UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE BIOATIVIDADE IN VITRO

E IN VIVO DE

Raulinoa echinata

ROSANGELA WESTERLON

Itajaí- 2006

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

CENTRO DE EDUAÇÃO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE

BIOATIVIDADE IN VITRO E IN VIVO DE

Raulinoa echinata

Dissertação submetida

à Universidade do Vale do Itajaí

como parte dos requisitos para a obtenção

do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas

ROSANGELA WESTERLON

Itajaí, junho de 2006

ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE BIOATIVIDADE

IN VITRO E IN VIVO DE

Raulinoa echinata

Rosangela Westerlon

“Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Farmacêuticas, e aprovada em forma final pelo programa de Pós-

Graduação em Ciências Farmacêuticas de Universidade do Vale do Itajai”

_________________________________

Maique Weber Biavatti, Profa. Dra em Química Orgânica- UFSCAR

Orientadora

___________________________________

Tânia Maria Bellé Bresolin, Profa. Dra. Em Bioquímica- UFPR

Coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas

Apresentando a Banca Examinadora composta pelos professores:

_____________________________________

Maique Weber Biavatti (UNIVALI)

Presidente

____________________________________

Ângela Malheiros (UNIVALI)

Membro

_____________________________________

Moacir Geraldo Pizzolatti (UFSC)

Membro

Itajaí (SC), junho de 2006.

DEDICATÓRIA

Aos meus pais Alzira e João (in memoriam) minha gratidão por todo o amor,

ensinamentos, esforços e compreensão incondicionais.

Mãe, obrigada por sempre acreditar em mim e por tanto ter me ajudado em

momentos tão difíceis de minha vida.

Pai, sinto muitas saudades, seu amor me faz falta. Sei que onde estiver

continuará torcendo por mim.

AGRADECIMENTOS

Meu especial agradecimento à minha orientadora e amiga Maique pela excelente

orientação, pela imensa paciência e constante incentivo durante tantos momentos

que pensei que não iria conseguir, por sua compreensão devido à minha limitação

de tempo disponível.

À Profª Márcia, que tanto contribuiu com a parte farmacológica. Seu conhecimento e

auxílio foram fundamentais.

Ao meu namorado José pelos momentos agradáveis e por sua companhia que

serviram como estímulo na fase de conclusão deste trabalho.

Às amigas Cristina Wöhlke e Sheila meu muito obrigada por tanto me ouvirem, me

incentivarem, me entenderem. Cada uma à sua maneira e ao seu tempo

contribuíram para o fim deste trabalho.

Às colegas Juliana Ardenghi, Juliana Pretto, Cristine Bordini por tantos momentos

legais compartilhados durante o curso. Juli, obrigada pelos experimentos

microbiológicos.

A todos os docentes do programa que contribuíram para meu aprendizado.

Ao Prof. Antônio G. Ferreira (UFSCar) responsável pelos equipamentos de RMN

utilizados neste trabalho, à Luciana Vizzoto pela obtenção dos espectros.

Ao professor Paulo Cezar Vieira (UFSCar) pelo valioso apoio e discussão

espectroscópica.

Ao professor Javier Ellena (IFSC-USP- São Carlos) pelos espectros de difração de

raios-X.

À Fernanda Penaflor (UNESP-Rio Claro) pelos testes com as formigas.

E a todos aqueles que contribuíram de forma direta ou indireta para conclusão deste

trabalho.

ANÁLISE FITOQUÍMICA, AVALIAÇÕES DE BIOATIVIDADE

IN VITRO E IN VIVO DE Raulinoa echinata

Rosangela Westerlon

Junho/2006.

Orientadora: Maique Weber Biavatti, Drª em Química Orgânica Área de concentração: Fitoquímica Número de Páginas: 87

No presente trabalho investigou-se fitoquimicamente a fração metanólica dos galhos e os extratos, hexano e metanol, das raízes de R. echinata. No processo fitoquímico, tanto para separação e purificação, quanto para identificação e elucidação de compostos isolados recorreu-se a técnicas fitoquímicas tradicionais de isolamento e caracterização espectroscópica (CCD, CCD comparativa, CC, RMN1 H, RMN 13C e espectometria de massas). Dos galhos isolou-se os triterpenos em mistura isomultiflorenol/isobaurenol, os alcalóides furoquinolínicos maculina e flindersiamina e o alcalóide alquil-quinolínico, 2-n-nonil- 4 quinolona e o ácido limonéxico, um limonóide. Das raízes três limonóides degradados foram isolados, fraxinelona, fraxinelonona e epóxifraxinelona. Os dois primeiros são inéditos nesta espécie. Já o último, epóxifraxinelona, não estava definida sua conformação absoluta, mas desta vez, por se obter um monocristal, foi possível definir por difração de raios-X. Durante todo o experimento fitoquímico houve biomonitoramento com Artemia salina, porém todas as frações, sub-frações e compostos isolados testados apresentaram-se inativos, o que também pode ser interessante sob o aspecto de citoxicidade. No screening antimicrobiano as frações e subfrações testadas contra bactérias gram-positivas e gram-negativas e contra o fungo Cândida albicans, não inibiram os microorganismos nas concentrações testadas. A Concentração Inibitória Mínima foi >1000 µg/mL. No ensaio para avaliação de atividade inseticida sobre formigas cortadeiras Atta sexdens rubropilosa, o limonóide ácido limonéxico inibiu significativamente a longevidade da formigas (11 dias), quando comparado com o controle (22 dias). A propriedade antinociceptiva do ácido limonéxico (10, 30 e 60 mg/Kg i.p.) também foi testada. Em modelos de dor induzida quimicamente com: ácido acético (0,6 %), formalina (2,5 %), capsaicina (1,6 µg/pata) e glutamato (30 mmol/pata) obsevou-se inibição no processo doloroso de forma significativa, com DI50s (dose que inibe 50 % do efeito nociceptivo) calculadas em mg/Kg respectivamente de 21,74 (11,91- 39,69), 13,66 ( 9,35- 19, 61) (segunda fase), 11,67 (8,51- 16,0) e (36,51- 60,95). Conclui-se portanto que as substâncias inéditas isoladas foram fraxinelona e fraxinelonona e que a conformação absoluta do epóxifraxinelona foi definida .e ainda que ácido limonéxico mostrou resultado promissor Palavras Chave: Raulinoa echinata, bioatividade, limonóides, limonóides degradados

PHYTOCHEMICAL ANALYSIS, EVALUATIONS OF IN VITRO

AND IN VIVO BIOACTIVITY OF Raulinoa echinata

Rosangela Westerlon

June/2006.

Supervisor: Maique Weber Biavatti, PhD in Organic Chemistry Area of Activity : Phytochemistry Number of Pages: 87

In this work, methanol extract of stems, and hexane and methanol extracts of roots of R. echinata, were investigated using traditional phytochemical techniques. In the phytochemical process, both for isolation and purification, traditional techniques of phytochemical isolation and spectroscopic characterization were used (TLC, comparative TLC, CC, 1H and 13C NMR, MS). From the stems, the triterpenes isomultiflorenol/isobaurenol, the furoquinoline alkaloids maculine and flindersiamine, the alkylquinoline 2-n-nonil- 4 quinolone, and the limonoid limonexic acid were isolated. From the roots, three degraded limonoids were isolated: fraxinellone, fraxinellonone and epoxyfraxinellone. The former two are isolated here for the first time in this species. The latter was monocristalysed and the absolute configuration was established by X-ray diffraction. Biomonitoring with Artemia salina was carried out throughout the experiment, however all its isolated fractions, sub-fractions and test compounds were inactive, which could be relevant in relation to cytotoxicity. The antimicrobian screening, fraction and subfractions tested against gram-positive and gram-negative bacteria and the fungus Cândida albicans were inactive. The MIC was >1000 µg/mL. In the study carried out to evaluate the insecticide activity against the leaf-cutter ants Atta sexdens rubropilosa, the limonoid limonexic acid significantly inhibited the longevity of the ants (11 days), compared with the control group (22 days). The antinociceptive activity of limonexic acid (10, 30 and 60 mg/Kg i.p.) was also tested. In models of chemically induced pain: in the acetic acid model (0.6 %), formalin (2.5 %), capsaicin (1.6 µg/pata) and glutamate (30 mmol/paw), significant inhibition of pain was observed, with DI50S values of 21.74 (11.91- 39.69), 13.66 (9.35- 19, 61) (second phase), 11.67 (8.51- 16.0) and (36.51- 60.95), respectively. It is therefore concluded that the new substances isolated were fraxinellone and fraxinellonone, that the absolute configuration of epoxyfraxinellone was established, and that limonexic acid showed a promising result. Key Words: Raulinoa echinata, bioactivity, limonoids, degraded limonoids

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS……………………………………………………………………….10

LISTA DE TABELAS .................................................................................................12

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS……………………………………………..13

1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................15

2 OBJETIVOS............................................................................................................17

2.1 OBJETIVO GERAL..............................................................................................17

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................17

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................18

3.1 Aspectos Gerais sobre Plantas............................................................................18

3.2 Raulinoa echinata Cowan....................................................................................21

3.3 Limonóides...........................................................................................................28

3.4 Alcalóides.............................................................................................................30

4. MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................32

4.1 Material botânico..................................................................................................32

4.2 Fracionamento fitoquímico...................................................................................32

4.3 Obtenção das frações .........................................................................................34

4.3.1 Sub-fração metanol dos galhos (RGM) ............................................................34

4.3.2 Extrato das raízes .............................................................................................36

4.4 Ensaios de Toxicidade.........................................................................................38

4.4.1 Ensaio com Artemia salina ...............................................................................38

4.4.2 Bioensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens............................................39

4.5 Avaliação Microbiológico.....................................................................................40

4.5.1 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para bactérias.....................40

4.5.2 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para fungos........................41

4.6 Avaliação da atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico.....................41

4.6.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético......................................................42

4.6.2 Modelo de dor induzida pela formalina.............................................................42

4.6.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina...........................................................42

4.6.4 Modelo de dor induzida pelo glutamato............................................................43

4.7 Análise estatística dos testes in vivo....................................................................43

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES..........................................................................45

5.1 Triterpenos em mistura.........................................................................................45

5.2 Alcalóides.............................................................................................................46

5.3 Limonóides...........................................................................................................49

5.3.1 Limonóides Degradados ..................................................................................52

5.4 Ensaio de citoxicidade com Artemia salina .........................................................61

5.5 Ensaio com formigas Atta sexdens......................................................................62

5.6 Ensaio microbiológico..........................................................................................65

5.7 Atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico..........................................67

5.7.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético.......................................................68

5.7.2 Modelo de dor induzida pela formalina.............................................................69

5.7.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina...........................................................71

5.7.4 Modelo de dor induzido pelo glutamato.............................................................73

6 CONCLUSÕES.......................................................................................................77

7REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................78

LISTA DE FIGURAS

Figura. 1: Foto da planta em estudo Raulinoa echinata (BIAVATTI, 2001)...............23

Figura 2: Esquema ilustrativo do fracionamento da fração metanol dos galhos de R.

echinata. ...................................................................................................................34

Figura 3. Esquema ilustrativo do preparo extrato das Raízes de R. echinata e

posterior obtenção das frações..................................................................................36

Figura 4: Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) da mistura de triterpenos

isomultiflorenol/isobaurenol (7 e 8)............................................................................46

Figura 5 . Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3) do alcalóide 2n- Nonil-4-quinolona

(25).............................................................................................................................49

Figura 6: Espectro de RMN 1H (400 MHz) do ácido limonéxico (13) (CDCl3 + DMSO-

d6) ..............................................................................................................................50

Figura 7: Espectro de RMN 13C BBD para o ácido limonéxico (100 MHz, CDCl3 +

DMSO-d6)...................................................................................................................51

Figura 8: Espectro RMN 1H (400 MHz, CDCl3) do limonóide degradado fraxinelona

(28).........................................................................................................53

Figura 9: Espectro de massas da fraxinelona (28) obtido por impacto eletrônico...54

Figura 10: Espectro RMN 1H (200 MHz, CDCl3) do limonóide degradado

fraxinelonona (29) ....................................................................................................55

Figura 11:Espectro de massas da fraxinelonona (29) obtido por impacto eletrônico.56

Figura 12: Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3) do limonóide degradado

epóxifraxinelona (15).................................................................................................57

Figura 13: Projeção ORTEP 3 da epóxifraxinelona com numeração cristalográfica

Elipsóides dos átomos não hidrogenados com 50% de probabilidade......................56

Figura 14: Formação dos limonóides degradados.....................................................60

Figura 15: Espectro de massas da epóxifraxinelona (15) obtido por impacto

eletrônico....................................................................................................................60

Figura 16: Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, Atta sexdens

rubropilosa frente aos compostos epóxifraxinelona (painel A) e ácido limonéxico

(painel B)....................................................................................................................63

Figura 17: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente

sobre a nocicepção induzida pelo ácido acético (0,6%) em camundongos..............68.

Figura 18: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrada sistemicamente

sobre nocicepção induzida pela formalina em camundongos...................................70

Figura 19:Efeito do ácido limonéxico (10-60mg/Kg) administrado sistemicamente

sobre nocicepção induzida pela injeção intraplantar da capsaicina em

camundongos ............................................................................................................72

Figura 20: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente

sobre a nocicepção induzida pelo glutamato em camundongos................................73

LISTA DE TABELAS Tabela 1: Ranking dos 35 produtos éticos derivados de produtos naturais mais

comercializadas no período de 2000 – 2002............................................................19.

