UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRÓ-REITORIA...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Análise do perfil proteômico de Moniliophthora perniciosa em resposta ao fluido apoplástico de cacau e caracterização de uma ascorbato peroxidase de Theobroma cacao. Luciana Rodrigues Camillo ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Novembro de 2013
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR
Análise do perfil proteômico de Moniliophthora perniciosa em
resposta ao fluido apoplástico de cacau e caracterização de uma
ascorbato peroxidase de Theobroma cacao.
Luciana Rodrigues Camillo
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Novembro de 2013
ii
Luciana Rodrigues Camillo
Análise do perfil proteômico de Moniliophthora perniciosa em
resposta ao fluido apoplástico de cacau e caracterização de uma
ascorbato peroxidase de Theobroma cacao.
Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Doutora em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Biotecnologia e Genômica.
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Novembro de 2013
C183 Camillo, Luciana Rodrigues.
Análise do perfil proteômico de Moniliophthora perniciosa em resposta ao fluido apoplástico de cacau e caracterização de uma ascorbato peroxidase de Theobroma cacao. / Luciana Rodrigues Camillo. – Ilhéus, BA: UESC, 2013.
xv, 119 f.: il.; anexos. Orientador: Carlos Priminho Pirovani. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de
Santa Cruz. Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular.
Inclui referências.
1. Cacau – Melhoramento genético. 2. Vassoura-de-bruxa (Fitopatologia). 3. Fungos fitopatogênicos. 4. Oxidação. I. Título.
CDD 633.74
iii
LUCIANA RODRIGUES CAMILLO
ANÁLISE DO PERFIL PROTEÔMICO DE Moniliophthora perniciosa EM RESPOSTA AO FLUIDO APOPLÁSTICO DE CACAU E CARACTERIZAÇÃO
DE UMA ASCORBATO PEROXIDASE DE Theobroma cacao
Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Biotecnologia e Genômica.
Aprovada: 21 de novembro de 2013
________________________________ ___________________________
Dr. Antonio Vargas de Oliveira Figueira Dra. Virgínia Lúcia Fontes Soares (CENA/USP) (UESC)
____________________________ _____________________________
Dr. Marcio Gilberto Cardoso Costa Dra. Ana Cristina Caribé dos Santos
(UESC) (UESC) _____________________________
Dr. Carlos Priminho Pirovani (UESC – Orientador)
iv
Aos meus pais, por me ensinarem a voar e a trilhar meus caminhos.
Dedico.
v
AGRADECIMENTOS
Primeiramente, à Universidade Estadual de Santa Cruz e ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular pela oportunidade e à CAPES, pelo apoio financeiro.
Aos membros da banca de defesa: Dr. Antonio Vargas de Oliveira Figueira, Dra. Virgínia Lúcia Fontes Soares, Dr. Marcio Gilberto Cardoso Costa e Dra. Ana Cristina Caribé dos Santos pela análise, discussão e sugestões do presente trabalho.
Ao Prof. Dr. Julio Cezar de Mattos Cascardo como primeiro incentivador da minha vinda para a UESC – Ilhéus-BA. Agradeço-o pela orientação, confiança e “pertubação”, causada por novas idéias e desafios propostos, com dinamismo e criatividade. Saudades eternas!!
Ao meu até então co-orientador que me adotou como orientanda, Prof. Dr. Carlos Priminho Pirovani. A quem, particularmente agradeço, não só pela orientação e amparo, como pela amizade e paciência, tão necessárias ao desenvolvimento e conclusão deste trabalho.
Às Profªs. Drª Fabienne Micheli pela co-orientação e preciosas sugestões, à Profa Helena Costa pela co-orientação e à Profa Fátima Alvim pelas correções finais e apoio.
Ao Prof. Dr. Paulo Monzani pelo apoio e sugestões nos experimentos com a APX.
Ao Ciro Filadelfo pelos experimentos com as peroxidases.
Aos Profs. do PPGGBM, Prof. Dr. Ronan Xavier pelas discussões das análises filogenéticas da APX e à Profª. Drª. Karina Gramacho / CEPLAC, por disponibilizar as plântulas de cacau e os isolados do fungo M. perniciosa.
Aos colegas de trabalho, pela afinidade e empatia que sempre fazem a diferença. Agradeço ao grupo inicial de trabalho no laboratório de Proteômica que me proporcionou interessantes discussões. Agradeço aos “irmãos” por parte de “pai”: André, Juliano Salles, Cristiano, Aurizângela, Jamilly, Sanderson e Gileno. E aos irmãos de coração: à Joise, ao Thyago, à Manu, à Dayane, ao Raoni, ao Duca e ao Everton.
Aos alunos de iniciação científica pela experiência de orientar pessoas: Tiago Cerqueira, Anna, Analu, Bárbara e George.
À Fabrícia Silva, Kátia e Mara do PPGGBM pelo sempre “apoio administrativo”.
Aos meus pais Antônio e Ema pelo apoio incondicional, eterno! Por acreditarem em mim e no meu desenvolvimento. Especialmente à minha mãe, ávida guerreira em suportar minhas crises existenciais durante esse processo.
Aos meus irmãos Rodrigo e Rafael, apesar de não entenderem dos desafios e da persistência necessária aos trabalhos dessa natureza.
Aos meus queridos e amados sobrinhos Isabela e Daniel, por terem trazido mais alegria à minha vida.
À minha avó Júlia... in memmoriam.
Ao Lucas, parceiro de todas as horas, companheiro carinhoso, pelo amor, dedicação e paciência pelas horas roubadas ao convívio! À família Portela Mello pelo apoio em Ilhéus.
Enfim, às sempre amigas parceiras e insubstituíveis, Alessandras (Belluzzo e Schanoski), Camilas (Lima e Madeira), Carol, Patrícia, Makelly, Fernanda, Juliana e Isabel.
vi
“Foi o tempo que perdeste com a
tua rosa que a fez tão importante.”
Antoine De Saint–Exupéry
vii
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................. ix
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ x
LISTA DE TABELAS (ANEXOS) ...................................................................... xi
RESUMO ............................................................................................................. xii
ABSTRACT ........................................................................................................ xiv
1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................... 3
2.1 O fungo Moniliophthora perniciosa e a doença vassoura-de-bruxa (VB) do cacau ................................................................................................................ 3
2.1.1 Histórico .................................................................................................. 3
2.1.2 Sintomas da VB ...................................................................................... 5
2.1.3 Controle da doença ................................................................................. 6
2.2 Estresse oxidativo como mecanismo de defesa .......................................... 7
2.3 A interação molecular do patossistema T. cacao x M. perniciosa ........... 11
2.4 Características e importância do fluido apoplástico ................................. 14
2.4.1 Função do apoplasto na defesa em plantas ........................................... 14
2.4.2 Composição proteica do apoplasto ....................................................... 16
2.5 Importância da ascorbato peroxidase (APX) na defesa de plantas ........... 18
2.6 Estudos proteômicos em interações planta-patógeno ............................... 19
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS ..................................................................... 21
3.1 Hipótese .................................................................................................... 21
3.2 Objetivos ................................................................................................... 21
3.2.1 Geral ...................................................................................................... 21
3.2.2 Específicos ............................................................................................ 22
CAPÍTULO 1 - Análise do perfil proteômico de Moniliophthora perniciosa em resposta ao fluido apoplástico de cacau ............................................................... 22
1 RESUMO ................................................................................................. 22
2 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 23
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................... 25
3.1 Material biológico e cultivo do M. perniciosa ......................................... 25
3.2 Extração do Fluido Apoplástico (FA) de folhas de T. cacao ................... 26
3.3 Crescimento de Mp em fluido apoplástico ............................................... 26
viii
3.4 Extração de proteínas do fungo M. perniciosa ......................................... 27
3.5 Eletroforese Bidimensional e SDS-PAGE: .............................................. 27
3.6 Análise da imagem dos géis pelo programa Image Master ...................... 28
3.7 Extração de peptídeos em gel e análise por espectrometria de massas (LC/MS/MS) ....................................................................................................... 29
3.8 Categorização funcional de proteínas ....................................................... 29
4 RESULTADOS ........................................................................................ 29
4.1 Perfil proteico do micélio saprofítico de Mp em resposta ao cultivo com FA de T. cacao. ................................................................................................... 29
4.2 Perfil de spots de proteínas do gel 2-DE .................................................. 32
4.3 Análise do perfil proteico em resposta aos tratamentos com FA das variedades Cat e TSH ......................................................................................... 35
4.4 Proteínas identificadas e diferenciais ....................................................... 36
4.5 - Menor abundância de proteínas no isolado Mp553 ................................ 41
4.6 Maior abundância de proteínas no isolado Mp565 ................................... 42
5 DISCUSSÃO ............................................................................................ 43
5.1 Classificação funcional de proteínas diferencialmente expressas ............ 44
5.1.1 Síntese de proteínas e folding ............................................................... 46
5.1.2 Metabolismo, energia e processos biossintéticos.................................. 47
5.1.3 Transdução de sinal .............................................................................. 50
5.1.4 Proteínas de resposta à defesa ............................................................... 51
5.1.5 Proteínas de redução-oxidação ............................................................. 52
5.1.6 Proteínas estruturais .............................................................................. 56
6 CONCLUSÃO .......................................................................................... 57
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................... 57
CAPÍTULO 2 - Tc-cAPX, a cytosolic ascorbate peroxidase of Theobroma cacao L. engaged in the interaction with Moniliophthora perniciosa, the causing agent of witches' broom disease..................................................................................... 72
8 Conclusão geral ........................................................................................ 85
9 Anexos ...................................................................................................... 86
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
VB: Vasoura-de-bruxa
FA: Fluido Apoplástico
Mp: Moniliophthora perniciosa
Tc: Theobroma cacao
Cat: Catongo
TSH: TSH1188
Ctrl: Controle
APX: Ascorbato Peroxidase
ROS: Espécies Reativas de Oxigênio
H2O2: Peróxido de Hidrogênio
rTc-cAPX: Ascorbato Peroxidase citosólica recombinante de Theobroma cacao
2-DE: Gel de Eletroforese Bidimensional
APX-R: Ascorbate Peroxidase Related
LC/MS/MS: Cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas
CAT: catalase
AK: Aldo ceto redutase
PGK: fosfoglicerato quinase
GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase
MetE: sintase da metionina dependente de cobalamina
Sahh: S-adenosil-L-homocisteina hidrolase
HSP: Proteína “Heat Shock”
SOD: superóxido dismutase
Prx: peroxirredoxina
ADH: álcool desidrogenase
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Progresso da doença VB ............................................................................................... 6
Figura 2 Perfil de proteínas totais em SDS-PAGE 12,5% do M. perniciosa. ............................ 30
Figura 3 Perfil proteico em géis 2DE dos isolados 553 e 565 de Mp. ....................................... 31
Figura 4. Número de spots de proteínas totais do gel 2-DE. ...................................................... 33
Figura 5. Número de spots de proteínas identificadas do gel 2-DE. .......................................... 34
Figura 6 Mapa de referência do perfil proteico do isolado Mp553 ............................................ 35
Figura 7. Identificações por espécies de fungos pelo Blast2GO. ............................................... 36
Figura 8. Categorização funcional de proteínas diferencialmente expressas de Mp .................. 37
Figura 9. Contribuições das categorizações de funções moleculares de proteínas .................... 42
xi
LISTA DE TABELAS (ANEXOS)
ANEXO 1
Tabela 1A. Spots totais identificados - Mp553................................................................86
Tabela 2A. Spots totais identificados – Mp565...............................................................97
ANEXO 2
Tabela 2A. Expressão diferencial de proteínas – Mp553..............................................112
Tabela 2B. Expressão diferencial de proteínas- Mp565................................................115
xii
RESUMO
Camillo, Luciana Rodrigues. DR. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – Bahia.
Novembro de 2013. Análise do perfil proteômico de Moniliophthora perniciosa em
resposta ao fluido apoplástico de cacau e caracterização de uma ascorbato
peroxidase de Theobroma cacao. Orientador: Dr. Carlos Priminho Pirovani.
Coorientadores: Dras. Fabienne Micheli e Helena Costa.
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa (Mp) é o causador da doença
vassoura-de-bruxa (VB) em Theobroma cacao (Tc), que promove forte queda da
produção de amêndoas de cacau no estado da Bahia. A infecção é iniciada pela invasão
do apoplasto da planta pelo fungo. Como resposta à infecção, a explosão oxidativa,
gerada pelas espécies reativas de oxigênio (ROS), é uma rápida resposta de defesa da
planta após o reconhecimento do patógeno. Dentre as diversas moléculas que compõe as
ROS, o peróxido de hidrogênio (H2O2) é um dos compostos mais abundantes e a sua
detoxificação é essencial para a proteção e sinalização celular. Enzimas Ascorbato
peroxidases (APX) catalisam a conversão de H2O2 em água e usam o ascorbato (AsA)
como doador de elétrons preferencial. O objetivo do trabalho foi analisar a influência do
fluido apoplástico (FA) de cacau na expressão de proteínas do micélio dicariótico do
Mp bem como analisar a importância e caracterização de uma APX citosólica
recombinante de cacau (rTc-cAPX) envolvida na resposta da planta à infecção pelo Mp.
Através da técnica de gel bidimensional (2-DE) e identificação por LC/MS/MS foram
identificadas e comparados os perfis proteícos do micélio dicariótico de dois isolados
contrastantes do Mp, 553 (menos agressivo) e 565 (mais agressivo), em resposta ao
cultivo em FA de cacau das variedades suscetível (Catongo) e resistente (TSH1188). A
análise do perfil protéico dos isolados Mp553 e Mp565, mostrou a diminuição
expressiva na detecção total de spots do isolado 565 (517 spots) do M. perniciosa
quando comparado ao 553 (755 spots). Há diferenças no perfil de expressão também
entre os tratamentos de cada isolado, principalmente quando observamos as amostras
suplementadas com FA da variedade resistente (TSH1188) de cacau. Dentre as
proteínas diferenciais entre os tratamentos e identificadas nas análises com ambos os
isolados, proteínas de metabolismo e energia representaram o maior grupo (35-30%),
seguido de proteínas envolvidas com os processos redox (16%), para o isolado 553, e
xiii
proteínas relacionadas à síntese de proteínas e folding (16%) para o isolado 565. A
análise do perfil proteômico de isolados contrastantes em resposta às variedades
suscetível e resistente de cacau sugere a ação de proteínas como Aldo-ceto redutases
(AKs), Cisteína-peroxirredoxinas e aegerolisinas na patogenicidade do M. perniciosa. A
detecção diferencial de diversas proteínas em resposta às variedades de cacau foi
discutida no trabalho. A análise do envolvimento de peroxidases na doença vassoura-de-
bruxa mostrou o aumento da atividade de peroxidases em tecidos de cacau resistente
infectados com o M. perniciosa e, que essa atividade é devida à peroxidases do tipo
APX. A caracterização da rTc-cAPX mostrou que essa enzima está corretamente
estruturada, sendo um homodímero em solução a 25ºC e bioquimicamente ativa. Suas
propriedades enzimáticas são semelhantes à de outras cAPXs recombinantes. A rTc-
cAPX mostra a atividade de catalase e, preferencialmente, usa o AsA como um doador
de elétrons, mas é mais estável quando oxida guaiacol. A análise de 92 peroxidases da
base de dados do genoma de cacau (http://cocoagendb.cirad.fr/) sugere a presença de
oito APX, sendo duas cAPX e uma APX-R (APX-Related). Tomados em conjunto, os
resultados sugerem a importância da rTc-cAPX na eliminação de H2O2 durante a
interação de T. cacao x M. perniciosa e que a identificação de moléculas chave
envolvidas na patogenicidade do fungo seja um passo fundamental para nortear novas
estratégias de controle da doença.
Palavras chave: Fungo biotrófico, vassoura de bruxa, proteômica diferencial,
Ascorbato Peroxidase-Related (APX-R) e estresse oxidativo.
xiv
ABSTRACT
Camillo, Luciana Rodrigues. DR. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – Bahia.
November- 2013. Analysis of proteomic profile from Moniliophthora perniciosa
apoplastic fluid in response to cocoa and characterization of an ascorbate
peroxidase of Theobroma cacao. Advisor: Dr. Carlos Priminho Pirovani. Advisor
Committee Members: Dras. Fabienne Micheli e Helena Costa.
The basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa (Mp) is the causal agent of
witches' broom (WB) in Theobroma cacao (Tc), which had promoted sharp drop in
production of cocoa beans in the state of Bahia since 1985. Infection is initiated by
invasion of the plant through the apoplast, then, in response to infection, the oxidative
burst is generated by reactive oxygen species (ROS) as a fast defense response in plants
after pathogen recognition. Among the various molecules that compose the ROS,
hydrogen peroxide (H2O2) is one of the most abundant compounds and their
detoxification is essential for the protection and cell signaling. The enzyme ascorbate
peroxidase (APX) catalyzes the conversion of H2O2 into water and use the ascorbate
(AsA) as a preferred electron donor. The objective of this study was to analyze the
influence of apoplastic fluid (AF) of cocoa in the expression of proteins of Mp
dikaryotic mycelium and analyze the importance and characterization of a recombinant
cytosolic APX cocoa (rTc-cAPX) involved in plant response to Mp infection. Through
the technique of two-dimensional gel (2-DE) and identification by LC/MS/MS, we
compared the protein profiles of the two strains dikaryotic mycelium of contrasting Mp,
553 (less aggressive) and 565 (more aggressive) in response the cultivation of cocoa in
AF susceptible varieties (Catongo) and resistant (TSH1188) and the proteins were
identified. Analysis of the protein profile of Mp553 and Mp565 isolates showed a
significant decrease in the total detection of isolated spots of Mp-565 (517 spots)
compared to Mp-553 (755 spots). There are differences in the expression profile also
among treatments of each strain, especially when we observe samples supplemented
with AF resistant variety (TSH1188). The classification of the differentially expressed
proteins in the treatments reveal that the proteins related to energy metabolism represent
the largest group (35-30%) followed by redox processes (16%) for strain 553 and
proteins related to protein synthesis and folding (16%) for strain 565. The analysis of
the proteomic profile of contrasting isolates in response to susceptible and resistant
xv
varieties of cocoa suggests the action of proteins like aldo-keto reductase (AK),
cysteine-peroxiredoxins and aegerolisines possess an important role in the pathogenicity
of M. perniciosa. The differential detection of several proteins in response to cocoa
varieties was discussed at work. The analysis of the involvement of peroxidases in the
witches' broom disease showed increased peroxidase activity in tissues of infected
resistant cocoa with M. perniciosa, and that this activity is due to the peroxidases like
APX. The characterization of rTc-cAPX showed that the enzyme is correctly structured
and is a homodimer in solution at 25 °C and biochemically active. Their enzymatic
properties are similar to other recombinant cAPXs. The rTc-APX shows catalase
activity and preferably uses AsA as an electron donor, but it is more stable when it
oxidizes guaiacole. Analysis of 92 peroxidases from the cocoa genome database
(http://cocoagendb.cirad.fr/) suggests the presence of eight APX, two cAPX and APX-R
(APX-Related). Taken together, the results suggest the importance of rTc-cAPX in
eliminating H2O2 during interaction of T. cacao x M. perniciosa and that the
identification of key molecules involved in the pathogenicity of the fungus is a key to
guide new strategies for disease control step.
Keywords: biotrophic fungus, witches´ broom, differential proteomic, ascorbate
peroxidase - Related (APX-R) and oxidative stress.
1
1 INTRODUÇÃO
O basidiomiceto Moniliophthora perniciosa (Mp) é o causador da doença
vassoura-de-bruxa em Theobroma cacao (Tc). Essa é uma das doenças com maior
impacto econômico que ameaça a viabilidade da produção de cacau na América do Sul,
onde causou forte queda da produção de amêndoas (matéria prima para a produção de
chocolate) no estado da Bahia (GRIFFITH et al., 2003). Apesar do grande impacto
sócio econômico, aspectos importantes sobre a complexa interação que leva ao
desenvolvimento dessa doença ainda não são suficientemente compreendidos. Embora
existam estudos genômicos (DIAS et al., 2011; MEINHARDT et al., 2008; MONDEGO
et al., 2008; PIRES et al., 2009; RINCONES et al., 2008), ainda não foram publicados,
em periódicos, análises do perfil de expressão de proteína de cacau em resposta à
infecção de Mp (SANTIAGO, 2010).
A infecção é iniciada quando os tubos germinativos dos basidiósporos invadem
o tecido meristemático de gemas apicais e atingem o apoplasto (espaço intercelular /
fase monocariótica) onde se desenvolvem até a necrose dos tecidos na segunda fase da
infecção (fase dicariótica). O apoplasto é o conjunto de paredes celulares e espaços
intercelulares e apresenta um papel crucial no metabolismo das células relacionado ao
desenvolvimento e crescimento da planta, respostas de defesa, transdução de sinal e
nutrição mineral (DIETZ, 1997; SATTELMACHER, 2001). Evidências mostram que o
perfil de expressão proteica do apoplasto é alterado em resposta a diferentes tipos de
estresse como sal (GUO e SONG, 2009; ZHANG et al., 2009), temperatura (BRUNE,
URBACH e DIETZ, 1994), ferimentos (LI e MCCLURE, 1990), infestação de insetos
(WESTHUIZEN e PRETORIUS, 1996) e invasão de patógenos (DIAZ-VIVANCOS et
al., 2006; OH et al., 2005). O fluido apoplástico (FA) compreende um lavado aquoso do
apoplasto. Análises in vitro da germinação de basidiósporos de Mp em FA de Tc
sugerem que o apoplasto da planta contenha moléculas sinalizadoras ou moduladoras do
crescimento fúngico (PIROVANI, 2008). Na fase monocariótica ele se encontra em um
dos momentos mais críticos da infecção, uma vez que precede a evolução de
mecanismos de translocação, manipulados pelos patógenos no citoplasma do
hospedeiro, suprimindo as respostas de defesa (JONES e DANGL, 2006).
A explosão oxidativa, composta por espécies reativas de oxigênio (ROS), é uma
resposta de defesa da planta após o reconhecimento do patógeno. Dentre as diversas
moléculas que compõe as ROS, o peróxido de hidrogênio (H2O2) pode ser diretamente
2
tóxico ao patógeno e, especificamente à doença vassoura-de-bruxa, foi observado o
aumento de H2O2 no Tc em resposta aos estágios iniciais da infecção pelo Mp (DIAS et
al., 2011). A adição de baixas concentrações de H2O2, em meios de cultura contendo
glicerol, induziu a formação de grampos de conexão no fungo, necessárias ao
desenvolvimento da segunda fase da doença (PUNGARTNIK et al., 2009)
A detoxificação do H2O2 é essencial para proteção e sinalização celular e é
dependente da existência de eficientes mecanismos celulares enzimáticos e não
enzimáticos (APEL e HIRT, 2004; QUAN et al., 2008). Estudos mostraram que ocorre
modulação de enzimas do sistema oxidativo, bem como a indução de APX no apoplasto
de folhas em resposta à invasão de patógenos (DIAZ-VIVANCOS et al., 2006;
PECHANOVA et al., 2010; VANACKER, CARVER e FOYER, 1998). Essas enzimas
catalisam a conversão de H2O2 em água e usam o ascorbato (AsA) como doador de
elétrons preferencial (ASADA, 1999; SHIGEOKA et al., 2002). Durante o
desenvolvimento da doença vassoura-de-bruxa, o estresse oxidativo é gerado, e a ação
da APX é recrutada pela planta. De forma a complementar os dados sobre a análise das
respostas do fungo ao estresse oxidativo, o presente trabalho teve como um de seus
objetivos caracterizar uma APX citosólica recombinante de T. cacao (rTc-cAPX)
envolvida na interação molecular de T. cacao-M. perniciosa.
A adição de FA, de genótipos contrastantes de cacau, em meios de cultura de Mp
propõe mimetizar o ambiente de crescimento natural do fungo, atuando portanto, como
indutor na expressão de genes de patogenicidade deste patógeno. Até o presente, não há
caracterização que demonstre ativação de defesa apoplástica na espécie. Portanto, o
trabalho teve como objetivos estudar a influência do FA de cacau, suscetível e
resistente, na expressão de proteínas do Mp na fase dicariótica e mostrar a importância e
caracterização da rTc-cAPX de cacau na detoxificação do H2O2 causada pela infecção
do M. perniciosa..
Mediante análise por eletroforese bidimensional (gel 2-DE) e cromatografia
líquida acoplada ao espectrômetro de massas (LC/MS/MS), foi analisado o proteoma
micelial dos isolados 553 (menos agressivo) e 565 (mais agressivo) do fungo M.
perniciosa na presença de FA das variedades resistente (TSH1188) e suscetível
(Catongo) à doença vassoura-de-bruxa. A identificação de moléculas-chave envolvidas
na patogenicidade do fungo é um passo fundamental para nortear novas estratégias de
controle da doença.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O fungo Moniliophthora perniciosa e a doença vassoura-de-bruxa (VB) do
cacau
2.1.1 Histórico
O fungo causador da doença VB foi, primeiramente, classificado como Marasmius
perniciosa Stahel (STAHEL, 1915). Após, foi renomeado, por Singer, como Crinipellis
perniciosa (SINGER, 1942) permanecendo com essa nomenclatura até 2005. Apesar da
divergência de alguns autores, o nome foi trocado novamente quando Aime e Phillips-
Mora (2005) mostraram, por sequenciamento de DNA, sua relação com as espécies de
Crinipellis e a proximidade filogenética com Moniliophthora roreri (AIME e
PHILLIPS-MORA, 2005). Portanto, hoje é chamado de Moniliophthora perniciosa
(Stahel) Aime e Phillips-Mora (= Crinipellis perniciosa). Esse fungo é um
basidiomiceto da ordem Agaricales, família Marasmiaceae, e é endêmico da bacia
amazônica, na região da América do Sul (PURDY e SCHMIDT, 1996).
O Theobroma cacao é uma espécie nativa da floresta amazônica tropical úmida
americana. É uma planta perene, arbórea e típica de clima tropical. O cacau, fruto do
cacaueiro, possui sementes as quais após serem fermentadas e secas são a matéria prima
para a produção de chocolate e de seus derivados (WOOD e LAW, 1987).
Por volta do ano de 1746, sementes de cacau vindas do Pará foram introduzidas no
estado da Bahia, mais precisamente no atual município de Canavieiras, onde encontrou
o clima ideal para seu desenvolvimento. Desde então, constituiu-se em um dos pilares
fundamentais para o desenvolvimento econômico e crescimento da região, e foi o
responsável pelo montante da produção de cacau que levou o Brasil à posição
privilegiada de um dos principais produtores mundiais desse produto (RESENDE et al.,
2007).
Em 1989 foi verificada a primeira incidência do fungo Moniliophthora
perniciosa, mais precisamente nas regiões de Uruçuca e Camacã, locais centrais da
produção cacaueira no sul da Bahia (PEREIRA et al, 1996). Análises demonstraram a
ocorrência de duas linhagens genéticas diferentes em focos do fungo encontrados em
locais distantes e distintos no mesmo período, o que sugere que a incidência do mesmo
tenha sido causada por intervenção humana (ANDEBRHAN et al., 1999). Este fungo é
o causador da doença VB do cacaueiro (Theobroma cacao L.) e de outros hospedeiros.
4
A VB é uma das doenças de maior impacto econômico e representa uma séria ameaça à
viabilidade da produção de cacau na América do Sul (GRIFFITH et al., 2003; PURDY
e SCHMIDT, 1996).
Atualmente, a doença constitui o maior problema fitopatológico da cacauicultura
do estado da Bahia, consequentemente, o país passou de um dos maiores exportadores
para importador de cacau para suprir a demanda interna (PEREIRA, et al., 1996;
RESENDE et al., 2007). Os baixos preços das amêndoas, praticados no mercado
internacional, após a incidência da doença, fragilizaram consideravelmente a situação
socioeconômica e o equilíbrio ecológico das regiões produtoras de cacau no país
(http://www.agricultura.gov.br).
A cultura do cacau apresenta elevada importância para a região sul baiana não
apenas pela produção de chocolate e de seus derivados, mas pela questão ambiental, que
fica evidente uma vez que a forma de cultivo predominante nesta região é o sistema
agroflorestal tradicional cabruca (plantações de cacau sob floresta raleada) (DONALD,
2004; JOHNS, 1999). Esse sistema possibilitou a Floresta Atlântica, da Região
Cacaueira da Bahia, possuir os mais significativos remanescentes florestais em áreas
agricultáveis, uma vez que a fragmentação de florestas nativas e sua reduzida área não
seriam suficientes para a continuidade das populações de fauna e flora desses locais
(LOBÃO, 2007). Estima-se que aproximadamente 70% de toda a área com cacau no
Sudeste da Bahia (cerca de 460 mil hectares) foi implantada no sistema cabruca
(FRANCO et al., 1994).
No período da crise da lavoura cacaueira, causada pela doença VB,
ambientalistas denunciaram a conversão das áreas de cabruca em pasto e em cultivos
que causavam maior impacto ambiental e, o corte ilegal de árvores nativas das cabrucas
para a venda da madeira (ALGER e CALDAS, 1996). Consequentemente, grandes áreas
da floresta foram destruídas. Nesse cenário, não restam dúvidas de que a conservação da
biodiversidade, existente nas regiões produtoras de cacau, está intimamente relacionada
à manutenção do sistema cabruca, diretamente relacionado ao controle da doença VB.
Os prejuizos causados pela doença ficam evidentes quando comparamos a
produção brasileira no mercado internacional. A safra de 1990/91 correspondeu a 15%
da produção de amêndoas, quando o Brasil ocupava o segundo lugar na produção
mundial, em contraste com as safras de 2007/08 (4,5%) e de 2011/12 (5,4%) (FAO,
2013). A alta produção em torno de 400 mil toneladas nunca foi recuperada (BOWERS
et al., 2001). Contando com 682.000 ha de área plantada no país, observa-se um
5
aumento gradual na produção brasileira nos últimos 4 anos. A safra anual em toneladas
de amêndoas (t) foi de 218.500, 235.400, 248.500 e 257.000 toneladas em 2009, 2010,
2011 e 2012, respectivamente. A Bahia é o estado responsável pela maior produção do
país (160.200 t - 62%), seguido do Pará (67.300 t), Rondônia (16.420 t), Espírito Santo
(8.300 t), Amazonas (4.600 t) e Mato Grosso (576 t) (Anuário Estatístico do Brasil,
2011 e 2012).
2.1.2 Sintomas da VB
Os sintomas característicos da doença na fase monocariótica são a hipertrofia e
hiperplasia dos tecidos infectados e perda da dominância apical (PURDY e SCHMIDT,
1996). O M. perniciosa ataca as regiões meristemáticas, principalmente frutos, brotos e
almofadas florais e induz uma variedade de sintomas, dependendo do órgão infectado e
do estágio de desenvolvimento. A infecção ocasiona queda acentuada na produção,
provocando o desenvolvimento anormal, seguido de morte, das partes infectadas
(EVANS, 1981; RUDGARD, 1989).
O fungo apresenta duas fases distintas: quando apresenta hifas monocarióticas
(biotrófica/parasítica) (Figura 1. 3A e 3B) e a segunda fase, quando apresenta hifas
dicarióticas (necrotrófica/saprofítica) (Figura 1. 3C e 3D). No primeiro estágio da
colonização o micélio cresce no espaço intercelular do apoplasto e por não ter
apressório, sugere-se que o fungo acumule nutrientes do hospedeiro (SILVA e
MATSUOKA, 1999), semelhante ao que ocorre na infecção de Cladosporium fulvum
Cooke em tomate (KENYON et al., 1993). Nessa fase o fungo se encontra na forma de
micélio monocariótico (fase biotrófica), que ocorre em baixa densidade (PENMAN et
al., 2000) e apresenta lento crescimento (SILVA e MATSUOKA, 1999) (Figura 1. 3A e
3B). Na palnta observa-se a hipertrofia e hiperplasia dos tecidos, perda de dominância
apical e proliferação de gemas axilares, o que resulta na formação de ramos anormais
chamados de vassoura-verde que apresenta cor verde mais clara (Figura 1. 3B). Essa
coloração sugere que a infecção inicial causa alterações no metabolismo, reduzindo a
capacidade fotossintética do tecido (SCARPARI et al., 2005).
Entre 50 e 90 dias após infecção, grande parte das hifas invade as células do
hospedeiro, coincidindo com o aparecimento dos sintomas necróticos visíveis (Figura 1.
3C), quando ocorre a morte dos tecidos infectados levando à formação da vassoura-seca
(Figura 1 3D). Essa fase corresponde ao segundo estágio da infecção
6
(saprofítico/dicariótico), quando se observa a presença de hifas dicarióticas e grampos
de conexão (Figura 1. 3C e 3D). Nesse estágio ocorre a formação do basidioma que
produz os basidiósporos (EVANS, 1981; CEITA et al., 2007; SILVA e MATSUOKA,
1999) (Figura1 3E). Os esporos são dispersos pelo vento e chuva, e são os únicos
propágulos capazes de infectar o cacaueiro, germinando na superfície da planta e
produzindo tubos monocarióticos, os quais entram na planta pelos estômatos ou espaços
intercelulares do hospedeiro retomando o ciclo de infecção (PEREIRA et al., 1996;
PURDY e SCHMIDT, 1996)
2.1.3 Controle da doença
Para conter o avanço da doença são utilizados métodos de controle integrado:
genético, cultural, químico e biológico, sendo o manejo das plantações de extrema
importância (HEBBAR, 2007; MEINHARDT et al., 2008; OLIVEIRA e LUZ, 2005). O
método de controle considerado como mais promissor é o plantio e enxertia de
Meinhardt et al., 2008
Figura 1. Progresso da doença VB (da esquerda para a direita). As imagens dos
estágios fúngicos, acima das fotos, representam a progressão da fase biotrófica para a
saprofítica, as estruturas miceliais típicas e o número de núcleos para cada estágio
sintomático. A) infecção pela penetração por estômatos abertos. B) Crescimento da
vassoura-verde. C) Necrose de tecidos infectados. D) vassoura seca. E) formação do
basidiocarpo e esporo.
7
genótipos resistentes ao patógeno, prática que vem sendo largamente adotada no sul da
Bahia (FRIAS e PURDY, 1995; GRIFFITH et al., 2003). No entanto, as fontes de
resistência genética apresentam o aparecimento de sintomas da infecção na Bahia,
possivelmente associado com a variabilidade genética dos fungos (ALBUQUERQUE et
al., 2009). Tem sido proposto que o M. perniciosa pode ter co-evoluido com
hospedeiros de Theobroma spp. na região Amazônica, onde ambos podem partilhar um
centro comum de diversidade (PURDY e SCHMIDT, 1996). Os níveis de infecção
também podem derivar de uma possível dispersão dos isolados mais virulentos, ou a
partir de um aumento na pressão de inóculo pela intensificação da epidemia de VB
(ALBUQUERQUE et al., 2009).
