UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Química...
135
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Química CARLOS DIEGO LIMA DE ALBUQUERQUE DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA RAMAN INTENSIFICADA PELA SUPERFÍCIE E QUIMIOMETRIA CAMPINAS 2016
Transcript of UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Instituto de Química...
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Química
CARLOS DIEGO LIMA DE ALBUQUERQUE
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA RAMAN INTENSIFICADA PELA SUPERFÍCIE E
QUIMIOMETRIA
CAMPINAS
2016
CARLOS DIEGO LIMA DE ALBUQUERQUE
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZANDO ESPECTROSCOPIA RAMAN INTENSIFICADA PELA SUPERFÍCIE E
QUIMIOMETRIA
Tese apresentada ao Instituo de
Química da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de
Doutor em Ciências.
Orientador: Ronei Jesus Poppi
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO ALUNO CARLOS DIEGO LIMA DE ALBUQUERQUE, E ORIENTADA PELO PROF.DR. RONEI JESUS POPPI.
CAMPINAS
2016
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Célia Regina e José Carlos, principalmente a minha mãe guerreira que sempre me instruiu a estudar. Amo vocês.
Ao meu irmão e minha avó Maria (in memorian) pelo carinho e amor que sempre me deram.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente gostaria de agradecer a Deus e a Nossa Senhora Aparecida por
terem me guiado o meu caminho até este momento ímpar.
Ao meu orientador Ronei J. Poppi, o qual agradeço pela confiança, pelos
ensinamentos: específicos e de vida; que sempre tão solicito e preocupado
com a formação e durante o desenvolvimento deste trabalho. Orgulho-me
muito por ter participado do seu grupo de pesquisa.
Ao professor Alexandre B. Brolo, por ter me recebido muito bem no seu grupo
de pesquisa na University of Victoria – CA, na qual pude ter uma das
experiências mais marcantes de vida, cultural e também academicamente.
Ao professor Márcio P. Pedroso, por ser um dos grandes responsáveis pela
minha vinda para a Unicamp.
Aos meus amigos e colegas do LAQQA: Paulo R. Filgueras, Guilherme L.
Alexandrino, Marina, Humberto, Felipe, Javier, Monica, Guto, Carlos Texeira,
Luciana Oliveira, Thiago, Luciana Terra e Mariana; pelo agradável convívio e
discussões proveitosas.
Aos amigos da University of Victoria: Leo Furini, Fernando, Muyang (Mike),
Regie, Nick, JiaYi He, Alex, Mahdieh, Sabrina, Koh Yiin; pelo agradável
convívio e discussões proveitosas.
Aos meus amigos do futebol da Química e da academia: Rodrigão, P2, Dênio e
outros; pela agradável convívio e ajuda para sair da rotina nos momentos
difíceis.
Ao Instituto de Química e a Unicamp por fornecerem toda a estrutura e pessoal
para ser possível o desenvolvimento deste trabalho.
Ao CNPq (processo no140706/2013-5), a Funcamp (processo no5028) e o
programa Ciência sem Fronteiras (processo no10880/14-3) pelo apoio
financeiro.
RESUMO
A espectroscopia Raman apresenta diversas vantagens analíticas práticas: mínimo preparo de amostra, ser não destrutiva e permitir trabalhar em soluções aquosas; porém, a falta de sensibilidade é um fator limitante desta técnica. Por outro lado, a espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) contorna este problema, permitindo alcançar baixos limites de detecção, até no regime de uma única molécula (single-molecule), e com as mesmas vantagens práticas da técnica Raman. Desde a descoberta de SERS até os dias atuais aconteceram importantes avanços no desenvolvimento de novas nanopartículas para o aumento da intensificação do sinal incluindo o desenvolvimento de novos substratos com alto padrão de reprodutibilidade. Sendo assim, esta tese de doutorado visou demonstrar e avaliar a técnica SERS para diferentes aplicações no âmbito da química analítica com o suporte de robustos métodos de calibração e resolução multivariadas. Na primeira aplicação, a quantificação de dois hormônios, 17β-estradiol e noradrenalina, em soro de cães foi proposta empregando calibração multivariada pelo método probabilístico floresta randômica. Na segunda aplicação, a identificação in situ do agrotóxico, malation, em cascas de frutas foi realizada utilizando diferentes métodos de resolução multivariada de curvas. Na terceira aplicação, um novo método foi desenvolvido para a calibração multi-produto de melamina em duas diferentes matrizes de leite. A quarta aplicação, consistiu no desenvolvimento de um método para solucionar o desafio na quantificação SERS em soluções extremamente diluídas, na qual foi determinado um contaminante emergente em água: o enrofloxacin.
ABSTRACT
Raman spectroscopy has several practical analytical advantages: minimal sample preparation, non-destructivity and it allows working with aqueous solutions; however, the lack of sensitivity is a limiting factor from this technique. On the other hand, surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) solves this problem, allowing to reach low limits of detection, single-molecule, and with the same practical advantages of Raman spectroscopy. Since SERS was discovery until nowadays several advances had been occurred in the development of new nanoparticles for improving the signal enhance and new substrate with high reproducibility pattern. So, this thesis was focused to show and to evaluate the SERS technique for different applications in analytical chemistry scope with the support of the robust methods of multivariate calibration and resolution. In the first study, the quantification of two hormones, 17β-estradiol and noradrenaline in dog serum was performed by multivariate calibration using the probabilistic method: random forest. In the second study, the in situ identification of pesticide: malathion; in fruit peels was done using different multivariate curve resolution methods. In the third study, a new method was developed for multi-product calibration of melamine in two different milks matrices. In the fourth study, the development of method/algorithm for solving the challenge in the SERS quantification in ultra-low diluted solutions, emergent contaminant (enrofloxacin), was carried out.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 2.1. (A) Esquema dos espalhamentos elásticos (Stokes e Anti-Stokes) e inelásticos (Rayleigh) (Modificado de Sasic & Ozaki [14]) (B) esquema dos mecanismos quânticos de espalhamento e absorção........................................................ 26
Figura 2.2. Esquema ilustrando a geração de ressonância de plasmons de superfície localizada (LSPR) sobre as nanopartículas de ouro. ......................................................... 30
Figura 2.3. Formação dos “hotspots” (A) imagens de TEM de AuNPs; (B) Aumento do campo elétrico local devido ao acoplamento entre os campos elétricos de duas nanopartículas esféricas (Adaptado de [20]). ...................................................................... 31
Figura 2.4. Superfície recoberta com AuNPs em (A) alta concentração do analito: SERS average, (B) baixíssima concentração do analito: SM-SERS; Histograma de frequência para (C) SERS average e (D) SM-SERS. Em roxo as AuNPs imobilizadas sobre uma superfície de vidro, em amarelo os “hotspots”, em vermelho o analito e a linha vermelha é valor médio das intensidades. .................................................................. 33
Figura 2.5. Representação esquemática do experimento do bianalito para o SM-SERS. (A) evento nulo; (B) molécula verde, (C) molécula azul e (D) ambas as moléculas no “hotspot”. .................................................................................................................................... 34
Figura 3.1. Esquema de equipamento Raman moderno com notch filters e um detector CCD. ........................................................................................................................................... 36
Figura 3.2. Esquema representando um sistema com monocromador tipo echelle contido no espectrômetro PerkinElmer Raman Station (400F) utilizado nesta tese (aplicações 1 a 3). .................................................................................................................... 37
Figura 3.3. Espectrômetro Raman para obtenção de imagem hiperespectral. .............. 38
Figura 3.4. Esquema de aquisição de espectros Raman pontuais em: (A) alta concentrações; (B) baixas concentrações; e (C) mapeamento pontual. ......................... 39
Figura 3.5. Esquema de um microscópio Raman confocal baseado no equipamento Raman inVia da Renishaw. (A) acoplamento espectrômetro microscópio; (B) Esquema óptico do microscópio. ............................................................................................................. 39
Figura 4.1. Representação da organização dos dados na forma de uma matriz de respostas ( X ) e um vetor de concentrações ( y ) para o desenvolvimento de um modelo
matemático multivariado num procedimento de calibração. ............................................. 43
Figura 4.2. Representação dos dados partindo do modelo univariado ao multivariado com suas respectivas vantagens em relação a manipulação de interferentes baseado no ponto de vista da química analítica. ................................................................................. 44
Figura 4.3. Correção da linha base pelo AsLS (A) antes e (B) depois da correção. ..... 46
Figura 4.4. Representação hipotética de um fluxograma baseado em árvores. IMC – índice de massa corpórea. ...................................................................................................... 49
Figura 4.5. Esquema hipotético exemplificando um procedimento de classificação utilizando árvores de decisão pelo método classificação e regressão de árvores (CART). (A) etapa de treinamento e (B) etapa de classificação. ...................................... 51
Figura 4.6. Esquema mostrando o procedimento de reamostragem bagging (bootstrap aggregation) utilizado em floresta randômica. ..................................................................... 54
Figura 4.7. Esquema hipotético exemplificando um procedimento de regressão utilizando árvores de decisão pelo método classificação e regressão de árvores (CART). ...................................................................................................................................... 55
Figura 5.1. Solução coloidal de nanopartículas de ouro (AuNPs) sintetizadas pelo método clássico de Lee-Meisel [57]. (A) solução coloidal; (B) AuNPs após o procedimento de concentração; (C) Espectro de extinção das AuNPs antes do procedimento de concentração; (D) imagens de TEM das AuNPs antes do procedimento de concentração (tamanho médio aproximado de 62 nm). ...................... 63
Figura 5.2. (A) Substrato de vidro funcionalizada com APTMS e recoberto com AuNPs; (B) suporte em alumínio utilizado para as medidas. Imagens de AFM (C) em 2 dimensões e (D) 3 dimensões. ............................................................................................... 64
Figura 6.1. Esquema resumido das etapas da metodologia de análise desenvolvida para a quantificação dos hormônios nos soros de cães. ................................................... 70
Figura 6.2. Espectros de extinção da solução coloidal de ouro. A linha na vertical em verde indica a linha do laser utilizado (785 nm). ................................................................. 71
Figura 6.3. Pré-processamento do espectros descrito em etapas. AsLS: do inglês asymmetric least squares. ...................................................................................................... 72
Figura 6.4. Resultados para o erro relativo percentual calculado para a calibração/validação para (A) estradiol e (B) noradrenalina.............................................. 74
Figura 6.5. Resíduos dos modelos de calibração para (A) estradiol e (B) noradrenalina. Teste de permutação aplicado para (C) estradiol e (D) noradrenalina. Linha em verde na vertical é o valor de b2 calculado antes da permutação. Número de permutações igual 50.000 e os polinômios ajustados foram o de 2º grau. ............................................. 75
Figura 6.6. Estimativa das importâncias das variáveis para o modelo RF (A) 17β-estradiol (E2) e (B) noradrenalina (NE). ............................................................................... 77
Figura 7.1. Esquema do procedimento utilizado para a detecção dos resíduos de pesticidas. .................................................................................................................................. 83
Figura 7.2. Esquema do tratamento de dados realizado para obtenção das imagens químicas e espectros puros. ................................................................................................... 84
Figura 7.3. Espectros SERS pontuais; (a) Espectros SERS do malation em todas as condições de trabalho; (b) Espectros SERS para o tomate e para o malation nas concentrações de 12,3 mg L-1. (c) Espetros SERS para a ameixa e para o malation nas concentrações de 12,3 mg L-1. ............................................................................................... 85
Figura 7.4. (a) todos os espectros do mapeamento do tomate pré-processados por normalização e AsLS; (b) comparação entre o desvio padrão e média do espectro SERS; (c) matriz de covariância do erro (ECv); (d) matriz de correlação do erro (ECr) para os canais entre 1768-892 cm-1. ..................................................................................... 87
Figura 7.5. (a) Todo os espectros do mapeamento da ameixa pré-processados por AsLS; (b) comparação entre o desvio padrão e a média do espectro SERS (c) matriz de covariância do erro (ECv) e (d) matriz de correlação do erro (ECr) para os canais na faixa entre 1712-696 cm-1. ................................................................................................. 88
Figura 7.6. Comparação dos espectros recuperados do tomate e do malation recuperado pelos métodos NMF-ALS e MCR-ALS. ........................................................... 90
Figura 7.7. Resultados do NMF-ALS para o tomate; (a) recuperação do NMF-ALS para os espectros do tomate e da ameixa; (b) mapeamento para o tomate (c) mapeamento para o malation (12,30 a 0,12 mg L-1). .................................................................................. 91
Figura 7.8. Resultados do MCR-WALS para a ameixa; (a) recuperação do MCR-WALS para os espectros de fluorescência, ameixa e malation; (b) mapeamento para a fluorescência; (c) mapeamento para a ameixa (d) mapeamento para o malation (12.3 a 0.123 mg L-1). ............................................................................................................................ 92
Figura 7.9. (A) Escores médios do NMF-ALS versus concentração esperada na casca para o tomate e (B) Escores médios do MCR-WALS versus concentração esperada na casca para a ameixa. ............................................................................................................... 93
Figura 8.1. Esquema ilustrando o NMF-ALS com restrição de correlação múltipla. ..... 99
Figura 8.2. Esquema ilustrando o procedimento experimental realizado para o desenvolvimento dos modelos de calibração de melamina nos diferentes produtos. 102
Figura 8.3. Espectros SERS dos conjuntos de calibração e validação para os diferentes produtos antes (A) e depois (B) da correção da linha base pelo algoritmo quadrados mínimos assimétricos (AsLS). .......................................................................... 102
Figura 8.4. Curva de calibração dos escores do NMF sem restrição de correlação múltipla versus concentração nominal para ambos os produtos. ................................... 103
Figura 8.5. Perfis espectrais recuperados pelo método NMF com restrição de correlação múltipla para ambos os produtos contaminados com melamina. ............... 104
Figura 8.6. Concentração prevista pelo NMF-ALS com correlação múltipla versus concentração nominal para ambos os produtos................................................................ 105
Figura 9.1. Esquema do procedimento de decomposição dos dados por NMF-ALS para as imagens hiperespectrais e a etapa de digitalização dos escores para o desenvolvimento da curva de calibração digital. ............................................................... 112
Figura 9.2. Esquema resumido do procedimento experimental realizado para a aquisição dos dados de imagem hiperespectral. .............................................................. 114
Figura 9.3. Resultados PCA para os dados de enrofloxacin. (A) loadings com os 4 fatores mais importantes; (B) Histograma de frequência para as diferentes concentrações de enrofloxacin. A linha vermelha representa o valor médio das intensidades calculados pelos escores. .............................................................................. 116
Figura 9.4. Curva de calibração para os valores em (A) SERS average e (B) SM-SERS; Histograma mostrando a concentração de 200 ppm (SERS average versus o (D) SM-SERS. ......................................................................................................................... 118
Figura 9.5. Resultados obtidos após o procedimento de calibração SERS digital: (A) Mapas de concentrações digitalizados (B) Curva de calibração SERS digital; (C) Comparação dos espectros médios calculados para o valor digital “0” e valor digital “1”. ................................................................................................................................................... 119
Figura 9.6. Prova do conceito do SM-SERS. (A) Representação dos espectros recuperados pelo NMF-ALS para o ciprofloxacin (CIPRO) e seu isótopo (CIPRO-ISO); (B) Mapa digital dos resultados para CIPRO (azul) e CIPRO-ISO (vermelho). Os círculos em verde representam quando as duas moléculas estavam presentes nos “hotspots”. ................................................................................................................................ 120
LISTA DE TABELAS
Tabela 6.1. “Performance” dos modelos RF para a quantificação dos hormônios em soro de cães. ............................................................................................................................. 73
Tabela 7.1. Resultados dos modelos de resolução de curvas. ......................................... 89
Tabela 8.1. Comparação entre os modelos NMF-ALS com restrição de CL e o PLSR. ................................................................................................................................................... 106
Tabela 8.2. Figuras de mérito para os dados de validação utilizando a calibração pseudo-univariada calculada a partir do modelo NMF-ALS com restrição de correção múltipla. .................................................................................................................................... 107
Tabela 8.3. Figuras de mérito adicionais para o modelo NMF-ALS com restrição de correlação múltipla. ................................................................................................................ 108
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
(Fast Combinatorial NNLS, FCNNLS), 57
(LOF, Lack of fit), 60
(NMF, non-negative matrix factorization), 57
(WALS, do inglês weighted alternating least squares), 58
AFM, do inglês atomic force microscopy, 63
APTMS (do inglês, 3-Aminopropyl)trimethoxysilane), 63
AsLS, do inglês asymmetric least squares, 45
ASTM, do inglês american society for testing and materials, 69
AuNPs, do inglês gold nanoparticles, 20
bootstrapping aggregation (bagging), 52
CART, do inglês classification and regression trees, 50
CCD, do inglês Charge-Coupled Device, 36
CCα, do inglês decision limit, 106
CIPRO, ciprofloxacin, 111
CIPRO-ISO, do inglês isotopically-ciprofloxacin, 120
DC-SERS, do inglês digital calibration SERS,
112
D-SERS, do inglês digital SERS, 111
E2, 17β-estradiol, 66
EC, do inglê European Commission,
107
ECM, error covariance matrix, 81
EF, do inglês enhancement fator, 29
EFA, do inglês envolving factor analysis, 56
ELISA, do inglês enzyme-linked immunosorbent assay, 21
ENRO, enrofloxacin, 111
FDA (do inglês, Food and Drug Administration), 80
HPLC, do inglês high performance liquid chromatography, 80
ICA, do inglês independent component analysis, 121
importância das variáveis (ImpVar), 56
índice de massa corpórea (IMC), 49
LC-MS-MS, do inglês liquid chromatography tandem mass spectrometry, 96
LOD, do inglês limit of detection, 106
LSPR, do inglês localized surfasse plasmon ressonance, 29
matriz covariância do erro (ECv), 59
matriz de erro de correlação (ECr), 60
MCR-ALS, do inglês multivariate resolution curve with alternating least squares, 20
MRL, do inglês maximum residue limit, 96
NE, noradrenalina, 66
NNLS (FNNLS, Fast NNLS), 57
out-of-bag (OOB), 52
PCA, do inglês principal componente analysis, 97
PLS, do inglês partial least squares, 47
PLSR, do inglês partial least squares regression, 98
PURE, do inglês purest variable detection method, 56
quadrados mínimos não negativos (NNLS, Non-Negative Least Square), 57
RF, do inglês random forest, 22
RMSE, root-mean squares error, 68
RMSEOOB, do inglês root-mean squares error out-of-bag, 68
RR, do inglês resonance Raman, 27
SERS, do inglês surface enhanced Raman spectroscopy, 19
SIMPLISMA, do inglês simple-to-use interactive self-modeling mixture analysis, 56
SM-SERS, do inglês single-molecule surface enhanced Raman spectroscopy, 21
TEM, do inglês transmission electron microscopy, 62
UHT, do inglês ultra-high temperature,
22
Sumário
1. Introdução ................................................................................................... 19
1.1. Introdução Geral .................................................................................... 19
1.2. Objetivo Geral ....................................................................................... 20
1.2.1. Objetivos específicos ....................................................................... 20
1.3. Estrutura da tese ................................................................................... 21
2. Espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) ........................... 25
2.1. A espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) .................. 25
2.1.1. O espalhamento Raman .................................................................. 25
2.1.2. O mecanismo do espalhamento Raman intensificado pela superfície (SERS) 28
2.1.2.1. Efeito químico.............................................................................. 29
2.1.2.2. Efeito eletromagnético .................................................................. 29
2.1.2.3. Espectro de extinção .................................................................... 30
2.2. Detecção no regime de uma única molécula (SM-SERS) .......................... 30
2.2.1. Os Hotspots e o Sinal SERS ............................................................ 31
2.2.2. A estatística complexa do SM-SERS ................................................ 32
2.2.3. Série isotopóloga ............................................................................ 33
3. Equipamentos Raman .................................................................................. 36
3.1. Espectrômetro Raman ........................................................................... 36
3.1.1. Equipamento Raman dispersivo ....................................................... 36
3.2. Equipamento Raman para imagens hiperespectrais ................................. 37
3.3. Equipamento Raman acoplado a um microscópio confocal ....................... 39
4. Métodos quimiométricos ............................................................................... 42
4.1. Quimiometria ......................................................................................... 42
4.2. Pré-processamento dos dados ............................................................... 45
4.2.1. Correção da linha base .................................................................... 45
4.2.1.1. Mínimos quadrados assimétricos (AsLS) ....................................... 45
4.2.1.2. Normalização .............................................................................. 46
4.3. Calibração multivariada .......................................................................... 47
4.3.1. Quadrados mínimos parciais (PLS) ................................................... 47
4.3.2. Métodos probabilísticos baseados em árvores de decisão .................. 48
4.3.2.1. Classificação e regressão de árvores (CART) ................................ 50
4.3.2.2. Floresta randômica (RF) ............................................................... 52
4.4. Métodos baseados na resolução multivariada de curvas ........................... 56
4.4.1. Fatoração não negativa de matriz (NMF-ALS) ................................... 57
4.4.2. MCR com mínimos quadrados alternados ponderados (MCR-WALS) .. 58
4.5. Avaliação dos modelos quimiométricos.................................................... 60
4.5.1. Avaliação dos modelos MCR............................................................ 60
5. Síntese, imobilização e caracterização das AuNPs ......................................... 62
5.1. Solução coloidal .................................................................................... 62
5.2. Imobilização das AuNPs ......................................................................... 63
6. Aplicação 1: SERS e métodos de calibração multivariada usando Floresta Randômica para a quantificação de hormônios em soro de cães ............................ 66
6.1. Introdução ............................................................................................. 66
6.2. Procedimento experimental .................................................................... 67
6.2.1. Coleta das amostras de soro ............................................................ 67
6.2.2. Síntese e concentração das nanopartículas ....................................... 67
6.2.3. Instrumentação ............................................................................... 68
6.2.4. Método de referência ELISA ............................................................ 68
6.2.5. Tratamento dos dados ..................................................................... 68
6.3. Resultados e discussão.......................................................................... 69
6.3.1. Metodologia desenvolvida ................................................................ 69
6.3.2. Caracterização das nanopartículas e espectros SERS dos hormônios nas amostras de soro ......................................................................................... 70
6.3.3. Desenvolvimento e validação dos modelos de calibração ................... 73
6.3.4. Importância das variáveis para a floresta randômica .......................... 75
6.4. Conclusões ........................................................................................... 77
7. Aplicação 2: SERS e métodos de resolução multivariada de curvas para a detecção in situ de agrotóxico em casca de frutas ................................................. 80
7.1. Introdução ............................................................................................. 80
7.2. Procedimento experimental .................................................................... 81
7.2.1. Solucões e reagentes ...................................................................... 81
7.2.2. Síntese do colóide ........................................................................... 82
7.2.3. Espectrômetro Raman de Imagem ................................................... 82
7.2.4. Análise e tratamento dos dados........................................................ 82
7.3. Resultados e discussão.......................................................................... 84
7.3.1. Detecção por SERS ........................................................................ 84
7.3.2. Pré-processamento ......................................................................... 85
7.3.3. Medida da matriz de covariância dos erros (ECMs) ............................ 86
7.3.4. Resultados para o MCR-ALS, NMF-ALS e MCR-WALS ...................... 88
7.3.5. Resultados quantitativos para o MCR-ALS, NMF-ALS e MCR-WALS .. 92
7.4. Conclusões ........................................................................................... 93
8. Aplicação 3: Desenvolvimento de um método para quantificação de melamina em diferentes matrizes de leite .................................................................................. 96
8.1. Introdução ............................................................................................. 96
8.1.1. NMF-ALS com restrição de correlação múltipla .................................. 98
8.2. Procedimento experimental .................................................................. 101
8.2.1. Síntese do colóide ......................................................................... 101
8.2.2. Espectrômetro Raman ................................................................... 101
8.2.3. Conjuntos de calibração e validação ............................................... 101
8.2.4. Medidas ....................................................................................... 101
8.3. Resultados e discussão........................................................................ 102
8.3.1. “Performance” e espectros recuperados .......................................... 102
8.3.2. Comparação com o método de calibração multivariada .................... 105
8.3.3. Validação ..................................................................................... 106
8.4. Conclusões ......................................................................................... 108
9. Aplicação 4: Desenvolvimento de um método para quantificação de enrofloxacin em águas em concentrações ultra-diluídas utilizando calibração SERS digital ........ 110
9.1. Introdução ........................................................................................... 110
9.2. Calibração SERS digital (DC-SERS) ..................................................... 111
9.3. Procedimento experimental .................................................................. 113
9.3.1. Síntese do coloide e preparação do substrato ................................. 113
9.3.2. Espectrômetro Raman confocal ...................................................... 113
9.3.3. Procedimento experimental ............................................................ 113
9.4. Resultados e discussão........................................................................ 114
9.4.1. Caracterização das AuNPs e do substrato ....................................... 114
9.4.2. Avaliação preliminar dos dados ...................................................... 115
9.4.3. Calibração SERS average versus SM-SERS ................................... 117
9.4.4. Digital SERS ................................................................................. 119
9.4.5. Experimento da série isotopóloga ................................................... 120
9.5. Conclusões ......................................................................................... 121
Considerações finais ......................................................................................... 123
Perspectivas futuras.......................................................................................... 125
Referências bibliográficas .................................................................................. 127
18
Capítulo1: Introdução
19
1. Introdução
1.1. Introdução Geral
A partir das observações realizadas por Fleischmann et al. [1] em 1974 do
efeito da intensificação do sinal Raman da piridina adsorvida numa superfície
rugosa de um eletrodo de prata, foi aberta uma nova fase para aplicações da
espectroscopia Raman. Com o procedimento adotado foi contornado a baixa
secção de choque da técnica, quando comparada a outras técnicas
espectroscópicas, e fez surgir a espectroscopia Raman intensificada pela
superfície (SERS, do inglês surface enhanced Raman spectroscopy). O efeito
SERS é caracterizado pela intensificação do espalhamento Raman, em várias
ordens de magnitude (104 a 107 vezes), que ocorre devido à interação da
radiação eletromagnética com as nanopartículas metálicas, tais como Ag, Au
ou Cu.
