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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE MARLOVA MANHABOSCO DAL MOLIN ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DE EXTRATOS, FRAÇÕES E COMPOSTOS OBTIDOS DAS PARTES AÉREAS DA Garcinia achachairu Rusby (Clusiaceae). Itajaí - 2009
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
MARLOVA MANHABOSCO DAL MOLIN
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA
DE EXTRATOS, FRAÇÕES E COMPOSTOS OBTIDOS DAS PARTES
AÉREAS DA Garcinia achachairu Rusby (Clusiaceae).
Itajaí - 2009
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
MARLOVA MANHABOSCO DAL MOLIN
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA
DE EXTRATOS, FRAÇÕES E COMPOSTOS OBTIDOS DAS PARTES
AÉREAS DE Garcinia achachairu Rusby (Clusiaceae).
Dissertação apresentada à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero Co-orientador: Prof. Dr. Nara Lins Meira Quintão
Itajaí, abril de 2009.
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AGRADECIMENTOS
À DEUS que é fonte de Luz, inspiração, amor , sabedoria e proteção em todos os momentos da minha vida, por ter me guiado por este longo caminho. Ao professor Dr. Rivaldo Niero pela orientação, pelos ensinamentos, incentivos, conselhos, sugestões e presença constante mostrados durante todas as etapas deste trabalho. Junto a ele agradeço aos professores Nara Lins Meira Quintão, Sérgio Faloni de Andrade e Ângela Malheiros sem os quais não teria sido possível este trabalho. Ao professor Dr. Franco Delle Monache do Centro Chimica Recettori, C.N.R., Roma, Itália, pelo auxilio na interpretação dos espectros de RMN. À minha família, que mesmo de longe, sempre me incentivou em todas as atividades que venho desenvolvendo. Ao André, meu amor e companheiro de todas as horas, pelo incentivo, carinho, paciência e apoio durante essa longa etapa. À minha filha Dora, que nasceu no decorrer desta caminhada e trouxe muita alegria para as nossas vidas. Ao meu sogro, sogra, cunhada, Roberto e Denise pelo apoio, incentivo, hospedagem, carona, busca de material na Univali, rodoviária...... A todos os meus colegas do mestrado, obrigada pelo coleguismo e pelos bons momentos compartilhados durante estes dois anos. Aos professores do PMCF da UNIVALI, pela transmissão do conhecimento e pela amizade. Aos alunos de iniciação científica que participaram deste trabalho tanto na fitoquímica, quanto na farmacologia: Suellen e Douglas Ao pessoal do laboratório e às secretárias do Programa de Mestrado da Univali pela ajuda e amizade. Obrigada também, pelo apoio e incentivo de todos os demais amigos, que se fizeram presentes neste período e que, direta ou indiretamente, contribuíram para que este trabalho fosse concretizado.
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ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS DAS
PARTES AÉREAS DE Garcinia achachairu Rusby (Clusiaceae).
Marlova Manhabosco Dal Molin Abril /2009
Orientador: Rivaldo Niero, PhD. Co-orientador: Nara Lins Meira Quintão, Doutora Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas Número de páginas: 81 Garcinia achachairu Rusby é uma planta pertencente ao gênero Garcinia (ex-Rheedia), conhecida popularmente como “achachairu” e utilizada na medicina popular no tratamento de reumatismo, inflamação e distúrbios gástricos. Algumas das espécies deste gênero apresentam diferentes classes químicas tais como benzofenonas e biflavonóides de grande importância para a indústria farmacêutica. No entanto, poucos estudos científicos são encontrados na literatura tanto da parte química quanto biológica. O presente estudo teve como objetivo isolar e identificar os principais constituintes químicos presentes nas partes aéreas bem como avaliar o potencial biológico de alguns extratos, frações e substâncias puras. Neste sentido, as partes aéreas (sementes, folhas e galhos) foram, secas a foram secas a 40oC e separadamente maceradas em metanol a temperatura ambiente, para obtenção dos respectivos extratos metanólicos brutos (EMB). O EMB das folhas sucessivamente particionado com solventes de polaridade crescente como: hexano, clorofórmio e acetato de etila. Subsequentemente, o EMB sementes e as frações obtidas das folhas, foram submetidos à purificação através de cromatografia em coluna (CC) e monitorados por cromatografia em camada delgada (CCD). Os compostos isolados foram identificados por métodos espectroscópicos convencionais de identificação (IV, RMN-H1 e C13). Os seguintes compostos foram identificados: uma benzofenona prenilada denominada de gutiferona A e dois biflavonóides denominados de GB1a e a Amentoflavona. Os extratos foram avaliados quanto ao seu efeito antiulcerogênico através do experimento da atividade antiulcera induzida por etanol em camundongos. Os extratos, frações e Gutiferona A foram avaliados quanto ao seu efeito antinociceptivo em diferentes modelos experimentais em camundongos. A maioria das amostras avaliadas demostraram perfil analgésico no modelo da acido acético, formalina, capsaicina e glutamato. No entanto, o EMB das sementes apresentou uma DI50 de 13,1mg/Kg e inibição Máxima de 72±4% no modelo de nocicepção induzida pelo acido acético. Neste mesmo modelo, Gutiferona A apresentou uma DI50 de 4,54 (3,29 -6,24) mg/Kg e IM de 73±5%, sendo cerca de cinco vezes mais potente do que a aspirina e o paracetamol, dois medicamentos usados em comparação. Quando avaliado a atividade antiulcerogênica induzida por etanol, todos os extratos metanólicos reduziram estatisticamente a área total ulcerada (ATU) e o índice de lesões ulcerativas (ILU). No entanto, o extrato obtido das sementes foi mais efetivo com inibições de 74,1 e 54,7 % para ATU e ILU, respectivamente. Estas inibições foram similares ao omeprazol, um medicamento usado como controle. Estes em conjunto confirmam o uso de G. achachairu na medicina popular e como uma fonte importante de moléculas bioativas. Palavras-chave: Garcinia achachairu, antinocicepção, antiúlcera, gutiferona A
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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF BIOACTIVE COMPOUNDS
FROM AERIAL PARTS OF GARCINIA ACHACHAIRU RUSBY
(CLUSIACEAE).
Marlova Manhabosco Dal Molin Abril /2009
Supervisor: Rivaldo Niero, PhD. Area of Specialization: Natural Products and Bioactive Substances. Number of pages: 81. Rheedia achachairu Rusby is a plant belonging to the genus Garcinia (ex Rheedia), popularly known as "achachairu" and used in folk medicine to treat rheumatism, inflammation, and gastric disorders. Some of the species of this genus have different chemical classes, such as benzophenone and biflavonoids, which are of great importance to the pharmaceutical industry. However, few scientific studies are found in the literature concerning its phytochemical and biological aspects. The present study aimed to isolate and identify the main chemical constituents present in the aerial parts, and evaluate the biological potential of some extracts, fractions and pure compounds. The aerial parts (seeds, leaves and twigs) were dried at 40oC and separately macerated in methanol at room temperature, to obtain the respective crude methanolic extracts (CME). The CME of leaves was successively partitioned with solvents of increasing polarity, such as hexane, chloroform and ethyl acetate. Subsequently, the CME of seeds and fractions from the leaves were submitted to purification by column chromatography (CC) and monitored by thin-layer chromatography (TLC). The isolated compounds were identified by conventional spectroscopic methods (IR, NMR-1H and 13C). The following compounds were identified: a prenylated benzophenone called Guttiferone A, and two biflavonoids known as GB1a and Amentoflavone. The fractions, extracts and Guttiferone A were evaluated as antiulcerogenic and antinociceptive agents in different experimental models in mice. The majority of the samples tested were active in the formalin, capsaicin and glutamate test. However, the CME-seeds presented ID50 of 13.1 mg / kg and MI of 72 ± 4% in the acetic acid induced nociception model. In the same model, Guttiferone A presented ID50 of 4.54 (3.29 -6.24) mg / kg and inhibition of 73 ± 5%, being about 5-fold more potent than aspirin and paracetamol, two drugs used for comparison. When evaluating the ethanol-induced antiulcerogenic activity, all the methanol extracts statistically inhibited the total ulcerated area (TUA) and the index of ulcerative lesions (IUL). However, the extract obtained from the seeds was more effective, with inhibitions of 74.1 and 54.7% for TUA and IUL, respectively. These inhibitions were similar to omeprazole, a drug used as control. These data confirm the use of G. achachairu in folk medicine and as an important source of bioactive molecules. Kew words: Garcinia achachairu, antinociception, antiulcer, gutifferone A
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 14
2.1 Objetivo Geral: ................................................................................................... 14
2.2 Objetivos Específicos: ...................................................................................... 14
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 15
3.1 Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários ........................ 16
3.1.1 Flavonóides .................................................................................................... 17
3.1.2 Biflavonóides .................................................................................................. 19
3.1.3 Benzofenonas preniladas .............................................................................. 20
3.1.4. Compostos fenólicos .................................................................................... 22
3.2 Sistemática e descrição botânica da Garcinia ................................................ 23
3.2.1 Aspectos químicos e biológicos do gênero Garcínia ................................ 24
3.3 Antinocicepção....................................................................................................27
3.4 Úlcera péptica......................................................................................................29
4 MATERIAL E MÉTODOS. ..................................................................................... 32
4.1 Análise fitoquímica............................................................................................ 32
4.1.1 Material vegetal ............................................................................................. 32
4.1.2 Preparação do extrato metanólico e fracionamento das sementes .......... 32
4.1.3 Preparação do extrato metanólico e fracionamento dos galhos ............... 33
4.1.4 Preparação do extrato e obtenção das frações das folhas ........................ 33
4.1.5 Purificação das frações de hexano e clorofórmio obtidas
das folhas...........................................................................................................33
4.1.6 Elucidação estrutural ..................................................................................... 34
4.1.7 Reagente e equipamentos ............................................................................. 34
4.2 Análise biológica ............................................................................................... 35
4.2.1 Animais ........................................................................................................... 35
4.2.2 Avaliação da atividade antinociceptiva ........................................................ 35
4.2.2.1 Testes das contorções abdominais induzidas pelo ác acético ............... 35
4.2.2.2 Modelo de antinocicepção induzida pela formalina ................................. 36
4.2.2.3 Antinocicepção induzida pela capsaicina ................................................. 36
4.2.2.4 Antinocicepção induzida pelo glutamato .................................................. 37
6
4.2.3 Avaliação da atividade antiúlcera ................................................................. 37
4.2.3.1 Úlcera induzida por metanol ...................................................................... 37
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................... 38
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 39
5.1 Purificação e isolamento dos constituíntes das sementes ........................... 39
5.2 Purificação e isolamento dos compostos das folhas .................................... 45
5.3 Avaliação da atividade farmacologica.............................................................48
5.3.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ác acético....................48
5.3.2 Modelo de antinocicepção induzido pela formalina....................................55
5.3.3 Modelo de antinocicepção induzido pela capsaicina..................................61
5.3.3 Modelo de antinocicepção induzido pelo glutamato...................................63
5.4 Avaliação da atividade antiúlcera.....................................................................65
6.0 Conclusões.........................................................................................................71
REFERÊNCIAS..........................................................................................................72
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 01:
Estrutura base dos principais flavonóides..................................... 18
Figura 02:
Biflavonóides................................................................................. 20
Figura 03: Benzofenonas tipo I.......................................................................
21
Figura 04
Benzofenonas tipo II...................................................................... 22
Figura 05: Partes aéreas, folhas, sementes, flores e fruto da G. achachairu
24
Figura 06:
Estrutura química de compostos isolados das plantas do
Gênero Garcinia............................................................................
27
Figura 07: Resumo das operações realizadas na obtenção do extrato das
sementes da Garcinia achachairu ................................................
32
Figura 08: Esquema do preparo do extrato das folhas da G. achachairu .....
33
Figura 09: Resumo das operações realizadas no processo de purificação
com o extrato metanólico obtido das sementes ...........................
39
Figura 10: Estrutura química da Gutiferona A ...............................................
40
Figura 11: Espectro RMN H1 ampliado de 7,5 a 4,5 ppm da substância
GA 51-120. ...................................................................................
41
Figura 12: Espectro RMN H1 ampliado de 2,9 a 1,4 ppm da substância
GA 51-120 ....................................................................................
41
Figura 13: Espectro de RMN-C13 (CDCl3, 75 MHz) ampliado de 210 a 190
ppm da substância GA 51-120 .....................................................
42
Figura 14: Espectro de RMN-C13 (CDCl3, 75 MHz) ampliado de 152 a 114
ppm da substância GA 51-120 .....................................................
43
Figura 15: Espectro de RMN-C13 (CDCl3, 75 MHz) ampliado de 75 a 15
ppm da substância GA 51-120......................................................
43
Figura 16: Resumo das operações realizadas com a fração clorofórmio ...... 46
Figura 17: Estrutura química da amentoflavona e GB1 a ............................... 47
Figura 18: Efeito antinociceptivo do extrato metanólico das sementes sobre
o no de contorções induzida por ácido acético .............................
49
Figura 19: Efeito antinociceptivo do extrato metanólico das folhas sobre o
no de contorções induzida por ácido acético ................................
50
8
Figura 20: Efeito antinociceptivo do extrato metanólico dos galhos sobre a
dor induzida por ácido acético. .....................................................
51
Figura 21: Efeito da fração hexânica das folhas sobre a dor induzida por
ácido acético ................................................................................
52
Figura 22: Efeito da fração clorofórmio das folhas sobre a dor induzida por
ácido acético ..............................................................................
53
Figura 23: Efeito da fração acetato de etila das folhas sobre a dor induzida
por ácido acético ........................................................................