Os embarques internacionais das commodities, o transporte de mudas, de
sementes e de frutos contaminados é bastante crítico frente à dificuldade de diagnóstico
desses materiais devido ao longo período de incubação do patógeno e, portanto, deve
ser evitado para diminuir o risco de propagação da doença (MEINHARDT et al., 2008).
Dentro do controle integrado, o escape por meio do cultivo de cacau no semiárido tem
demonstrado ser bastante benéfico no controle da VB, uma vez que nessas regiões a
umidade do ar é baixa na maior parte do ano, diminuindo drasticamente a incidência do
fungo. Outra forma de controle é o biológico. Análises com o fungo Trichoderma
stromaticum mostraram expressiva inibição do desenvolvimento de basidiocarpos do M.
perniciosa (BASTOS, 2000; LOGUERCIO et al., 2009), resultando no produto
TRICOVAB, utilizado para controle biológico do agente causador da VB (BEZERRA
et al., 2000; MEINHARDT et al., 2008).
2.2 Estresse oxidativo como mecanismo de defesa de plantas contra patógenos
As plantas podem responder ao ataque de patógenos de diversas formas. A
diversidade de respostas dinâmicas e coordenadas é observada tanto na planta quanto no
patógeno, culminando na indução da expressão de vários genes que codificam proteínas
que sinalizarão respostas de suscetibilidade ou resistência. A resistência no hospedeiro
é, portanto, o resultado de um sistema complexo de contribuições individuais de
diferentes mecanismos de resistência. Na teoria gene-a-gene, semelhante ao sistema
imunológico de vertebrados, plantas resistentes reconhecem especificamente o patógeno
e sinalizam diversas respostas que resultam na reação de hipersensibilidade (HR)
(FLOR, 1971). O reconhecimento ocorre através do produto do gene de resistência
8
dominante da planta (R) e o produto do gene de avirulência do patógeno (Avr),
resultando na incompatibilidade de interações, e consequente resistência da planta. Na
ausência do produto de um desses genes, o patógeno se instala (interação compatível)
causando a doença (DANGL e JONES, 2001; FLOR, 1971).
Oposta à hipótese clássica de interação gene-a-gene, no modelo de interação
guard-model ocorre a participação do produto de mais de dois genes, demonstrando
interações indiretas entre proteínas R e Avr. Em interações incompatíveis, proteínas de
genes Avr interagem com proteínas alvos envolvidas em importantes processos
celulares. Chamadas de protetoras ou “proteínas-guardiãs”, estas seriam modificadas
devido a essa interação, resultando no reconhecimento de proteínas R do hospedeiro
gerando resposta da planta, seja como uma HR ou pela supressão de mecanismos de
defesa do hospedeiro (DANGL e JONES, 2001; XIA et al., 2004).
Ainda na ocorrência de interações indiretas, muitos efetores do patógeno podem
ter vários destinos no hospedeiro, dispensando a atuação das proteínas-guardiãs em
plantas sem a proteína R, como sugere a teoria decoy model (HOORN et al., 2008).
Proteínas chamadas de iscas imitam os alvos dos efetores do patógeno e competem com
as proteínas-guardiãs, diminuindo assim a carga patogênica sem alterar a aptidão do
patógeno, independente da presença ou ausência dos genes R. Por outro lado
desencadeiam a imunidade inata em plantas que possuem a proteína R (HOORN et al.,
2008). O envolvimento de proteínas guardiãs e iscas são sugeridos na interação de Cicer
arietinum (grão-de-bico) e o fungo Fusarium oxysporum f.sp. ciceri, como cistatinas e
fosfolipases e, Serina Treonina Quinases, respectivamente (GUPTA et al., 2010).
Após o reconhecimento do patógeno, pela interação incompatível, é
desencadeada a reação de hipersensibilidade (HR) na planta que inclui a expressão de
proteínas relacionadas à patogênese (Pathogenesis Related- PR) e ao aumento de ROS.
O aviso de acumulação de ROS em ataque de patógenos é denominado de explosão
oxidativa, composta principalmente pelas espécies reativas de oxigênio (ROS) e morte
celular programada (PCD) no local da infecção (GREENBERG, 1997; MEHDY, 1994).
A HR é a mais eficiente resposta da planta para a tentativa de contenção do patógeno
biotrófico (GOVRIN e LEVINE, 2000). Como exemplo de proteína PR, a TcPR-10 foi
diferencialmente expressa na biblioteca de interação T. cacao – M. perniciosa
(GESTEIRA et al., 2007). Essa PR de cacau tem atividade ribonucleásica e antifúngica
contra M. perniciosa e S. cerevisae (PUNGARTNIK et al., 2009). Em T. cacao, um dos
mecanismos de resposta da planta pode ser observado pelo aumento dos níveis de BIP
9
(Proteína de Ligação à Imunoglobulina) em meristemas tratados com proteínas
secretadas pelo M. perniciosa (ALVIM et al., 2009).
A explosão oxidativa, ocorre em muitas interações planta-patógeno durante a
HR e confere resistência a patógenos biotróficos, restringindo a sua dispersão
(GOVRIN e LEVINE, 2000; KAN, VAN, 2006). No caso de fungos necrotróficos como
Botrytis cinerea, a morte de células de plantas é benéfica para o agente patogênico e
conduz à susceptibilidade (GOVRIN e LEVINE, 2000). Patógenos necrotróficos, em
contraste com os biotróficos, matam células hospedeiras por meio de moléculas tóxicas
e enzimas líticas, e podem sobreviver na ausência de células hospedeiras vivas,
decompondo o tecido da planta para o seu próprio crescimento (GOVRIN e LEVINE,
2000; KAN, VAN, 2006). Trabalhos também sugerem que estes agentes patogênicos
tenham a capacidade de ativar respostas imunológicas vegetais destinadas a trabalhar
contra patógenos biotróficos, induzindo a PCD do hospedeiro (GOVRIN e LEVINE,
2000).
As ROS agem como moléculas sinalizadoras que regulam o desenvolvimento
em plantas e a adaptação ao estresse, mas também podem ser altamente tóxicas (QUAN
et al., 2008; SHETTY et al., 2007). As ROS são compostas por ânion superóxido (O2-),
peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxil (OH) (MEHDY, 1994). O H2O2 é a
molécula mais bem estudada e por ser quimicamente estável, apresenta alta
permeabilidade através das membranas celulares favorecendo a rápida elicitação da
resposta vegetal a estresses bióticos e abióticos (COSTET et al., 2002). Portanto,
apresenta diversas funções podendo alterar a expressão gênica, induzir resposta
sistêmica e a produção de fitoalexinas (APEL e HIRT, 2004; BOLWELL et al., 2002;
COSTET et al., 2002) e desencadear morte celular (Mittler, ET AL. 1999). No
patossistema T.cacao x M. perniciosa, a combinação de baixas concentrações de H2O2 e
glicerol in vitro, parecem induzir a dicariotização de hifas que resulta na mudança de
fase do fungo M. perniciosa, de biotrófica para necrotrófica. Nessa fase, o patógeno
invade as células resultando na morte de tecidos infectados, sintoma conhecido como
vassoura seca, em plantas de cacau (PUNGARTNIK et al., 2009).
O alto estresse oxidativo é observado pelo aumento da peroxidação lipídica na
primeira fase de infecção do fungo M. perniciosa em cacau (SCARPARI et al., 2005).
A variação da concentração de H2O2 foi observada em plantas de T. cacao infectadas
com o M. perniciosa (DIAS et al., 2011). Na variedade suscetível, ocorre maior
concentração de cristais de oxalato de cálcio (CaOx) e menor concentração de H2O2.
10
Em contraste, plantas resistentes apresentam um aumento da concentração de H2O2
acompanhada de menor concentração de cristais de oxalato de cálcio (CaOx), sugerindo
a degradação enzimática desses cristais nas etapas precoces da infecção e na fase final
da doença em plantas resistentes e susceptíveis, respectivamente (DIAS et al., 2011;
CEITA et al., 2007)
Portanto, durante a infecção pelo M. perniciosa, a enzima oxalato oxidase
converte o ácido oxálico complexado nos CaOx em H2O2, promovendo um ambiente
altamente oxidativo com a função de deter a invasão e sugere que CaOx estejam
relacionados à progressão da doença VB. Acompanhando esses dados, também foi
observado o aumento de transcritos de oxalato oxidase e APX em plantas resistentes de
cacau após 48h de infecção pelo M. perniciosa (DIAS et al., 2011).
A detoxificação do H2O2 é essencial para proteção e sinalização celular e é
dependente do desenvolvimento de eficientes mecanismos celulares enzimáticos,
compostos pelas enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase
(POD), ascorbato peroxidase (APX) e glutationa redutase (GR), e por mecanismos não
enzimáticos como tocoferóis, flavonoides, ácido ascórbico (AsA) e glutationa (APEL e
HIRT, 2004; QUAN et al., 2008). Diversas condições de estresse como seca, alta
intensidade de luz, salinidade e ataque de patógenos são estímulos para a produção de
ROS e para a modulação da expressão de genes de ascorbato peroxidase (APX)
(MILLER et al., 2007; MITTLER et al., 2004; MOHAMMADI et al., 2012; ROSA et
al., 2010; SHIGEOKA et al., 2002). A principal função das APX (EC 1.11.1.11) é a
detoxificação do H2O2 em plantas superiores, algas e euglena prevenindo o estresse
oxidativo causado pelas ROS. Outras funções também podem ser observadas para essas
enzimas, como o favorecimento da dissipação do excesso de foto energia através do
ciclo água-a-água em cloroplastos (ASADA, 1999, 2006), além do seu envolvimento na
regulação de transdução de sinais (DAVLETOVA et al., 2005; ISHIKAWA e
SHIGEOKA, 2008; MARUTA et al., 2012).
Acompanhando a explosão oxidativa, ocorre a indução de peroxidases no FA de
plantas (PIROVANI et al., 2008). A maioria das peroxidases pode oxidar uma vasta
gama de substratos à custa de H2O2 (CHRISTENSEN et al., 1998). A ação das
peroxidases no consumo do H2O2 e na oxidação dos fenóis leva a lignificação e
formação de parede secundária (CHRISTENSEN et al., 1998). Plantas de Arabidopsis
anti-senso para a peroxidase de feijão francês (FBP1) demonstraram ser altamente
susceptíveis a agentes patogénicos bacterianos e fúngicos (BOLWELL et al., 2002).
11
Diferentes peroxidases foram detectadas no apoplasto de folhas de álamo e algumas
foram induzidas em resposta à infecção por Melampsora spp, demonstrando amplo
papel dessas proteínas na defesa de plantas (PECHANOVA et al., 2010).
2.3 A interação molecular do patossistema T. cacao x M. perniciosa
Existem poucos e recentes trabalhos sobre os mecanismos moleculares envolvidos
no desenvolvimento da interação específica entre o M. perniciosa e T. cacao. O projeto
genoma do M. perniciosa (MONDEGO et al., 2008) foi determinante para o
desenvolvimento de pesquisas moleculares sobre esse patossistema e desde então,
aumentaram os estudos moleculares acerca desse patossistema (ALVIM et al., 2009;
CAMILLO et al., 2013; GESTEIRA et al., 2007; LEAL JR, ALBUQUERQUE e
FIGUEIRA, 2007; LOPES et al., 2008; MEINHARDT et al., 2008; PIRES et al., 2009;
PIROVANI et al., 2010; RINCONES et al., 2008; THOMAZELLA et al., 2012).
A expressão gênica diferencial de duas fases do ciclo de vida do fungo M.
perniciosa, resultou na identificação de 189 genes, os quais refletem as mudanças no
metabolismo de carbono e nitrogênio, bem como o entendimento de vias metabólicas
que podem ser essenciais para a patogenicidade do fitopatógeno (RINCONES et al.,
2008). Dentre essas, a identificação de genes que codificam proteínas de necrose e
indutoras de etileno (MpNEPs). A MpNEP1 apresenta expressão constitutiva, em ambas
as fases do fungo, enquanto que a MpNEP2 apresenta maior nível de transcritos na fase
monocariótica (GARCIA et al., 2007). Ensaios de imunolocalização mostraram que as
MpNEPs localizam-se no apoplasto de tecidos infectados e parecem desempenhar papel
importante na doença VB (GARCIA et al., 2007). Genes de folhas de cacau foram
modulados em resposta a diferentes moléculas sinalizadoras de defesa, incluindo a
MpNEP1 (VERICA et al., 2004). Análises de proteômica e metabolômica mostraram
alterações moleculares e bioquímicas globais em culturas de células de Nicotiana
benthamiana elicitadas com MpNEP2. O estudo mostrou que proteínas up-reguladas
estão relacionadas à ligação de nucleotídeos e atividade de oxidorredutase e aquelas
down-reguladas apresentam função nas vias glicolítica, de resposta ao estresse e
dobramento de proteínas (VILLELA-DIAS et al., 2013). Meristemas de cacau
infiltrados com MpNEPs resultaram na indução de multicistatina em cacau, sugerindo
que essa pode ser uma proteína PR (PIROVANI et al., 2010). A obtenção da estrutura
cristalográfica da MpNEP2 (ZAPAROLI et al., 2011) e, de outras proteínas
12
consideradas como alvos promissores para o desenvolvimento de fungicidas como a
proteína de ligação ao Acil-CoA (ACBP) (MONZANI et al., 2010) e a ciclosporina do
M. perniciosa, complexada ao seu inibidor ciclofilina (MONZANI et al., 2011),
facilitam a compreensão dos mecanismos de ação dessas proteínas.
Cistatinas de cacau (TcCYS1, 2, 3 e 4) foram eficientes na inibição do
crescimento micelial do M. perniciosa. As cistatinas podem inibir proteases, reduzindo
a atividade dessas enzimas que estão envolvidas na nutrição/digestão do fungo M.
perniciosa (PIROVANI et al., 2010). O trabalho sugere que a TcCYS4 tenha ação
efetiva no bloqueio da PCD em plantas sadias e na fase biotrófica do fungo, através da
inibição de cisteíno-proteases envolvidos neste processo. Nos tecidos infectados pelo M.
perniciosa, mais precisamente no final da fase biotrófica na ausência de TcCYS4, as
cisteíno-proteases estariam ativas na participação da PCD, contribuindo para a mudança
de fase do patógeno.
O genoma do T. cacao foi completamente sequenciado, favorecendo os diversos
estudos que buscam melhorar a qualidade e a resistência dessa planta (ARGOUT et al.,
2011). Bibliotecas ESTs de folhas de cacau em resposta aos indutores etileno, ácido
salicílico e ácido jasmônico, apresentaram a expressão de genes correspondentes à
proteína APX (VERICA et al., 2004). Bibliotecas de cDNA de meristemas apicais de
variedades resistentes e susceptíveis de cacau infectadas pelo M. perniciosa, mostraram
a presença de genes relacionados com apoptose e explosão oxidativa, dentre eles uma
APX citosólica - cAPX (EC 1.11.1.11), homóloga à APX encontrada por Verica (2004).
Dias et al (2011) também detectou a produção de H2O2 no início da infecção da
variedade resistente de plantas de cacau, porém o mesmo não ocorreu com a variedade
susceptível. Em contraste, plantas suscetíveis mostraram a concentração de cristais de
oxalato de cálcio, os quais foram pouco presente em plantas resistentes (DIAS et al.,
2011). Análises por RT-qPCR mostraram que plantas resistentes ao M. perniciosa
apresentaram a indução de transcritos de cAPX, oxalato oxidase (E.C. 1.2.3.4) e
dehidroascorbato redutase (E.C 2.5.1.18), enzimas que estão diretamente envolvidas na
resposta da planta ao estresse oxidativo causado por patógeno. A interação de uma
genótipo susceptível de T. cacao com o fungo M. perniciosa resulta em PCD e necrose,
utilizada pelo fungo para o seu benefício na mudança da fase biotrófica para a
necrotrófica (CEITA et al., 2007). Nessa interação, a expressão de genes de oxalato
oxidase e cAPX sugere que a degradação de cristais de oxalato de cálcio esteja ligada a
uma função crucial na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e ativação de
13
PCD, e que uma cAPX esteja relacionada à detoxificação do peróxido de hidrogênio
(DIAS et al., 2011; CEITA, et al., 2007). Essas alterações da expressão da cAPX
reforçam uma provável função dessa enzima na resposta da planta sob a infecção pelo
M. perniciosa.
O glicerol representa uma fonte de carbono de extrema importância para a
manutenção do fungo na fase biotrófica in vitro (MEINHARDT et al., 2006;
SCARPARI et al., 2005). Análises bioquímicas de plântulas de cacau demonstraram
que na fase monocariótica do fungo, quando há o desenvolvimento dos sintomas de
vassoura-verde na planta, ocorre alta concentração de glicerol na planta infectada
(SCARPARI et al., 2005). A expressão aumentada de enzimas que clivam açúcares na
interação incompatível entre o Cicer arietinum e o fungo Fusarium oxysporum f. sp
ciceri sugere um papel vital de açúcares na mediação de defesa contra a doença murcha
fúngica (GUPTA et al., 2010).
Compostos fenólicos, carboidratos e aminoácidos apresentam intensa relação nas
respostas de resistência de plantas a doenças. Genótipos de cacau altamente suscetíveis
à infecção pelo fungo Phytophthora megakarya, apresentaram muito mais carboidratos
solúveis do que em clones menos suscetíveis. Entretanto, a concentração diminui mais
rapidamente nos tecidos infectados, sugerindo que o fungo utilize esses carboidratos
para o seu crescimento (NDOUMOU, NDZOMO e DJOCGOUE, 1996). Uma vez que
vias de síntese de compostos fenólicos e aminoácidos usam produtos de metabólitos de
carboidratos como precursores, esse aumento também pode estar relacionado à síntese
bioquímica de derivados fenólicos envolvidos nos mecanismos de defesa da planta.
