UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA …
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE MÁRCIA KANEGUSUKU ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE DUAS ESPÉCIES DO GÊNERO Rubus ENCONTRADAS NA FLORA CATARINENSE Itajaí - 2006
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
MÁRCIA KANEGUSUKU
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE DUAS ESPÉCIES DO
GÊNERO Rubus ENCONTRADAS NA FLORA CATARINENSE
Itajaí - 2006
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
MÁRCIA KANEGUSUKU
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE DUAS ESPÉCIES DO
GÊNERO Rubus ENCONTRADAS NA FLORA CATARINENSE
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero
Itajaí, Novembro de 2006.
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE DUAS ESPÉCIES DO
GÊNERO Rubus ENCONTRADAS NA FLORA CATARINENSE
Márcia Kanegusuku
‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’
____________________________________ Rivaldo Niero, Doutor
Orientador
__________________________________________________________ Tânia Mari Bellé Bresolin, Doutora
Coordenadora do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas
Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:
______________________________________ Prof. Dr. Rivaldo Niero (UNIVALI)
Presidente
______________________________________ Prof. Dr. Jacir Dal Magro (UNOCHAPECÓ)
Membro
______________________________________ Profa. Dra. Adriana Dias Elpo Barbosa (UNIVALI)
Membro
Itajaí (SC), novembro de 2006
AGRADECIMENTOS
À Deus pela vida e mais esta oportunidade de crescimento.
Ao Prof. Rivaldo Niero pela orientação e amizade em mais um trabalho de
pesquisa, por ter acreditado em meu potencial, sendo incentivador, compreensivo e
paciente nos momentos em que houve a necessidade.
À professora Márcia Maria de Souza e seus colaboradores pelos testes
farmacológicos.
Ao professor Alexandre Bella Cruz e colaboradores pelos testes
microbiológicos.
Ao professor Franco Delle Monache pelas análises espectroscópicas.
Aos professores da comissão interna Clóvis Rodrigues e Alexandre Bella Cruz
pelas correções.
Aos professores membros da banca Jacir Dal Magro e Adriana Elpo por terem
aceitado o convite e pelas valiosas sugestões.
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas.
À Marina pelos testes microbiológicos e principalmente pela amizade e
companheirismo.
Às alunas de iniciação científica Gabriela e Isabela pela colaboração na
pesquisa.
Ao meu amigo e marido Volnei por estarmos juntos amadurecendo e
crescendo nesta maravilhosa jornada da vida.
Ao meu filho Mateus fonte inspiradora para o término de mais esta etapa.
Aos meus pais Paulo e Mioko pelo apoio, incentivo e confiança em todos os
momentos.
Aos meus irmãos Patrícia e Paulo Roberto pelos conselhos e apoio durante o
trabalho e a gravidez.
A todas as pessoas que direta ou indiretamente, estiveram presentes durante
a realização deste trabalho.
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DE DUAS ESPÉCIES DO GÊNERO Rubus ENCONTRADAS NA FLORA CATARINENSE
Márcia Kanegusuku
Nov/2006 Orientador: Rivaldo Niero, Doutor. Área de Concentração: Fitoquímica. Número de Páginas: 69 O gênero Rubus tem se destacado pelo uso popular devido aos frutos que produzem e suas folhas que são usadas com propósito terapêutico para tratar diversas patologias, incluindo diabetes. Algumas espécies têm sido alvo de estudos científicos visando o isolamento e a avaliação do potencial terapêutico. No entanto, sobre as espécies adaptadas no Brasil muito pouco é encontrado na literatura. Desta forma, este trabalho descreve a avaliação fitoquímica e biológica das raízes de R. imperialis e das partes aéreas de R. rosaefolius encontradas na flora catarinense. O material vegetal foi moído, seco a 40 oC e macerado em metanol durante 7 dias. Após evaporação do solvente sobre pressão reduzida, o extrato foi dissolvido numa mistura de metanol:água (9:1) e particionado com solventes de polaridade crescente como hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol. As respectivas frações foram submetidas aos métodos cromatográficos (CC e CCD) e as substâncias puras foram identificadas através das técnicas espectroscópicas usuais (IV, RMN 1H e 13C). Da fração butanólica obtida das raízes de R. imperialis, foi isolado e identificado uma substância denominada de ácido 3-O-metil-4’-metilelágico. Quando testado frente a diferentes microrganismos patogênicos, esta substância apresentou uma concentração inibitória mínima de 200 µg/mL para a bactéria Streptococcus agalactiae. Em relação a R. rosaefolius, as substâncias isoladas foram identificadas como stigmasterol, sitosterol, β sitosterol glicosídeo, ácido tormêntico e o ácido 28-metóxitormêntico. Tanto as frações quanto o ácido 28-metóxitormêntico apresentam um pronunciado dose-dependente efeito antinociceptivo, quando submetido aos testes das contorções abdominais induzidas pelo pelo ácido acético e formalina, em camundongos. Particularmente, no teste das contorções, o ácido 28- metóxitormêntico apresentou uma DI50 e IM de 5,1 (3,6 - 7,1) mg/kg de 64,2% respectivamente. Quando analisada no modelo de dor induzido pela formalina, este ácido apresentou uma DI50 e IM de 9,9 (8,0 -12,3) e 6,3 (5,0 - 7,9) mg/kg e 39,3 e 90,3%, para a primeira e segunda fase, respectivamente. Quando comparado com a aspirina e o paracetamol, dois medicamentos usados na clínica, mostrou-se cerca de 10 vezes mais potente, sugerindo contribuir em parte pelo efeito encontrado para a planta em questão.
Palavras-chave: R. imperialis, R. rosaefolius, ácido 3-O-metil-4’-metilelágico.
PHYTOCHEMICAL AND BIOLOGICAL STUDY OF DIFFERENTS SPECIE OF Rubus GENUS FOUND IN THE CATARINENSE FLORA
Márcia Kanegusuku
Nov/2006
Supervisor: Rivaldo Niero, Doctor. Area of Specialization: Phytochemistry Number of pages: 69
The Rubus genus has been highlighted for popular use, due to its tasty fruits - blackberries. The leaves are used as infusions to treat various pathologies, including diabetes. Some species have been the target of scientific studies aimed at isolating and evaluating their therapeutic potential. However, few studies are found in the literature relating to the species in Brazil. In this aspect, the present work describes the phytochemical and biological results obtained for Rubus imperialis and Rubus rosaefolius, two species found in the flora of Santa Catarina. The plant material was ground, air-dried at 40 oC, and macerated in methanol. After evaporation of the solvent, the MeOH extract was partitioned with solvents of increasing polarity: hexane, dichloromethane, ethyl acetate and butanol. The respective fractions were submitted to chromatographic separation methods (CC and TLC) and the pure compounds were identified using spectroscopic techniques (IV, RMN 1H e 13C). From the butanol fraction obtained from the roots of R. imperialis, a compound was isolated and identified as 3-O-methyl-4'-methylellagic acid. The antimicrobial activity was carried out in different stages of the purification process, suggesting that this compound is probably responsible for the antimicrobial action initially found in the MeOH extract, with Maximal Inhibitory Concentration values of 200mg/mL for the Streptococcus agalactiae bacteria. In relation to the R. rosaefolius, the compounds isolated and identified were stigmasterol, β-sitosterol, β-sitosterol glicosidic, tormentic acid, and 28- methoxytormentic acid. The pharmacological results show that the 28-methoxytormentic acid, when submitted to antinociceptive analysis by the acetic acid-induced abdominal writing test, showed Maximal Inhibition of 64.22 % and ID50 of 5.10 (3.64 -7.14) mg/Kg. When analyzed by the pain-induced formalin test, this compound showed MI of 39.37 and 90.37 %, DI50 of 9.98 (8.08 -12.31) and 6.31(5.07-7.98) mg/Kg proving to be about 10 times more potent than clinically used medicines, such as aspirin and paracetamol.
Key words: Rubus imperialis, R. rosaefolius, 3 –O –methyl-4’-methylellagicacid.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Fotografia das partes aéreas de R. imperialis................................... 20
Figura 2 Fotografia das partes aéreas de R. rosaefolius................................. 21
Figura 3 Operações realizadas para isolamento e identificação de
substâncias puras das raízes de R. imperialis...................................
31
Figura 4 Operações realizadas para isolamento e identificação de
substâncias puras das partes aéreas de R. rosaefolius.....................
37
Figura 5 Efeito do extrato hidroalcoólico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius
sobre a dor induzida por ácido acético...............................................
42
Figura 6 Efeito do extrato hidroalcoólico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius
sobre a dor induzida por formalina.....................................................
43
Figura 7 Efeito da fração hexano (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre
a dor induzida por ácido acético.........................................................
43
Figura 8 Efeito da fração hexano (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre
a dor induzida por formalina
44
Figura 9 Efeito da fração de diclorometano (10; 30; 60 mg/kg) de R.
rosaefolius sobre a dor induzida por ácido acético.............................
44
Figura 10 Efeito da fração de diclorometano (10; 30; 60 mg/kg) de R.
rosaefolius sobre a dor induzida por formalina...................................
45
Figura 11 Efeito da fração de acetato de etila (3; 6; 10 mg/kg) de R.
rosaefolius sobre a dor induzida por ácido acético............................
45
Figura 12 Efeito da fração de acetato de etila (3; 6; 10 mg/kg) de R.
rosaefolius sobre a dor induzida por formalina....................................
46
Figura 13 Efeito da fração butanólica (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius
sobre a dor induzida por ácido acético...............................................
46
Figura 14 Efeito da fração butanólica (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius
sobre a dor induzida por formalina.....................................................
47
Figura 15 Efeito do metoxitormêntico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre
a dor induzida por ácido acético........................................................
47
Figura 16 Efeito do metoxitormêntico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre
a dor induzida por formalina...............................................................
48
Figura 17 Espectro de IV de Ri-5, em KBr.......................................................... 62
Figura 18 Espectro RMN 1H (300 MHz) de Ri-5 em piridina-d5.......................... 63
Figura 19 Espectro de RMN 13C (75 MHz) de Ri-5 em piridina-d5...................... 64
Figura 20 Espectro de IV de Rr-1, em KBr......................................................... 66
Figura 21 Espectro de RMN 1H (300 MHz) de Rr-1 entre 1 e 6 ppm, em
piridina-d5...........................................................................................
67
Figura 22 Espectro de RMN 13C (75 MHz) de Rr-1 entre 16 e 42 ppm, em
piridina d5............................................................................................
68
Figura 23 Espectro de RMN 13C (75 MHz) de Rr-1 entre 47 e 180 ppm, em
piridina d5............................................................................................
69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao
espectro de RMN 1H (300 MHz) de Ri-5 em piridina-d5........................
32
Tabela 2 Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao
espectro de RMN 13C de Ri-5 em piridina-d5.......................................
32
Tabela 3 Atividade antimicrobiana de extratos de diferentes partes de
R.imperialis contra bactérias e fungos..................................................
34
Tabela 4 Atividade antimicrobiana de frações das raízes e R. imperialis contra
bactérias e fungos.................................................................................
34
Tabela 5 Atividade antimicrobiana de substâncias isoladas das raízes de R.
imperilais contra bactérias e fungos.....................................................
