomas de pulmão, mama, prostata, colon, linfomas,

sarcomas, glioblastomas e melanomas. HICKE et al (2006), fizeram estudos de imagem

tumoral utilizando o aptâmero TTA1 marcado com 99m

Tc e estudos de biodistribuição em

modelo experimental de camundongos com xenotransplantes de células humanas U251 de

glioblastoma. Após injeção intravenosa (5 noml/camungongo – 200 nmol/Kg) foi obtida uma

captação máxima no tumor de 6% da dose injetada (ID/g) observada rapidamente, dentro de

10 minutos, seguido de um lento decréscimo, sendo observado 1.9 % ID/g ainda presentes

após 3 h da injeção. O aptâmero controle mostrou captação inicial de 3% ID/g em 10 min,

mas foi eliminado do tumor rapidamente (0.04 %ID/g em 3 h). A depuração sanguínea foi

extremamente rápida com uma relação tumor/sangue de 50 em 3 h. A rápida depuração se

deve a excreção renal e a degradação por nucleases. No entanto, 60% dos aptâmeros intactos

foram medidos no tumor 3 h após a injeção, sugerindo que a interação do aptâmeros com o

alvo de alguma forma protege os aptâmeros contra nucleases. Foi utilizado no estudo três

diferentes quelantes, mostrando que cada agente altera dramaticamente o padrão de

biodistribuição dos aptâmeros (HICKE et al, 2006).

Dois outros aptâmeros, AptA e AptB, selecionados contra a proteína MUC1 foram marcados

com 99m

Tc e testados em imagem tumoral. MUC1 é uma glicoproteína grande, de superfície,

expressa na matriz extracelular de células epiteliais glandulares e ductos e em algumas

linhagens de células hematopoéticas. MUC1 está superexpressa na maioria dos

adenocarcinomas humanos, sendo então, um marcador tumoral. AptA foi selecionado contra a

proteína não glicosilada de MUC1 enquanto que AptB foi selecionado contra a forma maligna

e glicosilada da proteína. Ambos os aptâmeros foram modificados com a inserção de uma

timina invertida na ponta 3´ para conferir resistência a nucleases. Após marcação com 99m

Tc,

foram injetados intravenosamente em camundongos nude com xenotransplante de células de

câncer de mama da linhagem MCF-7. Diferentes quelantes foram utilizados para sintetizar

formas monoméricas e tetraméricas de AptA. Como descrito anteriormente, o padrão de

biodistribuição variou dependendo do quelante, mas as formas tetraméricas mostraram maior

captação tumoral comparadas com as formas monoméricas. Em outro experimento, AptA e

57

AptB foram marcadas usando o mesmo quelante MAG2. Os aptâmeros foram eliminados pelo

trato urinário e sistema hepatobiliar. AptB mostrou maior captação tumoral que AptA em 5 h

e 22 h após a injeção (0.14% ID/g x 0.12% ID/g e 0.013% ID/g, x 0.008% ID/g

respectivamente) (FERREIRA et al, 2006; PIEVE et al, 2009).

58

5) MATERIAL E MÉTODOS

5.1) Aptâmeros

Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 (Figura 12) previamente desenvolvidos para S. aureus

(CAO et al, 2009) foram sintetizados pela empresa Prodimol Biotecnologia em duas

variações: sem modificações e com a adição de um grupo amino (-NH2) com um espaçador de

seis carbonos na extremidade 5´.

Figura 12: Aptâmeros SA20, SA23 e SA34. A) Sequências dos aptâmeros. B) Estruturas

secundárias dos aptâmeros com menor estado de energia desenhados pelo software RNA

STRUCTURE 4.5. Fonte: CAO et al, 2009.

59

5.2) Microrganismos e condições de cultura

Staphylococcus aureus da linhagem ATCC 25923 e Candida albicans da linhagem ATCC

18804 foram cultivados em meio BHI sólido (Himedia Laboratories Pvt. Ltda) em placas de

petri a 37°C e repicados a cada sete dias.

5.3) Animais

Camundongos Swiss foram adquiridos do biotério da Faculdade de Farmácia da UFMG. Os

camundongos foram mantidos em gaiolas com maravalha, água e ração comum (sem

restrição), em estantes comuns. Os camundongos Swiss utilizados para infecção com C.

albicans foram imunossuprimidos por irradiação em fonte uniforme de 60

Co, com a dose de

2,5 Gray e taxa de dose de 75 Gray/hora, no Laboratório de Irradiação Gama do CDTN e

mantidos em gaiolas autoclavadas com maravalha, água e ração (sem restrição). Todos os

experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação animal

da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA/UFMG), protocolo nº. 143 / 2013

(ANEXO A).

5.4) Marcação dos aptâmeros com 32

P

Os aptâmeros foram inicialmente colocados a 95°C por 5 min, em seguida no gelo por 1 min e

depois por 15min a 8°C. Em seguida, foram deixados em repouso a temperatura ambiente por

no mínimo 1 hora para atingirem o enovelamento correto. Para a reação de marcação foram

adicionados na respectiva ordem, 15,5 µL de água DNase free, 5 µL de tampão (250 mM

Imidazole-HCl (pH 6.4), 60 mM MgCl, 5 mM 2-mercaptoetanol, 350 M ADP ), 0,5 µL (5

unidades) da enzima T4 polinucleotideo kinase, 1 µL da solução do aptâmero (10 pmol), 3 µL

de [γ-32

P]ATP. Após a adição dos reagentes o tubo foi agitado e incubado em banho-maria a

37°C por 10 min. Em seguida, a solução foi deixada a 65°C por 10 minutos para paralização

da reação. Após essa etapa, foram adicionados 7,5 µL de água DNase free no tubo contendo o

produto da reação. Uma biblioteca de oligonucleotídeos degenerados com sequências

aleatórias também foi marcada para utilização como controle.


P a células de S. aureus

Para o ensaio de ligação de cada um dos aptâmeros marcados a células de S. aureus da

linhagem ATCC 25923 foram realizadas 4 diluições em PBS dos aptâmeros marcados nas

concentrações de 5 pmol, 2,5 pmol, 1,5 pmol e 0,75 pmol. Foram adicionados 100 µL de cada

60

diluição em microtubos contendo 107 células de S. aureus. A incubação foi realizada em

banho-maria a 37°C por 45 min para a ocorrência da ligação dos aptâmeros radiomarcados

com as células bacterianas. Após esse tempo o material foi centrifugado a 13000 rpm por 5

min e o sobrenadante descartado. Em seguida o pellet foi resuspendido em 200 µL de PBS e

novamente centrifugado nas mesmas condições. O procedimento foi repedido mais duas vezes

até que não foi verificada a presença de radiação no sobrenadante. Ao final, o pellet foi

armazenado a 20°C até ser utilizado.

5.6) Detecção da Radioatividade por Cintilação Líquida

O pellet obtido após o ensaio de ligação dos aptâmeros marcados com 32

P a células de

S. aureus foi ressuspendido em 200 µL de PBS e transferido para um tubo contendo 1,3 mL

do cintilador líquido Ultima GoldTM

LLT (PerkinElmer). A radioatividade foi determinada em

cpm (contagem por minuto) pelo método de espectrometria em cintilador líquido no

equipamento Quantulus com tempo de contagem de 10 minutos.

5.7) Marcação dos aptâmeros com 99m

Tc

Em um frasco foi adicionado 20 mg de tricina e 5 mg de EDDA solubilizando-os em 300 µL

de salina 0,9%. Em seguida, foi adicionado 10 µL de uma mistura dos aptâmeros SA20, SA23

e SA34 na concentração de 200 pmol/µL cada e 100 µL de uma solução de cloreto estanoso

(SnCl2) a 2 µg/mL, solubilizada em HCl 0,25N. O pH foi ajustado para 7 com solução de

NaOH 1,0 N. O recipiente foi lacrado e vácuo foi aplicado com auxílio de uma seringa. A

atividade de 200 µCi de 99m

Tc foi adicionada para a marcação para utilização em ensaios in

vitro. Para os ensaios in vivo e obtenção de imagens cintilográficas a atividade adicionada foi

de 3 mCi. Em seguida, a solução foi deixada em banho-maria a 100°C por 15 min para a

ocorrência da ligação. Após a ligação, o produto da marcação foi resfriado em água corrente.

O rendimento da marcação foi determinado por cromatografia em camada delgada (CCD)

(Figura 13) utilizando como fase móvel acetona, para a determinação do percentual de TcO4-,

e solução de NaCl 0,9% com 5% de hidróxido de amônio para avaliar a quantidade de TcO2

(Tabela 2) . As placas cromatográficas de sílica gel de fase normal (cromatofolha de alumínio

com sílica gel) foram cortadas em tiras de 1x10 cm. Com o auxílio de uma seringa de 1 mL

uma gota do aptâmero marcado com 99m

Tc foi aplicada no ponto de origem. Após a secagem a

temperatura ambiente a corrida foi realizada em tubos contendo os eluentes citados na Tabela

2. A corrida foi paralisada quando a fase móvel atingiu a marca superior da placa (0,5 cm da

61

extremidade superior). Após a corrida, as placas foram deixadas a temperatura ambiente para

secagem e cortadas ao meio. As atividades das porções inferiores e superiores da placa foram

medidas utilizando contador gama (Wizard-Perkin Elmer).

Tabela 2: Eluentes utilizados na CCD

Suporte Solvente Rf∆

TcO4- Rf TcO2 Rf TcAptâmero

ITLC SG* NaCl 0,9%,

5% de NH4OH

1,0 0,0 1,0

ITLC SG Acetona 1,0 0,0 0,0

*ITLC SG: Instataneous Thin Layer Cromatography Media Silica Gel. ∆Rf: índice de retenção: razão

entre a distância percorrida pelo composto e pelo eluente.

O rendimento da marcação foi obtido seguindo a fórmula abaixo:

Porcentagem de marcação= 100 – (% TcO4- + % TcO2)

5.8) Testes de estabilidade dos aptâmeros marcados

O pool dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 foi marcado com 99m

Tc conforme metodologia

descrita no item 5.7. Foi utilizado 10 µL de cada aptâmero (200 pmol/µL) para a marcação

conjunta com 500 µCi de 99m

Tc. O pool de aptâmeros radiomarcados foi em seguida,

incubado separadamente com solução salina 0,9%, plasma de camundongos Swiss e em

excesso de cisteína para análise da estabilidade da marcação.

Figura 13: Diagrama esquemático da cromatografia em camada delgada.

62

Os coligantes tricina e EDDA utilizados na metodologia de marcação do presente projeto

foram marcados com 99m

Tc sem a adição dos aptâmeros, sendo utilizados como controle da

marcação. A estabilidade dos coligantes foi avaliada em solução salina 0,9%.

5.8.1) Teste de estabilidade em solução salina

Foram adicionados 100 µL do pool de aptâmeros radiomarcados com 99m

Tc em um tubo

contendo 1,1 mL de solução salina 0,9%. A solução resultante foi estocada a temperatura

ambiente e analisada por CCD em triplicata nos tempos de 1, 2, 4 e 24 h.

5.8.2) Teste de estabilidade em excesso de cisteína

A cisteína é um aminoácido competidor pelo 99m

Tc e assim é utilizada para avaliar a

estabilidade da marcação dos aptâmeros. Foram adicionados 50, 500 e 5000 vezes de excesso

de cisteína a solução contendo os aptâmeros radiomarcados. Foi utilizado 1,1 mL de cada

solução de cisteína para cada 100 µL do produto da marcação de aptâmeros. As soluções

foram mantidas à temperatura ambiente e analisadas por CCD também em triplicata nos

tempos de 1, 2, 4 e 24 h.

5.8.3) Teste de estabilidade no plasma

Foi obtido 3 mL de sangue de camundongos Swiss e adicionado 25 µL de anticoagulante

EDTA. O sangue foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos e a fração do plasma foi

separada. Foi obtido um tubo contendo 1,1 mL de plasma no qual foram adicionados 100 µL

dos aptâmeros marcados e a mistura foi incubada a 37°C. A atividade na fração do plasma foi

analisada por CCD, em triplicata, nos tempos de 1, 2, 4 e 24 h.