Compostos fenólicos protegem plantas durante diversos estresses como ataque de
patógenos e exposição à luz UV, como observado no aumento desses compostos em
clones de cacau infectados por P. megakarya (NDOUMOU, NDZOMO e DJOCGOUE,
1996). Em plantas infectadas, fenóis são substratos para a síntese de compostos, como
fitoalexinas envolvidos na resposta a doenças (DIXON e LAMB, 1996). Folhas de
Theobroma grandiflorum sadias apresentaram maior conteúdo de amido, açúcares
solúveis, compostos fenólicos e taninos quando comparados com folhas infectadas por
M. perniciosa. Nessa interação o fungo altera o balanço hormonal de folhas de T.
grandiflorum afetando o acúmulo de constituintes das paredes celulares para facilitar o
seu desenvolvimento no apoplasto (CONCEIÇÃO et al., 1997)
14
No patossistema M. perniciosa x T. cacao, a planta utiliza mecanismos não
específicos como aumento de alcalóides, compostos fenólicos e de taninos, além de
mudanças bioquímicas como alterações de etileno, ácidos graxos e açucares na tentativa
de contenção do fungo (SCARPARI et al., 2005). Tecidos foliares de clones de
cacaueiro com diferentes níveis de resistência ao M. perniciosa mostraram
concentrações mais elevadas de fenóis em clones resistentes de cacau quando
comparados aos suscetíveis o que sugere o envolvimento desses compostos na defesa
constitutiva de T. cacao contra o Mp (NOJOSA et al., 2003).
Estudos desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisas identificaram, pela
primeira vez, proteínas secretadas pelo M. perniciosa em resposta ao seu tratamento
com glicerol e glicose, por cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas
(LC/MS/MS). O glicerol elicita a secreção de proteínas de patogenicidade, quando
comparados com outras fontes de carbono como a glicose; promove modificações na
parede celular do fungo e favorece a resistência aos indutores de estresse como,
vermelho Congo e SDS (ALVIM et al., 2009). O glicerol também induz a expressão de
genes relacionados à proteção ao estresse oxidativo como catalase e SOD. Esses dados
sugerem a importância do glicerol como molécula chave para a indução de virulência no
M. perniciosa (SANTOS et al., 2008).
2.4 Características e importância do fluido apoplástico
2.4.1 Função do apoplasto na defesa em plantas
Diversos tecidos da planta como folhas, sementes e raízes, formam uma unidade
fisiológica integrada que recebe sinais e produtos metabólicos resultantes do
crescimento e desenvolvimento da planta. A comunicação entre essa unidade fisiológica
integrada é dependente do simplasto e do apoplasto (DIETZ, 1997). O simplasto é
composto pelos citoplasmas das células conectados através dos plasmodesmas. O
apoplasto é o espaço externo à membrana celular e que compreende a parede celular e o
espaço intercelular. (BLINDA et al., 1997; PIGNOCCHI e FOYER, 2003). Considerado
como um ambiente fisiológico interno de corpos de plantas por Sakurai (1998), o
apoplasto é responsável por diversas funções como regulação do crescimento e
sustentação do esqueleto através de proteínas estruturais. Esse compartimento também é
a rota de transporte de água, solventes orgânicos bem como hormônios,
oligossacarídeos e proteínas. É o local onde ocorrem processos regulatórios cruciais e
15
interações proteína-proteína. O apoplasto mantém a homeostase do ambiente interno,
adesão celular e troca de gases para a fotossíntese e também confere proteção à
dessecação, a fatores ambientais e ao ataque de patógenos (BOLWELL et al., 2002;
SAKURAI, 1998; SATTELMACHER, 2001). Portanto, desempenha um papel
importante nos processos de comunicação da planta com o meio ambiente, podendo
determinar o destino da interação entre hospedeiros e patógenos (DIETZ, 1997;
DOEHLEMANN e HEMETSBERGER, 2013; PECHANOVA et al., 2010).
O apoplasto é constituído por componentes enzimáticos, íons, açúcares,
aminoácidos, compostos fenólicos e ácidos orgânicos em baixas concentrações, sendo
um ambiente pobre na concentração de nutrientes. Esses compostos caracterizam o
apoplasto como um compartimento reativo, porém dependente de propriedades da
parede celular (transporte de íons entre as células), de metabólitos e proteínas (GUO e
SONG, 2009). Em situações de estresse e danos celulares, o apoplasto pode ser a
diferença entre a sobrevivência ou morte celular (PIGNOCCHI e FOYER, 2003).
Mudanças de pH no apoplasto são indicadoras de respostas de defesa específicas do
hospedeiro (PIGNOCCHI e FOYER, 2003).
Um estudo desenvolvido para a manutenção in vitro do M. perniciosa mostrou
que a primeira fase do ciclo de vida do fungo é a mais crítica, uma vez que os micélios
da fase monocariótica são produzidos em condições de limitação nutricional encontrada
no apoplasto, mimetizando o que ocorre in vivo e, portanto, deve suportar todas as
condições adversas da resposta da planta (MEINHARDT et al., 2006). Estimativas de
biomassa do M. perniciosa em tecidos de T. cacao infectados, através da composição de
quitina percentual dos micélios, mostraram que as vassouras verdes continham a metade
da biomassa fúngica encontrada na vassouras secas. Cortes consecutivos da vassoura-
verde apresentaram gradiente de concentração de quitina, sendo observadas quantidades
progressivamente maiores próximas à base da vassoura, com declínio da biomassa em
relação ao ápice (PENMAN et al., 2000). A baixa concentração de nutrientes do
apoplasto e o intenso estresse oxidativo podem favorecer a manutenção e baixo
crescimento do fungo na fase biotrófica (RIO et al., 2008; SCARPARI et al., 2005).
Provavelmente, nessa fase, a presença do patógeno pode causar mudanças morfológicas
no tecido da planta como uma resposta de defesa à infecção (PENMAN et al., 2000).
A coloração verde clara de vassouras-secas e a diminuição de clorofila a e b e de
carotenóides sugere a redução no processo de fotossíntese (SCARPARI et al., 2005) e a
dependência da severidade da infecção do M. perniciosa na capacidade fotossintética da
16
planta (ORCHARDT e HARDWICK, 1988). Nesse sentido, o estresse oxidativo é
observado no apoplasto de T. cacao infectado pelo M. perniciosa, uma vez que
vassouras-verdes apresentaram expressivo aumento de malondialdeido (MDA), produto
final da peroxidação lipídica, quando comparadas com tecidos não infectados, indicando
que há oxidação de pigmentos (SCARPARI et al., 2005). Constituintes do apoplasto
foliar de T. cacao de plantas resistentes (TSH1188) elicitadas foram efetivos na inibição
de 50% da germinação de esporos de M. perniciosa (PIROVANI, 2008).
A parede celular (CW) secreta proteínas envolvidas em uma variedade de
processos fisiológicos, como crescimento, desenvolvimento e resposta de defesa e
apresenta uma série de proteínas não estruturais que incluem as peroxidases, invertases,
manosidades, galactosidades e glucanases (OH et al., 2005). A análise de proteínas
secretadas pela CW resultou no isolamento de 13 proteínas de defesa contra patógenos,
semelhantes às proteínas reguladas por jasmonato, ácido salicílico e etileno, e
retrotransposons, lipases e esterases. A lipase GLP1 de A. thaliana mostrou ser um
componente crítico na interação incompatível com o fungo necrotrófico Alternaria
brassicola (OH et al., 2005).
As peroxidases e glucanases apresentaram aumento de atividade em plantas de
cacau resistentes ao M. perniciosa (PIROVANI, 2008). Ensaios de atividade de
peroxidases do apoplasto de cacau mostraram o uso preferencial do ascorbato ao invés
do composto guaiacol como substrato, o que sugere uma alta concentração de APX
dentre essas peroxidases (PIROVANI, 2008). Extratos do FA de cacau evidenciam um
maior teor de proteínas em tecidos infectados por M. perniciosa do que nos sadios
(MACHADO, 1991).
2.4.2 Composição proteica do apoplasto
Existem diversos trabalhos que mostram alterações no perfil de expressão
proteico do apoplasto em resposta a diferentes tipos de estresse como sal (GUO e
SONG, 2009; ZHANG et al., 2009) e temperatura (BRUNE, URBACH e DIETZ,
1994), ferimentos (LI e MCCLURE, 1990), infestação de insetos (WESTHUIZEN e
PRETORIUS, 1996) e invasão de patógenos (OH et al., 2005). Proteínas do apoplasto
podem ativar vias de sinalização de resposta de tolerância à seca em plantas de arroz
(GUO e SONG, 2009). O apoplasto também é um local preferencial de acúmulo de
metais pesados em plantas cultivadas na presença desses compostos. Plantas de cevada
17
cultivadas na presença de zinco, níquel e cádmio mostraram aumento expressivo da
expressão proteica no apoplasto (BLINDA et al., 1997).
As ferramentas de proteômica têm sido bastante utilizadas para analisar o
conteúdo proteico do apoplasto de diversas espécies de plantas (GAU et al., 2004; GUO
e SONG, 2009; HASLAM et al., 2006; PECHANOVA et al., 2010). A especiação pode
ocorrer ao nível do apoplasto, e devido à identificação de uma diversidade de padrões
proteicos, reflete as múltiplas funções do apoplasto (HASLAM et al., 2006). As
principais proteínas observadas nesse estudo estavam relacionadas com a resposta de
defesa (identificação de “germin-like” ou glucanases) e expansão celular (HASLAM et
al., 2006). Análises do proteoma do apoplasto de folhas e raízes de álamo mostraram
que cada apoplasto representa um conjunto de proteínas diversas indicando que a
resposta ao estresse é parcialmente compartimentado, dinâmico e necessário para a
adaptação a diferentes ambientes (PECHANOVA et al., 2010). Nesse organismo,
proteínas relacionadas aos estresses hídrico e do patógeno (Melampsora spp.) foram
abundantes, além da presença de muitas peroxidases que parecem estar envolvidas na
modificação da parede celular induzida por estresse nas fases de crescimento da planta
(PECHANOVA et al., 2010). Em direção à esses mecanismos, a indução de transcritos
gênicos relacionados às de vias de regulação redox como GST, cAPX e SOD foram
observados em folhas de Álamo (Populus spp.) após 48 de infecção com Melampsora
larici-populina (RINALDI et al., 2007).
Como o apoplasto é a interface de comunicação entre a planta e o ambiente, sua
importância na resposta de defesa em plantas é evidente (BOLWELL, 1999;
BOLWELL et al., 2002; DIAZ-VIVANCOS et al., 2006; PECHANOVA et al., 2010).
Uma das formas de se protegerem da invasão de patógenos é a secreção de proteínas
relacionadas à patogênese (Pathogenesis-Related-PR), as quais são de extrema
importância na resposta de defesa de plantas. As PRs ativam e controlam vias de
sinalização no apoplasto em resposta especificamente à elicitores liberados pela parede
celular de fungos (PECHANOVA et al., 2010; SALZER et al., 1996). Plantas de álamo
ativam proteínas PR sob estresse abiótico em ecossistemas de estuários, uma vez que
transcritos de quitinases das classes III e IV e β-1,3-glucanases foram induzidas no
apoplasto de folhas em resposta à infecção pelo basidiomiceto Melampsora sp.
(PECHANOVA et al., 2010).
18
2.5 Importância da ascorbato peroxidase (APX) na defesa de plantas
Estudos sugerem uma dupla função para as ROS em plantas. De um lado, podem
ser extremamente tóxicas ou serem moléculas importantes para a regulação de
crescimento, desenvolvimento e vias de defesa. A importância do sistema de defesa
antioxidante de plantas é observada uma vez que ocorre a indução das enzimas que o
compõe, em resposta a diferentes estresses em plantas, resultando em significante
proteção ao estresse oxidativo (BREUSEGEM et al., 2001; MITTLER et al., 2004).
Porém, a supressão da atividade de enzimas que detoxificam peróxido promove a sua
acumulação, necessária para a ativação da morte celular programada (PCD) (LEVINE et
al., 1994). As APX são parte integrante do sistema de defesa e apresentam função-chave
na redução da concentração do peróxido, um dos principais radicais livres que compõe a
explosão oxidativa (ISHIKAWA e SHIGEOKA, 2008). Plantas transgênicas de tabaco,
com a atividade suprimida da APX citosólica ou de catalase (CAT), mostraram ser
altamente sensíveis ao ataque de patógeno bacteriano (MITTLER et al., 1999). Raízes
de plantas de soja mostraram altos níveis de atividade de enzimas antioxidantes (APX,
CAT e SOD), sete dias após a infecção com o fungo Rhizoctonia solani AG-4 (JUNG
et al., 2011).
O composto ascorbato (AsA) é um potente componente tamponante que protege
o apoplasto de danos oxidativos através da remoção de ROS. Está envolvido na
fotossíntese, elongação radicular e expansão celular (NOCTOR e FOYER, 1998). É o
mais abundante antioxidante encontrado, uma vez que mais de 10% do AsA, presente
em folhas, está localizado no apoplasto e participa de importantes interações
metabólicas com função central na fotossíntese (PIGNOCCHI e FOYER, 2003;
WHEELER, JONES e SMIRNOFF, 1998). A biossíntese de AsA ocorre em tecidos de
plantas, em células de algas eucarióticas e são efetivos na regulação dos níveis de
peróxido quando acoplados ao sistema redox do ciclo AsA/glutationa. A APX é uma
enzima chave desse ciclo e utiliza o AsA como doador de elétron para reduzir o H2O2
em água com a formação de monodehidroascorbato (MDA) (ASADA, 1999;
SHIGEOKA et al., 2002). Estudos mostram que ocorre modulação de enzimas do
sistema oxidativo, bem como a indução de APX no apoplasto de folhas em resposta à
invasão de patógenos (DIAZ-VIVANCOS et al., 2006; PECHANOVA et al., 2010;
VANACKER, CARVER e FOYER, 1998). No apoplasto de folhas de Hordeum vulgare
inoculadas com o fungo Blumeria graminis foi observado o dobro da indução de APX,
19
em variedades suscetíveis quando comparadas com a variedade resistente
(VANACKER, CARVER e FOYER, 1998).
2.6 Estudos proteômicos em interações planta-patógeno
A proteômica é hoje muito mais do que um complemento de informações
genômicas. Com o rápido avanço de técnicas analíticas, os estudos de proteômica
permitem a análise de um conjunto de proteínas expressas por um genoma em
determinadas condições. A expressão específica de um genoma pode ser analisada pela
proteômica, que oferece a possibilidade do estudo simultâneo do perfil proteico presente
em uma unidade biológica, e que dependem de diversos fatores como fisiologia,
estresses bióticos e abióticos. Um gene pode gerar diversas ou apenas uma proteína,
além disso, modificações pós-traducionais podem afetar a estrutura, localização ou
função de uma macromolécula. Como podemos saber quando e onde um produto gênico
está sendo expresso e qual a sua concentração relativa? Portanto, o conjunto de
metodologias de análise proteômica, aliada às ferramentas de bioinformática, hoje são
determinantes para a elucidação dessas informações (PANDEY e MANN, 2000;
VALLEDOR e JORRÍN, 2011).
Grandes progressos têm sido realizados no estudo proteômico de fungos. Isso se
deve muito ao aumento do número da disponibilização dos genomas desses organismos,
aliado à modernização das técnicas e equipamentos na preparação de amostras,
separação de proteínas com alta resolução e de softwares específicos (GONZÁLEZ-
FERNÁNDEZ, PRATS e JORRÍN-NOVO, 2010). As sequências geradas por projetos
genomas não são suficientes para elucidar funções biológicas, entretanto, os genomas
são imprescindíveis para a continuidade de estudos posteriores como o perfil de
expressão de uma proteína em um tecido ou célula (MEHTA et al., 2008). Nesse
sentido, a proteômica é complementar a genômica, uma vez que, seu foco é no produto
gênico, aqueles que são os agentes ativos das células, sendo, portanto, dados bastante
informativos. Além disso, a existência de ORFs, nos dados gerados pelos projetos
genoma, não implicam, necessariamente, na existência de um gene funcional, já que não
há uma correlação direta entre os níveis de RNAm e de expressão protéica (GYGI et al.,
1999; PANDEY e MANN, 2000).
Atualmente, ferramentas analíticas de proteômica são robustas e altamente
sensíveis, favorecendo um estudo detalhado de proteínas de tecidos ou de organismos.
20
Estudos de proteômica comparativa podem ser feitos por eletroforese em gel ou
cromatografia líquida (MEHTA et al., 2008; TAN et al., 2009; WASHBURN,
WOLTERS e YATES, 2001). Como uma ferramenta pioneira nesse tipo de estudo, a
eletroforese em gel bidimensional (2-DE) ainda é a mais utilizada por ser de baixo custo
e de fácil manipulação, apesar de ser bastante trabalhosa e de difícil reprodutibilidade.
Desenvolvida para resolver misturas proteicas de alta complexidade, nessa técnica as
proteínas são separadas de acordo com dois parâmetros distintos. Na primeira dimensão
as proteínas são separadas pelo seu ponto isoelétrico (pI) e na segunda, separadas por
suas massas moleculares, sendo utilizado a focalização isoelétrica e a eletroforese em
gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE), respectivamente para cada dimensão
(FARRELL, 1975). Apesar das limitações de rendimento desta técnica (em comparação
com LC-MS), até 5000 spots podem ser resolvidos (FARRELL, 1975; LÓPEZ, 2007).