Tabela 2: Dados de RMN 1H (400 MHz, CDCl3 + DMSO-d6) do ácido limonéxico (13)

isolado em comparação com a literatura...........................................................51

Tabela 3: Dados de RMN 1H (200 MHz, CDCl3) da fraxinelonona isolada em

comparação com a literatura......................................................................................56

Tabela 4: Interações geométricas intramolecular e intermolecular (Ǻ) do

epóxifraxinelona.........................................................................................................59

Tabela 5: Efeitos de extratos, sub-frações e compostos isolados de Raulinoa

echinata no screening de citotoxidade de Artemia salina.........................................61

Tabela 6: Resultados de Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) de frações e sub-

frações de Raulinoa echinata através da diluição em agar........................................65

Tabela 7: Comparação dos valores das DI50s para atividade do ácido limonéxico, do

paracetamol e da aspirina no modelo do ácido acético........................................69

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

BBD- Broad Band Declouping

CCD- Cromatografia em Camada Delgada

CC- Cromatografia em Coluna

CIM- Concentração Inibitória Mínima

CGRP- Peptídeo Relacionado ao gene-calcitonina

δ- Deslocamento químico (ppm)

DL50- Dose Letal 50%

DI50- Dose Inibitória 50%

DMSO- Dimetilsulfóxido

IM- Inibição Máxima

IV- Infra-vermelho

J- Constante de acoplamento

m/z- Relação massa carga

m – Multipleto

[M+]- Íon molecular

NMDA- n-Metil-D-aspartato

NKA- Neurocinina-A

NKB- Neurocinina B

RMN1H- Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN13C- Ressonância Magnética Nuclear de Carbono

RGM- Fração Metanol dos Galhos

RGM-H- Sub-fração hexano da fração metanol dos galhos

RGM-D- Sub-fração diclorometano da fração metanol dos galhos

RGM-A- Sub-fração acetato de etila da fração metanol dos galhos

RRH- Extrato hexano das raízes

RRM- Extrato metanol das raízes

RRH-H- Fração hexano do extrato hexano das raízes

RRH-A- Fração acetato de etila do extrato hexano das raízes

RRM-H- Fração hexano do extrato metanol das raízes

RRM-D- Fração diclorometano do extrato metanol das raízes

RRM-A- Fração acetato de etila do extrato metanol das raízes

SNC- Sistema Nervoso Central

SP- Substância P

s- Singleto

sl- Singleto largo

UV- Ultra Violeta

15

1. INTRODUÇÃO

O conhecimento sobre as plantas medicinais sempre tem acompanhado o

homem através dos tempos. As primitivas civilizações cedo se aperceberam da

existência, ao lado das plantas comestíveis, de outras dotadas de maior ou menor

toxicidade que, ao serem experimentadas no combate às doenças, revelaram,

embora empiricamente, o seu potencial curativo.

Há séculos, substâncias químicas derivadas de fontes naturais (plantas,

animais, organismos marinhos e microorganismos) têm sido utilizadas pela

humanidade no tratamento de enfermidades (KOEHN E CARTER, 2005). Apesar da

descoberta de novos fármacos por diversos outros métodos, a pesquisa com

produtos naturais ainda apresenta-se como meio importante para o surgimento de

novas substâncias utilizadas na clínica médica. Tal feito foi recentemente

demonstrado por Cragg, Newmam e Snader que analizaram em 1996, do total de

drogas lançadas entre 1981 a 2002, as que são derivadas de produtos naturais. Os

autores concluíram que as substâncias analizadas representaram uma significante

fonte de novas drogas, especialmente na terapia anticâncer e antihipertensiva.

Dos 250 medicamentos considerados como básicos e essenciais pela

Organização Mundial de Saúde (OMS), 11% são exclusivamente obtidos de plantas

medicinais e um número significativo são de fármacos sintéticos obtidos a partir de

fonte natural. O potencial das plantas como fonte de pesquisa na busca de novos

medicamentos, com novos modos de ação, alta seletividade e atividade é ainda

muito pouco explorado, uma vez que, entre as cerca de 250.000 espécies de plantas

existentes no mundo, somente uma pequena porcentagem tem sido investigada

fitoquímica e biologicamente, e menos de 2500 tem sido caracterizadas com relação

aos metabólitos secundários (CECHINEL E BRESOLIN, 2003).

O Brasil é o país com uma das maiores diversidades genética vegetal do

mundo, contando com mais de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado

entre 350.000 e 550.000 (SIMÕES et al., 2003), há portanto, um riquíssimo arsenal

botâncio a ser investigado sob o ponto de vista fitoquímico, biológico e

farmacológico. São as plantas uma fonte importante de produtos naturais

biologicamente ativos, muitos dos quais se constituem em modelos para síntese de

um grande número de fármacos. Pesquisadores da área de produtos naturais

16

mostram-se impressionados pelo fato desses produtos encontrados na natureza

revelarem uma gama quase que inacreditável de diversidade em termos de estrutura

e de propriedades físico-químicas e biológicas. Apesar do aumento de estudos

nessa área, os dados disponíveis revelam que apenas 15 a 17% das plantas foram

estudadas quanto ao seu potencial medicinal (SIMÕES et al., 2003) e isto demonstra

o grande potencial para descoberta de novas substâncias a partir de plantas.

Vários métodos têm sido descritos e empregados para seleção de plantas a

serem estudadas sob o ponto de vista químico e biológico, objetivando o

desenvolvimento de novos fármacos. Papel importante nisto desempenha a

etnofarmacologia, ou seja, o conhecimento popular do uso terapêutico de plantas,

que oferece valiosas informações que constituem um importante critério para o

estudo fitoquímico de plantas as quais poderiam se transformar em novos

medicamentos

(CECHINEL E BRESOLIN, 2003).

Raulinoa echinata não apresenta nenhum uso na medicina popular, porém a

investigação fitoquímica e biológica de seus galhos e raízes, proposta deste

trabalho, é pertinente tendo em vista a raridade da planta e os promissores

resultados fitoquímicos e de bioatividade obtidos em pesquisa anterior das folhas e

caules. Além disso, os ensaios farmacológicos se mostraram promissores

evidenciando também um possível potencial terapêutico da planta.

17

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

� O presente trabalho teve como objetivo analisar fitoquimicamente a fração

metanólica dos galhos e as raízes de Raulinoa echinata, bem como avaliar

sob o ponto de vista biológico frações e compostos isolados da planta.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Preparar e fracionar extratos das raízes e sub fracionar a fração metanólica

dos galhos

� Testar extratos, frações, sub-frações e compostos isolados no screening com

o micro-crustáceo Artemia salina e quanto à atividade antimicrobiana.

� Identificar compostos isolados

� Testar extratos e frações quanto à atividade microbiana

� Analisar efeito antinociceptivo in vivo do ácido limonéxico, utilizando ensaios

com ácido acético, formalina, glutamato e capsaicina

� Avaliar atividade inseticida sobre formigas cortadeiras Atta sexdens

rubropilosa dos compostos isolados ácido limonéxico e epóxifraxinelona.

18

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Aspectos Gerais sobre Plantas

As plantas, desde o início dos tempos, são importantes tanto na alimentação

quanto na cura de doenças. A utilização delas na cura de doenças é prática

difundida por diversas populações e portanto, cada vez mais estudos quanto ao seu

perfil químico e quanto ao seu potencial biológico são necessários, comprovando

assim sua segurança e eficácia terapêutica. As plantas medicinais continuam a ser

utilizadas pela população e jamais foram completamente substituídas pelos

fármacos sintéticos (COSTA, 1994; SIMÕES et al, 2003).

Ao se estudar uma planta com relação às suas características fitoquímicas,

considera-se a existência de dois grupos de metabólitos, os primários e os

secundários. Os metabólitos primários são essenciais ao crescimento e à vida do

vegetal, como por exemplo os aminoácidos, monossacarídeos, lipídeos etc. Já os

metabólitos secundários são produtos de metabolismo específico, relacionados aos

processos adaptativos e muitas vezes característicos de um dado gênero ou

espécie. Os metabólitos secundários apresentam uma grande diversidade química,

como por exemplo os alcalóides, esteróides, terpenóides, flavonóides, etc

(CECHINEL E BRESOLIN 2003). Os metabólitos secundários são constituídos por

uma variedade de substâncias bioativas, e nos dias atuais o interesse científico por

esses constituintes tem aumentado, devido a busca por novos medicamentos

(BASILE et al., 1999 e 2000; SATO et al., 2002; PAIVA et al., 2003). Medicamentos

derivados de produtos naturais foram bem representados entre as drogas mais

vendidas em 2000, 2001 e 2003, em percentagem 40%, 24% e 26%

respectivamente (tabela 1) (BUTLER, 2004).

Segundo Magistretti (1980), a pesquisa sistemática para obtenção de novos

compostos com finalidade terapêutica pode ser executada por meio de vários

processos. Alguns princípios podem ser utilizados para planejar a seleção das

plantas que serão objeto de estudo, como por exemplo, a seleção aleatória ou

randômica seguida de bioensaios. Para Maciel et al (2002), a pesquisa conduzida

por meio de abordagem randômica aumenta a probabilidade de “novas descobertas”

19

de substâncias inéditas, pois a cada 10.000 diferentes tipos de plantas existe a

possibilidade de obtenção entre 50.000- 100.000 estruturas.

Tabela 01: Ranking dos 35 produtos éticos derivados de produtos naturais mais comercializadas no período de 2000 – 2002.

2000/ Ranking 2001/ Ranking 2002/ Ranking

Atorvastatina/ 2º Atorvastatina/ 1º Atorvastatina/ 1º

Sinvastatina/ 3º Sinvastatina/ 3º Sinvastatina/ 2º

Estrogênio/ 16º Estrogênio/ 16º Estrogênio/ 25º

Amoxicilina+ ácido

clavulânico/ 17º

Amoxicilina+ ácido

clavulânico/ 17º

Amoxicilina+ ácido

clavulânico/ 27º

Enalapril/ 18º ______ ______

Pravastatina/ 19º Pravastatina/ 15º Pravastatina/ 15º

Placlitaxel/ 25º ______ ______

Azitromicina/ 27º Azitromicina/ 29º Azitromicina/ 33º

Gabapentina/ 30º Gabapentina/ 23ª Gabapentina/ 14º

Propionato de fluticasona/

31º

Propionato de fluticasona/

33º

______

Claritromicina/ 32º ______ ______

Cicllosporina/ 34º ______ ______

Lisinopril/ 35º ______ ______

______ ______ Propionato de fluticasona/ +

salmoterol 13º

Fonte: Adaptado de BUTLER 2004

O grande crescimento da pesquisa de produtos naturais nos últimos anos

deve-se principalmente ao rápido avanço de técnicas de isolamento e análise dos

compostos bioativos em plantas, e pela facilidade da busca de informações em

vários sistemas de bases de dados (WRIGLEY et al. ,1997).

Na fitoquímica, a extração dos constituintes da planta é realizado com o uso

de diferentes solventes sob as mais variadas condições como tempo e temperatura

de extração. Após a extração bruta procede ao isolamento dos diferentes

constituintes do extrato bruto obtido. O procedimento de isolamento pode envolver

desde uma simples cristalização, até separações sucessivas com partições em

solventes de polaridades diferentes e extensivas técnicas cromatográficas. Assim

20

sendo, técnicas cromatográficas têm destaque no que concerne à separação,

identificação e quantificação de compostos. A cromatografia é um método físico de

separação, na qual os compostos a serem separados são distribuídos entre duas

fases (HOUGHTON E RAMAN, 1998).

Após a extração e isolamento, procede-se à determinação estrutural que

envolve o acúmulo de dados de numerosas fontes, cada qual fornece alguma

informação estrutural e a assimilação destes dados leva à determinação da

estrutura química.

Existe uma variedade de técnicas espectroscópicas disponíveis tais como

Ultra-violeta (UV), Infravermelho (IV), RMN de hidrogênio ( RMN 1H) e de carbono 13

(RMN 13C) e Espectroscopia de massas. O processo espectroscópico para

determinação estrutural deve estar muito bem aliado com a literatura científica. Caso

o composto encontrado ainda não tiver sido descrito, o mesmo pode ser similar a

outros já descritos, o que ajudará na interpretação dos dados (BUCKINGHAM E

THOMPSON, 1997).

Quando a análise dos dados do composto desconhecido não é conclusiva e

este possuir uma estrutura cristalina, pode-se fazer o estudo de difração de raios X.

Isto é possível quando um simples cristal é irradiado com raios X. A correta

interpretação dos dados resultará numa figura tri-dimensional da molécula, incluindo

a estereoquímica relativa se a molécula for opticamente ativa e em alguns casos a

estereoquímica absoluta também pode ser determinada (HAMBURGER E

HOSTETTMANN, 1991)

Dando continuidade a pesquisa por compostos ativos, parte-se a seguir para

análise biológica que pode ser tanto in vitro quanto in vivo. Dependendo do que se

deseja investigar faz-se a escolha do modelo mais apropriado levando em conta

custos, disponibilidade de material, características e quantidade da amostra,

reprodutibilidade e rapidez. Mas principalmente, deve-se levar em consideração o

uso popular da planta (para que serve na medicina popular) ou na falta deste, para a

espécie em estudo, o uso popular de espécies do mesmo gênero e/ou família.

Geralmente, as triagens iniciais são realizadas com modelos experimentais menos

complexos e, após a seleção das substâncias puras ativas, estas são avaliadas em

ensaios mais específicos, para posteriormente serem submetidos à análise do

mecanismo de ação biológica (YUNES E CALIXTO, 2001)

21

3.2 Raulinoa echinata Cowan

A família Rutaceae constitui o maior grupo de Rutales (ENGLER, 1931) e

caracteriza-se por uma grande diversidade de metabólitos secundários não comuns

nas demais famílias da ordem (SILVA et al., 1988; WATERMAN, 1983). Os

metabólitos mais representativos são os alcalóides derivados do ácido antranílico,

cumarinas (GRAY, 1983) e limonóides (DREYER, 1983). A diversificação dos

alcalóides e cumarinas é maior nas subfamílias Rutoideae e Toddalioideae. A

similaridade química entre estas duas subfamílias é muito pronunciada (SILVA et al.,

1987).

Raulinoa é gênero monoespecífico da espécie Raulinoa echinata Cowan

(Rutaceae). Trata-se de uma espécie endêmica no vale do Itajaí. Raulinoa inclui-se

na subtribo Pilocarpinae, pertencente a Cuspariae (Gallideae), que é uma das cinco

tribos da subfamília Rutoideae. Pilocarpus, Esenbeckia, Metrodorea e Raulinoa são

os quatro gêneros inseridos em Pilocarpinae, e estão dispersas pelo Neotrópico (sul

dos USA até norte da Argentina). Os gêneros Pilocarpus e Esenbeckia possuem

espécies com atribuídas propriedades medicinais. O primeiro era originalmente

usado como sudorífero, sialogogo devido a presença de pilocarpina (alcalóide

imidazólico), que atualmente é utilizado para tratamento do glaucoma. O segundo

tinha indicações como estomáquico e febrífugo (BIAVATTI, 2001).

Considera-se morfologicamente o gênero Esenbeckia o mais primitivo da

subtribo, o qual é bastante semelhante a Metrodorea, seguido de Raulinoa. Ao

contrário, Pilocarpus é considerado altamente especializado devido à presença de

alcalóides imidazólicos (KAASTRA,1982).

Raulinoa echinata (figura1), denominada “Cutia-de-espinho” ou “sarandi”, é

um arbusto de tronco fino e flexuoso caracterizado pela presença de espinhos,

pertencente ao grupo dos sarandis, (vegetação arbustiva característica e exclusiva

das margens rochosas dos rios que são freqüentemente inundadas durante as

cheias). Quando indentificada pela primeira vez, Raulinoa echinata foi apenas

encontrada como parte integrante da vegetação que se desenvolve ao longo das

margens do rio Itajaí-açu, apenas em um pequeno trecho (1000 m) no município

de Apiúna, em Santa Catarina (KAASTRA, 1982).