SERS apresenta como principais vantagens baixos limites de detecção e
quantificação, chegando até o regime de uma única molécula [2], que
apresenta características interessantes para a química analítica,
principalmente, devido à simplicidade e à ausência da necessidade de preparo
de amostra na maioria dos casos. Isso permite sua aplicação em diversificadas
áreas e em ambientes totalmente adversos, como: in vivo, in situ, in vitro e ex
vivo, na investigação de drogas [3], na identificação e detecção de pesticidas
[4], no monitoramento ambiental intracelular [5] e na quantificação em amostras
biológicas como urina [6] e soro [7].
Com os recentes avanços na área de nanofabricação e síntese das
nanopartículas metálicas [8], praticamente o conhecido problema de falta de
reprodutibilidade em SERS foi minimizado [9, 10], elevando consideravelmente
o número de aplicações em química analítica. Entretanto, do ponto de visto
analítico, as aplicações com amostras reais de alta complexidade ainda têm
sido um desafio. Por exemplo, realizar a calibração na presença de
interferentes muitas das vezes desconhecidos, que podem depreciar o sinal
SERS e dificultar a detecção e quantificação do analito de interesse. Para
resolver este problema é adequado o uso de ferramentas estatísticas mais
robustas, tais como as contidas em quimiometria, como realizado no trabalho
20
descrito por Mamián-López & Poppi [11]. Os autores utilizaram o método
resolução multivariada de curvas com mínimos quadrados alternados (MCR-
ALS, do inglês multivariate resolution curve with alternating least squares) e o
método de adição de padrão para a determinação de nicotina em urina, na qual
a quantificação pode ser realizada na presença de interferentes não
conhecidos sem a sua separação física. Como vantagens práticas do método
podem-se destacar o não pré-tratamento de amostras, apenas um
procedimento de diluição foi necessário, e o uso de uma síntese clássica muito
simples de nanopartículas de ouro (AuNPs, do inglês gold nanoparticles). Além
disso, outros trabalhos têm surgido na literatura [4, 7] aliando o alto potencial
da técnica SERS com métodos quimiométricos de resolução de curvas e
calibração multivariada, possibilitando o desenvolvimento de novas ferramentas
para análise em matrizes complexas.
1.2. Objetivo Geral
Como objetivo geral dessa tese, pretende-se utilizar a espectroscopia
Raman intensificada pela superfície (SERS) aliada a métodos quimiométricos
para o desenvolvimento de novas metodologias analíticas aplicadas a matrizes
complexas, para os quais os métodos convencionais apresentam limitações.
1.2.1. Objetivos específicos
1) Desenvolver um método automatizado para a calibração multivariada de
dois hormônios, 17β-estradiol e noradrenalina, em soro de cães após a
suplementação de medicamentos contra hipertensão utilizando SERS e
Floresta Randômica;
2) Desenvolver um método para a detecção in situ do pesticida malation
em cascas de tomate e ameixa utilizando imagem hiperespectral SERS
e diferentes métodos de resolução multivariada de curvas;
3) Desenvolver um novo método/algoritmo para a calibração multiprodruto
de melamina em matrizes lácteas, UHT e Fórmula Infantil, utilizando
21
SERS e uma nova abordagem de metodologia para resolução
multivariada de curvas com múltipla restrição de correlação;
4) Desenvolver um novo método/algoritmo para a calibração multivariada
do antibiótico, enrofloxacin, em soluções extremamente diluídas
utilizando SERS, resolução multivariada de curvas e calibração SERS
digital.
1.3. Estrutura da tese
Nesta Tese foram desenvolvidos métodos para a identificação e
determinação de hormônios, pesticida, contaminante de matrizes lácteas e
contaminante emergente em água baseados em SERS e quimiometria. Os
resultados estão resumidos em quatro aplicações distintas entre si,
estruturadas na forma de capítulos.
No primeiro capítulo, é composto pela introdução geral, objetivo geral e
objetivos específicos e uma breve discussão sobre a estrutura desta Tese. No
segundo capítulo é apresentada de forma simplificada a teoria SERS e seus
mecanismos, assim como a teoria do single-molecule SERS (SM-SERS), que
faz parte da última aplicação. No terceiro capítulo são apresentados os
equipamentos Raman utilizados e suas principais diferenças e vantagens num
ponto de vista prático.
No quarto capítulo é abordada a teoria que envolve os métodos
quimiométricos de calibração e resolução multivariada de curvas que foram
empregados nas aplicações descritas a seguir. No quinto capítulo foi discutido
a síntese e caracterização das AuNPs utilizadas em todas as aplicações da
tese.
Na primeira aplicação, sexto capítulo, é apresentado o desenvolvimento da
metodologia para quantificação dos hormônios 17β-estradiol e noradrenalina
em soro de cães após a suplementação de medicamentos contra hipertensão
utilizando SERS e Floresta Randômica. Inicialmente, as concentrações dos
dois hormônios foram determinadas pelo método de referência ELISA e estes
valores foram utilizados para desenvolver modelos de calibração multivariada
utilizando os seus respectivos espectros SERS. Este método teve como
vantagem prática a automação das leituras SERS, reduzindo
22
consideravelmente o tempo das medidas. Este fato é importante uma vez que o
método de referência possui procedimentos laboriosos, os quais demandam
em torno de 2 a 3 dias para a obtenção dos resultados. Em contrapartida, com
a metodologia proposta foi possível realizar 96 medidas em menos de 2 h.
Outra novidade que foi apresentada nesta aplicação foi utilizar o método
probabilístico de floresta de decisão: floresta randômica (RF, do inglês random
forest); que pela primeira vez foi estudada pelo nosso grupo de pesquisa. Os
resultados obtidos com a RF foram comparáveis também aos erros obtidos
pelo método de referência. Esta aplicação gerou um artigo publicado na revista
Microchemical Journal [7].
A segunda aplicação, sétimo capítulo, consistiu em desenvolver uma
metodologia que fosse simplificada e sem qualquer pré-tratamento de amostra
para a identificação do pesticida malation em cascas de frutas: tomate e
ameixa. Para isso, a estratégia tomada foi obter a imagem hiperespectral
SERS das cascas dos alimentos e utilizar as ferramentas quimiométricas de
resolução de curvas multivariada para a obtenção dos perfis espectrais puros
separados, para a identificação do pesticida. Cabe ressaltar, que os métodos
de resolução de curvas utilizados foram inicializados sem o conhecimento
prévio dos respectivos espectros puros, uma vez que esta informação nem
sempre é disponível. Esta aplicação gerou um artigo publicado na revista
Analytica Chimica Acta [4].
Na terceira aplicação, oitavo capítulo, foi desenvolvido um método/algoritmo
para a calibração multiproduto de melamina em duas diferentes matrizes
lácteas, leite UHT e fórmula infantil, simultaneamente numa mesma curva de
calibração. O algoritmo baseou-se em uma nova abordagem para resolução
multivariada de curvas, no qual foi inserida uma restrição de correlação global,
para a previsão do contaminante nos dois diferentes produtos utilizando
apenas um único modelo global. Através do uso deste método foi possível
obter a chamada “vantagem de segunda ordem” empregando dados de
primeira ordem, ou seja, permitiu realizar o procedimento de calibração na
presença de interferentes desconhecidos. Esta aplicação gerou um manuscrito
que está submetido na revista Talanta.
Na quarta e última aplicação, nono capítulo, realizada durante um período
de estágio no Canadá (University of Victoria – CA), foi desenvolvido um
23
método/algoritmo para a calibração em soluções extremamente diluídas de um
antibiótico contaminante emergente em água: o ciprofloxacin. O método
desenvolvido, chamado de calibração SERS digital, baseou-se na contagem
das moléculas presentes nos “hotspots”, no qual são as que mais contribuem
para a intensidade total do espectro SERS. Como conclusão, através deste
método mostrou-se ser possível realizar o procedimento de calibração SERS
em soluções ultra-diluídas. Após, o regime single molecule-SERS (SM-SERS)
foi constatado através do experimento da série isotopóloga, utilizando o
antibiótico ciprofloxacin e seu isótopo deuterado. Esta aplicação apresenta um
grande potencial para contribuir nos estudos de SM-SERS e na aplicação da
técnica na área de Química Analítica. Esta aplicação gerou um resumo de um
congresso internacional e um manuscrito que está em fase de redação.
24
Capítulo 2: Espectroscopia Raman intensificada
pela superfície (SERS)
25
2. Espectroscopia Raman intensificada pela superfíc ie (SERS)
2.1. A espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS)
A espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS), observada
pela primeira vez por Fleischmann et al. em 1974 [1], foi incialmente descrita
como intensificação do sinal Raman devido ao aumento da área do eletrodo de
prata. Entretanto, posteriormente, este efeito foi descrito por Jeanmaire e Van
Duyne [12] e Albretch e Creighton [13], em dois trabalhos independentes, como
tendo outras causas e não apenas devido ao eletrodo. O efeito SERS, como o
nome já diz, é o efeito de intensificação do espalhamento Raman, em várias
ordens de magnitude (104 a 107 vezes), que ocorre devido à interação radiação
da eletromagnética com nanopartículas metálicas, Ag, Au e Cu, gerando as
chamadas ressonâncias de plasmons de superfície. Embora o SERS seja uma
espectroscopia de superfície, as mesmas regras de seleção do Raman também
são válidas.
2.1.1. O espalhamento Raman
A espectroscopia Raman é baseada no fenômeno de espalhamento da luz
[14]. Nela, uma fonte de radiação monocromática coerente e colimada (E=hνex)
é utilizada para excitação de uma molécula (Figura 2.1A). Durante este
processo, parte desta radiação (ou desses fótons) irá transpassar sem colidir
com a matéria (molécula) e outra parte irá se espalhar elasticamente ou de
forma inelástica. O que ocorre naturalmente é que a maioria desses fótons são
espalhados elasticamente, portanto, sem interagirem com a amostra. Este
efeito é chamado de espalhamento de Rayleigh, e os fótons espalhados
possuem a mesma energia que a inicial (E=hνex). Por outro lado, uma pequena
parcela é espalhada de forma inelástica, ou seja, com energia diferente que a
inicial (E=hνex±νvib). Caso ela seja de energia maior que a inicial, o efeito é
denominado espalhamento Anti-Stokes (E=hνex+νvib), caso contrário, é
denominado espalhamento Stokes (E=hνex-νvib).
26
Figura 2.1. (A) Esquema dos espalhamentos elásticos (Stokes e Anti-Stokes) e inelásticos
(Rayleigh) (Modificado de Sasic & Ozaki [14]) (B) esquema dos mecanismos quânticos de
espalhamento e absorção.
De acordo com o mecanismo quântico (Figura 2.1B), um fóton da radiação
incidente colide com a molécula no estado fundamental (ν = 0), promovendo a
espécie a um estado de maior energia chamado de estado virtual (nominal), no
qual ao retornar para um estado de menor energia novamente ocorrerá a re-
emissão de um novo quantum de energia. Além disso, se esse estado for de
mesma energia do inicial (ν = 0), teremos o efeito Rayleigh ou, então, o efeito
Stokes, no caso de retornar para um estado mais excitado (ν = 1). Essa
diferença de energia entre a radiação incidente e a espalhada (Figura 2.1B)
corresponde à energia com que átomos presentes na área estudada estão
vibrando, fornecendo informações sobre as vibrações moleculares.
Porém, pode ser que ocorra também de o fóton encontrar a molécula no
estado vibracional excitado (ν = 1), e neste caso o fóton liberado terá energia
maior que os anteriores. Normalmente, de acordo com a distribuição de
27
Boltzmann, este estado é mais difícil de ser encontrado. Portanto, o
espalhamento anti-Stokes é menos intenso que o Stokes. Por outro lado, pode
ser que, ao invés de ocorrer a transição para um estado virtual, ocorra a
transição para um estado eletrônico excitado, chamado de efeito Raman
ressonante (RR) [15, 16]. A origem deste fenômeno está relacionada à
coincidência entre o comprimento de onda da radiação de excitação com uma
banda de absorção eletrônica do analito, no qual acontece a promoção de um
elétron para um estado eletrônico excitado seguido de uma imediata relaxação
de volta para o estado fundamental. Ao contrário disso, pode ser que ocorra um
efeito de relaxação para um estado eletrônico excitado antes da volta para o
estado fundamental; nesta situação teremos o efeito de fluorescência. A
observação do fenômeno de fluorescência não é desejável, pois ele compete
com efeito de espalhamento Raman e isso promoverá uma depreciação do
sinal Raman. Um caso comum de intensificação por RR é o ocorrido em
corantes, pois muitos deles apresentam estruturas macrocíclicas que absorvem
os comprimentos de onda de excitação do laser na região visível.
No espectro Raman, assim como no infravermelho, as bandas são
relacionadas a modos vibracionais intrínsecos das moléculas, portanto, elas
contêm a impressão digital das moléculas, uma importante vantagem dessas
técnicas. Entretanto, no infravermelho a molécula para ser ativa necessita de
ter variação no momento de dipolo, enquanto que na espectroscopia Raman a
polarizabilidade da molécula deve variar.
Quando a radiação incidente interage com a molécula, ela promove uma
alteração no momento de dipolo induzido (→P ) da molécula,
→→→= EαP (2.1)
no qual, →α é o tensor de polarizabilidade da molécula e
→E é o campo elétrico
da radiação incidente. Fica evidente nesta equação que o momento de dipolo
induzido é influenciado pelo campo elétrico da radiação incidente, e a
intensidade do espalhamento Raman ( mnI ) é dada por:
28
( ) 244
2
9
16∑∑
=
i jmnijexmn I
cI ανπ
(2.2)
na qual, exI é intensidade da radiação excitante é proporcional à quarta
potência da frequência ν . Portanto, quanto maior a frequência da radiação
excitante, maior será a intensidade do espalhamento, porém mais susceptível
ela será as interferências por transições de fluorescência.
A probabilidade de ocorrência do espalhamento não elástico (Raman) é
muito baixa, devido à baixa secção cruzada de choque. Por exemplo, se 106
moléculas foram emitidas apenas 1 delas será espalhada de forma não
elástica. Essa limitação da técnica Raman é perceptível na falta sensibilidade
em alguns casos em específico, principalmente, quando comparada com outras
técnicas espectroscópicas moleculares, tais como Uv-vis, infravermelho e
fluorescência.
2.1.2. O mecanismo do espalhamento Raman intensificado pela superfície
(SERS)
Ao contrário da espectroscopia Raman, a espectroscopia SERS é uma
técnica bem sensível, comparável à técnica de fluorescência molecular. O
mecanismo de amplificação do sinal Raman pode ser explicado por dois
fatores: o mecanismo químico e o eletromagnético. No primeiro, é fundamental
que a molécula adsorva na superfície do metal, para que ocorra a transferência
de cargas entre o metal e a molécula. No segundo, o mais importante, o efeito
é dependente da ressonância de plasmons de superfície, na qual é gerado o
sinal de intensificação do sinal SERS. A geração dos plasmons é dependente
do tipo do metal utilizado (normalmente Ag ou Au), da estrutura/formato da
nanopartícula metálica, estado de agregação, assim como demais fatores. De
fato, ambos os mecanismos contribuem com uma parcela para o mecanismo
de intensificação do SERS, no entanto, para compreendê-los, é preciso avaliar
a contribuição de cada um deles, separadamente, como veremos a seguir.
29
2.1.2.1. Efeito químico
Como foi dito anteriormente, é de suma importância para que o efeito
SERS ocorra que o analito esteja adsorvido quimicamente ou fisicamente na
superfície do metal. A formação deste complexo, metal-molécula, permite que
ocorra a transferência de carga entre molécula/metal, afetando o tensor de
polarizabilidade da molécula ( →α ). Como consequência disso, a intensificação do
espectro Raman é observada em ordem de grandeza exponencial.
2.1.2.2. Efeito eletromagnético
Apesar de o efeito químico ser importante para que o efeito SERS ocorra, a
sua contribuição no fator de intensificação (EF, do inglês enhancement fator) é
pequena comparada ao efeito eletromagnético [17, 18]. Como pode ser
observado no esquema da Figura 2.2, o campo elétrico da radiação
eletromagnética induz a oscilação dos elétrons da camada de valência da
nanopartícula, promovendo uma variação do campo local, conhecida como
ressonância de plasmons localizado (LSPR, do inglês localized surface
plasmon ressonance). Considerando um conjunto de nanopartículas
suportadas num substrato, essa nuvem de elétrons deslocalizados é
propagada para as demais partículas dependendo da distância inter-partículas.
Outro importante fator é que essa alteração local no momento de dipolo
induzido do metal também é válida para a molécula, de acordo com as regras
de seleção também observada no espalhamento Raman. Sendo assim, um
efeito adicional é observado com um aumento significativo da intensificação do
sinal.
30
Figura 2.2. Esquema ilustrando a geração de ressonância de plasmons de superfície localizada
(LSPR) sobre as nanopartículas de ouro.
2.1.2.3. Espectro de extinção
O mecanismo de extinção da luz, que nos compostos moleculares é
denominado absorção, porém devido aos LSPR para as nanopartículas
metálicas é composto por dois outros mecanismos: de absorção e de
espalhamento. Medidas de absorção de luz pelo plasmon de nanopartículas
metálicas podem ser obtidas nas regiões do ultravioleta, visível e infravermelho
próximo. O aumento no tamanho das nanopartículas resulta em um
deslocamento da banda do plasmon de superfície do metal para a região
espectral de maior comprimento de onda. Assim, conclui-se que dessa forma a
cor da nanopartícula, em função da ressonância plasmônica, está associada às
dimensões da própria partícula.
2.2. Detecção no regime de uma única molécula (SM-SERS)
Em 1997, a técnica SERS foi utilizada pela primeira vez para estudar a
detecção no regime de uma única molécula (SM-SERS) por dois grupos de
forma independente [2, 19]. De acordo com Nie e Emory [2], o efeito observado
foi mais intenso e mais estável quando comparado com o SM utilizando a
técnica de fluorescência, além de possuir a vantagem da técnica Raman de
fornecer a impressão digital molecular. Essas características colocam o SM-
31
SERS num grupo seleto de técnicas importantes para o estudo e entendimento
de processos de dinâmica molecular e com um atrativo para aplicações na área
de Química Analítica, devido aos baixos limites de detecção alcançados.
2.2.1. Os Hotspots e o Sinal SERS
Como foi mencionada anteriormente, a intensificação do sinal SERS é
devido à geração dos LSPRs sobre as nanopartículas, existindo dependência
do ambiente dielétrico que as contêm e do seu estado de agregação [20]. Caso
as nanopartículas estejam próximas uma das outras, existe a possibilidade de
formar dímeros, trímeros ou outras estruturas, dependendo da distância inter-
partículas [21]. Nesta condição, os LSPRs entre duas (ou mais) nanopartículas
esféricas podem se acoplar, formando os chamados “hotspots”, e gerar um
forte fator de intensificação do sinal SERS. Na Figura 2.3 está representada a
formação dos “hotspots” e o aumento do campo elétrico local. Como pode ser
observado na Figura 2.3A, na solução coloidal podem existir monômeros,
dímeros, trímeros e outras estruturas e isso pode promover a formação de um
“hotspot” (Figura 2.3B).
Figura 2.3. Formação dos “hotspots” (A) imagens de TEM de AuNPs; (B) Aumento do campo
elétrico local devido ao acoplamento entre os campos elétricos de duas nanopartículas
esféricas (Adaptado de [20]).
32
A presença dos “hotspots” é de suma importância para a formação e
contribuição do sinal SERS. De acordo com um experimento de Fang et al.
[22], dois terços das moléculas (por volta de 106 moléculas) sobre uma
superfície recoberta por nanopartículas de prata, contribuíram menos de 5%
para a intensidade de todo o sinal SERS. Por outro lado, menos de 0,1%
destas moléculas, o que seria por volta de 63 moléculas, seriam responsáveis
por um terço de toda a intensidade SERS. Isso indica uma forte dependência
do sinal SERS dos “hotspots” e sua importância para obter limites de detecção
no regime SM-SERS. Um fato interessante é que estima-se que em menos de
1% da área deste substrato tem-se realmente “hotspots” ativos [23], ou seja,
uma ínfima parcela de todo material.
2.2.2. A estatística complexa do SM-SERS
Desde a primeira observação do SM-SERS [2, 19], já era conhecido o
efeito de flutuação do sinal sobre os resultados. De forma a compreender
melhor a origem destas variações no sinal, um esquema é mostrado na Figura
2.4.
Na Figura 2.4A pode ser observado que em regime de alta concentração
do analito (em vemelho) toda a superfície do material, AuNPs imobilizadas
sobre uma superfície de vidro, está recoberta, inclusive todos os “hotspots”
estão preenchidos, formando uma monocamada de Langmuir. Ao iluminar-se
toda essa região dividida em 11 x 11 pixels, totalizando 121 espectros SERS,
pode-se construir um histograma de distribuição das intensidades médias
normalizadas entre 0 e 1 (Figura 2.4C). Pode-se observar que a distribuição
das intensidades segue o formato de uma gaussiana (distribuição normal), ou
seja, o valor médio segue o chamado teorema do limite central, representado
pela linha vermelha na vertical. Este caso é chamado na literatura por SERS
average [24]. Em contrapartida, em concentração muito baixa (ultra-low) é
observado que não existem moléculas suficientes do analito para formar uma
monocamada e muito menos para serem adsorvidas em todos os “hotspots”
(Figura 2.4B), alcançando o regime SM-SERS. Como consequência deste fato,
cerca de 60% dos eventos são governados por eventos nulos (null events),
33
embora dois dos valores de intensidades sejam bem altos (Figura 2.4D), os
quais representam apenas as duas moléculas que estão acomodadas nos
“hotspots” (Figura 2.4C). Neste caso, os dados não seguem uma distribuição
normal, mas uma distribuição chamada de cauda longa [25].
Figura 2.4. Superfície recoberta com AuNPs em (A) alta concentração do analito: SERS
average, (B) baixíssima concentração do analito: SM-SERS; Histograma de frequência para (C)
SERS average e (D) SM-SERS. Em roxo as AuNPs imobilizadas sobre uma superfície de vidro,
em amarelo os “hotspots”, em vermelho o analito e a linha vermelha é valor médio das
intensidades.
2.2.3. Série isotopóloga
O experimento do bianalito é o experimento mais utilizado para provar a
existência do efeito SM-SERS [24]. O seu objetivo é provar a capacidade do
SM-SERS em acomodar mais de uma molécula no “hotspot”.
Como pode ser observado na Figura 2.5A, no primeiro caso nenhuma das
moléculas estão presentes no “hotspot”, portanto, o evento é considerado nulo,
34
ou seja, não apresenta espectro, apenas ruído instrumental. No segundo caso
(Figura 2.5B), a molécula verde está contida no “hotspot” e, portanto, um forte
sinal é observado para a mesma. O mesmo acontece para a molécula em azul
no terceiro caso mostrado na Figura 2.5C. No último caso (Figura 2.5D), ambas
as moléculas podem visitar o “hotspot”, dessa forma, o espectro total terá tanto
informações da molécula azul quanto da verde. Isso é um forte indicativo da
observação do efeito SM-SERS [24].
Figura 2.5. Representação esquemática do experimento do bianalito para o SM-SERS. (A)
evento nulo; (B) molécula verde, (C) molécula azul e (D) ambas as moléculas no “hotspot”.