Tc

O pool dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcado com 99m

Tc foi filtrado em filtros 3K para

a eliminação de impurezas. O filtro de 3K foi escolhido considerando o valor do peso

molecular estimado dos aptâmeros (SA20 = 27,5 KDa; SA23 = 27,6 KDa e SA34 = 27,4

KDa). Após a filtração, o produto foi diluído em 160 µL de PBS e 50 µL foram incubados

separadamente com 1 x 107 células de S. aureus em 1,0 mL de PBS. A incubação foi

realizada em banho-maria a 37°C por 45 min para a ocorrência da ligação do aptâmero

marcado com as células. Após a ligação, o material foi centrifugado a 13000 rcf por 5 min e o

sobrenadante descartado. Em seguida, o pellet foi lavado em PBS por 3 vezes até que não se

63

obteve radiação no sobrenadante. A radioatividade incorporada ao pellet foi determinada em

contador gama. A biblioteca marcada foi utilizada como controle.

5.10) Estudos de Biodistribuição e Cintilografia

Para os estudos de biodistribuição e cintilografia, três grupos de camundongos Swiss (peso

20-25 g) contendo 6 animais em cada (n=6) foram utilizados. Os animais foram anestesiados

com uma mistura de xilasina (15 mg/Kg) e quetamina (80 mg/Kg).

O grupo 1 foi infectado com 1 x 107 células de S. aureus da linhagem ATCC25923,

suspensas em 100 µL de solução salina, por via intramuscular na coxa direita. Após 24 h,

tempo necessário para o desenvolvimento da infecção intramuscular, foram injetados 100 µL

do pool de aptâmeros anti S. aureus marcados com 99m

Tc, por via intravenosa, para a

realização das imagens cintilográficas e estudos de biodistribuição. Foi utilizada uma dose de

3 mCi de 99m

Tc na marcação para os ensaios in vivo.

O grupo 2 foi infectado com 1 x 107 células de C. albicans da linhagem ATCC18804,

suspensos em 100 µL de solução salina, por via intramuscular na coxa direita. Os

camundongos do segundo grupo foram previamente imunossuprimidos para que fosse

possível o desenvolvimento da infecção fúngica, segundo descrito no item 5.3. Após 24 h da

inoculação do microrganismo, foram injetados 100 µL dos aptâmeros anti S. aureus marcados

com 99m

Tc, por via intravenosa, para a realização das imagens cintilográficas e estudos de

biodistribuição.

Nos animais do grupo 3 foi injetado 100 µL de zimosan 5% por via intramuscular para a

indução de uma inflamação no músculo da coxa direita. Após 24 h foram injetados 100 µL

dos aptâmeros anti S. aureus marcados com 99m

Tc, por via intravenosa, para a realização das

imagens cintilográficas e estudos de biodistribuição. Em todos os grupos foi observado um

inchaço visível nas coxas infectadas ou inflamadas, quando comparadas com as coxas sem

intervenção.

Foram adquiridas imagens cintilográficas nos tempos de 1 e 4 h após a administração do

radiomarcado para todos os grupos. Para tal, os camundongos foram anestesiados com uma

mistura de xilasina (15 mg/Kg) e quetamina (80 mg/Kg). Em seguida, foram colocados em

posição de decúbito ventral sob uma câmara de cintilação à raios gama para a obtenção da

imagem cintilográfica. Uma janela de 20% de simetria foi utilizada para um pico de energia

de 140 keV e um colimador de baixa energia do tipo LEHR foi utilizado para direcionar os

64

raios. As imagens foram obtidas durante 5 minutos e armazenadas em uma matriz de 256x256

pixels.

Os estudos de biodistribuição foram realizados no tempo de 4 h após a administração dos

aptâmeros anti S. aureus marcados com 99m

Tc. Após o tempo de 4 h, os camundongos foram

eutanasiados por deslocamento cervical e amostras de tecido (sangue, fígado, baço, estômago,

coração, pulmão, rim, músculo da coxa direita infectada e músculo da coxa esquerda) foram

dissecadas, pesadas e suas atividades medidas em contador gama. Foi obtida a relação

alvo/não alvo a partir da análise da radiação medida no músculo da coxa direita infectada com

a radiação medida no músculo da coxa esquerda. Utilizou-se padrões de dose para corrigir o

decaimento físico do 99m

Tc para calcular o percentual da dose injetada por grama de tecido

(%ID/g) para cada órgão. Os padrões continham a mesma dose injetada nos camundongos. O

%ID/g para cada órgão foi calculado pela fórmula:

ó ã ó ã

5.11) Histologia

Após os estudos de biodistribuição, os fragmentos de tecido do músculo da coxa direita

infectada ou com a indução de inflamação foram encaminhados para a análise histopatológica

no laboratório de Histopatologia e Imunohistoquímica do setor de Patologia do departamento

de Clínica e Cirurgia Veterinária da UFMG. Os tecidos de músculo da coxa foram dissecados

do osso e os fragmentos de tecido foram fixados em formol 10% por 72 h. Em seguida, os

tecidos foram submetidos a um processo de desidratação, sendo utilizada uma série crescente

de concentrações de álcool etílico: 70% (1 h); 80% (1 h); 90% (1 h); 95% (1 h); 100% (4 h).

Após este processo os fragmentos foram submetidos a um processo de clarificação com a

imersão no solvente xilol por 2 h e por último foram submetidos a um processo de

impregnação com parafina por 3 h. O material resultante foi incluído em moldes de parafina

para a realização de cortes. Secções histológicas de 4 µm foram coradas por hematoxilina-

Eosina (HE), PAS e Good-pastore para avaliação histopatológica. As imagens dos cortes

histológicos foram capturadas por uma câmera digital adaptada a um microscópio óptico

Olympus IX70.

65

5.12) Análise Estatística

O tratamento estatístico dos dados obtidos foi realizado com o auxílio do programa GraphPad

Prism versão 5.01, utilizando-se a Análise da variância (ANOVA) com intervalo de confiança

de 95% e teste de comparação múltipla de Tukey. Também foi utilizada a apresentação dos

dados em gráficos contendo os respectivos desvios-padrão e análise da média dos dados.

66

6-RESULTADOS E DISCUSSÃO


P para células de S. aureus

Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 foram avaliados individualmente quanto a capacidade de

ligação ao alvo, no caso células de S. aureus. Os aptâmeros foram marcados na extremidade

5´com 32

P e incubados com 1x 107 células de S. aureus. A biblioteca de oligonucleotídeos

também foi marcada e utilizada como controle. Pode-se observar que os aptâmeros marcados

apresentaram alta capacidade de ligação a células de S. aureus, pois a contagem em cpm

relativa a biblioteca, que apresenta diversas sequências aleatórias, apresentou-se desprezível

em comparação aos três aptâmeros analisados. A leitura da radioatividade em cpm relativa ao

aptâmero SA20 (5 pmol) foi 8751 vezes maior quando comparado com a biblioteca na mesma

concentração (Gráfico 1). A radioatividade devida ao aptâmero SA23 foi 11928 vezes maior

(Gráfico 2) e do aptâmero SA34 foi 9574 vezes maior (Gráfico 3) que a da biblioteca na

mesma concentração.

Bib

l-5

Bib

l-2,5

Bib

l-1,5

-32P

]ATP li

vre

[

SA20

- 5

SA20

- 2,5

SA20

- 1,5

0

10000

20000

30000

40000

cp

m


P a células de S. aureus.

Os valores estão representados como média ± desvio padrão. O asterisco (*) indica

diferenças estatisticamente significativas em relação a biblioteca (p<0,005). Bibl-5:

Biblioteca (5pmol); Bibl-2,5: Biblioteca (2,5 pmol); Bibl-1,5: Biblioteca (1,5 pmol); [γ-32

P]ATP livre; nucleotídeo marcado com 32

P livre; SA20-5: Aptâmero SA20 (5 pmol);

SA20-2,5: Aptâmero SA20 (2,5 pmol); SA20-1,5: Aptâmero SA20 (1,5 pmol).

*

*

*

67

Bib

l-5

Bib

l-2,5

Bib

l-1,5

-32P

]ATP

livr

e

[

SA23

- 5

SA23

- 2,5

SA23

- 1,5

0

10000

20000

30000

40000cp

m

Bib

l-5

Bib

l-2,5

Bib

l-1,5

-32P

]ATP

livr

e

[

SA34

- 5

SA34

- 2,5

SA34

- 1,5

0

10000

20000

30000

40000

cp

m






P]ATP livre: nucleotídeo marcado com 32

P livre ; SA23-5: Aptâmero SA23 (5 pmol);


*

*

*






P]ATP livre: nucleotídeo marcado com 32

P livre; SA34-5: Aptâmero SA34 (5 pmol);


*

*

*

68

CAO et al. (2009), obtiveram resultados semelhantes utilizando ensaio por citometria de fluxo

que avaliou a capacidade de ligação dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 a células de

S. aureus. Os autores utilizaram diferentes linhagens de S. aureus (ATCC 8325-4; ATCC 196

e ATCC 04018) enquanto que neste estudo foi utilizada a linhagem ATCC 25923. O

aptâmero SA23 foi o que apresentou maior capacidade de ligação, de acordo com os dados de

EC50 (tabela 3) obtidos por Cao et al. (2009), para a linhagem ATCC 8325-4 e com os

resultados observados no ensaio de ligação com aptâmeros marcados com 32

P obtidos no

presente trabalho (tabela 4). O EC50 indica a concentração da substância em estudo que induz

metade do efeito máximo e quanto menor o EC50 maior a afinidade. Portanto, os resultados

do ensaio de ligação comprovaram a afinidade dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 para

células de S. aureus.

Tabela 3: EC50 para células de S. aureus da linhagem ATCC 8325-4.

Aptâmero EC50 (nM)

SA20 70.86 ± 39.22

SA23 61.50 ± 22.43

SA34 72.42 ± 35.23

Tabela 4: Determinação da radioatividade incorporada aos pellets de S. aureus

da linhagem ATCC 25923*

Aptâmero Cintilações por minuto (cpm)

SA20 25902,49 ± 3793,16

SA23 36497,47 ± 2123,51

SA34 25742,51 ± 787,39

FONTE: modificado de Cao et al. (2009).

* Resultados para os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 32

P na concentração de

5 pmol. Os valores estão representados como média ± desvio padrão.

69

6.2) Marcação com 99m

Tc e avaliação da estabilidade dos aptâmeros marcados

O pool dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 foi marcado com 99m

Tc pela metodologia de

marcação direta descrita no item 5.7 da secção de Material e Métodos. Para a marcação com

99mTc foram utilizados aptâmeros modificados na extremidade 5´ pela adição de um espaçador

de seis carbonos ligado a um grupamento NH2. A estabilidade da marcação foi avaliada em

solução salina 0,9%, plasma de camundongos Swiss e em excesso de cisteína (50, 500, 5000

vezes) nos tempos de 1, 2, 4, e 24 h. Os resultados obtidos estão representados como média ±

desvio padrão. Os coligantes EDDA e tricina utilizados no processo de marcação também

foram marcados na ausência dos aptâmeros e avaliados quanto a estabilidade em solução

salina 0,9%.

Como observado, os aptâmeros marcados foram estáveis em solução salina 0,9% (Tabela 5),

plasma de camundongos Swiss (Tabela 6) e em excesso de cisteína (50, 500 e 5000 vezes)

(Tabela 7), nos tempos de 1, 2, 4, e 24 h. A estabilidade da marcação na presença de excesso

de cisteína, aminoácido que possui um grupamento SH doador de elétrons pelo qual o 99m

Tc

apresenta grande afinidade e que compete com as moléculas vizinhas pelo 99m

Tc, demonstrou

a firmeza do complexo 99m

Tc-aptâmero e a eficiência do processo de marcação direta.

Os coligantes marcados isoladamente não apresentaram estabilidade em solução salina

(Tabela 8). Estes resultados atestam a estabilidade da marcação direta com 99m

Tc e excluem a

presença de quantidades significativas de coligantes marcados na preparação do aptâmero

marcado, uma vez que a porcentagem de marcação dos aptâmeros em solução salina se

manteve praticamente constante por 24 h.

Tabela 5: Estabilidade em solução salina 0,9%

Tempo (h) Marcação (%)*

1 87,72% ± 1,46

2 86,17% ± 1,11

4 85,36% ± 3,29

24 85,75% ± 0,63

*Os resultados obtidos estão representados como média ± desvio padrão.