22

Recentemente, em estudos sobre os possíveis impactos ambientais que a

obra de construção da Usina de Salto Pilão traria aos 15 quilômetros de construção

entre os municípios de Apiúna, Lontras e Ibirama, se descobriu a presença da

espécie R. echinata em uma região bastante extensa às margens do rio Itajaí-açu,

chegando próxima a Blumenau, o que segundo os defensores da construção da

usina não prejudicaria a perpetuação da espécie (FERRI, 2006). Apesar disso, a

Associação de Preservação do Meio Ambiente do Alto Vale do Itajaí e o Grupo Pau

Campeche, recorreram ao Tribunal Regional Federal, em Porto Alegre, com pedido,

anteriormente negado pela Justiça Federal de Rio do Sul, para suspender as obras

de construção da usina, com alegação entre outras de que,quando da elaboração do

estudo de impacto ambiental, não se teria observado corretamente a principal obra

de referência no que diz respeito à flora da região, onde consta que o citado

espécime é exclusivo das margens dos rios e das ilhas atingidas. Tal pedido foi

negado pelo juiz relator que alegou que pelo exame dos documentos acostados

houve, anteriormente ao licenciamento da obra, um alentado estudo do impacto

ambiental, e mesmo das condições ambientais da região, dedicando-se um capítulo

inteiro destes estudos à populações naturais de Raulinoa echinata, que culminariam

com recomendações relativas à conservação da espécie, aduzindo, o grupo de

estudiosos, que a amostragem e as avaliações realizadas foram superiores as

previstas, tanto em número de plantas como em número de populações,

identificando a presença da planta fora da área que será impactada pelo

empreendimento, afastando, assim, o risco de extinção da espécie, até porque,

conforme consta nos autos, é possível seu replantio em outras áreas bem como qa

reprodução em cativeiro (LIMA, 2006).

Raulinoa diferencia-se dos outros membros de Pilocarpinae devido a

presença de espinhos, veias intramarginais nas folhas e pelas flores levemente

zigomorfas. Arbusto com 2-3 m de altura, glabro, exceto para os pecíolos jovens,

ramos com 2-5 mm de diâmetro, freqüente presença de espinhos com 8-21 mm de

comprimento, delgados, que sustentam flores e folhas perto da base. Folhas firme-

cartáceas, opostas, simples, ápice arredondado, às vezes levemente retuso, lâminas

com 23-60 mm de comprimento e 6-15 mm de largura; pecíolos 3-5 mm de

comprimento, sésseis, flores tetrâmeras, pétalas escuro-vermelhas, largamente

ovais. Frutos 10 mm de comprimento se 7 mm de largura, oblongo-obovados, 1 por

infrutescência, 3-4 cápsulas loculares (COWAN e SMITH, 1973; KAASTRA, 1982).

23

Figura. 1 Foto da planta em estudo Raulinoa echinata (BIAVATTI, 2001)

Anatomicamente, a lâmina foliar apresenta-se dorsiventral, hipoestomática,

com feixes vasculares colaterais e mesofilo constituído por parênquimas, paliçádico

e esponjoso, e cavidades secretoras contendo óleos. Análises estruturais e ultra-

estruturais revelaram características dos estômatos, da cutícula e do mesofilo que

devem ter relevante importância na adaptação da planta às peculiaridades

ambientais. Tais características, ora mostram-se xeromorfas (átrio entre poro e

ostíolo, cutícula espessa), ora hidromorfas (células-guarda acima das demais células

epidérmicas, parênquima esponjoso com amplos espaços intercelulares). As

paredes periclinais espessas das células-guarda podem estar associadas com a

manutenção do fechamento estomático durante as cheias do rio, quando as folhas

permanecem submersas. A cutícula espessa, em ambas as faces, é fator que pode

evitar a desidratação interna durante a vazante (quando as folhas estão expostas à

intensa irradiação solar) e o encharcamento interno durante as cheias do rio (quando

as folhas estão submersas) (TAGIANE E VOLTOLINI, 2005)

Raulinoa echinata já teve seus caules e folhas analisados fitoquimicamente

em pesquisa de doutorado (BIAVATTI, 2001). Na pesquisa realizada, isolou-se

vários compostos típicos de Rutaceae e alguns inéditos nesta família. Verificou-se

24

também com este estudo características químicas de metabolismo secundário

bastante próximas daquelas apresentadas pelos gêneros Metrodorea e Esenbeckia,

os quais estão morfologicamente posicionados na mesma subtribo (Pilocarpinae) da

subfamília Rutoideae.

Foram isolados por Biavatti (2001) 44 substâncias pertencentes a diversas

classes de metabólitos secundários, das quais, cita-se as isoladas dos caules e

folhas de Raulinoa echinata: a) sesquiterpenos: Germacreno (1), Eudesmendiol (2),

Oplopanona (3), b) triterpenos: Esqualeno (4), Friedelina (5), β-sitosterol (6),

Isomultiflorenol (7), Isobaurenol (8), c) protolimonóides: Melianona (9), Melianodiol

(10), 21α, 25- Dimetilmelianodiol (11), triterpenos esterificados, d) limonóides:

Limonina (12), Ácido limonéxico (13), Kiadalactona (14), 8,14 Epóxifraxinelona (15),

e) cumarinas: Escopoletina (16), Aiapina (17) e Lomatina (18), f) alcalóides:

Esquimianina (19), Kokusaginina (20), Maculina (21) Flindersiamina (22), 4,8-

Dimetoxi-furol [2,3-b] quinolina-5,7 diol (23), 2-Fenil-1-metil-4-quinolona (24), 2-n-

Nonil-4-quinolona (25), 1-Metil-2-n-nonil-4quinolona (26), 1-Metil-2-[Tridecenil]-4-

quinolona (27).

São exemplos de compostos inéditos e bioativos isolados de R. echinata os

alcalóides furoquinolínicos e os alcalóides alquil-quinolínicos, os quais revelaram boa

atividade antifúngica sobre Leucoagaricus gongylophorus. No biomonitoramento

com micro-crustáceo Artemia salina, foi confirmada a atividade citotóxica do

protolimonóide (melianona) (BIAVATTI, 2001).

OH

HOH

O

HOH

H

1 2

3

25

H H

O

4 5

H

HO

HH

6

7 8

HO

HO

26

O

O

OHOH

H

O

O OH

HO

HO

H

H

9 10

11

12 13

O

O OMe

HO

MeO

H

H

O

O

O

H

O

O

O

O

O

O

O

HO

O

O

H

O

O

O

O

O

27

14 15

O O

MeO

HO

16 17

O OO

OH

N O

OMe

OMe

MeO

18 19

N O

OMe

MeO

MeO

N O

OMe

O

O

20 21

O

O

OAc

OAc

O

O

O

O

O

O

O O

O

O

28

N O

OMe

O

O

OMe

N O

OMe

OMe

OH

HO

22 23

H

N

O

24 25

N

O

N

O

26 27

3.3 Limonóides

Os limonóides são triterpenos modificados com 26 átomos de carbono

(tetranortriterpenóides), produzidos em plantas pertencentes à ordem Rutales, mais

freqüentemente encontrados em Meliaceae e em Rutaceae e com menos freqüência

em Cneoraceae. O termo limonóide foi derivado de limonina (12), o primeiro

tetranortriterpenóide isolado (ROY E SARAF, 2006)

A produção desta classe de metabólitos secundários é considerada uma

resposta da planta à herbivoria, tendo sido revelados diversos efeitos inseticidas,

N

O

29

seja interferindo no crescimento, seja através da inibição da alimentação

(JAYAPRAKASHA et al., 1997; VIEIRA et al., 2001).

Mais recentemente, têm sido estudadas as atividades antitumorogênica,

anticarcinogênica, antimicrobiana, antiviral e ainda outras atividades farmacológicas

para os limonóides (CHAMPAGNE et al., 1992; JUNG et al., 2000, ROY E SARAF,

2006).

O estudo fitoquímico dos caules e folhas de R. echinata já levou ao

isolamento de quatro limonóides e um limonóide degradado, sendo a limonina (12)

o mais abundante em ambas as partes da planta. A literatura relata que plantas

produtoras de limonóides em Rutaceae não são capazes de acumular intermediários

biossintéticos, tendendo a serem dominadas pela presença de limonina (12)

(DREYER et al., 1972). Os outros limonóides encontrados em R. echinata

apresentaram poucas modificações estruturais no anel A conforme o esperado para

Rutaceae, porém o anel furânico apresenta-se oxidado. Da degradação biológica

derivam os limonóides degradados em que os anéis C-D e também o anel furano

são mantidos intactos, o que provavelmente preserva grande parte de sua atividade

intacta.Os limonóides degradados são encontrados principalmente em Rutaceae e

raramente em Meliaceae (NAKATANI et al. ,1998).

A limonina causou uma pronunciada diminuição na atividade do citocromo

P450, o que foi verificado em um estudo in vitro conduzido com substâncias isoladas

dos frutos de Evodia rutaecarpa e Evodia officinalis, pertencentes à família

Rutaceae, sobre atividade do citocromo P450 do fígado de humanos (IWATA, et al.,

2004). Resultados de estudos sobre os efeitos da suplementação da dieta com os

limonóide limonina (12) e nomilina, sobre o metabolismo de enzimas do fígado e

intestino delgado de ratos levam à conclusão de que estes compostos induzem a

detoxificação da enzima Glutation Transferase S (KELLY, 2003).

Testou-se os limonóides, limonina (12), ácido limonéxico (13), Ac. 21-metil-

limonéxico, Kiadalactona (14), 8,14 Epóxifraxinelona (15), nos modelos biológicos de

citoxicidade sobre Artemia salina, inibição antiparasitária, forma tripomastigota de

Trypanossoma cruzi, inibição da atividade da enzima GAPDH- gliceraldeído-3-

fosfato-desidrogenase de Trypanossoma cruzi e atividade antifúngica sobre

Leucoagaricus gongylophorus, porém não apresentaram nenhuma atividade

potencial, apenas uma moderada inibição da forma tripomastigota de Trypanosoma

cruzi. Sabe-se que alguns limonóides de Meliaceae (derivados da gedunina)

30

apresentam boa atividade anti-malárica (MACKINNON et al., 1997; BICKII et al.,

2000).

3.4 Alcalóides

A família Rutaceae é considerada atípica na diversidade de produção de

alcalóides. Os alcalóides estão classificados em cinco tipos diferentes de acordo

com a sua origem biogenética, sendo que os alcalóides derivados do ácido

antranílico são tidos como eminentes marcadores quimiotaxonômicos. Mesmo

famílias próximas de Rutaceae (ordem Rutales) são praticamente incapazes de

produzir estes alcalóides (WATERMAN, 1999).

Dentre os derivados do ácido antranílico, os alcalóides furoquinolínicos são de

ocorrência ubíqua dentro da família, juntamente com alcalóides acridônicos e

piranoquinolínicos. Apesar de ocorrerem amplamente mas não universalmente,

ainda não foi encontrado um padrão quimiotaxonômico elusivo para estes alcalóides.

Os gêneros Esenbeckia e Metrodorea, filogeneticamente próximos de

Raulinoa, também apresentaram os mesmos tipos de alcalóides, em diversas

espécies estudadas: E. belizencis (RIOS e DELGADO, 1992), E. grandiflora

(OLIVEIRA et al., 1996), E. almawilla (GUILHON et al., 1994), E. leiocarpa

(NAKATSU et al.,1990), M. nigra (MÜLLER et al., 1995) e M. flavida (BAETAS et al.,

1999). Diferentemente, os alcalóides imidazólicos isolados do gênero Pilocarpus não

são derivados do ácido antranílico, mas possuem uma origem biogenética ainda

discutida.

O estudo dos extratos das folhas e caules de Raulinoa echinata levou ao

isolamento de alcalóides furoquinolínicos, bem conhecidos e característicos de

Rutaceae, em grandes quantidades: esquimianina (19), kokusaginina (20), maculina

(21) e flindersiamina (22) e também alguns quinolônicos: 2-fenil-1-metil-4-quinolona

(24), 2-n-nonil-4-quinolona (25), 1-metil-2-n-nonil-4-quinolona (26) Os alcalóides

isolados demonstraram atividade antifúngica contra o fungo simbionte de formigas

cortadeiras Leucoagaricus gongylophorus. Quando testados in vitro contra formas

tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, os alcalóides foram inativos ou parcialmente

ativos (BIAVATTI, 2001).

31

A literatura cita diversas atividades biológicas para estes alcalóides,

principalmente antimicrobiana contra os patógenos de plantas Cladosporium

cucumerinum (ZHAO et al., 1998) e Phytophthora spp (MOON et al., 1996).

Alcalóides furoquinolínicos foram ativos in vitro contra os parasitas Leishmania spp

(FOURNET el al., 1993) e Plasmodium falciparum (BASCO el tal., 1994).Um

alcalóide quinolônico (3-dimetilalil-4-metoxi-2-quinolona) demonstrou atividade

antihelmíntica (PERRET e WHITFILED, 1995), entre outras.

Os alcalóides flindersiamina, kokusoginina, maculina e esquimianina

apresentaram, quando testados sobre linhagens de células tumorais ovarianas, fraca

atividade citotóxica (PRAKASH et al., 2003)

32

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Material botânico

Os galhos (5,7 Kg) de Raulinoa echinata foram coletados no município de

Apiúna, Santa Catarina, à margem esquerda do rio Itajaí-açu, na localidade de

Subida, perto do porto de rafting, em julho de 1998. O material coletado foi

identificado pelos professores Ademir Reis (Universidade Federal de Santa Catarina)

e José R. Pirani (Universidade de São Paulo). Exsicatas do material coletado foram

depositadas no Herbário Barbosa Rodrigues (HBR) [A Reis & M. Biavatti 2.570

(26/07/98)], Itajaí, Santa Catarina.

As raízes de Raulinoa echinata foram coletadas em maio de 2001 em Apiúna

(SC), dos mesmos espécimes vegetais e na mesma localidade em que os galhos e

folhas coletados anteriormente.

4.2 Fracionamento fitoquímico

4.2.1 Suportes Cromatográficos

4.2.1.1 Cromatografia em Coluna - CC

Sílica gel Aldrich/Merck 70-230 mesh (sem pressão) e 230-400 mesh (com

pressão).

4.2.1.2 Cromatografia em Camada Delgada-CCD

Cromatoplacas Merck sílica gel GF 254 0,25 µm, como reveladores utilizou-se

anisaldeído sulfúrico, reagente Dragendorff, câmera de Iodo (I2) e luz UV em 365 e

254 nm (WAGNER E BLADT, 1996)

4.2.1.3 Cromatografia em Camada Delgada Preparativa

Cromatoplacas Merck sílica gel 60 F254 = 366 2mm

4.2.2 Solventes

33

Hexano, diclorometano, acetona, acetato de etila, metanol e benzeno

comercial (grau técnico).

Hexano, etanol, acetona, metanol, isopropranol grau HPLC.