35
Tabela 6 Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao
espectro de RMN 1H (300MHz) de Rr-1 em piridina-d5........................
40
Tabela 7 Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao
espectro de RMN 13C de Rr-1 em piridina-d5........................................
40
Tabela 8 Efeito antinociceptivo comparativo entre o Extrato Hidroalcoólico, as
Frações Hexano, Diclorometano, Acetato de Etila, Butanol, o Ácido
28-Metóxitormêntico e fármacos usados como referência no modelo
de dor induzida pelo ácido acético 0,6% em camundongos,
administrados intraperitonialmente.......................................................
49
Tabela 9 Efeito antinociceptivo comparativo entre o Extrato Hidroalcoólico, as
Frações Hexano, Diclorometano, Acetato de Etila, Butanol, o Ácido
28-Metóxitormêntico e fármacos usados como referência no modelo
de dor induzida pela formalina, administrados intraperitonialmente.....
50
LISTA DE ABREVIATURAS
CC Cromatografia em Coluna
CCD Cromatografia em Camada Delgada
CIM Concentração Inibitória Mínima
IV Infra-Vermelho
RMN-1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN-13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
LC50 Concentração letal de 50%
ppm parte por milhão da freqüência aplicada
TMS Tetrametilsilano
UFC Unidade formadora de colônia
Ri Composto relacionado com Rubus imperialis
Rr Composto relacionado com Rubus rosaefolius
FAE Fração Acetato de Etila
FB Fração Butanol
FD Fração Diclorometano
FH Fração Hexano
EH Extrato Hidroalcoólico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................. 11
2 OBJETIVOS.................................................................................................. 14
2.1 Objetivo Geral............................................................................................ 14
2.2 Objetivos Específicos.............................................................................. 14
3 REVISÃO DA LITERATURA.................................................................... 15
3.1 Plantas Medicinais: Aspecto Geral....................................................... 15
3.2 Características químicas e biológicas das espécies do gênero
Rubus............................................................................................................
17
3.2.1 Rubus imperialis........................................................................................ 19
3.2.2 Rubus rosaefolius..................................................................................... 21
4 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 22
4.1 Material botânico.........................................................................……...... 22
4.2 Análise química................................................................................... 22
4.2.1 Obtenção dos extratos.............................................................................. 22
4.2.2 Separação, purificação e identificação dos constituintes químicos.... 22
4.2.3 Reagentes e equipamentos...................................................................... 23
4.3 Análise antimicrobiana............................................................................ 24
4.3.1 Material microbiológico............................................................................ 24
4.3.2 Manuntenção dos microrganismos......................................................... 25
4.3.3 Preparo dos inóculos................................................................................ 26
4.3.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima................................. 26
4.4 Atividade antinociceptiva........................................................................ 27
4.4.1 Modelo das contrações abdominais induzidas pelo ácido acético...... 27
4.4.2 Modelo de dor induzido pela formalina.................................................. 28
4.4.3 Princípios básicos para pesquisa envolvendo o uso de animais........ 29
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................... 30
5.1 Rubus imperialis................................................................................. 30
5.1.1 Análise química......................................................................................... 30
5.1.2 Análise antimicrobiana............................................................................. 34
5.2 Rubus rosaefolius..................................................................................... 37
5.2.1 Análise química......................................................................................... 38
5.2.2 Atividade antinociceptiva......................................................................... 42
6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES............................................................. 51
6.1 Rubus imperialis....................................................................................... 51
6.2 Rubus rosaefolius..................................................................................... 51
REFERÊNCIAS................................................................................................ 53
ANEXO I............................................................................................................ 61
ANEXO II........................................................................................................... 65
11
1 INTRODUÇÃO
Descobrir um novo medicamento é como encontrar uma agulha em um palheiro.
A Pharmaceutical Research and Manufacturers of America (PhRMA), calcula que de
cada 10 mil moléculas analisadas com o objetivo de gerar um novo medicamento,
somente cinco evoluem para testes pré-clínicos. Desse total apenas uma é aprovada
e será utilizada como medicamento.
Até obter o registro oficial e poder ser comercializado, o medicamento passa por
uma criteriosa, extensa e dispendiosa série de estudos que atestem sua segurança
e eficácia. Os investimentos para descoberta de uma molécula até sua
transformação em medicamento comercializado superam US$ 800 milhões, ao longo
de um período de estudos e testes clínicos que pode estender-se por até 12 anos
(INTERFARMA, 2003).
Os gastos na descoberta de um novo medicamento são cada vez maiores e
como alternativos, a indústria farmacêutica tem dedicado uma atenção especial aos
medicamentos fitoterápicos, pois se apresentam como medicamentos de menor
custo de pesquisa e desenvolvimento (P&D), além de uma oportunidade de
diversificação (FERREIRA, 1998). Para as grandes empresas internacionais as
plantas medicinais são fontes de novas estruturas que serão isoladas e
posteriormente sintetizadas para produção em larga escala (ABIFITO, 2003).
A fitoterapia valoriza o fitocomplexo, um conjunto de vários princípios ativos que
atuam sinergicamente. O mecanismo de ação terapêutica é mais lento, e chega a
ser considerado como mais fisiológico e natural (YAMADA, 1998).
No entanto é preciso estar atento à idéia equivocada de que produto natural não
tem efeito colateral, isso leva muitas pessoas a fazer uso das plantas medicinais
sem ao menos saber o que realmente estão consumindo (GIOVANO, 1980). Essas
plantas devem acima de tudo, serem asseguradas quanto à eficácia terapêutica e a
toxicologia ou segurança de uso (GARCIA, 2001).
A utilização de plantas para curar diversos males é tradicionalmente conhecida e
utilizada há centenas de anos pela humanidade. O homem primitivo, ao procurar
plantas para o seu sustento, foi descobrindo plantas com ação tóxica ou medicinal,
formando, assim um conhecimento empírico das ações terapêuticas e tóxicas das
plantas. Sendo assim, indícios do uso de plantas medicinais e tóxicas foram
12
encontrados nas mais antigas civilizações. Contudo, a medicina popular não tinha
em seu uso qualquer comprovação científica (PINTO et al.,2002; BHATTARAM, et
al., 2002).
Até meados do século XX, a pesquisa para o desenvolvimento de novos
fármacos era baseada na síntese química de novas substâncias e no estudo de sua
atividade farmacológica. Contudo, percebeu-se que duas características distinguiam
os produtos de origem natural dos produtos sintetizados: a diversidade molecular e a
função biológica. Como os produtos de origem natural são sintetizados por
organismos vivos, ou seja, a partir do metabolismo dos organismos vivos, espera-se
que tais substâncias tenham maior chance de apresentar alguma atividade biológica.
Esse princípio relativamente simples é a base para um complexo estudo dessas
substâncias e suas atividades sobre os organismos (SANDES et al., 2000).
Neste momento, cabe comentar que as substâncias que geralmente são fontes
de estudo quanto à atividade biológica são aquelas que advêm do metabolismo
secundário das plantas. Outra característica relacionada aos metabólitos
secundários é a variedade na qual são encontrados em cada espécie vegetal
(SANTOS, 2000). A variedade e a complexidade das micromoléculas que constituem
os metabólitos secundários de plantas ainda são inatingíveis por métodos
laboratoriais. Sendo conseqüência de milhões de anos de evolução, como forma de
proteção e resistência às intempéries do clima, poluição e predadores (LESNEY,
2004; CALIXTO, 2003; VIEGAS JÚNIOR et al., 2006).
As plantas medicinais são as responsáveis pela maior parcela de diversidade
química conhecida e registrada na literatura. Tendo em vista esses aspectos,
podemos afirmar que com o aumento da diversidade biológica das espécies
vegetais, aumentam a diversidade de substâncias químicas de origem vegetal que
podem ser obtidas e a probabilidade de identificação de substâncias biologicamente
ativas (HARBORNE, 1988).
Dessa forma o Brasil encontra-se em grande vantagem, possuem a maior
biodiversidade do mundo, com um número estimado entre 10 e 20% do número total
de espécies do planeta. Conta com a mais diversa flora do mundo, com mais de 55
mil espécies descritas 22% do total mundial (GARCIA, 2001). Esse imenso
patrimônio genético, já escasso nos países desenvolvidos, na atualidade significa
valor econômico-estratégico inestimável em várias atividades, mas é no campo do
desenvolvimento de novos medicamentos onde reside sua maior potencialidade.
13
Estima-se que 40% dos medicamentos disponíveis na terapêutica atual foram
desenvolvidos de fontes naturais: 13% de microorganismos, 3% de animais e 25%
de plantas (CALIXTO, 2003).
Neste sentido, é importante estudar plantas principalmente encontrada em
nossa região, de fácil acesso e coleta.
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar os constituintes químicos presentes nas raízes de R. imperialis e nas
partes aéreas de R. rosaefolius, bem como suas atividades biológicas no intuito de
contribuir com dados científicos para subsídios ao uso na medicina popular.
2.2 Objetivos Específicos
- Isolar através de métodos cromatográficos os constituintes químicos
presentes na fração butanólica das raízes de R. imperialis.
- Isolar através de métodos cromatográficos os constituintes químicos
presentes nas partes aéreas de R. rosaefolius.
- Identificar através de métodos espectroscópicos de IV, RMN 1H e RMN 13C
os constituintes químicos isolados.
- Avaliar a atividade antimicrobiana das frações e compostos isolados das
raízes de R. imperialis através do método de diluição em ágar.
- Avaliar a atividade antinociceptiva de extratos, frações e compostos isolados
de R. rosaefolius no modelo do ácido acético 0,6% e formalina, em
camundongos.
- Comparar os resultados biológicos obtidos com medicamentos usados na
clínica.
15
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Plantas Medicinais: Aspecto Geral
Dados da OMS (Organização Mundial de Saúde) revelam que
aproximadamente 80% ou 4 bilhões de habitantes do globo recorrem à medicina
tradicional como tratamento primário de saúde (YAMADA, 1998). As plantas
medicinais têm se mostrado adequadas para atender as necessidades básicas de
saúde em função da facilidade de acesso, do baixo custo e da compatibilidade com
as tradições populares (BENDAZZOLI, 2000). Possuem a enorme vantagem de
originar medicamentos em menor tempo a um custo inferior se comparado com os
sintéticos, tornando-se mais acessíveis à população em geral (CECHINEL FILHO,
2000).
Nos últimos anos tem-se verificado um grande avanço científico envolvendo os
estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos
compostos com propriedades terapêuticas (CECHINEL FILHO et al., 1998). O Brasil
possui a maior base universitária e técnica das Américas, excluindo os EUA, e os
cientistas brasileiros publicam nas melhores revistas internacionais (FERREIRA,
1998).
Entretanto no Brasil existe um relativo atraso na corrida pela busca de novos
medicamentos fitoterápicos, ficando inclusive atrás de países menos desenvolvidos
tecnologicamente. Um dos motivos é a falta de uma política definida, permanente e
comprometida com o desenvolvimento da indústria farmacêutica (YUNES et al.,
2001). Existe ainda uma falta de tradição das indústrias farmacêuticas brasileiras em
investir em P&D e isto é mais forte nas indústrias de fitoterápicos, poucas se
destacam mantendo cooperação com universidades, que buscam garantir a
qualidade, eficácia e segurança de seus produtos (SIMÕES et al.,2002).