53
Figura 24: Efeito antinociceptivo da gutiferona A sobre a dor induzida por
ácido acético .................................................................................
55
Figura 25: Efeito antinociceptivo do extrato metanólico dos galhos sobre a
dor induzida por formalina .........................................................
56
Figura 26: Efeito antinociceptivo do extrato metanólico das sementes sobre
a dor induzida por formalina .........................................................
57
Figura 27: Efeito antinociceptivo do extrato metanólico das folhas sobre a
dor induzida por formalina .........................................................
58
Figura 28: Efeito antinociceptivo das frações acetato de etila, hexânica, e
clorofórmica da Garcinia achachairu sobre a dor induzida por
formalina .......................................................................................
59
Figura 29: Efeito antinociceptivo da gutiferona A sobre a dor induzida por
formalina .......................................................................................
60
Figura 30: Efeito do extrato metanólico da semente, dos galhos e das
folhas da R. achachairu sobre a dor induzida pela capsaicina.....
62
Figura 31: Efeito da gutiferona A sobre a dor induzida pela capsaicina ........ 63
Figura 32: Efeito antinociceptivo dos galhos, semente e folhas sobre a dor
induzida por glutamato .................................................................
64
Figura 33: Efeito antinociceptivo da gutiferona A sobre a dor induzida pelo
glutamato ......................................................................................
65
Figura 34: Área total de lesão ulcerada induzida por etanol absoluto em
animais tratados com extrato metanólico das sementes, folhas,
galhos e omeprazol .....................................................................
66
Figura 35: Índice percentual de área ulcerada induzida por etanol absoluto
em animais tratados com extrato metanólico das sementes,
67
9
folhas, galhos e omeprazol...........................................................
Figura 36: Índice de lesão ulcerativa induzida úlcera por etanol absoluto
em animais tratados com extrato metanólico das sementes,
folhas, galhos e omeprazol ..........................................................
67
Figura 37: Índice percentual de área ulcerada induzida por etanol absoluto
em animais tratados com extrato metanólico das sementes em
dosagens de 50, 250 e 500 mg/Kg e omeprazol...........................
69
Figura 38: Área total de lesão ulcerada induzida por etanol absoluto em
animais tratados com extrato metanólico das sementes em
dosagens de 50, 250 e 500 mg/Kg e omeprazol...........................
69
Figura 39: Índice de lesão ulcerativa induzido por etanol absoluto em
animais tratados com extrato metanólico das sementes em
dosagens de 50, 250 e 500 mg/Kg e omeprazol...........................
70
10
LISTA DE TABELAS: Tabela 1: Plantas com atividade antiinflamatória confirmada por
estudos científicos...................................................................
29
Tabela 2: Valores de deslocamento químicos (em ppm) de RMN 1H e
13C comparativos com a literatura da gutiferona A.................
44
Tabela 3: Valores de deslocamento químicos (em ppm) de RMN 1H e
13C comparativos com a literatura da amentoflavona e GB1a.
47
Tabela 4: Comparativo da atividade antinociceptiva do extrato
metanólico, da fração hexânica e clorofórmica do extrato
das folhas da G. achachairu, paracetamol e aspirina no
modelo de dor abdominal induzida por ácido acético. ...........
54
11
LISTA DE ABREVIATURAS: C- Controle
CC- Cromatografia de coluna
CCD- Cromatografia em camada delgada
COX- ciclooxigenase
DI50- dose que reduziu em 50 % a resposta quando comparado ao controle
Ext- Extrato
FO- Folhas
Fr- Fração
GA- Galhos
GA- Garcinia achachairu
HCA- Ácido hidroxicítrico
HCA-SX- sal do ácido hidroxicítrico
HIS- histamina
Ig- imunoglobulina
IM- Inibição máxima
ip- intraperitoneal
IV- Infravermelho
LT- leucotrieno
MeOH- Metanol
NF-kB- fator nuclear-kB
PGE2- prostaglandina E2
RMN-13C- Ressonância magnética nuclear do isótopo carbono 13
RMN-1H- Ressonância magnética nuclear do hidrogênio
SE- Semente
TGI- Trato gastrointestinal
TNF- fator de necrose tumoral
ILU- Índice de lesão ulcerativa
UV- Ultravioleta
12
1 INTRODUÇÃO
Os produtos naturais serviram historicamente como a mais significativa fonte
de novas moléculas para o desenvolvimento farmacêutico (JAMES; SYLESH; JOHN,
2007). A busca pela cura de doenças através da ingestão de ervas e folhas tem sido
uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais. A história do
desenvolvimento das civilizações apresenta vários exemplos da utilização de recursos
naturais na medicina, no controle de pragas e em mecanismos de defesa (VIEGAS Jr;
BOLZANI; BARREIRO, 2006).
O conhecimento a respeito das plantas medicinais ainda é o único recurso
terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos nas regiões mais pobres do
país. Mesmo nas grandes cidades brasileiras, é comum a comercialização de plantas
em feiras livres, mercados populares e em quintais residenciais (VEIGA Jr; PINTO;
MACIEL, 2005). A utilização de plantas medicinais tornou-se um recurso terapêutico
alternativo de grande aceitação pela população. Há um crescimento junto à
comunidade médica, desde que sejam utilizadas plantas cujas atividades biológicas
tenham sido investigadas cientificamente, comprovando sua eficácia e segurança
(CECHINEL FILHO; YUNES, 1998; NIERO et al., 2003).
A natureza, de uma forma geral, produz a maioria das substâncias orgânicas
conhecidas. Dentre os diversos reinos, o vegetal contribui de forma bastante
significativa para o fornecimento de metabólitos secundários, muitos desses de
grande valor agregado devido às suas aplicações como medicamentos, cosméticos,
alimentos e agroquímicos. Muitas dessas substâncias servem como protótipos para o
desenvolvimento de medicamentos semi-sintéticos mais específicos e seletivos
(PINTO et al., 2002).
Diversos fatores como variações temporais, bem como as proporções relativas
de metabólitos secundários em plantas ocorrem em diferentes níveis (sazonais e
diárias; intraplanta, inter e intraespecífica) e, apesar da existência de um controle
genético, podem sofrer modificações resultantes da interação de processos
bioquímicos, fisiológicos, ecológicos e evolutivos. Os metabólitos secundários
representam uma interface química entre as plantas e o ambiente circundante,
portanto, sua síntese é freqüentemente afetada por condições ambientais (GOBBO
NETO; LOPES, 2007).
13
Mesmo levando em conta estes fatores, uma breve busca na literatura mostra
que a pesquisa em produtos naturais, de uma maneira ou de outra está viva e ativa
em função de se obter estruturas privilegiadas levando a descoberta de novos
medicamentos genuinamente naturais (KINGSTON; NEWMAN, 2005; NEWMAN;
GRAGG, 2007).
Neste aspecto, este trabalho é de suma importância não só pela possibilidade
da inclusão de uma nova espécie no rol de plantas a serem pesquisadas, mas na
obtenção de novas substâncias, com grande possibilidade de servirem como
protótipos de novos medicamentos. Apesar da importância da aplicabilidade
terapêutica, poucas plantas são cientificamente estudadas por isso a importância de
testar o uso popular desta espécie através de modelos experimentais de
antinocicepção e atividade antiúlcera, uma vez que esta é utilizada em tratamentos de
úlcera gástrica, reumatismo e inflamação.
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Isolar, identificar e analisar as atividades antinociceptiva e antiúlcera de
extratos, frações e um composto isolado obtido das sementes da Garcinia
achachairu.
2.2 Objetivos Específicos:
Preparar um extrato metanólico das partes aéreas (sementes, folhas e
galhos) da G. achachairu mediante maceração.
Fracionar o extrato metanólico das folhas através da extração líquido-líquido
usando solventes de polaridade crescente.
Isolar através de métodos cromatográficos os principais metabólitos presentes
no extrato metanólico das partes aéreas da G. achachairu.
Identificar os componentes isolados, através de técnicas espectroscópicas.
Avaliar a atividade antinociceptiva de extratos, frações e substância pura
através de diferentes modelos experimentais de nocicepção em
camundongos.
Avaliar a atividade antiúlcera dos extratos, no modelo de úlcera gástrica,
induzida por etanol em animais.
15
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Diversas formas de preparados naturais vêm sendo usados pela medicina
tradicional contra os mais variados distúrbios, a mais de 7000 anos, principalmente
no que se refere a processos dolorosos (McCURDY; SCULLY, 2005). Os estudos
clínicos, farmacológicos e químicos deste tipo de medicina alternativa eram
derivados principalmente de plantas, as quais foram fonte da maioria dos
medicamentos lançados no mercado. Alguns exemplos mais importantes são a
aspirina, digoxina, morfina, paclitaxel, quinina e a pilocarpina (BUTLER, 2004;
BUTLER, 2005; BUTLER; BUSS, 2006). Na década de 80 a indústria farmacêutica
passou por um estado estacionário quanto à introdução de novos fármacos no
mercado. Nesta década houve uma explosão no que se referem a ensaios
monitorados, modelos computacionais baseados em receptores e a química
combinatória (SAMS-DODD, 2005; KINGSTON; NEWMAN, 2005).
Dos 250 medicamentos considerados como básicos e essenciais pela
Organização Mundial da Saúde (OMS), 11% são exclusivamente obtidos de plantas
medicinais. Sendo que este número pode chegar a 50% se considerarmos fármacos
semi-sintéticos obtidos a partir de fonte natural (VUORELA et al., 2004; CHIN et al.,
2006). Dados da literatura especializada mostram que 61% das 877 moléculas
conhecidas como Novas Entidades Químicas (NEQ), entre 1981 e 2002, foram
oriundas de produtos naturais ou derivados destes (NEWMAN; CRAGG; SNADER,
2003). Recentemente, estes autores chamaram a atenção para a importância das
estruturas obtidas de fontes naturais bem como a modificação estrutural. Segundo
eles, embora a química combinatória seja uma técnica de otimização estrutural
relativamente rápida e com possibilidade de obter inúmeras substâncias, dos 25
produtos lançados no mercado farmacêutico nos últimos anos, apenas um foi
derivado desta técnica (NEWMAN; CRAGG, 2007).
O potencial das plantas como fonte de pesquisa na busca de novos
medicamentos, com novos modos de ação, alta seletividade e atividade, é ainda
pouco estudado, uma vez que, entre as cercas de 500 mil espécies de plantas
existentes no planeta, somente uma pequena porcentagem tem sido investigada
fitoquímica e biologicamente e, menos de 250 mil espécies tem sido caracterizadas
com relação aos metabólitos secundários (KOEHN; CARTER, 2005, NEWMAN;
16
GRAGG, 2007, SCHMIDT et al., 2008). Aliado a este fato, estão os estudos
realizados em nossos laboratórios, onde algumas espécies encontradas na flora
catarinense têm apresentado importantes efeitos farmacológicos em diferentes
modelos experimentais (PAMPLONA et al., 2006; NIERO et al., 2006; SERAFIN et
al., 2007; KANEGUSUKU et al., 2007).
3.1 Metabolismo básico e origem dos metabólitos secundários
No interior de todos os organismos ocorrem reações bioquímicas que
permitem a sua subsistência, através da decomposição e transformação de
substâncias para a produção de energia necessária a vida. O metabolismo é o
conjunto dessas reações. Nos vegetais foi convencionada a divisão do metabolismo
em primário e secundário. O metabolismo primário é aquele responsável pela
produção de substâncias essenciais a vida das plantas, como aminoácidos,
proteínas, lipídeos. As substâncias produzidas com outras finalidades como, por
exemplo, alcalóides, flavonóides, taninos e outros, são considerados metabólitos
secundários (WINK, 1990). Desde o estabelecimento dessa classificação há muita
discusssão sobre a função dos metabólitos secundários, já que estes não são
essenciais à manutenção da vida. Várias hipóteses já foram levantadas, algumas
demonstradas e outras que carecem de comprovação. Nesse contexto, as
generalizações parecem ser insuficientes para explicar a complexidade das
interações químicas, biológicas e ecológicas que envolvem a produção dos
metabólitos vegetais. Algumas hipóteses listadas na literatura são apresentadas a
seguir:
Defesa contra herbívoros e microorganismos: Exemplo dos taninos que conferem
gosto adstringente a tronco de arvores e frutas verdes, afastando os herbívoros.
Algumas substâncias produzidas pelas plantas após lesão de seus tecidos
apresentam atividade bacteriostática e fungiostática (SANTOS, 2004).
Proteção contra os raios UV: Por exemplo, os flavonóides que absorvem
intensamente a radiação ultravioleta e dessa forma poderiam impedir danos as
células vegetais resultantes da exposição a essa radiação (SANTOS, 2004).
Atração de polinizadores ou dispersores de semente: Alguns compostos
fenólicos são mais visíveis para os insetos e os guiam em direção aos órgãos
17
reprodutivos, bem como os óleos essenciais que os atraem devido ao cheiro que
exalam , auxiliando na polinização (SANTOS, 2004).
O estudo do metabolismo secundário torna-se, nesse contexto, importante
para compreender a produção e degradação de compostos pelos vegetais. O
entendimento das variáveis envolvidas poderá ser o primeiro passo para a
compreensão das variações edafoclimáticas, verificadas para os vegetais, e
permitirá o estudo de mecanismos capazes de direcionar a biossíntese para a
obtenção de compostos de interesse do ponto de vista qualitativo e quantitativo
(SANTOS, 2004).