70

Tabela 6: Estabilidade no plasma

Tempos (h) Marcação (%)*

1 93,97% ± 0,30

2 97,58% ± 0,52

4 97,54% ± 0,33

24 97,00% ± 0,66


Tabela 7: Estabilidade em excesso de cisteína

Cisteína 1:50 Cisteína 1:500 Cisteína 1:5000

Tempo (h) Marcação (%)* Marcação (%)* Marcação (%)*

1 84,59% ± 3,97 89,29% ± 0,78 90,55% ± 0,22

2 86,77% ± 1,79 83,44% ± 2,67 91,28% ± 1,72

4 84,05% ± 0,41 86,12% ± 1,13 90,23% ± 6,36

24 83,61% ± 0,13 83,79% ± 0,14 99,08% ± 0,08


Tabela 8: Estabilidade dos coligantes tricina e EDDA em solução salina 0,9%

Tempo (h) Marcação (%)*

1 70,06% ± 1,94

2 60,07% ± 0,63

4 53,41% ± 0,06

24 37,13% ± 0,73


71


Tc

Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34, individualmente, e a biblioteca foram marcados com

99mTc. O rendimento da marcação foi determinado por CCD (Tabela 9). Após a incubação dos

aptâmeros e da biblioteca com 1 x 107 células de S. aureus foi observado que os aptâmeros

SA20, SA23 e SA34 apresentaram ligação a células de S. aureus (Gráfico 4). Porém, a

biblioteca não apresentou contagem desprezível como no ensaio de marcação com 32

P,

possivelmente devido à permanência de impurezas como 99m

TcO4- e

99mTcO2 (como

demostrado na Tabela 9 através da porcentagem de marcação), e mesmo quantidades residuais

dos coligantes marcados que podem ser responsáveis por ligações inespecíficas. Embora para

todos os aptâmeros a ligação tenha sido superior a da biblioteca, apenas para o aptâmero

SA34 esta diferença foi estatisticamente significativa. Temos que levar em consideração que a

marcação com 99m

Tc pode alterar a afinidade dos aptâmeros pelo alvo. O ensaio in vitro com

aptâmeros marcados com 99m

Tc, entretanto, devido a alta leitura obtida com a biblioteca, não

permitiu elucidar uma possível alteração nas afinidades dos aptâmeros.

Bib

liote

ca

SA20

SA23

SA34

0

20000

40000

60000

cp

m

Gráfico 4: Ensaio de ligação dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcado com 99m

Tc a

células de S. aureus. Os valores estão representados como média ± desvio padrão. O

asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa em relação a biblioteca

(p<0,005).

*

72

Tabela 9: Rendimento da marcação dos aptâmeros SA20, SA23, SA34

e da biblioteca com 99m

Tc.

Amostras Marcação (%)*

Biblioteca 83,60% ± 2,80

SA20 82,93% ± 0,99

SA23 82,13% ± 2,77

SA34 82,37% ± 2,44

6.4) Biodistribuição

Para os estudos de biodistribuição foram utilizados três grupos de camundongos Swiss

contendo 6 animais em cada (n=6). A biodistribuição foi realizada no tempo de 4 h após a

administração do pool de aptâmeros (SA20, SA23 e SA34) anti S. aureus marcados com

99mTc.

A utilização de vários aptâmeros combinados apresenta um efeito somatório no

reconhecimento de S. aureus em relação a utilização de somente um aptâmero, visto que cada

um dos aptâmeros utilizados apresenta alvos diferenciados na superfície da bactéria em

relação aos demais (CAO et al, 2009). Para o diagnóstico de uma célula bacteriana inteira, um

único aptâmero pode vir a fornecer um resultado falso-negativo. Uma bactéria em diferentes

estados de crescimento pode expressar diferentes conjuntos de moléculas e, além disso, a

bactéria pode apresentar variações antigênicas para escapar da vigilância dos hospedeiros.

Portanto, a detecção baseada em uma única molécula pode excluir bactérias que não estejam

expressando esta molécula específica em um dado momento ou que podem estar expressando

a molécula mutada. Assim, explorar diferentes alvos na célula bacteriana pode aumentar a

sensibilidade da detecção. CAO et al (2009), utilizando citometria de fluxo e microscopia

confocal, demostraram que a utilização de um pool de aptâmeros combinados apresentou

efeito superior no reconhecimento de diferentes linhagens de S. aureus ou de células em

diferentes estados de crescimento, quando comparados com um aptâmero individual. Esse

efeito foi visualizado através de um aumento na intensidade da fluorescência quando o pool

de aptâmeros foi utilizado em relação a utilização de um aptâmero isoladamente. Nos estudos

in vivo no presente projeto foram utilizados os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 modificados

na extremidade 5´ com a adição de um grupo amino (-NH2) para conferir maior resistência a

ação de nucleases presentes no sangue.

*Os resultados obtidos estão representados como média ± desvio padrão

73

Os camundongos do grupo 1 e do grupo 2 foram infectados com células de S. aureus e com

células de C. albicans, respectivamente, por via intramuscular na coxa direita. Nos animais do

grupo 3 foi induzida inflamação no músculo da coxa direita com a administração de zimosan

5%, conforme metodologia descrita no item 5.10. Após 24 h foi injetado o pool de aptâmeros

anti S. aureus marcados com 99m

Tc, por via intravenosa (100 µl), e a biodistribuição foi

determinada. A Tabela 10 apresenta os resultados para o grupo 1, a Tabela 11 para o grupo 2

e a Tabela 12 para o grupo 3 com inflamação induzida.

74

Tabela 10: Resultado da Biodistribuição do pool de aptâmeros SA20, SA23 e SA34, marcados com 99m

Tc no grupo infectado por S. aureus (n=6) obtidos no tempo de 4 h.

CA1 CA2 CA3 CA4 CA5 CA6 MÉDIA

TECIDO cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g cpm/g %ID/g

Sangue NA* NA* 52496,10 0,11 72604,74 0,12 77041,21 0,11 90721,23 0,13 74497,77 0,11 73472,21 ± 13711,93 0,12 ± 0,01

Fígado 126319,60 0,24 104886,20 0,21 66218,91 0,11 125979,00 0,18 253330,50 0,37 132829,30 0,19 134927,25 ± 62930,43 0,22 ± 0,09

Baço 8481,69 0,02 31588,33 0,06 52206,58 0,08 32745,81 0,05 67748,88 0,10 56268,53 0,08 41506,63 ± 21386,12 0,07 ± 0,03

Estômago 135991,70 0,26 33365,90 0,07 37368,45 0,06 556313,10 0,82 61817,57 0,09 71542,49 0,10 149399,86 ± 202734,10 0,23 ± 0,30

Rim 527387,70 0,99 694425,30 1,42 807354,80 1,30 498142,70 0,73 424831,40 0,62 650644,90 0,95 600464,46 ± 141991,00 1,00 ± 0,31

Coração NA* NA* NA* NA* NA* NA* 37568,20 0,06 54840,20 0,08 52891,08 0,08 48433,16 ± 9459,66 0,07 ± 0,01

Pulmão NA* NA* NA* NA* NA* NA* 71465,89 0,10 62950,09 0,09 63125,64 0,09 48433,16 ± 4866,71 0,09 ± 0,01

Coxa com infecção 45003,24 0,08 246713,00 0,51 160581,10 0,26 81827,21 0,12 112167,90 0,16 89848,17 0,13 122690,10 ± 71710,17 0,21 ± 0,16

Coxa sem infecção 12118,43 0,02 55075,34 0,11 37321,30 0,06 23011,34 0,03 25435,65 0,04 29065,04 0,04 30337,85 ± 14642,33 0,05 ± 0,03

Relação alvo/não

alvo ** 4 4,63 4,33 4 4 3,25

4,035 ±0,460

*NA- Não avaliado.

** Determinada pela razão da %ID/g entre a coxa com infecção e a coxa sem infecção.

75


Tc no grupo infectado por C. albicans (n=6) obtidos no tempo de 4 h.



Sangue 73401,42 0,11 79099,76 0,12 659164,70 0,09 46463,94 0,07 46044,68 0,07 61139,42 0,09 160885,60 ± 244480,9 0,09 ± 0,02

Fígado 248047,50 0,36 257272,60 0,38 677033,20 0,38 152049,50 0,24 303096,20 0,47 293167,20 0,43 321777,70 ± 182087,2 0,38 ± 0,08

Baço 48939,30 0,07 38745,56 0,06 645759,30 0,07 40429,08 0,06 24604,38 0,04 41798,24 0,06 140046,00 ± 247875,4 0,06 ± 0,01

Estômago 73490,64 0,11 114678,60 0,17 674580,00 0,04 33102,00 0,05 71536,92 0,11 159300,80 0,23 187781,50 ± 247875,4 0,12 ± 0,07

Rim 1024386,00 1,50 601504,60 0,88 683528,00 0,70 991629,30 1,54 621518,50 0,97 606459,40 0,89 754837,60 ± 198551,2 1,08 ± 0,35

Coração 60751,81 0,09 29642,26 0,04 741056,50 0,05 33760,74 0,05 28649,30 0,04 50627,72 0,07 157414,70 ± 286210,3 0,06 ± 0,02

Pulmão 61084,22 0,09 34891,63 0,05 697832,60 0,05 44434,06 0,07 32992,77 0,05 62957,18 0,09 155698,70 ± 265892,1 0,07 ± 0,02



Relação alvo/não

alvo*

2,2

1,6

1,6

2

2

2,75

2,025 ±0,429

* Determinada pela razão da %ID/g entre a coxa com infecção e a coxa sem infecção.

76


Tc, no grupo com a indução de inflamação estéril por zimosan (n=6),

obtidos no tempo de 4 h.



Sangue 37021,83 0,07 49110,38 0,10 NA* NA* 50609,51 0,08 41444,63 0,06 35837,64 0,06 42804,80 ± 6791,69 0,07 ± 0,02

Fígado 75795,52 0,14 141209,90 0,29 84496,56 0,17 105544,00 0,17 164829,80 0,26 135859,50 0,21 117955,88 ± 34955,77 0,21 ± 0,06

Baço 11371,48 0,02 37444,85 0,08 22840,89 0,05 42605,96 0,07 51122,41 0,08 32480,47 0,05 32977,67 ± 14224,77 0,06 ± 0,02

Estômago 71527,98 0,13 27856,61 0,06 137633,80 0,28 61106,73 0,10 139329,50 0,22 322096,70 0,50 126591,88 ± 105428,00 0,22 ± 0,16

Rim 623889,10 1,17 747407,30 1,53 543320,90 1,11 994744,50 1,60 1164624,00 1,81 860710,80 1,34 822449,43 ± 232896,20 1,43 ± 0,27

Coraçao NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* 35830,17 0,06 24050,00 0,04 29940,08 ± 8329,84 0,05 ± 0,01

Pulmão NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* NA* 50526,12 0,08 33925,23 0,05 42225,67 ± 11738,60 0,07 ± 0,02



Relação alvo/não

alvo** 1,5

1,12

1,23

1 1,2 0,83

1,146 ±0,226

*NA- Não avaliado.

** Determinada pela razão da %ID/g entre a coxa com infecção e a coxa sem infecção.

77

O perfil de biodistribuição do pool de aptâmeros marcados com 99m

Tc em camundongos

Swiss apresentado em %ID/g no grupo infectado com S. aureus (Gráfico 5), no grupo

infectado com C. albicans (Gráfico 6) e no grupo com o desenvolvimento de

inflamação por zimosan (Gráfico 7) mostrou captação acentuada pelos rins indicando

que a eliminação do radiofármaco ocorre por via renal, estando de acordo com a

natureza da molécula que é hidrofílica. Além disso, o radiofármaco mostrou rápida

depuração sanguínea indicada pela reduzida dose em %ID/g no sangue.