A utilização das plantas seja como fitoterápico ou como substância protótipo
evidencia a importância da investigação científica para o desenvolvimento de um
medicamento. Tais pesquisas deverão ser direcionadas à valorização e modulação
da atividade farmacológica a ser explorada, garantindo a ação terapêutica, a
segurança de utilização bem como a viabilidade de produção. Desta maneira
16
aponta-se a importância equivalente do conhecimento botânico, fitoquímico,
agronômico, farmacológico, toxicológico e de desenvolvimento de metodologias
analíticas e tecnológicas (SIMÕES et al., 2000; BALUNAS et al., 2005).
Constata-se que a maioria dos fitoterápicos fabricado atualmente pela indústria
brasileira está fundamentada no uso popular das plantas sem nenhuma
comprovação pré-clinica nem clínica, desta forma não podendo competir em termos
nacional e muito menos internacional (YUNES et al., 2001). Em países da Europa os
medicamentos fitoterápicos possuem uma longa tradição, são submetidos a um
rigoroso controle de qualidade há mais de um século, comparável ao dos
medicamentos sintéticos, e por isso receitados com freqüência pelos médicos
(GRUENWALD, 1998).
Atualmente são promovidas várias discussões no Brasil e no mundo, a fim de
regularizar o setor e garantir ao consumidor e a comunidade médica eficácia,
segurança e qualidade do medicamento fitoterápico (SUELMA et al., 2001). A
legislação internacional da produção e comercialização de medicamentos
fitoterápicos não é uniforme, apresentando duas definições dos produtos naturais,
como medicamentos na Alemanha ou como suplementos alimentares no Reino
Unido, EUA e na Holanda (MORETTO, 2000). Entre as medidas tomadas nesse
sentido, está a resolução RDC 17 de 2000/ANVISA que manteve as rígidas regras
quanto à comprovação da eficácia, segurança e qualidade para validação de
fitoterápicos novos, mas passou a ter uma modalidade de registro denominada
“tradicional”. Uma primeira tentativa de valorizar a tradição de uso de uma planta
medicinal, de modo a alcançar um equilíbrio entre critérios exigidos para validar um
medicamento em geral, e as características peculiares de um medicamento
fitoterápico (SIMÕES et al., 2002). E a mais recente é a resolução RDC n° 48, de 16
de março de 2004, que tem como base principal à padronização na produção de
fitoterápicos exigindo reprodutibilidade, representando um controle de qualidade da
matéria-prima vegetal e dos próprios medicamentos (ANVISA, 2004).
17
3.2 Características químicas e biológicas das espécies gênero Rubus
Dentre as famílias de plantas que despertam interesse encontra-se a
Rosaceae que compreende cerca de 100 gêneros com mais de 700 espécies, sendo
que a maioria é encontrada em climas temperados (JOLY, 1991). Na flora brasileira
é representada por 5 gêneros, habitando principalmente o sul do país (JORGE et al.,
1993; AGRIDATA, 2002). O gênero Rubus em especial, tem se destacado pelo usos
populares, muitas das espécies são conhecidas pelos frutos saborosos que
produzem, e suas folhas são usadas em infusos com propósito terapêutico. Muitas
espécies têm sido alvas de vários estudos científicos visando o isolamento de novas
moléculas e avaliação do potencial farmacológico e biológico de extratos e
compostos isolados (PATEL et al., 2004).
Uma das espécies mais comuns é o R. idaeus popularmente chamada de
framboesa, além de seu fruto ser utilizado na culinária, suas folhas são
tradicionalmente utilizadas na forma de chá contra diarréia, estomatites,
conjuntivites, como adstringente e facilitador do parto (NEWALL et al., 1996). Um
estudo realizado com o extrato das folhas, em útero de ratas não-grávidas e
grávidas, apresentou pouco ou nenhum efeito para o primeiro grupo, mas para o
grupo das ratas grávidas tornou as contrações mais regulares e menos freqüentes.
O resultado foi similar para teste em amostras humanas (BAMFORD et al., 1970).
Em outro estudo o extrato das folhas apresentou atividade relaxante em íleo de
cobaia in vitro (ROJAS-VERA et al., 2002). Na espécie R. idaeus também foi
encontrada o ácido elágico, um potente anticarcinogênico (KHANDUJA et al., 1999).
A espécie R. fruticosus ou amora preta tem sido bastante cultivada, é mais
estudada sob o aspecto agronômico de cultivo. No entanto são relatados na
literatura alguns usos medicinais de seus frutos e folhas. Um estudo com o extrato
aquoso das folhas administrado via oral em ratos diabéticos induzidos por
estreptozotocina, apresentou ação efetiva para baixar os níveis de glicose no
sangue (JOUAD et al., 2002).
Também é alvo de estudos uma espécie brasileira a R. brasilensis Mart. outro
tipo de amora comestível. Em roedores, a fração hexano induziu ansiedade revertida
pelo flumazenil, um antagonista de receptor específico GABAA-benzodiazepínico
(NOGUEIRA et al., 1998). Essa mesma fração de hexano em outro trabalho induziu
18
hipnose, teve efeito anticonvulsivante e relaxante muscular em camundongos, e
ainda mostrou que o receptor GABAA-benzodiazepínico pode exercer um importante
papel nos efeitos desta fração (NOGUEIRA et al., 2000).
O extrato aquoso espécie R. coreanus Miq foi testado com um sistema de
cultura de células utilizando um vírus da hepatite B (HVB), verificou-se que o extrato
diminuiu os níveis de DNA HVB viral no meio extracelular e inibiu a secreção de
HBsAg dose dependente. Apresentando desta forma uma possível atividade anti-
HVB (KIM et al., 2001).
Já foram observadas, em várias espécies, atividades antinociceptiva, mais
recentemente, Choi e colaboradores (2003), demonstraram que o fracionamento
biodirecionado do extrato butanólico, permitiu o isolamento de triterpeno ácido 23-
hidroxitormentico-28-O-glicosídeo, denominado de Niga-ichigosideo F1, do qual,
através de hidrólise básica, obteve-se a aglicona derivada do ácido 23-hidroasiático.
Ambos apresentaram importante perfil analgésico e antiinflamatório. No entanto, a
aglicona se mostrou muito mais ativa do que o Niga-ichigosideo F1 (ALANIS et al.,
2003). Foram estudadas as subtâncias niga-ichigosideo F1 e sua aglicona o ácido
23-hidroxitormêntico isolados de Rubus coreanus ambos apresentaram ação
antiinflamatória contra artrite reumatóide e num estudo paralelo mostraram-se
eficientes para reduzir lesões gástricas induzidas em ratos, sugerindo que estas
substâncias são candidatas importantes como antiinflamatórios usados por longo
tempo (NAN, et al., 2006).
Estas substâncias estão presentes também em R. cariifolius, R. choosefalus,
R. allegheniensis e R. imperialis (NIERO et al. 1999; LIU et al., 2001; FLAMINI et al.,
2002; ONO et al., 2003). Alguns triterpenos deste mesmo núcleo estrutural foram
isolados de R. sieboldii. Neste estudo, os ácidos tormêntico e euscáfico,
apresentaram importantes ações antiinflamatórias, inibindo de maneira significativa
as enzimas envolvidas na replicação, principalmente as α e βpolimerase
(MURAKAMI et al., 2002). Assim como os extratos de R hirtus e R sanctus espécies
naturais da Turquia apresentaram atividade antinociceptiva significante
(ERDEMOGLU et al., 2003).
R. umifolius mostrou um significativo efeito hipoglicêmico em ratos com
diabetes induzida (LEMUS, 1999). Já foram isolados dessa planta flavonóides ,
triterpenos e antronas (FLAMINI et al., 2002).
19
Outra propriedade observada nos extratos do gênero Rubus é o potencial
antimicrobiano (RICHARDS et al. 1994). Foi observado em R. ulmifolius atividade
antibacteriana e antifúngica nas frações de fenólis e taninos (PANIZZI et al., 2002).
O extrato metanólico de Rubus chamaemorus apresentou atividade amebicida
(DERDA et al., 2004) e alguns extratos apresentaram atividade anti-bacteriana e
antimicotica (THIEM et al., 2004). Dos extratos das partes aéreas de Rubus
coriifolius foram também isolados além de outras substâncias o niga-ichigosideo F1,
ácido elágico e a epicatequina que foram avaliados quanto a atividade
antiprotozoária contra Entamoeba histolytica e Giardia lambia, a epicatequina foi o
maior responsável pela atividade do extrato sendo comparado a emetina (ALANIS et
al., 2003).
Rubus amabilis é conhecido por seu efeito antiflogístico, analgésico antídoto e
antitumuoral, Chen e colaboradores (2001) estudou os constituintes das partes
aéreas desta planta e identificou pregnanas glicosiladas, lignanas glicosiladas,
triterpernos éster glicosilados e flavonóides glicosilados.
Várias espécies têm apresentado propriedades antitumorais em seus extratos
e compostos isolados, como é o caso de R. crataegifolius no qual o extrato bruto das
raízes apresentou atividade em células de carcinoma mamário humano, como
potente indutor de apoptose e inibidor de DNA topoisomerase I (LEE et al., 2000).
Sendo que desta espécie já foi isolado um triterpeno éster glicosilado (JUNG et al.,
2001). Dois triterpenos isolados de R. sieboldii o ácido tormêntico e o ácido eufásico
apresentaram efeito anti-inflamatório e inibidor de DNA polimerases mamárias
(MURAKAMI et al., 2002).
3.2.1 Rubus imperialis
A espécie R. imperialis (Figura 1) é um arbusto conhecido comumente como
amora-branca, amora do mato e suas folhas são usadas na medicina popular para o
tratamento de diversas patologias, como diabetes, processos inflamatórios e
dolorosos (NIERO et al., 1998; CIRILO, 1993).
Em estudos anteriores feitos em nossos laboratórios, mostraram que alguns
extratos e um triterpeno denominado niga-ichigosideo F1 isolado exerceram uma
20
importante atividade antinociceptiva. Esta substância foi aproximadamente 30 vezes
mais potente do que a aspirina e o paracetamol no teste de contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético em camundongos, além de previnir tanto a dor de
origem neurogênica como a dor de origem inflamatória do teste da formalina (NIERO
et al., 2000; 2002). Alguns extratos das partes aéreas, também mostraram-se
bastante efetivos em diminuir os níveis de glicose em ratos hiperglicêmicos,
induzidos por aloxano (NOVAES et al., 2001). No bioensaio de citotoxicidade frente
a Artemia salina a fração acetato de etila das raízes apresentou uma ação
significativa. No entanto, o Niga-ichigosídeo F1 desta fração não teve ação sobre o
microcrustáceo, indicando que devem existir outros compostos responsáveis pela
atividade citotóxica ou ainda pode estar ocorrendo um sinergismo entre mais de um
princípio ativo (KANEGUSUKU, 2001; KANEGUSUKU et al., 2002). Recentemente,
um estudo realizado sobre o mecanismo de ação desta substância mostrou
resultados importantes e sugerem que estão envolvidas tanto no sistema
adrenérgico quanto serotonérgico, não tendo participação evidente do sistema
opióide (ARDENGHI et al., 2006).