3.1.1 Flavonóides
Os flavonóides representam um dos grupos fenólicos mais importantes e
diversificados entre os produtos de origem natural. São facilmente encontrados nas
plantas, estão presentes em abundância na família Clusiaceae, apresentando neste
grupo enorme diversidade estrutural. São conhecidos cerca de 4200 flavonóides
diferentes, sendo que o número de novas estruturas dobrou nos últimos 20 anos
(ZUANAZZI, 2002; COMPAGNONE et al, 2008).
Os flavonóides podem ser definidos como uma classe de metabólitos
secundários de plantas, que derivam da condensação de uma molécula de ácido
cinâmico com três grupos malonil-CoA. São pigmentos naturais presentes nos
vegetais que desempenham papel fundamental na proteção contra agentes
oxidantes (raios ultravioletas, poluição ambiental, substâncias químicas) e atuam
como agentes terapêuticos em um elevado número de patologias (MARTINEZ-
FLORES et al, 2002; TAPAS; SAKARKAR; KARDE, 2008).
Os flavonóides são compostos que apresentam como estrutura base 15
átomos de carbono, com um esqueleto C6-C3-C6 (dois anéis fenil – A e B – ligados
através de um anel pirano – C).
Dependendo da substituição e do nível de oxidação do anel C3, os
flavonóides podem ser divididos em 14 classes (DI CARLO et al, 1999; MARTINEZ-
FLOREZ et al, 2002). A Figura 1 mostra alguns exemplos como os flavanóis que
possuem um grupo hidroxila na posição 3 e um grupo carbonila na posição 4. Os
flavonóis possuem um grupo carbonila na posição 4, um grupo hidroxila na posição
3 e uma ligação dupla entre as posições 2 e 3. As flavonas possuem um grupo
18
carbonila na posição 4 e uma ligação dupla entre as posições 2, 3. Já as
antocianidinas possuem um grupo hidroxila na posição 3 e duas ligações duplas
uma entre o átomo de oxigênio e o carbono 2 e outra entre os carbonos 3 e 4. Os
isoflavonóis possuem um grupo carbonila na posição 4 e o anel B encontra-se ligado
ao restante da molécula através do carbono 3, podem possuir ainda uma dupla entre
os carbonos 2 e 3 (Figura 1). Dentro da mesma classe os flavonóides ainda diferem
na substituição dos anéis A e B (PIETTA, 2000; TAPAS; SAKARKAR; KARDE,
2008).
O O
O
OH
O
O
OH
O
O
O
OH
O
O
A C
B
1
2
3
45
6
7
8
1'
2' 3'
4'
5'6'
A C
B
1
2
345
6
7
8
1'
2' 3'
4'
5'6'
FlavonóidesFlavonóis
A C
B
1
2
345
6
7
8
1'
2' 3'
4'
5'6'
Flavonóis
A C
B
1
2
345
6
7
8
1'
2' 3'
4'
5'6'
Flavonas
A C
B2
345
6
7
8
1'
2' 3'
4'
5'6'
+
Antocianidinas
A C
2
345
6
7
8
Isoflavonóides
Figura 1- Estrutura base dos principais flavonóides.
Atualmente existe um grande interesse no estudo de antioxidantes, devido às
descobertas sobre o efeito dos radicais livres no organismo. Estes são produzidos
naturalmente ou por alguma disfunção biológica. O excesso de radicais livres é
19
combatido por antioxidantes produzidos pelo corpo ou absorvidos na dieta tais como
vitamina E, pró-vitamina A, vitamina C e compostos fenólicos, onde se destacam os
flavonóides e os poliflavonóides (PIETTA, 2000; GUERRERO et al, 2007).
Pesquisas in vitro e in vivo, estudos epidemiológicos e ensaios clínicos,
realizados com este grupo de metabólitos secundários, indicam que eles possuem
importantes efeitos como quimiopreventivos e quimioterápicos. Seus mecanismos de
ação incluem desativação de carcinógenos, efeito antiproliferativo, arresto da divisão
celular, indução da apoptose e da diferenciação, inibição da angiogênese, reversão
da resistência a multidrogas ou uma combinação destes mecanismos. Com base
nestes resultados os flavonóides podem ser considerados promissores agentes anti-
cancer (REN et al, 2003). Em países asiáticos onde a dieta é rica em vegetais, frutas
e chá, o risco de contrair alguns tipos de câncer é menor que no Ocidente, sendo
que uma dieta rica em flavonóides atuaria como quimiopreventivo do câncer
(KANADASWAMI et al, 2005).
Muitas informações demonstram também a potência antiinflamatória dos
flavonóides, uma vez que é necessário encontrar substâncias com vantagens sobre
os antiinflamatórios não esteroidais clássicos, sendo assim os flavonóides
apresentam uma alta margem de segurança, sem os efeitos ulcerogênicos de outras
drogas antiinflamatórias (DI CARLO et al, 1999; KIM et al, 2004).
3.1.2 Biflavonóides
Os biflavonóides pertencem a uma subclasse dos flavonóides, e sua
distribuição no reino vegetal é limitado a algumas espécies. Estas estruturas podem
ser formadas a partir de diversas combinações de flavonóides que podem ser
idênticos ou não, sendo os mais comuns aqueles compostos que apresentam as
ligações entre as flavonas (ligação dupla entre C2 e C3) e as flavanonas (ligação
simples entre C2 e C3), ou uma combinação entre ambos, tais como:
flavanona-flavona, flavona- flavonol que podem estar ligadas através de ligações C-
C ou C-O-C (Figura 2)(KIM et al., 2008).
20
Figura 2- Estrutura química de dois biflavonóides
A ginkgetin foi o primeiro biflavonóide, isolado de Ginkgo biloba, sendo que
atualmente existem mais de 100 biflavonóides isolados das plantas, sendo que a
amentoflavona e o ginkgetin são os biflavonóides mais comuns (KUROSHIMA,
2002).
Estas substâncias apresentam diversas atividades farmacológicas como
antibacterianos, antifúngicos, antialérgicos, antivirais e anticancerígenos, utilizados
para diversos fins, com testes farmacológicos testados e comprovados. Alguns
biflavonóides, possuem atividade analgésica o que pode levar ao desenvolvimento
de melhores agentes anti–inflamatórios (KIM et al., 2008).
3.1.3 Benzofenonas preniladas
As benzofenonas poliisopreniladas e outras estruturas benzofenônicas do tipo
2,4,6-triidroxi-benzofenonas e alquil-aril-cetonas poliisopreniladas foram isoladas nos
gêneros Garcinia, Clusia e Rheedia (subfamília Clusioideae), em diversos órgãos
das plantas. Embora alguns compostos pertencentes a esta classe venha mostrando
atividades contra diversos tipos de microrganismos, nenhuma síntese total destas
estruturas mais complexas (possuindo o anel biciclo[3.3.1]nonano) foi proposta. Até
o presente momento o que se tem disponível na literatura é somente a síntese da
grandona, uma benzofenona de estrutura simples, também conhecida como
benzolupofenona (MACHADO, 2002)
Já existe um número considerável de benzofenonas poliisopreniladas
divididas em dois grandes grupos: um representado por estruturas mais simples do
tipo I (sendo R1, R2 e R3 resíduos de isopentenil e R4 um resíduo de benzoil), e
outro representado por estruturas mais complexas possuindo o anel
21
biciclo[3.3.1]nonano do tipo II (sendo R1, R2, R3 e R4 três resíduos de isopentenil e
um de benzoil). Ambos os grupos estão representados nas Figuras 3 e 4.
Benzofenonas preniladas tem demonstrado possuir diferentes propriedades
biológicas, tais como: citoproteção contra o HIV in vitro, propriedades
antimicrobianas, atividade antioxidante e citotóxica (LENTA et al 2007).
Figura 3- Benzofenonas possuindo estruturas do tipo I e possíveis enol-éteres metílicos isoméricos.
22
Figura 4- Benzofenonas possuindo estruturas do tipo II e possíveis enol-éteres metílicos isoméricos.
3.1.4 Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos englobam uma série de substâncias, em geral de
ampla distribuição e origem biossintética nem sempre idêntica. Sua característica
comum é a presença do núcleo fenólico. Em geral estes compostos apresentam
mais de uma hidroxila ligada ao anel benzênico, sendo também chamados de
polifenóis. Apresentam como funções fisiológicas nos vegetais atividades de defesa,
incluindo a inibição do crescimento de fungos e de plantas em geral. Para alguns há
relatos de supressão do apetite de insetos e também da inibição da germinação de
sementes. Muitos compostos fenólicos simples, seus heterosídeos ou ésteres são
responsáveis pelo odor e sabor dos vegetais. Como exemplos, podem ser citados o
aldeído cinâmico, responsável pelo odor da canela (Cinnmomum zellanicum) e a
vanilina (Vanilla planifólia) (CARVALHO; GOSMANN; SHENKEL, 2004).
Para vários desses derivados tem sido relatada atividade antioxidante. A partir
dessa constatação, tem sido formulada a hipótese de que a ingestão de
antioxidantes na dieta pode retardar ou mesmo impedir o desenvolvimento de
doenças relacionadas a processos oxidativos (LARSOM, 1998; GUGLIUCCI, 1996;
YEN; CHEN; PENG, 1997; CICERALE, 2009). Alguns ésteres do ácido caféico como
23
o equinacosídeo (Equinacea ssp) e plantamajosídeo (Plantago major) têm
demonstrado atividade antibacteriana e antiviral. Para heterosídeos do cafeico
apresentaram inibição seletiva da lipoxigenase, relacionada à biossíntese dos
leucotrienos e esses a modulação imunológica (KIMURA et al, 1987; CARVALHO;
GOSMANN; SCHENKEL, 2004)
3.2 Sistemática e descrição botânica da Garcinia achachairu
O Gênero Garcinia denominado anteriormente de Rheedia, pertence à família
Clusiaceae a qual possui aproximadamente 1350 espécies (ALMEIDA et al., 2008).
Com a recente mudança do gênero Rheedia para Garcínia, estabeleceu-se certa
confusão na nomenclatura das dezenas de espécies conhecidas. Isso porque alguns
autores ainda usam o termo Rheedia para algumas frutíferas nativas e exóticas
existentes em várias regiões mundiais (BARBOSA et al., 2008). Algumas espécies
são de grande importância para a indústria farmacêutica, dada a presença de
substâncias químicas como biflavanóides e benzofenonas com relevantes atividades
antiinflamatória, antioxidante e anticancerígena (REUTRAKUL et al., 2007;
PHONGPAICHIT et al., 2006; JUNG et al., 2006; PANTHONG et al., 2007).
Garcinia achachairu Rusby conhecida como “achacahairú” é oriunda da
região de Santa Cruz - Bolívia e muito bem adaptada em nossa região. As plantas
desta família são angiospermas caracterizadas pela presença significativa de látex
na maioria de suas espécies. Na medicina popular, os frutos e folhas são utilizados
como cicatrizantes, digestivos e laxantes e em tratamentos de reumatismo, úlcera
gástrica e inflamação (ALVES et al., 2000; BARBOSA; ARTIOLE, 2007) por esta
razão o trabalho foi direcionado para avaliar a atividade antinociceptiva e antiulcera
desta planta. Os frutos são globoso-oblongos com massa média de 30g,
semelhantes a uma nêspera, com diâmetros transversais e longitudinais de 35,8mm
e 45,2mm respectivamente. A base peduncular do fruto é estreita e a calicinal mais
larga. São amarelo-alaranjados, com casca grossa (3,5 mm), lisa, firme e resistente;
internamente a casca é creme-palha. A polpa, não aderente à casca, é branca,
suculenta e de textura mucilaginosa, representando 1/3 da massa média do fruto,
sendo que após retirada dos frutos se oxida rapidamente (Figura 5). No Brasil, o
achachairú é pouco conhecido e, às vezes, confundido pelo público leigo como
frutas de outras espécies, como o bacupari, bacuripari e bacurizinho. Embora seus
24
frutos sejam comercializados na Bolívia e em grande parte do nordeste brasileiro,
raros são os estudos científicos sobre esta espécie (BARBOSA; ARTIOLE, 2007).
A B
Figura 5 – Fotografia das diferentes partes da Garcinia achachairu - A = partes aéreas; B e C = folhas
e frutos; D = sementes; E = flores; F = fruto. Fonte: autor
3.2.1 Aspectos químicos e biológicos do gênero Garcinia
O gênero Garcinia tem demonstrado pelos estudos químicos, ser possuidor
de uma grande diversidade de classes estruturais, como benzofenonas
poliisopreniladas, flavonóides, cumarinas e xantonas (TAHER et al., 2005). A
avaliação de atividade biológica, de compostos isolados de espécies da família
Clusiaceae, tem possibilitado a identificação de moléculas potencialmente capazes
de interferir na atividade celular de diferentes organismos tais como: fungos,
bactérias, vírus, protozoários e de células tumorais humanas (MARQUES; EL-
BACHA; CRUZ, 2009)
Dentre os estudos já realizados com algumas espécies, podemos destacar os
estudos fitoquímicos com o extrato metanólico dos frutos de Garcínia xantochymus,
no qual foram extraídas duas novas benzofenonas denominadas de guttiferona H e
gambogenona (Figura 6). Estes compostos induziram apoptose em células
D
C
E F
25
cancerígenas de cólon (SW-480) e também apresentaram atividade antioxidante
(BAGGETT et al., 2005). Da espécie Garcinia subellíptica, foi isolado dois novos
compostos, uma benzofenona denominada garcinialliptona FA (Figura 6) e uma
benzoilfluoroglucinol denominada garcinialliptona FB. Estes compostos exibiram
atividade citotóxica contra células cancerígenas humanas (WUU et al., 2005). Da
espécie G. virgata, Merza e cols (2006) isolaram duas novas guttiferonas,
denominadas guttiferona I (Figura 6) e J, além de outros compostos já conhecidos
tais como guttiferona E e xantoximol. Estas benzofenonas apresentaram atividade
citotóxica em células da linhagem KB com valores de IC 50 de 4,70 e 5,0 µg/ml,
respectivamente.