4.2.3 Equipamentos

4.2.3.1 Ressonância Magnética Nuclear- RMN

Espectrômetros Bruker DRX-400, 400,13 MHz para 1H e 100,62 MHz para 13C

e ARX-200, 200,13 MHz para 1H e 50,32 MHz para 13C. Foram utilizados tempos de

relaxação de 1 s e 30 ms, sendo 32 o número de transientes em todos experimentos

(Universidade Federal de São Carlos).

4.2.3.2 Espectro de Massas de Impacto Eletrônico

Shimadzu GC-17 A acoplado com MSQP 5000 e equipado com coluna DB-1

(J& W Scientific, 30m x 0,25 mm i.d. x0,25 µm espessura), modo split, volume de

injeção de 1µL e programação de temperatura variada, com fluxo inicial de 2,6

mL/min e com temperaturas párea detector/injectopr de 300 °C/280 °C

respectivamente. A energia de colisão utilizada de 1,5 e V, modo impacto eletrônico,

e scan de 50 à 500 u. m. a . Gás de arraste Hélio.

4.2.3.6 Difração de RAIOS-X

Foram realizados no IFSC/USP pelo professor Dr. Javier Ellena, utilizando

baixa temperatura (120 K) em um difratômetro Enraf- Nonius Kappa-CCD. Os dados

foram coletados usando programa COLLECT e a estrutura resolvida com SHELXS-

97 (BIAVATTI et al., 2005). Dados cristalográficos adicionais estão depositados no

Cambridge Crystallographic Data Centre sob número: CCDC 265853. CCDC, 12

Union Roade, Cambrigde CH2 1EZ, UK (fax: +44-1223-336-033 ou e-mail:

deposit@ccdc.cam.ac.uk ou http://www.ccdc.cam.ac.uk).

4.3 Obtenção das frações

4.3.1 Sub-fração metanol dos galhos (RGM)

34

Em pesquisa anterior obteve-se a fração MeOH (RGM, 80 g) (BIAVATTI,

2001). Do fracionamento de RGM, (previamente diluído com metanol e água, por

partição líquido-líquido com solventes de polaridade crescente) obteve-se as sub-

frações: hexano (RGM-H, 6 g), CH2Cl2 (RGM-D, 9 g), AcOEt (RGM-A, 3 g) e

MeOH/ H2O (RGM-M), (Figura 2)

Partição líquido-líquido

Hexano CH2Cl2 AcOEt MeOH/

H2O

Figura 2 – Esquema ilustrativo do fracionamento da fração metanol dos galhos de R. echinata.

As sub-frações acima foram tratadas com diferentes técnicas cromatográficas.

Sendo que, a sub-fração hexano dos galhos, RGM-H (6 g) foi fracionada por CC em

sílica gel (70-230 mesh), utilizando como eluente inicial hexano-diclorometano na

proporção de 7:3 seguido de aumento gradativo da polaridade. Esta sub-fração

forneceu nove sub-frações (A-I 5,4 g). De acordo com o perfil observado por CCD as

amostras B (510 mg) e C (2,6 g) foram semi purificadas em separado por CC em

sílica gel, utilizando como fase móvel hexano-diclorometano. Da semi-purificação

da amostra B obteve-se oito sub-frações (A-H 325 mg ). A purificação da amostra H

(9 mg) por CC, fase móvel hexano-acetona resultou no isolamento dos triterpenos

em mistura isomultiflorenol/isobaurenol (6 mg), previamente identificado por CCD

com padrão conhecido e confirmado posteriormente com o espectro de RMN.

Com a semi- purificação da amostra C obteve-se oito sub-frações (A-H 2 g). A sub-

fração B foi purificada em sílica- gel (70-230 mesh) e fase móvel hexano- acetona,

resultando na identificação por CCD com padrão conhecido do esteróide β- sitosterol

RGM-H

(6 g)

RGM-D

(9 g)

RGM-A

(3 g)

RGM-M

Peso não

disponível

RGM(80 g)

35

(146 mg) e novamente dos triterpenos em mistura isomultiflorenol/isobaurenol (140

mg).

A sub-fração diclorometano dos galhos, RGM-D (9 g) foi fracionada por CC em

sílica gel (70-230 mesh), utilizando como eluente inicial hexano-acetona na

proporção de 95:5 com aumento gradativo da polaridade. Desta fração obteve-se

dezessete sub-frações (A-Q), dentre estas quatro apresentaram um perfil em CCD

interessante D, E, F, G (4,1 g). Estas quatro sub-frações foram agrupadas e semi-

purificadas por CC em sílica gel e como fase móvel o sistema hexano-acetona na

proporção inicial 95:5 com gradativo aumento de polaridade foi utilizado. Esta semi-

purificação resultou em vinte sub-frações (A-T 3,5 g), sendo que na sub-fração I

(167 mg) foi isolado e identificado o alcalóide flindersiamina, encontrado, em

pesquisa anterior, nos caules da planta R. echinata. Na sub-fração F (18 mg) foi

isolado e identificado por RMN1 H o alcalóide furoquinolínico maculina, também já

isolado dos caules e folhas. Na sub-fração M (53mg) encontrou-se o alcalóide

quinolínico 2-n-nonil-4 quinolona. A sub-fração T (1,2 g) obtida com um rendimento

de 34,28%, apresentou um perfil “confuso” em CCD. Recorreu-se, na tentativa de

purificação, à cromatografia em coluna aberta com e sem pressão, CLAE fase

normal e reversa, mas nenhuma dessas atendeu ao objetivo. Decidiu-se então

recorrer à CCD Preparativa, como eluente a mistura de hexano- benzeno 1:1 foi

utilizada, pois apenas neste sistema de eluição houve a separação efetiva dos

compostos da mistura. A substância isolada e identificada por RMN1H, RMN13C foi o

ácido limonéxico (650 mg).

A sub-fração acetato de etila, RGM-A (2,12 g) foi fracionada por CC em sílica

gel (70-230 mesh) usando como eluente clorofórmio em gradiente de polaridade

crescente com metanol obtendo-se treze sub-frações.

As sub-frações F, G, H (130 mg) foram reunidas e cromatografadas por CC em

sílica gel com o intuito de isolar o composto majoritário detectado por meio de CCD.

O sistema de eluente utilizado foi hexano-acetona na proporção inicial 9:1. O

resultado obtido foram seis sub-frações (A-F), sendo que a sub-fração C (47 mg)

As sub-frações K, L, M, N (1,3 g) foram agrupadas e cromatografada por CC,

como suporte foi utilizado celulose e como eluentes utizou-se hexano, clorofórmio,

clorofórmio-acetato de etila (1:1), acetato de etila, acetato de etila-metanol (1:1) e

metanol.

36

Na sub-fração RGM-A não foi isolada nenhuma substância provavelmente

devido a mistura de compostos muito polares, o que requer técnicas específicas.

4.3.2 Extrato das raízes

As raízes (397,21 g) secas e moídas foram maceradas, por um período de 3

a 5 dias, com hexano e após com metanol, o que resultou nos extratos: hexano

(RRH, 4 g) MeOH (RRM, 20 g) respectivamente (Figura 3).

Maceração exaustiva a frio

Hexano Metanol

Partição líquido-líquido

Hexano CH2Cl2 ACOEt

CH2Cl2

Figura 3. Esquema ilustrativo do preparo extrato das Raízes de R. echinata e posterior obtenção das

frações.

4.3.2.1 Extrato hexano (RRH)

Raízes de R.

echinata

(397,21 g)

RRH

(4 g)

RRM

(20 g)

RRH- H (576 mg) RRM-H (6,3 g)

RRM-D (5,1 g)

RRH-A (2 g) RRM-A (2,6 g)

Resíduo aquoso

37

O extrato hexano das raízes de R. echinata (RRH, 4 g), foi fracionado por

partição líquido-líquido com hexano (RRH-H, 576 mg) e acetato de etila (RRH-A,

2 g).

A sub-fração de hexano, RRH-H (576 mg), foi cromatografada por CC (17 x 2

cm) usando-se como fase estacionária sílica-gel (70-230 mesh) e fase móvel

hexano e acetona de acordo com um gradiente de polaridade. Quatorze sub-frações

(A-N 366mg), foram obtidas. Por CCD observou-se que nas sub-frações C (37,1mg)

e D (76mg) havia sido isolado duas substâncias que revelavam de marrom intenso

ao reagir com anisaldeído sulfúrico, e portanto, de acordo com este perfil, diferente

das demais substâncias isoladas até o momento, o que foi confirmado após análise

por RMN1H e espectroscopia de massas. Com a análise do resultado destas duas

técnicas identificou-se os compostos fraxinelona e epóxifraxinelona respectivamente,

limonóides degradados. A sub-fração E (30 mg) foi purificada por CC (11 x 1 cm),

adsorvente sílica-gel (70-230 mesh) e eluente hexano/acetona 99:1 em gradiente de

polaridade crescente. Sete sub-frações foram obtidas (A-G 24 mg). Na sub-fração B

(3 mg) novamente foi isolado o epóxi-fraxinelona. Na sub-fração C (6 mg) o

composto fraxinelonona, também um limonóide degradado, foi isolado e identificado

por RMN1H.

A sub-fração de acetato de etila , RRH-A (2,12 g), foi semi-purificada por

cromatografia em coluna sob pressão, sílica-gel (230- 400 mesh) como fase móvel

e hexano e acetona como fase estacionária em polaridade crescente, o que resultou

em treze sub-frações (A-M 1,5 g). Na sub-fração F (34 mg) isolou-se o limonóide

degradado fraxinelona, identificado por comparação por CCD. Na fração H (147 mg)

estava presente novamente o epóxi-fraxinelona. A fração I (56 mg), por apresentar

um perfil em CCD intesessante foi cromatografada por CC, adsorvente sílica-gel (70-

230 mesh) e fase móvel hexano, acetona. Cinco sub-frações foram obtidas (A-E

31mg). Na sub-fração D (6 mg) o limonóide degradado fraxinelonona foi isolado

novamente.

Na literatura não há descrição da configuração absoluta do epóxi-fraxinelona,

o que já havia sido experimentado sem êxito por técnicas espectroscópicas usuais.

Tal determinação seria possível por difração de raios-X, para isto porém, precisava-

se de um monocristal. A primeira tentativa de obter o cristal foi reunir as sub-frações

H (147 mg) e D (76 mg) resultantes, respectivamente,de RRH-A e RRH-H e

cromatografá-las por CC com pressão, sílica-gel como adsorvente, e hexano e

38

acetona como fase móvel em gradiente de polaridade crescente. Com este

fracionamento vinte sub-frações (A-R 198 mg) foram obtidas. Na sub-fração G o

epóxi-fraxinelona foi isolado. Os cristais formados apresentaram-se como finas

agulhas, parecendo uma lã de vidro, impróprios para raios-X. Recorreu-se a

sucessivas recristalizações com diferentes misturas de solvente. Logrou-se êxito da

mistura de acetato de etila-acetona 1:1 seguido de algumas gotas de água. Por meio

da difração de raios-X foi possível determinar a configuração absoluta do

epóxifraxinelona.

4.3.2.2 Extrato metanol (RRM)

O extrato MeOH das raízes de R echinata (RRM, 20 g), previamente diluído

com MeOH/H2O, foi fracionado por partição líquido-líquido com hexano (RRM-H, 6,3

g), CH2Cl2 (RRM-D, 5,1 g), AcOEt (RRM-A, 2,6 g) restando a fração MeOH/H2O

(RRM-M). A fração hexano, RRM-H (6,3 g) foi fracionado por CC em sílica gel,

utilizando como eluente hexano-acetato de etila em polaridade crescente. Desta

cromatografia foram obtidas vinte e cinco sub-frações (A-Y 4,9 g). Na sub-fração F

(18 mg) houve a formação do ftalato ρ-dimetilftalato, provavelmente devido

impurezas existentes nos solventes utilizados. Na sub-fração H (111 mg) isolou-se

os triterpenos pentacíclicos em mistura isomultiflorenol e isobaurenol . As sub-

frações J e L (116 mg) foram unidas e purificadas por CC em sílica e como fase

móvel utilizou-se hexano-acetato em gradiente crescente de polaridade. Coletou-se

dez (A-J 96 mg) sub-frações, sendo que na A foi identificado o composto β-sitosterol,

também encontrado no caule e folhas

4.4 Ensaios de Toxicidade

4.4.1 Ensaio com Artemia salina

Após o preparo da água do mar sintética (Sera premium), (pH deve estar

entre 8-9) os ovos de Artemia salina são colocados para eclosão por um período de

48 horas em temperatura entre 24 e 26 °C. A solução estoque da amostra a ser

testada foi obtida pesando-se 8 mg e adicionou-se até 10% do volume final de

39

DMSO para facilitar a dissolução e então lentamente adicionou-se água do mar

sintética até completar 10 mL, a concentração final obtida é de 800 µg/mL. Quando

necessário, deixou-se alguns minutos no ultrassom para total dissolução da amostra.

As baterias com diversas concentrações dos extratos brutos (500 – 8 µg/mL) foram

preparadas da seguinte maneira: Pesou-se 8 mg de amostra e adicionou-se até 1ml

de DMSO (até 1% do volume final) para facilitar a dissolução do extrato e a seguir

adicionou-se lentamente água do mar sintética até completar um volume final de 10

mL. Desta solução estoque tomou-se em triplicata: 1250, 620, 310, 120, 60 e 20 µL

que correspondem respectivamente às concentrações finais de 500, 248, 124, 48,

24 e 8 µg/mL da amostra a ser testada, completou-se com água marinha para um

volume final de 2 mL.

Como controle positivo utilizou-se solução de dicromato de potássio nas

concentrações de: 400, 600 e 800 µg/mL. Para o preparo de tais concentrações,

pesou-se 16 mg de dicromato de potássio que foi dissolvido em 20 mL de água

marinha sintética. Desta solução estoque tomou-se em triplicata: 2,0, 1,5 e 1,0 ml e

completou-se quando necessário o volume para 2 mL com água do mar sintética,

resultando em soluções com as respectivas concentrações de 800,600 e 400 µg/mL.

Como controle negativo utilizou-se 2 mL de água do mar sintética.

Adicionou-se, com auxílio de uma micropipeta, de 8-10 micro-crustáceos por

experimento. Para facilitar a micropipetação das larvas uma luminária fluorescente

foi utilizada, pois houve uma migração das larvas para o local onde havia incidência

de luz. Após 24 horas a uma temperatura entre 24 a 26°C contou-se o número total

x número de mortos para cada experimento (em triplicata) (SAM, 1993)

4.4.2 Bioensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens

A toxicidade dos compostos sobre fromigas cortadeiras Atta sexdens

rubropilosa foi determinada por bioensaio de ingestão de acordo com protocolo

estabelecido e descrito por Bueno et al (1997).