Existe uma grande semelhança quanto às características fitoquímicas entre
as várias espécies do gênero Rubus principalmente no que se refere a triterpenos e
elagitaninos (TANAKA et al., 1993). Esse fato pode ser observado quando
analisamos os constituintes químicos encontrados na R. imperialis estudada em
nossos laboratórios. Nessa espécie os compostos identificados, niga-ichigosídeo F1
e ácido tormêntico, foram também identificados na R. alceaefolius (GAN et al.,
1998).
Figura 1 - Fotografia das partes aéreas de R. imperialis
21
3.2.2 Rubus rosaefolius
A espécie R. rosaefolius (Figura 2), é um arbusto de flores brancas de frutos
vermelhos comumente conhecida como amora vermelha, amora do mato ou
framboesa (JORGE et al., 1993). Suas folhas são utilizadas contra cólicas
menstruais, diarréia e inflamação de garganta. Em grande quantidade seus frutos
são laxativos. Na indústria é utilizada como flavorizante e corante (COIMBRA, 1994).
Embora seja muito comum em nossa região, não foram encontradas
publicações científicas dessa planta na literatura, analisando seus constituintes ou
avaliando seu potencial farmacológico e biológico até o momento.
Figura 2 - Fotografia das partes aéreas de R. rosaefolius.
22
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material botânico
As raízes de Rubus imperialis foram coletadas em São Sebastião no
município de Treze de Maio – SC em janeiro de 2000. As partes aéreas de Rubus
rosaefolius foram coletadas no município de São José – SC em janeiro de 2002. As
espécies foram identificadas pelo Prof. Dr Ademir Reis (Departamento de Botânica,
UFSC). Uma exsicata de cada espécie foi depositada no Herbário Barbosa
Rodrigues em Itajaí-SC, sob nº VC Filho 012 e VC Filho 054.
4.2 Análise química
4.2.1 Obtenção dos extratos e frações
O material vegetal seco e triturado foi extraído mediante maceração durante
10 dias em recipiente fechado a temperatura ambiente. O material foi filtrado e
concentrado através da evaporação do líquido extrator à pressão reduzida
(rotavapor). Posteriormente, o extrato foi submetido a um processo de partição
líquido-líquido, sob agitação, com solventes de polaridade crescente, como hexano,
diclorometano, acetato de etila e butanol, para a obtenção das respectivas frações
semi–purificadas (CECHINEL FILHO et al., 1998; NIERO, 2000). Paralelamente foi
obtido um extrato hidroalcoólico de etanol/água (50/50), mediante maceração
durante 10 dias. Após a eliminação do solvente, foi acondicionado em dessecador
sob sílica gel ativada para posterior análise.
23
4.2.2 Separação, purificação e identificação dos constituintes químicos
As frações semi-puras que depois de testadas apresentaram efeito biológico
de interesse, foram submetidas a procedimentos cromatográficos, como
Cromatografia em Coluna (CC) com sílica gel como fase estacionária, eluída com
uma mistura de solventes previamente determinadas por Cromatografia em Camada
Delgada (CCD). As sub-frações obtidas foram reunidas segundo seu perfil
cromatográfico, verificado por CCD. No processo de elucidação estrutural foram
empregados métodos espectroscópicos como Infravermelho (IV), Ressonância
Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e Carbono 13 (RMN 13C) (CECHINEL
FILHO; YUNES, 1998).
4.2.3 Reagentes e equipamentos
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos em
espectofotômetro FT-IR-BOMEM modelo M-100 em pastilhas de KBr. As frequências
das absorções foram medidas em centímetros recíprocos (cm-1) na Universidade do
Vale do Itajaí.
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e Carbono 13
foram obtidos a 300 e a 75 MHz num equipamento Varian XL 300 e os
deslocamentos químicos foram medidos em valores adimencionais (ppm), utilizando-
se TMS como padrão interno de referência. Os espectros foram obtidos gentilmente
pelo Prof. Dr. Franco Delle Monache da Universidade Católica de Sacro
Cuore/Roma.
Nos fracionamentos e separações cromatográficas foi utilizada sílica gel-60
de granulometria 70-230 mesh (0,063-0,20 mm) para colunas convencionais, sílica
do tipo GF254 para cromatografia de camada delgada analítica de 2,5 X 6,0 cm e
placas adquiridas da Merck. Todos os reagentes e solventes utilizados tinham ter
grau analítico P.A. Na cromatografia de camada delgada, as substâncias das
classes dos terpenóides e esteróides foram reveladas por vaporização com solução
de anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento da cromatoplaca durante 5 minutos
24
a 110 oC. As substâncias de características fenólicas foram reveladas através de
vaporização de uma solução de FeCl3 1% e secas a temperatura ambiente. Além
disso, as placas foram visualizadas sob luz ultravioleta nos comprimentos de onda
de 250 e 366nm.
4.3 Atividade antimicrobiana
A ação antimicrobiana dos componentes obtidos de R. imperialis foi
investigada através da determinação da concentração inibitória mínima. Os extratos
metanólico bruto das raízes, folhas e caules; frações hexano, acetato de etila e
butanol das raízes e as substâncias ácido 3-O-metil-4’ metilelágico e o ácido 3-O-
metilelágico-4’-O-α-raminose, foram realizadas através do método de diluição em
ágar. Os testes foram realizados pela equipe do Prof. Dr. Alexandre Bella Cruz, nos
laboratórios de microbiologia da UNIVALI.
4.3.1 Material microbiológico
Os microrganismos utilizados como cepas padrões para a realização dos
ensaios de atividade antimicrobiana foram as bactérias: Bacillus cereus (ATCC
14579), Escherichia coli (ATCC 11775), Salmonella typhimurium (ATCC 14028),
Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Staphylococcus saprophyticus (ATCC
35552) e Streptococcus agalactiae (ATCC 13813), e os fungos Candida albicans
(ATCC 10231) e Aspergillus flavus (ATCC 9170), que foram fornecidos pela
“Fundação Tropical de Pesquisa e Tecnologia André Tosello”, Campinas, SP, e o
fungo Rhizopus sp. (CL 35) que foi fornecido por “Control Lab”, Rio de Janeiro, RJ.
25
4.3.2 Manutenção dos microrganismos
As bactérias foram mantidas em tubos de ensaio contendo ágar nutritivo e
conservados sob refrigeração (4°C) no Laboratório de Pesquisa Microbiologia da
UNIVALI. Os microrganismos foram repicados em intervalos regulares de 15 a 30
dias para manter as colônias viáveis.
Os fungos (leveduriformes e filamentosos) foram mantidos em tubos de
ensaio contendo ágar Sabouraud dextrosado, devidamente identificados e
armazenados. As leveduras foram armazenadas sob refrigeração (4°C) e os fungos
filamentosos sob temperatura ambiente na micoteca do Laboratório de Micologia da
UNIVALI, sendo repicados em intervalos de 15 a 30 dias para manter as colônias
viáveis.
4.3.3 Preparo dos inóculos
Para o preparo dos inóculos bacterianos foram utilizados as bactérias Gram-
positivas Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus e
Streptococcus agalactiae e as Gram-negativas Escherichia coli e Salmonella
typhimurium.
As bactérias foram transferidas do meio nutriente para um tubo contendo
meio de manuntenção Mueller-Hinton (MERCK) e incubada a 37°C por 18-24 horas,
para a ativação da respectiva cultura.
Para o preparo do inóculo foi selecionado de 4 a 5 colônias da bactéria
cultivada em ágar Mueller-Hinton e transferidas para tubo de ensaio com 5 mL de
solução NaCl 0,86% estéril, seguido de homogeneização em agitador de tubos por
15 segundos. A densidade do inóculo foi ajustada por espectrofotometria a 520 nm,
por comparação com a escala de 0,5 de McFarland, obtendo-se concentração de
aproximadamente 1,5 x 108 células/mL. Em cada frasco (meio) com os componentes
da planta foi inoculada uma alça calibrada de 1 ·L equivalente a aproximadamente 1-
5 x 105 células (NCCLS, 1993).
26
Para o inóculo da levedura Cândida albicans, a mesma foi cultivada em ágar
Sabouraud dextrosado pelo menos duas vezes para assegurar pureza e viabilidade
das culturas de 24 a 48 horas a 37°C. Posteriormente foram selecionadas 5 colônias
de leveduras, com aproximadamente 1 mm de diâmetro, as quais foram suspensas
em 5 mL de NaCl 0,85% estéril e homogeneizadas em agitador de tubos por 15
segundos. A densidade do inóculo foi ajustada, por espectrofotometria a 520 nm
para a obtenção de transmitância equivalente `a 95%, obtendo-se uma concentração
final entre 1-5 x 106 células/mL, como descrito por Espinel-Ingroff e Pfaller (1995).
Os fungos filamentosos foram mantidos em ágar Sabouraud à temperatura
ambiente por 7 a 10 dias para obtenção de culturas jovens. Os respectivos inóculos
foram preparados removendo-se os esporos de cada fungo a partir de cultura jovem,
com auxílio de uma alça, transferidos para tubo com água estéril e homogeneizados
em agitador de tubos. A suspensão conidial foi filtrada, para remoção das hifas e
novamente homogeneizada e ajustada para 1,4 x 106 células/mL pela adição de
aproximadamente 2 mL de solução de salina a 0,85% e utilizando um hemocitômetro
para a determinação do número de células, inoculado em cada frasco (meio) uma
alça calibrada de 10 µL (1-5 x 104 células) (LLOP et al., 2000). Após a
homogeneização a turbidez da suspensão conidial foi medida por espectrofotômetro
em 530nm (INGROF – ESPINEL et al., 1992). A leitura da densidade dos inóculos
dos fungos foi realizada em comprimento de onda de 530 nm.
Ajustado o inóculo de acordo com os parâmetros destes métodos,
estabeleceu-se a concentração das leveduras, fungos dermatófitos e bactérias
compreendida em 1 a 5 x 10 UFC/mL, e 1,5 x 10 UFC/mL, respectivamente.
4.3.4 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
O método consistiu na preparação de diluições sucessivas das amostras a
serem testadas (extrato, fração ou substância) em meios de cultura sólidos, semear
as bactérias ou fungos em estudo, e após incubação, verificar a menor concentração
da amostra que inibiu o crescimento de microrganismo no ensaio.
27
Os valores da CIM foram determinados através da diluição dos componentes
obtidos de R. imperialis em ágar empregando a metodologia descrita por NCCLS
(1993) com modificações. Os extratos, frações e substâncias foram dissolvidas em
solução de dimetil sufóxido (DMSO) e água destilada (1:1), foram adicionados em
séries de 10 frascos com capacidade para 5 mL em diferentes concentrações (1 a 10
µg/mL; 10 a 100 µg/mL ou de 100 a 1000 µg/mL). Em seguida, a cada frasco foi
adicionado 1 mL de meio ágar Mueller-Hinton para as bactérias e 1 mL de ágar
Sabouraud dextrosado para os fungos, seguido de imediata homogeneização da
mistura. Após a solidificação dos respectivos meios de cultura, os microrganismos,
previamente ativados, foram inoculados nas séries correspondentes, sendo então,
incubados a 37°C por 18 a 24 horas para as bactérias e 37°C por 24 a 48 horas para
a levedura, e à temperatura ambiente (25°C) por 5 a 15 dias para os fungos
filamentosos.