Além disso, em um laboratório equipado e experiente, os géis 2-DE são fáceis de
manusear e apresentam alto custo-benefício para análises de rotina associados com boas
ferramentas de bioinformática, favorecendo a escolha dessa técnica para a maioria dos
estudos comparativos (GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ, PRATS e JORRÍN-NOVO, 2010;
VALLEDOR e JORRÍN, 2011).
Apesar da sua importância, técnicas de proteômica apresentam uma série de
limitações como sensibilidade, resolução, velocidade na captura de dados, cobertura do
genoma, quantificação de proteínas e etc. Esses desafios refletem a dificuldade de se
trabalhar com uma alta diversidade biológica de proteínas e suas inúmeras propriedades
físico-químicas (GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ, PRATS e JORRÍN-NOVO, 2010).
Dos estudos proteômicos que norteiam interações planta-patógeno a maioria
compreendem a associação de plantas x fungos (GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ, PRATS e
JORRÍN-NOVO, 2010; TAN et al., 2009) e mostram que grupos de proteínas
envolvidas na proteção celular aos danos oxidativos causados por ROS são produzidos
ou regulados em resposta à infecções fúngicas (AFROZ et al., 2011). O número de
estudos proteômicos de plantas em resposta à sua interação com fungos fitopatogênicos
é bem mais extensa do que os estudos proteômicos desses fungos. Análises de géis
bidimensionais de plantas do gênero Prunus spp., infectado com Plum Plox Virus
(PPV) mostraram mudanças no sistema oxidativo do apoplasto de folhas de plantas
resistentes, como o aumento da concentração de H2O2 e de proteínas peroxidases,
especificamente a APX de classe I (Diaz-vivancos ET AL., 2006). Na análise de perfis
proteicos do fungo Trametes hirsuta em resposta ao sulfato de cobre (CuSO4), indutor
21
de lacase, ocorreu aumento do número de proteínas que regulam o enovelamento e
secreção de enzimas como chaperones e de proteínas relacionadas à biosíntese de
lacases (VASINA, LOGINOV e KOROLEVA, 2013).
A análise proteômica do M. perniciosa em resposta ao ambiente hostil
encontrado no apoplasto do hospedeiro, durante a fase parasítica do fungo, poderá
revelar informações valiosas sobre o patossistema T.cacao x M. perniciosa. Além disso,
a análise de isolados do fungo com diferentes graus de agressividade cultivados em
meios de cultura suplementados com FA foliar de plantas resistentes e suscetíveis
poderá sugerir proteínas presentes em vias diretamente relacionadas com a resposta de
patogenicidade da planta. De forma a complementar o estudo relacionado ao estresse
oxidativo que o FA de folhas de cacau pode causar ao M. perniciosa, objetivou-se
também a obtenção de uma APX citosólica de cacau para a sua caracterização
bioquímica. A busca pelas informações a respeito das ferramentas utilizadas pelo fungo
hemibiotrófico para se desenvolver em plantas resistentes de cacau é fundamental para a
concepção de estratégias racionais para o controle da doença.
3 HIPÓTESE E OBJETIVOS
3.1 Hipótese
Os componentes presentes no FA de T. cacao de plantas resistentes e suscetíveis
modulam a expressão de proteínas de patogenicidade e de estresse oxidativo do M.
perniciosa.
3.2 Objetivos
3.2.1 Geral
- Analisar o perfil proteico de dois isolados do Mp em resposta ao fluido
apoplástico de cacau de variedades extremamente susceptível (Catongo) e tolerante
(TSH 1188) ao patógeno;
- Obter a proteína Ascorbato peroxidase (APX) de T. cacao (rTc-APX) por
tecnologia do DNA recombinante e realizar a sua caracterização bioquímica;
22
3.2.2 Específicos
- Estabelecer o perfil proteico em géis 2-DE dos micélios saprofíticos dos
isolados de Mp553 (menos agressivo) e Mp565 (mais agressivo), crescidos nos fluidos
apoplásticos de cacau de variedades extremamente susceptível (Catongo) e resistente
(TSH 1188) ao patógeno;
- Comparar os perfis proteicos dos diferentes tratamentos [Controle (Crtl),
Catongo (Cat) e TSH1188 (TSH)] e descrever os spots quanto ao padrão de acúmulo
proteico;
- Identificar as proteínas por espectrometria de massas e estabelecer as
respectivas classificações funcionais;
- Contextualizar as variações no perfil protéico com a patogenicidade dos
isolados de Mp e com as respostas ao fluido apoplástico dos genótipos de cacau
resistente e susceptível ao fungo;
- Estabelecer um mapa proteômico de referência para o micélio saprofítico do
fungo M. perniciosa;
- Analisar as sequências das peroxidases codificadas pelo genoma do cacau e
estabelecer as relações filogenéticas, com foco nas ascorbato peroxidases;
- clonar, expressar e caracterizar bioquimicamente a peroxidase codificada pela
sequência depositado no Gene Bank sob o número de acesso EF533885.2.
CAPÍTULO 1 - Análise do perfil proteômico de Moniliophthora perniciosa em
resposta ao fluido apoplástico de cacau
1 RESUMO
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa (Mp) é o causador da doença
vassoura-de-bruxa, principal responsável pelo declínio da cacauicultura (Theobroma
cacau L.) no Estado da Bahia, Brasil. O Mp invade o apoplasto do cacau onde se
desenvolve até a transição para a fase saprofítica. Nós hipotetizamos que a adição de
fluido apoplástico de genótipos suscetível e resistente de cacau em meios de cultura de
Mp, pode mimetizar o ambiente de crescimento natural do fungo, influenciando a
expressão de genes candidatos, relacionados ao desenvolvimento da doença. O objetivo
23
do trabalho foi analisar a capacidade do FA de cacau, suscetível (Catongo) e resistente
(TSH1188), de modular a expressão de proteínas de patogenicidade e de estresse
oxidativo no Mp saprofítico. As proteínas totais dos isolados 553 (menos agressivo) e
565 (mais agressivo) do fungo Mp, na presença de FA das variedades resistente e
suscetível de cacau à doença vassoura-de-bruxa, foram analisadas por géis 2DE e
indentificadas por LC/MS/MS. O isolado 565 do M. perniciosa apresentou um número
menor de spots (517) quando comparado ao 553 (755). Houve diferenças no perfil de
expressão também entre os tratamentos de cada isolado, principalmente quando
observamos as amostras suplementadas com FA da variedade resistente (TSH) de cacau.
Um total de 216 proteínas foi identificado no isolado Mp553 e 311 do isolado Mp565, o
que resultou no primeiro mapa de referência proteômica do fitopatógeno M. perniciosa.
A análise das proteínas diferencialmente expressas mostrou um maior número de
proteínas localizadas no citoplasma. Os processos celulares que apresentaram maior
número de proteínas foram: processos metabólicos e de energia com 45 proteínas para o
isolado 553 e 68 para o isolado 565; processos de redução-oxidação – com 21 e 31 para
os respectivos isolados e; síntese e enovelamento de proteínas com 15 e 38 proteínas,
para cada isolado, respectivamente. Como exemplos dessa análise encontramos 2 spots
identificados como cisteína-peroxirredoxina, que foram 3.5 a 5X mais abundantes no
tratamento TSH quando comparado ao catongo. A análise do efeito do FA de variedades
resistentes e suscetíveis de cacau na expressão proteica de micélios saprofíticos sugere
que moduladores presentes na planta induzem a reprogramação proteica do M.
perniciosa. A identificação de moléculas chave envolvidas na patogenicidade do fungo
pode ser um passo fundamental para nortear novas estratégias de controle da doença.
2 INTRODUÇÃO
Interações planta-patógeno têm despertado a devida atenção há tempos na
pesquisa. As plantas podem responder ao ataque de patógenos de diversas formas. Essa
resposta depende principalmente do reconhecimento do patógeno pela planta para que
ocorra a ativação de respostas "imunes” (DANGL e JONES, 2001; JONES e DANGL,
2006). Os fungos possuem diferentes estratégias para escapar dos mecanismos de defesa
das plantas e estabelecer a infecção. Os fitopatógenos hemibiotróficos tem sido o foco
de muitas pesquisas por apresentarem sofisticados mecanismos para “enganar” plantas
hospedeiras (GOVRIN e LEVINE, 2000; KAN, VAN, 2006). O patógeno inicialmente
24
se mantém nos tecidos vivos (fase biotrófica) do hospedeiro e, em estágios mais
avançados da infecção (fase necrotrófica), causam aa morte da célula hospedeira
(GLAZEBROOK, 2005).
O fungo hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa é o agente causal de uma das
doenças mais severas do cacau. Sua introdução, nas regiões produtoras do Caribe e
América do Sul, tem causado sérios impactos sócios econômicos devido ao drástico
declínio da produção de amêndoas, principalmente no Brasil, na região Sul da Bahia. A
complexa interação desse patossistema ainda não é suficientemente compreendida.
Alguns estudos moleculares foram realizados, mas poucas são as análises de expressão
proteica do fungo na interação com a planta (ALVIM et al., 2009; OLIVEIRA, DE et
al., 2012; THOMAZELLA et al., 2012; VILLELA-DIAS et al., 2013).
As moléculas elicitoras têm a capacidade de induzir reações de defesa em
plantas em diversos tipos de estresses por patógenos (FERNÁNDEZ et al., 2012; REP,
2005; WIT et al., 2009). Os patógenos são capazes de liberar moléculas efetoras que
agem na supressão da resistência basal, inibindo o reconhecimento ou para ativar o
sistema de defesa de plantas. Esses efetores podem ser translocados para dentro da
célula ou secretados no apoplasto (FERNÁNDEZ et al., 2012; GLAZEBROOK, 2005;
KAN, VAN, 2006). Diversos efetores de fungos já foram estudados. O principal grupo
deles são chamados de Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs), os quais
podem ser reconhecidos por receptores de reconhecimento da planta (PPRs) (JONES e
DANGL, 2006; WIT et al., 2009). Esse reconhecimento dispara a imunidade da planta
evitando a colonização do hospedeiro. A PAMP mais conhecida de fungos é a quitina,
principal componente estrutural da parede de células fúngicas (WIT et al., 2009).
Fungos necrotróficos produzem proteínas que podem ter ação de efetores que induzem
necrose em plantas, como as proteínas indutoras de necrose e emissão de etileno (NEPs)
(WIT et al., 2009). Três NEPs do M. perniciosa foram identificadas (MpNEPs)
(MONDEGO et al., 2008). MpNEPs tem sido bastante estudadas e podem executar
funções duplas, atuando como efetoras das respostas imunes ou como fator de
virulência / toxina promovendo a necrose do tecido (GARCIA et al., 2007; OLIVEIRA,
DE et al., 2012; ZAPAROLI et al., 2011). A obtenção da estrutura cristalográfica da
MpNEP2 (ZAPAROLI et al., 2011) e, de outras proteínas consideradas como alvos
promissores para o desenvolvimento de fungicidas como a proteína de ligação ao acil-
CoA (ACBP) (MONZANI et al., 2010) e a ciclofilina do M. perniciosa (MONZANI et
al., 2011) facilitam a compreensão dos mecanismos de ação desses alvos. Estudos de
25
expressão gênica diferencial das fases mono e dicariótica do M. perniciosa resultaram
na identificação de 189 genes, os quais refletem as mudanças observadas no
metabolismo de carbono e nitrogênio na primeira fase do fungo, e genes relacionados ao
metabolismo de hexoses, amônia e fosforilação oxidativa, que estariam ligados ao
crescimento mais rápido do patógeno, na segunda fase da infecção (RINCONES et al.,
2008).
Os projetos genômicos abriram caminho para estudos mais detalhados de análise de
genômica funcional de fungos, incluindo, transcriptoma, proteoma e metaboloma
(GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ, PRATS e JORRÍN-NOVO, 2010; TAN et al., 2009). No
presente estudo foram analisados perfis de expressão proteicos miceliais do M.
perniciosa elicitado com fluido apoplástico de cacau da variedade suscetível (Catongo)
e resistente (TSH1188) por 12 horas. Dois isolados do fungo foram analisados no
estudo através do diferencial de expressão proteica por géis 2-DE. A maioria das
proteínas obtidas em gel foi selecionada para a identificação por espectrometria de
massas, resultando no primeiro mapa proteômico do M. perniciosa. Mudanças de
expressão estatisticamente significantes mostram que no isolado menos agressivo
(Mp553) houve a modulação de proteínas de metabolismo e de vias de oxidação e
redução. No isolado mais patogênico (Mp565), proteínas relacionadas ao metabolismo e
síntese de proteínas foram as mais alteradas. No trabalho são discutidas as proteínas
provavelmente envolvidas nos eventos de patogenicidade pelo fungo M. perniciosa.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material biológico e cultivo do M. perniciosa
Dois isolados do fungo foram utilizados no presente estudo. Ambos foram
isolados da região produtora de cacau do Sul da Bahia – Brasil. O isolado FA553
(CP02), utilizado para a elucidação do genoma do M. perniciosa (MONDEGO et al.,
2008), com baixo nível de infecção na variedade Catongo sem causar infecção na
variedade TSH 1188, considerado, portanto, menos agressivo (comunicação pessoal
Dra. Karina Perez Gramacho) e outro, nomeado de 565, encontrado infectando ambos os
genótipos de cacau em campo, o qual é mantido na coleção fitopatológica do M.
perniciosa (CEPLAC/CEPEC) com a correspondente numeração 921 da WFCC
(http://www.wfcc.info/index.php/collections/display). O material biológico foi
gentilmente cedido em placas com meio BDA (Batata Ágar Dextrose) sólido, pela Dra.
26
Karina P. Gramacho, pesquisadora do Centro de Pesquisa do Cacau da Comissão
Excecutiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC/CEPEC). A manutenção e o
cultivo de ambos os isolados foi feito em meio mineral sólido (Glicose 1% (p/v),
NH4H
2PO
4 0,1% (p/v), KCl 0,02% (p/v), MgSO
4.7H
2O 0,02% (p/v), CuSO
4 0,01%
(p/v), ZnSO4.7 H
2O 0,01% (p/v), extrato de levedura 0,5% (p/v), Agar 1,5% (p/v)) e
líquido, utilizado para os experimentos com o fluido apoplástico. Os micélios foram
crescidos no escuro a 25o C em BOD no período de 14 a 20 dias.
3.2 Extração do Fluido Apoplástico (FA) de folhas de T. cacao
As folhas de T. cacao das variedades Catongo (suscetível) e TSH1188
(resistente) foram coletadas do banco de germoplasma da CEPLAC/CEPEC. Em todas
as plantas, de ambas as variedades, foram observadas vassouras-secas e, portanto, as
folhas coletadas foram consideradas elicitadas pelo M. perniciosa. O número de folhas
foi estimado para a obtenção de um volume final de 15 mL de FA de cada genótipo de
cacau, resultantes da máxima centrifugação à 4000 x g, com rendimento de ~240 mL/g
de FA, de acordo com Pirovani et al (2008). As folhas foram lavadas individualmente
com água destilada gelada e as nervuras principais foram retiradas para diminuir a
concentração de goma e, durante a extração do FA, bem como facilitar a infiltração à
vácuo e liberação do fluido por centrifugação, de acordo com Pirovani et al. (2008). A
máxima centrifugação das folhas à 4000 x g à 4o C é necessária para obter o maior
rendimento proteico, no entanto, sem que ocorra a contaminação citoplasmática do FA
(PIROVANI et al., 2008). Os fluidos extraídos obtidos foram filtrados (0,22 µm) e
liofilizados (Labconco, USA) por 48 horas. O rendimento protéico esperado no FA de
ambos os genótipos foi de ~37 mg/mL (PIROVANI et al., 2008).
3.3 Crescimento de Mp em fluido apoplástico
Devido à dificuldade de tempo e manutenção do fungo M. perniciosa na fase
monocariótica, principalmente para o cultivo do Mp553, foi utilizado micélios da fase
dicariótica para os experimentos (MEINHARDT et al., 2006). Seis discos de Mp
(isolados 553 e 565) retirados de micélios crescidos em placa contendo meio mineral,
cultivados de 10-13 dias, foram inoculados em erlenmeyers com 30 ml de meio mineral
27
líquido com os antibióticos estreptomicina (10mg.mL-1), cloranfenicol (34mg.mL-1) e
ampicilina (50mg.mL-1), totalizando 2 frasco para cada tratamento. Os frascos foram
incubados à 25oC sob leve agitação por 7 dias. O meio líquido de crescimento foi
descartado e o micélio foi lavado com água destilada estéril. Ao micélio dicariótico foi
adicionado 30 ml de meio mineral líquido suplementado com a fração sólida resultante
de 15 ml de FA liofilizado das variedades Catongo e TSH1188 e sem a adição do fluido
(amostra controle). Deu-se continuidade ao crescimento dos isolados nos três
tratamentos: controle, catongo e TSH, durante 12 horas. Durante esse período de
crescimento foi obtido alta concentração de massa micelial, não sendo necessário
extender o período de crescimento de ambos os isolados. Após o período de
crescimento, o micélio foi novamente lavado e separado do meio de cultura por
filtração. As amostras de micélio foram liofilizadas e acondicionadas em freezer -80oC.