Um ensaio bioguiado mais recente realizado com as frações obtidas do
extrato etanólico da Garcinia calcícola, evidenciou a presença de dois novos
derivados da guttiferona, a guttiferona K e L (Figura 6). Ambas apresentaram
atividade antiproliferativa em células cancerígenas humanas do ovário (CAO et al.,
2007).
Uma das espécies mais utilizada pela população é a Garcinia Camboja, esta
planta é nativa da Índia e considerada importante fonte natural de ácido hidroxicítrico
(HCA). Esta substância é um potente inibidor da enzima ATP citrato liase, a qual
catalisa a clivagem extramitocondrial do citrato para a formação de oxaloacetato e
acetil-CoA. A inibição desta reação limita a disponibilidade de acetil CoA, necessário
para a síntese de ácidos graxos e para a lipogênese, especialmente sob dietas
hipercalóricas. Neste contexto, estudos experimentais indicam que o HCA inibibe a
síntese de ácidos graxos, a ingestão de alimentos e, conseqüentemente, leva a
perda de peso (JENA et al, 2002). Estudos realizados por Martins e cols, 2006
comprovaram a eficácia da G. camboja na redução do peso corporal. Outro estudo
realizado com um extrato etanólico das sementes da G. camboja testados em ratos
Wister demostrou o efeito anti obesidade desta espécie (OLUYEMI et al., 2007).
Super Citrimax (HCA-SX) é um novo sal do ácido hidroxicítrico extraído das
frutas secas da G. camboja. Um estudo investigou os efeitos do HCA-SX na
inflamação, no stress oxidativo e na resistência a insulina em ratos Zucker obesos.
Os resultados sugeriram que a suplementação com HCA-SX reduziu a
ingestão de comida, o peso corporal e também atenuou a inflamação, o stress
oxidativo e a resistência à insulina nestes animais (ASGHAR et al., 2007).
26
Dentre as espécies já estudadas podemos também citar Reedhia gardneriana
(atualmente Garcinia gardneriana) da qual já foi isolado quatro biflavonóides
denominados de volkensiflavona, I 3-naringenina-II8-eriodicito, fukugetina e
fukugisideo (Figura 6), os quais tem apresentado promissores efeitos analgésicos
em diferentes modelos experimentais em camundongos (CECHINEL FILHO et al.,
2000; GIRARDI et al., 2005; CASTARDO et al, 2008).
Outras espécies também já estudadas foram a Garcinia intermédia, Garcinia
brasiliense e a Symphonia globulífera, das quais foi isolado a gutiferona A, com
atividade anti-HIV (MARTINS et al, 2007).
27
Figura 6 - Estrutura química de alguns compostos isolados de plantas do Gênero Garcinia.
3.3 Antinocicepção
O nosso organismo tem vários mecanismos que são responsáveis pelo
controle da homeostasia, a dor desempenha um papel de destaque, uma vez que
atua como mecanismo de alerta do corpo (WALL, 1999). A dor foi definida pela
Associação Internacional para o Estudo da Dor como sendo “uma experiência
emocional e sensorial desagradável associada com uma lesão tecidual real ou
potencial ou descrita em termos de tal lesão” (LOESER; MELZACK, 1999).
Entretanto, a dor é uma experiência complexa e não envolve apenas a transdução
do estímulo nocivo, mas também processos emocionais e cognitivos em nosso
cérebro (JULIUS; BASBAUM, 2001).
Uma distinção entra a dor e a nocicepção se faz necessário, portanto
nocicepção é o mecanismo pelo qual os estímulos periféricos nocivos são
28
transmitidos ao sistema nervosos central (DICKENSON; BESSON, 1997). Por outro
lado a dor envolve tanto o componente sensorial como o emocional e racional
associados aos quadros dolorosos, a dor é uma experiência subjetiva, nem sempre
associada com nocicepção (COUTAX et al., 2005).
Os receptores da dor são os principais órgãos dos sentidos periféricos que
respondem aos estímulos nocivos. A atividade no nociceptor, a via nociceptiva e os
processos neurofisiológicos induzidos pelo estímulo nervoso é chamado de
nocicepção (DICKENSON; BESSON, 1997).
A duração do episódio da dor pode ser agudo, crônico ou transitório. Na dor
aguda ocorrem ativação e dano dos nociceptores na região envolvida com a lesão.
Se persistir mais que alguns dias ou semanas passa a ser considerada dor crônica.
Neste processo a dor é causada por um dano tecidual ou por uma patologia, sendo
também mantida por outros fatores metabólicos que não os gerados no início do
processo doloroso, portanto a dor crônica pode permanecer mesmo depois da
recuperação do indivíduo (LOSER; MELZACK, 1999). Na dor transitória, não ocorre
qualquer dano tecidual, porém outros fatores podem ativar os nociceptores (MILLAN,
1999).
A dor pode ser provocada por múltiplos tipos de estímulos, como estímulos
dolorosos mecânicos, térmicos e químicos. Geralmente a dor rápida é provocada por
estímulos mecânicos e térmicos, enquanto que a dor lenta pode ser provocada pelos
três tipos de estímulos. Embora todos os receptores da dor serem terminações
nervosas livres, eles utilizam duas vias diferentes para a transmissão dos sinais de
dor para o sistema nervoso central, que são a via da dor rápida aguda e a via da dor
lenta-crônica. Os sinais da dor aguda são transmitidos pelos nervos periféricos, para
a medula espinhal, pelas pequenas fibras Aδ, com velocidade entre 6 e 30 m/s, e a
dor do tipo lenta-crônica é transmitida pelas fibras do tipo C, com velocidade de 0,5 a
2 m/s (GUYTON ; HALL, 2002).
Muitas plantas na qual a indicação popular aborda a resposta inflamatória são
alvos para o estudo de novos tratamentos terapêuticos para esta área. O uso
popular é muitas vezes confirmado pelos resultados das pesquisas científicas, como
pode ser observado com os exemplos citados na tabela abaixo: (CASTARDO, 2007).
29
Tabela 1: Plantas com atividade antiinflamatória confirmada por estudos científicos.
Planta
Nome científico
Atividades
confirmadas
Mecanismo de
ação
Salgueiro
Salix spp
Analgésico e antipirético.
Inibe as isoformas 1 e 2 da COX.
Gengibre
Zingiber officinale Roscoe
Antiinflamatório, antiemético, analgésico, antitumoral, antioxidante.
Inibe as isoformas 1 e 2 da COX, a síntese de LT e de TNF-α.
Picão
Bidens pilosa L.
Imunossupressor e antiinflamatório.
Inibe a liberação de HIS pelos mastócitos, a produção de IgE, e permite a permeabilidade vascular.
Unha-de-gato
Uncaria tomentosa
Atividade antiinflamatória na asma e artrite.
Impede a ativação do NF-kB, e a produção de TNF- _ e PGE2. Possui ação antioxidante e captadora de radicais livres.
Garra-do-diabo
Harpagophytum procumbens
Antiinflamatório e analgésico.
Inibe a produção de eicosanóides, principalmente dos cisteinil-LT.
CASTARDO, 2007
3.4 Úlcera péptica
O trato gastrointestinal (TGI) tem como função a obtenção de nutrientes para
a manutenção e bom funcionamento das células. O estômago um dos segmentos
proximais do TGI está dividido em quatro regiões anatômicas: cárdia, fundo, corpo e
antro. A sua superfície é constituída por células epiteliais, por células parietais,
principais, enterocromafins-like e células G (KUTCHAI, 1996).
30
As células parietais são secretoras de ácido, as células principais secretam o
pepsinogênio, estão localizadas no fundo e no corpo, enquanto que as células G,
produtoras de gastrina estão no antro. O suco gástrico normal é uma mistura de
secreção parietal (ácido e fator intrínseco) e secreções não parietais (muco,
bicarbonato, Na+, K+ e pepsinogênio).
Nas ultimas décadas, tem sido observado que a úlceras pépticas, não
dependem somente da acidez gástrica, mas também da presença de fatores
predisponentes que atuariam diminuindo a defesa da mucosa gástrica contra a ação
de diferentes agentes lesivos presentes no estômago (WALLACE, 1996).
Portanto as úlceras pépticas são lesões na mucosa gástrica e duodenal
provocadas por um desequilíbrio entre os fatores protetores (muco, bicarbonato,
fluxo sanguíneo adequado, NO, prostaglandinas, dentre outros) e lesivos (pepsina,
ácido clorídrico, H2O2, OH-, O2 dentre outros). Estas lesões podem ser
desencadeadas e agravadas pelo consumo excessivo de álcool, tabagismo,
estresse, uso de drogas antiinflamatórias do tipo não-esteroidais (DAINEs) e pela
presença de Helicobacter pylori no trato gastrintestinal (MAITY et al., 2003).
As úlceras pépticas são lesões crônicas, geralmente recidivantes, são
diagnosticadas com mais freqüência em adultos de meia-idade ou mais velhos, mas
podem aparecer pela primeira vez no início da vida adulta (CALAM E BARON,
2001). Apesar da diversidade dos fármacos utilizados no tratamento da úlcera
péptica, do amplo conhecimento da fisiopatologia e do TGI, do avanço das indústrias
na busca de novos medicamentos, ainda não foi descoberto um fármaco que
produza 100 % de remissão nas úlceras gastroduodenais (WALLACE, 1996,
ANDRADE et al, 2008). Entre os inúmeros fármacos empregados temos os
antiácidos, anticolinérgicos, inibidores da bomba de próton, antagonistas do receptor
H-2 para histamina. No entanto, estes medicamentos apresentam algumas
desvantagens pelos efeitos colaterais, reações adversas e resposta limitada em
patologias crônicas (RAGHUNATH et al., 2005).
Nas últimas décadas cresceu muito a utilização de plantas medicinais como
alternativa terapêutica. Segundo a Organização Mundial da Saúde estudos
demonstram que 85% da população em países em desenvolvimento fazem uso de
plantas medicinais ou de seus derivados, no tratamento das patologias
gastrointestinais (GRACIOSO, 2002).
31
Um método comumente utilizado para a verificação da atividade antiúlcera de
extratos de plantas é através da verificação da proteção que o extrato proporciona,
contra lesões gástricas induzidas por etanol em ratos. Podemos citar exemplos de
várias plantas com esta atividade, tais como: Panax ginseng, Angelica sinensis ,
Bupleurum falcatum, Cochlospermum tinctorium e Strychnos potatorum (CIPRIANI,
2007).
32
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Análise fitoquímica
4.1.1 Material vegetal
As partes aéreas (folhas, galhos e sementes) foram coletadas no município
de Camboriú em março de 2007 e identificadas pelo professor Dr. Oscar B. Iza da
Univali. Uma exsicata foi registrada e depositada no herbário Barbosa Rodrigues de
Itajaí – Santa Catarina sob o no HBR 52637.
4.1.2 Preparação do extrato metanólico e fracionamento das sementes
O material moído e seco das sementes (250 g) foi submetido à maceração
com metanol durante sete dias. Após a evaporação do solvente à pressão reduzida
em rotaevaporador, o extrato metanólico bruto das sementes (9g) foi cromatografado
diretamente usando cromatografia de coluna (CC) em sílica gel 60 70-230 mesh
(Merck) e empacotadas em clorofórmio 100 %, as dimensões da coluna foram de 50
cm de altura x 2,5 cm de diametro. Foram utilizadas 84 g de sílica e um sistema de
eluição com polaridade crescente (diferentes proporções de clorofórmio: metanol)
as frações foram coletadas em frascos de 10 mL, e reunidas conforme perfil
semelhante através de cromatografia em camada delgada (CCD). Um fluxograma
das operações realizadas encontra-se na Figura 7.
Figura 7- Resumo das operações realizadas no fracionamneto do extrato das sementes de Garcinia
achachairu
33
4.1.3 Preparação do extrato metanólico e fracionamento dos galhos
A purificação e isolamento dos galhos, foram realizados pela aluna Suellen
Silva, como trabalho de conclusão do Curso de Farmácia, UNIVALI.
4.1.4 Preparação do extrato e obtenção das frações das folhas
O material moído e seco das folhas (840 g) foi submetido à maceração com
metanol durante sete dias. Após a evaporação do solvente à pressão reduzida em
rotaevaporador o extrato obtido (83,28 g) foi ressuspendido com aproximadamente
500 mL de metanol e água na proporção de 9 : 1. Este extrato foi particionado com
diferentes solventes de polaridade crescente hexano, clorofórmio e acetato de etila,
para a obtenção das respectivas frações semipurificadas. Um fluxograma das
operações realizadas encontra-se na Figura 8
Figura 8- Esquema do preparo e fracionamento do extrato obtido das folhas da Garcinia achachairu.
4.1.5 Purificação das frações de hexano e clorofórmio obtidas das folhas
A fração hexanica e a fração clorofórmica obtidas das folhas foram
cromatografadas em coluna usando como fase estacionária sílica gel (70-230 mesh)
empacotada com hexano (100 %). Os sistemas de eluição utilizados possuiam
polaridade crescente (diferentes proporções de hexano e acetona) e as frações
foram coletadas em frascos de aproximadamente 10 mL.
34
Na fração de hexano (9,1 g) foram utilizadas 67 g de sílica em uma coluna de
vidro com 50 cm de altura e 2,5 cm de diâmetro interno. Por outro lado na fração de
clorofórmio (3,4 g) foram utilizadas 74 g de sílica para uma coluna com as mesmas
especificações utilizadas para a fração de hexano.