Após o período de incubação, foram realizadas leituras da concentração
inibitória mínima através da verificação visual do crescimento microbiano.
Durante os testes foram realizados controles, com os meios de culturas e
solventes utilizados nas solubilizações dos extratos, frações e compostos, a fim de
se verificar seu efeito sobre os microrganismos testados. A concentração final de
DMSO nos ensaios não excedeu 2%. A leitura dos resultados foi considerada válida
somente quando houve crescimento microbiano nos controles.
4.4 Atividade antinociceptiva
Os testes farmacológicos foram realizados pela equipe da Profa Dr. Márcia
Maria de Souza, nos laboratórios de farmacologia da UNIVALI.
4.4.1 Modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
28
Camundongos “Suíços” machos (25-30 g) foram mantidos sob temperatura
controlada (~23ºC) e iluminação em ciclo de 12 horas com ração e água “ad libitum”.
A resposta nociceptiva foi induzida utilizando-se com ácido acético 0,6%, via
intraperitoneal, que promove contorções abdominais seguido de extensão de uma
das patas posteriores. Os animais foram pré-tratados com os extratos e compostos
isolados (3-10-60 mg/kg) via intraperitoneal 30 minutos antes da injeção de ácido
acético. O grupo controle recebeu volume semelhante de uma solução salina (NaCl
0,9%, 10 mg/kg). Após a injeção do ácido acético, os animais foram colocados em
cilindros de vidros individuais e o número de contorções abdominal foi quantificado
cumulativamente durante um período de 20 minutos. A atividade analgésica foi
então determinada tomando-se como base a inibição do número de contorções
abdominais dos animais pré-tratados com o extrato frações ou compostos,
comparados com o número de contorções abdominais dos animais controle (SOUZA
et al., 2003).
4.4.2 Modelo de dor induzido pela formalina
Camundongos “suíços” machos (25-30 g) foram mantidos sob temperatura
controlada (~23ºC) e iluminação em ciclo de 12 horas com ração e água “ad libitum”.
A resposta nociceptiva foi induzida utilizando-se 20 µL de formalina (2,5%, s.c.) ou
salina. Os animais foram pré-tratados com o extrato, frações (10-30-60 mg/kg) ou
com os compostos isolados (3-6-10 mg/kg) via intraperitoneal, 30 minutos antes.
Foram injetados na região dorsal da pata posterior direita e esquerda do
camundongo 20 µL de formalina (2,5%, s.c.) ou salina, respectivamente. Logo após,
iniciou-se a observação da reação à dor, cronometrando-se durante 30 minutos. O
tempo que o animal permanece lambendo ou mordendo a pata, considerando esse
indicativo de dor. Duas fases de sensibilidade foram observadas nesse modelo, a
primeira fase (dor neurogênica), aparece nos primeiros 5 minutos. e a segunda fase
(dor inflamatória) ocorre entre 15 e 30 minutos após a injeção da formalina,
representando a resposta tônica a dor, acompanhada de uma resposta inflamatória
relacionada à liberação de mediadores químicos (SOUZA et al., 2003).
29
4.4.3 Princípios básicos para pesquisa envolvendo o uso de animais (COBEA,
1991; BRASIL, 1934)
A escolha sempre que possível de métodos alternativos, ou seja, formas de
estudo que não utilizem animais. Quando da utilização de animais em pesquisa deve
estar condicionada à relevância científica e à adequação do método de estudo. Além
disso, o pesquisador deve ser treinado para fazer experimentação em animais, e é
responsável pelo seu bom uso. Neste sentido deve-se utilizar o menor número
possível de animais necessários para obtenção de resultados válidos; o transporte,
as acomodações e o trato dos animais devem ser feitos com o mínimo de estresse,
de forma que seu equilíbrio biológico seja preservado; e os animais que sentiram dor
ou angústia intensa ou crônica, e os que não serão utilizados devem ser sacrificados
por método indolor e que não cause estresse.
30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Rubus imperialis
5.1.1 Análise química
Em estudos anteriores realizados em nossos laboratórios com diferentes
partes desta planta, foi demonstrado que o extrato metanólico das raízes apresentou
melhor perfil antimicrobiano com valores de Concentração Inibitória Mínima de 900,
1200, 800 e 900 µg/mL para as bactérias B. cereus, S. aureus, S. saprophyticus e S.
agalactiae, respectivamente. O fracionamento deste extrato levou as respectivas
frações de hexano (FH), acetato de etila (FAE) e butanol (FB), das quais a FB
apresentou resultados mais relevantes (KANEGUSUKU, 2001; KANEGUSUKU et
al., 2002; BELLA CRUZ et al., 2006). O fracionamento fitoquímico de algumas
frações obtidas das raízes levou ao isolamento e a identificação de quatro
substâncias denominadas de ácido tormêntico e ácido 23-hidroxitormêntico, ácido
24-hidroxitormêntico e um derivado do ácido elágico, identificado como ácido 3-O-
metilelágico-4’-O-α-raminose (BELLA CRUZ et al., 2006).
Dando sequência aos estudos fitoquímicos de R. imperialis e, tendo em vista
os resultados da análise antimicrobiana da fração butanólica, 2,5g foram submetidas
ao procedimento cromatográfico em coluna utilizado o sistema de eluente
clorofórmio/metanol (CHCl3/MeOH) com polaridade crescente sendo coletados em
sub-frações de aproximadamente 10 mL. Posteriormente o solvente dessas sub-
frações foi evaporado e reunido segundo seus perfis cromatográficos verificado por
CCD. As sub-frações foram recromatografados em coluna e sistema de solventes
similar ao descrito acima. As sub-frações 50 a 66 CHCl3/MeOH (85:15)
apresentaram um composto de coloração branca que, após sucessivas
recristalizações em MeOH:/CHCl3 (80:20) se apresentou em forma de um sólido
amorfo, PF=197°C massa de 11mg, denominado inicialmente de Ri-5. Um resumo
das operações realizadas encontra-se na figura 3. Esta substância (Ri-5), foi
31
identificada através de dados espectroscópicos (IV, RMN 1H e 13C) em comparação
com dados encontrados na literatura.
Figura 3 - Operações realizadas para isolamento e identificação de substâncias puras das raízes de R.imperialis. *Dados obtidos de Kanegusuku 2001.
Neste aspecto, espectro de IV, Ri-5 apresentou bandas de absorções de
alguns grupos funcionais característicos como: 3212 cm-1 (OH); 1712 cm-1 (COO);
1699 cm-1 (C=O); 1615 cm-1 (C=C); 1110 cm-1 (unidade heterosídica) (Figura 17,
anexo I).
Analizando-se o espectro de RMN 1H (Figura 18, anexo I) podemos destacar
dois sinais na forma de singletos em δ 8,76 e δ 8,07 ppm típicos de hidrogênio
aromáticos, atribuídos aos hidrogênios (s, H-5’) e (s, H-5), respectivamente. Um
singleto em δ 4,20 ppm característicos de hidrogênios ligados ao grupo metoxila (s,
3-OCH3). Um singleto em 3,60 ppm característico de Hidrogênio de grupo metila
ligado a um anel aromático e atribuído ao grupo metila (4’-CH3).
O espectro de RMN 13C (Figura 19, anexo I) mostra sinais δ 112,32 ppm e
111,85 ppm referentes aos carbonos quaternários (C-1e C-1’) respectivamente.
Teste antimicrobiano (2 a Etapa)
Teste antimicrobiano (3 a Etapa)
Raízes (490g)
Extrato metanólico bruto (84,7g)
Teste antimicrobiano (1 a Etapa)
Hexano (88mg)
Ac. de Etila (4,0g)
Butanol (2,5g)
.
Ri - 5 (31mg)
•Ác. 3-O-metilelágico-4’-O-α-raminose (20mg)
•Ác. Tormêntico; •Ác. 23-hidroxitormêntico; •Ác. 24-hidroxitormêntico.
- Particionamento com solventes de polaridade crescente.
Espectroscopia - IV, RMN 13C, RMN 1H
Cromatografia em Coluna -Eluente: CHCl/MeOH; -Monitorada por CCD.
- Maceração em MeOH por 7 dias. - Evaporação do solvente à pressão reduzida
* *
*
*
32
Assim como o sinal de δ 152,82 ppm referente ao carbono quaternário de (C-4). O
sinal do grupamento metóxi ligado ao C-3 é indicado pelo sinal em δ 61,26 ppm. Já o
sinal em 56,20 ppm foi atribuído ao carbono do grupo metila ligado ao C-4’ Os
demais sinais podem ser observados nas tabelas 1 e 2.
Todos os dados estão de acordo com os encontrados na literatura (RAHMAN
et al., 2001) e permitiram concluir que se trata do ácido 3-O-metil-4’ metilelágico (1).
Tabela 1 - Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao espectro
de RMN 1H (300MHz) de Ri-5 em piridina-d5.
Posição
δδδδ (ppm)
δδδδ (ppm) Literatura a
5
8.07
8,04
5’ 8,73 8,44
7 7.58 7,82
7’ 7,36 7,74
3 – OCH3 4.20 4,16
4’ –CH3 3.60 3,86 a (RAHMAN et al., 2001)
Tabela 2 - Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao espectro
de RMN 13C de Ri-5 em piridina-d5.
Carbono
δδδδ (ppm)
δδδδ (ppm) Literatura a
Carbono
δδδδ (ppm)
δδδδ (ppm) Literatura a
1
112,32 (C)
112,5
1’
111,85 (C)
112,5
2 140,58 (C) 141,0 2’ 141,45 (C) 142,5
3-OCH3 61,26 61,1 3’ 111,93(CH) 112,9
4 152,92 (C) 152,2 4’- CH3 56,20 56,4
5 152,82 (C) 154,2 5’ 111,59(CH) 107,9
O
O
O
O
H 3 C O H
O H H
R H O 4 4' 3'
5'
7'
3
5
7
(1)
33
6 113,23(C) 113,6 6’ 114,20 (C) 113,6
7 159,89 (C) 159,1 7’ 158,87 (C) 159,1 a (RAHMAN et al., 2001)
A ocorrência do ácido elágico e derivados tem sido observado em algumas
espécies do gênero Rubus (HÄKKINEN et al., 1999; MAATTA-RIIHINEN et al., 2004;
GUDEJ et al., 2004). O ácido elágico está presente em muitas frutas e vegetais têm
sido apontado como um dos agentes moleculares que atua na prevenção e
tratamento principalmente do câncer (AGGARWAL et al., 2006; PAIVARINTA et al.,
2006).
Alguns derivados do ácido 3-O-decilelagico e ác. 3,3’-di-O-metilelagico
demonstraram importante efeito quanto ao potencial antimutagênico em
camundongos (SAMART et al.,1986). Da mesma forma, o ácido elágico e o ácido
3,3'-di-O-metilelágico, apresentaram efeito hepatoprotetor quando testados em ratos,
revelando uma importante propriedade antioxidante desses compostos (ITO et al.,
1990).
34
5.1.2. Análise antimicrobiana
Como mencionado anteriormente, na tentativa de direcionar a análise
fitoquímica, estudos anteriores foram realizados com os extratos metanólico de
diferentes partes da planta, bem como as frações semipurificadas. Estes resultados
podem ser observados nas tabelas 3 e 4.