Embora o experimento do bioanalito seja muito utilizado para a
observação do efeito SM-SERS, o mesmo possui algumas limitações. A
principal delas é a preferência de adsorção pela superfície por umas das
moléculas [24, 26]. Neste caso, uma das moléculas pode ficar mais tempo
adsorvida nos “hotspots”, e será observado na maior parte do tempo o seu
espectro. Uma forma alternativa para contorna este problema é utilizando o
experimento conhecido na literatura como “série isotopóloga”, ou seja,
utilizando um isótopo deuterado de uma respectiva molécula, sendo que ambos
os isótopos têm a mesma chance de adsorver na superfície. Recentemente, o
grupo do professor Van Duyne propôs o uso do experimento multianalito [27].
35
Capítulo 3: Equipamentos Raman
36
3. Equipamentos Raman
3.1. Espectrômetro Raman
3.1.1. Equipamento Raman dispersivo
Até meados da década de 80, os espectrômetros Raman não eram muito
populares. Muito disso se deve a diversos problemas e limitações que eram
encontrados, pois os espectrômetros disponíveis não eram projetados para
este tipo de aplicação em específico [16]. Mais tarde, a técnica ressurgiu,
principalmente devido a três importantes fatores: o uso e o desenvolvimento de
novas linhas de lasers de excitação: íon argônio (488 ou 514,5 nm), íon
criptônio (530,9 ou 647,1 nm), Hélio-neônio (632,8 nm), diodo (785 ou 830 nm),
Nd-YAG (1064 nm); o uso de filtros de rejeição (notch filters); e o uso de
detectores do tipo carga acoplada (CCD, do inglês Charge-Coupled Device).
Um equipamento Raman com esses componentes é apresentado na Figura
3.1.
Figura 3.1. Esquema de equipamento Raman moderno com notch filters e um detector CCD.
As principais funções dos notch filters são eliminar a radiação de baixa
frequência (ruídos) e evitar que os sinais Raman anti-Stokes e Rayleigh
cheguem ao detector (Figura 3.1). Outra grande vantagem do equipamento
Raman moderno é o uso dos espectrômetros com monocromador do tipo
echelle [14], como o PerkinElmer Raman Station (400F) utilizado nas
aplicações 1 a 3 nesta Tese (Figura 3.2).
37
Figura 3.2. Esquema representando um sistema com monocromador tipo echelle contido no
espectrômetro PerkinElmer Raman Station (400F) utilizado nesta tese (aplicações 1 a 3).
Como pode ser observado na Figura 3.2, o monocromador tipo echelle
possui duas grades de difração posicionadas ortogonalmente, sendo que a
primeira separa o feixe em faixas de comprimentos de onda para depois o
segundo monocromador realizar uma separação mais detalhada dentro destas
faixas. A grande vantagem dessa abordagem é a possibilidade de obter um
espectro Raman simultaneamente em toda a faixa espectral compreendida
entre 3600-100 cm-1, em tempos relativos curtos e com grande resolução, pois
não existem partes móveis.
3.2. Equipamento Raman para imagens hiperespectrais
Outra característica relevante dos equipamentos Raman atuais é a
possibilidade da obtenção de imagens hiperespectrais, nas quais um espectro
completo é obtido a cada pixel da imagem. Esta prática foi primeiramente
reportada décadas atrás [14] e tem se mostrado até os dias atuais como uma
potente ferramenta analítica, pois permite que espectros possam ser adquiridos
em diversas regiões de interesse e obter informações sobre a distribuição do
analito em uma superfície. Normalmente, são utilizados estágios de
posicionamento x,y,z para selecionar a região onde será obtido o espectro,
conforme mostrado na Figura 3.3.
38
Figura 3.3. Espectrômetro Raman para obtenção de imagem hiperespectral.
Na Figura 3.4 está representado um esquema dos diferentes tipos de
aquisição dos espectros. Nos pontuais (Point Microspectroscopy), Figuras 3.4A
e B, diversos espectros são adquiridos em determinadas regiões de interesse,
na escala, por exemplo, de 100 µm. Esta abordagem não gera imagens, mas
fornece uma boa noção do micro-espaço amostral. A principal desvantagem
deste método é que, se a concentração do analito é baixa na amostra, o sinal
também será depreciado (Figura 3.4B). Por outro lado, no mapeamento pontual
(Point Mapping), Figura 3.4 C, uma micro-área é selecionada (mapping) e um
espectro é adquirido a cada ponto da região selecionada, chamado de pixel. A
área e o tamanho dos pixels utilizados são pré-determinados pelo usuário via
software e através de uma mesa motorizada (motorized stage) (Figura 3.3). A
adição da informação espacial permite a construção das chamadas imagens
químicas (Chemical Imaging), utilizando-se uma banda do espectro,
normalmente a mais intensa, ou os escores calculados por um modelo
quimiométrico (que será discutido no próximo capítulo). As duas principais
vantagens da análise por imagens hiperespectrais são obter a informação de
um analito, de concentração global relativamente baixa, no entanto, alta em
respectivos pontos da superfície monitorada (pixels) e, além disso, conhecer a
distribuição deste composto ao longo de uma superfície pré-estabelecida
(Figura 3.4). Por outro lado, esse tipo de medida pode ser bastante demorada,
devido ao tempo de exposição do laser e/ou do tamanho da área mapeada.
39
Figura 3.4. Esquema de aquisição de espectros Raman pontuais em: (A) alta concentrações;
(B) baixas concentrações; e (C) mapeamento pontual.
3.3. Equipamento Raman acoplado a um microscópio confocal
Em 1981 [28], surgiram os equipamentos Raman acoplados a um
microscópio confocal chamada de microscopia Raman (ou micro-Raman). Essa
configuração permite o uso de diversas lentes de aumento: 5x, 10x, 20x, 50x,
100x; que possibilitam a aquisição de espectros Raman em amostras de escala
micrométrica, podendo chegar a resolução espacial mínima próxima do limite
de difração da luz, 1 µm2. Um esquema do equipamento Raman inVia da
Renishaw, que foi utilizado nesta Tese na quarta aplicação, está representado
na Figura 3.5.
Figura 3.5. Esquema de um microscópio Raman confocal baseado no equipamento Raman
inVia da Renishaw. (A) acoplamento espectrômetro microscópio; (B) Esquema óptico do
microscópio.
40
Além de permitir alcançar alta resolução espacial, o micro-Raman permite a
eliminação de grande parte da radiação espalhada espúria, evitando que
grande parte dela chegue ao detector (Figura 3.5B).
41
Capítulo 4: Métodos quimiométricos
42
4. Métodos quimiométricos
4.1. Quimiometria
A Quimiometria tem como objetivo extrair o máximo de informação de
dados químicos altamente complexos pela otimização, calibração, classificação
ou resolução dos mesmos. A Quimiometria reúne conhecimentos altamente
interdisciplinares: matemática, estatística multivariada, ciência da computação
e química. O advento da quimiometria surgiu na primeira metade dos anos 70,
embora a sua evolução tenha ocorrido mais tarde de forma significativa, na
década de 80, junto com o surgimento dos microcomputadores [29].
Uma importante diferença do uso da quimiometria em relação aos métodos
convencionais univariados para tratamento de dados é a utilização de toda
informação contida neles, de forma multivariada. Como exemplo, os dados
multivariados podem ser agrupados em uma matriz X (Figura 4.1), na qual nas
linhas estão contidas as informações sobre as amostras ( I ), espectros SERS
em diferentes concentrações, e nas colunas sobre as variáveis ( J ),
intensidades SERS em cada deslocamento Raman. Também para o caso de
calibração, para cada espectro haverá um valor de resposta que estará contida
num vetor de concentrações y (Figura 4.1). Posteriormente, um modelo
matemático será desenvolvido que relacionará de maneira multivariada as
informações contidas em X e y .
43
Figura 4.1. Representação da organização dos dados na forma de uma matriz de respostas ( X )
e um vetor de concentrações ( y ) para o desenvolvimento de um modelo matemático
multivariado num procedimento de calibração.
Uma importante vantagem de se utilizar os modelos multivariados em
relação aos convencionais está na possibilidade de lidar com interferentes sem
a necessidade da sua separação física. Do ponto de vista da química analítica,
as amostras reais, como sangue, urina, leite, dentre outras, são altamente
complexas devido à presença de compostos que são denominados
interferentes, os quais podem apresentar sobreposição da sua resposta
instrumental com a do analito. Para este caso, o maior número de informações
possível é importante para aumentar a “performance” e qualidade dos
resultados. Um esquema demonstrando a progressão dos dados univariados a
multivariados baseado no aumento da complexidade do sinal está
representado na Figura 4.2.
44
Figura 4.2. Representação dos dados partindo do modelo univariado ao multivariado com suas
respectivas vantagens em relação a manipulação de interferentes baseado no ponto de vista
da química analítica.
Nos dados de ordem zero ou univariados apenas uma resposta é adquirida
por amostra (Figura 4.2, ver a primeira linha). Esse sinal corresponde, por
exemplo, a apenas um valor de intensidade SERS, por amostra em um pré-
determinado deslocamento Raman (por exemplo, 1730 cm-1), gerando um vetor
de respostas considerando as demais amostras. Para este caso, não é
desejável a presença de interferentes, e procedimentos de extração/isolamento
do analito da amostra são necessários para obter um resultado que seja
satisfatório. Por outro lado, no procedimento multivariado ou de primeira ordem
permite realizar a calibração na presença de interferentes que sejam fornecidos
durante a calibração e estejam presentes também nas amostras chamadas de
validação, as que irão certificar a robustez do modelo (Figura 4.2, ver a
segunda linha). Nos dados de primeira ordem, é utilizada uma faixa espectral
(por exemplo, 2000-400 cm-1) por amostra formando uma matriz de dados para
todas as amostras. Por último, a partir dos dados multi-modo, por exemplo,
dados de fluorescência de emissão/excitação, é permitido a calibração de
interferentes desconhecidos ou não calibrados pelo modelo (Figura 4.2, ver a
terceira linha), utilizando a chamada “vantagem de segunda ordem” [30]. Esta
vantagem pode ser alcançada na maioria por alguns modelos de segunda
45
ordem, mas não apenas restrita a alguns deles, como será discutido mais
tarde.
4.2. Pré-processamento dos dados
Antes da construção dos modelos multivariados, uma etapa primordial para
obter um resultado com relativa qualidade é o pré-processamento dos
chamados dados brutos. Este procedimento está relacionado a um cálculo
matemático que irá remover e/ou reduzir as fontes de variações irrelevantes,
sejam elas aleatórias ou sistemáticas, que podem prejudicar o desenvolvimento
dos modelos multivariados [31]. Existem diversos procedimentos que podem
ser utilizados, no entanto, nesta tese serão comentados apenas os utilizados
nas aplicações com SERS: correção de linha base e normalização.
4.2.1. Correção da linha base
4.2.1.1. Mínimos quadrados assimétricos (AsLS)
As medidas espectrais são suscetíveis a irregularidades na linha base
devido à complexidade da amostra e espalhamentos indesejáveis, comum em
imagens hiperespectrais Raman [32] e SERS [3]. Entretanto, este problema
pode ser facilmente contornado pelo método mínimos quadrados assimétricos
(AsLS, do inglês asymmetric least squares) [33]. O método AsLS foi
primeiramente desenvolvido para alinhamento de picos cromatográficos, no
entanto, ele também tem demonstrado um bom potencial para a correção de
linha base de dados de imagens hiperespectrais Raman [32] e SERS [3]. O
algoritmo AsLS utiliza uma função warping (equação 4.1), ou seja, ele compara
e alinha duas ou mais séries temporais. Nesta Tese, os espectros SERS foram
registrados em cada ponto numa região mapeada, na qual é feita uma
minimização interativa da soma dos quadrados dos erros ponderados e
penalizados para encontrar o melhor polinômio para suavização dos espectros
em cada canal (Figura 4.3).
46
( ) ( )∑∑==
∆+−=I
i
I
i
p1
22
1
2iiiAsLS ffxX λ (4.1)
na qual, ix é um espectro (vetor linha) e if o padrão de tendência de
suavização, na qual se os parâmetros p for próximo de zero e λ for um valor
grande, if irá tender a seguir os valores de ix , ou seja, da linha base. Dessa
forma, a qualidade da suavização é facilmente determinada apenas pelo ajuste
dos parâmetros da função warping, o parâmetro assimétrico, p , e o parâmetro
de suavização, λ (Figura 4.3). Um procedimento típico de correção de linha
base utilizando o algoritmo AsLS está demonstrado na Figura 4.3.
Figura 4.3. Correção da linha base pelo AsLS (A) antes e (B) depois da correção.
4.2.1.2. Normalização
A normalização baseia-se no procedimento de dividir cada espectro (um
vetor) por uma constante [31]. O procedimento de normalização dos espectros
SERS foi fundamental para as aplicações que foram realizadas nesta tese,
principalmente, como comentando anteriormente, devido aos diferentes
tamanhos e dimensões das nanopartículas, que ocasionam efeitos de
47
flutuações de intensidade nos sinais. A seguir, estão representadas as
equações utilizadas para normalizar os espectros neste trabalho:
Espectro médio: ∑=
=I
iI 1
1imed xX (4.2)
Norma de Frobenius: ∑∑= =
=I
i
J
j1 1
2
ijfrob xX (4.3)
4.3. Calibração multivariada
A calibração multivariada visa encontrar uma relação matemática entre um
sinal instrumental e a concentração. A calibração multivariada pode ser dividida
em duas importantes etapas: calibração e validação. A calibração é a etapa na
qual as amostras com concentrações conhecidas são medidas por alguma
técnica, e.g. SERS, e, em seguida, um modelo de calibração multivariada é
desenvolvido. Na validação, amostras desconhecidas são utilizadas para
avaliar a robustez e realizar inferências sobre o modelo desenvolvido.
4.3.1. Quadrados mínimos parciais (PLS)
O método dos mínimos quadrados parciais (PLS, do inglês partial least
squares) [34] é comumente utilizado em quimiometria para o objetivo de
calibração multivariada. Uma das vantagens do PLS é a redução os dados
quando se tem um número elevado de variáveis. Em termos matriciais, de
acordo com o método PLS2 [35], ambas as matrizes X (variável
independente, resposta instrumental) e Y (variável dependente,
preditores/concentrações) são decompostas, como:
ETPX T += (4.4)
FUQY T += (4.5)
48
no qual, Te U são os escores contendo a informação sobre a projeção dos
dados originais no novo espaço das componentes principais. Uma relação
linear é estabelecida entre eles para cada variável latente:
( ) ( )k
T
k
1
k
T
k tttub −= (4.6)
de modo que a máxima covariância entre todas as componentes (variáveis
latentes, k) é estabelecida:
( )[ ]2covmax
PLSkk u,t (4.7)
Normalmente, k é encontrado por validação cruzada [35], na qual vários
submodelos de calibração são desenvolvidos retirando uma amostra e
desenvolvendo um modelo local com as demais. O valor de concentração
dessa amostra retirada é prevista e a raiz quadrada do erro quadrático de
validação cruzada (RMSECV) é encontrada.
4.3.2. Métodos probabilísticos baseados em árvores de decisão
Aprendizado de máquinas é um sub-campo da inteligência
artificial dedicado ao desenvolvimento de algoritmos e técnicas que permitam
ao computador aprender, isto é, que permitam ao computador aperfeiçoar seu
desempenho em alguma tarefa. O objetivo do aprendizado é encontrar uma
função matemática através de um conjunto de dados finito e tentar encontrar os
parâmetros ótimos que o descrevem, durante a etapa chamada de treinamento
[36], equivalente à etapa de calibração. Após o treinamento, amostras de
classes e/ou concentrações desconhecidas podem ser previstas pelo modelo,
na etapa de previsão (ou validação). Existem diversos métodos de aprendizado
de máquinas, como redes neurais artificiais, máquinas de vetores de suporte,
redes bayesianas, dentre outros. No entanto, devido a algumas características
importantes, que serão comentadas a seguir, nesta Tese foi estudada pela
49
primeira vez no nosso grupo de pesquisa a floresta randômica (do inglês,
random forest).
Os métodos de árvore de decisão (do inglês, decision tree) são uma classe
de algoritmos baseados em aprendizado de árvores, as quais são utilizadas
para tomar decisões em tarefas de classificação ou regressão. A árvore de
decisão é construída como um a flow-chart-like structure, estrutura na forma de
fluxograma. Ou seja, partições recursivas no espaço original dos dados são
realizadas, formando pequenos subespaços, de tal forma que a “pureza” das
saídas aumenta com o aumento do número de divisões (splits) [37]. O termo
“pureza” está relacionado a quanto uma saída é capaz de discriminar uma
classe de outra, em classificação, ou quanto o erro quadrático de previsão das
amostras do conjunto de treinamento (calibração) é mínimo, em regressão. Um
exemplo hipotético representando uma população de 100 pessoas que foram
utilizadas para desenvolver banco de dados sobre obesidade através do índice
de massa corpórea (IMC) está representado na Figura 4.4.
Figura 4.4. Representação hipotética de um fluxograma baseado em árvores. IMC – índice de
massa corpórea.
Na Figura 4.4, pode ser observado que, antes de realizar o primeiro split a
população pode ter 50% de chance de ser homem ou mulher e existe uma
mesma chance de ser abaixo, normal, acima ou obesa (12,5%). O início do
fluxograma é o local que contém sempre menor informação (maior impureza)
sobre a discriminação dos dados. Por outro lado, a pureza das saídas torna-se
50
maior quanto mais próximo se aproxima o final do fluxograma, no qual o
resultado é discriminativo. É também observado na Figura 4.4., que em cada
split uma decisão é tomada baseada nas informações contidas no banco de
dados sobre o IMC desta população, até se chegar a uma conclusão final sobre
o peso (abaixo, normal, acima e obeso) da população, de homens e mulheres.
Essa é uma característica importante dos algoritmos de árvores de decisão,
que são um conjunto de regras de if-then-else [37], de programação, no qual
uma decisão é tomada localmente para se obter um resposta final mais
interpretável. Por fim, em árvores de decisão as probabilidades iniciais se
alteram a medida que mais informação é obtida pelo sistema, seguindo a
chamada regra de Bayes:
( ) ( ) ( )( )X
YY|XX|Y
P
PPP = (4.8)
no qual, X e Y são os valores de entrada e saída respectivamente. ( )X|YP
e ( )Y|XP são as probabilidades condicionais para que um evento verdadeiro
ocorra. Os valores de ( )X|YP calculados para cada possibilidade estão em
negrito na Figura 4.4 no final de cada evento.
4.3.2.1. Classificação e regressão de árvores (CART)
Um dos algoritmos de árvore de decisão mais populares é o método
desenvolvido por Breiman, chamado de classificação e regressão de árvores
(CART, do inglês classification and regression trees) [38]. No CART, uma única
árvore é “crescida” de forma que os splits (subespaços) são criados
recursivamente até que a impureza nas saídas seja reduzida ou quando algum
critério de parada é alcançado. Como vantagem tem-se saídas mais puras; em
contrapartida, encontrar o número adequado de splits é um desafio. Como
consequência disso, os modelos de classificação ou regressão desenvolvidos
por CART podem apresentar baixa capacidade preditiva e/ou sobre-ajustarem.
Uma forma de contornar este problema é utilizando os procedimentos de poda
51
dos ramos; embora este procedimento não seja trivial. Na Figura 4.5 está
representado um esquema hipotético de separação de classes (classificação)
de bolinhas azuis, verdes, amarelas e vermelhas, utilizando o algoritmo CART.
Nesse caso, no treinamento, as classes são conhecidas e na classificação
deseja-se encontrar a classe de uma amostra desconhecida.
Figura 4.5. Esquema hipotético exemplificando um procedimento de classificação utilizando
árvores de decisão pelo método classificação e regressão de árvores (CART). (A) etapa de
treinamento e (B) etapa de classificação.
Como em todo método de árvores de decisão, a etapa de treinamento é
importante para se conhecer (aprender) os parâmetros ótimos que resultaram
no número e valor ideal dos splits, com os quais melhor se ajusta aos dados de
treinamento (Figura 4.5A). Como pode ser observado na Figura 4.5A,
inicialmente não existe informação sobre a discriminação entre as classes. O
52
próximo passo é dividir o conjunto de treinamento por uma linha imaginária na
vertical (H1) ou na horizontal (H2), chamada split point. Na primeira divisão (H1),
tem-se a separação entre as classes azuis, verdes e metade das amarelas
(esquerda, X1 ≤ H1) e metade das amarelas e vermelhas (direita, X1 > H1). Na
segunda divisão (H2), tem-se uma mistura entre as três classes de ambos os
lados. Portanto, no primeiro caso ganha-se mais informação ou diminui-se a
entropia do sistema ao realizar-se o split em H1. Dessa forma, o split point H1
será escolhido inicialmente, seguido pelo split point H2. Após realizar-se o
treinamento, o modelo está pronto para realizar classificação dos dados. A
bolinha em cinza representa uma amostra desconhecida, a qual se pretende
classificar utilizando o conjunto de dados previamente treinados (Figura 4.5B).
No início, a probabilidade dela pertencer a qualquer uma das classes é
igualmente 25%. No entanto, esta probabilidade aumenta para
aproximadamente 67%, após realizado o primeiro split, pois o valor de X1 > H1.
Finalmente, esta amostra é classificada como da classe vermelha com 80% de
certeza, de acordo o último nodo folha (X2 ≤ H2). Para mais informações sobre
a função objetiva de treinamento, ganho de informação e entropia, ver a
referência [39].
4.3.2.2. Floresta randômica (RF)
O método floresta randômica (RF) [40] é a união dos métodos classificação
e regressão de árvores (CART) [38] e bootstrapping aggregation (bagging) [41],
todos criados por Breiman, para resolver problemas de classificação e
regressão através da metodologia ensemble, ou seja, um conjunto de árvores.
Nesse algoritmo, durante a etapa de treinamento, um subconjunto dos
dados originais é selecionado de forma aleatória, normalmente tomando-se de
2/3 (66,67%) das amostras e 1/3 (33,33%) das variáveis. Essa etapa é
denominada “dentro do pacote” (in-bag), na qual as classes conhecidas serão
apresentadas aos seus respectivos espectros (por amostra). Assim, uma etapa
de classificação local pode ser realizada com as amostras “fora do pacote”,
chamadas de etapa/estimativa out-of-bag (OOB) [40-42]. Um procedimento de
reamostragem é realizado com reposição (ou seja, com todas as amostras) e
novas amostras e variáveis são escolhidas para o crescimento de outra árvore,
53
que irá compor a floresta ( Ttávores
,...,3,2,1= ). O número total de árvores é
escolhido baseado nos resultados da validação. Como cada árvore é um
preditor, chamado na linguagem ensemble de weak learners, o resultado de
saída, durante a etapa de validação (Figura 4.6), será a classe de maior
probabilidade, segundo o teorema de Bayes:
( ) ( )XYXY |PT
|PT
tt
árvores
árvores∑=
=1
1 (4.9)
na qual ( )X|Yp é a densidade estimada dos valores preditos por cada árvore
contida na floresta ( Ttávores
,...,3,2,1= ). Como conclusão, os modelos
desenvolvidos com a RF apresentam baixa variância, produzindo modelos mais
robustos e preditivos. Outra característica importante, deve-se ao fato do
procedimento utilizar apenas uma parte das variáveis para crescer uma árvore.
Este procedimento seria equivalente a montar vários modelos locais,
suficientes para eliminar quase toda falta de linearidade, como se o espaço
fosse dividido em pequenos pedaços [39]. Um esquema do procedimento da
floresta randômica é apresentado na Figura 4.6.
54
Figura 4.6. Esquema mostrando o procedimento de reamostragem bagging (bootstrap
aggregation) utilizado em floresta randômica.