4.1.6 Elucidação estrutural
Para a elucidação estrutural os espectros de Ressonância Magnética Nuclear
de Hidrogênio e Carbono 13 (300 e 75 MHz) foram obtidos em equipamento Bruker
300 e os deslocamentos químicos foram medidos em ppm, utilizando TMS como
padrão interno de referência .
4.1.7 Reagentes e equipamentos
Nas separações cromatográficas foi utilizado como suporte, sílica gel-60 de
granulométrica 70-230 mesh (0,063-0,20 mm) foram utilizadas colunas de diferentes
dimensões dependendo do tipo e quantidade de material a ser purificado. No
monitoramento das subfrações foi utilizada a cromatografia em camada delgada
(CCD) em placas de sílica gel 60 (do tipo F254 de 2,5 X 6,0 cm) adquiridas da Merck
e eluentes em diferentes proporções conforme pré-selecionados pela melhor
resolução cromatográfica. Na CCD, as substâncias foram reveladas por vaporização
com solução de anisaldeído sulfúrico seguido de aquecimento durante 5 minutos à
110o C para as classes dos terpenóides e esteróides. As substâncias de
características fenólicas foram reveladas com solução de FeCl3 1% e secas a
temperatura ambiente. Além disso, as placas também foram visualizadas sob luz
ultravioleta nos comprimentos de onda de 250 e 366nm como método físico de
identificação.
35
4.2 Análise biológica
4.2.1 Animais
Para os testes biológicos foram utilizados camundongos machos Swiss (n= 6
pesando entre 20 e 30 g) criados no Biotério Central da Universidade do Vale do
Itajaí. Os animais foram mantidos em ambiente com temperatura de 22 ± 1°C, em
ciclo 12 h claro/12 h escuro, com água e ração fornecidos ad libitum. Os animais
permaneceram no laboratório durante um período de adaptação de pelo menos 1 h
antes da realização dos testes farmacológicos, realizados geralmente entre 8 e 17 h.
Os experimentos descritos foram conduzidos de acordo com as diretrizes
atuais de cuidados com os animais de laboratório e com as diretrizes éticas para
investigações de dor experimental em animais conscientes (ZIMMERMANN, 1983).
O número de animais e a intensidade do estímulo nocivo utilizado foram os
mínimos necessários para demonstrar os efeitos dos tratamentos com as drogas.
Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da UNIVALI sob nº
012008.
.
4.2.2 Avaliação da atividade antinociceptiva
4.2.2.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
A resposta nociceptiva foi induzida com acido acético (0,6% intraperitoneal).
O acido acético promove contorções da musculatura abdominal seguidas de
extensão dos membros posteriores. Grupos de animais foram pré-tratados com o
extrato das folhas, dos galhos e das sementes, e com as frações hexânica,
clorofórmica e acetato de etila, nas doses de 1 a 30 mg/Kg ou com o composto
isolado Gutiferona A nas doses de 1 a 10 mg/Kg 30 minutos antes do experimento.
Após receberam uma injeção intraperitoneal de ácido acético (0,6%). (MENDES et
al., 1998). Os animais foram observados individualmente e o número de contorções
abdominais foi cumulativamente contado durante 20 min após a injeção i.p. de ácido
acético, e considerado como indicativo de nocicepção.
36
4.2.2.2 Modelo de nocicepção induzida pela formalina
Este modelo é mais específico e permite avaliar dois tipos de dor: a dor de
origem neurogênica e a de origem inflamatória. Assim, os animais foram tratados
com o extrato metanolico das folhas, galhos e sementes nas doses de 3 a 100
mg/Kg, com as frações hexânica, clorofórmica e acetato de etila, nas doses de 1 a
100 mg/Kg ou com o composto isolado Gutiferona A nas doses de 1 a 10 mg/Kg 30
minutos antes do experimento. Após receberam 20 μl de formalina a 2,5 % (0,92 %
de formaldeído) ou salina na região subplantar das patas posteriores direita e
esquerda, respectivamente. Posteriormente a injeção de formalina, os animais foram
colocados, individualmente, sob um funil de vidro o qual é circundado por espelhos
para facilitar a observação do comportamento emitido. O tempo em que o animal
permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada com a formalina foi
cronometrado, sendo este tempo indicativo de nocicepção (CAMPOS et al, 1993,
SOUZA et al, 2003). Inicialmente foi cronometrado os primeiros 5 minutos após a
injeção da formalina, aguardou-se 10 minutos e recomeça a cronometrar por 15
minutos consecutivos o tempo de lambidas que correspondeu a dor inflamatória. O
tempo total do teste foi de 30 minutos.
4.2.2.3 Modelo de nocicepção induzida pela capsaicina
A fim de obter outras evidências sobre a atividade antinociceptiva da planta
em estudo na dor de origem neurogênica, camundongos tratados com os extratos e
composto isolado foram avaliados no modelo de nocicepção induzida pela injeção
intraplantar de capsaicina. Neste experimento grupos de animais foram pré-tratados
com o extrato metanólico das folhas, galhos e sementes nas doses de 10 a 30
mg/Kg, ou com o composto isolado Gutiferona A nas doses de 0,3 a 10 mg/Kg por
via intraperitonial 30 min antes da injeção de capsaicina. Ao grupo controle foi
administrado um volume semelhante de uma solução salina (NaCl 0,9%).
Cada animal foi colocado individualmente sob um funil de vidro transparente,
por um período de adaptação de no mínimo 20 minutos. Após este período foi
observado a reação à nocicepção induzida pela capsaisina, cronometrando durante
5 minutos o tempo que o animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata
injetada. Cada animal recebeu 20μl de solução de capsaisina (1,6 mg/pata), injetada
37
na região intraplantar da pata posterior direita. O tempo que o animal permaneceu
lambendo ou mordendo a pata injetada com a capsaicina foi cronometrado e
considerado como indicativo de nocicepção.
4.2.2.4 Modelo de nocicepção induzido pelo glutamato
Com a finalidadade de se obter evidências mais diretas a respeito da
interação da planta em estudo com o sistema glutamatérgico, foi avaliada a atividade
antinociceptiva do extrato metanólico das folhas, galhos e sementes nas doses de
10 e 30 mg/Kg, e do composto isolado Gutiferona A nas doses de 1 a 10 mg/Kg.
Neste modelo os animais foram colocados individualmente sob um funil de vidro
transparente, por um período de adaptação de no mínimo 20 minutos, o qual
posteriormente foi utilizado para observar a reação à nocicepção induzida pelo
glutamato, cronometrando-se durante 15 minutos o tempo que o animal permaneceu
lambendo ou mordendo a pata. Cada animal recebeu 20 µl de solução de glutamato
(30 μmol/pata), injetada na região intraplantar da pata posterior direita. O tempo que
o animal levou para lamber ou morder a pata injetada com glutamato foi considerado
como indicativo de nocicepção (SOUZA et al, 2003).
4.2.3 Avaliação da Atividade antiúlcera
4.2.3.1 Úlcera induzida por etanol
Este método foi descrito por Morimoto et al. (1991). Os animais (machos Swiss
pesando (25-30 g) foram submetidos inicialmente a jejum de 8 horas e após esse
período, divididos em diferentes grupos (n=6) que foram pré-tratados por via oral
com omeprazol na dose de 30 mg/kg (controle positivo), água destilada (controle
negativo), extrato metanólico das folhas, sementes e galhos na dose de 500 mg/kg.
Após 1 hora foi administrado aos animais 0,3 mL de etanol absoluto (agente
lesivo) por via oral e 1 h após a administração do agente lesivo, os mesmos foram
sacrificados por deslocamento cervical; em seguida, os estômagos foram retirados e
abertos ao longo da curvatura maior, sendo esticados em placas de parafina.
Através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por software de
análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho
38
destas. Posteriormente foi realizada a determinação da área total de lesão,
porcentagem de área lesada e índice de úlceras (ULI) calculado através da
severidade das lesões da mucosa gástrica, classificadas como:
a) área da úlcera 1 mm2;
b) área da úlcera de 1-3 mm2; e
c) área da úlcera 3 mm2.
O índice lesão ulcerativa (ULI) foi determinado como:
ILU = 1 x (número de lesões do tipo 1) + 2 x (número de lesões do tipo 2) + 3 x
(número de lesões do tipo 3).
Após resultado de maior atividade para o extrato metanólico da semente, foi
realizado o mesmo experimento, utilizando as dosagens de 50, 250 ou 500 mg/Kg ,
na tentativa de observar a dependência da dose.
4.3 Análise estatística
Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média
(E.P.M., 95%). As porcentagens de inibição foram citadas como a média ± o erro
padrão da média da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas
obtidas para cada experimento individual em relação ao grupo controle
correspondente ou por cada experimento individual. A análise estatística dos dados
foi realizada por meio de análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelos
testes de Dunnett. Valores de p menores que 0,05 (P < 0,05) foram considerados
como indicativos de significância. Todas as análises citadas acima foram realizadas
utilizando o programa GraphPad PRISM®.
39
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Purificação e isolamento dos constituintes das sementes.
O extrato metanólico obtido das sementes, após procedimentos
cromatográficos com um sistema gradiente de eluição (CHCl3:MeOH), foram obtidas
241 frações, que foram reunidas conforme perfil cromatográfico semelhante, através
de cromatografia em camada delgada (CCD). A sub-fração GA 1-40 foi
recromatografada utilizando-se um sistema de solvente hexano:acetona rendendo
132 novas sub-frações. A sub-fração GA 51-120 (600mg), a qual foi eluída na
proporção 70:30, apresentou-se em forma de um sólido esverdeado e uma rotação
óptica de 24º. Um fluxograma das operações realizadas está representado na
Figura 9.
Figura 9- Resumo das operações realizadas no processo de purificação do extrato metanólico obtido
das sementes de G. achachairu.
40
Depois de submetida a analise espectroscópicas de Ressonância Magnética
nuclear de Hidrogênio e Carbono -13 (DELLE MONACHE, 2001; ABAD et al., 2007),
e comparado os dados com aqueles encontrados na literatura, a sub-fração 51-120
foi identificada como sendo uma benzofenona prenilada e denominada de Gutiferona
A (Figura 10).
Figura 10- Estrutura química da gutiferona A isolada das sementes de G. achachairu
Como pode ser observado na Figura 11, o espectro de RMN-1H mostra quatro
sinais característicos de prótons vinílicos na região de 5,20, 5,06, 4,89 e 4,92ppm
os quais foram relacionados com os hidrogênios H-30, H-35, H-25 e H18,
respectivamente. Além disso, mostra a evidencia de hidrogênios aromáticos em δ
6,68d (J = 9 Hz), 6,96dd (J = 9; 2 Hz) e 7,17d (J = 2 Hz) atribuídos aos hidrogênios
H-15, H-16 e H-12, respectivamente.
É possível observar também, oito sinais em 1,57, 1,72, 1,65, 1,47, 1,71, 1,67,
1,63 e 1,47 ppm, atribuídos aos grupos metilas vinílicos referentes aos hidrogênios
H-20, H-21, H-27, H-28, H-32, H-33, H-37 e H-38, respectivamente (Figura 12).
41
Figura 11- Espectro de RMN-1H (CD3OD, 300 MHz) ampliado de 7.5 a 4.5 ppm da substancia GA 51-
120
Figura 12- Espectro de RMN-1H (CD3OD, 300 MHz) ampliado de 2.9 a 1,4 ppm da substancia GA 51-
120
Da mesma forma, os sinais na região entre 2,0 e 2,6 ppm (Figura 12) foram
relacionados com hidrogênios alílicos, indicando a possibilidade de quatro grupos
isopentenila.
Quando se analisa o espectro de RMN 13C (Figura 13), observa-se dois sinais
em 209,5 e 195,7 ppm, típico de carbono carbonílico atribuído ao C-9 e C-10. Além
destes, três sinais em 195,4, 117,7 e 195,1 ppm são típicos de um sistema
42
enolizado 1,3 dicetona e atribuídos aos carbonos C-1, C2 e C-3 em função da
ocorrência de tautomerismo ceto-enólico. Este fato pode ser evidenciado pelos
sinais duplicados na região dos prótons aromáticos (Figura 12). Outros sinais no
espectro de carbono que sugerem esta estrutura, são os encontrados em 51,9, 41,1
e 64,0 ppm, os quais são característicos de um sistema biciclo do tipo [3.3.1] nonano
e relacionados aos carbonos C5, C6 e C8, respectivamente (Figura 15).
Figura 13- Espectro de RMN -13
C (CD3OD, 75 MHz) ampliado de 210 a 190 ppm da substancia GA
51-120
Outros sinais que merecem destaque são aqueles em 129,3; 117,3; 146,1;
152,5; 115,1 125,0 ppm, típicos de carbonos aromáticos e atribuídos aos carbonos
C-11, C-12, C-13, C-14, C-15 e C-16 (Figura 14). Os sinais em 120,7; 125,4; 120,8
e 125,1 ppm em conjunto com os sinais 26,6; 29,8; 32,0; e 23,7 ppm justificam a
presença de quatro grupos prenilas os quais foram atribuídos ao carbono C-18; C-
25; C-30; C-35; C-17; C-24; C-29; C-34 (Figuras 14 e 15). Todos os valores de
deslocamentos químicos comparativos podem ser observados na tabela 2. Estes
valores estão de acordo com aqueles obtidos por Kirk e cols (1992) e relacionados à
Gutiferona A. Esta substância embora conhecida, nesta especie está sendo isolada
pela primeira vez. Gutiferona A é o principal constituinte dos frutos de G. livingstonei
a qual apresentou forte atividade anti HIV. Mais recentemente, tem demostrado
importante ação contra diferentes formas de T. Cruzi in vitro, além de atividade
citotóxica, antioxidante e inibidora de microtúbulos (ABE et al., 2004; HERATH et al.,
2005; NGOUELA et al., 2006; LENTA et al., 2007).