Tabela 3 - Atividade antimicrobiana de extratos de diferentes partes de R. imperialis
contra bactérias e fungos.
CIM (µg/mL)
Extratos MeOH
Bactérias Gram-positiva*
B.c. S.a S.s
S.ag.
Bactérias Gram-negativa* E.c. S.t.
Fungos*
C.a. A.f. R.sp.
Raízes
Folhas
Calules
900 1200 800 900
n.t. 1000 n.t. n.t.
n.t. >2000 n.t. n.t.
1800 >2000
1900 >2000
>2000 >2000
>2000 >2000 >2000
>2000 >2000 >2000
>2000 >2000 >2000
Bacillus cereus (B.c.) Staphylococcus aureus (S.a.); Staphylococcus saprophyticus (S.s.); Escherichia coli (E.c.); Salmonella typhimurium (S.t.); Streptococcus agalactiae (S.ag.); Candida albicans (C.a.); Aspergillus fumigatus (A.f.); Rhizopus sp. (R.sp.); não testado (n.t); Concentração Inibitória Mínima (CIM). *Dados obtidos de Kanegusuku, 2001.
Tabela 4 - Atividade antimicrobiana de frações obtidas das raízes de R. imperialis
contra bactérias e fungos.
CIM (µg/mL)
Frações
Bactérias Gram-positiva*
B.c. S.a S.s S.ag.
Bactérias Gram-negativa* E.c. S.t.
Fungos*
C.a. A.f. R.sp.
Hexano
Ac. de etila
Butanol
n.t. >2000 n.t. n.t.
n.t. 800 n.t. n.t.
500 800 500 500
>2000 >2000
>2000 >2000
>2000 >2000
>2000 >2000 >2000
>2000 >2000 >2000
>2000 >2000 >2000
Bacillus cereus (B.c.) Staphylococcus aureus (S.a.); Staphylococcus saprophyticus (S.s.); Escherichia coli (E.c.); Salmonella typhimurium (S.t.); Streptococcus agalactiae (S.ag.); Candida albicans (C.a.); Aspergillus fumigatus (A.f.); Rhizopus sp. (R.sp.); não testado (n.t); Concentração Mínima Inibitória (CIM). *Dados obtidos de Kanegusuku, 2001.
35
É oportuno observar a importância de um estudo biodirecionado, tendo em
vista que em cada etapa dos testes antimicrobianos, mostraram melhores resultados
para a substância 1 com atividade duas vezes superior do que a fração de partida,
com uma CIM de 200 µg/mL relacionado especificamente a bactéria Gram-positiva
Streptococcus agalactae (Tabela 5).
Tabela 5 - Atividade antimicrobiana de substâncias isoladas das raízes de R.
imperialis contra bactérias e fungos.
CIM (µg/mL)
Substância
Bactérias Gram-positiva B.c. S.a S.s S.ag.
Bactérias Gram-negativa
E.c. S.t.
Fungos C.a. A.f. R.sp.
1
2
>2000 >2000 >2000 200
>2000 >2000 >2000 >2000
>2000 >2000
>2000 >2000
>2000 >2000 >2000
>2000 >2000 >2000
Ác. 3-O-metil-4’metilelágico (1); Ác. 3-O-metilelágico-4’-O-α-raminose (2); Bacillus cereus (B.c.) Staphylococcus aureus (S.a.); Staphylococcus saprophyticus (S.s.); Escherichia coli (E.c.); Salmonella typhimurium (S.t.); Streptococcus agalactiae (S.ag.); Candida albicans (C.a.); Aspergillus fumigatus (A.f.); Rhizopus sp. (R.sp.); Concentração Mínima Inibitória (CIM).
A concentração inibitória de 200 µg/mL alcançada para este composto é
significativa e nos dá subsídios para que através de modificações estruturais, obter
compostos mais potentes do que os utilizados clinicamente. Uma breve comparação
com um composto semelhante isolado anteriormente da fração acetato de etila
mostra que diferenças nas estruturas dos dois compostos levaram a diferentes
resultados sobre ação antimicrobiana. Como pode ser observado na tabela 5, o fato
da substância 2 possuir uma unidade raminose, mostrou-se totalmente inativo frente
aos microrganismos testados. O fragmento de açúcar torna a molécula mais polar e
dificulta a permeabilidade. Por outro lado, o grupo CH3 torna mais apolar e
conseqüentemente pode ultrapassar melhor as barreiras lipofílicas.
R (1) CH3 (2) ORaminose
O
O
O
O
H 3 C O H
O H H
R H O 4 4' 3'
5'
7'
3
5
7
36
Sobre avaliação microbiológica, ainda são poucos os estudos utilizando
derivados do ácido elágico. Pode-se citar um estudo sobre a atividade contra
Staphylococcus aureus do elagitanino denominado punicalagin (MACHADO et al.,
2002) e outro estudo realizado por Rarhman et al. (2001) com três derivados do
ácido elágico revelando atividade contra diferentes bactérias patogênicas.
O ácido 3-O-metil-4’metilelágico sendo um derivado do ácido elágico pertence
ao grupo dos taninos hidrolisáveis. Kilkuskie e colaboradores (1992) observaram que
os taninos complexos mostraram potente atividade contra a replicação do HIV. Outro
estudo revela atividade antibacteriana de vários taninos contra Staphylococcus
aureus (AKIYAMA et.al., 2001). Scalbert (1991) relata que taninos condensados e
hidrolisáveis não apresentam diferenças significantes frente a fungos e bactérias. No
entanto, o efeito da toxicidade relacionado à estrutura molecular é ainda
desconhecido. Por outro lado, o mecanismo antimicrobiano de um tanino pode estar
relacionado à pelo menos três propriedades: ação adristingente, que pode induzir a
complexação com enzimas ou substratos; ações tóxicas, podendo estar relacionada
com a ação nas membranas dos microrganismos e ação de complexação de íons
metálicos (SACALBERT, 1991; CHUNG et al., 1998a; 1998b).
37
5.2 Rubus rosaefolius
5.2.1 Análise química
No intuito de contribuir com a fitoquímica desta espécie, as partes aéreas
(700 g) foram secas, moídas e maceradas em metanol por 10 dias. Em seguida o
solvente foi evaporado em evaporador rotatório sob pressão reduzida,
ressuspendido em 50/50% de metanol/água e particionado utilizando solventes de
polaridade crescente: hexano, diclorometano, acetato de etila e butanol.
Cada fração separadamente foi submetida a um processo de purificação
através de cromatografia de coluna empacotada com sílica gel 60, utilizando
eluentes de polaridade crescentes previamente selecionados por CCD. As frações
obtidas foram monitoradas por cromatografia de camada delgada. As substâncias
que apresentaram suficiente grau de pureza foram analisados por IV, RMN 13C e 1H
e comparados com dados da literatura. Os procedimentos podem ser resumidos na
figura 4.
Partes aéreas (700g)
Extrato metanólico ( 35,31g )
Hexan o (7,45g)
Diclorometano (4,34g)
Acetato de Etila (1,92g)
Butanol (1,45g)
Rr 52 - 54 (15 mg)
Rr 48 - 58 (18mg)
Rr 1 (100 - 123) ( 18 mg)
Rr 124 - 142 (19 mg)
- Maceração durante 10dias - Evaporação do solvente
- Suspensão em MeOH:H2O (50:50) - Extração líq/líq com diferentes solvente - Evaporação do solvente
- CC - CCD
- CC - CCD - IV, RMN 13C e 1H
38
Figura 4 – Operações realizadas para isolamento e identificação de substâncias puras das partes aéreas de R. rosaefolius.
5.2.1.1 Fração Hexano
7,45 g foram submetidos a uma coluna empacotada com sílica gel 60 (60g) e
eluída com uma mistura de solventes de polaridade crescente (hexano/acetona)
onde foram coletados 120 sub-frações. As de número 52-54 apresentaram-se na
forma de cristais incolores e após um screeming com padrões autênticos eluídos em
diferentes sistemas de solventes foi identificada como sendo uma mistura de
possíveis fitoesteróis denominados de: stigmasterol (3), β-sistosterol (4) e
campesterol (5).
Estruturalmente os fitoesteróides são semelhantes ao colesterol dos
mamíferos um importante componente das membranas celulares e formação de
hormônios sexuais. Estudos clínicos e experimentais demonstraram que a adição de
fitoesteróis na dieta reduz os níveis plasmáticos de colesterol e de LDL-colesterol
(MICTTINEN et al., 2006).
H H
H
HO
H
(5)
H H
H
HO
H
CH3
(3) H H
H
HO
H
CH3
(4)
39
5.2.1.2 Fração Diclorometano
4,34 g desta fração foram submetidos a uma coluna empacotada com sílica
gel 60 (40 g) e eluída com uma mistura de solventes de polaridade crescente
(hexano/acetona) onde foram coletados 250 sub-frações. A sub-fração Rr 100-123
(18 mg) apresentou-se na forma de cristais incolores e ponto de fusão 182°C. Após
screening por CCD e alguns padrões existentes no laboratório, demonstrou não ser
nenhuma das substâncias isoladas anteriormente, sendo denominado de
previamente de Rr-1.
Esta substância apresentou no IV, bandas de absorção em 3450 cm-1
característico de grupamento OH, na região de 2900 cm-1 duas bandas de absorção
atribuídas às ligações CH3 e CH2, um sinal intenso em 1688,5 cm-1 típico de C=O e
de 1500 a 1100 cm-1 sinais característicos de duplas ligações C=C (Figura 20, anexo
II).
No espectro de RMN 1H (Figura 21, anexo II), pode ser observado na região
entre δ 1 a 1,72 ppm sinais característicos de sete metilas atribuídos aos hidrogênios
H-23, H-24, H-25, H-26, H-27, H-29, H-30. Em δ 3,11 ppm um sinal na forma de um
tripleto característico do H-5 e em δ 3,40 ppm um duplo dupleto relacionado ao
hidrogênio H-3. Os singletos de H-18 e H-29 com sinais em δ 3,03 e 1,42 ppm,
mostram ausência de um próton em C-19, sugerindo que existe uma hidroxila ligado
a este carbono (Tabela 6).
Analisando-se o espectro de RMN 13C (Figura 22 e 23, anexo II), observam-se
sinais característicos em δ 125,3 e 139,1 atribuídos aos carbonos (C-12 e C-13); δ
179,7 (C-28); δ 65,9 (C-2); δ 79,1 (C-3); δ 39,3 (C-19); δ 39,2 (C-20).
Um estudo comparando esses sinais como os encontrados em trabalhos de
Sashi (1992), Jang (2005) e Hirai (2000) permitiram concluir que a estrutura do
composto Rr-1, trata-se do triterpeno denominado ácido 28 metóxitormêntico (6). Os
demais dados podem ser observados nas tabelas 6 e 7.
Da mesma forma a subfração Rr 124-142 (19 mg) se apresentou na forma de
cristais amorfos após análise espectroscopica e CCD com padrões autênticos
revelaram ser outro triterpeno denominado de ácido tormêntico (7).
40
Tabela 6 – Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao espectro de RMN 1H (300 MHz) de Rr-1 em piridina-d5.