Atualmente, o 99m

Tc é o radioisótopo mais utilizado nos procedimentos diagnósticos em

medicina nuclear, devido as suas características físicas favoráveis como meia vida de

6,02 hs e emissão gama principal de 140,51 Kev (89%) (WELCH & REDVANLY,

2003). A marcação de aptâmeros com 99m

Tc tem sido realizada utilizando-se uma etapa

de síntese precedente. Nesta reação uma molécula quelante para o radioisótopo é ligada

ao aptâmero para em seguida o complexo aptâmero-quelante ser marcado. Alguns

quelantes como MAG2, MAG3, MetCyc, HYNIC, DTPA e DOTA tem sido utilizados

com sucesso (ZHANG et al, 2000; HICKE et al, 2006; FERREIRA et al, 2006;

BORBAS et al, 2007).

A utilização de quelantes para marcação com 99m

Tc pode alterar o perfil de

biodistribuição, como observado por HICKE et al (2006). Hicke e colaboradores

utilizaram o aptâmero TTA1 para a proteína extracelular tenascina-C, com a finalidade

de identificar glioblastomas. Ao conjugarem o aptâmero TTA1 ao quelante MAG2 foi

observado elevada captação intestinal, mas com a conjugação do aptâmero ao quelante

DTPA foi observada captação no fígado e rins. Por sua vez, a conjugação de

polietilenogligol (PEG), que é hidrofílico, aboliu a depuração hepatobiliar e levou a alta

captação pelos rins. BORBAS et al (2007), conjugou o aptâmero anti-MUC1,

desenvolvido para o diagnóstico de adenocarcinomas, com MAG3 e observou elevada

captação pelos rins e fígado, mostrando eliminação por via renal. VARMIRA et al

(2013), conjugou o aptâmero anti-HER2, selecionado para o diagnóstico de carcinoma

de óvario humano (linhagem SKOV-3) ao quelante HYNIC e observou elevada

captação pelos rins e rápida depuração no sangue.

No presente estudo não foram utilizados quelantes, pois foi utilizado um processo

inédito de marcação direta de aptâmeros e assim, o perfil de biodistribuição foi devido

apenas às propriedades da molécula do aptâmero que é hidrofílica e de pequeno

78

tamanho. A marcação direta possibilita ganho de tempo e rendimento na preparação dos

aptâmeros radiomarcados, reduzindo o número de etapas. Isto torna o processo mais

fácil e menos dispendioso. A redução da manipulação da preparação diminui ainda as

chances de degradação.

Sangue

Fígad

o

Baç

o

Estôm

ago

Rim

Cora

ção

Pulmão

Coxa

infe

ctad

a

Coxa

não

infe

ctad

a

0.0

0.5

1.0

1.5

%ID

/g

Sangue

Fígad

o

Baç

o

Estôm

ago

Rim

Cora

ção

Pulmão

Coxa

infe

ctad

a

Coxa

não

infe

ctad

a

0.0

0.5

1.0

1.5

%ID

/g


Tc em camundongos

Swiss (n=6) no grupo infectado com S. aureus em %ID/g.


Tc em camundongos

Swiss (n=6) no grupo infectado com C. albicans em %ID/g.

79

Sangue

Fígad

o

Baç

o

Estôm

ago

Rim

Cora

ção

Pulmão

Coxa

infla

mad

a

Coxa

não

infla

mad

a

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

%ID

/g

A contagem em %ID/g na coxa infectada por S. aureus foi estatisticamente superior em

relação aos outros grupos (C. albicans e zimosan), indicando assim a maior captação do

radiofármaco e maior afinidade e especificiadade do mesmo para as células bacterianas,

demostrando a eficácia do radiofármaco na identificação de S. aureus (Gráfico 8).

Ressalta-se que a biodistribuição foi realizada no tempo de 4 h, após a realização das

imagens cintilográficas mostradas na próxima seção. Devida a rápida eliminação do

radiofármaco do organismo pela via urinária e a provável ação de nucleases que

degradam os aptâmeros, pode se supor que valores mais elevados de %ID/g no foco de

infecção poderiam ser obtidos se a biodistribuição fosse realizada em tempos menores

como 1 ou 2 h, por exemplo.


Tc em camundongos

Swiss (n=6) no grupo com o desenvolvimento de inflamação por zimosan em %ID/g.

80

S. a

ureus

C. a

lbic

ans

Zimosa

n

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4%

ID/g

A relação alvo/não alvo nos três grupos foi obtida a partir razão da %ID/g medida no

músculo da coxa direita infectada em relação a obtida no músculo da coxa esquerda

(Gráfico 9). O grupo 1, infectado por S. aureus, mostrou uma elevada relação alvo/não

alvo de 4,03 ± 0,46, enquanto que os outros grupos utilizados como controle

apresentaram relações inferiores. O grupo 2, infectado por C. albicans, apresentou

relação alvo/não alvo de 2,02 ± 0,42 e o grupo 3, com inflamação asséptica por

zimosan, apresentou relação alvo/não alvo de 1,14 ± 0,22. A relação alvo/não alvo deve

ser superior a 1,5 para finalidade de diagnóstico, pois esse valor indica uma captação

pelo menos 50% maior no tecido alvo em relação ao tecido não alvo (PHILLIPS, 1999).

Com base nesse critério os aptâmeros marcados com 99m

Tc mostraram-se altamente

promissores no diagnóstico de infecções causadas por S. aureus. A relação alvo/ não

alvo do grupo infectado por C. albicans mostrou-se ligeiramente superior ao controle

por zimosan, apresentando-se superior a 1,5, possivelmente devido a uma baixa

reatividade cruzada dos aptâmeros com C. albicans. CAO et al (2009), mostraram que

os aptâmeros são específicos para S. aureus com coeficientes de dissociação (Kd) na

faixa de nanomolar e que não apresentaram reatividade cruzada com Streptococcus

A5005, S. epidermidis 26069 e E. coli DH5α, mas o grupo não testou a reatividade

cruzada para C. albicans. Apesar da pequena captação observada em focos de

Gráfico 8: Comparação da %ID/g nas coxas infectadas (S. aureus e C. albicans) e

inflamada (zimosan). O asterisco (*) indica que S. aureus apresenta diferença

estatisticamente significativa em relação aos outros grupos (p<0,05).

*

81

infecciosos devidos a C. albicans, o pool de aptâmeros mostrou diferença significativa

na relação alvo/não alvo entre o grupo infectado por S. aureus e o grupo controle

infectado por C. albicans (Gráfico 9), apresentando a capacidade de diferenciar entre os

dois tipos de infecção. Além disso, a ID%/g (Gráfico 8) na coxa infectada por S. aureus

mostrou diferença estatisticamente significativa em relação aos outros grupos (C.

albicans e zimosan).

VARMIRA et al (2013), marcaram com 99m

Tc um aptâmero de RNA específico para o

receptor HER2, superexpresso em tumores de mama, cabeça e pescoço, próstata e

óvario. O aptâmero de RNA, com finalidade de diagnóstico de carcinoma de óvario

humano (linhagem SKOV-3), foi conjugado ao quelante HYNIC e os estudos de

biodistribuição mostraram elevada captação pelo fígado, não justificada pela natureza

da molécula do aptâmero e do quelante HYNIC (que possuem caráter hidrofílico), e

baixas relações alvo/não alvo (menores que 1). VARMIRA et al (2013), apresentaram

como hipótese para o resultado uma provável reatividade cruzada do aptâmero aos

tecidos do fígado. Assim, apesar dos aptâmeros serem específicos para seus alvos,

reatividade cruzada com outras moléculas pode ocorrer. No presente estudo, a relação

alvo/não alvo estatisticamente superior para S. aureus, demostrando o potencial do pool

de aptâmeros utilizados para o diagnóstico diferencial.

Outra hipótese para o ocorrido seria que um quadro infeccioso grave estimula uma

reação do sistema imune mais acentuada do que uma simples inflamação, com um

aumento da vascularização e presença de um maior número de células

polimorfonucleares. Assim, uma permeabilidade vascular aumentada no grupo de

C. albicans poderia explicar uma relação alvo/não alvo superior ao grupo controle por

zimosan.

Destaca-se que os resultados demonstraram também que os aptâmeros radiomarcados

diferenciaram com facilidade infecção causada por S. aureus de inflamação asséptica,

limitação que tem sido verificada em diferentes radiofármacos utilizados no diagnóstico

de infecção por cintilografia.

82

S. a

ureus

C. a

lbic

ans

Zimosa

n

0

1

2

3

4

5

Rela

ção

alv

o/n

ão

alv

o

KAUL et al (2013), que utilizaram o antibiótico ceftriaxone marcado com 99m

Tc para o

diagnóstico de infecções causadas por estafilococos e bacilos Gram-negativos,

obtiveram uma relação alvo/não alvo de 4.5, mas somente no tempo de 24 h.

CHATTOPADHYAY et al (2012), utilizaram o antibiótico cefuroxima marcado com

99mTc para o diagnóstico de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e obtiveram

relação alvo/não alvo de apenas 1,8 em imagem de 3 h. SIAENS et al (2004), avaliaram

os antibióticos 99m

Tc-enrofloxacina e 99m

Tc-ciprofloxacina que são antibióticos de

amplo espectro para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O estudo demonstrou

que ambos os antibióticos não foram capazes de discriminar entre infecção e inflamação

estéril de acordo com a análise da relação alvo/não alvo obtida por ROI das imagens e

dados de biodistribuição no tempo de 22 h. A relação alvo/não alvo para 99m

Tc-

enrofloxacina foi de 4.2 ± 0,6 e para 99m

Tc-ciprofloxacina foi de 3.8 ± 0,8, mas não

houve diferença significativa em relação ao grupo de inflamação estéril onde esta

relação foi de 4,2. Portanto, essa classe de radiofármacos apresentou dúvidas quanto a

especificidade. No presente estudo foi obtida a relação alvo/não alvo de 4,03 ± 0,46 no

tempo de 4 h, enquanto que relação semelhante só foi obtida no tempo de 22 h para

antibióticos marcados e principalmente esta relação foi estatisticamente superior a

obtida em sítios inflamação asséptica. Com base nestes resultados concluímos que os

Gráfico 9: Relação alvo/não alvo (coxa infectada/coxa não infectada) nos grupos S. aureus,

C. albicans e Zimosan. O asterisco (*) indica diferença estatisticamente significativa entre

todos os grupos (p<0,05).

*

*

*

83

aptâmeros utilizados nesse estudo são moléculas promissoras para o diagnóstico de

infecções devido as suas características de especificidade e afinidade para o seu alvo.

Além disso, devido ao pequeno tamanho estes apresentam rápida depuração plasmática,

sendo que o pico da relação alvo/não alvo pode ser obtido em um tempo menor,

diminuindo assim a dose de exposição ao paciente.

84

6.5) Cintilografia

As imagens cintilográficas obtidas nos tempos de 1 e 4 h após a administração do pool

dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m

Tc por via intravenosa em

camundongos Swiss estão apresentadas na Figura 14 para os animais infectados com S.

aureus, na Figura 15 para os infectados com C. albicans e na Figura 16 para os animais

com indução de inflamação por zimosan.

1 HORA

A1

4 HORAS

A2

B1

B2

Figura 14: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de aptâmeros SA20, SA23

e SA34 marcados com 99m

Tc em camundongos Swiss infectados na coxa direita com S. aureus. As

setas indicam o foco infeccioso. Imagem no tempo de 1h (A1) e 4h (A2) em gradiente de cores.

Imagem no tempo de 1h (B1) e 4h (B2) em preto e branco.

85

1 HORA

A1

4 HORAS

A2

B1

B2

Figura 15: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de aptâmeros

SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m

Tc em camundongos Swiss infectados na coxa

direta com C. albicans. As setas indicam o foco infeccioso. Imagem no tempo de 1h

(A1) e 4h (A2) em gradiente de cores. Imagem no tempo de 1h (B1) e 4h (B2) em preto e

branco.

86

1 HORA

A1

4 HORAS

A2

B1

B2

Figura 16: Imagens cintilográficas obtidas após a administração do pool de aptâmeros

SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m

Tc em camundongos Swiss com uma inflamação

desenvolvida por administração de zimosan na coxa direita. As setas indicam o foco

inflamatório. Imagem no tempo de 1h (A1) e 4h (A2) em gradiente de cores. Imagem no

tempo de 1h (B1) e 4h (B2) em preto e branco.