3.4 Extração de proteínas do fungo M. perniciosa
O micélio liofilizado e congelado foi triturado em almofariz com N2 líquido até
a obtenção de um pó bem fino. Uma massa em torno de 0,02 – 0,05 g do pó foram
obtidos. A extração foi realizada segundo Pirovani et al (2008). O precipitado final
obtido foi lavado duas vezes com a solução 0,1 M de acetato de amônio em metanol
(gelado) e após, lavado mais duas vezes com a solução de acetona 80% (gelada). Os
sobrenadantes foram descartados em todas as etapas de lavagens e o precipitado foi seco
à temperatura ambiente. As amostras foram solubilizadas em solução tampão de
reidratação (ureia 7 mol.L-1, tiourea 2 mol.L-1, CHAPS 1 %, DTT 0,1 mol.L-1, IPG 0.5%
pH 3–10 NL e traços de azul de bromofenol). Os extratos protéicos obtidos foram
quantificados através do 2-D Quant-kit (GE Healthcare), usando albumina do soro
bovino (BSA), como padrão. As amostras também foram analisadas por SDS-PAGE
(Laemmli, 1970) em minicubas de eletroforese (Omniphor) com géis de 8 x 10 cm,
contendo 12,5% de acrilamida.
3.5 Eletroforese Bidimensional (2-DE-bi-Dimensional Electrophoresis) e SDS-
PAGE:
A primeira dimensão, composta pela focalização isoelétrica (IEF), foi realizada com
a aplicação de 350 µg de proteínas de cada amostra em strips de 13 cm, com gradiente
28
de pH imobilizado 3 a 10 NL (pH 3-10NL, 130 × 3 × 0.5 mm; GE Healthcare,
Immobiline™ Dry-Strip). As strips foram alocadas na unidade de Focalização
Isoelétrica Ethan IPGphor III com os seguintes passos: 1 h a 500 Vh, 1 h e 4 min a
1000 Vh, 2 h e 30 min a 8000 Vh e 22 min a 8000 Vh) à 20ºC. Em seguida, as strips
foram tratadas (2 x 15 min) em tampão de equilíbrio (urea 6 mol.L-1, SDS 2%, glicerol
30%, Tris–HCl 0,05 mol.L-1, pH 8.8) contendo DTT 1% e iodoacetamida a 2,5% e em
tampão de corrida 1X ( Tris, 0,025 mol.L-1, Glicina 0,19 mol.L-1, SDS 0.1%, pH 8.3),
sob agitação lenta. A segunda dimensão foi feita em gel de poliacrilamida 12,5 % (12
ml de 29,2 %/0.8% (w/v) Acrilamida/Bis-acrilamida, 7.5 ml de 1.5 mol.L-1 Tris-HCl
(pH 8.8), 0.15 ml de persulfato de amônio10 % (p/v), 0.02 ml of TEMED e 10.2 ml de
água) no sistema de eletroforese vertical HOEFER SE 600 Ruby (Amersham
Bioscience). As strips equilibradas foram alocadas no topo do gel e seladas com 1% de
agarose contendo traços de azul de bromofenol. Um total de 3 corridas de cada amostra
foram realizadas, contabilizando triplicatas de gel para cada análise.
3.6 Análise da imagem dos géis pelo programa Image Master
Os géis resultantes da eletroforese 2-DE foram fixados em solução contendo
etanol 40% e ácido acético 10% por 1 h e finalmente transferidos para o azul de
coomassie brilhante G-250 (NEUHOFF et al., 1988). As imagens dos géis foram
digitalizadas com o scanner LabScanner (Amersham Bioscience) e analisados com o
ImageMaster 2D Platinum 7.0 (GE Healthcare) considerando a área e intensidade dos
“spots”. As amostras controles foram comparadas com as amostras tratadas com fluido
apoplástico das variedades suscetível (Catongo – Cat) e resistente (TSH1188 – TSH) de
cacau. A análise de spots diferenciais foi baseada no cálculo da ANOVA. O cálculo foi
feito para cada dois tratamentos, sendo Controle x Cat, Controle x TSH e, Cat x TSH,
em ambas as análises dos isolados 553 e 565 do M. perniciosa. Apenas valores de p <
0.005 e spots com variações de intensidade (fold) ≥ 1.5 foram considerados como
diferenciais.
29
3.7 Extração de peptídeos em gel e análise por espectrometria de massas
(LC/MS/MS)
Os spots de interesse foram excisados a partir do gel 2-DE e a digestão tríptica foi
realizada de acordo com SHEVCHENKO et al (2006). Misturas de peptídeos foram
analisadas por “online nano flow liquid chromatography tandem mass spectrometry”
(LC-MS/MS) em um cromatógrafo nanoAcquity (Waters, Milford, MA) acoplado ao
espectrômetro de massas Q-Tof micro (Waters), de acordo com Oliveira et al (2012). Os
dados brutos de MS e MS/MS foram processados pelo software ProteinLynx v2.3
(Waters) e pesquisados contra o banco de dados NCBInr através do servidor MASCOT
(http://www.matrixscience.com/). Os parâmetros utilizados para a pesquisa foram os
seguintes: digestão pela enzima tripsina, carbamidometil (Cys) como modificação fixa e
oxidação (Met), como modificação variável; máximo de uma perda de sítio de
clivagem; e ±0.3 Da para o erro de tolerância de peptídeos e 0.1 Da para erros dos íons
fragmentados.
3.8 Categorização funcional de proteínas
As sequências FASTA das proteínas identificadas foram obtidas a partir dos
números de acesso resultantes da busca pelo software MASCOT
(http://www.matrixscience.com/). Essas sequências foram submetidas à anotação
funcional pelo software BLAST2GO (http://www.blast2go.com/b2ghome) e,
posteriormente, categorizadas em oito classes relacionadas à função e processos
celulares específicos (Figura 8).
4 RESULTADOS
4.1 Perfil proteico do micélio saprofítico de Mp em resposta ao cultivo com FA de
T. cacao.
O protocolo de extração das proteínas foi eficiente e resultou em massa
suficiente para triplicatas de amostra proteica para os experimentos de gel 2-DE. Com o
intuito de avaliar a integridade das amostras extraídas, uma massa de 30 μg de cada
amostra foi aplicada em duplicata em gel SDS-PAGE 12,5% (Figura 2). A figura 2
mostra bandas bem definidas de 14 a 97 KDa. Bandas diferenciais para o isolado 565
30
são mostradas entre 45 e 66 kDa, mas o perfil protéico apresenta-se bastante semelhante
entre os dois isolados (553 e 565). Não foram observadas bandas diferenciais
significativas entre os tratamentos Controle (Crtl) Catongo (Cat) e TSH1188 (TSH) de
cada isolado.
Figura 2 Perfil de proteínas totais em SDS-PAGE 12,5% do M. perniciosa
(isolados 553 e 565) cultivados em meio de cultura sem FA (Crtl) e aqueles
cultivados em FA dasvariedades Catongo (Cat) e TSH1188 (TSH) de T. cacao. A
região marcada por uma elipse mostra bandas de proteínas diferencialmente expressas
no isolado 565, quando comparado ao isolado 553.
31
A revelação dos géis 2DE dos respectivos isolados mostra o perfil proteico para
os três tratamentos (Crtl, Cat e TSH) de cada isolado (Figura 3).
Figura 3 Perfil proteico em géis 2DE dos isolados 553 e 565 de Mp.
Géis 2DE de referência para os três tratamentos (Controle, Catongo e
TSH1188) revelados por Comassie-Blue e digitalizados com LabScan para
análise no Software ImageMaster (GEHealthcare).
32
4.2 Perfil de spots de proteínas do gel 2-DE
A análise do número de spots obtidos nos perfis protéicos dos isolados 553 e 565
foi organizada em diagramas de Venn. A figura 4 mostra um número total de 755 spots
para o isolado 553 em contraste com 517 spots para o isolado 565 e o número de spots
para cada amostra analisada: Crtl, Cat e TSH (Figura 4). Observamos valores bem
semelhantes de spots exclusivos na amostra controle, em ambos os isolados, sendo 24
para o Mp553 e 20 para o Mp565. Entretanto uma grande diferença foi observada no
número de spots nos tratamentos Cat e TSH entre os isolados (Figura 4). O Mp553
apresentou 89 proteínas exclusivas em resposta ao FA da variedade suscetível de cacau
(Cat) contrastando com apenas dois spots para o isolado mais agressivo Mp565. No
tratamento com FA de variedades resistentes de cacau (TSH), observamos 24 spots
exclusivos no isolado Mp553 contra 138 spots do Mp565. Apesar da diferença
observada no número de spots totais entre os isolados, o tratamento com TSH resultou
em um número de spots totais semelhante aos induzidos nos dois isolados, sendo 524
spots para o Mp553 e 495 spots para o Mp565 (Figura 4A e B).
A
33
B
O número de spots identificados também foi organizado em Diagramas de Venn
para cada tratamento e isolado do fungo (Figura 5). Para tanto, um total de 216 spots
foram identificados do isolado Mp553 (Figura 5A) e 311 spots do Mp565 (Figura 5B).
Um total de 163 spots comuns aos três tratamentos foi identificado no perfil protéico do
Mp553 e 205 spots do Mp565. Um número bastante expressivo de spots foi identificado
para o Mp565 em resposta ao tratamento com TSH (Figura 5B) e reflete o número total
de spots obtidos para esse tratamento (Figura 4B).
Figura 4. Número de spots de proteínas totais do gel 2-DE. Diagrama de
Venn dos spots totais obtidos do perfil proteico dos isolados Mp553 (A) e Mp565 (B) e
entre os tratamentos com o FA das variedades Catongo (Cat) e TSH1188 (TSH) de T.
cacao e da amostra contole (Crtl).
34
A
B
Figura 5. Número de spots de proteínas identificadas do gel 2-DE.
Diagrama de Venn dos spots identificados em cada tratamento nos respectivos
isolados Mp553 (A) e Mp565 (B), observados no perfil proteico do Mp em resposta ao
FA das variedades Catongo (Cat) e TSH1188 (TSH) de T. cacao e da amostra controle
(Crtl).
35
4.3 Análise do perfil proteico em resposta aos tratamentos com FA das
variedades Cat e TSH
O perfil proteico dos dois isolados do fungo M. perniciosa foi analisado por gel 2-
DE e Q-TOF, resultando no mapa de referência do isolado 553 que pode ser visualizado
na Figura 6. As respectivas identificações dos spots nos géis podem ser visualizadas na
tabela 1A e B (Anexos).
Figura 6 Mapa de referência do perfil proteico do isolado Mp553 em
resposta ao crescimento no FA da variedade Cat (maior número de spots). Os spots
identificados em vermelho correspondem às proteínas que apresentaram expressão
diferencial (p≤0.005 e fold ≥1.5) entre os tratamentos Crtl, Cat e TSH (variação da
expressão pode ser visualizada na Tabela 2A- Anexos).
KDA
97
14.4
36
O maior número de sequências identificadas em ambos os isolados do fungo
correspondeu às proteínas do M. perniciosa, Laccaria bicolor e Coprinopsis cinerea
(Figura 7).
4.4 Proteínas identificadas e diferenciais
A identificação das proteínas obtidas no perfil proteico micelial dos isolados
Mp553 e Mp565 é mostrada na Tabela 1A e B (Anexos ), respectivamente. As proteínas
que apresentaram padrões de acúmulo diferenciais em resposta aos tratamentos com FA
de Cat ou TSH são mostradas na Tabela 2A e B (Anexos), respectivamente. Dentre as
proteínas identificadas, apenas as diferencialmente significantes (anova p≤ 0.005 e fold
≥ 1.5) foram categorizadas de acordo com sua função fisiológica e processos
moleculares, baseado na análise do Gene Ontology pelo software Blast2GO
(http://www.blast2go.com) (Figura 8). Buscando uma análise global das funções e
processos envolvidos das proteínas identificadas, as mesmas foram separadas nas
seguintes categorias e foram representadas de acordo com as porcentagens de proteínas
que compõe cada categoria: A- Síntese de proteínas e folding, representada por 12% e
16% pelo Mp553 e Mp565, respectivamente; B - Metabolismo e energia (composta
0%
10%
20%
30%
40%
50%
M.
pe
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C.
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a
L. b
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its_
BLA
ST
Species
Mp553
Mp565
Figura 7. Identificações por espécies de fungos pelo Blast2GO. Principais
espécies resultantes das identificações da análise do perfil proteômico do M.
perniciosa, isolados 553 e 565, indicados na figura.
37
pelas reações de catabolismo), sendo 35% e 30%; C - Transcrição/ transdução de sinal,
sendo 14% e 8%; D - resposta à estresse, 6% e 8%; E - processos de oxidação-redução,
16% e 13%; F - Processos biossintéticos, sendo 10% e 11%; G – Proteínas estruturais –
5% e 8%; e H – Desconhecidas (proteínas hipotéticas e/ou sem função descritas), sendo
2% e 6% (Figura 8).
Todas as categorias apresentaram variação do acúmulo em resposta aos FA de
Cat e TSH em ambos isolados, sendo que o número de proteínas moduladas em resposta
ao FA de TSH foi muito mais expressivo do que com o FA de Cat, principalmente
devido ao alto número de spots exclusivos observados em resposta a esse tratamento
(Tabela 2A e B – Anexos). No isolado 565 o número de proteínas que foram moduladas
em ambos os tratamentos foi muito maior ao observado no 553.
Figura 8. Categorização funcional de proteínas diferencialmente expressas
de Mp553 e Mp565 em resposta ao FA de Catongo e TSH1188. O número de
sequências e a correspondente porcentagem estão indicados na figura.
38
De acordo com a categorização das proteínas diferenciais de ambos isolados,
proteínas relacionadas à síntese de proteínas e folding (categoria A – Figura 8), foram
representadas principalmente por proteínas ribossomais, heat shock proteins (HSPs) e as
que compõem o complexo proteassomal (Tabela 2A e B – Anexos). Em nossas análises
identificamos sete spots de cada isolado que correspondem a proteínas do complexo
proteassomal (20s, 26s e 60s). No isolado 553, dos sete spots identificados (46, 60, 403,
410, 414, 706 e 742), dois apresentaram acúmulo reduzido na amostra tratada com FA
de Cat, sendo ausentes no TSH e dois foram únicos (706 e 742) no tratamento com
TSH. No isolado 565, dos sete spots (59, 301, 333, 375, 418, 419, 422) três foram mais
abundantes em ambos os tratamentos e outros três (375, 419, 422) foram únicos para o
tratamento TSH.
Muitos fatores de iniciação eucarióticos foram identificados em ambos isolados
do M. perniciosa, sendo 11 spots (0, 42, 70, 174, 278, 279, 281, 291, 386, 388 e 499) do
isolado 565 e 9 spots do Mp553 (8, 90, 132, 162, 189, 332, 336, 378 e 732). Dentre
esses, o spot 378 foi mais abundante no Cat e menos abundante no TSH e o spot 732 foi
exclusivo para o Crtl. Os spots 388 e 386 foram exclusivos para o tratamento com TSH.
Em nossas análises identificamos nove spots correspondentes às HSPs no
isolado 553, sendo dois com acúmulos diferenciais (7 e 282) e aumentados em resposta
ao o FA de TSH e Cat, respectivamente (Tabela 2A- Anexos). No isolado 565, foram
identificados 22 spots, sendo cinco diferenciais (26, 243, 350, 474 e 475) com variações
no acúmulo dessas proteínas de acordo com o tratamento. Os spots 474 e 475 foram
exclusivos para o tratamento com TSH (Tabela 2B - Anexos).
O maior número de proteínas identificadas (Tabela 1A e B – Anexos) e com
acúmulo diferencial (Tabela 2A e B – Anexos) foram agrupadas na categoria B
(metabolismo e energia) e compõe a via glicolítica como fosfoglicerato quinase (PGK),
frutose bisfosfato aldolase, gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH), ATP
sintase e enolase. E proteínas que compõe a via de gliconeogênese, como triose fosfato
isomerase, aspartato aminotransferase e fosfoglucanato desidrogenase (6-
phosphogluconate dehydrogenase) (Figura 8).
Em nossas análises, foram detectados dois spots de PGK no micélio de 553 (534
e 589) e 3 spots no 565 (126, 348 e 483), sendo o spot 126 aumentado (2X) no
tratamento com FA de Cat em relação ao Crtl e o 483 foi detectado como exclusivo no
tratamento com FA de TSH. As enolases também foram identificadas em ambos os
isolados do M. perniciosa representadas por 7 spots no 565 e 2 no 553, sendo o spot 154
39
aumentado 2X no tratamento com FA de TSH. A proteína GAPDH foi identificada em
12 spots no isolado 553, destes, três spots (92, 96 e 446) apresentaram acúmulo
diferencial com aumento de 2X em relação ao Crtl e a amostra tratada com FA de TSH.
No isolado 565 foram identificados 14 spots, sendo dois spots com acúmulo diferencial
(71 e 76) em relação ao Crtl e 1 aumentado, o qual só foi detectado nas amostras
tratadas com FA de Cat e TSH.
As enzimas S-adenosil-L-homocisteína hidrolase (Sahh), 5-
metiltetraidropteroiltriglutamato-homocisteína metiltransferase e metionina sintase não
dependente de cobalamina (MetE) são proteínas relacionadas com a biossíntese de
metionina e processos metabólicos de carbono. Um total de sete spots desse grupo
foram identificadas no 553 (139, 140, 263, 308, 309, 553 e 660), entretanto não foram
observadas como diferenciais para esse isolado. No isolado 565, 14 spots foram
correspondentes a essas proteínas (6, 18, 49, 101, 110, 115, 118, 123, 181, 263, 265,
268, 269 e 327), e o spot 327 foi diferencial, uma vez que não foi detectado na amostra
Crtl e sua abundância foi maior no tratamento com FA de Cat (1.84X) do que com TSH
(Tabela 2B). Outras proteínas importantes no processo metabólico são as Acetil-CoA C-
acetyltransferases também chamadas de 2-metilacetoacetil tiolase e a acetil-CoA
hidrolase. Dois spots (119 e 454) dessas proteínas foram identificados, os quais foram
menos abundantes no isolado 553 em resposta aos tratamentos com FA das variedades
de cacau. No isolado 565, identificamos quatro spots (09, 299, 336 e 461)
correspondentes à identificação de Acetil-CoA C-acetyltransferases, sendo 09, 336 e
461 também diferenciais.