Posição
δδδδ (ppm)
δδδδ (ppm) Literatura a
Posição
δδδδ (ppm)
δδδδ (ppm) Literatura a
2
4,10
4,22
24
1,09
1,01
3 3,75 3,85 25 0,97 0,93
5 2,60 2,53 26 1,15 1,12
12 5,52 5,60 27 1,63 1,61
18 3,03 3,03 29 1,42 1,42
23 2,60 2,67 30 1,15 1,11
ª(JANG et al., 2005)
Tabela 7 – Valores de deslocamentos químicos comparativos referentes ao espectro de RMN 13C de Rr-1 em piridina-d5.
Posição
δδδδ (ppm)
δδδδ (ppm) Literatura a
Posição
δδδδ (ppm)
δδδδ (ppm) Literaturaa
1
42,2/42,3
42,2
16
24,6
24,4
2 65,9 66,7 17 48,1/47,8 48,3
3 79,1 79,2 18 53,3 53,2
4 38,6 39,3 19 39,3 39,1
5 48,5 48,3 20 39,2 38,5
6 18,3 18,2 21 30,8 30,8
7 33,3/33,0 33,0 22 37,2 36,8
8 40,4 40,0 23 28,4 28,6
9 47,4 47,6 24 22,1 22,0
10 38,5 38,4 25 16,8/16,6 16,5
11 23,9/23,5 23,4 26 17,3/17,2 17,1
12 125,3 125,8 27 23,7 23,9
13 139,1 138,7 28 179,7 178,4
14 42,2/42,3 42,2 29 17,3/17,7 17,1
HO
HOCOOCH3
HO
12
34
5
24 23
25 26 1312
17
28
19
30
29
(6)
HO
HOCOOH
HO
12
34
5
24 23
25 26 1312
17
28
1929
30
(7)
41
15 28,4 28,2 30 21,2 21,7 a (SHASHI et al., 1992)
Muitos triterpenos têm sido encontrados em várias espécies de Rubus α-
amyrin, β-amyrin, campesterol, stigmasterol, β-sitosterol,ácido ursolico, ácido
tormêntico são alguns exemplos mais comuns (DURHAM et al., 1994; GRIFFITHS et
al., 2000; PATEL et al., 2004). São também isolados vários triterpenos inéditos como
o ácido pinfaensis, um triterpeno glicosideo isolado de Rubus pinfaensis usado
popularmente para cicatrização de feridas (DURHAM et al., 1994) e
rubupungenoside A e B, triterpenos dímeros de Rubus pungens utilizado como
antibacteriano, antiinflamatório, agente antitumoral pela medicina popular (WANG et
al., 2000). Foi encontrado um triterpeno éster glicosil chamado de rubussideo A
isolado de Rubus allegheniensis (ONO et al., 2003).
Com relação às atividades biológicas dos triterpenos foram encontrados
efeitos antiinflamatórios (SAFAYHI et al., 1997; DE LAS HERAS et al., 2003),
antineoplásico (STELZER et al., 2003; RAVELO et al., 2004), antimicrobiano
(RAGASA et al., 2005; DE LEON et al., 2005; EL-SEEDI, 2005).
Segundo um estudo realizado por Jung et al. (2005), o ácido tormêntico
apresentou um efeito antinociceptivo pronunciado sendo mais potente que a aspirina
e um significativo efeito antiinflamatório, mostraram ainda que com 3β-hidroxil em
sua estrutura foi mais potente o efeito antinociceptivo e antiinflamatório que o ácido
eufásico com 3α-hidroxil.
5.2.1.3 Fração Acetato de Etila
Esta fração apresentou uma massa de 1,92 g que foi, submetido a uma
coluna empacotada com sílica gel 60 (35 g) e eluída com uma mistura de solventes
de polaridade crescente (clorofórmio/metanol) onde foram coletados 270 sub-
frações. A sub-fração Rr 48-58 (18 mg) após análise espectroscópica e CCD com
padrões autênticos revelaram ser o triterpeno ácido tormêntico (7) isolado também
na fração de clorofórmio.
42
5.2.2 Atividade antinociceptiva
Neste sentido, no intuito de avaliar o potencial farmacológico, a propriedade
antinociceptiva do extrato e diferentes frações e de um composto isolado foi
verificada através de modelos clássicos de dor em camundongos.
Dessa forma, utilizou-se o modelo de contorções abdominais induzidas pelo
ácido acético (0,6%) administrado intraperitonialmente. Este método tem sido
empregado amplamente, uma vez que se trata de um modelo bastante simples e,
pouco específico, permitindo avaliar a atividade antinociceptiva de substâncias que
atuam tanto em nível central como periférico. Já o outro modelo de dor induzida pela
formalina é mais específico, permitindo avaliar dois tipos distintos de dor. A dor de
origem neurogênica (estímulo direto dos neurônios nociceptivos) e a de origem
inflamatória representando a resposta tônica à dor, acompanhada de uma resposta
inflamatória (mediadores químicos da inflamação) (SOUZA et al., 2003).
Analisando-se a figura 5 observa-se que o extrato hidroalcoólico promoveu
uma IM de 97,9% e DI50 2,4 (1,5-6,6) mg/kg quando avaliado no modelo de ácido
acético. Já a figura 6 mostra que o EH promoveu também uma forte ação quando
analisado no modelo da formalina, apresentando IM de 62,8 e 98,8% e DI50 7,0 (4,2-
11,6) e 2,3 (1,2-8,8) mg/kg em ambas as fases da dor, respectivamente.
Figura 5 – Efeito do extrato hidroalcoólico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor
induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (** p < 0,01) quando comparados com o grupo
0
30
60 ControleHidroalcóolico
Tratamento (mg/kg i.p.)
**
C 10
IM = 97.99%
03 06
** **
DI50= < 2mg/Kg
Número de contorções
DI50=< 2 mg/kg DI50 = 2,4 (1,5-6,6) mg/kg
IM= 97,9%
43
controle.
Figura 6 – Efeito do extrato hidroalcoólico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor
Induzida por formalina. A Fase I representa a dor neurogênica e a Fase II corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** < 0,001) quando comparados com o grupo controle.
Analisando-se a figura 7 observa-se que a fração de hexano promoveu um
efeito com IM de 93,4% e DI50 de 27,3 (22,9-32,5) mg/kg. Por outro lado, quando
analisado no modelo de dor da formalina no FH não causou ação analgésica
significante para primeira (neurogênico) e segunda fase (inflamatória)
respectivamente (Figura 8).
Figura 7 – Efeito da fração hexano (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor induzida
por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (** p < 0,01) quando comparados com o grupo controle.
0
30
60
90
Controle Hidroalcóolico
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 1006
Fase I
03
* **
**
DI50= 7,03(4,24-11,68)mg/KgIM= 62,82 %
Tem
po de Reação
0
75
150
Controle Hidroalcóolico
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 1006
Fase II
03
IM= 98.82%
*** *** ***
DI50 = < 3,0 mg/kg
Tem
po de Reação
DI50= 7,03( 4,24-11,68)mg/kg IM=62,82%
DI50 = 7,0 (4,2-11,6) mg/kg IM = 62,8% DI50 = 2,3 (1,2-8,8) mg/kg
IM = 98,8%
0
30
60ControleHexano
Tratamento (mg/kg i.p.)
**
C 60
IM = 93,44 %
10 30
**
DI50 = 27,33(22,96-32,53)mg/Kg
Número de co
ntorções
DI50 = 27,33 (22,96-32,53) mg/kg IM = 93,44% DI50 = 27,3 (22,9-32,5) mg/kg IM = 93,4%
44
Figura 8 - Efeito da fração hexano (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor induzida
por formalina. A Fase I representa a dor neurogênica e a Fase II corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (* p < 0,05) quando comparados com o grupo controle.
Quando se analisa a fração diclorometano observa-se que esta fração
promoveu dose dependente no número de contorções induzidas pelo ácido acético,
com DI50 21,0 (15,7-28,0) mg/kg e inibição máxima de 88,0% figura 9. Quando
analisada no modelo de dor induzido pela formalina foi observado um efeito
significativo somente na segunda fase de dor apresentando uma DI50 6,4 (4,2-12,7)
mg/kg e inibição máxima de 87,9% (Figura 10).
Figura 9 – Efeito da fração de diclorometano (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a
dor induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (** p < 0,01) quando comparados com o grupo controle.
0
30
60
90Controle
Diclorometano
Tratamento (mg/kg i.p.)
**
C 60
IM = 88 %
10 30
**
**
DI50 = 21,01(15,75-28,04)mg/Kg
Número de co
ntorções
DI50 = 21,0 (15,7-28,0) mg/kg IM = 88%
0
60
120 Controle Hexano
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 6010 30
Fase I
Tem
po de Reação
0
50
100
150
ControleHexano
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 6010 30
Fase II
IM= 63,42 %
*
DI50 = 51,11(16,75-155,90) mg/kg
Tem
po de Reação
DI50 = 51,1 (16,7-155,9) mg/kg IM = 63,4%
45
Figura 10 - Efeito da fração de diclorometano (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor induzida por formalina. A Fase I representa a dor neurogênica e a Fase II corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (** p < 0,01) quando comparados com o grupo controle.
Outro dado importante observa que se analisa a figura 11 a fração acetato de
etila promoveu um forte efeito analgésico com IM de 93,8% e DI50 1,9 (1,3-4,8)
mg/kg no modelo do ácido acético. Da mesma forma quando analisada a ação
analgésica no modelo da formalina observa-se que o efeito concentrou-se na
segunda fase de dor, apresentando IM de 83,5% e DI50 de 6,0 (4,1-8,7) mg/kg como
mostra a figura 12.
Figura 11 - Efeito da fração de acetato de etila (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a
dor induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (** p < 0,01) quando comparados com o grupo controle.
0
25
50 Controle
Acetato de Etila
Tratamento (mg/kg i.p.)
**
C 10
IM = 93,88 %
03 06
** **
DI50 < 3,0 mg/kg
Número de co
ntorções
DI50 = 1,9 (1,3-4,8) mg/kg IM = 93,8%
0
150
300
Controle
Diclorometano
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 6010 30
Fase II
IM= 87,98 %
DI50 = <10mg/Kg
** ****T
empo de Reação
0
60
120 Controle
Diclorometano
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 6010 30
Fase I
Tem
po de Reação
DI50 =< 10mg/kg IM = 87,98% DI50 = 6,4 (4,2-12,7) mg/kg IM = 87,9%
46
Figura 12 - Efeito da fração de acetato de etila (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a
dor induzida por formalina. A Fase I representa a dor neurogênica e a Fase II corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (* p < 0,05) quando comparados com o grupo controle.
Em relação à fração butanol a figura 13 mostra um efeito moderado com IM
de 51,4% e DI50 54,1 (37,0-78,9) mg/kg. Por outro lado, no modelo da formalina não
teve efeito tanto para a primeira como para a segunda fase de dor (Figura 14).
Figura 13 – Efeito da fração butanólica (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor
induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (** p < 0,01) quando comparados com o grupo controle.
0
30
60
90 ControleButanol
Tratamento (mg/kg i.p.)