87

Como pode ser observado, o perfil obtido pelas imagens cintilográficas após a

administração do pool de aptâmeros marcados com 99m

Tc apresentou uma elevada

captação do radiofármaco pelos rins e pela bexiga em todos os grupos. A bexiga foi

editada das imagens no grupo de C. albicans nos tempos de 1 e 4 h (Figura 14) e do

grupo de S. aureus no tempo de 4 h (Figura 13) para melhor vizualização do contorno

do animal, pois o percentual de radiação associado a bexiga foi muito elevado. Esse

perfil está de acordo com os dados obtidos na biodistribuição, indicando a via urinária

como via de eliminação do radiofármaco. Além disso, não foram observados acúmulos

de radioatividade na tireóide, no estômago, no fígado e no baço, indicando assim níveis

aceitáveis de impurezas radioquímicas como o tecnécio livre (99m

TcO4-) e tecnécio

hidrolisado (99m

TcO2).

O grupo infectado por S. aureus apresentou maior captação na coxa direita infectada

sendo visível a diferença entre a coxa direita e esquerda no tempo de 1 h (Figura 13). Os

outros grupos (C. albicans e zimosan) não apresentaram diferenças vísíveis entre a coxa

direita que sofreu a intervenção e a coxa esquerda, estando em consonância com os

resultados obtidos das relações alvo/não alvo nos estudos de biodistribuição.

De acordo com a análise das imagens cintilográficas, o tempo de 1 h foi suficiente para

a ação do radiofármaco como agente para imagem. No tempo de 4 h as imagens já

mostravam pequena captação provavelmente devida á rápida eliminação ou degradação

do radiofármaco, visto que os aptâmeros utilizados foram apenas parcialmente

protegidos contra a ação de nucleases pela adição de um grupo amino na extremidade

5’. CHARLTON et al. (1997), utilizaram aptâmero inibidor de elastase de neutrófilos

humanos para diagnóstico de inflamação e obtiveram uma relação alvo/não alvo de

aproximadamente 4, determinada por análise de ROI nas imagens no tempo de 2 h e

que depois começou a declinar.

Os resultados obtidos neste estudo demonstram que aptâmeros marcados diretamente

com 99m

Tc são promissores no diagnóstico de infecções causadas por S. aureus e abrem

a perspectiva de utilização desta abordagem para o diagnóstico pela cintilografia de

infecções provocadas por outros microrganimos e patógenos.

88

6.6) Histologia

Em todos os animais, foram analisados fragmentos dos tecidos do músculo da coxa

direita infectada (S. aureus e C. albicans) e com a indução de inflamação (zimosan).

Foram preparadas lâminas coradas com hematoxilina-eosina (HE) para os três grupos.

Para os grupos 1 e 2 foram realizadas adicionalmente colorações com good pastore e

PAS, respectivamente, para a identificação diferencial de batérias e fungos. Resultados

representativos para cada grupo estão representados a seguir.

6.6.1) Grupo 1: infectado com S. aureus

Foi observada uma reação mais grave e mais intensa com vários focos coalescentes de

reação inflamatória predominantemente neutrofílica com grande quantidade de

neutrófilos degenerados (piócitos). Foi observado também a presença de material

fibrilar amorfo e eosinofílico em moderada quantidade por entre as células

inflamatórias. Além disso, foi observada grande quantidade de fibras musculares sem

estriações e fragmentadas (necrose) (Figura 17). Foi detectada também a presença de

grumos bacterianos intralesionais com bactérias do tipo cocos que pode ser confirmada

em coloração good pastore (Figura 18).

Diagnóstico: miosite neutrofílica multifocal acoalescente intensa com grumos

bacterianos intralesionais e necrose muscular intensa e extensa agudos.

89

Figura 17: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em microscopia

óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de 200x. A seta indica o

infiltrado inflamatório por entre as fibras musculares. Nota-se a presença de fibras

sem estriações (necrose). Barra de escala: 50 µm.

Aumento, coloração.

Figura 18: Fotomicrografia de infeção intramuscular de S. aureus em microscopia

óptica. Coloração good pastore em aumento de 200x. As setas indicam a presença

de grumos bacterianos do tipo cocos. Nota-se a presença de fibras fragmentadas e

sem estriações (necrose).

90

6.6.2) Grupo 2: Infectado com C. albicans

Foram observadas áreas focalmente extensas por entre as fibras musculares com grande

quantidade de neutrófilos, sendo que muitos deles apresentam-se degenerados (piócitos)

(Figura 19). Por entre esse infiltrado inflamatório e na periferia dele foi observada

discreta quantidade de um material amorfo e fibrilar e eosinofílico (fibrina). As fibras

musculares adjacentes a reação inflamatória apresentaram perda de estriações e

fragmentação (necrose muscular) (Figura 20). Foi observado ainda a presença de raros

mastócitos. Foi detectado a presença de leveduras em coloração PAS (Figura 21).

Diagnóstico: miosite focalmente extensa e intensa supurada aguda.


microscopia óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de 200x.

A seta indica o infiltrado inflamatório por entre as fibras musculares. Barra de

escala: 50 µm.

91


microscopia óptica. Coloração PAS em aumento de 200x. As setas indicam a

presença de leveduras. Barra de escala: 50 µm.


microscopia óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de

200x. A seta indica fibra muscular sem estriações (necrose) próxima ao

infiltrado. Nota-se que a fibra adjacente apresenta-se com estriações. Barra

de escala: 50 µm.

92

6.6.3) Grupo 3: Zymosan

Foi observada reação inflamatória moderada, com pequenos focos de inflamação por

entre as fibras musculares. Além disso, foi obervada discreta quantidade de neutrófilos,

linfócitos e raros plasmócitos. O processo degenerativo nas fibras musculares foi menos

presente que nos outros grupos (Figura 22).

Diagnóstico: miosite linfoplasmocitária e neutrofílica multifocal moderada e aguda.

Os resultados das análises histológicas demostraram que as infecções experimentais,

bem como a inflamação induzida, foram bem sucedidas para todos os animais utilizados

nos experimentos de biodistribuição e cintilografia.

Figura 22: Fotomicrografia de inflamação intramuscular induzida por zimosan

em microscopia óptica. Coloração HE (hematoxilina-eosina) em aumento de

200x. A seta indica o infiltrado inflamatório por entre as fibras musculares. Nota-

se a presença de fibras fragmentadas e sem estriações (necrose). Barra de escala:

50 µm.

93

7- CONCLUSÕES

O ensaio de ligação com os aptâmeros marcados com 32

P comprovaram a afinidade dos

mesmos para células de S. aureus.

Os aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados diretamente com 99m

Tc foram estáveis em

solução salina 0,9%, plasma de camundongos Swiis e em excesso de cisteína.

O ensaios de ligação in vitro com os aptâmeros marcados com 9m

Tc apresentaram

interações inespecíficas provavelmente devidas a presença de impurezas como

99mTcO4

-,

99mTcO2 e quantidades residuais dos coligantes marcados.

Os estudos de biodistribuição dos aptâmeros SA20, SA23 e SA34 marcados com 99m

Tc

mostraram perfil de excreção renal e rápida depuração sanguínea.

O grupo infectado por S. aureus mostrou elevada relação alvo não alvo (4,03 ± 0,46),

enquanto que os grupos utilizados como controle, C. albicans e zimosan, apresentaram

relaçõesalvo/não alvo de 2,02 ± 0,42; 1,14 ± 0,22, respectivamente.

Os estudos de biodistribuição demostraram o potencial de aptâmeros radiomarcados no

diagnóstico de infecções por S. aureus, sendo capazes de diferenciarem com facilidade,

infecção causada por S. aureus de inflamação asséptica, limitação que tem sido

verificada em diferentes radiofármacos utilizados no diagnóstico de infecção por

cintilografia.

Observou-se coerência entre as imagens cintilográficas e as relações alvo/não alvo

obtidas pela biodistribuiçao, sendo que já no tempo de uma hora foi possível obter o

diagnóstico com a maior captação na coxa direita infectada por S. aureus. Já os outros

grupos, C. albicans e zimosan, não apresentaram diferenças vísíveis entre a coxa direita

que sofreu a intervenção e a coxa esquerda.

As análises histológicas comprovaram o modelo experimental, mostrando a infecção

presente na coxa direita infectada por S. aureus ou C. albicans e a inflamação obtida por

zimosan.

O conjunto dos resultados aponta que aptâmeros, diretamente marcados com 99m

Tc, são

moléculas promissoras para utilização como radiofármacos no diagnóstico de infecção

bacteriana.

94

8- PERSPECTIVAS

- Desenvolver e avaliar aptâmeros mais resistentes a nucleases, com alterações nas

extremidades 5’ e 3’, para o diagnóstico de infecção bacteriana.

- Avaliar aptâmeros diretamente marcados com 99m

Tc para o diagnóstico de infecção

bacteriana em tecidos densos como o tecido ósseo.

- Avaliar o efeito da encapsulação de aptâmeros radiomarcados em lipossomas pH-

sensíveis no diagnóstico de infecção bacteriana.

- Marcar os aptâmeros com e emissores de pósitrons como 68

Ga e 18

F e avaliar sua

eficácia para o diagnóstico pela Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET).

- Utilizar aptâmeros radiomarcados para o diagnóstico de infecção por cintilografia de

outros microrganismos e patógenos.

95

9- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADAMIS A. P., ALTAWEEL M., BRESSLER N. M. , et al. Changes in retinal

neovascularization after pegaptanib (Macugen) therapy in diabetic individuals.

Ophthalmology, v. 113, n °1, p. 23-8, 2006.

ALLEN P., GOLD L. High affinity nucleic acid ligands to HIV integrase. US5587468;

1996

ALLEN P. N., GOLD L. High affinity HIV nucleocapsid nucleic acid ligands.

US5654151; 1997

BANERJEE J., NILSEN- HAMILTON M. Aptamers: multifunctional molecules for

biomedical research. J Mol Med, v. 91, p.1333–1342, 2013

BARRERA P., VAN DER LAKEN C. J., OVEN W. J.G., VAN DE PUTTE,

CORSTENS F. Radiolabeled IL-1ra for detection of synovitis in patients with RA

Preliminary results. Arthritis Rheum, v. 41, p. 37, 1998.

BATES P. J. , LABER D. A. , MILLER D. M. , THOMAS S. D., TRENT J. O.

Discovery and development of the G-rich oligonucleotide AS1411 as a novel treatment

for cancer. Exp Mol Pathol, v. 86, n° 3, p. 151–64, 2009.

BECKER W., BAIR J., BEHR T., REPP R., STRECKENBACH H., BECK H., et al.

Detection of soft-tissue infections and osteomyelitis using a Tc-99M-labeled

antigranulocyte monoclonal-antibody fragment. J Nucl Med., v. 35, p. 1436–43, 1994.

BEKERMAN C., HOFFER P. B., BITRAN J. D. The role of gallium-67 in the clinical

evaluation of cancer. Semin Nucl Med., v.14, p. 296–323, 1984.

BERENS, C., THAIN, A., SCHROEDER, R. A tetracycline-binding RNA aptamer.

Bioorg. Med. Chem., v. 9, p. 2549–2556, 2001.

BIANCHINI M., RADRIZZANI M., BROCARDO M.G., REYES G.B., GONZALEZ

S.C., SANTA-COLOMA T.A. Specific oligobodies against ERK-2 that recognize both

the native and the denatured state of the protein. J. Immunol. Methods, v. 252, p. 191–

197, 2001.

BIESECKER G.. et al. Derivation of RNA aptamer inhibitors of human complement

C5. Immunopharmacology, v. 42, p. 219–230 ,1999.

BLANK M., WEINSCHENK T., PRIEMER M., SCHLUESENER H. Systematic

evolution of a DNA aptamer binding to rat brain tumor microvessels selective targeting

of endothelial regulatory protein pigpen. J. Biol. Chem., v. 276, p. 16464–16468, 2001.

BOCK L.C., GRIFFIN L.C., LATHAM J.A., VERMAAS E.H., TOOLE J.J. Selection

of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature, v.

355, p. 564–566, 1992.

96

BOIZIAU C., DAUSSE E., YURCHENKO L., TOULME J.J. DNA aptâmeros selected

against the HIV-1 trans-activation-responsive RNA element form RNA-DNA kissing

complexes. J. Biol. Chem., v. 274, p. 12730–12737, 1999.