Cada tratamento constitui de 50 formigas distribuídas em 5 placas de Petri. As

formigas foram isoladas de seus ninhos e alimentadas com uma dieta artificial. As

formigas do tratamento receberam uma dieta adicionada com epóxifraxinelona e/ou

40

ácido limonéxico, até uma concentração de 200 µg. As formigas do tratamento

controle receberam uma dieta sem os compostos.

Durante 25 dias o número de formigas mortas em cada placa foi contada e as

sobreviventes eram alimentadas com mais uma porção da dieta. A curva de

sobrevivência foi estimada para cada tratamento e calculada a longevidade

mediana.

4.5 Avaliação Microbiológico

4.5.1 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para bactérias

Os valores da CIM foram determinados conforme descrito por NCCLS, 1993.

Em frascos de vidro de 5 mL, os compostos foram dissolvidos em solução DMSO e

água 1:1. Após dissolução, os compostos foram adicionados em séries de dez

frascos, em diferentes concentrações juntamente com 1mL do meio de cultura ágar

Mueller-Hinton. Após homogeneização da mistura e solidificação dos meios de

cultura, os microrganismos previamente ativados foram inoculados nas séries

correspondentes, sendo então incubados a 35°C por 18 a 24 horas. Após o período

de incubação foram realizadas leituras da concentração inibitória mínima através da

verificação do crescimento microbiano (BARON e FINEGOLD 1990 ). A CIM foi

determinada como a mais baixa concentração do composto teste que inibiu

completamente o crescimento do microrganismo.

Durante os testes foram realizados controles com solventes utilizados na

solubilização dos compostos, a fim de se verificar seu efeito sobre os

microrganismos testados.

Os testes foram realizados em duplicata. Soluções estoques do controle

negativo foram separados com solvente. Suspensões estoques do inóculo

bacteriano, foram ajustadas para 1,5 x106 UFC/mL, através de leitura em

espectrofotômetro no comprimento de onda de 530 nm, transmitância de 80%.

Como branco utilizou-se salina estéril (T=100%).

4.5.2 Método da Concentração Inibitória Mínima (CIM) para fungos

41

Em frascos de vidro de 5 mL, os compostos foram dissolvidos em DMSO e

água 1:1. Após dissolução, os compostos foram adicionados em séries de dez

frascos, em diferentes concentrações juntamente com 1mL do meio de cultura ágar

Sabouraud. Após homogeneização da mistura e solidificação dos meios de cultura,

os microrganismos previamente ativados foram inoculados nas séries

correspondentes, sendo então incubados a temperatura ambiente por 7-15 dias para

fungos filamentosos e 24-48 horas para fungos leveduriformes.

Afim de ajustar o inóculo, foi medida a transmitância da solução (95%),

lendo-se em comprimento de onda de 610 nm em espectrofotômetro. Como branco,

foi utilizado água destilada estéril ajustando-se a transmitância para 100%. Também

foi realizado a contagem de microrganismos em câmara de Neubauer. Obteve-se a

concentração desejada entre 10 5 e 10 6 células. Como controle positivo utilizou-se

um tubo contendo meio de cultura e solvente e como controle negativo meio de

cultura e 30 µg/mL.

Após solidificação do meio de cultivo, foi inoculado o fungo com alça calibrada

estéril (5 µL), sobre a superfície do ágar. Os tubos foram incubados a 28ºC o tempo

necessário de acordo com o microorganismo testado. A leitura dos resultados foi

válida quando houve crescimento do fungo no controle positivo e não no negativo.

4.6 Avaliação da atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico

Em todos os modelos no ensaio para avaliação da atividade antinociceptiva

foram utilizados camundongos “Swiss” machos pesando entre 25 a 35 g Os animais

provenientes do Biotério da UNIVALI, foram mantidos à temperatura controlada

(entre 20 a 23 ° C), tratados com água e ração ad libitum. Antes da realização do

experimento os animais foram mantidos por 4 horas ou mais no laboratório para

adaptação. Os procedimentos foram realizados de acordo com orientações

específicas referente aos cuidados com animais de laboratório e considerações

éticas para investigações da dor experimental em animais conscientes

(ZIMMERMANN, 1983).

4.6.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético

42

Embora o modelo do ácido acético seja simples e pouco específico permite

avaliar a atividade antinociceptiva de várias substâncias que atuam tanto em nível

central quanto periférico. A resposta nociceptiva foi induzida pela injeção

intraperitonial de ácido acético (0,6%) diluído em solução salina (0,9%). As

contorções abdominais, observadas durante um período de 20 ou 30 minutos,

consistem na contração da musculatura abdominal juntamente com a extensão de

uma das patas posteriores. O grupo controle recebeu somente veículo salina

(0,9%), utilizado para dissolver o composto Após injeção do ácido acético os animais

foram transferidos sob funil de vidro e o número de contorções foi quantificado

cumulativamente durante um período de 20 minutos.(COLLIER et al., 1968).

4.6.2 Modelo de dor induzida pela formalina

Neste modelo o procedimento adotado foi semelhante ao descrito por

HUNSKAAR E HOLE (1987). Três grupos de 6 animais cada foram tratados com

ácido limonéxico pela via i.p. ( 10, 30 e 60 mg/Kg) diluído com salina e, após 30

minutos, receberam 20 µl de formalina a 2,5% (0,92% de formaldeído) na região

plantar da pata posterior esquerda. No grupo de animais controle injetou-se solução

de salina ao invés do composto teste.

Após injeção de formalina, os animais foram colocados, dois a dois, sob um

funil de vidro invertido, próximo a espelhos para facilitar a observação. O tempo em

que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina foi

cronometrado, sendo este período considerado como indicativo de dor. Com este

modelo há possibilidade de evidenciar duas fases da dor. A primeira fase, ocorre

durante os 5 minutos após a injeção da formalina corresponde à dor neurogênica, e

a segunda fase, ocorre entre 15 a 30 minutos após injeção da formalina corresponde

à dor inflamatória.

4.6.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina

SAKURADA (1992), propôs este modelo para investigar a possível ação

modulatória de compostos, em estudo sobre a dor neurogênica induzida pela

43

capsaicina. Ao injetar capsaicina ocorre estimulação direta de receptores específicos

localizados nos neurônios nociceptivos, causando a liberação de vários

neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa, incluindo principalmente as

taquicininas. (SAKURADA, 1996)

Durante este procedimento cada animal recebeu 20 µl de solução de

capsaicina (1,6 µg/pata) na pata posterior direita, sendo que o tempo que o animal

permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com capsaicina foi

cronometrado por um período de 5 minutos e considerado como indicativo de dor

(SAKURADA, 1992) Grupos de 6 animais cada foram pré-tratados com ácido

limonéxico pela via i.p. ( 10, 30 e 60 mg/Kg) diluído com salina 30 minutos antes da

injeção de capsaicina. O grupo controle recebeu somente solução salina (0,9%),

veículo utilizado para dissolver o composto.

4.6.4 Modelo de dor induzida pelo glutamato

Modelo este proposto por Beirith et al. (1998) é aplicado para o estudo de

substâncias que atuam sobre o sistema glutamatérgico envolvido na transmissão

nociceptiva. A injeção de glutamato induz a estimulação direta dos neurônios

nociceptivos, causando a liberação de vários mediadores inflamatórios e

neuropeptídeos envolvidos na transmissão dolorosa.

Cada animal recebeu 20 µl de solução de glutamato (30 mmol/pata), injetada

na região intraplantar da pata posterior direta, imediatamente foram colocados , dois

a dois, sob funil de vidro transparente. O tempo que o animal lambeu ou mordeu a

pata injetada foi cronometrado durante 15 minutos. Este tempo é considerado

indicativo de dor. Grupos de 6 animais cada foram pré-tratados com ácido

limonéxico pela via i.p. (10, 30 e 60 mg/Kg) diluído com solução salina 30 minutos,

antes da injeção de glutamato. O grupo controle recebeu somente solução salina

(0,9%), veículo utilizado para dissolver o composto (BEIRITH et al., 1998)..

4.7 Análise estatística dos testes in vivo

44

Para o screening com Artemia salina a obtenção do valor de DL50% foi

através da análise estatística (probitos) do n° de micro-crustáceos mortos em cada

experimento e o intervalo de confiança 95%.

Para o ensaio com formigas cortadeiras teste estatístico utilizado para análise

dos dados foi o Log rank-test (α= 0,05)

Para analgesia os resultados foram apresentados como a média padrão mais

ou menos erro padrão para cada grupo de animais, exceto as DI 50s (dose do ácido

limonéxico que reduz a resposta em 50% em relação ao grupo controle) que foram

apresentadas como médias geométricas acompanhadas de seus respectivos limites

de confiança, em nível de 95%.As análises estatísticas foram realizadas por meio de

análise da variância seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se método

de Dunnet. As DI 50s foram estimadas a partir de experimentos individuais utilizando-

se o método de regressão linear através do programa GraphPad (Prism).

45

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Triterpenos em mistura

Triterpenos são substâncias abundantes em todos os vegetais e portanto

comumente encontrados em estudos fitoquímicos.

De R. echinata já foram isolados por Biavatti (2001) dos caules e fohas o

esqualeno (4), O esteróide β- sitosterol (6) e três triterpenos pentacíclios, pouco

comuns em Rutaceae, friedelina (5), isomultiflorenol (7) e isobaurenol (8), estes dois

últimos em mistura.

Neste trabalho os triterpenos pentacíclicos isolados em mistura da fração

metanólica dos galhos e das raízes de R. echinata foram o isomultiflorenol (3β-

Hidroxi-D:C-friedoolean-8-eno) (7) e o isobaurenol (3β- Hidroxi-D:C-friedours-8-eno)

(8), substâncias pouco comuns em espécies de Rutaceae, sendo mais comuns em

espécies de Celastraceae. A identificação destes triterpenos foi realizada pela

comparação dos dados espectrais de RMN 1H obtidos com a literatura, e ainda por

CCD com padrão conhecido

O espectro de RMN 1H (figura 4) da mistura é caracterizado pela presença de

um duplo-dubleto em δ 3,23 (J= 11,6 e 5,2 Hz), referente H-3α além da presença de

doze sinais para metilas, 8 singletes e 2 dubletes, na região 0,8 a 1,08 ppm

podendo-se observar assim que o espectro refere-se a uma mistura, apesar da

condição cristalina (agulhas brancas) da amostra que apresenta apenas uma

mancha em CCD.

4

210

14

17

19

22

30

27

28

26

25

2423

HO6

8

9

12

29

7

29

12

9

8

6HO

23 24

25

26

28

27

30

22

19

17

14

102

4

8

8 7

46

Figura 4: Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) da mistura de triterpenos isomultiflorenol e

isobauerenol (7 e 8).

Maiores informações sobre a mistura dos triterpenos pentacíclicos foram

fornecidas pelos espectros de RMN 13C BBD e DEPT 135 realizados anteriormente

(BIAVATTI et al., 2001).

Na literatura pesquisada, nenhuma referência de atividade biológica foi

encontrada para estes triterpenos.

5.2 Alcalóides

47

Através de CCD com padrão conhecido e Dragendorff como revelador foi

verificado que na fração metanólica dos galhos estavam presentes os alcalóides

furoquinolínicos maculina (21) e flindersiamina, (22), o primeiro também encontrado

nos caules e folhas e o segundo somente nos caules de R. echinata. Além de serem

amplamente isoladas de Rutaceae os Rfs das amostras e dos padrões foram muito

próximos, assim como a coloração das manchas do padrão e da amostra após

revelação. Os espectros de RMN 1H obtidos confirmaram a proposta.

Os alcalóides maculina (21) e flindersiamina (22) apresentaram boa atividade

antifúngica quando avaliados contra o fungo Leucoagaricus gongylophorus, obtendo-

se uma inibição de 60% e 80% respectivamente (BIAVATTI, 2002). Apresentaram

ainda, fraca atividade citotóxica quando testados em células tumorais ovarianas

(PRAKASH, et al., 2003).

O alcalóide flindersiamina vem sendo isolado em espécies de Rutaceae

desde 1957 (OKOGUN e AYAFOR, 1977).

O alcalóide alquil-quinolínico, 2-n-nonil-4 quinolona (25), estava também

presente na fração metanólica dos galhos, e já foi isolado das folhas.

Quinolonas contendo longas cadeias alquílicas em C-2 foram primeiramente

isoladas de microrganismos (Pseudomonas, sendo também chamados de

pseudanos (REISCH et al., 1975). Também já foram isolados em vários gêneros de

Rutaceae, principalmente Evodia (TANG et al., 1996), Boronia (SARKER et al.,

1995), Ruta (GRUNDON e OKELY, 1979) e Esenbeckia (GUILHON et al., 1994).

Algumas espécies do primeiro gênero são utilizadas na medicina tradicional chinesa

e os alcalóides isolados demonstraram atividade inibitória contra a bactéria

Helicobacter pilori (RUO et al., 1999 e HAMASAKI et al., 2000). Recentemente, foi

testada a atividade antimicobactericida de alcalóides quinolonicos de Evodia, sendo

bastante promissores (ADAMS et al., 2005)

N O

OMe

O

O

OMe

87

65

8a

4a4

8b

3a

2

3

27

N O

OMe

O

O8

7

65

8a

4a4

8b

3a

2

3

2621 22

48

N

O

H

2

3

5

44a6

7

88a

1'

2'

3'

4'

5'

6'

7'

8'

9'

30

O alcalóide 2-n-nonil-4-quinolona (25) apresentou sinais para cadeia alquílica

saturada pela presença de metila terminal Me- 9’ (δ 0,84 t J = 7Hz), hidrogênios

metilênicos em δ 1,25 sl, para H- 3’, H- 4’, H- 5’, H-6’, H-7’, H-8’, δ 2,69 t para H-1’

(J= 8,0 Hz) e δ1,65 quinteto para H-2’ (J = 7,5 Hz); além dos sinais para hidrogênios

aromáticos do núcleo quinolínico não substituído na região de δ 8,36 - 7,72 e para

hidrogênio H-3 de dupla conjugada trissubstituída em δ 6,22 s (figura 10). Os dados

espectrais foram comparados com descritos na literatura (KAN-FAN et al., 1970 e

GRUNDON E OKELEY, 1979). O tamanho da cadeia alquíca (formada por nopve

carbonos) ligada ao C2 foi determinado por espectroscopia de massas.

Atividade antifúngica contra o fungo L. gongylophorus com 50% de inibição

também foi obtida com o alcalóide 2-n-nonil-4-quinolona (BIAVATTI et al., 2002).

Nenhuma outra atividade foi encontrada na literatura pesquisada.

25

49

Figura 5 . Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3) do alcalóide 2-n- Nonil-4-quinolona (25)

5.3 Limonóides

Das raízes de R. echinata foram isolados o ácido limonéxico (13) que

diferencia-se da limonina (12) apenas pela oxidação do anel furano da molécula,

está também presente no extrato metanólico das folhas.