De forma similar à classificação, na regressão os dados também são
subdivididos em partes, excetuado que agora as saídas são diferentes, ou seja,
os dados assumem valores contínuos (Figura 4.7). Suponha-se que os dados
tenham o comportamento observado na Figura 4.7A, um modelo linear pode
ser ajustado aos dados, no entanto, como pode ser observado, o mesmo não é
adequado para descrever o comportamento dos dados. Por outro lado, um
modelo não linear seria mais adequado para este caso (Figura 4.7B). Outra
forma de descrever o comportamento dos dados seria utilizando o algoritmo RF
(Figura 4.7C). Nele, os dados são separados em dois submodelos de
calibração de forma similar ao procedimento de classificação, na qual duas
retas lineares, chamadas de retas de probabilidade linear, são ajustadas aos
dados. Estas retas equivalem a uma regressão local para cada conjunto de
dados divididos. Na regressão, ao contrário da classificação, o split point (H) é
encontrado a partir do cálculo dos quadrados mínimos do erro dos dados de
treinamento (ver com mais detalhes em [39]). Esse ponto é exatamente onde
existe um desvio de linearidade dos dados (Figura 4.7C). Dessa forma, cada
nodo filho da árvore será um regressor, o qual será responsável por descrever
parte dos dados. Após o treinamento, uma amostra de concentração
55
desconhecida (bolinha cinza na Figura 4.7C) pode ser prevista por algum dos
submodelos de calibração, de acordo com sua similaridade ao mesmo. Neste
caso, será determinada pelo submodelo da esquerda. Outra informação que
pode ser observada na Figura 4.7C são os limites representados pela linha
tracejada de cor vermelha. Como o centro dos dados é o valor médio das
respostas, então, a sua dispersão é dada pelos desvios padrões. Essa
densidade é similar aos métodos de aprendizado baseados em algoritmos
Kernel, como as máquinas de vetores de suporte. No entanto, como descrito na
referência [43], o método RF não é designado para encontrar essas
densidades, mas sim para a localização apenas dos seus limites. Na Figura
4.7D pode ser observada a comparação do ajuste de um conjunto de dados
altamente complexo por um modelo não linear convencional e pela floresta
randômica (RF).
Figura 4.7. Esquema hipotético exemplificando um procedimento de regressão utilizando
árvores de decisão pelo método classificação e regressão de árvores (CART).
4.3.2.2.1. Cálculos internos da floresta randômica
Uma característica marcante do método floresta randômica é a
possibilidade de realizar alguns cálculos internos que podem ser utilizados para
avaliação da “performance” do modelo desenvolvido. Uma delas é calcular
quais variáveis foram mais importantes durante o treinamento, chamada de
56
importância das variáveis (ImpVar) [40]. Essa estimativa é muito relevante, uma
vez que nem sempre nos métodos de aprendizado de máquina é possível
saber se o procedimento de calibração está relacionado ao analito de interesse
ou a qualquer outro composto interferente presente na amostra. O cálculo
ImpVar consiste em permutar os valores das variáveis OOB e calcular o erro
entre o valor original para cada árvore. Caso esta diferença seja significativa, a
variável terá um peso maior e, portanto, terá alta importância no
desenvolvimento do modelo. Esta informação pode ser utilizada para
comparação com o espectro puro do analito ou na tentativa de identificar
bandas características do mesmo no espectro original. Outra estimativa
importante que pode ser obtida com o método RF, característica dos métodos
ensemble, é o intervalo de confiança [44]. Brevemente, como cada árvore
fornece um resultado para os dados de validação, a média e o desvio padrão
podem ser calculados e, assim, estimados os intervalos de confiança.
4.4. Métodos baseados na resolução multivariada de curvas
Os métodos de resolução multivariada de curvas são métodos de
decomposição bilinear de uma matriz genérica ( mxnG ) em escores ( mxrT ), que
contêm informação sobre as amostras, e pesos ( TrxnP ), que contém informações
sobre as variáveis, e uma matriz de erros ( mxnE ):
mxnTrxnmxrmxn EPTG += (4.10)
na qual, m e n são o número de amostras e variáveis, respectivamente, e r é o
posto de mxrT e TrxnP , que podem ser determinados pelos métodos SVD ou PCA
[45, 46], através da matriz original, mxnG . O algoritmo pode ser inicializado
através de uma estimativa inicial de mxrT ou TrxnP (as concentrações ou os
espectros do analito e dos interferentes), quando conhecidos. Quando não se
tem esta informação, uma simples inicialização randômica pode ser utilizada ou
calculada através de outros métodos mais robustos, como o PURE [46],
SIMPLISMA [47], EFA [48], needle-search [49], dentre outros. No MCR com o
57
algoritmo dos mínimos quadrados alternados (MCR-ALS), cada interação é
resolvida para obter alternadamente mxrT e TrxnP :
( ) ( )+−== T
PCA
1TPCA PGPPPGT ˆˆˆˆˆ (4.11)
e
( ) ( ) PCAPCA
1TT GTGTTTP+−
== ˆˆˆˆˆˆ (4.12)
de modo que o erro seja minimizado:
PCA
TPCA PTGmin ˆˆ− (4.13)
na qual PCAG é a matriz original mxnG , calculada por PCA. Um problema
comum na solução do MCR-ALS é a ambiguidade rotacional (soluções
diferentes para mxrT e TrxnP ). Para contornar este problema, o uso de restrições
é mais adequado, tais como não negatividade [45, 46], balanço de massas [45,
46] ou outros [50]. A restrição de não negatividade pode ser realizada por
diversos e diferentes métodos. Desde a forma mais simples, apenas truncando
os valores negativos para zero, ou por outros métodos mais robustos, como
quadrados mínimos não negativos (NNLS, Non-Negative Least Square) [51],
NNLS rápido (FNNLS, Fast NNLS) [52] ou mesmo o método rápido combinável
(Fast Combinatorial NNLS, FCNNLS) [53].
4.4.1. Fatoração não negativa de matriz (NMF-ALS)
No método fatoração não negativa de matriz (NMF, non-negative matrix
factorization), toda a decomposição em escores e pesos descrita anteriormente
é realizada de forma que estes sempre serão positivos. A primeira função de
atualização proposta para o NMF foi a regra de atualização multiplicativa
euclidiana. No entanto, o algoritmo ALS também pode ser utilizado [54-56]:
58
( )+= TPGT , no qual 0ˆ ≥T (4.14)
e
GTP +=ˆ , no qual 0ˆ ≥P (4.15)
Outra importante diferença no NMF-ALS é que durante o processo de
otimização ou minimização do erro, a função de custo utilizada é a norma de
Frobenius calculada a partir da própria matriz original dos dados (G):
2ˆˆminF
TPTG − (4.16)
Quando um critério de convergência é satisfeito, o algoritmo é parado. Esse
critério pode ser um número máximo de iterações ou um erro mínimo pré-
estabelecido.
4.4.2. MCR com mínimos quadrados alternados ponderados (MCR-WALS)
Os métodos MCR-ALS e NMF-ALS são adequados para resolução de
problemas quando os erros apresentam variância uniforme (i.d.d. normal), ou
seja, seguem uma distribuição normal (homocedástico). Por outro lado, o MCR
com o algoritmo de mínimos quadrados alternados ponderados (WALS, do
inglês weighted alternating least squares) [24] mostrou-se mais robusto na
presença de desvios de normalidade, situação na qual propagação do erro não
segue uma variância uniforme, os dados são heterocedásticos, e/ou existem
erros correlacionados entre os canais (bandas do espectro).
Uma das etapas mais importantes do algoritmo MCR-WALS é estimar os
dados originais ( mxnG ) nos subespaços mxrT e TrxnP para encontrar G , através
do método da máxima verossimilhança:
( ) PPΣPPΣGG1T1
mT1
mmmˆˆˆˆˆ −−−
•• = (4.17)
e
59
( ) n1
nT11
nT
n GΨTTΨTTG •−−−
• = ˆˆˆˆˆ (4.18)
em que, •mG e nG• indicam a m-ésima (linha) e a n-ésima (coluna),
respectivamente, e 1mΣ− e 1
nΨ− são as matrizes de variância-covariância do erro
para a m-ésima linha e a n-ésima coluna de mxnG , respectivamente, o que irá
conferir ao WALS a melhor projeção dos dados e, consequentemente, a melhor
solução. De acordo com as equações 4.17 e 4.18, mxnG será decomposta de
forma ponderada, de modo que para medidas com grandes incertezas são
atribuídos menores pesos. Depois de feito isso, o algoritmo segue as etapas
utilizando as equações 4.11 a 4.13 até que algum critério de parada seja
satisfeito. Para calcular 1mΣ− e 1
nΨ− , também chamadas de matriz covariância do
erro (ECv), é necessário conhecer a medida do erro,
ogge −= (4.19)
em que, og é a medida verdadeira, ou seja, o valor médio encontrado através
de replicatas experimentais reais, e g o valor da medida. No caso desta tese,
a matriz ECv foi calculada para dados de imagens, na qual as amostras são os
pixels, que são independentes entre si. Portanto, 1mΣ− e 1
nΨ− podem ser
definidos apenas como:
( )
==
221
22212
11221
nnn
n
n
σσσ
σσσσσσ
ΛΜΟΜΜ
ΛΚ
Tnxn eeEΣ (4.20)
na qual, nxnΣ é a matriz aproximada ECv e os elementos da diagonal (linha
tracejada) desta matriz descrevem a variância do erro associada com cada
canal, enquanto os elementos fora da diagonal são o erros de covariância entre
eles. O primeiro indicará a uniformidade (homocedasticidade) ou não
uniformidade (heterocedasticidade) das medidas nos deslocamentos Raman, e
o segundo a independência (não correlacionado) ou dependência
60
(correlacionado) entre os mesmos. Uma forma alternativa de complementar a
análise da estrutura do erro é avaliar em termos de matriz de erro de
correlação (ECr, jkρ ), a partir da normalização de ECv pela raiz quadrada da
diagonal (equação 4.20, linha tracejada), que nada mais é que o desvio padrão:
( )∑∑=
diagjkρ (4.21)
4.5. Avaliação dos modelos quimiométricos
Uma importante etapa após a construção dos modelos quimiométricos de
resolução de curvas multivarida é o procedimento de avaliação da performance
dos modelos, como será colocado na próxima seção.
4.5.1. Avaliação dos modelos MCR
Para avaliar os resultados finais dos modelos de resolução de curvas, são
calculadas a falta de ajuste ( LOF, Lack of fit) e a variância explicada ( 2R ):
( )100
ˆ
1 1
2
1 1
2
×−
=∑∑
∑∑
= =
= =I
i
J
jij
I
i
J
jijij
X
XX
LOF (4.22)
e
( )100
ˆ
1
1 1
2
1 1
2
2 ×
−−=
∑∑
∑∑
= =
= =I
i
J
jij
I
i
J
jijij
X
XX
R (4.23)
em que, ijX é a matriz original e ijX é a matriz estimada pelo modelo.
61
Capítulo 5: Síntese, imobilização e
caracterização das AuNPs
62
5. Síntese, imobilização e caracterização das AuNPs
5.1. Solução coloidal
As nanopartículas de ouro (AuNPs) foram sintetizadas pelo método de Lee
e Meisel [57]. Brevemente, uma alíquota de 36 mL de HAuCl4 foi adicionada
em aproximadamente 95 mL de água Milli-Q e levada para o aquecimento com
agitação constante. Chegando ao ponto de ebulição, uma solução de citrato de
sódio anidro (1%, m/v) foi adicionada e o aquecimento interrompido logo que a
solução se tornou vermelha. Após alguns minutos, a agitação também foi
interrompida e o volume completado para 100 mL. Na aplicação 2, antes da
realização das medidas foi adicionado NaCl 1 mol L-1 (1:1, colóide:sal).
Nas aplicações 1 e 3, foi realizado um procedimento de concentração do
colóide: uma alíquota de 5 mL foi levada a centrífuga a 3000 r.p.m. por 30 min,
90% do sobrenadante foi descartado e o restante foi ressuspendido na própria
solução. As Figuras 5.1A e B apresentam as imagens das nanopartículas
sintetizadas e após o procedimento de concentração.
As nanopartículas antes do procedimento de concentração foram
caracterizadas pela obtenção dos espectros de extinção na região do
Uv/visível, nos quais foi verificado um máximo em torno de 532 nm, e por
microscopia eletrônica de transmissão (TEM), com o qual foi verificado que o
tamanho médio das nanopartículas eram de aproximadamente 62 nm.
63
Figura 5.1. Solução coloidal de nanopartículas de ouro (AuNPs) sintetizadas pelo método
clássico de Lee-Meisel [57]. (A) solução coloidal; (B) AuNPs após o procedimento de
concentração; (C) Espectro de extinção das AuNPs antes do procedimento de concentração;
(D) imagens de TEM das AuNPs antes do procedimento de concentração (tamanho médio
aproximado de 62 nm).
5.2. Imobilização das AuNPs
As nanopartículas de ouro foram imobilizadas em slides de vidro (18 x 18 x
1,5 mm, Fisher Scientific®) utilizando um procedimento de silanização com
uma solução de APTMS (3-Aminopropyl)trimethoxysilane) em tolueno (30%),
por 24 h. Em seguida, o substrato foi lavado por 5 dias com etanol e, no quinto
dia, foi seco em forno a 110 oC por 3 h, para permitir o efeito de cross-linked
entre os grupos amino. Mais informações sobre este procedimento podem ser
consultadas em [58]. Para a imobilização das AuNPs, foi utilizada a solução
coloidal descrita anteriormente, diluída a 50% com água deionizada, e o
substrato foi imerso nesta solução por 2 h. Após, o material foi lavado e seco
com N2 e caracterizado por microscopia de força atômica (AFM) em 2 e 3
dimensões, sendo verificada a homogeneidade do recobrimento por
nanopartículas esféricas com tamanho em torno de 50 nm. O material obtido
pode ser visto na Figura 5.2, e mais detalhes serão apresentados na aplicação
4 (Capítulo 9).
64
Figura 5.2. (A) Substrato de vidro funcionalizada com APTMS e recoberto com AuNPs; (B)
suporte em alumínio utilizado para as medidas. Imagens de AFM (C) em 2 dimensões e (D) 3
dimensões.
65
Capítulo 6: Aplicação 1:
SERS e métodos de calibração multivariada usando Floresta Randômica para a quantificação de
hormônios em soro de cães
66
6. Aplicação 1: SERS e métodos de calibração multiv ariada usando
Floresta Randômica para a quantificação de hormônio s em soro de
cães
6.1. Introdução
Os hormônios 17β-estradiol (E2) e noradrenalina (NE) estão presentes
naturalmente em animais e nos seres humanos na ordem de picomolar (pM).
Mesmo em baixíssimas concentrações, os seus efeitos benéficos são bem
conhecidos, principalmente sobre a saúde cardiovascular, devido à sua ação
vasoprotetora e anti-inflamatória [59, 60]. A suplementação com medicamentos
contendo esses hormônios pode prevenir, por exemplo, a ocorrência de
ataques cardíacos em animais e seres humanos [61]. Entretanto, a quantidade
(concentração) necessária para que se alcance esses benefícios ainda não é
conhecida, tornando-se de suma importância a determinação dessas
substâncias, assim como o efeito delas no organismo.
O método mais utilizado para a quantificação hormonal é o ELISA [62],
sendo sua principal vantagem os baixos limites de detecção e quantificação.
Embora o ELISA seja uma técnica bem sensível, a sua principal desvantagem,
do ponto de vista metodológico, é o tempo de análise. Dependendo da
metodologia, diversas etapas de extração e de incubação podem ser
necessárias, as quais demandam muitas horas e os resultados só são obtidos
após alguns dias.
Atualmente, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para
a determinação desses hormônios, baseados em técnicas como cromatografia
líquida acoplada à espectrometria de massas [63, 64], marcador proteico
(exato) com diluição isotópica e espectrometria de massas [65],
quimiluminescência [66], fluorescência de imunoensaio [67] e microextração
em fase líquida com eletroforese e detector de ultravioleta [68]. No entanto,
nota-se ainda uma clara dependência do uso de marcadores moleculares ou de
ensaios imunoenzimáticos, restringindo o método a um determinado composto
ou uma classe de compostos, além de não apresentarem muita praticidade.
Dessa forma, o objetivo desta aplicação foi desenvolver um método para
quantificação de dois hormônios: E2 e NE em soro de cães após a
67
suplementação de medicamentos contra hipertensão. Foram empregadas as
estratégias SERS e de calibração multivariada, com as quais foi desenvolvida
uma metodologia simples, rápida e relativamente de baixo custo, objetivando
uma futura utilização em rotina laboratorial. Como novidade, estudamos pela
primeira vez no nosso grupo o método ensemble: RF [40]; com o qual bons
resultados foram alcançados, comparáveis ao método de referência ELISA.
Alguns testes estatísticos foram realizados para a avaliação da “performance”
dos modelos de calibração desenvolvidos, tais como testes de exatidão e
tendência nos resíduos. Finalmente, baseado na proposta fornecida por
cálculos internos da RF (como outros métodos ensemble), foram calculados os
intervalos de confiança e avaliada a importância das variáveis para a
construção dos modelos de calibração multivariada.
6.2. Procedimento experimental
6.2.1. Coleta das amostras de soro
Oito fêmeas de diferentes idades e pesos do Centro de Cardiologia de
Ensino de Veterinária da Universidade Federal de Lavras (UFLA, MG, Brasil)
foram utilizadas nesse trabalho, sendo que todo o procedimento realizado foi
aprovado pelo comitê de bioética (NINTEC/PRP), protocolo nº 067/11
(24/11/2011). Todos os animais foram examinados previamente antes da sua
inclusão no estudo e somente os saudáveis foram escolhidos. As coletas das
amostras de sangue foram realizadas antes e depois de 2 horas, 5 horas e 10
dias após a suplementação oral dos medicamentos contendo angiotensina-(1–
7) e estriol. Após a coleta, os soros foram armazenados em freezer a -20º C até
as medições serem realizadas. Antes de cada medição, as amostras foram
diluídas com água ultrapura na razão de 1:2 (soro:água).
6.2.2. Síntese e concentração das nanopartículas
Ver capítulo 5, item 5.1.
68
6.2.3. Instrumentação
Para a análise pelo método ELISA, um leitor de placas automático foi
utilizado da marca Termoplate, TP Reader Basic Model, com leitura em seis
comprimentos de onda entre 405-650 nm, além de e um agitador.
Para as medidas SERS, o equipamento utilizado foi um espectrômetro
Raman dispersivo, PerkinElmer RamanStation 400F, equipado com câmera de
imagem de objetiva 10x (10-µm2 spot), um leitor automático de placas e um
laser com potência nominal de 250 mW no infravermelho próximo, em 785 nm,
e um detector CCD de alta sensibilidade, resfriado a -50oC.
6.2.4. Método de referência ELISA
As concentrações nominais dos hormônios foram determinadas pelo
método de referência ELISA, utilizando kits comerciais, Estradiol EIA kit,
adquirido junto a Cayman Chemical Company (item nº 582251), e
Noradrenaline EIA kit, adquirido junto a Uscn Life Science (cE90907Ge). Nos
respectivos manuais podem ser encontradas mais informações sobre os
procedimentos de análise realizados [69, 70].
6.2.5. Tratamento dos dados
O algoritmo AsLS [33] foi utilizado para a correção de linha base e os
espectros anômalos (outliers) foram removidos após uma análise por PCA. Por
fim, os espectros foram normalizados entre 0 e 1, para correção das variações
de intensidades entre os espectros, como será discutido mais adiante.
Os modelos de calibração multivariada foram desenvolvidos com 81
espectros (matriz aumentada), sendo 57 amostras selecionadas para o
conjunto de calibração e 24 para o de validação, escolhidas utilizando uma
análise de componentes principais. Os números ideais de árvores foram
determinados pelos valores mínimos de RMSEOOB. Todos os cálculos foram
realizados com o algoritmo Breiman & Cutler's versão 4.6-10 for R [71].
A qualidade dos modelos RF foi avaliada pela raiz quadrada do erro
(RMSE) e pela análise da possível presença de erros sistemáticos nos
69
modelos, ambos de acordo com a ASTM E1655 [72]. Por fim, uma avaliação
dos resíduos do modelo foi realizada utilizando um teste de permutação [73,
74].
6.3. Resultados e discussão
6.3.1. Metodologia desenvolvida
Antes de iniciar as medidas SERS, as condições de análise foram
previamente avaliadas e otimizadas. Visando uma metodologia que pudesse
ser viável numa rotina laboratorial, as amostras foram dispostas em placas tipo
método ELISA, nas quais é permitido analisar até 96 amostras. Um esquema
resumido do procedimento realizado pode ser visto na Figura 6.1. Após a
síntese e a concentração das AuNPs, descritas no capítulo 5, as amostras de
soro foram analisadas em triplicata, tomando-se o volume de 15 µL, seguidas
da adição de 75 µL da solução ouro coloidal. Antes das leituras as placas foram
agitadas por 30 s, para homogeneização e levadas para obtenção dos
espectros SERS. As melhores condições de operação foram encontradas
quando a potência máxima permitida do laser foi de 100% (250 mW na fonte),
com 4 s de exposição e 12 acumulações. A faixa de trabalho medida
compreende a região de 3280–200 cm-1, com resolução espectral de 4 cm-1,
resultando em 770 pontos no espectro. No entanto, apenas a região entre
1660-348 cm-1 (329 pontos) foi selecionada, por conter maior informação
química relacionada com a estrutura das moléculas em estudo. Ao todo, 27
amostras (81 espectros em triplicata) foram analisadas e todo o procedimento
de análise durou cerca de 2 h.
70
Figura 6.1. Esquema resumido das etapas da metodologia de análise desenvolvida para a
quantificação dos hormônios nos soros de cães.
6.3.2. Caracterização das nanopartículas e espectros SERS dos hormônios
nas amostras de soro
Como foi abordado anteriormente no capítulo 5, uma das características
das nanopartículas de ouro é que seu espectro de extinção fornece uma boa
noção sobre o tamanho [9], o qual está diretamente relacionado com o efeito
de LSPR [17] e, consequentemente, com a intensificação do espectro SERS
(Figura 6.2). Como vimos no capítulo 5, o método de Lee e Meisel [57] permitiu
obter um tamanho médio das partículas de aproximadamente 62 nm,
resultando num máximo de extinção em torno de 532 nm. Por outro lado, nesta
aplicação o plasmon foi localizado por volta de 569 nm (Figura 6.2, Espectro
em azul), o que resultaria num tamanho próximo do anterior. Sendo assim,
como o equipamento Raman utilizado é equipado com um laser de excitação
de 785 nm, este comprimento de onda estaria longe da região ressonante, na
qual ocorre a maior intensificação do campo local e, consequentemente, maior
intensificação do espectro SERS. Como o LSPR é dependente também do
estado de agregação das nanopartículas, torna-se importante um procedimento
de concentração das nanopartículas com intuito de deslocar o plasmon para
71
mais próximo da linha do laser. Dessa forma, foi realizado o procedimento de
concentração por centrifugação (Figura 6.2, Espectro em verde) e também pela
adição de NaCl 1 mol L-1 (Figura 6.2, Espectro em vermelho). Pode-se
observar que este último apresenta um máximo na região da linha do laser
(Figura 6.2, linha vertical em verde). Além disso, a estratégia de agregação das
nanopartículas é de suma importância, uma vez que dímeros, trímeros e
demais estruturas de agregação podem favorecer a formação dos “hotspots”.
Figura 6.2. Espectros de extinção da solução coloidal de ouro. A linha na vertical em verde
indica a linha do laser utilizado (785 nm).
Em trabalhos encontrados na literatura [9, 10], têm sido reportados
problemas com a irregularidade e estabilidade dos coloides, ocasionados pela
mudança das condições do ambiente. A irregularidade está associada a
variações no tamanho das partículas, diretamente relacionada com variações
de intensidade dos espectros [9, 10]. Já mudanças na força iônica, pH e outros
efeitos estão relacionados com problemas de agregação não controlada do
colóide e possível depreciação no sinal obtido [9, 10]. No entanto, o
procedimento de agregação do coloide, não causou nenhum desses efeitos
citados anteriormente. Como outra vantagem do procedimento adotado, o
coeficiente de variação calculado entre os espectros foi de aproximadamente
9%, o que é muito baixo quando comparado a alguns trabalhos reportados na
literatura [9, 10].
72
Na Figura 6.3, estão apresentados todos os espectros SERS obtidos,
antes e após a correção da linha de base os ALS e normalização.
Figura 6.3. Pré-processamento do espectros descrito em etapas. AsLS: do inglês asymmetric
least squares.
Como pode ser observado, os espectros SERS do soro dos animais
apresentam altas flutuações na linha base (Figura 6.3A) e variações das
intensidades SERS (Figura 6.3B). Dessa forma, o algoritmo AsLS foi aplicado
primeiramente e seguido do procedimento de normalização, corrigindo os
73
efeitos citados anteriormente. Os parâmetros utilizados foram p = 0,001 e λ =
104 (equação 4.1, capítulo 4).
6.3.3. Desenvolvimento e validação dos modelos de calibração
Uma vez que os dados foram pré-processados, eles foram separados
em conjuntos de calibração e validação (Figura 6.3C), e os modelos RF foram
desenvolvidos e otimizados usando as amostras OOB (Tabela 6.1). Os
números de árvores foram 24 para o E2 e 8 para a NE. Os valores de
RMSEOOB e RMSEP são similares, um indicativo de que os modelos não
estão sobreajustados. Também os modelos não apresentaram erro sistemático,
utilizando o teste de bias, no qual ambos os hormônios apresentaram valores
de t calculados (0,50 para o E2 e 0,91 para a NE) abaixo do valor tabelado, que
é 2,069, para um limite de confiança de 95% e graus de liberdade iguais a 24-
1. Também pode ser observado que os valores dos erros dados pelo RMSEP
são diferentes para os dois hormônios, 20 pg mL-1 para E2 e 4 pg mL-1 para a
NE, assim como para os valores de erros relativos (Figura 6.4). Essa
discrepância, muito provavelmente, é devido a diferenças entre as faixas de
concentração dos hormônios, que são de 210 – 295 pg mL-1 para E2 e 85 –
103 pg mL-1 para a NE.