BORBAS K., FERREIRA C., PERKINS A., BRUCE J., MISSAILIDIS S. Design and

Synthesis of Mono- and Multimeric Targeted Radiopharmaceuticals Based on Novel

Cyclen Ligands Coupled to Anti-MUC1 Aptamers for the Diagnostic Imaging and

Targeted Radiotherapy of Cancer. Bioconjugate Chem, v. 18, p. 1205-1212, 2007.

BRIDONNEAU P., CHANG Y-F, BUVOLI V-B, O’CONNELL D., PARMA D. Site-

directed selection of oligonucleotide antagonists by competitive elution. Antisense

Nucleic Acids Drug Dev, v. 9, p.1–11, 1999.

BRITTON K. E., WAREHAM D. W., DAS S. S., SOLANKI K. K., AMARAL H.,

BHATNAGAR A., et al. Imaging bacterial infection with Tc-99mciprofloxacin

(Infecton). J Clin Pathol, v. 55, p. 817–23, 2002.

BRUNO J.G., KIEL J.L. In vitro selection of DNA aptamers to anthrax spores with

electrochemiluminescence detection. Biosens. Bioelectron., v. 14, p. 457–464, 1999.

BUNKA D., PLATONOVA O., STOCKLEY P. Development of aptamer therapeutics.

Current Opinion in pharmacology, v. 10, p. 557-562, 2010.

BURGSTALLER P., FAMULOK,M. Isolamento de aptâmeros de RNA para cofatores

biológicos por seleção in vitro. Angew. Chem., v. 106, p. 1163–1166, 1994.

BURKE D.H., HOFFMAN D.C., BROWN A., HANSEN M., PARDI A., GOLD L.

RNA aptamers to the peptidyl transferase inhibitor chloramphenicol. Chem. Biol., v. 4,

p. 833–843, 1997.

CAO X., LI S., CHEN L., DING H., XU H., HUANG Y., LI J., LIU N., CAO W., ZHU

Y., SHEN B., SHAO N. Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection

of Staphylococcus aureus. Nucleic Acid Research, v. 37, n° 14, p. 4621-4628, 2009.

CHAN, M. Y. et al. Phase 1b randomized study of antidote-controlled modulation of

factor IXa activity in patients with stable coronary artery disease. Circulation, v. 117,

p. 2865–2874, 2008.

CHARLTON J., SENNELLO J., SMITH D. In vivo imaging of inflammation using an

aptamer inhibitor of human neutrophil elastase. Chemistry & Biology, v. 4, No 11, p.

809-816, 1997.

CHATTOPADHYAY S., MAYURI G., SETT S., et al. Preparation andevaluationof 99m

Tc-cefuroxime,a potential infection specific imaging agent:A reliable thin layer

chromatographic system to delineate impurities from the 99m

Tc-antibiotic. Applied

Radiation and Isotopes, v. 70, p. 2384–2387, 2012.

CHEN F., HU Y., LI D., CHEN H., ZHANG X.L. CS-SELEX generates high affinity

ssDNA aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2.

PLoS One, v. 4, n°12, p. 8142, 2009.

97

CHEN F., J. ZHOU, F. LUO, A.B. MOHAMMED, X.L. ZHANG. Aptamer from

wholebacterium SELEX as new therapeutic reagent against virulent Mycobacterium

tuberculosis. Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 357, p. 743-748, 2007.

CHEN L., D.Q. LI, J. ZHONG, X.L. WU, Q. CHEN, H. PENG, S.Q. LIU. IL17RA

aptamer mediated repression of IL-6 inhibits synovium inflammation in a murine model

of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage , v.19, p. 711-718, 2011.

CIBIEL A., PESTOURIE C., DUCONGÉ F. In vivo uses of aptamers selected against

cell surfasse biomarkers for therapy and molecular imaging. Biochimie, v. 94, p. 1595-

1606, 2012.

CIESIOLKA, J., GORSKI, J., YARUS, M. Selection of an RNA domain that binds

Zn2+. RNA, v. 1, p. 538–550, 1995.

CONRAD R., L.M. KERANEN, A.D. ELLINGTON, A.C. NEWTON. ‘Isozyme-

specific Inhibition of ProteinKinase CbyRNAAptamers’. J. Biol.Chem.,v. 269, n° 51,

p. 32051–32054, 1994.

DAMICO F. Angiogênese e doenças da retina. Arq Bras Oftalmol., v. 70, n° 3, p. 547-

53, 2007.

DANIELS D.A., CHEN H., HICKE B.J., SWIDEREK K.M., GOLD L. A tenascin-C

aptamer identified by tumor cell SELEX: Systematic evolution of ligands by

exponential enrichment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 100, p. 15416–15421, 2003.

DATZ FREDERICK L. Indium-Ill-Labeled Leukocytes for the Detection of Infection:

Current Status. Seminars in Nuclear Medicine, v. XXIV, No 2, p 92-109, 1994.

DATZ F., THORNE D. Effect of chronicity of infection on the sensitivity of the 111

In-

labeled leukocyte scan. AJR, v. 147, p. 809-812, 1986.

DAVIS K.A., ABRAMS B., LIN Y., JAYASENA S.D. Use of a high affinity DNA

ligand in flow cytometry (Reprinted from Nucleic Acids Research). J. Clin. Ligand

Assay, v. 20, p. 90–97, 1997.

DIENER, J. L. et al. Inhibition of von Willebrand factormediated platelet activation and

thrombosis by the anti-von Willebrand factor A1-domain aptamer ARC1779. J.

Thromb. Haemost., v. 7, p. 1155–1162, 2009.

DINGES M., ORWIN P., SCHLIEVERT P. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin.

Microbiol. Rev, v. 13, p. 16-34, 2000.

DOLLINS C. M., S. NAIR, D. BOCZKOWSKI, J. LEE, J.M. LAYZER, E. GILBOA,

B.A. SULLENGER. Assembling OX40 aptamers on a molecular scaffold to Create a

receptor-Activating aptamer. Chem. Biol., v. 15, 675-682, 2008.

ELLINGTON A. D., SZOSTAK J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind

specific ligands. Nature, v. 346, p. 818-822, 1990.

98

FAMULOK, M. Molecular recognition of amino-acids by RNA–aptamers—an L-

citrulline binding RNA motif and its evolution into an L-arginine binder. J. Am. Chem.

Soc., v. 116, p. 1698–1706, 1994.

FERREIRA, C. S., MISSAILIDIS S. Aptamer-based Therapeuticis and their potencial

in radiopharmaceutical Design. Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 50,

p. 63-76, 2007.

FERREIRA C.S.M., MATTHEWS C.S., MISSAILIDIS S. DNA aptamers that bind to

MUC1 tumour marker: design and characterization of MUC1-binding single-stranded

DNA aptamers. Tumor Biol., v. 27, p. 289–301, 2006.

FIDEL J. VOS, CHANTAL P. BLEEKER-ROVERS, PATRICK D. STURM, et al.

Oyen F-FDG PET/CT for Detection of Metastatic Infection in Gram-Positive

Bacteremia. The Journal of Nuclear Medicine, v. 51, N°8, 2010.

GEIGER A., BURGSTALLER P., VON DER ELTZ H., ROEDER A., FAMULOK M.

RNA aptamers that bind L-arginine with sub-micromolar dissociation constants and

high enantioselectivity. Nucleic Acids Res, v. 24, p.1029–36, 1996.

GEMMEL F., DUMAREY N., WELLING M. Future diagnostic agents. Semin Nucl

Med, v. 39, p.11–26, 2009.

GEMMEL F., WYNGAERT V., LOVE C., WELLING M., GEMMEL P., PALESTRO

C.Prosthetic joint infections: radionuclide state-of-the-art imaging. Eur J Nucl Med

Mol Imaging, v. 39, p. 892–909, 2012.

GOLD L., TUERK C. Ligands of HIV-1 tat protein. US5527894; 1996

GOLD L, TUERK C. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev. US5496938;

1996.

GOMES C., ABRUNOSA A., RAMOS P., PAUWELS E. Molecular imaging with

SPECT as a tool for drug development. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 63, p.

547–554, 2011.

GRAGOUDAS, E. S. et al. Pegaptanib for neovascular age-related macular

degeneration. N. Engl. J. Med, v. 351, p. 2805–2816, 2004.

GRATZ S., SCHIPPER M. L., DORNER J., HOFFKEN H., BECKER W., KAISER J.

W., et al. LeukoScan for imaging infection in different clinical settings—a retrospective

evaluation and extended review of the literature. Clin Nucl Med, v. 28, p. 267–76,

2003.

GREEN L. S., JELLINEK D., JENISON R., OSTMAN A., HELDIN C.H., JANJIC N.

Inhibitory DNA ligands to platelet-derived growth factor B-chain. Biochemistry, v. 35,

n° 45, p.14413–24, 1996.

99

GUO K. T., SCHAFER R., PAUL A., et al. Aptamer-based strategies for stem cell

research. Mini Rev Med Chem., v. 7, p. 701–705, 2007.

GUTSAEVA D. R., J.B. PARKERSON, S.D. YERIGENAHALLY, J.C. KURZ, R.G.

SCHAUB, T. IKUTA, C.A. HEAD. Inhibition of cell adhesion by anti-P-selectin

aptamer: a new potential therapeutic agent for sickle cell disease. Blood, v.117, p. 727-

735, 2010.

GUYTON & HALL. Tratado de Fisiologia Médica. Saunders, pg 434-435, 2006.

HALLER A. A., SARNOW P. In vitro selection of a 7-methyl-guanosine binding RNA

that inhibits translation of capped mRNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 94,

p. 8521–6, 1997.

HARWOOD S.J., VALDIVIA S., HUNG G. L., QUENZER R. W. Use of sulesomab, a

radiolabeled antibody fragment, to detect osteomyelitis in diabetic patients with foot

ulcers by leukoscintigraphy. Clin Infect Dis, v. 28, p. 1200–5, 1999.

HE J. L., WU Z. S., ZHANG S. B., SHEN G. L., YU R. Q. Fluorescence aptasensor

based on competitive-binding for human neutrophil elastase detection. Talanta, v. 80,

n° 3, p. 1264–8, 2010.

HICKE B. J., STEPHENS A.W., GOULD T., CHANG Y.F., LYNOTT C.K., HEIL J.,

BORKOWSKI S., et al. Tumor targeting by an aptamer, J. Nucl. Med., v. 47, p. 668-

678, 2006.

HICKE B.J.,WATSON S.R., KOENIG A., LYNOTT C.K., BARGATZE R. F.,

CHANG Y.F., et al. DNA aptamers block L-selectin function in vivo. Inhibition of

human lymphocyte trafficking in SCID mice. J. Clin. Invest., v. 98, p. 2688–2692,

1996.

HOFMANN P., LIMMER S., HORNUNG V., SPRINZL M. Ni21-binding RNA motifs

with an asymmetric purine-rich internal loop and a G-A base pair. RNA, v. 3, p. 1289–

300, 1997.

HOMANN M., GORINGER H.U. Combinatorial selection of high affinity RNA ligands

to live African trypanosomes. Nucleic Acids Res., v. 27, p. 2006–2014, 1999.

JAMES WILLIAM. Aptamers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Wiley, p. 4848-

4871, 2000.

JANEWAY C. A., TRAVERS M. W., SHLOMCHIK M. Imunobiologia: O sistema

immune na saúde e na doença. Artemed, pg 89-99, 2002.

JANJIC N, GOLD L, SCHMIDT P, VARGEESE C. Vascular endothelial growth factor

(VEGF) nucleic acid ligand complexes. US6051698; 2000.

JANJIC N., GOLD L. High affinity PDGF nucleic acid ligands. US5668264; 1997.

100

JAYASENA D. SUMEDHA. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival

Antibodies in Diagnostics. Clinical Chemistry, v. 45, p. 1628-1650, 1999.

JELLINEK D., GREEN L.S., BELL C., JANJIC N. Inhibition of receptor binding by

high-affinity RNA ligands to vascular endothelial growth factor. Biochemistry, v. 33,

p. 10450–10456, 1994.

JEON S., B. KAYHAN, T. BEN-YEDIDIA, R. ARNON. A DNA aptamer prevents

influenza infection by blocking the receptor binding region of the viral haemagglutinin.