43
Figura 14- Espectro de RMN - 13
C (CD3OD, 75 MHz) ampliado de 152 a 114 ppm da substancia GA
51-120
Figura 15- Espectro de RMN -13
C (CD3OD, 75 MHz) ampliado de 75 a 15 ppm da substancia GA 51-
120.
44
Tabela 2. Valores de deslocamento químicos (em ppm) de RMN 1H e 13C comparativos com a literatura.
OH
HO
O OH
OO
12
34
5 6
7
8
9
10
12
16
17
20
21
23
24
37
27
28
32
33
29
34
38
Gutferona A
aGUTIFERONA A
(CD3OD) +0,1% TFA GA 51-120 (CD3OD)
Posição C H (J em Hz) C H (J em Hz)
1 195,4 195,7
2 117,7 117,7
3 195,1 195,4
4 68,8 69,3
5 51,9 51,9
6 41,1 1,83 t 41,1 1,80
7 40,1 1,97 40,1 1,90
8 62,1 64,06
9 209,5 209,7
10 195,5 195,7
11 129,3 129,3
12 117,3 7,16 d (2) 117,4 7,20 d (2)
13 146,1 146,2
14 152,5 152,6
15 115,1 6,69 d (2) 115,2 6,69 d (2)
16 125,0 6,97 dd (9; 2) 125,1 6,97 dd (9; 2)
17 26,6 2,62 26,6 2,65
18 120,7 4,92 t 121,3 4,92 t
19 135,6 135,8
20 26,0 1,63 s 26,4 1,57 s
21 18,2 1,67 s 18,5 1,72 s
22 19,7 1,24 s 19,8 1,25 s
23 36,9 1,20 s 36,9 1,20 s
24 29,8 2,06 t 29,8 2,07 t
25 125,4 4,88 t 125,5 4,89 t
26 133,7 133,8
27 26,3 1,64 s 25,3 1,65 s
28 18,2 1,47 s 18,3 1,47 s
29 32,0 2,44 40,2 2,45
30 120,8 5,20 t 152,2 5,21t
31 135,7 135,7
32 26,3 1,71 1,71
33 18,3 1,67s 18,0 1,67s
34 23,7 1,87 m 23,9 1,58 m
35 125,1 5,07 125,1 5,06 36 132,8 132,9
37 25,9 1,67 s 26,1 1,63 s
38 17,1 1,58 17,8 1,47
a Kirk e cols.1992
45
5.2 Purificação e isolamento dos compostos das folhas da Garcinia
O extrato metanólico das folhas, após particionamento conforme metodologia
do item 4.1.4, rendeu as frações de hexano (10,8 g), clorofórmio (8,4 g) e acetato de
etila (15,8 g). A fração hexano foi cromatografada conforme item 4.1.5. Desta forma,
foram obtidas 169 frações, as quais foram descartadas por não apresentarem
importância fitoquímica após monitoramento por CCD. Ou seja, substâncias de
caráter apolar como triglicerídeos e ácidos graxos insaturados.
Dando continuidade ao processo de purificação, a fração de clorofórmio (3,4
g) foi empacotada com hexano 100% e eluída aumentando gradativamente a
polaridade com acetona de 3 em 3 %. As frações foram coletadas em frascos de 10
ml e agrupadas conforme perfil cromatográfico semelhante através de CCD. Desta
coluna, foram obtidas 190 sub-frações. A sub-fração GA 141-160 (0,18 g) foi
recromatografada utilizando um sistema de solventes de hexano:acetona no qual
aumentou-se a polaridade gradativamente com acetona 2 em 2%, rendendo 170
novas sub-frações. A fração GA 145- 150, eluída com 34 % de acetona, apresentou-
se na forma de um sólido laranja (25,9 mg) enquanto que a fração GA 161-170,
eluída com 40 % de acetona, apresentou-se na forma de um sólido amarelo (25,4
mg). Um resumo das operações realizadas com a fração clorofórmio encontra-se na
Figura 16.
46
Figura 16- Resumo das operações realizadas no processo de purificação da fração clorofórmio.
A sub-fração GA 145- 150 e a sub-fração GA 161-170 foram identificadas com
base em dados espectrais de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio e
Carbono-13 e através de CCD com padrões autênticos anteriormente isolados em
nossos laboratórios. É conhecido que os biflavonóides a temperatura ambiente,
apresente duplicidade de sinais no espectro de ressonância magnética nuclear, em
função de um equilíbrio conformacional entre os C3’-I e C8-II. Entretanto, os dados
correlacionados neste trabalho referem-se ao confôrmero preferencialmente mais
estável (COMPAGNONE et al., 2008). Estes dados em conjunto permitiram
identificar como sendo os biflavonóides denominados GB1-a e Amentoflavona
(Figura 17).
47
O
OH
OH
O
H
OH
OOHOH
O
H
O
OH
OH
O
OH
OOHOH
O
H
OH
H
H
1
2
345
6
78
1'
2' 3'
4'
5'6'
I
9
10
II
2
34
5
6
78
Amentoflavona
1
2
3
45
6
78
1'
2' 3'
4'
5'6'
I
9
10
II
2
345
6
78
GB1a
Figura 17- Estrutura química da Amentoflavona e GB1a isolados de G.achachairu.
Tabela 3. Valores de deslocamento químicos (em ppm) de RMN 1H e 13C comparativos com a literatura.
aCompagnone et al., 2008.
bSuárez et al., 2003.
aGB1-a
C5D5N
Fr 145-150
CD3OD
bAmentoflavona
DMSO-d6
Fr 161-170
CD3OD
H1
C13
H1 C
13 H
1 C
13 H
1 C
13
I - 2 6,22 82,6 5,93 79,4 I - 2 - 164,1 - 166,1
3 5,20 48,9 5,40 48,7 3 6,73 103,2 6,58 s 104,0
4 - 197,1 - 198,9 4 - 182,9 - 183,4
5- OH 13,18 165,3 - 164,8 5- OH - 161,6 - 162,6
6 6,53 97,2 6,70 97,2 6 6,24 98.8 6,39 d 100,2
8 6,49 96,0 6,60 96,2 8 6,53 94,2 6,17d 95,2
2’, 7,69 130,0 7,10 129,7 2’ 8,12 127,9 7,94 d 128,9
3’ 7,31 116,3 6,80 116,3 3’ - 121,7 - 123,3
5’ 7,31 116,3 6,80 116,3 5’ 7,25 116,4 7,08 d 117,5
6’ 7,69 130,0 7,10 130,1 6’ 8,05 131,6 7,93 d 132,8
II-2 5,76 79,5 5,60 80,4 II-2 - 164,3 - 166,1
3 2,83 43,6 2,66 44,2 3 6.66 102,8 6,58 d 103,3
4 - 197,8 - 197,6 4 - 185,2 - 184,2
5- OH 12,74 166,3 - 165,6 5- OH - 160,8 - 161,1
6 6,42 96,6 5,91 97,2 6 6,46 115,8 6,35 d 115,5
2’ 7,56 128,6 7,20 128,9 2’ 7,64 128,3 7,84 d 129,3
3’ 7,24 115,7 7,09 115,6 3’ 6,83 116,0 6,72 d 116,9
5’ 7,24 115,7 7,09 115,6 5’ 6,84 116,0 6,84 d 117,15
6’ 7,56 128,6 7,20 127,9 6’ 7,64 128,9 7,52 d 129,3
48
Como já citado anteriormente os biflavonóides são dímeros de flavonóides, na
qual a ligação entre os flavonóides pode ser através das ligações C-C ou através de
uma ligação éter (menos comuns), podendo apresentar uma grande variedade entre
os locais de ligação. No caso da amentoflavona a ligação ocorre entre C3’ e II-C8
de duas flavonas, também é conhecida como 3’8’’ biapigenina, por ser dímeros das
flavonas apigeninas.
A amentoflavona é observada em várias espécies do gênero Ginkgo e
Hypericum, neste aparece principalmente nas flores, sempre acompanhado da
hipericina, em diferentes proporções, indicando a sua contribuição de forma
sinérgica na ação antidepressiva, característica das espécies deste gênero
(BAUREITHEL et al., 1997). Estudos mostram a amentoflavona como sendo o
primeiro composto com alta afinidade pelo receptor benzodiazepinico, não alcalóide,
o que levou a verificação de vários flavonóides para esta atividade farmacológica
(NIELSEN, et al., 1988; MARDER et al., 2001; KUROSHIMA, 2002)
5.3 Avaliação da atividade farmacológica:
5.3.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
As contorções abdominais induzidas pela administração intraperitonial do
ácido acético em camundongos, é descrita como um modelo típico de dor
inflamatória. Há muito tempo este modelo tem sido utilizado para avaliar as
propriedades analgésicas e antiinflamatórias de novas substâncias, embora seja um
experimento muito simples e não especifico é de fácil observação, boa correlação e
sensível a vários fármacos analgésicos e antiinflamatórios (SIEGMUND; CADMUS;
LU, 1957; BLANE, 1967; CAMPOS-BUZZI et al., 2006; COSTA et al., 2007;
KANEGUSUKU et al, 2007) .
Em, 1964 Whittle descreveu que o ácido acético atua indiretamente, ou seja,
a dor desencadeada por ele decorria da liberação de mediadores envolvidos na
modulação da dor: prostaglandinas, histamina, serotonina e bradicinina. Ribeiro e
colaboradores (2000), mostraram que a nocicepção induzida pelo ácido acético
depende da liberação de citocinas, como a IL-1b, TNF-α e à IL-8 a partir de
macrófagos e basófilos residentes na cavidade abdominal, e que em conjunto com
49
outros mediadores podem induzir a nocicepção característica, observada nesse
modelo.
Para melhor compreensão dos resultados expressos através das figuras, a
barra preta corresponde à média dos resultados do grupo controle, tratado com o
veículo no qual o extrato, frações e o composto puro foram diluídos, e as barras
brancas correspondem aos resultados dos tratamentos em diferentes
concentrações.
Os resultados apresentados na Figura 18 demonstram que o extrato
metanólico das sementes, administrado por via i.p. apresentou significativa ação
antinociceptiva e dependente da dose nas concentrações de 3 a 30 mg/Kg. A
porcentagem de inibição calculada para a dose de 30mg/Kg foi de 72 ±4% e a DI50
(dose inibitória de 50%) foi de 13,1 (9,3 -18,4) mg/Kg.
Figura 18- Efeito antinociceptivo do extrato metanólico das sementes da Garcinia achachairu (1 - 30 mg/Kg) sobre o n
o de contorções induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de
seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (
*p <
0,05,**p< 0,01) quando comparados com o grupo controle.
De acordo com a Figura 19, o extrato metanólico das folhas também produziu
redução significativa do número de contorções abdominais, de maneira dependente
da dose nas concentrações de 10 e 30 mg/Kg quando comparado ao grupo controle.
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Ext. MeOH Semente G . achachairu(mg/kg, i.p.)
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A porcentagem de inibição calculada para a dose de 30 mg/Kg foi de 57 ± 7% e a
DI50 de 21,6 (15,2 – 30,9) mg/Kg.
Figura 19- Efeito antinociceptivo do extrato metanólico das folhas (1 - 30 mg/Kg) sobre o no
de contorções induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (
*p < 0,05,
**p< 0,01) quando
comparados com o grupo controle.
Em relação ao extrato metanólico obtido dos galhos, a Figura 20 mostra
significativa ação dose dependente nas concentrações de 3, 10 e 30 mg/Kg,
enquanto que a dose de 1mg/Kg não apresentou atividade antinociceptiva
significativa, com porcentagem de inibição para a dose de 30mg/Kg de 73 ± 6% e
uma DI50 de 15 (11,8 – 19,1) mg/Kg.
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Ext. MeOH Folha G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Figura 20- Efeito antinociceptivo do extrato metanólico dos galhos (1; 3; 10; 30 mg/Kg) sobre o n
o de
contorções induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (
*p < 0,05,
**p< 0,01) quando
comparados com o grupo controle.
Se compararmos com os medicamentos utilizados clinicamente, tais como o
ASS e o paracetamol (tabela 4), o extrato obtido das sementes e dos galhos é cerca
de duas vezes mais potente neste modelo (NIERO et al, 2006).
Levando em consideração a avaliação dos extratos, sugere-se que eles
inibem alguns neurotransmissores envolvidos neste modelo experimental
produzindo inibição significativa e de forma dependente da dose das contorções
abdominais provocadas pelo ácido acético.
Embora o extrato metanólico obtido das folhas não seja o mais efetivo, foi o
que apresentou maior rendimento, neste sentido as frações de hexano, clorofórmio e
acetato de etila também foram testadas no mesmo modelo experimental. Como pode
ser observado na Figura 21, a fração de hexano apresentou atividade nas
concentrações de 10 e 30 mg/Kg, quando comparada com o grupo controle. O efeito
observado foi dependente da dose, de modo que o aumento da concentração da
dose produz aumento do efeito antinociceptivo. A porcentagem de inibição calculada
foi de 72 ± 7% e a DI50 de 21,3 (15,7 – 29) mg/Kg.
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Ext. MeOH Galhos G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Figura 21- Efeito da fração hexânica das folhas (3 - 30 mg/Kg) sobre o n
o de contorções induzida por
ácido acético. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (
*p < 0,05,
**p< 0,01) quando comparados com o grupo
controle.