Tabela 6.1. “Performance” dos modelos RF para a quantificação dos hormônios em soro de
cães.
Parâmetros b E2a NEa
RMSEOOB (pgmL-1) 24 4
RMSEP (pgmL-1) 20 4
tbias 0,50 0,91
aEstradiol (E2) – 24 árvores; Noradrenalina (NE) – 8 árvores. bRaiz quadrada media do erro de out-of-bag (RMSEOOB) e previsão (RMSEP) ambos em pg
mL-1. Nível de confiança de 95%, a ttab = 2,069 (graus de liberdade de 24-1 para a previsão).
Na Figura 6.4 podemos observar que os erros relativos foram de, no
máximo, 15% para o E2 e 7% para a NE. De acordo com os manuais dos
métodos de referência ELISA [69, 70], os valores de erros relativos para a NE
74
são da ordem de 10% e para o E2 na faixa de 7,1 a 12,3%. Isso confirma
também que os valores alcançados neste estudo são comparáveis ao método
de referência.
Figura 6.4. Resultados para o erro relativo percentual calculado para a calibração/validação
para (A) estradiol e (B) noradrenalina.
Outro método utilizado neste trabalho foi a avalição da presença de
tendência nos resíduos (Figura 6.5), utilizando um teste de permutação [73,
74]. Sabe-se que um modelo bem ajustado não deve conter tendências nos
resíduos dos modelos. Para os resultados dos dois hormônios foram ajustados
polinômios de segundo grau (y=b0 + b1x + b2x2), para 50.000 permutações,
para a relação entre resíduo e valor estimado. A aleatoriedade nos resíduos foi
constatada, ou seja, não existe tendência nos resíduos, sendo ambos
confirmados pelo teste de permutação, que forneceu valores de pvalor maiores
que 0,05 (95% de confiança): 0,383 para E2 (Figura 6.5A e C) e 0,366 para a
NE (Figura 6.5B e D).
75
Figura 6.5. Resíduos dos modelos de calibração para (A) estradiol e (B) noradrenalina. Teste
de permutação aplicado para (C) estradiol e (D) noradrenalina. Linha em verde na vertical é o
valor de b2 calculado antes da permutação. Número de permutações igual 50.000 e os
polinômios ajustados foram o de 2º grau.
Uma característica dos modelos baseados nos métodos ensemble é a
possibilidade dos cálculos de intervalos de confiança [44]. Os intervalos de
confiança estimados estiveram na faixa de 1 a 2 pg mL-1 para o modelo
desenvolvido para a E2, e de 6 a 10 pg mL-1 para o NE, os quais são
resultados aceitáveis para as faixas de concentração estudadas.
6.3.4. Importância das variáveis para a floresta randômica
A principal dúvida sobre os métodos de aprendizado de máquinas, como
redes neurais artificiais ou máquinas de vetores de suporte, dentre outros, é a
falta de informação sobre os cálculos internos realizados durante a etapa de
aprendizagem/calibração, funcionando como uma “caixa preta”. Nesse caso, a
RF permite obter resultados mais interpretáveis (com sentido físico). Esta
avaliação está relacionada ao cálculo interno da importância das variáveis
(ImpVar) [40]. Este resultado permite relacionar os parâmetros do modelo com
a estrutura química das moléculas do analito de interesse, para o qual se quer
desenvolver um modelo de calibração/previsão, tornando o método conhecido
como uma “caixa cinza”.
76
Os resultados calculados de ImpVar para os hormônios estão presentes
na Figura 6.6, em que eles foram contrapostos ou comparados com os
respectivos espectros puros dos analitos em estudo. As suas respectivas
estruturas químicas podem ser vistas no canto superior à esquerda de cada
gráfico (Figuras 6.6A e B). Observam-se valores pronunciados de ImpVar nas
regiões de 992 cm-1 para E2 e 984 cm-1 para NE, os quais estão relacionado
com as vibrações do anel ν(C–C–C) [75]. Assim como, para a banda em 624
cm-1 [76], presentes em ambas as moléculas e atribuída ao grupo δ(C–O).
Além disso, a respiração do anel aromático por volta de 1028 cm-1 foi apenas
selecionada para o E2 [75]. Em contraste, a banda 1172 cm-1 foi mais
importante para a NE, devido a esta região estar relacionada à vibração ν(C–
N), não presente na molécula de E2 [76]. As demais regiões selecionadas e
atribuídas podem ser vistas na Figura 6.6 [75, 76].
77
Figura 6.6. Estimativa das importâncias das variáveis para o modelo RF (A) 17β-estradiol (E2)
e (B) noradrenalina (NE).
6.4. Conclusões
Um novo método foi desenvolvido para a determinação de 17β-estradiol
(E2) e noradrenalina (NE) em soros de cães empregando espectroscopia
Raman intensificada pela superfície, com auxílio do método de calibração
multivariada por floresta randômica (RF). Os resultados finais demostraram que
o método RF foi adequado para ambos os hormônios, com RMSEP de 20
pgmL-1 para E2 e 4 pgmL-1 para NE, comparáveis aos trabalhos da literatura e
com o método de referência. Foi apresentada uma nova abordagem para o
cálculo de intervalos de confiança e importância das variáveis (ImpVar), através
do método de reamostragem ensemble a partir da RF. A estimativa ImpVar
78
demonstrou boa concordância com os seus respectivos espectros puros,
fornecendo resultados com maior sentido químico. Por último, a metodologia
proposta demonstrou ser rápida (por uma parte do procedimento foi
automatizada), com menos de 1 h de análise, requer pouca manipulação da
amostra, apenas uma etapa de diluição, permitindo a manipulação de
interferentes não modelados e desconhecidos, uma vez presentes na amostra
real. Pela facilidade de implementação do método proposto, ele pode se tornar
viável para uma rotina laboratorial e em futuras aplicações com outros analitos
e, talvez, com outras matrizes biológicas complexas.
79
Capítulo 7: Aplicação 2:
SERS e métodos de resolução multivariada de curvas para a detecção in situ de agrotóxico em casca de
frutas
80
7. Aplicação 2: SERS e métodos de resolução multiva riada de curvas
para a detecção in situ de agrotóxico em casca de frutas
7.1. Introdução
O malation é um agrotóxico organofosforado muito utilizado na
agricultura, como inseticida para matar mosquitos e moscas. De acordo com o
EPA, este pesticida é classificado como Classe III, com sugestiva evidência de
carcinogenicidade [77]. Devido a isso, a FDA (Food and Drug Administration)
determina que o limite máximo residual (MRL, do inglês maximum residue
limit), em alimentos, seja de 8 partes por milhão [78]. O método de referência é
baseado na técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) [77, 78],
na qual vários trabalhos utilizando esta técnica podem ser encontrados na
literatura [79-81]. Entretanto, a HPLC é uma técnica relativamente demorada e,
na maioria dos casos, requer várias etapas de pré-tratamento de amostra e de
extração, nas quais o analito de interesse pode ser perdido ao longo desses
processos. Além disso, ela é destrutiva e não permite a realização de análises
in situ.
A espectroscopia SERS tem tido grande destaque nos últimos anos,
como uma técnica que permite a detecção de pesticidas em baixas
concentrações, apresentando também alta seletividade e baixos limites de
quantificação [82]. Os recentes avanços em SERS têm possibilitado o seu uso
em ambientes adversos. Exemplos estão na detecção de estruturas biológicas
e estudos intracelulares [5, 83-85] utilizando a espectroscopia de imagens,
como também na detecção de pesticidas e herbicidas residuais em alimentos
[86, 87]. Liu e colaboradores [86] utilizaram nanopartículas de ouro-prata do
tipo caroço-casca (nanoshells) para identificarem e detectarem resíduos de
pesticidas em cascas de alguns frutos. Nesse caso, os autores relataram que
essa detecção não foi possível em algumas amostras devido a anomalias
presentes nos espectros advindos da matriz. Além disso, do ponto de vista
prático, a síntese das nanoshells proposta pelos autores é muito extensa e
demorada, além de envolver diversas etapas de preparação das
nanopartículas.
81
Atualmente, uma vertente importante da técnica de espectroscopia
Raman é o emprego de SERS de imagens juntamente com métodos
quimiométricos de resolução de curvas [3, 88]. A adição da informação espacial
aumenta a capacidade de detecção, possibilitando alcançar baixos limites de
detecção. Como exemplo, a concentração do pesticida no total (bulk) da
amostra pode ser relativamente baixa, no entanto, em determinados pontos da
área mapeada (pixels) a concentração pode ser alta.
Dessa forma, nesta tese desenvolveu-se uma metodologia analítica
relativamente simples e eficiente, que não necessitou quaisquer pré-
tratamentos de amostra e utilizando uma síntese de nanopartículas de ouro
clássica, com apenas uma etapa. O método permitiu a detecção in situ de
malation em cascas de tomate e ameixa acoplando SERS de imagens e
métodos de resolução multivariada de curvas. Foi testado e avaliado o método
de resolução de curvas por fatoração não-negativa com mínimo quadrados
alternados (NMF-ALS) e os resultados foram comparados com o método mais
utilizado, que é o de resolução multivariada de curvas com mínimos quadrados
alternados (MCR-ALS). Além disso, os resultados para a ameixa apresentaram
estrutura de erro heterocesdástico, na qual apenas o MCR-WALS apresentou
excelentes resultados de recuperação dos espectros. Matrizes de
variância/covariância dos erros (ECMs) foram calculadas para qualificar e
avaliar a estrutura de erros dos dados.
7.2. Procedimento experimental
7.2.1. Solucões e reagentes
O ácido tetracloroauríco (HAuCl4) 30 wt% foi adquirido na Sigma-Aldrich,
o citrato de sódio anidro (Na3C6H5O7), o cloreto de sódio (NaCl) e o etanol
anidro PA 99,8% (C2H6O) foram adquiridos na Synth (Brasil) e o padrão de
malation foi adquirido na Pestanal (Alemanhã). As amostras de tomate e
ameixa foram compradas em um mercado local, de modo que fossem
alimentos “orgânicos”, ou seja, livre de pesticidas. Para todo o experimento
realizado, a água utilizada foi do tipo Milli-Q® UltrapureWater Purification
System (Millipore, Bruxelas, Bélgica). Todas as vidrarias utilizadas durante o
82
experimento foram lavadas com uma solução de água régia (3:1, HCl:HNO3) e
secas antes de serem utilizadas novamente.
7.2.2. Síntese do colóide
Ver capítulo 5, item 5.1.
7.2.3. Espectrômetro Raman de Imagem
Para as medidas SERS, o equipamento utilizado foi um espectrômetro
Raman dispersivo, PerkinElmer RamanStation 400F, equipado com câmera de
imagem de objetiva 10x (10-µm2 spot), um laser com potência nominal de 250
mW no infravermelho próximo (785 nm) e um detector CCD de alta
sensibilidade refrigerado a -50oC. Ver capítulo 3, item 3.2.
7.2.4. Análise e tratamento dos dados
Para a detecção dos resíduos de pesticidas, cinco soluções de malation
com concentrações de 12,30; 6,15; 1,23; 0,62 e 0,12 mg L-1 foram preparadas
e utilizadas para a contaminação das cascas. Antes de cada medida, uma
solução de cloreto de sódio, 1 mol L-1, foi adicionada à solução de ouro coloidal
antes de ser adicionado o colóide de ouro sobre as superfícies das cascas.
Para o mapeamento, uma fina camada de casca de tomate ou ameixa
com dimensões de 2,0 x 2,0 x 0,1 cm, foi cortada com o auxílio de um bisturi, e
este fragmento foi colocado sobre uma cela de quartzo (ver Figura 7.1). Em
seguida, 5 µL de uma solução de malation foi adicionado sobre um ponto
central da casca e finalmente 5 µL de etanol foi adicionado sobre o malation,
para permitir a interação do pesticida com a superfície. Depois, a superfície
contaminada foi seca em temperatura ambiente e, em seguida, foram
adicionados 25 µL da solução coloidal de ouro e levado para aquisição do
mapeamento no equipamento Raman. O laser foi operado na sua potência
máxima e o tempo de integração foi de 5s com 10 acumulações. Esse
procedimento foi repetido para todas as concentrações de malation e para
83
ambos os alimentos. Triplicatas experimentais foram realizadas para medida do
erro (variações entre as medidas experimentais, tomadas como o desvio
padrão para cada número de onda).
Figura 7.1. Esquema do procedimento utilizado para a detecção dos resíduos de pesticidas.
Durante a realização dos mapeamentos, a região escolhida foi de 1,2 x
1,2 mm a partir do ponto central da casca, com resolução de 0,1 mm,
resultando em 12 x 12 = 144 pixels. Um espectro foi obtido para cada pixel na
faixa espectral entre 3200-600 cm-1, resultando num cubo hiperspectral de
dimensões 12 × 12 × 770 para cada amostra.
Para os cálculos, as regiões selecionadas para o tomate foram 12 × 12 ×
220 e 12 × 12 × 255 para ameixa, que foram definidas de acordo com a região
espectral de maior informação e, ao mesmo tempo, de melhor desempenho
dos modelos quimiométricos. Analisando o esquema da Figura 7.2, os cubos
hiperespectrais (D1, D2, ..., D15) são desdobrados em matrizes (D1, D2, ..., D15)
na direção das linhas, ou seja, pixel por pixel, para serem decompostos pelos
métodos bilineares. Em seguida, as matrizes são concatenadas na forma de
uma matriz aumentada (Daum) e os dados foram pré-processados por
normalização pela média da linha (por espectro) e pelos AsLS [33], para
84
correção do “background” devido à fluorescência. Os dados relativos às
amostras de ameixa foram pré-processados apenas por AsLS, como será
discutido posteriormente. Antes do uso dos métodos de resolução de curvas,
foi feita uma avaliação das ECMs, na forma de duas matrizes, a Ecv e Ecr,
visando uma melhor compreensão da estrutura do erro nos dados. Em
sequência, os métodos de resolução foram aplicados. Os resultados finais são
a imagem química e os seus respectivos espectros puros. (ver Figura 7.2).
Figura 7.2. Esquema do tratamento de dados realizado para obtenção das imagens químicas e
espectros puros.
A eficiência dos modelos foi avaliada pelos cálculos de falta de ajuste (
LOF, equação 4.22) e variância explicada (R2 eq. , equação 4.23) [32]. O LOF
e R2 têm interpretações semelhantes, embora, o LOF tenha mais sensibilidade
quando as diferenças são pequenas, como veremos nos resultados obtidos.
7.3. Resultados e discussão
7.3.1. Detecção por SERS
85
Antes de realizar as contaminações das cascas de tomate e ameixa, e
para avaliar a sensibilidade das nanopartículas de ouro sintetizadas com
respeito à detecção dos pesticidas, espectros pontuais foram adquiridos para
cinco soluções diluídas de malation (Figura 7.3a). Nesse caso, todas as
concentrações mostraram atividade SERS, destacando-se um pico intenso na
região de 1032 cm-1, atribuído à vibração P-O-CH3 [89]. Esta região poderia ser
utilizada para monitorar o pesticida e realizar-se uma detecção baseada em um
modelo univariado. Entretanto, quando se sobrepõe os espectros do tomate e
da ameixa (antes da contaminação) com o espectro do malation na
concentração de 12,3 mg L-1 (Figuras 7.3b e c), pode-se observar claramente
diversas regiões de sobreposição, assim como na região de 1032 cm-1. Esses
resultados sugerem que utilizar um modelo univariado não seria o mais
adequado para estes casos em estudo.
Figura 7.3. Espectros SERS pontuais; (a) Espectros SERS do malation em todas as condições
de trabalho; (b) Espectros SERS para o tomate e para o malation nas concentrações de 12,3
mg L-1. (c) Espetros SERS para a ameixa e para o malation nas concentrações de 12,3 mg L-1.
7.3.2. Pré-processamento
Como descrito anteriormente, os pré-processamentos foram utilizados
após serem adquiridos os dados, excluindo o procedimento de normalização
86
para os dados de ameixa. A normalização foi requerida devido a um problema
comum apresentado em imagens hiperespectrais Raman e SERS [3, 32], que
são às alterações de intensidade nos dispositivos de excitação (LASER) ao
longo do mapeamento. Adicionalmente, em SERS de imagem, existe também
um efeito de flutuação das intensidades dos espectros, relacionado à variação
do tamanho das nanoparticulas e à presença de agregados contidos no colóide
de ouro que recobrem a superfície da amostra [10, 90]. Além disso, essa
variação pode ser observada também devido à irregularidade nas superfícies
das frutas. Portanto, procedimentos de normalização se tornam essenciais para
alcançar um bom resultado, neste caso. Outra correção que foi realizada é a
correção de linha base, devido a um intenso background de fluorescência,
oriundo da complexidade das amostras. Para esta tarefa, o algoritmo AsLS foi
utilizado. Por último, os spikes cósmicos foram removidos a partir de uma rotina
desenvolvida pelo nosso grupo [91].
7.3.3. Medida da matriz de covariância dos erros (ECMs)
As análises de ECMs podem ser feitas de diversas formas [92]. Neste
trabalho, uma simples análise visual das matrizes ECv e ECr foi realizada
(Figura 7.4). Para os resultados do tomate, pode ser notada uma concordância
entre o espectro médio e o desvio padrão (em cada número de onda), o qual
aumenta com a intensidade do sinal de forma análoga (Figuras 7.4a e b). Este
comportamento pode ser associado com ruídos offset e offset multiplicativo,
proporcionais à magnitude do sinal, típico de ruído correlacionado, que pode
ser melhor observado na Figura 7.4c. Uma elevada variância está presente nos
canais entre aproximadamente 1600-1500 cm-1 e 1200-1100 cm-1, onde os
picos são mais intensos. O mesmo pode ser visto na Figura 7.4d através da
matriz Ecr, indicando que a grande maioria dos canais (números de onda)
apresenta uma significativa correlação positiva. A partir destas figuras pode-se
concluir que apesar da presença de erros correlacionados, os dados são de
natureza homocedástica, ou seja, seguem a distribuição normal.
Na Figura 7.5 são apresentados os resultados para os dados de ameixa.
Como mencionado anteriormente, estes espectros foram corrigidos apenas
pelo algoritmo AsLS (Figura 7.5a). A correlação entre os espectros médios e os
87
desvios padrão em cada número de onda é alta em certas regiões,
principalmente nos picos mais intensos. Em contrapartida, na faixa entre 872-
696 cm-1 e 1476-1112 cm-1 (Figura 7.5b) esta correlação é perdida. É possível
concluir que os dados apresentam também erros correlacionados (Figura 7.5d),
em determinadas regiões do espectro, no entanto, também é perceptível uma
modificação na forma da matriz de covariância (Figura 7.5c), em relação a
discutida anteriormente (Figura 7.4c). Este comportamento é típico em dados
que apresentam heterocedasticidade e não seguem uma distribuição normal.
Estes seus resultados serão comentados na sessão seguinte.
Figura 7.4. (a) todos os espectros do mapeamento do tomate pré-processados por
normalização e AsLS; (b) comparação entre o desvio padrão e média do espectro SERS; (c)
matriz de covariância do erro (ECv); (d) matriz de correlação do erro (ECr) para os canais entre
1768-892 cm-1.
88
Figura 7.5. (a) Todo os espectros do mapeamento da ameixa pré-processados por AsLS; (b)
comparação entre o desvio padrão e a média do espectro SERS (c) matriz de covariância do
erro (ECv) e (d) matriz de correlação do erro (ECr) para os canais na faixa entre 1712-696 cm-1.
7.3.4. Resultados para o MCR-ALS, NMF-ALS e MCR-WALS
Primeiramente, cabe ressaltar que o objetivo deste trabalho não foi
comparar o desempenho entre os algoritmos MCR-ALS, NMF-ALS e MCR-
WALS, mas desenvolver um método analítico para detecção de resíduos de
pesticidas sem qualquer manipulação da amostra e de maneira muito simples e
rápida, sem a necessidade de conhecer previamente o espectro puro do
pesticida. Para isso, algumas características foram consideradas para resolver
os diversos casos. (1) Inicialização: os algoritmos foram inicializados sem as
contribuições dos perfis ou espectros puros do malation e das frutas, uma vez
que esta informação nem sempre está disponível. Para o NMF-ALS foi utilizada
uma inicialização pseudorrandômica, escalando esses perfis em relação à
matriz original. No MCR-ALS, foram testados o algoritmo PURE [46] e, depois,
uma inicialização randômica, sendo ambos os resultados foram equivalentes. O
MCR-WALS foi inicializado por uma permutação aleatória através de uma
89
amostragem da matriz original. (2) Os postos químicos (ou rank) das matrizes
foi pré-definido como sendo iguais a dois (r = 2, pesticida e fruta) e também
avaliados por SVD. Após uma análise dos dados de ameixa, o seu posto foi
determinado como 3, como será comentando mais adiante. (3) Restrições: para
o NMF-ALS não foi utilizada qualquer restrição, uma vez que no seu próprio
algoritmo os valores negativos são automaticamente forçados para zero. No
MCR-ALS foi utilizada a restrição de não negatividade, com o algoritmo FNNLS
[31] e depois comparados com os resultados forçando apenas os valores
negativos a zero, o que seria equivalente ao NMF-ALS. Ambos apresentaram
resultados equivalentes. No MCR-WALS, a restrição de não negatividade com
o algoritmo FCNNLS [32] foi utilizada. (4) Ajuste dos modelos: os modelos
NMF-ALS, MCR-ALS e MCR-WALS para o tomate e para a ameixa foram
desenvolvidos. Um balanço de massas foi realizado apenas no final para fins
comparativos entre os mapas de concentração. (5) Os parâmetros de LOF e
R2 foram utilizados para avaliarem a capacidade de recuperação dos métodos
e justificar possíveis discrepâncias. Os resultados são apresentados na Tabela
7.1.
Tabela 7.1. Resultados dos modelos de resolução de curvas.
Parâmetros MCR-ALS
(tomate)
MCR-
WALS
(tomate)
NMF-ALS
(tomate)
MCR-ALS
(ameixa)
MCR-
WALS
(ameixa)
NMF-ALS*
(ameixa)
LOF 24.0 39.5 17.4 59.8 21.2 48,4
R2 94.2 84.4 97.0 64.3 95.5 -
*valor muito grande.
Para o tomate, os resultados do modelo NMF-ALS foram um pouco
melhores que os do MCR-ALS, com menores valores de LOF e maiores
valores de R2. Embora o MCR-ALS e o NMF-ALS tenham o mesmo algoritmo
para atualização das matrizes, o ALS, o processo de cálculo dos erros é
diferente (ver capítulo 4, item 4.4). Comparando os resultados de recuperação
dos espectros do tomate e do pesticida para ambos os modelos (Figura 7.6),
pode-se observar que ambos recuperaram equivalentemente o espectro do
tomate. No entanto, ao compararmos os espectros recuperados para o
90
malation, fica evidente novamente que o NMF-ALS apresentou melhor
recuperação, principalmente nas regiões nas quais o sinal do tomate foi mais
intenso. Cabe ressaltar que, apesar dessa diferença para ambos os métodos, a
principal banda em 1032 cm-1 foi recuperada de forma satisfatória e, assim,
tanto o MCR-ALS quanto o NMF-ALS podem ser empregados para
identificação do pesticida na casca de tomate.
Figura 7.6. Comparação dos espectros recuperados do tomate e do malation recuperado pelos
métodos NMF-ALS e MCR-ALS.
Em contrapartida, os resultados para o tomate utilizando o MCR-WALS
foram os piores de todos, não sendo considerado o mais adequado para
tratamento de dados com ruído homocedástico.
Logo, os resultados para o tomate empregando o método NMF-ALS
demonstram boa recuperação e semelhança com os seus respectivos
espectros puro. Nos mapas de concentração pode ser vista a alta
complementariedade das regiões (Figura 7.7).
91
Figura 7.7. Resultados do NMF-ALS para o tomate; (a) recuperação do NMF-ALS para os
espectros do tomate e da ameixa; (b) mapeamento para o tomate (c) mapeamento para o
malation (12,30 a 0,12 mg L-1).