O ácido limonéxico já foi isolado de Dictamnus angustifolius (WU et al., 1999),

uma planta tradicional da China, das raízes de Tetradium trichotomum (QUADER et

al., 1990) e ainda é um dos principais constituintes dos frutos de Citrus nippokoreana

(CONOLLY et al., 2001). Apesar de ser encontrado desde 1948 (KONDO et al.,

1985), nenhuma referência significante de bioatividade foi encontrada para este

limonóide.

50

O

OO

H O

O

O

O

O

O

HO

H

3

2

1

5

12

14

17

20

21

22

23

18

19

30

28 29

9

7

17

No espectro de RMN 1H (figura 6 e tabela 2) observa-se singletos para o anel

furano em δ 6,24, H-22 e δ 6,01, H-21. Estes sinais estão de acordo e indicam um

sistema diidrofuranona com hidroxila em C-21. Isto é confirmado pelo espectro de

RMN 13C (figura 7) o qual apresenta ressonâncias em δ 97,3, C- 21 e δ121,7, C-22 e

em δ 168,2, C-23 e δ162,6 C-20 indicando a presença de 2 carbonos quaternários

O

OO

H O

O

O

O

O

O

HO

H

3

2

1

5

12

14

17

20

21

22

23

18

19

30

28 29

9

7

Figura 6: Espectro de RMN 1H (400 MHz) do ácido limonéxico (13) (CDCl3 + DMSO- d6)

13

51

Figura 7: Espectro de RMN 13C BBD para o ácido limonéxico (100 MHz, CDCl3 + DMSO-d6). Tabela 02: Dados de RMN 1H (400 MHz, CDCl3 + DMSO-d6) do ácido limonéxico (13) isolado em comparação com a literatura.

Ácido limonéxico (13) ( 400 MHz CDCl3 + DMSO- d6)

Ácido limonéxico (NG et al., 1987)

(250 MHz, DMSO- d6)

H

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm), J (Hz) 1 4,14 sl 4,06 d (3,6) 2 2

2,90 dd (16,7; 3,6) 2,79 d (16,9)

2,72 d (16,1) 2,60 dd (16,1, 3,6)

5 2,34 dd (15,9, 2,8) 2,27 dd (15,0, 3,0) 6ax 6eq

3,01 t (15,0) 2,41dd (14,1; 3,0)

3,11 t (15,0) 2,53-2,41 m

9 2,54 dd (10,5; 3.7) 2,53-2,41 m 11 1,95 m 12 1,70 m 15 3,87 s

4,10 s

17 5,32 s 5,24 s 18 1,17 19 4,49 d (13,0)

4,86 d (13,0) 4,92/4,47 d (13,0)

21 6,01 s 6,08 s 22 6,24 s 6,28 s 28 1,29 s 4xMe 1,19, 1,15, 1,01, 1,01 29 1,16 s 30 1,04 s

52

5.3.1 Limonóides Degradados

Das raízes de R.echinata isolou-se os limonóides degradados fraxinelona

(28), fraxinelonona (29) e epóxifraxinelona (15), sendo os dois primeiros são inéditos

na espécie pesquisada., já o último é também encontrado nas folhas e caules.

Existem apenas uma dezena de limonóides degradados isolados

principalmente de Rutaceae principalmente (BOUSTIÉ et al., 1995) e também de

Meliaceae (NAKATANI et al., 1998), os quais mantém grande parte da atividade

biológica inicial dos limonóides; essencialmente porque mantém os anéis C-D e

também o anel furano intacto, sendo estes parte essencial para algumas ações

biológicas, mais pronunciada a atividade inseticida.

O

O

OO

As estruturas dos compostos 28 e 29 foram elucidadas baseado-se nos dados

espectrais de RMN 1H e massas, dados estes que estão de acordo com a literatura

(NAKATANI et al., 1998; LIU et al., 2002)

FRAXINELONA (28)

A fraxinelona é um produto natural com um anel furano β-substituído,

registrada primariamente na família Rutaceae (Dictamnus albus, D. dasycarpus ) e,

posteriormente na família Meliaceae. A fraxinelona apresenta várias atividades

biológicas, dentre as quais podemos citar sua atividade anti-agregação plaquetária

significante, vaso relaxante e antifertilizante (NAKATANI et al., 1998)

O

O

O

O

8

9

11

13

15

17

30

18

21

2023

12

20O

O

O

20a28 29

15

53

O espectro de RMN1 H (figura 8) apresentou dois sinais de metilas em δ 0,85

e 2,13 correspondentes à Me –18 e Me-30, respectivamente; os sinais dos

hidrogênios do anel furânico como um duplo dubleto em δ 6,35 atribuído a H-22, um

tripleto em δ 7,44, atribuído a H-23 e um duplo dubleto em δ 7,47 atribuído a H-21.

O espectro ainda apresentou um singleto largo em δ 4,88 (H-17). Dados de RMN 1H

foram concordantes com a literatura (OKAMURA et al., 1997; BLAISE E

WINTERNITZ, 1985)

O espectro de massas (figura 9) para fraxinelona (28) obtido por impacto

eletrônico [M+]= 232 (C14H16O3) mostra o sinal 136, formado principalmente pela

expulsão consecutiva do aldeído-3-furano [M-96], formando assim o pico base

(100%). Observa-se ainda a saída de CO, formando o fragmento m/z 108. A saída

de metila (CH3) dos fragmentos anteriores é evidenciada pela formação do

fragmento m/z 93.

Figura 08 - Espectro RMN 1H (400 MHz, CDCl3 )do limonóide degradado Fraxinelona (28)

54

Figura 09: Espectro de massas da fraxinelona (28) obtido por impacto eletrônico

FRAXINELONONA (29)

O espectro de RMN 1H (figura 10) apresentou singletos em δ 1,09 e 2,18

correspondentes à Me- 18 e Me- 30, respectivamente. Os sinais dos hidrogênios do

anel furano aparecem como duplo dubleto em δ 6,36 atribuído a H-22, multipletos

em δ 7,49 atribuído a H- 23 e em δ 7,53 atribuído a H-21. O espectro ainda

apresentou um singleto largo em δ 5,12 (H-17) (tabela 03).

O espectro de massas (figura 11) obtido por impacto eletrônico apresenta o

pico do íon molecular [M+]= 246 (C14H14O4) compatível e o pico base em 150

formado principalmente pela expulsão consecutiva do aldeído-3-furano [M-96].

Observa-se ainda a saída de CO, formando o fragmento m/z 122. A saída de metila

(CH3) dos fragmentos anteriores é evidenciada pela formação do fragmento m/z

107.

O

O

O

20a28

55

Figura 10: Espectro RMN 1H (200 MHz, CDCl3) do limonóide degradado Fraxinelonona (29)

O

O

OO

29

56

Figura 11: Espectro de massas da fraxinelonona (29) obtido por impacto eletrônico

Tabela 03: Dados de RMN 1H (200 MHz, CDCl3 ) da fraxinelonona isolada em

comparação com a literatura.

H

Fraxinelonona (29) (200 MHz, CDCl3)

δ (ppm), J (Hz)

Fraxinelonona (OKAMURA et al., 1997; BLAISE E WINTERNITZ, 1985) (400 MHz, CD3OD)

δ (ppm), J (Hz)

11 2,64 m 2,70 ddd (5,5, 14,3, 18,3)

12 2,10 m 2,53 ddd (2,2, 5,1, 18,3)

17 5,12 s 5,24 s

21 7,53 m 7,60 s

22 6,36 dd (2,0, 0,92) 6,48 d (1,1)

23 7,49 m 7,57 dd (1,5, 1,8)

2,22 ddd (5,1, 13,0 14,3)

2,02 ddd (2,2, 5,5, 13,0)

Me- 18 1,09 s 1,07 s

Me- 30 2,18 s 2,09 s

EPÓXIFRAXINELONA (15)

O espectro de RMN 1H com poucos sinais, mostrou a presença de metilas

terciárias (singletes) em δ 0,89 (Me-18), e δ 1,60 (Me-30), de um grupo furano [δ

57

7,48 m, 7,47 m e � 6,35 m] e um singleto para H-17 (δ 5,19) (FIGURA 12). Também

confirmou-se o isolamento do epóxifraxinelona ao realizar uma CCD com padrão.

Figura 12: Espectro RMN1H (400 MHz, CDCl3 )do limonóide degradado Epóxifraxinelona (15)

A

O

O

O

O

8

9

11

13

15

17

30

18

21

2023

12

2015

58

A principal diferença observada entre fraxinelona (28) , fraxinelonona (29) e

epóxifraxinelona (15) pode ser verificada no espectro de RMN 13C para o

epóxifraxinelona, onde há presença de sinais para epóxi quaternário (δ 66,1 e 65,7)

ao invés de C de dupla ligação como para as duas primeiras substâncias. Para

fraxinelona cita-se os valores de δ 127,2 e 148,2 (BIAVATTI, 2001).

Há portanto neste limonóide degradado um grupamento epóxi ligado ao C8-

C14. Porém os dados espectrais publicados (BIAVATTI et al., 2001) em

concordância com os encontrados não fornecem clara evidência da configuração

espacial deste grupo. Em tentativa para confirmar a conformação espacial do grupo

epóxi Biavatti (2001) realizou nOe diferencial, mas os sinais foram sobrepostos,

frustrando conclusões precisas. Para esclarecer e confirmar a posição do grupo

epóxi uma análise de raios-X foi realizada (figura 13).

Figura 13: Projeção ORTEP 3 da epóxifraxinelona com mumeração cristalográfica. Elipsóides dos

átomos não hidrogenados com 50% de probabilidade.

Um monocristal de epóxi-fraxinelona foi obtido por recristalização seguido de

um processo de melhoramento do cristal. A recristalização envolveu a dissolução do

material em quantidade adequada de uma mistura de acetato de etila e acetona e

gotas de água. Os monocristais melhores foram selecionados e analisados por

difração de raios-X que estabeleceu indubitavelmente a estrutura do

epóxifraxinelona.

59

A figura 13 mostra uma projeção Ortep (FARRUGIA 1997) para

epóxifraxinelona. Este estudo mostra que a conformação molecular de

epóxifraxinelona é fixada pela presença de três principais interações

intramoleculares e intermoleculares (tabela 4) (BIAVATTI et al., 2005).

Tabela 04: Interações geométricas intramolecular e intermolecular (Ǻ) do

epóxifraxinelona

D-H....A D-H D.....A H......A D-H.......A Interações Intramoleculares

C8-H8A...O2 1.03(2) 2.909(2) 2.66(2) 93(1)

C14-H14B...O2 0.99(2) 2.980(2) 2.74(2) 94(1)

C11-H11B...O3 0.98(2) 3.246(2) 2.50(2) 131(1)

Interações Intermoleculares

C4-H4…O3i 0.93(2) 3.140(2) 2.35(2) 142(1)

C9-H9a…O2i 1.00(2) 3.309(2) 2.54(2) 133(1)

C5-H5…O3i 1.03(2) 3.546(2) 2.70(2) 139(1)

Códigos simétricos : (i) -y+1,+x,+z+1/4

Estes estudos evidenciaram que a configuração da metila 30 no limonóide

degradado é a mesma que a da limonina, sustentando a proposta de degradação

apresentada na figura 14.

Ainda o espectro de massas [M+248] (figura 15) da epóxifraxinelona

apresenta como fragmentos principais em m/z 161 (60), 137 (100), 124 (50).

60

O

O

O

O

O

O

O

H

OH

O

O

OO-co2

O

O

OH

O

O

O

O

O

OO

O

O

OO

oxidação isomerização

[O]

[O]fraxinelona

epoxifraxinelona

fraxinelonona

Figura 14: Formação dos limonóides degradados

Figura 15: Espectro de massas da epóxifraxinelona (15) obtido por impacto eletrônico

61

5.4 Ensaio de citoxicidade com Artemia salina

No ensaio de citotoxicidade com Artemia salina os extratos, sub-frações e

compostos isolados que foram analisados, não apresentaram atividade sobre este

micro- crustáceo (tabela 05), ou seja, não foram letais. Apresentaram valores de

DL50 maiores que 1000µg/ mL. Segundo Meyer et al., (1982) considera-se que um

composto é bioativo neste modelo quando encontra-se valores de DL50 menores que

1000µg/ mL. Como controle positivo, 100% de letalidade, utilizou-se o dicromato de

potássio e água marinha como controle negativo onde não houve letalidade;.

Tabela 05: Efeitos de extratos, sub-frações e compostos isolados de Raulinoa

echinata.no screening de citotoxidade em Artemia salina.

AMOSTRA DL50 (µg/mL)

RGM > 1000

RGM-H > 1000

Isomultiflorenol/ isobaurenol > 1000

RGM-D > 1000

Maculina,Flindersiamina,

2-n-Nonil-4-quinolona

> 1000

RRH > 1000

Epóxifraxinelona > 1000

Fraxinelonona > 1000

Fraxinelona > 1000

Acido limonéxico > 1000

A investigação da toxicidade de substâncias bioativas isoladas de plantas

deve ser viável, de fácil execução e que não necessite de uma grande infra-

estrutura, pois muitos laboratórios são desprovidos de tais condições. Animais,

cultura celular, avaliação de sistemas bioquímicos podem ser utilizados, porém

requerem laboratórios adequadamente equipados (CAVALCANTE et al., 2000).

O screening com Artemia salina é barato, não é complicado de ser

estabelecido e simples de executar, não requer equipamentos especiais ou técnicas

assépticas, e pequenas quantidades de substâncias são suficientes (micro-escala).

62

Por apresentar sensibilidade a substâncias tóxicas é utilizado para

biomonitorar o isolamento de compostos oriundos de plantas (HARTL E HUMPF,

2000). Este ensaio fornece informações para determinar a toxicidade de produtos

naturais e químicos, também fornece indícios de uma possível correlação com

atividade anti-tumoral e anti-Trypanossoma cruzi (CAVALCANTE et al., 2000;

SANTOS PIMENTA et al., 2003; MAcLAUGHILIN, 1991; ZANI et al., 1995).

Com tal embasamento da literatura sugere-se que os extratos, sub-frações e

compostos isolados testados no ensaio com Artemia salina não apresentem

citoxicidade, e portanto, é possível que não sejam dotados de atividade anti-tumoral

e anti Trypanossoma cruzi. Ainda sugere-se uma suposta ausência de toxidade

levando-se em conta o resultado obtido por PARRA et al., (2001) em seu

experimento, no qual, para determinação de valores de DL50 para 20 extratos de

plantas realizou um estudo de toxicidade em que comparou os resultados obtidos no

ensaio com Artemia salina e entre o ensaio com ratos. Uma boa correlação foi

verificada entre as DL50 obtidas nos testes in vivo e in vitro (PARRA et al., 2001).