Algumas proteínas foram identificadas com função relacionada à transdução de
sinais (categoria C) como, 14-3-3, ATPases, proteína ativadora de GTPase Ran-
específica, proteína de ligação à GTP, quinona oxirredutases dependente de NADH,
“voltage-dependent íon”, sintase do ATP e sintase do ATP vacuolar. Em nossas análises
a enzima GTPase Ran-específica foi identificada como um único spot (64) no isolado
553, sendo reduzida a sua abundância no tratamento com TSH. No isolado 565 foram
identificados dois spots diferenciais (406 e 430), os quais não foram observados na
amostra Crtl e Cat, apenas no tratamento com TSH. As proteínas do tipo ATP sintase
vacuolar, relacionadas ao transporte de vesículas, foram identificadas no isolado 553
(216, 219 e 494) e foram reprimidas nos tratamentos.
As proteínas relacionadas com eventos de defesa e estresse como, aegerolisinas,
ciclofilina, HSP, 14-3-3, erilisina e GAPDH foram agrupadas na categoria D. Apesar da
40
proteína GAPDH apresentar importante função na categoria B, também foi considerada
como uma provável proteína de patogenicidade do M. perniciosa (LIMA et al., 2009;
RINCONES et al., 2008). A análise da categoria D mostrou a identificação de seis spots
de aegerolisina (189, 208, 209, 210, 211 e 212) no Mp565 e um spot (248) no Mp553.
Em ambos os isolados do fungo, essa proteína apresentou diferencial entre os
tratamentos Cat e TSH (Tabela 2A e B – Anexos). No 553, o único spot foi aumentado
1.7X no Cat e 2.54X no TSH. No isolado 565, houve aumento de acúmulo no
tratamento com Cat e diminuição no TSH. No spot 212, a proteína foi diminuida no
TSH 2.4X em relação ao Cat. Ciclofilinas foram detectadas com expressão diferencial
em ambos isolados do M. perniciosa. No 553 foi observada apenas no tratamento com
FA de Cat e, nos tratamentos com FA de Cat e TSH, para o 565. Não houve ocorrência
dessas proteínas nas análises das amostras Crtls. Outras proteínas também foram
relacionadas à resposta a estresse como Catalase, GAPDH, leucil aminopeptidase
(identificado no isolado 553 - spot 33 e up-regulado no tratamento com TSH), alfa beta-
hidrolase (um spot identificado no 553 e 6 spots no 565 - 67, 98, 99, 102, 106 e 459,
sendo o 459 e o 106 diferencialmente expresso) e proteína de ligação ao oxisterol
(proteínas relacionadas à regulação celular e metabolismo de lipídios). Um spot
diferencial foi identificado apenas no isolado 565, o qual foi menos abundante nos
tratamentos Cat (1.9X) e TSH.
Proteínas relacionadas às funções redox, foram agrupadas na categoria E, como
superóxido dismutase (SOD), cisteína-peroxirredoxina (Prxs), catalase (CAT) e aldo-
ceto redutases (AKs). As cisteína-peroxirredoxinas apresentaram abundância bastante
alterada em resposta aos FA das variedades de cacau. Na análise do Mp565, os spot 303
e 304 apresentaram acúmulo elevado nos tratamentos com FA de Cat e TSH, e o spot
407 foi exclusivo de TSH. Na amostra controle, esses spots não foram detectados. O
spot 303 apresentou aumento de 3.5X em TSH quando comparado ao Cat. No estudo
com o isolado 553, o único spot identificado (396) foi detectado na amostra Crtl,
diminuída na amostra Cat e não detectada na TSH. No isolado 553 foram identificados
sete spots de catalase (3, 4, 5, 223, 234, 235 e 236), sendo que o spot 223 foi mais
abundante no tratamento com FA de TSH. No isolado 565, foram identificados 4 spots.
Um total de 14 Aldo-ceto redutases (AKs) foi identificado no isolado 553 (9, 78,
79, 80, 81, 83, 117, 126, 360, 491, 560, 562, 743 e 750), sendo 8 spots diferenciais
menos abundantes nos tratamentos Cat e de forma mais drástica no TSH. Com destaque
para os spots 78 e 80 que apresentaram diminuição de até 15X e 7,7X, respectivamente
41
no TSH, comparado à amostra Crtl. No isolado 565 foram identificadas apenas 4 AKs
(04, 46, 316, 362), sendo que os spots 316 e 362 não foram detectados na amostra
controle, mas sim nos tratamentos Cat e TSH.
Outras enzimas envolvidas nos processo de redução-oxidação foram moduladas
em resposta aos tratamentos com FA de Cat e TSH como, NADH ubiquinona
oxidoredutase (Complexo I), malato desidrogenase (MDH) e álcool desidrogenase
(ADH) e NADH desidrogenase (NDI1). Dessas enzimas dois spots foram identificados
no 553 (37 e 595) e três no 565 (256, 398 e 399), sendo mais abundante no tratamento
com FA de TSH nos spots 398 e 399. MDH foi menos abundante (spot 77 e 88) e única
no tratamento com Cat (spot 710) no Mp553 e foi aumentada no isolado 565, sem
detecção na amostra Crtl (spots 315, 435, 437, 438 e 453).
Proteínas estruturais foram agrupadas na categoria G, como proteínas
ribossomais e actina. A actina foi identificada em quatro spots no 553 e destes, dois
foram menos abundantes no tratamento com FA de Cat e não foi observado spot
correspondente no tratamento com TSH. No isolado 565 essa proteína foi aumentada
em ambos os tratamentos em três spots (24, 325, 378) de sete identificados (24, 94, 108,
324, 325, 351, 378).
4.5 - Menor abundância de proteínas no isolado Mp553 em resposta ao FA de cacau
Em uma análise global, um maior número de proteínas categorizadas para o
isolado Mp553 apresentou acúmulo reduzido em resposta aos FA dos genótipos de
cacau quando comparados ao tratamento Crtl, sendo < 60% o número de proteínas com
aumento de acúmulo (up-reguladas) no Cat (Figura 9A) e < 32% de proteínas com
aumento de acúmulo no TSH (Figura 9B). A diferença da redução do acúmulo de
proteínas é evidenciada quando comparados os tratamentos Cat e TSH, sendo < 25% o
número de proteínas com aumento de acúmulo (Figura 9C). Ao contrário dessa
observação, a análise das proteínas diferenciais mostrou que o isolado 553 (Controle –
Crtl) elicitado com os genótipos suscetível (Cat) e resistente (TSH) de cacau, apresentou
aumento do acúmulo na totalidade das proteínas relacionadas à resposta de defesa e
estresse (D) (Figura 9A e B), também observado na comparação entre os isolados
tratados (Figura 9C). Na comparação entre a amostra controle e a tratada com FA de
Catongo, ocorreu aumento da abundância proteínas diferenciais (100%) relacionadas a
42
processos biossintéticos (F), em contraste com o tratamento com FA de TSH, que
apresentou abundância reduzida dessas proteínas (82%). Também foi observada a
diminuição da abundância de proteínas relacionadas aos processos de redução-oxidação
(E) quando o fungo foi tratado com o FA de TSH (68%) (Figura 9B). Esse resultado
fica mais evidente quando comparados os dois tratamentos Cat e TSH (Figura 9C).
Proteínas estruturais (G) foram menos abundantes na totalidade em ambos os
tratamentos (Figura 9A e B) e entre os tratamentos (Figura 9C). Proteínas sem função
conhecidas foram aumentadas em resposta ao FA da variedade Catongo (50%) (Figura
9A) e diminuídas no tratamento TSH e entre os tratamentos (100%).
4.6 Maior abundância de proteínas no isolado Mp565 em resposta ao FA de cacau
Um aumento global de todas as proteínas com acúmulo diferencial no isolado
565 foi observado em resposta ao fluido apoplástico das variedades Cat (>60%) e TSH
(>70%) de cacau, com exceção das proteínas de resposta a estresse (D), as quais foram
totalmente diminuídas no Cat (100%) e TSH (50%) (Figura 9D e E) e entre os
Figura 9. Contribuições das categorizações de funções moleculares de
proteínas com aumento de acúmulo (up - preto) ou redução de acúmulo (down-cinza)
em resposta aos tratamentos Cat x Crtl (A/D), TSH x Crtl (B/E) e Cat x TSH (C/F), de
acordo com os isolados Mp553 e Mp565 indicados.
43
tratamentos 37,5% (Figura 9F). Quatro categorias foram mais abundantes no tratamento
TSH em relação ao Cat, uma vez que a categoria síntese de proteínas e folding (A)
apresentou 63% de aumento da abundância no tratamento Cat e 88% no TSH;
metabolismo e energia (B) apresentou 76% no Cat e 84% no TSH, resposta a estresse e
defesa (D), de 0% no Cat para 50% no TSH e, oxidação-redução (E) passaram de 75%
mais abundantes no Cat para 86% no TSH. Observa-se que o número total de proteínas
com maior ou menor abundância no TSH foi bem mais elevado do que o número total
de proteínas moduladas no Cat. Três categorias foram menos abundantes no tratamento
TSH como transcrição/transdução de sinal (C) que apresentou 27% de redução
percentual no tratamento TSH, bem como a categoria de processos biossintéticos, com
redução de 3,5% e a categoria de proteínas estruturais (G) de 100% para 94%.
5 DISCUSSÃO
A proteômica comparativa e a indução de genes de patogenicidade em fungos
têm sido bastante utilizadas para desvendar os eventos que levam ao desenvolvimento
de doenças fúngicas em diversos organismos (DOYLE, 2011). No presente trabalho foi
analisada a modulação do perfil protéico do micélio saprofítico de dois isolados do M.
perniciosa através do seu crescimento em meio de cultura suplementados com fluido
apoplástico (FA) das variedades suscetível, Catongo (Cat) e resistente, TSH1188 (TSH)
de cacau à VB. O trabalho resultou no primeiro mapa proteômico do fungo M.
perniciosa. A maior parte das proteínas que foram identificadas, de ambos os isolados
do fungo, apresenta maior similaridade às proteínas de Laccaria bicolor e Coprinus
cinerea (Figura 7), corroborando com a análise de sequências observadas no
sequenciamento do M. perniciosa, que apresenta alta similaridade de genes de fungos
basidiomicotas, como Laccaria bicolor e Cropinus cinerea, do que com Ascomicotas
(MONDEGO et al., 2008).
O gel SDS-PAGE 1DE é considerado uma ferramenta bastante informativa na
obtenção de resultados preliminares aos estudo com o gel 2-DE (GONZÁLEZ-
FERNÁNDEZ, PRATS e JORRÍN-NOVO, 2010). Apesar de seu uso ser mais comum
em análises de proteínas secretadas, devido à menor complexidade da amostra, foram
observadas bandas de proteínas induzidas no isolado 565 quando comparados com o
isolado 553, resultantes das amostras complexas do extrato total de proteínas do micélio
saprofítico do M. perniciosa na análise prévia do SDS-PAGE (Figura 2).
44
A análise do número total de spots obtido para os perfis protéicos de Mp553 e
565 (Figura 4A e B), sugere uma resposta específica do M. perniciosa relacionada às
variedades de cacau em estudo, uma vez que um número expressivo de spots exclusivos
(89) foi observado para o tratamento Cat (figura 4A), no perfil do Mp553, e 138 spots
exclusivos do Mp565, em resposta ao tratamento com o TSH (Figura 4B). A diferença
observada no número de proteínas moduladas no 565 também pode ser devido ao fato
de termos identificado 95 proteínas a mais no Mp565 (311 proteínas identificadas-
Figura 5B/ Tabela 1A - Anexos) em relação ao Mp553 (216 proteínas identificadas)
(Figura 5A /Tabela 2A- Anexos).
O aumento da atividade de peroxidases, especificamente do tipo APX, em
plantas resistentes de cacau (CAMILLO et al., 2013), parece acompanhanhar o aumento
do peróxido no ambiente de infecção observado nessas plantas (DIAS et al., 2011). Essa
análise sugere que o FA de plantas resistentes apresente uma composição alta de ROS e
corrobora com nossos resultados de indução da expressão de proteínas de redução e
oxidação (categoria E) no isolado 565 (90% up reguladas) e repressão dessas no isolado
553 (25% up reguladas), que apresenta baixa infecção no Catongo e não causam doença
em TSH.
5.1 Classificação funcional de proteínas diferencialmente expressas
A concentração das proteínas diferencialmente expressas categorizadas foi
proporcional em ambos os isolados, uma vez que foram identificadas mais proteínas do
Mp565 em relação ao Mp553 (Figura 5). Como mostrado na figura 8, o maior número
de proteínas diferencialmente expressas está relacionada ao metabolismo. Alterações de
expressão de proteínas de metabolismo são comumente observadas em estudos
proteômicos de organismos submetidos à estresse (GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ,
PRATS e JORRÍN-NOVO, 2010) e podem ser devido à técnica de gel 2-DE favorecer a
observação de proteínas mais abundantemente expressas. A via glicolítica desempenha
um papel central no metabolismo energético celular, sendo proteínas dessa via, as mais
expressas em diferentes organismos (COBOS et al., 2010). Síntese de proteínas e
folding representaram o segundo maior grupo categorizado para o isolado 565 (16%),
sugerindo que a ativação metabólica e a síntese de novas proteínas estejam relacionadas
à patogenicidade do M. perniciosa, uma vez que a modulação de proteínas dessa
45
categoria foi observada em resposta, principalmente, ao FA de TSH para o Mp553 e
para os FA de Cat e TSH no Mp565.
Proteínas relacionadas a processos de redução e oxidação foram o segundo
maior grupo encontrado entre as proteínas diferencialmente expressas do isolado 553
(16%), indicando a necessidade do fungo em responder ao alto estresse oxidativo da
planta resistente (TSH) durante o processo de infecção da doença VB. A observação de
múltiplos spots de uma mesma proteína sugere a ocorrência de modificações pós-
traducionais como, fosforilação, glicosilação, N-acetilação e proteólise.
A repressão generalizada de proteínas diferencialmente expressas no isolado 553
corrobora com a resistência da variedade TSH sob infecção pelo Mp553 (Figura 9B)
(CAMILLO et al., 2013; DIAS et al., 2011; GESTEIRA et al., 2007; RINCONES et al.,
2008) o qual foi isolado no período em que houve a detecção da VB no Estado da
Bahia, em 1989 (PEREIRA et al., 1996). As plantas coletadas no banco de
Germoplasma da CEPLAC (ver seção 5.1) não se encontram em casa de vegetação,
sendo expostas às infecções pelas diversas linhagens do fungo que ocorrem no campo.
Essa observação sugere que as variedades coletadas se apresentem com os mecanismos
de defesa elicitados e, portanto, podem estar mais resistentes ao Mp553. Em contraste, a
análise de proteínas diferencialmente expressas do Mp565 evidenciou aumento
generalizado de expressão, o que corrobora com a capacidade desse isolado de causar
doença em ambas as variedades de cacau utilizadas em nosso estudo. A completa
repressão de proteínas categorizadas como de resposta a estresse (categoria D) na
comparação dos tratamentos Crtl e Cat do Mp565 (Figura 9D) sugere que esse isolado
não ativa os seus mecanismos contra estresse no contato inicial com o genótipo de cacau
suscetível. Porém, em resposta ao FA de plantas de cacau resistentes (TSH1188), o
sistema de defesa deve ser acionado no contato inicial com a planta, para que o Mp565
consiga desenvolver a doença nessas plantas (Figura 9E). Isto é, se o micélio dicariótico
e monocariótico apresentarem comportamentos similares, quando em contato com
tecido vivo do hospedeiro.
46
5.1.1 Síntese de proteínas e folding
O proteassoma degrada proteínas ligadas covalentemente por ubiquitinas. Essa
atividade proteolítica é dependente de ATP. O proteassoma é essencial para a regulação
dinâmica entre a síntese e degradação de proteínas, como aquelas com erros no seu
enovelamento. A modulação dessas proteínas observadas especificamente nos spots
exclusivos no Mp553 (706 e 742) e Mp565 (375, 419, 422) em resposta ao tratamento
com FA de TSH e a up-regulação de três spots (12, 33 e 48) em ambos os tratamentos
no Mp565, bem como a indução de fatores eucarióticos, como o eIF5a (HENDERSON
e HERSHEY, 2011), indicam a ocorrência de reprogramação proteica do M. perniciosa
em resposta aos FA de T. cacao.
Muitas proteínas “Heat shock” (HSP) foram identificadas em nossas análises.
HSPs tem função de manutenção de proteínas em sua correta conformação (folding) e
previnem a agregação de proteínas de organismos submetidos a estresse, bem como em
processos celulares normais (WANG et al., 2004). Devido à importância de suas
funções, diversos trabalhos mostram que essas proteínas apresentam aumento de
expressão em resposta a diversos estresses abióticos e bióticos (WANG et al., 2004). .