Para os dados de ameixa (Figura 7.8), a presença do ruído
heterocedástico nos dados pode explicar os melhores resultados do modelo
MCR-WALS. De fato, o NMF e o MCR com o algoritmo ALS consideram que os
erros são sempre homocedásticos e, portanto, seguem a distribuição normal
[24]. No entanto, isso nem sempre ocorre, como foi mostrado neste trabalho.
No algoritmo MCR-WALS, é realizada uma ponderação nas matrizes de
concentrações e dos espectros puros a partir da matriz de covariância dos
erros. Caso um canal apresente um erro elevado, um menor peso é dado para
este, caso contrário é atribuído um maior peso. Bons resultados foram obtidos
para os espectros recuperados e mapas de concentração obtidos pelo método
MCR-WALS para a ameixa (Figura 7.8). Nesse caso, um fator a mais foi
necessário para explicar o sinal de fluorescência, que provavelmente é algo
intrínseco e presente na casca da ameixa, como pode ser visualizado nos
mapas de concentração e espectros recuperados. (Figura 7.8b).
92
Figura 7.8. Resultados do MCR-WALS para a ameixa; (a) recuperação do MCR-WALS para os
espectros de fluorescência, ameixa e malation; (b) mapeamento para a fluorescência; (c)
mapeamento para a ameixa (d) mapeamento para o malation (12.3 a 0.123 mg L-1).
7.3.5. Resultados quantitativos para o MCR-ALS, NMF-ALS e MCR-WALS
A fim de avaliar a relação entre os resultados médios dos escores
(valores médios para cada mapeamento) e as concentrações esperadas,
visando uma possível aplicação do método para quantificação, os resultados
foram apresentados na forma de curvas pseudo-univariados, nas quais são
graficados os valores médios dos escores contra o valor esperado na casca
para o NMF-ALS, no caso do tomate, e MCR-WALS, para a ameixa (Figuras
7.9A e B).
Foi realizada uma estimativa da concentração esperada de malation nas
cascas, a partir da concentração da solução de malation, volume adicionado na
casca e área mapeada. Tomando como exemplo a concentração de 12,3 mg L-
1, ao ser utilizado 5 µL desta solução, resultaria numa massa de 6,15 x 10-8 mg
93
sobre um volume de aproximadamente 0,40 cm3 (volume ocupado) ou 1,54 x
10-8 mg.cm3 de malation na casca. No entanto, a região mapeada foi de 1,20 x
1,20 x 0,10 mm (0,14 mm3), sendo que a quantidade de massa presente nesta
janela seria de 1,1 x 10-7 mg.mm-3 ou equivalente a 106,80 ppb, se considera-
se que mm-3 para L. Portanto, a partir desta transformação o limite de detecção
foi estabelecido em 1,10 ppb.
Fica evidenciada uma relação entre os escores médios dos mapas e os
valores esperados de concentração, que pode ser modela por uma curva não
linear. Além disso, os baixos valores dos coeficientes de correlação
demonstram a dificuldade de recuperação dos espectros de resíduos do
pesticida nas cascas empregadas, sendo que o resultado para o tomate com o
método NMF-ALS foi um pouco melhor do que o MCR-WALS para a ameixa, r2
= 0,892 e r2 = 0,787, respectivamente.
Figura 7.9. (A) Escores médios do NMF-ALS versus concentração esperada na casca para o
tomate e (B) Escores médios do MCR-WALS versus concentração esperada na casca para a
ameixa.
7.4. Conclusões
O método proposto demonstrou ser capaz de identificar in situ o pesticida
mesmo em concentrações muito baixas nas cascas de diferentes frutas. Ele
pode ser considerado eficaz mesmo na presença de ruídos correlacionados e
heterocedáscticos e na presença de sobreposição de picos. Os espectros
SERS de imagem acopladas com os métodos quimiométricos permitiram a
94
detecção do malation abaixo do limite máximo de resíduos, que é 8 ppm,
alcançando o limite de detecção estimado de 1,1 ppb.
Para os dados do tomate, os resultados do NMF-ALS foram superiores
ao MCR-ALS, com melhor recuperação dos espectros na presença de ruído
correlacionado. Por outro lado, para a ameixa, devido à presença dos ruídos
heterocedásticos e correlacionados, o MCR-WALS foi mais apropriado, com
superior recuperação dos espectros e dos mapas de distribuição. A
metodologia analítica desenvolvida é relativamente fácil de ser implementada,
rápida, eficiente e não requer manipulação de amostra, permitindo a análise in
situ. O método proposto pode ser aplicado para outras frutas, com outros
pesticidas, sem precisar conhecer o espectro dos interferentes, uma vez que os
algoritmos foram inicializados sem quaisquer informações dos compostos
presentes nas amostras.
95
Capítulo 8: Aplicação 3:
Desenvolvimento de um método para quantificação de melamina em diferentes matrizes de leite
96
8. Aplicação 3: Desenvolvimento de um método para q uantificação de
melamina em diferentes matrizes de leite
8.1. Introdução
O leite é um dos produtos alimentícios mais suscetíveis à adulteração,
devido à facilidade neste procedimento e, principalmente, pelos componentes
adicionados que mimetizam as propriedades dos compostos originais [93, 94].
Dentre estes compostos adulterantes, pode-se destacar a melamina (1,3,5-
Triazina-2,4,6-triamina), que é um composto rico em nitrogênio, comumente
utilizado para simular o alto teor de proteína no leite após a diluição do mesmo
com água. Uma vez que até baixas concentrações deste contaminante podem
causar intoxicação e até morte, muitos países têm estabelecido que o limite
melamina em fórmula infantil e outros produtos alimentícios seja de 1 mg kg-1 e
2,5 mg kg-1, respectivamente [93, 94].
Atualmente, o método de referência para a determinação de melamina
em leites é feito por LC-MS-MS [93]. No entanto, apesar de ser uma técnica
muito robusta, o método atual utiliza de grande quantidade volumes de
amostra, além de requerer diversas etapas de extração para limpeza e
separação do analito da amostra. Recentemente, novas aplicações têm sido
baseadas na espectroscopia Raman intensificada por superfície (SERS) [95,
96], devido à sensibilidade e certa seletividade da técnica com o analito de
interesse e, principalmente, pelo mínimo preparado de amostra. Embora o
SERS apresente diversas vantagens sobre o método oficial, algumas
características ainda dificultam sua inserção como um método analítico e/ou
consolidação na área de química de alimentos. Dentre elas, podem-se destacar
a estreita e/ou a não compreensão do limite máximo residual (MRL, do inglês
maximum residue limit) dentro da faixa linear proposta pelos métodos [95]. Os
limites de detecção e quantificação apresentados em trabalhos envolvendo o
SERS muitas vezes são baseados no analito em solução e não nas amostras
reais [95, 96], portanto, não consideram a presença de possíveis interferentes.
Além disso, muitos dos métodos utilizam de procedimentos de sínteses de
nanopartículas que são complexos e demandam muito tempo de preparo [95,
96]. Também os métodos apresentados são desenvolvidos para um produto
97
específico, e a determinação de melamina em vários produtos
simultaneamente é uma aplicação interessante, uma vez que apenas um
modelo de calibração é utilizado, facilitando a atualização e aplicação do
mesmo.
O método fatoração NMF é um método de resolução multivariada de
curvas que foi desenvolvido para processamento de imagens faciais [56]. Uma
característica deste método é que, ao contrário do método de análise de
componentes principais (PCA, do inglês principal componente analysis) [56], os
elementos são sempre maiores ou iguais a zero. Como resultado, quando
fatoramos uma matriz de misturas os resultados serão perfis de concentrações
e espectrais comparáveis aos seus respectivos espectros puros
separadamente. Quanto à sua aplicação em química analítica, podemos
destacar alguns trabalhos encontrados na literatura, no processamento de
imagens SERS [4], fluorescência [97], ressonância magnética nuclear [98] e
espectroscopia Raman coerente anti-stokes [99], separação de sobreposição
em dados cromatográficos [100], espectros de fluorescência [101] e dados de
gene de expressão [102]. No entanto, não têm sido relatados e explorados
ainda em trabalhos voltados para a quantificação, mas apenas para fins semi-
quantitativos [99, 102].
Um problema comum a todos os métodos de resolução de curvas, assim
como para o NMF, é o número infinito de resultados (escores e pesos) que
podem resultar na matriz original de dados, chamado de ambiguidade
rotacional. No entanto, esse problema é facilmente contornado através do uso
de restrições [46]. O uso das restrições visa limitar o número de soluções
possíveis e auxilia ao algoritmo a convergir a um resultado único, ou seja, mais
próximo do resultado com sentido físico e desejável. Do ponto de vista da
calibração, a restrição mais importante é a restrição de correlação [103, 104].
Nesse caso, os escores referentes à concentração do analito de interesse são
correlacionados com suas respectivas concentrações conhecidas (fase de
calibração) durante o processo de otimização do algoritmo. Os resultados são
significativamente melhorados e apresentam baixos erros de previsão. No
entanto, em alguns casos complexos, nos quais os dados apresentam efeito de
matriz, o uso da restrição de correlação precisa ser adaptado. Uma forma de
fazer isso é utilizando uma restrição de correlação local (CL), na qual os
98
escores são corrigidos em relação a um modelo de referência [105] para cada
caso. Em um trabalho recente, Oliveira et al. [105] demostraram o uso da
restrição CL para a determinação de biodiesel em diesel, no qual o efeito de
matriz estava presente entre diferentes bateladas. Contudo, quando as
amostras são muito diferentes, a restrição de CL deve ser aprimorada.
Neste capítulo é apresentada uma estratégia de calibração multiproduto
[106, 107] utilizando a técnica SERS que permite a quantificação simultânea de
melamina em duas diferentes matrizes de leite: UHT e a FI. Para isso, foi
inserido no algoritmo NMF-ALS a restrição de correlação em várias etapas. A
estratégia consistiu em re-escalar os escores em uma restrição local para cada
produto e, depois, o efeito de matriz foi corrigido utilizando uma terceira
equação global para relacionar os scores do NMF-ALS para todos os produtos
conjuntamente com os valores conhecidos de concentração. A performance e
validação dos modelos desenvolvidos por NMF-ALS com restrição de
correlação foram avaliadas através de figuras de mérito e os resultados
comparados ao método de calibração multivariada, que é a regressão por
mínimos quadrados parciais (PLSR).
8.1.1. NMF-ALS com restrição de correlação múltipla
O uso das restrições é muito importante para os métodos de resolução
de curvas bilineares, uma vez que auxiliam a obter um resultado que seja mais
próximo do real e com sentido físico, evitando a chamada ambiguidade
rotacional. Dentre as diversas restrições existentes para os métodos MCR [46],
de fato, a mais importante para a calibração é a chamada restrição de
correlação [103, 104], na qual o objetivo principal é maximizar a correlação e a
covariância entre os escores e as concentrações nominais, durante todo o
processo interativo do algoritmo. Embora em alguns casos nos quais existam
desvios de concentração, o uso de dois ou mais modelos locais pode auxiliar a
resolver esse problema [105]. No entanto, na calibração multiproduto, na qual
as amostras são diferentes, produzindo também diferentes modelos/curvas de
calibração (intercepto e inclinação diferentes) por apresentarem efeito de
matriz, uma consideração deve ser feita para corrigir esta diferença e obter-se
apenas uma única curva de calibração que descreva a calibração da melamina
99
em duas matrizes distintas. A proposta utilizada nessa tese segue os seguintes
passos (ver Figura 8.1):
Figura 8.1. Esquema ilustrando o NMF-ALS com restrição de correlação múltipla.
(1) Primeiramente, os dados são organizados numa matriz aumentada augV ,
contendo tanto os espectros do leite UHT como o da fórmula infantil;
(2) A matriz aumentada augV é então decomposta em duas sub-matrizes: W
(escores, perfis de concentrações) e HT (pesos, perfis de espectrais);
(3) O fator correspondente ao perfil de concentração da melamina é
extraído de W e relacionado com as suas respectivas concentrações
nominais em cada leite, separadamente, encontrando-se duas curvas de
calibração chamadas de pseudo-univariadas:
100
UHTUHTUHTUHT
cal bb 10 CW += (8.1)
FIFIFIFI
cal bb 10 CW += (8.2)
(4) Os coeficientes encontrados nas retas ajustadas apresentadas nas
equações (8.1) e (8.2) são utilizados para re-escalar os escores nos
conjuntos de calibração e validação, também separadamente:
[ ][ ]
UHT
UHTUHTcal;valUHT
cal;val b
b
1
0ˆ −=
WW (8.3)
[ ][ ]
FI
FIFIcal;valFI
cal;val b
b
1
0ˆ −=
WW (8.4)
(5) Após realizar-se esta correção, os escores do conjunto de calibração
são armazenados num vetor aumentado, contendo os dois produtos
conjuntamente, e então uma nova curva de calibração é ajustada:
globalglobal
calglobalglobal
cal bb 10 CW += (8.5)
(6) Finalmente, todos os escores tanto de calibração quanto validação para
ambos os leites são re-escalados utilizando os parâmetros do modelo
ajustado mostrado na equação (8.6):
global
globalglobalvalcal
b
b
1
0];[ˆ −=
WW (8.6)
(7) O vetor W retorna para o algoritmo ALS e este processo continua até
que algum critério de convergência seja satisfeito, como mencionado
anteriormente.
101
8.2. Procedimento experimental
8.2.1. Síntese do colóide
Ver capítulo 5, item 5.1.
8.2.2. Espectrômetro Raman
Para as medidas SERS, o equipamento utilizado foi um espectrômetro
Raman dispersivo, PerkinElmer RamanStation 400F, equipado com câmera de
imagem de objetiva 10x (10-µm2 spot), um laser com potência nominal de 250
mW no infravermelho próximo (785 nm) e um detector CCD de alta
sensibilidade refrigerado a -50oC. Ver capítulo 3, item 3.2.
8.2.3. Conjuntos de calibração e validação
As amostras de leites FI e UHT foram adquiridas num mercado local,
nas quais não foram constatadas a presença de melamina. As concentrações
do conjunto de calibração foram selecionadas através do planejamento D-
optimal tomando o valor de MRL como base, que é de 1,0 mg L-1 para a FI e
2,5 mg L-1 para o UHT [93, 94]. Portanto, cinco soluções nas concentrações de
0,00; 1,25; 2,50; 3,75; 5,00 mg L-1 foram preparadas por adição nos leites. No
conjunto de validação, as soluções foram preparadas baseadas nos pontos
centrais das faixas de concentrações anteriores: 0,63; 1,88; 3,13; 4,38 mg L-1.
Todas as soluções foram preparadas com triplicatas reais.
8.2.4. Medidas
Um esquema ilustrando o procedimento experimental realizado pode ser
visto na Figura 8.2. Como suporte para a disposição das amostras foi utilizado
um “slide” de vidro recoberto com uma folha de alumínio. 1 µL de cada amostra
foi adicionada no suporte, seguido de 5 µL da solução coloidal. Após isso, o
material foi deixado por aproximadamente 40 min para secar. Finalmente, o
suporte foi levado ao equipamento Raman para as medidas. Os espectros
102
foram adquiridos nas mesmas condições de análise para todas as amostras;
100% da potência do laser, 4 s de exposição, 12 acumulações na faixa
espectral de 3200-200 cm-1 com resolução espectral de 4 cm-1.
Figura 8.2. Esquema ilustrando o procedimento experimental realizado para o desenvolvimento
dos modelos de calibração de melamina nos diferentes produtos.
8.3. Resultados e discussão
8.3.1. “Performance” e espectros recuperados
A correção de linha base dos espectros foi feita através do algoritmo
AsLS [22]. Os espectros corrigidos estão representados na Figura 8.3, abaixo.
Figura 8.3. Espectros SERS dos conjuntos de calibração e validação para os diferentes
produtos antes (A) e depois (B) da correção da linha base pelo algoritmo quadrados mínimos
assimétricos (AsLS).
103
Em seguida, as flutuações de intensidades SERS foram corrigidas
através de um procedimento de normalização (norma de Frobenius). Após o
pré-precessamento dos dados, o número de fatores do modelo foi determinado
através de uma análise SVD e checado em concordância aos resultados do
NMF-ALS sem restrição de correlação múltipla. O número adequado de fatores
foi estipulado como cinco, resultando num modelo com 98% de variância
acumulada. Como forma de constatação do efeito de matriz existente sobre a
melamina nas diferentes matrizes, os escores do NMF-ALS para cada amostra
de leite foram “plotados” contra as concentrações nominais e, em seguida,
duas equações foram ajustadas para os dados (Figura 8.4). Visualmente,
existe uma forte evidência neste gráfico que as curvas de calibração são
diferentes, com intercepto e inclinação diferentes, confirmando o efeito de
matriz. Embora, esta diferença não foi estatisticamente avaliada. Sendo assim,
não seria possível desenvolver apenas um modelo de calibração global para a
determinação da melamina em ambos os leites utilizando apenas um único
modelo. Neste caso, o NMF com restrição de correlação múltipla foi empregado
para desenvolver os novos modelos corrigidos utilizando esses dados.
Figura 8.4. Curva de calibração dos escores do NMF sem restrição de correlação múltipla
versus concentração nominal para ambos os produtos.
104
O melhor modelo obtido com o NMF com restrição de correlação foi
também com cinco fatores, para o qual se obteve 12% de falta de ajuste e 99%
de variância explicada. A Figura 8.5 apresenta os perfis espectrais recuperados
pelo método, sendo que o primeiro fator demonstra ter alta concordância com o
espectro puro da melamina. Algumas bandas nas regiões de 584, 700, 1000 e
1076 cm-1 foram identificadas e estão de acordo com o que foi relatado
anteriormente na literatura [95] para este composto. Além disso, pode-se
observar que outros dois fatores para cada leite foram também recuperados,
mas não identificados, e por definição foram apenas considerados como
compostos interferentes. Essa é a principal vantagem dos métodos
quimiométricos, os quais permitem a calibração do analito na presença de
interferentes desconhecidos, chamada de vantagem de segunda ordem,
alcançada neste trabalho a partir de dados de primeira ordem [11, 23, 24].
Figura 8.5. Perfis espectrais recuperados pelo método NMF com restrição de correlação
múltipla para ambos os produtos contaminados com melamina.
Na Figura 8.6, pode ser observado a curva dos valores previstos
“versus” as concentrações nominais, após utilizar o método NMF com restrição
de correlação múltipla. O coeficiente de correlação foi de 0,992 e os resultados
do novo método demonstram alta exatidão e precisão. Além disso, o efeito de
matriz foi perfeitamente corrigido, gerando-se apenas uma curva de calibração
para a quantificação de melamina em ambos os produtos.
105
Figura 8.6. Concentração prevista pelo NMF-ALS com correlação múltipla versus concentração
nominal para ambos os produtos.
8.3.2. Comparação com o método de calibração multivariada
Como mencionado anteriormente, os resultados do algoritmo proposto
foram comparados aos resultados do método de calibração multivariada PLSR
(Tabela 8.1). Como pode ser observado na tabela 8.1, os resultados de
RMSEP e r2 foram superiores para o NMF-ALS em relação aos modelos
desenvolvidos com o PLSR. Além disso, esse modelo demonstrou não ter
presença de erros sistemáticos em um nível de confiança de 95% (ttab = 2,069
e graus de liberdade de 24-1), de acordo com a ASTM E1655 [72], e, portanto,
é adequado para prever a melamina em amostras desconhecidas. Por outro
lado, o modelo PLSR com 4 variáveis latentes apresentou evidência de erro
sistemático, com tbias de 2,578, maior que o valor tabelado, 2,069 a um nível de
95% de confiança. O uso de 4 variáveis pode ser justificado na tentativa de
corrigir o efeito de matriz presente sobre a melamina nos diferentes leites,
embora esse modelo não seja adequado para previsões. Dessa forma, um
modelo PLSR com 3 variáveis latentes também foi avaliado. De acordo com os
106
resultados para esse novo modelo, sua capacidade de previsão foi menor,
porém, não foi constatada a evidência de erros sistemáticos.
Tabela 8.1. Comparação entre os modelos NMF-ALS com restrição de CL e o PLSR.
Modelo RMSEP (mg L-1) r2a tbiasc
NMF-ALS 0,258 0,992 0,151
PLS (4)b 0,354 0,985 2,578
PLS (3) 0,390 0,982 1,447
a coeficiente de correlação quadrático – r2. b números de variáveis latentes do modelo PLS. c Nível de confiança de 95%, ttab = 2,201 (graus de liberdade: 12-1 para os dados de validação).
A fim de ter uma comparação mais confiável entre os modelos, NMF
com restrição de correlação múltipla e PLSR, um teste de comparação de
exatidão foi realizado pelo método de Voet [108]. Esse teste avalia a hipótese
de que os RMSEPs sejam iguais (RMSEPPLS = RMSEPNMF). Caso esta
hipótese nula seja rejeitada, uma nova hipótese, alternativa, precisa ser
avaliada (RMSEPPLS ≠ RMSEPNMF), a um pré-determinado nível de confiança
(95%). Neste caso, o valor de pvalor encontrado foi bem menor do que 0,05 e,
portanto, isso sugere que o método NMF-ALS com restrição de correlação
múltipla tem maior exatidão do que o modelo PLSR com 3 e 4 variáveis
latentes.
8.3.3. Validação
De acordo com os resultados apresentados anteriormente, o método
NMF com restrição de correlação múltipla possui alta capacidade preditiva de
melamina em ambos os leites e, portanto, outros parâmetros podem ser
avaliados, tais como o limite de detecção (LOD) e de decisão (CCα), calculados
a partir dos modelos pseudo-univariados [109, 110] (Tabela 8.2).
107
Tabela 8.2. Figuras de mérito para os dados de validação utilizando a calibração pseudo-
univariada calculada a partir do modelo NMF-ALS com restrição de correção múltipla.
Parâmetros
MRLUHT
(mg L-1)
MRLFI
(mg L-1)
LOD
(mg L-1)
CCα
(mg L-1)
2,50 1,00 0,93 0,46
MRL: Limite máximo residual para os leites UHT e FI; LOD: Limite de detecção; CCα: Limite de
Decisão.
Na Tabela 8.2, pode ser observado que o LOD e o CCα calculados
foram de 0,93 mg L-1 e 0,46 mg L-1, respectivamente, e são menores do que o
MRL, determinados para ambos os leites, 2,50 mg L-1 para o UHT e 1,00 mg L-1
para a FI [93, 94]. De acordo com uma recomendação da European
Commission (EC) [111], o CCα pode ser utilizado para comparações diretas
como o MRL, uma vez que representa a menor concentração que o método
pode discriminar, com uma certeza estatística de 1-α, na presença do analito
contido certamente na amostra (falso positivo).
Finalmente, na Tabela 8.3, os valores nominais e resultados previstos
são demonstrados para as 4 amostras de validação em cada leite e os seus
respectivos valores de recuperação. Ficam evidentes, os bons resultados
alcançados, excetuando apenas a amostra 1 para o leite UHT, cujo valor
previsto diferiu do valor nominal. Este fato pode ser justificado devido a
diversas regiões de sobreposição entre os interferentes do leite UHT e a
melamina, dificultando a recuperação dos escores para esta concentração, o
qual está na faixa do limite de detecção do método (Figura 8.6).
108
Tabela 8.3. Figuras de mérito adicionais para o modelo NMF-ALS com restrição de correlação
múltipla.
Matriz Amostra Nominal
(mg L-1)
Prevista
(mg L-1)
Recuperação
(%)
FI
1 0,63 0,64 101
2 1,88 1,95 104
3 3,13 3,41 109
4 4,38 4,22 96
UHT
1 0,63 0,17 27
2 1,88 1,93 103
3 3,13 3,28 105
4 4,38 4,38 100
8.4. Conclusões
O método proposto, denominado fatoração não negativa de matriz com
restrição de correlação múltipla, foi introduzido com sucesso para quantificação
de melamina nas duas diferentes matrizes de leite: UHT e fórmula infantil.
Como vantagens práticas obtemos apenas uma curva de calibração no final, o
que facilita o desenvolvimento de modelos de calibração. Além disso, a
calibração na presença de interferentes desconhecidos foi feita com sucesso,
obtendo vantagem de segunda ordem, utilizando-se dados de primeira ordem
(espectros SERS).
O método proposto apresentou resultados superiores ao método de
calibração multivariada PLSR, baixo limite de detecção, e limite de decisão
abaixo do MRL estabelecido para os dois tipos de leites. Também foram
obtidos baixos erros de previsão e alta taxa de recuperação. A metodologia
proposta é simples, relativamente rápida, requer mínima manipulação de
amostras e utilizou um pequeno volume de amostra. Por último, o algoritmo
pode ser uma alternativa para outros casos complexos, nos quais existam
problemas com efeito de matriz.