J. Biol. Chem., v. 279, p. 48410-48419, 2004.

KAUL A., HAZARI P., RAWAT H., SINGH B., KALAWAT T., SHARMA S.,

BABBAR A., MISHRA A. Preliminary evaluation of technetium-99m-labeled

ceftriaxone: infection imaging agent for the clinical diagnosis of orthopedic infection.

International Journal of Infectious Diseases, v. 17, p. 263–270, 2013.

KO J., LEE Y., PARK I., CHO B. Identification of a structural motif of 23S rRNA

interacting with 5S rRNA. FEBS Lett., v. 508, p. 300–304, 2001.

KOIZUMI M., BREAKER R.R. Molecular recognition of cAMP by an RNA aptamer.

Biochemistry, v. 39, p. 8983–8992, 2000.

KONG H., BYUN J. Nucleic Acid Aptamers: New Methods for Selection, Stabilization,

and Application in Biomedical Science. Biomol Ther, v. 21, n° 6, p. 423-434, 2013.

KUBIK M.F., BELL C., FITZWATER T.,WATSON S.R., TASSET D.M. Isolation

and characterization of 20-fluoro-, 20-amino-, and 20 fluoro/amino-modified RNA

ligands to human IFN-gamma that inhibit receptor binding. J. Immunol., v. 159, p.

259–267, 1997.

LARIKKA M. J., AHONEN A. K., JUNILA J. A., NIEMELÄ O., HÄMÄLÄINEN M.

M., SYRJÄLÄ H. P. Extended combined 99mTc-white blood cell and bone imaging

improves the diagnostic accuracy in the detection of hip replacement infections. Eur J

Nucl Med, v. 28, p. 288–93, 2001.

LATO S.M., BOLES A.R., ELLINGTON A.D. In-vitro selection of RNA lectins—

using combinatorial chemistry to interpret ribozyme evolution. Chem. Biol., v. 2, p.

291–303, 1995.

LAUHON C.T., SZOSTAK J.W. RNA aptamers that bind flavin and nicotinamide

redox cofactors. J. Am. Chem. Soc., v. 117, p. 1246–1257, 1995.

LEE J., YIGIT M., MAZUMDAR D., LU Y. Molecular diagnostic and drug delivery

agents based on aptamer-nanomaterial conjugates. Advanced Drug Delivery Reviews,

v. 62, p. 592–605, 2010.

LEVY M., CATER S., ELLINGTON A. Quantum-Dot Aptamer Beacons for the

Detection of Proteins. ChemBioChem, v. 6, p. 2163, 2005.

101

LEVY S., M. D. Antibiotic and antiseptic resistance: impact on public health. Pediatr

Infect Dis J., v. 19, No. 10, p S120–2, 2000.

LIBERATORE M., CLEMENTE M., IURILLI A. P., ZORZIN L., MARINI M.,

DIROCCO E., et al. Scintigraphic evaluation of disease-activity in rheumatoid-

arthritis—a comparison of Tc-99M human nonspecific immunoglobulins, leukocytes

and albumin nanocolloids. Eur J Nucl Med, v. 19, p. 853–7, 1992.

LIMA & OLIVEIRA. Atualização em infecções em próteses articulares. Rev Bras

Ortop., v. 45, p. 520-3, 2010.

LIU J., LEE J.H., LU Y. Quantum Dot Encoding of Aptamer-Linked Nanostructures for

One Pot Simultaneous Detection of Multiple Analytes. Anal. Chem., v. 79, p. 4120,

2007.

LIU J., STORMO G.D. Combining SELEX with quantitative assays to rapidly obtain

accurate models of protein–DNA interactions. Nucleic Acids Res., v. 33, p.141, 2005.

LIU Y., KUAN C.T., MI J., ZHANG X., CLARY B. M., BIGNER D.D., SULLENGER

B.A. Aptamers selected against the unglycosylated EGFRvIII ectodomain and delivered

intracellularly reduce membrane-bound EGFRvIII and induce apoptosis. Biol. Chem, v.

390, p. 137–144, 2009.

LOCHRIE M. A., GOLD L. High affinity HIV-1 gag nucleic acid ligands. US5726017;

1998.

LORSCH J.R., SZOSTAK J.W. In vitro selection of RNA aptamers specific for

cyanocobalamin. Biochemistry, v. 33, p. 973–982, 1994.

LOWY F. D.Staphylococcus aureus infections. New Engl. J. Med., v. 339, p. 520-532,

1998.

LUPETTI A., WELLING M. M., MAZZI U., NIBBERING P. H., PAUWELS E. K. J.

Technetium-99m labelled fluconazole and antimicrobial peptides for imaging of

Candida albicans and Aspergillus fumigatus infections. Eur J Nucl Med Mol Imaging,

v. 29, p. 674–9, 2002.

M. LEVY, S.F. CATER, A.D. ELLINGTON. Quantum-Dot Aptamer Beacons for the

Detection of Proteins. Chem Bio Chem, v. 6, p. 2163, 2005.

MAASCH, C. et al. Physicochemical stability of NOX-E36, a 40mer l-RNA

(Spiegelmer) for therapeutic applications. Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf.), v. 52, p.

61–62, 2008.

MAJERFELD I., YARUS M. An RNA pocket for an aliphatic hydrophobe. Nat.

Struct. Mol. Biol., v. 1, p. 287–292, 1994.

MALLIKARATCHY P., TANG Z., KWAME S., MENG L., SHANGGUAN D., TAN

W. Aptamer directly evolved from live cells recognizes membrane bound

102

immunoglobin heavy mu chain in Burkitt’s lymphoma cells. Mol. Cell. Proteomics, v.

6, p. 2230–2238, 2007.

MANNIRONI C., NARDO A. D., FRUSCOLONI P., TOCCHINI-VALENTINI G. P.

In vitro selection of dopamine RNA ligands. Biochemistry, v. 36, p.9726–34, 1997.

MARQUES F., OKAMOTO M., BUCHPIGUEL C. Alguns aspectos sobre geradores e

radiofármacos de tecnécio-99m e seus controles de qualidade. Radiol Bras, v. 34, p

233-239, 2001.

MCNAMARA J. O., KOLONIAS D., PASTOR F., MITTLER R.S., et al. Multivalent

4-1BB binding aptamers costimulate CD8þ T cells and inhibit tumor growth in mice. J.

Clin. Invest., v. 118, 376-386, 2008.

MELENDEZ-ALAFORT L., RODRIGUEZ-CORTES J., FERRO-FLORES G., DE

MURPHY C. A., HERRERA-RODRIGUEZ R., MITSOURA E., et al. Biokinetics of

Tc-99m-UBI 29–41 in humans. Nucl Med Biol., v. 31, p. 373–9, 2004.

MELI M., VERGNE J., DECOUT J.L., MAUREL M.C. Adenine-aptamer complexes—

A bipartite RNA site that binds the adenine nucleic base. J. Biol. Chem., v. 277, p.

2104-2111, 2002.

MENDONSA S.D., BOWSER M.T. In vitro selection of high-affinity DNA ligands for

human IgE using capillary electrophoresis. Anal. Chem, v. 76, p. 5387–5392, 2004.

MI J., LIU Y., RABBANI ZN, et al. In vivo selection of tumor targeting RNA motifs.

Nat Chem Biol., v. 6, p. 22–24, 2010.

MISSAILIDIS & HARDY. Aptamers as inhibitors of target proteins. Expert Opin.

Ther. Patents, v. 19, n° 8, p. 1-10, 2009.

MISSAILIDIS S. & PERKINS A. Aptamers as Novel Radiopharmaceuticals: Their

Applications and Future Prospects in Diagnosis and Therapy. Cancer Biotherapy &

Radiopharmaceuticals, v. 22, número 4, 2007.

MOYES C. & SCULTE P. Princípios de Fisiologia Animal. Artmed; segunda ediçao ,

2010.

MUNHOZ LIMA A. L., PÉCORA J. R., ALBUQUERQUE R. M., PEREIRA A.,

OLIVEIRA D´ELIA C., GODOY DOS SANTOS A. L., CROCI A.T. Infecção pós-

artoplastia total do joelho- Considerações e protocolo de tratamento. Acta Ortop Bras,

v. 12, n° 4, 2004.

NINICHUK V. et al. Late onset of Ccl2 blockade with the Spiegelmer mNOX-E36-

3′PEG prevents glomerulosclerosis and improves glomerular filtration rate in db/db

mice. Am. J. Pathol., v. 172, p. 628–637, 2008.

OLIVEIRA R., SANTOS D., FERREIRA D., COELHO P., VEIGA F. Preparações

radiofarmacêuticas e suas aplicações. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas,

v. 42, n° 2, p. 151-165, 2006.

103

PABORSKY L.R., S.N. MCCURDY, L.C. GRIFFIN, J.J. TOOLE, L.L. LEUNG. The

Single-stranded DNA Aptamer binding Site of Human Thrombin. J. Biol. Chem., v.

268, n° 28, p. 20808–20811, 1993.

PASTOR F., KOLONIAS D., MCNAMARA J.O., GILBOA E. Targeting 4-1BB

costimulation to disseminated tumor lesions with bi-specific oligonucleotide aptamers.

Mol. Ther., v. 19, p.1878-1886, 2011.

PELTIER P., POTEL G., LOVAT E., BARON D., CHATAL J. F. Detection of lung

and bone infection with antigranulocyte monoclonal-antibody BW-250/183 radiolabeled

with Tc(M)-99. Nucl Med Commun, v. 14, p. 766–74, 1993.

PHILLIPS W. Delivery of gamma-imaging agents by liposomes. Advanced Drug

Delivery Reviews, v. 37, p. 13–32, 1999.

PIETRAS K., OSTMAN A., HELDIN C-H., RUBIN K. Method for treatment of tumors

using nucleic acid ligands to PDGF. US6699843; 2004.

PIEVE C., BLACKSHA E., MISSAILIDIS S., PERKINS A. PEGylation and

Biodistribution of an anti-MUC1 Aptamer in MCF-7 Tumor-Bearing Mice.

Bioconjugate Chem., v. 23, p. 1377−1381, 2012.

PIEVE C., PERKINS A., MISSAILIDIS S. Anti-MUC1 aptamers: radiolabelling with 99m

Tc and biodistribution in MCF-7 tumour-bearing mice. Nuclear Medicine and

Biology, v. 36, p. 703-710, 2009.

RADOM F., JUREK M., MAZUREK M., OTLEWSKI J., JELEN F. Aptamers:

Molecules of great potential. Biotechnology Advances xxx (2013) xxx–xxx,

http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.04.007; 2013.

RAY P., VILES K., SOULE E., WOODRUFF R. Application of Aptamers for Targeted

Therapeutics. Arch. Immunol. Ther. Exp., v. 61, p. 255–271, 2013.

RHIE A., KIRBY L., SAYER N., WELLESLEY R., DISTERER P., SYLVESTER I.,

GILL A., HOPE J., JAMES W., TAHIRI-ALAOUI A. Characterization of 20-fluoro-

RNA aptamers that bind preferentially to disease-associated conformations of prion

protein and inhibit conversion. J. Biol. Chem, v. 278, p. 39697–39705, 2003.

ROBERT S., CHAMBERS S. Diagnosis and management of Staphylococcus aureus

infections of the skin and soft tissue. Intern Med J, v. 35, p. 97S-105S, 2005.

ROBERTSON D. L. & JOYCE G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that

specifically cleaves single-stranded DNA. Nature, v. 344, p. 467-468, 1990.

RUSCKOWSKI M., FRITZ B., HNATOWICH D. J. Localization of infection using

streptavidin and biotin—an alternative to nonspecific polyclonal immunoglobulin. J

Nucl Med, v. 33, p.1810–5, 1992.

http://dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.04.007

104

RUSCONI C. P., SCARDINO E., LAYZER J., PITOC G. A., ORTEL T. L., MONROE

D., et al. RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa. Nature, v.

419, n° 6902, p. 90–4, 2002.

SAHA G. Fundamentals of Nuclear Pharmacy. Sexta edição. Springer, 2010.

SANTOS A. L., SANTOS D. O., FREITAS B. L., et al. Staphylococcus aureus:

visitando uma cepa de importância hospitalar. Bras Patol Med Lab, v. 43, p. 413-

423,2007.