Da mesma forma, a fração de clorofórmio (Figura 22) apresentou um efeito
antinociceptivo nas doses de 10 e 30 mg/Kg de maneira dose dependente, sendo
que as demais doses não apresentaram resultado satisfatório para este modelo
experimental. A inibição máxima calculada foi de 61 ± 6% e a DI50 foi de 22,1 (15,3 -
31,9) mg/Kg. Por outro lado, resultados não significativos da atividade
antinociceptiva foram observados com a fração acetato de etila quando comparados
ao grupo controle (Figura 23).
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Fr. Hexânica Folhas G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Figura 22- Efeito da fração clorofórmio das folhas (3 - 30 mg/Kg) sobre o no
de contorções induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (
*p < 0,05,
**p< 0,01) quando comparados com o grupo
controle.
Figura 23- Efeito antinociceptivo da fração acetato de etila das folhas (3 - 30 mg/Kg) sobre o n
o de
contorções induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (
*p < 0,05,
**p< 0,01) quando
comparados com o grupo controle.
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Fr. CHCl3 Folha G. achachairu
(mg/kg, i.p.)
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Fr. Acet. Etila Folha G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Se novamente compararmos com os medicamentos utilizados como
referência, observa-se que, tanto a fração de hexano quanto a de clorofórmio
demonstraram atividade semelhante (tabela 4), neste mesmo modelo experimental.
Por outro lado, observa-se que as frações testadas foram muito mais efetivas com
inibições máximas de 72 e 61%, respectivamente.
Tabela 4 - Comparativo da atividade antinociceptiva dos extratos metanólicos, da fração hexânica e clorofórmica do extrato das folhas da G. achachairu, paracetamol e aspirina no modelo de dor abdominal induzida por ácido acético.
Tratamento Dose (mg/Kg) Inibição máxima
Extrato MeOH semente 13,1 (9,3 – 18,4) mg/Kg 72 ± 4 %
Extrato MeOH galhos 15,0 (11,8 – 19,1) mg/Kg 73 ± 6 %
Extrato MeOH folhas 21,6 (15,2 – 30,9) mg/Kg 57 ± 7%
Fração hexânica 31,3 (15,7 – 29,0) mg/Kg 72 ± 7%
Fração clorofórmio 22,1 (15,3 - 31,9) mg/Kg 61 ± 6%
Paracetamol 18, 8 (15,7 - 22,6) mg/Kg 38%
Aspirina 24,0 (13,1 - 43,8) mg/Kg 35 %
Neste contexto podemos sugerir que substâncias apolares estariam inibindo a
liberação de mediadores envolvidos na modulação da dor, uma vez que a fração
acetato de etila (mais polar) não apresentou nenhuma atividade.
Levando em consideração que um dos objetivos é encontrar substâncias
potencialmente ativas, a gutiferona A, isolada do extrato metanólico das sementes
foi analisada em diferentes modelos de dor (Figura 24). Esta substância apresentou
atividade nas concentrações de 1 a 10 mg/Kg, quando comparada com o grupo
controle do tipo dose-dependente. A inibição máxima calculada foi de 73 ± 5% e a
DI50 de 4,54 (3,29 -6,24) [7,54 (5,46 – 10,36) μmol/Kg]. Se compararmos o efeito da
gutiferona A na dose de 10 mg/Kg, podemos perceber que a mesma apresenta
atividade antinociceptiva superior ao grupo tratado com paracetamol.
55
Figura 24- Efeito antinociceptivo da Gutiferona A (1-10 mg/Kg) sobre a dor induzida por ácido acético. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significantes (
*p < 0,05,
**p< 0,01) quando comparados com o grupo
controle.
Considerando a avaliação da atividade antinociceptiva da Gutiferona A,
sugere-se que ela inibe a liberação de mediadores envolvidos na modulação da dor,
tais como prostaglandinas, histamina, serotonina, bradicinina e citocinas uma vez
que reduziu significativamente o número de contorções abdominias.
5.3.2 Modelo de nocicepção induzida pela formalina
Este modelo experimental consiste na injeção intraplantar da solução de
formaldeído diretamente na pata posterior do animal, a qual induz dor intensa por
estimular diretamente os nociceptores. A dor causada nos animais é caracterizada
por vigorosas lambidas, mordidas e batidas na pata injetada com a formalina.
(DUIBUISSON; DENNIS, 1977; HUNSKAAR; FASMER; HOLE, 1985; HUNSKAAR;
HOLE, 1987).
Esse teste caracteriza-se por apresentar duas fases distintas de nocicepção,
que parecem envolver diferentes mediadores, além de ser considerado o modelo
que mais se assemelha a dor clínica inflamatória (TJOLSEN; HOLE 1997). A
primeira fase da nocicepção inicia-se logo após a injeção de formalina estendendo-
se pelos primeiros 5 minutos e está associada à estimulação química direta dos
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Gutiferona A(mg/kg, i.p.)
Paracetamol (30 mg/kg, i.p.)
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nociceptores (DUBUISSON; DENNIS, 1977; HUNKKAR; HOLE, 1987). Nesta fase a
informação conduzida pelos neurônios aferentes primários volta à periferia por
ramificações eferentes dos mesmos neurônios, induzindo a liberação de
neuropeptídeos e outras substâncias que produzem uma grande quantidade de
respostas locais, denominadas inflamação neurogênica (MAMET; LAZDUNSKI;
VOILLEY, 2003).
A segunda fase ocorre entre 15-30 minutos após a injeção de formalina, e
está relacionada com a liberação de mediadores pró-inflamatórios como substância
P, bradicinina, citocinas, histamina, prostaglandinas e serotonina (HUNSKAAR;
HOLE, 1987; TJOLSEN; HOLE; 1997, SANTOS et al, 2009).
Para o entendimento dos resultados obtidos, os parâmetros para a
interpretação gráfica foram os mesmos adotas para o ácido acético.
O extrato metanólico dos galhos não produziu redução do tempo em que o
animal permaneceu lambendo ou mordendo a pata injetada na fase da dor
neurogênica (Fase I), quando comparado ao grupo controle. No entanto, em relação
à dor inflamatória (Fase II) o extrato diminuiu significativamente o tempo de reação
de modo dose dependente com IM de 66 ± 7% e a DI50 calculadas de 74,7 (50,3 –
110,9) mg/Kg, respectivamente (Figura 25).
Figura 25- Efeito antinociceptivo do extrato metanólico dos galhos (3 – 100 mg/Kg) da G. achachairu sobre a dor induzida por formalina. A fase I (A) representa a dor neurogênica e a fase II (B) corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
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Ext. MeOH Galhos G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Por outro lado, no experimento com o extrato metanólico das sementes
(Figura 26), apenas teve efeito sobre o tempo de reação durante a fase da dor
inflamatória, quando comparado com o grupo controle.
Figura 26- Efeito do extrato metanólico da semente (3 – 100 mg/Kg) da G. achachairu sobre a dor induzida por formalina. A fase I (A) representa a dor neurogênica e a fase II (B) corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros indicam os erros padrão da média. . ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
Da mesma maneira, pode ser observado que o extrato metanólico obtido das
folhas (Figura 27) foi ineficaz em reduzir o tempo de duração da primeira fase da
nocicepção induzido pela formalina. Porém, com relação à dor inflamatória, o extrato
promoveu diminuição do tempo de reação na dose de 10 e 30 mg/Kg não
apresentando portanto um efeito dose-dependente, tendo em vista que não diminuiu
do tempo de reação na dose de 100 mg/Kg com porcentagem de inibição de 37 ± 5
%.
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Ext. MeOH Semente G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Figura 27- Efeito do extrato metanólico das folhas (3 – 100 mg/Kg) da G. achachairu sobre a dor induzida por formalina. A fase I (A) representa a dor neurogênica e a fase II (B) corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01;) quando comparados com o grupo controle.
Em relação à avaliação da primeira fase da dor sugere-se que os extratos não
inibem a liberação de neuropeptídeos e outras substâncias que produzem respostas
locais, uma vez que não demonstraram atividade para este modelo experimental. No
entanto, para a segunda fase da dor, sugere-se que os extratos metanólicos dos
galhos e das folhas inibem a liberação de mediadores como substância P,
bradicinina, citocinas, histamina, prostaglandinas e serotonina.
Considerando o maior rendimento, e na tentativa de biodirecionar a análise
fitoquímica das folhas, foi avaliada a atividade antinociceptiva no modelo de
formalina das frações acetato de etila, hexânica e clorofórmica. Como pode ser
observado, somente as frações de hexano e clorofórmio foram eficazes em reduzir o
tempo de reação na dose de 30 mg/Kg. Para a fração hexânica somete a 2º fase,
para a fração clorofórmica ambas as fases apresentaram atividade com percentuais
de inibição de 33 ± 8 %, 30 ± 6% e 33 ± 9 %, respectivamente.
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Ext. MeOH Folha G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Figura 28 - Efeito antinociceptivo das frações acetato de etila, hexânica e clorofórmica (3 – 100 mg/Kg) da G. achachairu sobre a dor induzida por formalina. A fase I (A, C, E) representa a dor neurogênica e a fase II (B, D, F) corresponde a dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
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Fr. Clorofórmica(mg/kg, i.p.)
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Fr. Clorofórmica(mg/kg, i.p.)
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Fr. Acetato de Etila(mg/kg, i.p.)
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Fr. Acetato de Etila(mg/kg, i.p.)
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Comparando as frações sugere-se que somente a fração clorofórmica foi
capaz de inibir a liberação de substâncias que produzem respostas locais,
relacionadas com a dor neurogênica. No entanto, as frações hexânica e clorofórmica
foram capazes de inibir a liberação de mediadores relacionados apenas com a dor
inflamatória. Novamente podemos perceber que a atividade antinociceptiva pode
estar relacionada com compostos mais apolares, uma vez que a fração acetato de
etila não demonstrou nenhuma atividade.
A gutiferona A (Figura 29), apresentou atividade antinociceptiva apenas na
dosagem de 3 mg/Kg, não apresentando dose dependência na primeira fase da
nocicepção com IM de 25 ± 5%, inibição significativa se levarmos em consideração o
paracetamol o qual foi usado como controle e apresenta uma IM de 30% ± 7%.
Na segunda fase da dor foi observado efeito antinociceptivo para as doses de
3 e 10 mg/Kg não apresentando índice de dose dependência, sendo a IM calculada
de 36 ± 5%. Se levarmos em consideração o paracetamol que apresentou IM de 38
±8 %, o efeito causado pela gutiferona A é muito semelhante, abrindo a possibilidade
de um estudo mais detalhado em outros modelos ou modificação estrutural.
Figura 29 - Efeito antinociceptivo da gutiferona A (1-30mg/Kg) sobre a dor induzida por formalina. A fase I (A) representa a dor neurogênica e a fase II (B) corresponde à dor inflamatória. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
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Gutiferona(mg/kg, i.p.)
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Paracetamol(mg/kg, i.p.)
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Estes dados são importantes uma vez que os fármacos de referência (AAS e
ACE) são inativos nesta primeira fase na dose de 10 mg/kg, e a dipirona embora
ativa nesta fase, apresenta uma DI50 de 51,4 (33,3 – 79,5) mg/kg (BEIRITH al.,
1998). Levando em consideração os resultados obtidos para a gutiferona A, sugere-
se que a mesma possui atividade frente a mediadores envolvidos tanto na dor
neurogênica como inflamatória.
5.3.3 Modelo de nocicepção induzido pela capsaicina
Neste modelo proposto por Sakurada, Katsumata, e Yogo (1993), procura-se
analisar a possível ação modulatória dos compostos sobre a dor de origem
neurogênica induzida pela capsaicina. O teste da dor com capsaicina tem como
objetivo, evidenciar a interação dos compostos em estudo sobre os neuropeptídeos
envolvidos na transmissão dolorosa, principalmente no sistema taquicinérgico.
Uma vez que a injeção com esta substância provoca uma estimulação direta
dos receptores específicos localizados nos neurônios nociceptivos, ocasionando a
liberação de diversos mediadores envolvidos na transmissão dolorosa, tais como as
taquicininas entre elas a substância P, neurocinina A e neurocinina B, peptídeos
relacionados ao gene da calcitonina (CGRP), somastatina, óxido nítrico e
aminoácidos excitatórios (SAKURADA; KATSUMATA; YOGO, 1993; SANTOS et al,
2008).
Acredita-se que a capsaicina atua através da ativação de receptores
específicos, denominados de receptores vanilóides do tipo 1 (TRPV1), presentes
principalmente nos gânglios da raiz dorsal da medula espinhal e no gânglio do
trigêmeo (FERREIRA; SILVA; CALIXTO, 2004; SANTOS et al, 2008).
Estudos demonstram que os receptores vanilóides estão acoplados a um
canal iônico permeável a cátions mono e divalentes, que quando ativado produz
despolarização e excitação dos neurônios levando a liberação de neuropeptídeos.
Na Figura 30 estão representados os resultados referentes ao modelo de
nocicepção induzida pela injeção intraplantar de capsaicina, de modo que os
parâmetros gráficos de apresentação foram os mesmos adotados nos resultados
anteriormente descritos.
62
Como pode ser observado, neste modelo, o extrato metanólico das sementes,
galhos e folhas não apresentaram atividade antinociceptiva estatisticamente
significativa.
Figura 30- Efeito do extrato metanólico da semente (A), galhos (B) e folhas (C) (10 e 30 mg/kg ), de G. achachairu sobre a dor induzida por capsaicina. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
De uma forma geral, pode-se observar que os extratos metanólicos não
possuem atividade antinociceptiva frente à capsaicina, sugerindo que os mesmos
não inibem a liberação de taquicininas, substância P, neurocinina A e B, peptídeos e
somastatina.