5.5 Ensaio com formigas Atta sexdens

No ensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens testou-se dois compostos

isolados de Raulinoa echinata, o ácido limonéxico e o epóxifraxinelona, ambos

limonóides. De acordo com as curvas de sobrevivência mediana (figura 16), o

epóxifraxinelona não mostrou ser tóxico contra as formigas, já o ácido limonéxico

reduziu significativamente o tempo de vida das formigas (11 dias) quando

comparado com ao grupo controle (22 dias).

63

Figura 16: Curva de sobrevivência das formigas cortadeiras, Atta sexdens rubropilosa frente aos

compostos epóxifraxinelona (painel A) e ácido limonéxico (painel B).

As saúvas, formigas cortadeiras Atta spp, pertencem à tribo Attini, subfamília

Myrmicinae, família Formicidae compreendem cerca de 215 espécies dentro de 13

gêneros (BUENO, 2003). Elas são consideradas causadoras de grandes danos

econômicos, estimam-se perdas da ordem de $1 bilhão/ano, devido principalmente

ao desfolhamento que causam nas plantas, onde cortam e transportam fragmentos

Controle Epóxi-fraxinelona

A

B

64

vegetais para seus ninhos subterrâneos, onde cultivam o fungo Leucoagaricus

gongylophoros, do qual se alimentam, por este motivo também são chamadas

cultivadoras de fungo Elas distribuem-se mundialmente do norte do Texas (EUA) até

a Argentina central. O Brasil é o país que possui maior número de espécies de

formigas cortadeiras, compreendendo 200 espécies do gênero Atta (BUENO, 2003).

Um formigueiro contém várias entradas e pode atingir uma área de 200 m2 e 25

metros de profundidade, onde vivem cerca de 5-8 milhões de formigas.

Tradicionalmente, os inseticidas mais utilizados têm sido os organoclorados

e/ou fosforados. Estes inseticidas têm amplo espectro de ação e exterminam

indiscriminadamente insetos considerados pestes como também aqueles benéficos

ao homem. Além disso, os insetos podem adquirir resistência a estes inseticidas,

significando a aplicação de maiores quantidades, causando danos ecológicos e

poluição do meio ambiente (FERREIRA et al., 2001). Os inseticidas derivados de

produtos naturais já foram muito utilizados até 1940, sendo principalmente utilizado

o alcalóide nicotina extraído das folhas de Nicotiana tabacum e Nicotiana rustica

(Solanaceae) associado a nornicotina e anabasina. O surgimento dos inseticidas

sintéticos desenvolvidos a partir da II Guerra Mundial acabou substituindo por

completo os agentes naturais por serem muito mais potentes.

É sabido que os limonóides, isolados apenas de plantas pertencentes à

família Rutaceae, Meliaceae e Cneoraceae apresentam atividade em insetos seja

interferindo no crescimento, seja através da inibição de alimentação (CONNOLY et

al., 1973). Cita-se como exemplo de limonóide com ação inseticida o azadirachtina,

extraído da A. indica . Entre os limonóides mais comuns na família Rutaceae estão a

limonina e o obacunona, cuja atividades contra insetos estão sendo avaliadas.

(FERREIRA et al., 2001).

Um grande desafio tem sido encontrar um produto inseticida contra as

formigas cortadeiras que não cause danos ao ser humano e ao meio ambiente,

neste contexto é interessante avaliar produtos de origem natural no combate a este

inseto. O resultado obtido com o ácido limonéxico no ensaio com formigas foi

significativo, pois inibiu a longevidade destes insetos, se comparado ao controle, em

11 dias. Sugere-se que este limonóide, isolado de Raulinoa echinata, exerça uma

ação inseticida, talvez por apresentar uma atividade fagoinibidora, ou seja, inibe a

alimentação, mas não mata diretamente, portanto não apresentaria uma ação tóxica

sobre as formigas. Esta possível ação fagoinibidora seria mais plausível uma vez

65

que no ensaio com Artemia salina o ácido limonéxico não apresentou-se tóxico,

importante considerar que são modelos distintos, portanto para confirmação ou

refutação desta hipótese são necessários mais estudos.

5.6 Ensaio microbiológico

Algumas frações e sub-frações de Raulinoa echinata foram testadas

microbiologicamente com bactérias gram-positivas, bactérias gram-negativas e com

o fungo Cândida albicans. Conforme exposto na tabela 06 , os resultados obtidos

foram superiores a 1000µg/mL.

Tabela 06: Resultados de Concentração Inibitória Mínima (µg/mL) de frações e sub-

frações de Raulinoa echinata através da diluição em ágar

Fração/ Sub-fração

B.c S.s S.a St.a E.co E.c P.m Ps.a S.t Ca

RGM >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

RGM-H >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

RGM-A >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

RGM-D >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

RRH >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

RRM >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000 >1000

Bactérias Gram-positivas: Bacilus cereus (B.c), Staphylococus aureus (S.a), S. saprophyticcus (S.s), Streptococcus agalactie (St.a), Bactérias Gram-negativas Enterobacter cloacae (E.co) , Escherichia coli (E.c), Proteus mirabilis (P.m) Pseudomonas aeruginosa (Os.a) Salmonella tiphymurium (S.T), Fungo: Candida albicans

O homem e os microorganismos partilham uma vida em comum que se perde

na sombra do tempo, e certamente, desde a pré-história provocam doenças ao

homem. Entretanto as causas dessas doenças só começaram a ser descobertas

séculos atrás, a partir de 1878, graças aos trabalhos de Pasteur e Koch, que

demonstraram a origem infecciosa de várias enfermidades do homem e animais

(TAVARES, 1999; MIMS et al., 1999).

As bactérias são os mais simples organismos encontrados na maioria dos

ambientes naturais. Elas são células esféricas ou em forma de bastonetes curtos

66

com tamanhos variados, alcançando à vezes micrômetros linearmente. A célula

bacteriana apresenta várias estruturas, algumas das quais estão presentes apenas

em determinadas espécies, enquanto outras são essenciais, e portanto encontradas

em todas as bactérias (MIMS et al., 1999; SCHAECHTER et al., 2002).

A manutenção da forma bacteriana (bacilo, coco, etc.) é devido a presença da

parede celular bacteriana. De acordo com a constituição da parede, as bactérias

podem ser divididas em dois grandes grups: Gram-negativas e Gram-positivas. As

diferenças entre esses dois grupos residem principalmente nas suas propriedade de

permeabilidade e nos componentes de superfície. As principais diferenças reveladas

pela coloração de Gram estão relacionadas a presença de uma membrana externa

nas bactérias Gram-negativas e de uma espessa camada de peptideoglicano nas

bactérias gram- positivas (SCHAECHTER et al., 2002).

Os fungos podem causar no homem doenças denominadas micoses, das

mais variadas classificações. As micoses ocupam lugar de destaque na patologia

tropical. O termo micose foi empregado pela primeira vez por Virchow, em 1856

(TRABULSI et al., 1999). Vários dos fungos que podem causar micoses viem em

associação com o homem como comensais ou estão presentes no ambiente. Nos

últimos anos houve um aumento crescente das infecções fúngicas sistêmicas, não

apenas por fungos patogênicos conhecidos, mas também por fungos considerados

inócuos (RANG E DALE, 2004; MIMS et al., 1999).

Diversos fungos, presentes no meio ambiente ou integrantes da flora normal,

podem em determinadas situações passarem de saprófitos a patogênicos,

provocando quadros clínicos variáveis, desde processos febris benignos, a

septicemias algumas vezes fatais (LACAZ et al., 2002).

Dentre as principais patologias fúngicas oportunistas pode-se citar entre

outras a candidíase que são infecções provocadas por leveduras do gênero

Candida, principalmente Cândida albicans. A maior parte dessas infecções são de

origem endógena, ou seja são causadas por microorganismos que fazem parte da

microbiota normal do ser humano (LACAZ et al., 1998; TRABULKSI et al., 1999).

Os principais grupos de compostos com propriedade antimicrobianas,

extraídas de plantas incluem: terpenóides e óleos essenciais, alcalóides, lecitinas e

polipeptídeos, substâncias fenólicas e polifenólicas (GONÇALVES et al., 2005)

No ensaio microbiológico realizado com as frações e sub-frações, RGM,

RGM-H, RGM-A, RGM-D, RRH E RRM oriundas de Raulinoa echinata os valores de

67

CIM foram superiores a 1000 µg/mL, valor este irrelevante, pois possivelmente seria

necessário, para obtenção de uma possível atividade antimicrobiana, nas cepas

avaliadas, uma elevada concentração de compostos, o que inviabilizaria sua

utilização na terapêutica. Para classificar a atividade antimicrobiana das frações e

sub-frações de Raulinoa echinata, utilizou-se como parâmetros o seguinte: CIM

menor que 100 µg/mL foram considerados com boa atividade antimicrobiana, os que

apresentaram CIM entre 100 e 500 µg/mL foram considerados fracos e quando a

CIM for maior que 1000 µg/mL o produto foi considerado inativo (HOLETZ et al.,

2002). O emprego deste justifica-se devido ao fato da grande maioria dos

antimicrobianos de uso clínico serem ativos contra microorganismos sensíveis em

concentração de até 10 µg/mL. Segundo Mitscher et al. (1972), caso um composto

puro não apresente atividade até a concentração de 100 µg/mL, é pouco provável

que esse seja candidato a uso clínico, a menos que seja ativo contra um

microorganismo resistente ou ainda seja comparativamente atóxico.

A família Rutaceae tem se distinguido pela sua alta variedade de metabólitos

secundários tais como cumarinas, lignanas e terpenóide. Estas classes de

compostos apresentam grande variedade de atividade biológica, como por exemplo

antifúngica, bactericida, antiviral e inseticida (GUERREIRO et al., 2005).

Não há na literatura pesquisada nenhuma citação de atividade antimicrobiana

para Raulinoa echinata e nem para os compostos isolados das frações e sub-frações

testadas. Esta inatividade de ação antimicrobiana era esperada, uma vez que no

ensaio com Artemia salina também não houve morte dos micro-crustáceos. Estes

dois experimentos podem ser considerados concludentes, pois há trabalhos em que

os compostos selecionados a serem testados contra bactérias e fungos são

escolhidos se apresentarem letalidade sobre Artemia salina (YANG, 2001).

5.7 Atividade antinociceptiva in vivo do ácido limonéxico

Para efeitos de melhor compreensão dos resultados que passaremos a

descrever e discutir, as barras escuras das figuras referem-se ao grupo de animais

tratados com o veículo no qual o ácido limonéxico foi diluído, enquanto as barras

mais claras referem-se ao tratamento com o referido composto.

68

5.7.1 Modelo de dor induzida pelo ácido acético

Conforme mostra a figura 17 o ácido limonéxico exerceu efeito antinociceptivo

estatisticamente significante nos animais tratados com doses de 30 e 60 mg/Kg. Não

se observou efeito significativo para a dose de 10 mg/Kg. A DI50 calculada para o

modelo foi de 21,74 (11,91- 39,69) mg/Kg e a IM foi de 58,80%.

Figura 17: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente sobre a nocicepção

induzida pelo ácido acético (0,6%) em camundongos. Cada barra representa a média de resultados

de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças estatísticas quando

comparadas com o controle, representado pela barra fechada ** P <0,01.

Apesar de ser relativamente simples e com possibilidade de pouca

especificidade, este modelo de dor é de fácil observação, apresenta boa

sensibilidade à várias analgésicos e antiinflamatórios não esteroidais, bem como a

drogas semelhantes à morfina e outros analgésicos que atuam centralmente. Além

disso, os resultados obtidos com as várias classes de drogas analgésicas neste

modelo mostram boa correlação com a ação analgésica encontrada em outros

modelos pré-clínicos, bem como em estudos clínicos (KOSTER et al., 1959; BLANE

et al., 1967; BLUMBERG et al., 1965; SIEGMUND et al., 1957a,b). Postulou-se por

Whittle (1964) que o ácido acético atua indiretamente, causando a liberação de

mediadores endógenos envolvidos na modulação da dor, incluindo a bradicinina, a

0

25

50 ControleÁcido Limonéxico

Tratamento (mg/kg i.p)

**

C 60

IM = 58.80%

10 30

**

DI50= 21.74 (11.91- 39.69)mg/kg

Nú

mer

o d

e co

nto

rçõ

es

69

serotonina, histamina e as prostaglandinas. Além disso, Ribeiro et al. (2000)

mostraram que a nocicepção induzida pelo ácido acético depende da liberação de

citocinas, como a IL- 1β, TNF- α e a IL-8, a partir de macrófagos e basófilos

residentes na cavidade abdominal, e que em conjunto, com outros mediadores

podem induzir a dor característica observada neste modelo. Portanto, a dor

abdominal induzida pelo ácido acético pode ser previnida por vários fármacos,

destacando-se entre esses os antiinflamatórios não esteroidais (WHITTLE, 1964).

Tendo sido a DI50 calculada para o modelo modelo do ácido 21,74 (11,91-

39,69) mg/Kg e a IM 58,80%, sugere-se que o ácido limonéxico esteja atuando nos

mediadores da dor inflamatória ora, diminuindo sua liberação ora, atuando como

antagonista dos receptores desses neurotransmissores.

A tabela 07 mostra a comparação do efeito antinociceptivo do ácido

limonéxico com fármacos analgésicos utilizados terapeuticamente no modelo do

ácido acético, onde é possível verificar que o ácido limonéxico apresenta um efeito

antinociceptivo três vezes mais potente que o paracetamol e a aspirina

Tabela 07: Comparação dos valores das DI50para atividade do ácido limonéxico, do

paracetamol e da aspirina no modelo do ácido acético

Tratamento (i.p) DI50 (mg/Kg) DI50 (µmol/Kg)

Ácido limonéxico 21,74 (11,91- 39,69) 43 (2,3- 79)

Paracetamol 19,0 (16- 23) 125,80 (105-9- 152,08)

Aspirina 24,00 (13- 44) 133,00 (72,2- 244)

5.7.2 Modelo de dor induzida pela formalina

No modelo de dor induzida pela formalina demonstrado na figura 18 pode-se

observar que o ácido limonéxico exerceu efeito antinociceptivo em ambas as fases

do processo doloroso representado no modelo. Entretanto observou-se um efeito

mais pronunciado na segunda fase, a qual corresponde à dor inflamatória (dor

crônica). As IMs calculadas para ambas as fases foram respectivamente 34,24% e

78,69%. Somente foi possível calcular a DI50 para a segunda fase (DI50 13,66 ( 9,35-

19, 61) mg/Kg, uma vez que na primeira fase em todas as três doses utilizadas a

70

resposta antinociceptiva foi equivalente. Também verificou-se que o ácido limonéxico

inibiu o edema de pata induzido pela formalina (dados não mostrados), confirmando

assim, seu possível efeito sobre mediadores do processo inflamatório responsáveis

por dois dos sinais cardinais da inflamação que são: a dor e o edema.