SANTULLI-MAROTTO S., NAIR S.K., RUSCONI C., SULLENGER B., GILBOA E.

Multivalent RNA aptamers that inhibit CTLA-4 and enhance tumor immunity. Cancer

Res., v. 63, p. 7483 -7489, 2003.

SARAN D., FRANK J., BURKE D.H. The tyranny of adenosine recognition among

RNA aptamers to coenzyme A. BMC Evol. Biol., v. 3, 2003.

SASSANFAR M., SZOSTAK J.W. An RNA motif that binds ATP. Nature, v. 364, p.

550–553, 1993.

SAVLA R., TARATULA O., GARBUZENKO O., MINKO T. Tumor targeted quantum

dot-mucin 1 aptamer-doxorubicin conjugate for imaging and treatment of cancer. J

Control Release., v. 153, n° 1, p.16-22, 2011.

SAYYED S. G., HAGELE H., KULKARNI O. P., ENDLICH K., SEGERER S.,

EULBERG D., et al. Podocytes produce homeostatic chemokine stromal cell-derived

factor-1/CXCL12, which contributes to glomerulosclerosis, podocyte loss and

albuminuria in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia; v. 52, n° 11, p. 2445–

54, 2009.

SAZANI P.L., LARRALDE R., SZOSTAK J.W. A small aptamer with strong and

specific recognition of the triphosphate of ATP. J. Am. Chem. Soc., v. 126, p. 8370–

8371, 2004.

SCHNEIDER D. J., GOLD L., FEIGON J. Method for identification of high affinity

DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase. US5503978; 1996.

SHANGGUAN D., CAO Z., MENG L., MALLIKARATCHY P., SEFAH K., WANG

H., LI Y., TAN W. Cell-specific aptamer probes for membrane protein elucidation in

cancer cells. J. Proteome Res., v. 7, p. 2133–2139, 2008.

SHI H., FAN X.C., NI Z.Y., LIS J.T. Evolutionary dynamics and population control

during in vitro selection and amplification with multiple targets. RNA-A, v. 8, p.1461–

1470, 2002.

SHOJI OHUCHI. Cell-SELEX Technology. BioResearch Open Access, v.1, p. 265-

272, 2012.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Savla%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21342659

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Taratula%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21342659

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Garbuzenko%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21342659

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Minko%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21342659

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21342659

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21342659

105

SIAENS R., RENNEN H., BOERMAN O., DIERCKX, SLEGERS G. Synthesis and

Comparison of 99m

Tc-Enrofloxacin and 99m

Tc Ciprofloxacin. J Nucl Med, v. 45, p.

2088–2094, 2004.

SIGNORE A., GLAUDEMANS A. W. The molecular imaging approach to image

infections and inflammation by nuclear medicine techniques. Ann Nucl Med, v. 25, p.

681-700, 2011.

SOLANKI K. K., DAS S. S., BRITTON K.E. Infection is not specific for bacterial

osteo-articular infective pathology. Eur J Nucl Med Mol Imaging, v. 30, p.181–2,

2003.

STOLTENBURG R., REINEMANN C., STREHLITZ B. SELEX—A (r)evolutionary

method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering, v.

24, p. 381–403, 2007.

STOLTENBURG R., REINEMANN C., STREHLITZ B. FluMag-SELEX as an

advantageous method for DNA aptamer selection. Anal. Bioanal. Chem., v. 383, p.

83–91, 2005.

SWENSEN J. S., XIAO Y., FERGUSON B. S., LUBIN A. A., LAI R. Y., HEEGER A.

J., et al. Continuous, real-time monitoring of cocaine in undiluted blood serum via a

microfluidic, electrochemical aptamer-based sensor. J Am Chem Soc, v. 131, n°12, p.

4262–6, 2009.

SYDNOR E., PERL T. Hospital epidemiology and infection control in acute-care

settings. Clinical Microbiology reviews, v. 24, n° 1, p. 141-173, 2011.

TANG J.J., XIE J.W., SHAO N.S., YAN Y. The DNA aptamers that specifically

recognize ricin toxin are selected by two in vitro selection methods. Electrophoresis, v.

27, p. 1303–1311, 2006.

THEIS M.G., KNORRE A., KELLERSCH B., MOELLEKEN J.,WIELAND F.,

KOLANUS W., FAMULOK M. Discriminatory aptamer reveals serum response

element transcription regulated by cytohesin-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 101,

p. 11221–11226, 2004.

TOMBELLI S., MINUNNI A., MASCINI A. Analytical applications of aptamers.

Biosens. Bioelectron., v. 20, p. 2424–2434, 2005.

TRAMPUZ A., ZIMMERLIB W. Prosthetic joint infections: update in diagnosis and

treatment. SWISS MED WKLY, v. 135, p. 243-251, 2005.

TUERK C., GOLD L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA

ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science, v. 249, p.505-510, 1990.

TUERK C., MACDOUGAL S., GOLD L. RNA pseudoknots that inhibit human

immunodeficiency- virus type-1 reverse-transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A.,

v. 89, p. 6988–6992, 1992.

106

ULRICH H., MAGDESIAN M. H., ALVES M. J., et al. In vitro selection of RNA

aptamers that bind to cell adhesion receptors of Trypanosoma cruzi and inhibit cell

invasion. J Biol Chem., v. 277, p. 20756–20762, 2002.

VARMIRA K., HOSSEINIMEHR S., NOAPARAST Z., ABEDI M. A HER2-targeted

RNA aptamer molecule labeled with 99m

Tc for single-photon imaging in malignant

tumors. Nuclear Medicine and Biology, v. 40, p. 980–986, 2013.

VAN DER LAKEN C. J., BOERMAN O. C., OYEN W. J. G., VAN DE VEN M. T. P.,

VAN DER MEER J. W. M., CORSTENS F. H. M. Imaging of infection in rabbits with

radioiodinated interleukin-1 (alpha and beta), its receptor antagonist and a chemotactic

peptide: a comparative study. Eur J Nucl Med., v. 25, p. 347–52, 1998.

WALLACE S. T., SCHROEDER R. In vitro selection and characterization of

streptomycin-binding RNAs: recognition discrimination between antibiotics. RNA; v.

4, p.112–23, 1998.

WALLIS M.G., VON AHSEN U., SCHROEDER R., FAMULOK M. A novel RNA

motif for neomycin recognition. Chem. Biol., v. 2, p. 543–552, 1995.

WANG A. Z., VASIILLIOU C. C., GU F., ALEXIS F., ZHANG L., SHAIKH M., et

al. Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticle–Aptamer Bioconjugates for Combined

Prostate Cancer Imaging and Therapy. Chem Med Chem, v. 3, n° 9, p. 1311-1315,

2008.

WATERS E. K., GENGA R. M., SCHWARTZ M. C., NELSON J. A., SCHAUB R. G.,

OLSON K. A., et al. Aptamer ARC19499 mediates a procoagulant hemostatic effect by

inhibiting tissue factor pathway inhibitor. Blood, v. 117, n° 20 p. 5514–22, 2011.

WATERS E. K. et al. Effect of NU172 and bivalirudin on ecarin clotting time in human

plasma and whole blood. J. Thromb. Haemost. , v. 7, p. 683, 2009.

WATSON S. R, Y.F. CHANG, D. O’CONNELL, L. WEIGAND, S. RINGQUIST,

D.H. PARMA. Anti-L-selectin aptamers: binding characteristics, pharmacokinetic

parameters, and activity against an intravascular target in vivo. Antisense Nucleic Acid

Drug Dev., v. 10, p. 63-75, 2000.

WEISS S., PROSKE D., NEUMANN M., GROSCHUP M.H., KRETZSCHMAR H.A.,

FAMULOK M., WINNACKER E.L. RNA aptamers specifically interact with the prion

protein PrP. J. Virol., v. 71, p. 8790–8797, 1997.

WELCH M., REDVANLY C. Handbook of radiopharmaceuticals: Radiochemistry and

applications. Wiley, 2003.

WILLIAMS K. P., LIU X-H, SCHUMACHER T. N. M., LIN H.Y., AUSIELLO D. A.,

KIM P. S., et al. Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of vasopressin. Proc

Natl Acad Sci U S A, v. 94, p. 11285–90, 1997.

107

WILLIAMS K. P., LIU X. H., SCHUMACHER T. N., LIN H. Y., AUSIELLO D. A.,

KIM P. S., BARTEL D. P. Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of

vasopressin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 94, p. 11285–11290, 1997.

WILSON C., EPSTEIN D., DIENER J. L. Prophylactic and therapeutic HIV aptamers.

WO2004026260; 2004

WILSON C., NIX J., SZOSTAK J. Functional requirements for specific ligand

recognition by a biotin-binding RNA pseudoknot. Biochemistry; v. 37, p.14410–9,

1998.

WU C. C., M. SABET, T. HAYASHI, R. TAWATAO, J. FIERER, D.A. CARSON,

D.G. GUINEY, M. CORR. In vivo efficacy of a phosphodiester TLR-9 aptamer and its

beneficial effect in a pulmonary anthrax infection model. Cell Immunol, v. 251, p. 78-

85, 2008.

WU C. C., CASTRO J. E., MOTTA M., et al. Selection of oligonucleotide aptamers

with enhanced uptake and activation of human leukemia B cells. Hum Gene Ther.,

v.14, p. 849–860, 2003.

YANG Q., GOLDSTEIN I.J., MEI H.Y., ENGELKE D.R. DNA ligands that bind

tightly and selectively to cellobiose. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 95, p. 5462–

5467, 1998.

YE M., HU J., PENG M., LIU JING, LIU JUN, LIU H., ZHAO X., TAN W.

Generating Aptamers by Cell-SELEX for Applications in Molecular Medicine. Int. J.

Mol. Sci., v. 13, p. 3341-3353, 2012.

YOU K. M., LEE S. H., LEE B. S. Aptamers as Funcional Nucleic Acids: In vitro

Selection and Biotechnological Applications. Biotechnology and Bioprocess

Engineering, v. 8, p. 64-75, 2003.

ZHANG Y. M., LIU N., ZHU Z. H., RUSCKOWSKI M., HNATOWICH D. Influence

of different chelators (HYNIC, MAG3 and DTPA) on tumor cell accumulation and

mouse biodistribution of technetium-99m labeled to antisense DNA. J. Eur J Nucl

Med, v.27, p. 1700-1707, 2000.

ZOLLE, I. Technetium-99m Pharmaceuticals: Preparation and Quality Control in

Nuclear Medicine. Springer Berlin Heidelberg, 2007.

108

ANEXO A- CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DE MINAS GERAIS (CETEA/UFMG).

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

CEUA

COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS

CERTIFICADO

Certificamos que o Protocolo nº. 143 / 2013, relativo ao projeto intitulado “Avaliação in vivo de aptâmeros marcados com tecnécio-99m para

identificação de infecção em modelo experimental”, que tem como responsável VALBERT NASCIMENTO CARDOSO, está de acordo com os

Princípios Éticos da Experimentação Animal, adotados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA/UFMG), tendo sido aprovado na reunião

de 05/11/2013. Este certificado espira-se em 05/11/2018.

CERTIFICATE

We hereby certify that the Protocol nº. 143 / 2013, related to the Project entilted “Assessement of infecious foci using aptamers radiolabeled with

technetium-99m in experimental model”, under the supervision of VALBERT NASCIMENTO CARDOSO, is in agreement with the Ethical Principles

in Animal Experimentation, adopted by the Ethics Committee in Animal Experimentation (CEUA/UFMG), and was approved in 05/11/2013. This

certificates expires in 05/11/2018.

FRANCISNETE GRACIANE ARAUJO MARTINS

Coordenador(a) da CEUA/UFMG

Belo Horizonte, 05/11/2013.

Atenciosamente.

Sistema CEUA-UFMG

https://www.ufmg.br/bioetica/cetea/ceua/

Universidade Federal de Minas Gerais

Avenida Antônio Carlos, 6627 – Campus Pampulha

Unidade Administrativa II – 2º Andar, Sala 2005

31270-901 – Belo Horizonte, MG – Brasil

Telefone: (31) 3499-4516 – Fax: (31) 3499-4592

www.ufmg.br/bioetica/cetea - [email protected]

http://www.ufmg.br/bioetica/cetea

mailto:[email protected]

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