Por outro lado, conforme Figura 31, podemos observar atividade
antinociceptiva da gutiferona A, nas doses de 3 e 10 mg/kg. No entanto, esta
atividade não foi dose dependente. A inibição máxima calculada para este
experimento na dose de 3mg/Kg foi de 44 ± 7 %. Se compararmos a dipirona a qual
apresentou inibição máxima de 42 ± 6 %, na dose de 60 mg/kg, a gutiferona A se
mostrou mais efetiva em inibir o tempo de reação.
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Ext. MeOH Galhos G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Ext. MeOH Folhas G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Figura 31- Efeito da gutiferona A (0,3-10 mg/kg ), de G. achachairu sobre a dor induzida por capsaicina. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
Sugere-se, portanto que a gutiferona A, possa estar inibindo a liberação de
neurotransmissores liberados frente à capsaicina, ou até mesmo pode estar
bloqueando os receptores vanilóides. O fato de o extrato metanólico das sementes,
de onde foi isolada a gutiferona A não ter apresentado atividade pode estar
relacionado com a quantidade desta substância, ou com o sinergismo que possa
estar ocorrendo entre as substâncias presentes no extrato, interferindo, portanto, na
atividade.
5.3.3 Modelo de nocicepção induzida pelo glutamato
Este modelo proposto por Beirith, Santos e Calixto (1998) é aplicado para
substâncias que atuam sobre o sistema glutamatérgico envolvido na transmissão
nociceptiva (BUZZI et al, 2009). A injeção de glutamato induz a estimulação direta
dos neurônios nociceptivos, causando a liberação de vários mediadores
inflamatórios e neuropetídeos envolvidos na transmissão dolorosa. Portanto, este
teste foi empregado com o objetivo de evidenciar a possível interação dos
compostos com o sistema glutamatérgico.
O glutamato exerce seus efeitos pós-sinápticos via diversos receptores de
membranas, pertencentes tanto a classe dos ionotrópicos quanto metabotrópicos.
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Gutiferona(mg/kg, i.p.)
Dipirona(mg/kg, i.p.)
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Com relação aos receptores ionotrópicos, o receptor NMDA (N-metil-D-
aspartato) recebe particular atenção devido aos diversos papéis que desempenha
na transmissão sináptica excitatória, na plasticidade neuronal e na
neurodegeneração do SNC (PETRENKO et al., 2003)
Segundo Beirith e colaboradores (1998) a resposta nociceptiva induzida por
glutamato parece envolver sítios de ação periféricos, espinhais e supraespinhais os
quais são mediados por ambos os tipos de receptores: NMDA e os não NMDA.
Evidências mostram que a dor associada com a injúria tecidual ou nervosa periférica
envolve ativação dos receptores NMDA (PETRENKO et al., 2003). Os antagonistas
do NMDA têm demonstrado efeitos no alívio da dor, tanto em modelos animais como
em situações clínicas (FISHER; CODERRE; HAGEN, 2000).
Os resultados a seguir referem-se ao modelo de nocicepção induzida pelo
glutamato, e o parâmetro gráfico de apresentação foi o mesmo adotado nos
resultados anteriormente descritos.
Na Figura 32, pode-se observar que o extrato metanólico dos galhos e das
sementes promoveu efeito antinociceptivo moderado de maneira dose dependente
quando comparado aos animais do grupo controle, de modo que a IM foi de 43 ± 5%
e 49 ± 5%, respectivamente. Por outro lado, o extrato das folhas mostrou-se inativo
neste modelo.
Figura 32- Efeito antinociceptivodo extrato metanólico dos galhos (A), semente (B) e folhas (C) (10 e 30 mg/kg ), de G. achachairu sobre a dor induzida por glutamato. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
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Ext. MeOH Galhos G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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C
Ext. MeOH Semente G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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Ext. MeOH Folhas G. achachairu(mg/kg, i.p.)
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ção
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65
Em relação à nocicepção induzida pelo glutamato, a gutiferona A (Figura 33)
apresentou atividade nas doses de 3 e 10 mg/Kg, de maneira dose dependente, com
uma IM calculada de 39 ± 5%.
Figura 33- Efeito antinociceptivodo da gutiferona A (1-10 mg/Kg) sobre a dor induzida por glutamato. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett.Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
Neste sentido sugere-se que o extrato metanólico dos galhos, das sementes e
a gutiferona A podem estar inibindo diretamente a ação do glutamato através do
antagonismo de seus receptores ou inibindo a liberação de outros mediadores
inflamatórios.
5.4 Avaliação da atividade antiúlcera
A úlcera péptica é uma das principais desordens gastrointestinais. É causada
por um desequilíbrio entre fatores agressivos (secreção ácida) e protetores (muco e
bicarbonato). Conseqüentemente, reduzir a produção de ácido gástrico e reforçar a
produção de muco são as principais abordagens no tratamento desta doença
(ANDRADE et al, 2008).
Como parte das investigações para obter compostos com atividade antiúlcera,
ensaios foram realizados com o extrato metanólico dos galhos, das folhas e das
sementes da G. achachairu. O estudo foi realizado através da avaliação da atividade
0
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C 1 3 10 60
Gutiferona(mg/kg, i.p.)
Dipirona(mg/kg, i.p.)
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66
de proteção destes extratos contra lesões gástricas induzidas por etanol em
camundongos.
Os efeitos do tratamento com o extrato metanólico das sementes, folhas,
galhos e omeprazol sobre a área total de lesão no experimento de úlcera gástrica
induzida por etanol estão apresentados na Figura 34. Como pode ser observado, os
extratos metanólicos e o omeprazol reduziram em 74,1 %, 51,4 %, 32,8 % e 57,0 %,
respectivamente a área total de lesões ulcerativas.
C SE FO GA OME
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Figura 34- Área total da lesão ulcerada (mm2) em estômagos de animais induzida por etanol absoluto.
Os animais foram tratados com água (C), extrato metanólico das sementes (SE), folhas (FO) e galhos (GA) na dosagem de 500mg/Kg e omeprazol (OME) (30mg/Kg). Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett.Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
Os resultados obtidos (Figura 35) demonstraram que os pré-tratamentos com
os extratos (injetado 1 hora antes da indução da úlcera), na dose de 500mg/Kg e
com omeprazol na dose de 30mg/Kg foram capazes de reduzir a porcentagem de
área ulcerada em 73,5 %, 53,10%, 31,9 % e 77,91 %, respectivamente. Como pode
ser observado, o extrato metanólico das sementes reduziu de forma semelhante a
porcentagem de área lesada quando comparado ao omeprazol, um medicamento
usado como controle.
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C SE FO GA OME0
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da
Figura 35- Índice percentual de área ulcerada (mm2) em estômagos de animais induzida por etanol
absoluto. Os animais foram tratados com água (C), extrato metanólico das sementes (SE), folhas (FO) e galhos (GA) na dosagem de 500mg/Kg e omeprazol (OME) (30mg/Kg). Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett.Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
O índice de cura calculado a partir do Índice de Lesões Ulcerativas (ULI)
neste mesmo modelo experimental foi de 54,7%, 45,7%, 24,6% e 59,1% nos animais
tratados com extrato das sementes, folhas, galhos e omeprazol, respectivamente
(Figura 36). Se compararmos com o omeprazol observa-se que o extrato das
sementes reduziu as lesões de forma semelhante ao mesmo, sugerindo que
substâncias potencialmente ativas estão presentes nesta espécie.
C SE FO GA OME0
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Figura 36 - Índice de lesão ulcerativa em estômagos de animais em que foi induzida úlcera por etanol absoluto. Os animais foram tratados com água (C), extrato metanólico das sementes (SE), folhas (FO) e galhos (GA) na dosagem de 500mg/Kg e omeprazol (OME) (30mg/Kg). Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
68
A administração oral de etanol produz lesões (necroses) na mucosa com
aparecimento de úlceras em um curto espaço de tempo. Este processo envolve
diversos mecanismos, tais como redução do fluxo sanguíneo gástrico (contribuindo
para o desenvolvimento da hemorragia) e solubilização dos constituintes da mucosa
do estomago (KINOSHITA, M.; TSUNEHISA, N.; TAMAKI, H, 1995). Estas ações
resultam em maior fluxo de Na+ e K+, aumentando a secreção de pepsina, de íons
H+ e histamina no lúmen (SZABO, S, 1987; ANDRADE et al, 2008). Baseado no
exposto, nossos resultados sugerem que compostos presentes nestes extratos
podem estar atuando em parte por este mecanismo. No entanto, outros ensaios
mais específicos são necessários para realmente comprovar o mecanismo de
gastroproteção.
De acordo com os resultados apresentados neste modelo, observamos que o
extrato metanólico das sementes apresentou uma atividade antiulcerativa maior
quando comparado aos demais grupos (galhos e folhas). Por esta razão, optamos
por trabalhar com o extrato da semente, neste mesmo modelo experimental em
diferentes doses 50 mg, 250 mg e 500 mg/Kg.
Os resultados obtidos (Figura 37) demonstraram que para a porcentagem de
área ulcerada o extrato metanólico das sementes nas doses de 50, 250 e 500 mg/Kg
e o grupo do omeprazol 30 mg/Kg tiveram redução significativa na porcentagem de
lesão em 79,4 % 76,26 %, 92,6 % e 90,8 %, respectivamente.Por outro lado, os
extratos em diferentes dosagens não demonstraram dose dependência.
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C 50 mg 250 mg 500 mg OME0
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% á
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Figura 37- Índice de % de área ulcerada (mm2) em estômagos de animais em que foi induzida úlcera
por etanol absoluto. Os animais foram tratados com água, extrato metanólico das sementes na
dosagem de 50, 250 e 500 mg/Kg e omeprazol 30 mg/Kg. Cada coluna representa a média de seis
animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste
de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p
<0,01) quando comparados com o grupo controle.
Com relação à área total de lesão observou-se (Figura 38) que o extrato
metanólico das sementes nas diferentes dosagens 50, 250 e 500 mg/Kg e
omeprazol 30mg/Kg apresentaram significativa atividade antiulcerativa reduzindo
em 83,19%, 83,71%, 96,0% e 84,53% a área lesada.
C 50 mg 250 mg 500mg OME
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Figura 38- Área total de lesão ulcerada (mm2) em estômagos de animais em que foi induzida úlcera
por etanol absoluto. Os animais foram tratados com água (C), extrato metanólico das sementes na dosagem de 50, 250 e 500 mg/Kg e omeprazol 30 mg/Kg. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett.Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01 ) quando comparados com o grupo controle.
70
A análise do índice de lesão ulcerativa para este mesmo modelo experimental
(Figura 39) demonstrou que o extrato metanólico das sementes em diferentes
dosagens e o omeprazol reduziram significativamente o índice de lesões quando
comparados ao controle em 53,21%, 55,67%, 90,7% e 67,2%, respectivamente.
C 50 mg 250 mg 500 mg OME
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Figura 39- Índice de lesão ulcerativa (mm2) medido em estômagos de animais em que foi induzida úlcera por etanol absoluto. Os animais foram tratados com água (C), extrato metanólico das sementes na dosagem de 50, 250 e 500 mg/Kg e omeprazol 30 mg/ Kg. Cada coluna representa a média de seis animais e as barras verticais indicam os erros padrão da média. ANOVA de uma via seguido do teste de comparação de múltipla de Dunnett. Asteriscos indicam diferenças significativas (*p <0,05; ** p <0,01) quando comparados com o grupo controle.
Diante do exposto podemos perceber que o extrato metanólico das sementes
apresentou uma atividade superior na dose de 500 mg/Kg, não apresentando dose
dependência para este experimento.
Conhecer a atividade farmacológica das substâncias presentes nas espécies
estudadas sempre foi o objetivo de todo o trabalho envolvendo plantas, portanto um
estudo mais detalhado do extrato metanólico das sementes se faz necessário, uma
vez que este apresentou atividade antiulcerogênica superior ao grupo tratado com
omeprazol que é um dos fármacos utilizados nesta patologia. Novos experimentos
podem ser realizados com o extrato metanólico das sementes e com a gutiferona A,
já isolada, tais como indução de úlcera por antiinflamatórios não esteroidais, indução
de úlcera gástrica por ácido acético e os distintos mecanismo de ação envolvidos
com a atividade antiulcerogênica.
71
6.0 Conclusões
Do extrato metanólico das sementes da Garcinia achachairu foi possível isolar
a Gutiferona A.
Da fração clorofórmica das folhas isolou-se a amentoflavona e GB1a.
O extrato metanólico das sementes e dos galhos, a fração hexânica das
folhas e a gutiferona A apresentaram significativa atividade antinociceptiva
para o teste de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético.
Para o modelo de nocicepção induzido pela formalina o extrato metanólico
dos galhos apresentou atividade antinociceptiva significativa para a dor
inflamatória e a gutiferona A apresentou atividade semelhante ao
paracetamol.
A gutiferona A apresentou atividade antinociceptiva para o modelo de
nocicepção induzida pela capsaicina superior a dipirona.
O extrato metanólico das sementes e dos galhos e a gutiferona A
demonstraram atividade antinociceptiva significativa em relação ao modelo de
nocicepção induzida pelo glutamato.
Para o experimento de úlcera induzido por etanol, o extrato metanólico das
sementes reduziu significativamente a área total de lesão, % de área ulcerada
e o índice de lesões ulcerativas.
No experimento de úlcera induzida por etanol, o extrato metanólico das
sementes na dose de 500 mg/Kg apresentou uma melhor atividade, não
apresentando no entanto dose dependência.
72
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