Figura 18: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrada sistemicamente sobre nocicepção

induzida pela formalina em camundongos. Cada barra representa a média de resultados de 6 a 8

animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças estatísticas quando

comparadas com o controle, representado pela barra fechada .* P< 0,1 e ** P<0,01. O Painel A indica

a 1° fase do teste e o painel B a 2ª fase do teste

Descrito inicialmente em gatos e em ratos por Dubuisson e Dennis (1977), o

modelo da formalina consiste na injeção intraplantar de formaldeído diretamente na

pata do animal causando intensa dor por estimulação direta dos nociceptores. A dor

causada pela formalina é caracterizada por vigorosas lambidas, mordidas e batidas

0

60

120 ControleÁcido Limonéxico

Tratamento (mg/kg i.p)

**

C 60

IM = 33.90%

10 30

****

A

Tem

po

de

Rea

ção

(s)

0

125

250 ControleÁcido Limonéxico

Tratamento (mg/kg i.p)

**

C 60

IM = 78.65%

10 30

*

B

DI50= 13.66 (9.35-19.96)mg/kg

Tem

po

de

Rea

ção

(s)

71

na pata injetada com o irritante. Este teste é caracterizado por apresentar duas fases

distintas de nocicepção, que parecem envolver diferentes mediadores (DUBUISSON

e DENNIS, 1977; HUNSKAAR et al., 1985; HUNSKAAR e HOLE, 1987; ROSLAND,

1991), além de ser considerado atualmente o modelo que mais se aproxima da dor

clínica inflamatória. A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de

formalina, estendendo-se pelos primeiros 5 minutos, o que acredita-se ser devido à

estimulação química direta dos nociceptores (DUBUISSON E DENNIS, 1977;

HUNSKAAR et al., 1985), predominantemente das fibras aferentes do tipo C e, em

parte, as do tipo Aδ (HEAPY et al., 1987). A segunda fase desse modelo ocorre

entre 15- 30 minutos após a injeção de formalina e está relacionada principalmente

com a liberacão de vários mediadores pró-inflamatórios (HUNSKAAR E HOLE,

1987)

Resultados descritos na literatura indicam que vários mediadores químicos

como a substância P e o glutamato estão envolvidos com a primeira fase (dor

neurogênica), enquanto que a histamina, a serotonina, as prostaglandinas e a

bradicinina participam da segunda fase (dor inflamatória) da dor induzida pela

formalina (CORRÊA E CALIXTO, 1993; HUNSKAAR E HOLE, 1987; SHIBATA et al.,

1989).

Muitos pesquisadores têm mostrado que a primeira fase, por ser causada

pela estimulação direta dos nociceptores, é normalmente sensível aos opióides,

enquanto que a segunda fase desse modelo está associada a resposta inflamatória

e envolve a produção de prostagalandinas e outros mediadores inflamatórios, sendo

controlada por drogas antiinflamatórias não esteroidais (HUNSKAAR E HOLE, 1985;

HUNSKAAR E HOLE, 1987; HOLE, 1997).

O resultado mais significativo neste modelo foi obtido na segunda fase a qual

corresponde à dor inflamatória, com DI50 13,66 ( 9,35- 19, 61) mg/Kg e IM 78,69%.

Pode-se com este resultado sugerir que o ácido limonéxico esteja inibindo a dor

crônica (inflamatória), resultado este que corobora com o resultado obtido no modelo

do ácido acético.

5.7.3 Modelo de dor induzida pela capsaicina

72

Também verificou-se que o ácido limonéxico exibe efeito antinociceptivo de

forma estatisticamente significante em dose dependente sobre a nocicepção

induzida pela capsaicina, (figura 19) Neste modelo a IM e a DI50 calculadas foram

respectivamente 60,06% e 11,67 (8,51- 16,0) mg/Kg.

Figura 19: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sitemicamente sobre a nocicepção

induzida pela injeção intraplantar da capsaicina em camundongos. Cada barra representa a média de

resultados de 6 a 8 animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças

estatísticas quando comparadas com o controle, representado pela barra fechada ** P <0,01.

O modelo da capsaicina foi proposto inicialmente por SAKURADA et al.

(1992) onde demonstraram que a injeção intraplantar de capsaicina na pata

posterior de camundongos, causava vigorosa dor, caracterizada por lambidas e

mordidas na pata injetada, sendo esse efeito relacionado com a dor de origem

neurogênica.

A capsaicina é uma amina neurotóxica extraída da pimenta vermelha que,

quando aplicada na pele ou injetada em animais, produz irritação caracterizada por

reação dolorosa e subseqüente dessenbilizacão para a dor induzida quimicamente

(JANCSÓ et al., 1981). Recentemente, foi demonstrado que a capsaicina atua

através da ativação de receptores específicos, que foram chamados de receptores

vanilóides do tipo 1 (VR1)., esses receptores estão presentes principalmente nos

gânglios da raiz dorsal da medula espinhal e no gânglio trigêmio (CATERINA et al.,

1997).

0

30

60

90 ControleÁcido Limonéxico

Tratamento (mg/kg i.p)

**

C 60

IM = 60.06%

10 30

DI50= 11.67(8.51- 16.0) mg/kg

**

**

Tem

po

de

Rea

ção

(s)

73

Sakurada (1996) evidenciou que a nocicepção induzida pela injeção

intraplantar ou intratecal de capsaicina pode ser mediada, pelo menos em parte,

pela produção de óxido nítrico, glutamato e aspartato além dos neuropeptídeos (SP,

NKB, NKA e CGRP).

Como o resultado obtido no modelo de nocicepção induzido pela capsaicina,

foi significativo, sugere-se que o ácido limonéxico esteja também, atuando na

inibição da dor neurogênica, onde estaria inibindo os mediadores químicos óxido

nítrico, glutamato e neuropeptídeos ( SP, NKB, NKD, e CGRP).

5.7.4 Modelo de dor induzido pelo glutamato

No último modelo avaliado observou-se que o efeito antinociceptivo do ácido

limonéxico também está presente quando a dor é induzida pelo glutamato. Conforme

mostrado na figura 20, o tratamento dos animais com ácido limonéxico promoveu um

efeito antinociceptivo, sobretudo, com a dose de 30 mg/Kg. A IM calculada neste

modelo foi de 40,88% enquanto que a DI50 foi de 47,14 (36,51- 60,95) mg/Kg

Figura 20: Efeito do ácido limonéxico (10- 60mg/Kg) administrado sistemicamente sobre a nocicepção

induzida pelo glutamato em camundongos. Cada barra representa a média de resultados de 6 a 8

animais e as linhas verticais os E.P.Ms. Asteriscos denotam diferenças estatísticas quando

comparadas com o controle, representado pela barra fechada ** P <0,01

*** P< 0,001

0

100

200 ControleÁcido Limonéxico

Tratamento (mg/kg i.p)

**

C 60

IM = 40.80%

10 30

***

DI50= 47.17 (36.51-60.93)mg/kg

Tem

po

de

Rea

ção

(s)

74

O glutamato é um neurotransmissor (aminoácido excitatório) que está

envolvido na dor neurogênica induzida pela formalina e pela capsaicina. Além disso,

é um dos neurotransmissores chave do SNC e é usado na transferência de

informações entre os neurônios. Em fibras aferentes do tipo C ocorre a co-existência

de neuropeptídeos com o glutamato, funcionando este como neuromodulador do

processo doloroso (FISHER, et al., 2000). Também, há uma concentração muito

grande de receptores para o glutamato no corno dorsal da medula e, em neurônios

intrínsecos desta localidade. Os aminoácidos excitatórios como o glutamato podem

atuar em dois tipos de receptores, nos ionotrópicos como o N-Metil-D-aspartato

(NMDA), Kainato e AMPA, os quais são ligados a canais iônicos, e também nos

metabotrópicos que são ligados à proteína G.

O glutamato liberado dos neurônios aferentes primários atuando em

receptores AMPA é responsável pela primeira transmissão sináptica pela última

sinapse que ocorre no corno dorsal da medula na transmissão do impulso doloroso.

Os receptores metabotrópicos para o glutamato são expressos somente durante o

aumento da excitabilidde espinal associada à hiperalgesia periférica (MALMBERG e

YAKSH, 1995). também, em condições de dores crônicas, tem sido reportado o

envolvimento na neurotransmissão do impulso doloroso. Associado a isto,

antagonistas do receptor NMDA produzem analgesia (JENSEN e YAKSH, 1992).

Estes receptores parecem estar envolvidos não somente na nocicepção induzindo a

síntese de NO através da ativação da NO-sintase, como também no

desenvolvimento da tolerância a opióides, pois os inibidores da enzima têm se

mostrado como excelentes preventores da tolerância desenvolvida a estes agentes

analgésicos.

Em 2002, Beirith e colaboradores propuseram que o glutamato pode ser

utilizado como agente na indução da nocicepção. Levando isto em consideração,

substâncias que diminuem a nocicepção induzida por este neurotransmissor podem

estar atuando em seus receptores como antagonistas ou inibindo a síntese de óxido

nítrico pelo bloqueio da NO-sintase (BEIRITH, SANTOS, CALIXTO, 2002)

O ácido limonéxico nas doses de 30 e 60mg/Kg, mais significativamente na

de 30mg/Kg, mostrou inibir a nocicepção causada pelo glutamato. Sugere-se

portanto que exerceu atividade antinociceptiva, inibindo possivelmente a síntese de

óxido nítrico, atuando desta forma na dor neurogência.

75

De uma forma geral a transmissão da dor é um mecanismo que envolve

interações muito complexas de estruturas periféricas e cerebrais, desde a superfície

da pele até o córtex cerebral (FÜRST, 1999). A dor pode ser definida segundo o

Comitê de Taxonomia da Associação Internacional para o Estudo da Dor (I.A.S.P)

como uma sensação e experiência desagradável associada com um dano tecidual

atual ou potencial, ou descrita como tal dano (MERSKEY E BOGDUK, 1994;

MILLAN, 1999). Além disso, a dor pode ser denominada de acordo com o tipo da

lesão e/ou dos mediadores envolvidos em nociceptiva, neurogênica, neuroática e

psicogência, a qual está associada respectivamente, com estimulação excessiva de

nociceptores, com lesão ao tecido neuronal, com a disfunção de um nervo ou com

fatores psicológicos (MILLAN, 1999).

A dor, além de uma sensação, é uma experiência. O componente sensorial da

dor é denominado nocicepção, que pode ser definida como a resposta fisiológica a

uma lesão tecidual (RUSSO E BROSE, 1998). Desta forma, segundo os autores

pode-se dizer que ela possui dois componentes: o sensorial e o emocional,

enquanto que o componente emocional é a resposta emocional do processo

doloroso em si vale dizer então, que a nocicepção é unipresente em todos os

indivíduos normais mas, a “dor” na sua forma mais abrangente é bastante particular.

Isto é importante porque as sensações possuem vias neuroanatômicas importantes

com receptores específicos que permitem a detecção e medida de um estímulo. Já

as experiências incorporam componentes sensoriais com influências pessoais e

ambientais.

Em termos de duração, um episódio de dor pode ser transitório, agudo ou

crônico. No tipo transitório, a ativação dos nociceptores é feita na ausência de

qualquer dano tecidual. Na dor aguda, ocorre geralmente lesão e ativação dos

nociceptores. Já a dor crônica é causada geralmente por uma lesão ou patologia,

sendo que esta também pode ser perpetuada pó outros fatores que não os

causadores da dor (LOESER E MELZACK, 1999).

Os nociceptores, receptores da dor, são terminações nervosas livres, não

especializadas, que respondem a estímulos nociceptivos, detectando deste modo a

presença de lesão tecidual. Os estímulos desencadeantes podem ser mecânicos

(estresse/lesão mecânica dos tecidos), térmicos (temperaturas extremas) ou

químicos (histamina, bradicinina, prostaglandinas, etc.), atuando pela modificação do

potencial de membrana do receptor (MILLAN, 2002).

76

Os resultados descritos anteriormente sobre os efeitos antinociceptivos do

ácido limonéxico são bastante interessantes. Através dos resultados, pôde-se

verificar que o composto exibiu efeito antinociceptivo tanto em dores do tipo

neurogênica (relacionados a resultados obtidos no modelo da capsaicina, glutamato

e fase I da formalina) e dores inflamatórias (relacionado aos resultados obtidos no

modelo do ácido acético e fase II da formalina). Além disso, pode-se sugerir que o

efeito obtido possa estar vinculado ao antagonismo dos efeitos de

neurotransmissores envolvidos no processo doloroso, principalmente a bradicinina, a

histamina, a serotonina e as prostaglandinas, uma vez que são liberadas quando

estímulos químicos como a formalina, o ácido acético e a capsaicina são usadas

para produzir algesia.

Na literatura pesquisada não há citação de que o ácido limonéxico nem outro

compostos isolado de R. echinata houvessem sido testados nestes ou em outros

modelos de nocicepção . Sendo portanto, os resultados obtidos com o ácido

limonéxico neste experimento inéditos. Ainda, sugere-se que este composto possa

vir a ser um candidato ou protótipo a fármaco com ação analgésica, para isto mais

estudos são necessários.

77

6 CONCLUSÕES

� Isolou-se dos galhos de Raulinoa echinata os triterpenos em mistura

isobaurenol/ multiflorenol, o ácido limonéxico em grande quantidade, os

alcalóides furoquinolínicos maculina e flindersiamina, e o alcalóide alquil-

quinolínico , e 2-n-nonil-4 quinolona, substâncias estas não encontradas nas

raízes, com exceção dos triterpenos em mistura.

� Das raízes de Raulinoa echinata isolou-se os limonóides degradados

fraxinelona, fraxinelonona e epóxifraxinelona, sendo que os dois primeiros

não foram encontrados em outras partes da planta.

� Determinou-se por difração de Raios- X a posição do grupamento epóxi da

epóxifraxinelona em α e Me- 30 em β.

� Não se observou atividade biológica das frações e compostos isolados nos

modelos de citoxidade sobre Artemia salina e atividade antimicrobiana.

� Em concordância com os resultados obtidos nos modelos farmacológicos

testados o ácido limonéxico parece estar inibindo a produção de mediadores

endógenos envolvidos na modulação da dor, tais como: bradicinina,

serotonina, histamina, prostaglandinas, glutamato, substância P, óxido nítrico

além dos neuropeptídeos (SP, NKA, NFB, e CGRP). Porém faz-se necessário

pesquisas adicionais e com outros modelos para uma melhor avaliação.

� No ensaio com formigas cortadeiras Atta sexdens rubropilosa observou-se a

diminuição da longevidade mediana das formigas pelo ácido limonéxico

enquanto o limonóide degradado foi inativo.

78

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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