109
Capítulo 9: Aplicação 4: Desenvolvimento de um método para
quantificação de enrofloxacin em águas em concentrações ultra-diluídas utilizando calibração
SERS digital
110
9. Aplicação 4: Desenvolvimento de um método para q uantificação de
enrofloxacin em águas em concentrações ultra-diluíd as utilizando
calibração SERS digital
9.1. Introdução
Em meados de 1997, em dois trabalhos independentes, Nie e Emory, e
Kneipp et al. [2, 19] relataram a presença de um acentuado fenômeno no
espectro SERS, que ocasionava alta flutuação nas intensidades do sinal. De
acordo com os autores, essas flutuações ocorriam quando as soluções eram
“ultra-diluídas”, na ordem de pico Molar (pM). Uma explicação para a
observação deste fenômeno foi que, quanto maior era concentração do analito
sobre uma superfície metálica, maior seria o número de moléculas sobre ela,
seguindo o modelo de monocamada adsorvida de Langmuir. Para este caso,
maior será a probabilidade de ocorrer o evento de intensificação do sinal
Raman e, consequentemente, os espectros SERS terão uma variação que
seguirá uma distribuição normal, conhecida como “SERS average”. Em
contrapartida, quando a concentração é extremamente baixa o número de
moléculas recobrindo a superfície é menor (inferior à formação de uma
monocamada), seguindo uma distribuição não Gaussiana, com distribuição tipo
“cauda longa” [25], seguindo o chamado limite/regime single-molecule (SM) ou
SM-SERS.
O regime SM-SERS é alcançado em soluções extremamente diluídas
(ultra-low), abaixo de µM, nas quais observa-se um aumento no fator de
intensificação SERS superior a 108 [112]. Neste caso, “hotspots” são gerados
pelo aglomeramento de nanopartículas formando dímeros ou trímeros [21].
Esses aglomerados ou agregados podem ser formados a partir de AuNPs, que
podem estar suportadas sobre um substrato de vidro previamente
funcionalizado [8], criando-se uma superfície rugosa ou aleatória, na qual
podem estar presentes os “hotspots”. Um fato interessante sobre o “hotspost” é
que se estima que eles representem menos de 1% de uma área de um
substrato recoberto por nanopartículas [23]. Embora eles ocupem uma
pequena área, a contribuição deles para o espectro SERS é de suma
111
importância, sendo valores superiores a 70 % de toda intensidade causada
pelas moléculas presentes nestes “hotspots” [22].
A importância dos estudos voltados para SM-SERS é inúmera, como em
estudos de detecção [113], dinâmica [114, 115], fotodegradação [116, 117],
eletroquímica [118], dentre outros. Embora a detecção no regime SM-SERS
seja possível, a quantificação em concentrações ultra-low ainda é um desafio,
principalmente devido à difícil compreensão da estatística das flutuações dos
sinais. O principal problema é que não é possível estabelecer uma relação
direta entre concentração ou número de moléculas na superfície com as
intensidades SERS. Além do problema de variações de intensidades, outros
problemas comuns são a formação de produtos secundários originários da
fotodegradação das moléculas [117] e deslocamentos de picos [117, 119]. O
primeiro pode facilmente ser resolvido através do mapeamento da superfície
[120] e o segundo pode ser minimizado utilizando a análise de componentes
principais (PCA) ou o PCA modificado [24]. No entanto, os escores e os pesos
da PCA são misturas das componentes principais, ou seja, um fator pode
conter informação (bandas no espectro) de outros fatores.
Dessa forma, neste trabalho pretendeu-se estudar o SM-SERS como
uma ferramenta analítica, devido aos baixos limites de detecção que podem ser
alcançados. Para isso, foi estudado o antibiótico enrofloxacin (ENRO), que é
um contaminante emergente comumente presente em águas. Também nesse
trabalho foi desenvolvido um procedimento denominado SERS digital (D-
SERS), para permitir a calibração do analito, em regime de single-molecule.
Por fim, a observação do efeito SM-SERS foi constatado pelo já estabelecido
método da série isotopóloga, na qual outro antibiótico, o ciprofloxacin (CIPRO)
e seu isótopo deuterado foram utilizados.
9.2. Calibração SERS digital (DC-SERS)
A metodologia foi baseada em mapear uma área demarcada da
superfície nanoestruturada, pré-contaminada com o ENRO, na qual, de certa
forma, as moléculas nos hotspots serão encontradas. As imagens
hiperespectrais obtidas foram desdobradas numa matriz e os sinais foram
processados pelo método de resolução de curvas NMF-ALS [54-56]. Após a
112
decomposição, os pesos do modelo fornecem informações sobre os perfis
espectrais, que podem ser utilizados na identificação da impressão digital da
molécula, e os escores podem ser relacionados diretamente com a
concentração ou com o número de moléculas em cada mapeamento.
No entanto, no fator relacionado a informação sobre o analito, estão
agregadas outras informações não relevantes que não são separadas pelo
modelo de resolução multivariada de curvas, como: ruído (null events),
moléculas em outras regiões que não são os hotspots, moléculas em hotspots
não eficientes. Sendo assim, uma etapa de D-SERS dos dados foi realizada
(Figura 9.1), no intuito de realizar a contagem apenas dos espectros de
moléculas sobre os “hotsposts” efetivos, uma vez que a contribuição deles para
os espectros SERS é consideravelmente importante [22]. Um limite foi
estabelecido, através da estimativa do ruído, e os valores acima deste limiar
foram classificados ou computados como 1 e os abaixo deste valor como 0.
Figura 9.1. Esquema do procedimento de decomposição dos dados por NMF-ALS para as
imagens hiperespectrais e a etapa de digitalização dos escores para o desenvolvimento da
curva de calibração digital.
Os números de pixels acima de 1 são contados e esses valores são
correlacionados a uma respectiva concentração ou número de moléculas por
área, resultando na nova curva de calibração, DC-SERS. Se a técnica for
sensível a esta variação de concentração, os números de pixels nulos irão
113
aumentar ou diminuir, de acordo com a concentração/número de moléculas na
superfície.
9.3. Procedimento experimental
9.3.1. Síntese do coloide e preparação do substrato
Ver capítulo 5, item 5.1 e 5.2.
9.3.2. Espectrômetro Raman confocal
Os espectros SERS foram obtidos num equipamento Raman com
microscópio confocal da Renishaw inVia System 3000, equipado com uma
lente objetiva de 50x de aumento e com abertura numérica de NA = 0,5. Sendo
assim, a área iluminada na amostra é na ordem de 1 µm2. O laser utilizado foi
de 633 nm, com a potência de apenas 10% do total, com 10 s de tempo de
exposição e uma 1 acumulação. Ver capítulo 3, item 3.3.
9.3.3. Procedimento experimental
Na Figura 9.2 está resumido o procedimento experimental realizado
neste trabalho. Após a síntese das nanopartículas, elas foram suportadas em
vidro como substrato de acordo com método descrito em [58]. Uma solução
estoque contendo o enrofloxacin na concentração de 100 mg L-1 foi preparada
e, a partir dela, várias soluções diluídas foram preparadas até alcançar o valor
mínimo de 1 ng L-1. Inicialmente, uma gota da solução foi disposta na superfície
do substrato e seca rapidamente sobre baixo fluxo de nitrogênio por cerca de 3
min. A área mapeada foi de 50 x 50 µm, com espaçamento de 5 µm, a partir do
centro da gota. Isso resulta em 121 espectros para cada área mapeada, a partir
do ponto de origem. Embora a nanopartícula apresente uma banda máxima no
espectro de extinção por volta de 532 nm (Figura 5.1C), um melhor resultado
foi alcançado quando a linha do laser no comprimento de onda de 633 nm foi
utilizada. Este fato também foi reportado por outros trabalhos encontrados na
literatura [121, 122], nos quais foi observado um deslocamento do plasmon
114
para a região do vermelho após o suporte de nanopartículas em APTMS. Isso
se deve à formação dos “hotspots” causados pela proximidade das
nanopartículas, aglomerados observados nas imagens de AFM (Figura 5.2C e
D), que podem estar contribuindo para a observação deste efeito. Resultados
preliminares indicaram que a faixa espectral adequada para trabalho foi de
1667-1087 cm-1, com resolução espectral de aproximadamente 1 cm-1,
resultando em 389 pontos no espectro.
Figura 9.2. Esquema resumido do procedimento experimental realizado para a aquisição dos
dados de imagem hiperespectral.
9.4. Resultados e discussão
9.4.1. Caracterização das AuNPs e do substrato
O tamanho e a forma das nanopartículas foram verificados de acordo com o
seu respectivo espectro de extinção e imagens de TEM. Como foi discutido
anteriormente, para as nanopartículas sintetizadas o plasmon está localizado
por volta de 532 cm-1, o que sugere o tamanho médio das nanopartículas em
115
62 nm, em acordo com trabalhos anteriores [4, 7]. Este fato foi confirmado pela
imagem de TEM. Pode-se ainda verificar que as nanopartículas possuem um
formato esférico e alta homogeneidade entre os tamanhos. Além disso, é
possível observar a presença de alguns aglomerados: dímeros e trímeros, os
quais podem ser responsáveis pela formação dos “hotsposts”. Posteriormente,
as AuNPs foram imobilizadas nos “slides” de vidro previamente funcionalizados
com APTMS.
9.4.2. Avaliação preliminar dos dados
Uma análise exploratória utilizando PCA foi inicialmente realizada nos
dados para avaliar os resultados para o ENRO, quanto ao número de fatores,
homogeneidade do coloide e dependência da distribuição com a concentração
(Figura 9.3). Como pode ser observado na Figura 9.3A, 4 componentes
principais foram necessárias para descrever a variância dos dados. O total de
variância acumulada nesses fatores foi de aproximadamente 97%. Ao
compararmos os pesos da PC1 com o respectivo espectro puro do antibiótico
enrofloxacin, nota-se alta similaridade e algumas bandas foram atribuídas
(identificadas) aos estiramentos O–C–O, em 1371 cm-1, e C–C–H, como
respiração do anel em 1371 cm-1 [123]. As demais PCs foram relacionadas aos
deslocamentos destas bandas para a região do azul ou vermelho. Os
deslocamentos de bandas são comuns em SERS, principalmente quando
amostras de baixas concentrações são analisadas [120, 124]. A orientação
pela qual a molécula é adsorvida nos “hotspots” pode resultar em um ambiente
químico diferente [119] e, consequentemente, este efeito será observado no
espectro SERS, como é o caso da Figura 9.3A.
116
Figura 9.3. Resultados PCA para os dados de enrofloxacin. (A) loadings com os 4 fatores mais
importantes; (B) Histograma de frequência para as diferentes concentrações de enrofloxacin. A
linha vermelha representa o valor médio das intensidades calculados pelos escores.
Na Figura 9.3B estão representados os histogramas calculados a partir
dos escores para a PC1. Pode ser observado nesta figura que para a
concentração de 200 ppm de ENRO, o seu histograma apresenta um forte
indicativo de seguir uma distribuição normal com valor médio dos escores no
centro da distribuição (linha vermelha). Esse resultado indica a alta
homogeneidade do substrato utilizado, portanto, o mesmo pode ser utilizado
para a observação do SM-SERS. Por outro lado, ao diluir 40 vezes a solução
de ENRO (5 ppm), é notado que a distribuição não apresenta mais forma de
117
uma gaussiana. Após 200 vezes de diluição (1 ppm), é perceptível que o
número de eventos nulos ou próximos do ruído são cerca de metade do
número total de valores (50 em 121 valores). Neste caso, o número de
moléculas para formar uma monocamada não é suficiente e a presença de
espectros nulos é dominante. Este fato é um forte indicativo da proximidade do
regime SM-SERS [120, 124-126].
9.4.3. Calibração SERS average versus SM-SERS
Como comentando no procedimento experimental, 1 µL da solução de
ENRO foi adicionada sobre a superfície do substrato e, logo após, seca
utilizando gás N2. Este procedimento, além de contribuir para a rápida secagem
da gota, 3 min contra 30 min em condições normais ambientes, é importante
para minimizar o efeito de dinâmica na superfície [26]. Com isso, uma
transformação de concentração mol L-1 para quantidade de moléculas por área
(em µm2) foi realizada. A concentração inicial de ENRO foi de 200 ppm e
diluída até 1 ppt, totalizando 18 valores de concentração. Após a transformação
em moléculas por área, os novos valores equivalem à faixa de 1,4 x 109/µm2
(200 ppm) a 7/µm2 (1 ppt). Em termos experimentais, se considerarmos que o
spot do laser tem 1 µm2, seria o mesmo que a iluminar uma região substrato e
encontrar 1,4 x 109 moléculas ou apenas 7 moléculas.
Para a construção dos modelos de calibração o método NMF-ALS foi
aplicado na decomposição dos dados. O modelo NMF-ALS foi aplicado para
todos os dados na forma de matriz aumentada e os valores ótimos encontrados
foram dois fatores, LOF de 16% e R2 de 97%. Os resultados dos escores
médios por imagem versus o número de moléculas por µm2, para duas
diferentes amostras com alta (200 ppm) e baixa concentração (0,05 ppm),
estão representados na Figura 9.4, assim como os histogramas para
distribuição de valores dos escores.
Analisando-se os escores do NMF-ALS, pode-se identificar que o
primeiro fator foi responsável por descrever as altas concentrações de ENRO,
equivalente ao SERS average (Figura 9.4A), e o segundo fator pelas
concentrações ultra-diluídas (Figura 9.4B), ou no regime SM-SERS.
118
Figura 9.4. Curva de calibração para os valores em (A) SERS average e (B) SM-SERS;
Histograma mostrando a concentração de 200 ppm (SERS average versus o (D) SM-SERS.
Conforme observado na Figura 9.4A, existe uma elevada precisão nos
resultados, sendo que praticamente todos os pontos se situam próximos ao
ajuste da reta linear. Como consequência, esta reta apresentou um elevado
valor de coeficiente de correlação de 0,950. Para este caso, o valor médio das
intensidades é representativo da concentração do antibiótico presente na
amostra (Figura 9.4C). De maneira oposta, em baixíssimas concentrações, SM-
SERS, a precisão dos dados não é a mesma, muito provavelmente devido aos
efeitos de flutuações de intensidades. Como consequência disso, a equação da
reta apresentou baixo coeficiente de correlação, 0,716. Além disso, é
perceptível a falta de linearidade ao longo dos valores presentes nesta reta.
Neste segundo caso, o valor médio das intensidades não é representativo da
concentração (Figura 9.4D) e, portanto, justifica-se o uso da digitalização dos
dados, como será apresentado a seguir.
119
9.4.4. Digital SERS
De acordo com a Figura 9.1, o procedimento de digitalização foi
realizado de forma separada utilizando os escores dos resultados da resolução
de curvas aplicada às imagens hiperespectrais. Um limite de corte para definir
os valores 0 e 1 foi estabelecido em 3 desvios padrão em relação ao ruído.
Assim, valores acima deste limiar foram considerados como 1 e abaixo como 0,
transformando os dados originais em imagens digitais, conforme mostrado na
Figura 9.5.
Figura 9.5. Resultados obtidos após o procedimento de calibração SERS digital: (A) Mapas de
concentrações digitalizados (B) Curva de calibração SERS digital; (C) Comparação dos
espectros médios calculados para o valor digital “0” e valor digital “1”.
Pode ser observado na Figura 9.5, que para a concentração de 1 ppt, ou
seja 7 moléculas por µm2, apenas para dois pixels foi atribuído o valor digital
“1”. Por outro lado, para a concentração 25 ppb o número de valores “1” foi de
100 pixels. Assim, existe uma dependência da concentração (número de
moléculas) com o número da contagem digital, confirmada após análise do
gráfico de número de contagens “versus” número de moléculas, chamada de
curva de calibração SERS digital (Figura 9.5B). É possível notar uma
acentuada melhora na precisão dos dados, visto este efeito sobre o coeficiente
120
de correlação da curva, que passa de 0,716 para 0,992. Na Figura 9.5C, nota-
se claramente a diferença entre os espectros médios para os casos de valores
digitais “0” e “1”.
Com esse procedimento foi possível detectar concentrações muito
baixas, podendo-se estabelecer um valor mínimo para quantificação de 2,78
pmol L-1 ou 1 ppt. Em outros trabalhos da literatura foi registrado o valor
mínimo de 1 ppb para a técnica LC-MS [127] e 20 ppb para o SERS [123].
9.4.5. Experimento da série isotopóloga
Como foi discutido no capítulo 2, item 2.2.3, uma forma de confirmar a
observação do regime SM-SERS é realizando o experimento do bianalito [24]
ou da série isotopóloga [26]. Neste trabalho, foi utilizado outro antibiótico, o
CIPRO, e o seu isótopo deuterado (CIPRO-ISO) para a observação deste
fenômeno. Os resultados estão mostrados na Figura 9.6A.
Figura 9.6. Prova do conceito do SM-SERS. (A) Representação dos espectros recuperados
pelo NMF-ALS para o ciprofloxacin (CIPRO) e seu isótopo (CIPRO-ISO); (B) Mapa digital dos
resultados para CIPRO (azul) e CIPRO-ISO (vermelho). Os círculos em verde representam
quando as duas moléculas estavam presentes nos “hotspots”.
121
Como pode ser observado na Figura 9.6A, que apresenta os espectros
recuperados para as duas espécies, algumas bandas do CIPRO e seu isótopo
foram identificadas. Cabe ressaltar, que a região de 1450 a 1650 cm-1 foi a
única onde é perceptível uma diferença nos espectros. Esse resultado
demonstra a capacidade da técnica SERS para diferenciar até classes de
isótopos. A constatação da observação do efeito SM-SERS está mostrada na
Figura 9.6B, que apresenta os mapas de distribuição digital para as duas
espécies. Quando nenhuma molécula está no “hotspost”, tem-se um valor nulo
para o pixel (em branco nos mapas digitais). Por outro lado, podem ser
encontradas moléculas de CIPRO (pixel azul) ou CIPRO-ISO (pixel vermelha)
em pixels diferentes no mapa digital. Por fim, estas moléculas podem ser
encontradas nos mesmos pixels simultaneamente no “hotspost”, representado
pelo círculo em verde na Figura 9.6B.
9.5. Conclusões
O método de calibração SERS digital foi proposto e apresentado com
sucesso para quantificação do antibiótico enrofloxacin em solução ultra-diluída.
A estratégia possibilitou obter um valor mínimo para quantificação de
aproximadamente 3 pmol L-1 ou 1 ppt, valor ainda não reportada por técnicas
espectroscópicas. Também demonstrou aumentar a precisão dos resultados. A
metodologia proposta é relativamente simples de ser implementada, podendo
ser utilizados outros métodos de resolução de curvas, como ICA, MCR-ALS,
dentre outros. A chamada prova do conceito SM-SERS foi constatada, através
do experimento da série isotopóloga utilizando o antibiótico ciprofloxacin e seu
isótopo deuterado. O estudo pode auxiliar em pesquisas relacionadas ao SM-
SERS e este trabalho representa o primeiro em química analítica utilizando o
SM-SERS.
122
Considerações
Finais
123
Considerações finais
A espectroscopia Raman intensificada pela superfície (SERS) demonstrou
ser uma técnica muito útil nas diferentes aplicações em química analítica,
apresentando alta sensibilidade, baixos limites de detecção e de quantificação
e, aliada aos métodos quimiométricos, apresentou também alta seletividade,
mesmo na presença de interferentes desconhecidos.
O uso da floresta randômica (RF) como um método de calibração
multivariada demonstrou ser atrativo por apresentar a possibilidade do cálculo
de intervalos de confiança e a avaliar importância das variáveis, sendo muito
robusto e fácil de ser entendido. Com a identificação das variáveis importantes,
pode ser possível uma interpretação química baseada na impressão digital da
molécula. Além disso, o estudo da RF foi importante para o nosso grupo de
pesquisa, no qual uma tese focada somente neste método já está em
andamento.
O uso do NMF-ALS apresentou resultados superiores ao método mais
utilizado, que é o MCR-ALS, para recuperação dos espectros do pesticida
malation nas cascas dos alimentos estudados. Dessa forma, este algoritmo
pode ser mais explorado para outros problemas em Química Analítica.
Dois novos algoritmos foram apresentados neste trabalho. O primeiro
baseado numa modificação do algoritmo NMF-ALS para quantificação na
presença de efeito de matriz e obtendo a vantagem de segunda ordem com
dados de primeira ordem. No segundo, uma estratégia foi desenvolvida para a
quantificação em soluções extremamente diluídas, que possibilita o emprego a
novos estudos relacionados à quantificação SERS no regime de uma única
molécula e do aumento da aplicação do SERS em Química Analítica.
124
Perspectivas
Futuras
125
Perspectivas futuras
Espera-se que esta Tese, juntamente com os resumos e artigos que
foram e serão publicados, possam auxiliar no estudo da aplicação de SERS em
Química Analítica. O auxílio de métodos quimiométricos será fundamental para
ajudar a atingir estes objetivos, espera-se que mais trabalhos em conjunto
sejam aplicados nesta linha.
O uso da floresta randômica deve ser mais explorado, para outros casos
mais complexos, como sistemas com desvios de linearidade, e que possa ser
uma ferramenta para auxiliar as pesquisas na área de Química Analítica,
podendo ser mais uma alternativa aos métodos tradicionais como PLS e
máquinas de vetores de suporte, dentre outros. Além disso, é pretendido aa
publicação de um artigo de divulgação ou educação na revista Química Nova,
em português, para auxiliar na disseminação do conhecimento deste algoritmo
ainda pouco utilizado para Química Analítica no país.
Também pretende-se aplicar o algoritmo NMF-ALS e sua variação, o
NMF-ALS com restrição múltipla de correlação, em outros problemas nos quais
ocorra efeito de matriz ou calibração multiproduto. Finalmente, estudos mais
conclusivos sobre a aplicabilidade do algoritmo SERS digital devem ser
realizados, para que se adquira um maior conhecimento do potencial do SM-
SERS e sua aplicação em sistemas com soluções ultra-diluídas possa ser
expandida e explorada em situações reais.
126
Referências bibliográficas
127
Referências bibliográficas
[1] M. Fleischmann, P.J. Hendra, A.J. McQuillan, Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode, Chemical Physics Letters, 26 (1974) 163-166. [2] S. Nie, S.R. Emory, Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering, Science, 275 (1997) 1102-1106. [3] T. Firkala, A. Farkas, B. Vajna, I. Farkas, G. Marosi, Investigation of drug distribution in tablets using surface enhanced Raman chemical imaging, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 76 (2013) 145-151. [4] C.D.L. Albuquerque, R.J. Poppi, Detection of malathion in food peels by surface-enhanced Raman imaging spectroscopy and multivariate curve resolution, Analytica Chimica Acta, 879 (2015) 24-33. [5] A. Matschulat, D. Drescher, J. Kneipp, Surface-Enhanced Raman Scattering Hybrid Nanoprobe Multiplexing and Imaging in Biological Systems, ACS Nano, 4 (2010) 3259-3269. [6] M.B. Mamián-López, R.J. Poppi, Quantification of moxifloxacin in urine using surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) and multivariate curve resolution on a nanostructured gold surface, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 405 (2013) 7671-7677. [7] C.D.L. Albuquerque, R.B. Nogueira, R.J. Poppi, Determination of 17β-estradiol and noradrenaline in dog serum using surface-enhanced Raman spectroscopy and random Forest, Microchemical Journal, 128 (2016) 95-101. [8] M. Fan, G.F.S. Andrade, A.G. Brolo, A review on the fabrication of substrates for surface enhanced Raman spectroscopy and their applications in analytical chemistry, Analytica Chimica Acta, 693 (2011) 7-25. [9] Le Ru E, Etchegoin PG (2009) Principles of surface enhanced Raman spectroscopy. Elsevier, Amsterdam. [10] M.J. Banholzer, J.E. Millstone, L. Qin, C.A. Mirkin, Rationally designed nanostructures for surface-enhanced Raman spectroscopy, Chemical Society Reviews, 37 (2008) 885-897. [11] M.B. Mamián-López, R.J. Poppi, Standard addition method applied to the urinary quantification of nicotine in the presence of cotinine and anabasine using surface enhanced Raman spectroscopy and multivariate curve resolution, Analytica Chimica Acta, 760 (2013) 53-59. [12] D.L. Jeanmaire, R.P. Van Duyne, Surface raman spectroelectrochemistry, Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry, 84 (1977) 1-20. [13] M.G. Albrecht, J.A. Creighton, Anomalously intense Raman spectra of pyridine at a silver electrode, Journal of the American Chemical Society, 99 (1977) 5215-5217. [14] S. Sasic, Y. Ozaki, Introduction to Raman Spectroscopy. In S. Sasic (Ed.) Pharmaceutical applications of Raman spectroscopy, New Jersey: New Jersey: Wiley-Interscience (2007) 1-28. [15] O. Sala, Fundamentos da Espectroscopia Raman e no Infravermelho, Editora Unesp, 2 ed., 1996, São Paulo. [16] D.A. Skoog, F.J. Holler, S.R. Crouch, Principles of instrumental Analysis, Thomson, 6th edition, 2007, Canada. [17] K.A. Willets, R.P. Van Duyne, Localized Surface Plasmon Resonance Spectroscopy and Sensing, Annual Review of Physical Chemistry, 58 (2007) 267-297.