**
C 60
IM = 51,46 %
10 30
**
DI50= 54,13(37,09-78,98)mg/Kg
Número de co
ntorções
DI50 = 54,1 (37,0-78,9) mg/kg IM = 51,4%
0
50
100 ControleAcetato de etila
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 1006
Fase I
03
IM = 11,72 %
Tem
po de Reação
0
90
180Controle
Acetato de etila
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 1006
Fase II
03
IM = 83,58 %
DI50 = 6,05(4,17- 8,78)
*Tem
po de Reação
DI50 = 6,0 (4,1-8,7) mg/kg IM = 83,5%
IM = 11,7%
47
Figura 14 - Efeito da fração butanólica (10; 30; 60 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor
induzida por formalina. A Fase I representa a dor neurogênica e a Fase II corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média.
Os triterpenos têm se mostrado alvo de vários estudos no que se refere à
atividade biológica. Estudos anteriores em nossos laboratórios mostraram que
triterpenos isolados da espécie Rubus imperialis, niga-ichigosideo F1, 23-
hidroxitormêntico e 24-hidroxitormêntico, apresentaram importantes ações
analgésicas (NIERO, 2000; 2002). Devido à importância e a similaridade destes
triterpenos com o composto isolado o ácido metoxitormêntico foi submetido à análise
antinociceptiva. Quando avaliado no modelo das contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético, apresentou uma IM de 64,2% e DI de 5,1 (3,6-7,1) mg/kg. (Figura
15). Da mesma forma, quando analisado no modelo de dor induzido pela formalina,
apresentou uma IM de 39,3 e 90,3 % e DI50 de 9,9 (8,0-12,3) e 6,3 (5,0-7,9) mg/kg,
respectivamente (Figura 16).
Figura 15 – Efeito do ácido metoxitormêntico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor
0
25
50
Controle
Metoxitormêntico
Tratamento (mg/kg i.p.)
**
C 10
DI50 = 5,10(3,64-7,14) mg/Kg
IM = 64,22 %
03 06
**
**
Número de co
ntorções
DI50 = 5,1 (3,6-7,1) mg/kg IM = 64,2%
0
50
100 ControleButanol
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 6010 30
Fase I
Tem
po de Reação
0
100
200 ControleButanol
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 6010 30
Fase II
IM= 48,62 %
Tem
po de Reação
48
induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (** p < 0,01) quando comparados com o grupo controle.
Figura 16 - Efeito do ácido metoxitormêntico (3; 6; 10 mg/kg) de R. rosaefolius sobre a dor induzida por formalina. A Fase I representa a dor neurogênica e a Fase II corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis experimentos e as barras verticais indicam os erros padrão da média. Asteriscos indicam diferenças significantes (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** < 0,001) quando comparados com o grupo controle.
No intuito de relacionar o efeito encontrado com medicamentos utilizados na
terapêutica, uma análise comparativa foi realizada. Neste aspecto, a tabela 8 mostra
dados extremamente importantes no que se refere ao modelo do ácido acético.
Como pode ser observado, tanto o extrato hidroalcoólico quanto à fração de
acetato de etila apresentam DI50 inferior a 3 mg/kg e IM superior a 93%. Ao
compararmos com o medicamento de referência (aspirina e paracetamol), o 28-
metoxitormêntico testado foi cerca de oito vezes mais eficaz. Outro fato que chama
atenção se refere à fração diclorometano. Embora não tenha sido tão efetiva quanto
às mencionadas acima, a substância isolada desta fração apresentou um efeito
muito significativo neste modelo, com DI50 de 5,1 mg/kg. Da mesma forma, esta
substância foi cerca de três vezes mais potente do que os medicamentos de
referência. Por outro lado, ficou evidente que na fração de acetato de etila deve
conter outras substâncias com grande efeito antinociceptivo.
Quando se analisam os efeitos encontrados no modelo de dor induzido pela
formalina, observa-se um perfil muito semelhante ao ácido acético. Como pode ser
observado na tabela 9, novamente o extrato hidroalcoólico, a fração acetato de etila
0
75
150 Controle Metoxitormêntico
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 1006
Fase I
03
IM = 39,37 %
*
DI50 = 9,98(8,08-12,31)mg/Kg
*
Tem
po de Reação
0
60
120
Controle
Metoxitormêntico
Tratamento (mg/kg i.p.)
C 1006
Fase II
03
IM = 90,37 %
**
DI50 = 6,3(5,07-7,98)mg/Kg
Tem
po de Reação
DI50 = 9,9 (8,0 – 12,3) mg/kg IM = 39,3%
DI50 = 6,3 (5,0 – 7,9) mg/kg IM = 90,3%
49
e diclorometano foram as mais efetivas com DI50 de 6,0; 3,0 e 10,0 mg/kg
respectivamente. Estes resultados são promissores tendo em vista que são muito
inferiores aos encontrados pelos compostos de referência. Outro dado importante se
refere ao efeito encontrado pela substância isolada. Neste modelo mostrou-se
efetivo para inibir tanto na primeira quanto na segunda fase da dor com DI50 de 9,9 e
6,3 mg/kg respectivamente. Novamente se comparados estes valores com os
medicamentos de referência, observa-se que o composto isolado foi cerca de três
vezes mais potente além de ser efetivo em ambas as fases de dor.
Embora esta substância tenha sido isolada em outras espécies vegetais,
nesta espécie está sendo isolado pela primeira vez. Além disso, não foram
encontrados na literatura dados referentes a ensaios farmacológicos sobre atividade
antinociceptiva.
Tabela 8 – Efeito antinociceptivo comparativo entre o Extrato Hidroalcoólico, as Frações Hexano, Diclorometano, Acetato de Etila, Butanol, o Ác. 28-O- Metoxitormêntico e fármacos usados como referência no modelo de dor induzida pelo ácido acético 0,6% em camundongos, administrados intraperitonialmente.
Tratamento
DI50 (mg/kg, i.p.) a
IM (%)b
Extrato Hidroalcoólico
Fração Hexano
2,4 (1,5-6,6)
27,3 (22,9-32,5)
97,9
93,4
Fração Diclorometano 21,0 (15,7-28,0) 88,0
Fração Acetato de Etila 1,9 (1,3-4,8) 93,8
Fração Butanol 54,4 (37,0-78,8) 51,4
28-O-Metoxitormêntico 5,1 (3,6-7,1) 64,2
Aspirina* 24,0 (13,1-43,8) 35,0
Paracetamol* 18,8 (15,7-22,6) 38,0 a 95% Limite de confiança, sendo que cada grupo representa uma média de 6 animais. Valores de p < 0,05 foram considerados indicativos de significância. b Inibição Máxima *(BRESCIANI et al., 2003)
Um dado importante observa-se na tabela 9 tanto a fração diclorometano
quanto o sua substância isolada ácido 28-O-metóxitormêntico tiveram um percentual
de inibição elevada sugerindo que este pode ser o responsável pela atividade
analgésica da fração.
50
Tabela 9 – Efeito antinociceptivo comparativo entre o Extrato Hidroalcoólico, as Frações Hexano, Diclorometano, Acetato de Etila, Butanol, o Ácido 28- Metoxitormêntico e fármacos usados como referência no modelo de dor induzida pela formalina, i.p.
Tratamento
DI50 (mg/kg, i.p.) 1ª Fase
DI50 (mg/kg, i.p.) 2ª Fase
IM (%)b
Fração Hexano
Inativa
51,1 (16,7-155,9)a
NC1
63,42
Fração Diclorometano
Inativa
6,4 (4,2-12,7)a
NC1
87,92
Fração Ac. de Etila
Inativa
6,0 (4,1-8,7)a
11,71
83,52
Fração Butanol
Inativa
Inativa
NC1
NC2
Fração Hidroalcoólico
7,0(4,2-11,6)
2,3 (1,2-8,8)a
62,81
98,22
Ácido metoxitormêntico
9,9(8,0-12,3)
6,3 (5,0-7,9)a
39,31
90,32
Aspirina*
Inativa
18,1 (13,6-24,3)a
NC1
85,02
Paracetamol*
Inativa
22,1 (13,8-37,6)a
NC1
88,02
1 Fase I 2 Fase II a 95% Limite de confiança, sendo que cada grupo representa uma média de 6 animais. Valores de p < 0,05 foram considerados indicativos de significância b Inibição Máxima NC= Não calculada *(BRESCIANI et al., 2003)
51
6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES
6.1 Rubus imperialis
- Este trabalho possibilitou complementar alguns estudos sobre a fração butanólica
das raízes de R. imperialis identificando um segundo derivado do ácido elágico
responsável em parte pela ação antimicrobiana encontrada inicialmente no extrato
MeOH.
- A substância isolada foi identificada com base de dados espectrais e denominada
de ácido 3-O-metil-4’-metilelágico pode ser o responsável pelo efeito das raízes.
6.2 Rubus rosaefolius
- Na análise fitoquímica das partes aéreas de R. rosaefolius, foram identificados
triterpenos pentacíclicos: o ácido tormêntico e o ácido 28 -O- metoxitormêntico e
três esteróides: stigmasterol, sitosterol e campesterol.
- Nessa espécie pode-se observar a presença de substâncias que também estão
presentes em R. imperialis, o ácido tormêntico e o stigmasterol.
- Os resultados obtidos dos testes de atividade antinociceptiva demonstraram que
os extratos hidroalcoólicos e frações diclorometano, acetato de etila e a
substância isolada apresentaram significante atividade antinociceptiva, sendo
efetivos na nocicepção de origem inflamatória.
- Quando comparado com medicamentos usados clinicamente, a substância foi
cerca de 6 vezes mais potente.
52
- Os resultados sugerem que a substância isolada é responsável em parte pela
ação isolada é responsável em parte pela ação encontrada e que outras
substâncias podem estar contribuindo.
- Sugerem-se modificações estruturais no intuito de melhorar o efeito
antimicrobiano e antinociceptivo.
53
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61
ANEXO I
62
Figura 17 – Espectro de IV de Ri-5 em KBr.
O
O O
O
H 3 C O
H
O H
H
R
H O
4 4'
3' 5'
7'
3 5
7
63
Figura 18 - Espectro RMN 1H (300MHz) de Ri-5 em piridina - d
5.
O
O O
O
H 3 C O
H
O H
H
R
H O
4 4'
3' 5'
7'
3 5
7
64
Figura 19 - Espectro de RMN 13 C (75MHz) de Ri-5 em piridina - d5.
O
O O
O
H 3 C O
H
O H
H
R
H O
4
4'
3' 5'
7'
3
5
7
ANEXO II
66
Figura 20 - Espectro de IV de Rr-1 em KBr.
2325
26
27
17
HO
12 34
5
1213
28
24
19
29
30
HO
HO
H
COOCH3
67
Figura 21 - Espectro de RMN 1H (300 MHz) de Rr-1 entre 1 e 5.6 ppm, em piridina - d5.
2325
26
27
17
HO
12 34
5
1213
28
24
19
29
30
HO
HO
H
COOCH3
68
Figura 22 - Espectro de RMN 13 C (75MHz) de Rr-1 entre 16 e 42 ppm, em piridina - d5.
2325
26
27
17
HO
12 34
5
1213
28
24
19
29
30
HO
HO
H
COOCH3
69
Figura 23 - Espectro de RMN 13 C (75MHz) de Rr 1 entre 47 e 180 ppm, em
piridina - d
5
2325
26
27
17
HO
12 34
5
1213
28
24
19
29
30
HO
HO
H
COOCH3