128
[18] P.L. Stiles, J.A. Dieringer, N.C. Shah, R.P. Van Duyne, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, Annual Review of Analytical Chemistry, 1 (2008) 601-626. [19] K. Kneipp, Y. Wang, H. Kneipp, L.T. Perelman, I. Itzkan, R.R. Dasari, M.S. Feld, Single Molecule Detection Using Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS), Physical Review Letters, 78 (1997) 1667-1670. [20] K.L. Kelly, E. Coronado, L.L. Zhao, G.C. Schatz, The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment, The Journal of Physical Chemistry B, 107 (2003) 668-677. [21] DP dos Santos, MLA Temperini, AG Brolo, Surface-Enhanced Raman Scattering: Principles and Applications for Single-Molecule Detection. In S Szunerits, R Boukherroub (Ed.) Introduction to Plasmonics: Advances and Applications, 1ed.: CRC Press, 2015, v. 1, p. 275-318, Florida. [22] Y. Fang, N.-H. Seong, D.D. Dlott, Measurement of the Distribution of Site Enhancements in Surface-Enhanced Raman Scattering, Science, 321 (2008) 388-392. [23] J.P. Camden, J.A. Dieringer, Y. Wang, D.J. Masiello, L.D. Marks, G.C. Schatz, R.P. Van Duyne, Probing the Structure of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Hot Spots, Journal of the American Chemical Society, 130 (2008) 12616-12617. [24] P.G. Etchegoin, M. Meyer, E. Blackie, E.C. Le Ru, Statistics of Single-Molecule Surface Enhanced Raman Scattering Signals: Fluctuation Analysis with Multiple Analyte Techniques, Analytical Chemistry, 79 (2007) 8411-8415. [25] P.G. Etchegoin, M. Meyer, E.C. Le Ru, Statistics of single molecule SERS signals: is there a Poisson distribution of intensities?, Physical Chemistry Chemical Physics, 9 (2007) 3006-3010. [26] J.A. Dieringer, R.B. Lettan, K.A. Scheidt, R.P. Van Duyne, A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, Journal of the American Chemical Society, 129 (2007) 16249-16256. [27] A.B. Zrimsek, N.L. Wong, R.P. Van Duyne, Single Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A Critical Analysis of the Bianalyte versus Isotopologue Proof, The Journal of Physical Chemistry C, 120 (2016) 5133-5142. [28] M.E. Andersen, R.Z. Muggli, Microscopical techniques in the use of the molecular optics laser examiner Raman microprobe, Analytical Chemistry, 53 (1981) 1772-1777. [29] B.d. Barros Neto, I.S. Scarminio, R.E. Bruns, 25 anos de quimiometria no Brasil, Química Nova, 29 (2006) 1401-1406. [30] G.M. Escandar, A.C. Olivieri, N.M. Faber, H.C. Goicoechea, A. Muñoz de la Peña, R.J. Poppi, Second- and third-order multivariate calibration: data, algorithms and applications, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 26 (2007) 752-765. [31] K.R. Beebe, R.J. Pell, M.B. Seasholtz, Chemometrics: A Pratical Guide, Willey, 1998, Canada. [32] S. Piqueras, L. Duponchel, R. Tauler, A. de Juan, Resolution and segmentation of hyperspectral biomedical images by Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares, Analytica Chimica Acta, 705 (2011) 182-192.
129
[33] P.H.C. Eilers, Parametric Time Warping, Analytical Chemistry, 76 (2004) 404-411. [34] A. Höskuldsson, PLS regression methods, Journal of Chemometrics, 2 (1988) 211-228. [35] S. de Jong, SIMPLS: An alternative approach to partial least squares regression, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 18 (1993) 251-263. [36] C.M. Bishop, Neural Networks for Pattern Recognition, Oxford University Press, Inc.1995. [37] C. Aldrich, L. Auret, Unsupervised Process Monitoring and Fault Diagnosis with Machine Learning Methods. In C. Aldrich, L. Auret (Chapter 5) Tree-Based Methods, New Jersey: New Jersey: Wiley-Interscience (2013) 183-220. [38] Breiman L, Friedman JH, Olshen RA, Stone C J (1984) Classification and Regression Trees; Chapman and Hall:Boca Ration. [39] A. Criminisi, J. Shotton, E. Konukoglu, Decision Forests: A Unified Framework for Classification, Regression, Density Estimation, Manifold Learning and Semi-Supervised Learning, Foundations and Trends in Computer Graphics and Vision, 7 (2012) 81-227. [40] L. Breiman, Random Forests, Machine Learning, 45 (2001) 5-32. [41] L. Breiman, Bagging Predictors, Machine Learning, 24 (1996) 123-140. [42] BREIMAN, L. Out-of-bag estimation. Citeseer, p. 1-13, 1996. Disponível em: < http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=1 0.1.1.45.3712&rep=rep1&type=pdf >. [43] BREIMAN, L. Some infinity theory for predictor ensembles. Citeseer, p. 1-30, 2000. Disponível em: < https://www.stat.berkeley.edu/~breiman/some_theory2000.pdf> . [44] H. Babamoradi, F. van den Berg, Å. Rinnan, Bootstrap based confidence limits in principal component analysis — A case study, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 120 (2013) 97-105. [45] R. Tauler, InCINC '94 Selected papers from the First International Chemometrics Internet ConferenceMultivariate curve resolution applied to second order data, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 30 (1995) 133-146. [46] J. Jaumot, A. de Juan, R. Tauler, MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 140 (2015) 1-12. [47] W. Windig, D.A. Stephenson, Self-modeling mixture analysis of second-derivative near-infrared spectral data using the SIMPLISMA approach, Analytical Chemistry, 64 (1992) 2735-2742. [48] M. Maeder, Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks, Analytical Chemistry, 59 (1987) 527-530. [49] A. de Juan, B. van den Bogaert, F. Cuesta Sánchez, D.L. Massart, Application of the needle algorithm for exploratory analysis and resolution of HPLC-DAD data, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 33 (1996) 133-145. [50] A. de Juan, Y. Vander Heyden, R. Tauler, D.L. Massart, Assessment of new constraints applied to the alternating least squares method, Analytica Chimica Acta, 346 (1997) 307-318.
130
[51] C.L. Lawson, R.J. Hanson, Linear Least Squares with Linear Inequality Constraints, Solving Least Squares Problems, pp. 158-173, 1995, Texas. [52] R. Bro, S. De Jong, A fast non-negativity-constrained least squares algorithm, Journal of Chemometrics, 11 (1997) 393-401. [53] M.H. Van Benthem, M.R. Keenan, Fast algorithm for the solution of large-scale non-negativity-constrained least squares problems, Journal of Chemometrics, 18 (2004) 441-450. [54] R. Albright, J. Cox, D. Duling, A.N. Langville, C.D. Meyer, Algorithms, initializations and convergence for the nonnegative matrix factorization, Proceedings of the 12th ACM SIGKDD International Conference on Knowledge Discovery and Data Mining (2006) 1–18. [55] M.W. Berry, M. Browne, A.N. Langville, V.P. Pauca, R.J. Plemmons, Algorithms and applications for approximate nonnegative matrix factorization, Computational Statistics & Data Analysis, 52 (2007) 155-173. [56] D.D. Lee, H.S. Seung, Learning the parts of objects by non-negative matrix factorization, Nature, 401 (1999) 788-791. [57] P.C. Lee, D. Meisel, Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols, The Journal of Physical Chemistry, 86 (1982) 3391-3395. [58] A.M. Brito-Silva, R.G. Sobral-Filho, R. Barbosa-Silva, C.B. de Araújo, A. Galembeck, A.G. Brolo, Improved Synthesis of Gold and Silver Nanoshells, Langmuir, 29 (2013) 4366-4372. [59] D. Xing, S. Nozell, Y.F. Chen, F. Hage, S. Oparil, Estrogen and Mechanisms of Vascular Protection, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 29 (2009) 289-295. [60] A.P. Miller, D. Xing, W. Feng, M. Fintel, Y.-F. Chen, S. Oparil, Aged rats lose vasoprotective and anti-inflammatory actions of estrogen in injured arteries, Menopause, 14 (2007) 251-260. [61] S.M.R.R. Lima, A. Belló-Klein, K. Flues, J. Paulini, O. Monte, M.C. Irigoyen, K. De Angelis, Efeitos da suplementação do 17b-estradiol no dano oxidativo cardíaco de ratas submetidas à privação dos hormônios ovarianos, Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, 29 (2007) 27-33. [62] R.M. Lequin, Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Clinical Chemistry, 51 (2005) 2415-2418. [63] H. Lee, C.J. Park, G. Lee, Measurement of progesterone in human serum by isotope dilution liquid chromatography–tandem mass spectrometry and comparison with the commercial chemiluminescence immunoassay, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 396 (2010) 1713-1719. [64] Y. Wang, G.D. Gay, J.C. Botelho, S.P. Caudill, H.W. Vesper, Total testosterone quantitative measurement in serum by LC-MS/MS, Clinica Chimica Acta, 436 (2014) 263-267. [65] C. Pritchard, K.J. Groves, S. Biesenbruch, G. O’Connor, A.E. Ashcroft, C. Arsene, D. Schulze, M. Quaglia, Quantification of Human Growth Hormone in Serum with a Labeled Protein as an Internal Standard: Essential Considerations, Analytical Chemistry, 86 (2014) 6525-6532. [66] I. Lehmphul, G. Brabant, H. Wallaschofski, M. Ruchala, C.J. Strasburger, J. Köhrle, Z. Wu, Detection of 3,5-Diiodothyronine in Sera of Patients with Altered Thyroid Status Using a New Monoclonal Antibody-Based Chemiluminescence Immunoassay, Thyroid, 24 (2014) 1350-1360. [67] A. Hohenstein, M. Hebell, H. Zikry, M. El Ghazaly, F. Mueller, J. Rohde, Development and validation of a novel cell-based assay for potency
131
determination of human parathyroid hormone (PTH), Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 98 (2014) 345-350. [68] P. Li, B. Hu, M. He, B. Chen, Ion pair hollow fiber liquid–liquid–liquid microextraction combined with capillary electrophoresis-ultraviolet detection for the determination of thyroid hormones in human serum, Journal of Chromatography A, 1356 (2014) 23-31. [69] Estradiol EIA Kit ItemNo. 582251, Cayman Chemical Company, 2013, 1-32. https://www.caymanchem.com . [70] Noradrenaline EIA Kit Item cE90907Ge, Uscn Life Science, 2013, 1-8. http://www.uscnk.com . [71] Liaw A, Wiener M (2002) Classification and Regression by random Forest. R News 2:18-22. [72] Annual Book of ASTM Standards (2012) Standard Practices for Infrared Multivariate Quantitative Analysis, E1655-05, vol. 03.06, ASTM International, West Conshohocken. [73] F. Lindgren, B. Hansen, W. Karcher, M. Sjöström, L. Eriksson, Model validation by permutation tests: Applications to variable selection, Journal of Chemometrics, 10 (1996) 521-532. [74] P.R. Filgueiras, J.C.L. Alves, C.M.S. Sad, E.V.R. Castro, J.C.M. Dias, R.J. Poppi, Evaluation of trends in residuals of multivariate calibration models by permutation test, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 133 (2014) 33-41. [75] N.E. Variankaval, K.I. Jacob, S.M. Dinh, Characterization of crystal forms of β-estradiol – thermal analysis, Raman microscopy, X-ray analysis and solid-state NMR, Journal of Crystal Growth, 217 (2000) 320-331. [76] K. Kneipp, Y. Wang, R.R. Dasari, M.S. Feld, Near-infrared surface-enhanced Raman scattering (NIR-SERS) of neurotransmitters in colloidal silver solutions, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 51 (1995) 481-487. [77] National Pesticide Information Center (NPIC) (2010) Malathion (Technical Fast Sheet). Oregon State University, Corvallis, OR. http://npic.orst.edu/factsheets/malagen.html . Accessed on 5 February 2014. [78] Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR) (2003) Public Health Statement Malathion (CAS#: 121-75-5). Toxicological Profile for Malathion. http://www.atsdr.cdc.gov/ToxProfiles/tp.asp?id=522& tid=92 . Accessed on 5 February 2014. [79] L.F.C. Melo, C.H. Collins, I.C.S.F. Jardim, New materials for solid-phase extraction and multiclass high-performance liquid chromatographic analysis of pesticides in grapes, Journal of Chromatography A, 1032 (2004) 51-58. [80] G.C. Bedendo, I.C.S.F. Jardim, E. Carasek, Multiresidue determination of pesticides in industrial and fresh orange juice by hollow fiber microporous membrane liquid–liquid extraction and detection by liquid chromatography–electrospray-tandem mass spectrometry, Talanta, 88 (2012) 573-580. [81] V. Boeris, J.A. Arancibia, A.C. Olivieri, Determination of five pesticides in juice, fruit and vegetable samples by means of liquid chromatography combined with multivariate curve resolution, Analytica Chimica Acta, 814 (2014) 23-30. [82] B. Sharma, R.R. Frontiera, A.-I. Henry, E. Ringe, R.P. Van Duyne, SERS: Materials, applications, and the future, Materials Today, 15 (2012) 16-25. [83] S.P. Ravindranath, U.S. Kadam, D.K. Thompson, J. Irudayaraj, Intracellularly grown gold nanoislands as SERS substrates for monitoring
132
chromate, sulfate and nitrate localization sites in remediating bacteria biofilms by Raman chemical imaging, Analytica Chimica Acta, 745 (2012) 1-9. [84] H. Yuan, Y. Liu, A.M. Fales, Y.L. Li, J. Liu, T. Vo-Dinh, Quantitative Surface-Enhanced Resonant Raman Scattering Multiplexing of Biocompatible Gold Nanostars for in Vitro and ex Vivo Detection, Analytical Chemistry, 85 (2013) 208-212. [85] W.-C. Chin, S.P. Ravindranath, K.L. Henne, D.K. Thompson, J. Irudayaraj, Surface-Enhanced Raman Imaging of Intracellular Bioreduction of Chromate in Shewanella oneidensis, PLoS ONE, 6 (2011) e16634. [86] B. Liu, G. Han, Z. Zhang, R. Liu, C. Jiang, S. Wang, M.-Y. Han, Shell Thickness-Dependent Raman Enhancement for Rapid Identification and Detection of Pesticide Residues at Fruit Peels, Analytical Chemistry, 84 (2012) 255-261. [87] X. Liu, C. Zong, K. Ai, W. He, L. Lu, Engineering Natural Materials as Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Substrates for In situ Molecular Sensing, ACS Applied Materials & Interfaces, 4 (2012) 6599-6608. [88] M.B. Mamián-López, R.J. Poppi, SERS hyperspectral imaging assisted by MCR-ALS for studying polymeric microfilms loaded with paracetamol, Microchemical Journal, 123 (2015) 243-251. [89] T. Vo-Dinh, K. Wong-ek, M. Horprathum, P. Eiamchai, P. Limnonthakul, V. Patthanasettakul, P. Chindaudom, N. Nuntawong, J.R. Lakowicz, Portable surface-enhanced Raman spectroscopy for insecticide detection using silver nanorod film fabricated by magnetron sputtering. Proc. SPIE 7911, Plasmonics in Biology and Medicine VIII, 7911 (2011) 791108-791108-791111. [90] M. Rycenga, C.M. Cobley, J. Zeng, W. Li, C.H. Moran, Q. Zhang, D. Qin, Y. Xia, Controlling the Synthesis and Assembly of Silver Nanostructures for Plasmonic Applications, Chemical Reviews, 111 (2011) 3669-3712. [91] G.P. Sabin, A.M.d. Souza, M.C. Breitkreitz, R.J. Poppi, Desenvolvimento de um algoritmo para identificação e correção de spikes em espectroscopia Raman de imagem, Química Nova, 35 (2012) 612-615. [92] M.N. Leger, L. Vega-Montoto, P.D. Wentzell, Methods for systematic investigation of measurement error covariance matrices, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 77 (2005) 181-205. [93] Food and Drug Administration (FDA), FDA issues interim safety and risk assessment of melamine and melamine-related compounds in food, United States. http://www.fda.gov/ , 2009 (accessed 06.08.2015). [94] World Health Organization (WHO), Melamine and Cyanuric Acid: Toxicity, Preliminary Risk Assessment and Guidance on Levels in Food, World Health Organization, Geneva, Switzerland. http://www.who.int , 2008 (accessed 06.08.2015). [95] P. Ma, F. Liang, Y. Sun, Y. Jin, Y. Chen, X. Wang, H. Zhang, D. Gao, D. Song, Rapid determination of melamine in milk and milk powder by surface-enhanced Raman spectroscopy and using cyclodextrin-decorated silver nanoparticles, Microchimica Acta, 180 (2013) 1173-1180. [96] A.M. Giovannozzi, F. Rolle, M. Sega, M.C. Abete, D. Marchis, A.M. Rossi, Rapid and sensitive detection of melamine in milk with gold nanoparticles by Surface Enhanced Raman Scattering, Food Chemistry, 159 (2014) 250-256. [97] L. Hervé, Nonnegative matrix factorization: a blind spectra separation method for in vivo fluorescent optical imaging, Journal of Biomedical Optics, 15 (2010) 056009.
133
[98] S. Ortega-Martorell, P.J.G. Lisboa, A. Vellido, M. Julia-Sape, C. Arus, Non-negative Matrix Factorisation methods for the spectral decomposition of MRS data from human brain tumours, BMC Bioinformatics, 13 (2012) 38. [99] F. Masia, A. Glen, P. Stephens, P. Borri, W. Langbein, Quantitative Chemical Imaging and Unsupervised Analysis Using Hyperspectral Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy, Analytical Chemistry, 85 (2013) 10820-10828. [100] S. Anbumalar, R. Ananda Natarajan, P. Rameshbabu, An algorithm for overlapped chromatogram separation, Journal of Mathematical Chemistry, 51 (2013) 2144-2164. [101] S. Yu, Y. Zhang, W. Liu, N. Zhao, X. Xiao, G. Yin, Component recognition with three-dimensional fluorescence spectra based on non-negative matrix factorization, Journal of Chemometrics, 25 (2011) 586-591. [102] T. Zhang, B. Fang, W. Liu, Y.Y. Tang, G. He, J. Wen, Total variation norm-based nonnegative matrix factorization for identifying discriminant representation of image patterns, Neurocomputing, 71 (2008) 1824-1831. [103] M.C. Antunes, J.E. J. Simão, A.C. Duarte, R. Tauler, Multivariate curve resolution of overlapping voltammetric peaks: quantitative analysis of binary and quaternary metal mixtures, The Analyst, 127 (2002) 809-817. [104] H.C. Goicoechea, A.C. Olivieri, R. Tauler, Application of the correlation constrained multivariate curve resolution alternating least-squares method for analyte quantitation in the presence of unexpected interferences using first-order instrumental data, The Analyst, 135 (2010) 636. [105] R.R. de Oliveira, K.M.G. de Lima, R. Tauler, A. de Juan, Application of correlation constrained multivariate curve resolution alternating least-squares methods for determination of compounds of interest in biodiesel blends using NIR and UV–visible spectroscopic data, Talanta, 125 (2014) 233-241. [106] E. Micklander, K. Kjelhdahl, M. Egebo, L. Nørgaard, Multi-product calibration models of near infrared spectra of foods, Journal of Near Infrared Spectroscopy, 14 (2006) 395-402. [107] M.S. Piantavini, F.L.D. Pontes, C.P. Uber, D.P. Stremel, M.M. Sena, R. Pontarolo, Chemometric quality inspection control of pyrantel pamoate, febantel and praziquantel in veterinary tablets by mid infrared spectroscopy, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 125 (2014) 396-403. [108] H. van der Voet, Comparing the predictive accuracy of models using a simple randomization test, Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems, 25 (1994) 313-323. [109] S. Sentellas, J. Saurina, S. Hernández-Cassou, M.T. Galceran, L.s. Puignou, Resolution and quantification in poorly separated peaks from capillary zone electrophoresis using three-way data analysis methods, Analytica Chimica Acta, 431 (2001) 49-58. [110] A.C. Olivieri, Practical guidelines for reporting results in single- and multi-component analytical calibration: A tutorial, Analytica Chimica Acta, 868 (2015) 10-22. [111] European Commission; Official Journal of the European Communities, 17/08/2002, L221/8-36. [112] E.C. Le Ru, P.G. Etchegoin, Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, Annual Review of Physical Chemistry, 63 (2012) 65-87.
134
[113] S.-Y. Chou, C.-C. Yu, Y.-T. Yen, K.-T. Lin, H.-L. Chen, W.-F. Su, Romantic Story or Raman Scattering?Rose Petals as Ecofriendly, Low-Cost Substrates for Ultrasensitive Surface-Enhanced Raman Scattering, Analytical Chemistry, 87 (2015) 6017-6024. [114] T. Brulé, A. Bouhelier, H. Yockell-Lelièvre, J.-E. Clément, A. Leray, A. Dereux, E. Finot, Statistical and Fourier Analysis for In-line Concentration Sensitivity in Single Molecule Dynamic-SERS, ACS Photonics, 2 (2015) 1266-1271. [115] T. Konishi, M. Kiguchi, M. Takase, F. Nagasawa, H. Nabika, K. Ikeda, K. Uosaki, K. Ueno, H. Misawa, K. Murakoshi, Single Molecule Dynamics at a Mechanically Controllable Break Junction in Solution at Room Temperature, Journal of the American Chemical Society, 135 (2013) 1009-1014. [116] P.G. Etchegoin, P.D. Lacharmoise, E.C. Le Ru, Influence of Photostability on Single-Molecule Surface Enhanced Raman Scattering Enhancement Factors, Analytical Chemistry, 81 (2009) 682-688. [117] S.R. Emory, W.P. Ambrose, P.M. Goodwin, R.A. Keller, Observing single-molecule chemical reactions on metal nanoparticles, Proceedings of the SPIE, 2001, pp. 63-72. [118] E. Cortés, P.G. Etchegoin, E.C. Le Ru, A. Fainstein, M.E. Vela, R.C. Salvarezza, Strong Correlation between Molecular Configurations and Charge-Transfer Processes Probed at the Single-Molecule Level by Surface-Enhanced Raman Scattering, Journal of the American Chemical Society, 135 (2013) 2809-2815. [119] W.-H. Park, Z.H. Kim, Charge Transfer Enhancement in the SERS of a Single Molecule, Nano Letters, 10 (2010) 4040-4048. [120] D.P. dos Santos, M.L.A. Temperini, A.G. Brolo, Mapping the Energy Distribution of SERRS Hot Spots from Anti-Stokes to Stokes Intensity Ratios, Journal of the American Chemical Society, 134 (2012) 13492-13500. [121] G.F.S. Andrade, M. Fan, A.G. Brolo, Multilayer silver nanoparticles-modified optical fiber tip for high performance SERS remote sensing, Biosensors and Bioelectronics, 25 (2010) 2270-2275. [122] M. Fan, P. Wang, C. Escobedo, D. Sinton, A.G. Brolo, Surface-enhanced Raman scattering (SERS) optrodes for multiplexed on-chip sensing of nile blue A and oxazine 720, Lab on a Chip, 12 (2012) 1554-1560. [123] L. He, M. Lin, H. Li, N.-J. Kim, Surface-enhanced Raman spectroscopy coupled with dendritic silver nanosubstrate for detection of restricted antibiotics, Journal of Raman Spectroscopy, 41 (2010) 739-744. [124] T. Shegai, A. Vaskevich, I. Rubinstein, G. Haran, Raman Spectroelectrochemistry of Molecules within Individual Electromagnetic Hot Spots, Journal of the American Chemical Society, 131 (2009) 14390-14398. [125] A. Weiss, G. Haran, Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics, The Journal of Physical Chemistry B, 105 (2001) 12348-12354. [126] D.P. dos Santos, G.F.S. Andrade, A.G. Brolo, M.L.A. Temperini, Fluctuations of the Stokes and anti-Stokes surface-enhanced resonance Raman scattering intensities in an electrochemical environment, Chemical Communications, 47 (2011) 7158-7160.
135
[127] F.-Y. Hu, L.-M. He, J.-W. Yang, K. Bian, Z.-N. Wang, H.-C. Yang, Y.-H. Liu, Determination of 26 veterinary antibiotics residues in water matrices by lyophilization in combination with LC–MS/MS, Journal of Chromatography B, 949–950 (2014) 79-86.