O ambiente hostil da planta, em resposta à infecção, pode causar desenovelamento de
proteínas e o aumento da expressão de HSPs do fungo, o que sugere uma maior
resistência do M. perniciosa ao ambiente de estresse da planta durante a infecção
(COOPER, GARRETT e CAMPBELL, 2006). A indução dessas proteínas é
evidenciada no Mp553 em resposta aos FA de Cat e TSH, spots 7 e 282,
respectivamente. No Mp565 os spots 474 e 475 foram exclusivos ao tratamento TSH. A
HSP70 foi detectada na parede celular de C. albicans e essa localização sugere um
mecanismo de virulência desse fungo (EROLES et al., 1997). HSP70 também pode
atuar de forma a inibir a PCD (CHAVES et al., 2011). Neste caso, o aumento da
expressão dessas proteínas pode indicar um aumento na tolerância do fungo ao estresse
no interior da planta. O aumento específico de 2X dessa HSP foi observado no Mp553
em resposta ao tratamento com o FA de TSH (spot 7), sugerindo que constituintes do
FA da variedade resistente de cacau possam sinalizar proteínas de proteção do fungo M.
perniciosa.
47
5.1.2 Metabolismo, energia e processos biossintéticos
O maior número de proteínas identificadas e diferencialmente expressas compõe
a via glicolítica como fosfoglicerato quinase (PGK), frutose bisfosfato aldolase,
gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (GAPDH), ATP sintase (atp synthase f1 beta
subunit) e enolase e, a via de gliconeogênese, como triose fosfato isomerase (triose
phosphate isomerase), aspartato aminotransferase (aspartate aminotransferase) e
fosfoglucanato desidrogenase (6-phosphogluconate dehydrogenase). Proteínas como
triose fosfato isomerase, acetil transferases, aspartato amino trasnferases, enolase e 14-
3-3 também apresentam importância em diferentes processos biossintéticos. A indução
dessas proteínas favorece a manutenção da produção de ATP pelo fungo, além disso,
podem agir como elicitores, uma vez que enzimas glicolíticas de Candida albicans
podem elicitar resposta imune em humanos (ALLOUSH et al., 1997; DOYLE, 2011).
Chaffin et al alerta sobre a possibilidade de que muitas das proteínas de vias
metabólicas, que apresentam funções citoplasmáticas, inclusive indicadas pelo nome
dos seus genes correspondentes, podem se localizar em outro local (CHAFFIN, 2008).
A incorporação de algumas proteínas citosólicas imunogênicas como, enolase e HSP70,
na parede celular de fungos pode representar um mecanismo de virulência para a
sobrevivência do fungo (EROLES et al., 1997). Essas proteínas, chamadas de
multifuncionais, tais como fructose-bisfosfatoaldolase, triose fosfatoisomerase,
gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enolase, foram identificadas em nossas análises.
A PGK, além de compor a via glicolítica também apresenta atividade de fosforilação de
proteínas. PGK é uma proteína de parede celular de C. albicans (ALLOUSH et al.,
1997; PITARCH et al., 2002) e sua detecção também foi observada no estudo
proteômico do micélio do fungo Metharhizium acridum (BARROS et al., 2010). Em
nossas análises, foram detectados dois spots dessa proteína no micélio de Mp553 (534 e
589) e 3 spots no Mp565 (126, 348 e 483), sendo o spot 126 up-regulado (2X) no
tratamento com FA de Cat em relação ao Crtl e o 483 foi detectado como exclusivo no
tratamento com FA de TSH.
A enolase ou fosfopiruvato hidratase é uma enzima importante da glicólise.
Também são consideradas como as principais proteínas de parede celular associadas à
glucanas em C. albicans e, portanto, são proteínas imunogênicas (ANGIOLELLA et al.,
1996; DOYLE, 2011). O fato de estarem associadas à parede pode facilitar sua
translocação (CHAFFIN, 2008), sendo também identificadas em análises de proteínas
48
secretadas por fungos, como Aspergilus fumigatus (WARTENBERG et al., 2011) e
Trichoderma reeesei (JUN, GUANGYE e DAIWEN, 2013). As enolases também foram
identificadas em ambos os isolados do M. perniciosa e apresentou up-regulação de 2X
(spot 154) no tratamento com FA de TSH.
A GAPDH é uma enzima chave da via glicolítica que catalisa a conversão de
gliceraldeído-3-fosfato a 1,3-bisfosfo glicerato com concomitante redução de NAD+. É
considerada uma proteína multifuncional (DEVEZE-ALVAREZ, GARCÍA-SOTO e
MARTÍNEZ-CADENA, 2001) que pode ser encontrada na parede celular de fungos
(LIM et al., 2001; PITARCH et al., 2002), sendo uma proteína imunorreativa de
bastante interesse na produção de vacinas (DELVECCHIO et al., 2006). A GAPDH
pode ser exportada como um fator de virulência (EGEA et al., 2007) além de contribuir
na adesão ao hospedeiro mostrando ser uma proteína importante para a patogenicidade
(BARBOSA et al., 2006). Portanto, o potencial desta enzima como alvo poderá ser
futuramente estudado neste patosssistema. Em estudos de GAPDH em M. perniciosa,
esse gene foi usado como endógeno para análises de expressão gênica do fungo nas
fases biotrófica e saprofítica (RINCONES et al., 2008). O gene GAPDH de M.
perniciosa foi analisado por Lima et al (2009) e sua sequência apresentou alta
similaridade com GAPDH de outros fungos, plantas e animais. Nesse estudo, a análise
de expressão de transcritos desse gene, também em cultivo de M. perniciosa com
extratos de cacau, mostrou um aumento de ~ 1.3X no micélio dicariótico quando
comparado ao micélio monocariótico (LIMA et al., 2009). Em nossas análises, um
número expressivo dessa proteína foi identificado, sendo 12 spots para o 553 e 14 spots
no 565. Os spots 92, 96 e 446 foram up-regulados 1.8X, 1.78X e 2.27X,
respectivamente, em resposta ao FA de TSH. No isolado 565, dois spots diferenciais
foram reprimidos (71 e 76) em relação ao Crtl e 1 spot (449) exclusivo foi detectado nas
amostras tratadas com FA de Cat e TSH. Devido à sua importância na glicólise e em
outras vias não glicolíticas, variações na atividade de GAPDH podem influenciar outras
atividades celulares, capacitando o fungo a ambientes desafiadores ou em diferentes
condições de crescimento. Mais estudos devem ser realizados direcionando essa enzima
como um alvo para o desenvolvimento de drogas antifúngicas.
A hidrolase da S-adenosil-L-homocisteine (Sahh), 5-
metiltetraidropteroiltriglutamato-homocisteina metiltransferase e a sintase da metionina
dependente de cobalamina (MetE) são proteínas relacionadas com a biossíntese de
metionina e processos metabólicos de carbono. A expressão diferencial da Sahh só foi
49
observada no Mp565, uma vez que o spot 327 não foi detectado na amostra Crtl e sua
expressão foi maior no tratamento com FA de Cat (1.84X) do que com TSH (Tabela
2A). A Sahh é uma das proteínas mais conservadas em S. cerevisae e apresenta função
central de regulação nos processos de metilação e no metabolismo de metionina
(TEHLIVETS et al., 2013; TURNER et al., 2000). A deleção de Sahh causa redução da
virulência do fungo patogênico Cryphonectria parasitica e aumento expressivo de
transcritos de outros genes presentes na via de metilação (LIAO et al., 2012). A deleção
de Sahh também reduziu de forma significante o nível de transcritos da ciclofilina A
(também encontrada em nossas análises), bem como genes das vias de sinalização da
proteína G heterodimérica (LIAO et al., 2012). Dada à importância dessas proteínas no
metabolismo celular, um número expressivo delas era esperado em nossas análises
(Tabela 1A e B – Anexos). As Sahh foram encontradas em maior número no isolado
565 e mostraram serem diferenciais nos tratamentos com FA de cacau, sugerindo que
esta seja uma proteína envolvida nos processos de patogenicidade do M. perniciosa.
Outras proteínas importantes no processo metabólico são as Acetil-CoA C-
acetiltransferases também chamadas de 2-metilacetoacetil tiolase e a acetil-CoA
hidrolase que promovem a quebra de acetil-CoA em acetato e CoA, as quais são
necessárias para a biossíntese de compostos essenciais como ácidos graxos e esteróis,
bem como para a acetilação de proteínas, incluindo as histonas (HYNES et al., 2011).
Possivelmente, essas proteínas podem estar envolvidas na biossíntese de ergosterol, um
lipídio específico de fungos (LOGUERCIO-LEITE, DRESCHLER-SANTOS e
ABRÃO, 2006). O ergosterol é um componente chave da parede celular fúngica e sua
ausência pode causar alterações na permeabilidade da membrana e inibição do
crescimento (COWEN e STEINBACH, 2008). Por essas razões a via de biossíntese do
ergosterol é um importante alvo para o desenvolvimento de drogas antifúngicas
(COWEN e STEINBACH, 2008). Em leveduras, o metabolismo de acetil-CoA induz a
acetilação de histonas e ativa a transcrição, sendo uma via de controle para a regulação
de crescimento e proliferação celular (CAI e TU, 2011). Essas proteínas foram
reprimidas no isolado 553 em resposta aos tratamentos com FA das variedades de
cacau. No isolado 565 foram induzidas pelos FA de Cat e TSH e sugere um mecanismo
de manutenção da integridade da membrana e acetilação de proteínas como resposta do
fungo aos constituintes de defesa da planta presentes no FA.
50
5.1.3 Transdução de sinal
Algumas proteínas foram identificadas com função relacionada à transdução de
sinais como, 14-3-3, ATPases, proteína de ativação GTPase Ran-específica, proteína de
ligação à GTP, NADH quinona oxirredutase, proteínas canal de íon-seletivo voltagem-
dependentes, ATP sintases e ATP sintases vacuolares. Em uma análise mais ampla,
proteínas de funções relacionadas à transdução de sinal foram induzidas no isolado 565
e reprimidas no 553.
Proteínas GTPase são uma grande família de enzimas hidrolases (hidrolizam
GTP) com domínio RanA, conhecidas por serem up-regulados nas fases iniciais de
crescimento de leveduras. As proteínas GTPases desempenham um papel importante em
diversos processos como, transdução de sinal nos domínios intracelulares de receptores
transmembranas, biossíntese de proteínas nos ribossomas, translocação de proteínas
através da membrana e transporte de vesículas (CHANDLER et al., 2008). Essas
proteínas estão envolvidas na facilitação do transporte de materiais através da
membrana nuclear, assim como na regulação da atividade mitótica (CHANDLER et al.,
2008), sendo necessária para uma divisão nuclear simétrica e para a integridade do
envelope nuclear (GONZALEZ et al., 2009). Em nossas análises a proteína de ativação
GTPase Ran-específica foi reprimida no tratamento com TSH (spot 64). No isolado
565, dois spots (406 e 430) foram exclusivos do tratamento com TSH. Proteínas ATP
sintases vacuolares, relacionadas ao transporte de vesículas, foram reprimidas nos
tratamentos Cat e TSH. Citocromo B5 é uma proteína de baixo peso molecular e
cilíndrica. Essa proteína encontra-se ligada à membrana, consistindo de seis regiões α-
hélice e cinco β-sheet com o grupo heme voltado para a região citosólica, funcionando
como um carreador de elétron para uma variedade de mono-oxigenases. Essa proteína
forma um complexo com outra heme proteína denominada citocromo férrico P450 e
está envolvida em diversos mecanismos, tais como, anabolismo de ácidos graxos e
esteróides e catabolismo de xenobióticos e compostos endógenos (SCHENKMAN e
JANSSON, 2003). Essa proteína foi exclusiva no tratamento com TSH (spot 376), do
isolado 565. No isolado 553 essa proteína (spot 749) foi reprimida nos tratamentos Cat e
TSH. Proteínas de vias de sinalização demonstram serem cruciais para a virulência de
diversos fungos fitopatogênicos (GONZÁLEZ-FERNÁNDEZ, PRATS e JORRÍN-
NOVO, 2010).
51
5.1.4 Proteínas de resposta à defesa
Hemolisinas são uma classe de proteínas-toxinas com ação citolítica, ou seja, são
capazes de interagir com ligantes específicos na superfície de diversos alvos celulares e
formar poros na membrana. Elas são muito bem estudadas em bactéria sendo
consideradas proteínas de virulência (NAYAK, GREEN e BEEZHOLD, 2013). Apesar
dos recentes estudos de hemolisinas de fungos, sua função também está relacionada ao
de fatores de virulência (ABAD et al., 2010). Aegerolisinas e pleurotolisinas compõe a
classe de hemolisinas. Com funções também relacionadas ao desenvolvimento,
transcritos de aegerolisinas e pleurotolisina foram diferencialmente expressos na
formação de basidiomas de M. perniciosa (PIRES et al., 2009). Em nossas análises
identificamos apenas a erilisina b, que pertence ao grupo das aegerolisinas. Em ambos
os isolados do fungo, essa proteína apresentou diferencial entre os tratamentos Cat e
TSH (Tabela 2A e B – Anexos). No Mp553, o único spot identificado foi up-regulado
1.7X no Cat e 2.54X no TSH. No isolado 565, houve aumento de expressão no
tratamento com Cat e repressão no TSH, uma vez que o spot 212 pareceu ser reprimido
no TSH 2.4X em relação ao Cat. A expressão diferencial observada sugere que essas
proteínas tenham atividade na presença do hospedeiro. Entretanto, alguns estudos
mostram que a formação do complexo para causar ação lítica é dependente da erilisina
A, não identificada em nossas análises (SHIBATA et al., 2010). Como diversas
proteínas observadas no gel 2DE não foram identificadas, esta proteína pode estar entre
estas. Uma família de aegerolisinas (6) identificada no genoma do M. perniciosa, não
foi observada para outros fungos da Ordem Agaricales, como L. bicolor, C. cinerea e P.
chrysosporium, sugerindo a importância dessa proteína no desenvolvimento específico
do M. perniciosa e na defesa do fungo em processos infecciosos (MONDEGO et al.,
2008).
As HSPs também são proteínas envolvidas na resposta de defesa. (WANG et al.,
2004) e sua importância já foi discutida.
A 14-3-3 é uma proteína que apresenta função no desenvolvimento e na resposta
a estresse, uma vez que atua em diversos processos biológicos através de interações
proteína-proteína (HEUSDEN, VAN, 2009; WURTELE et al., 2003). Podem modular a
expressão dos genes induzíveis por estresse através da regulação da atividade e, ou a
localização de fatores de transcrição, além de apresentar função anti-apoptótica
(revisado por (ROBERTS, SALINAS e COLLINGE, 2002). Não identificamos a
52
proteína 14-3-3 no isolado 553, entretanto, três spots (432, 462 e 495) foram
identificados no Mp565 e foram spots exclusivos nos tratamentos com FA de TSH (432
e 462) e Cat (495).
As ciclofilinas apresentam atividade de peptidil-prolil cis-trans isomerase,
proteínas consideradas como chaperones moleculares (WANG et al., 2004). São
essenciais para capacitar agentes patogênicos fúngicos de causar doenças em animais e
plantas (CHEN et al., 2011). Essas proteínas foram detectadas apenas no tratamento
com Cat, no Mp553 e em ambos os tratamentos, no Mp565. Chen et al (2011) relatou
que a ciclofilina A é necessária à virulência do fungo fitopatogênico C. parasítica. A
super expressão da ciclofilina A em S. cerevisae promove tolerância a diversos estresses
como o oxidativo por metais e peróxido de hidrogênio (KIM et al., 2010). A ciclofilina
A é um dos alvos promissores para o desenvolvimento de drogas antifúngicas e a sua
estrutura em M. perniciosa já foi elucidada (MONZANI et al., 2011). O fato do isolado
553 não causar doença na variedade TSH, e o isolado 565 causar doença em ambas as
variedades, corrobora com a observação dos spots encontrados em nossas análises e
sugere a importância da proteína ciclofilina na patogenicidade do M. perniciosa.
5.1.5 Proteínas de redução-oxidação
Diferentes organismos estão sujeitos a condições de estresse oxidativo. Seja por
condições normais ou por aquelas causadas por diversos estresses. A explosão
oxidativa, que ocorre na interface patógeno-hospedeiro resulta no intenso estresse
oxidativo tanto no hospedeiro como no patógeno. Nesse sentido, os mecanismos de
detoxificação enzimáticos são necessários para o equilíbrio redox intra e extracelular
que incluemas enzimas superóxido dismutase (SOD), peroxirredoxinas (Prxs) e
catalases (CAT), as quais compreendem as primeiras enzimas de combate às ROS
(CAMILLO et al., 2013; HELLER e TUDZYNSKI, 2011). As SODs catalizam a
conversãodo superóxido (O2–) em O2 e H2O2. Em nossa análise apenas um spot foi
identificado como SOD no Mp 565 e foi exclusivo do tratamento com FA de TSH.
As peroxirredoxinas (Prxs) compreendem uma grande classe de tiol-peroxidases
capazes de degradar peróxidos. Essas proteínas são sensíveis à oxidação, servindo como
mediadoras de transdução de sinal, atuando como sensores no processo de oxirredução
(POYNTON e HAMPTON, 2013). Dentre a grande classe das peroxirredoxinas, todas
53
as identificações obtidas em nossas análises corresponderam à cisteína-
peroxirredoxinas. Na análise do Mp565, os spots 303 e 304 apresentaram elevada
expressão nos tratamentos com FA de Cat e TSH, e o spot 407 foi exclusivo de TSH.
Na amostra controle, esses spots foram ausentes. O spot 303 apresentou aumento da
expressão 3.5X em TSH quando comparado ao Cat. No estudo com o isolado 553, o
único spot identificado (396) foi detectado na amostra Crtl, reprimida na amostra Cat e
não detectada na TSH. Prxs são proteínas altamente abundantes, responsáveis por até
1% do total de proteínas de alguns organismos. Devido à sua abundância, é comum sua
expressão alterada em estudos proteômicos em resposta ao estresse oxidativo, ou na
forma de proteínas que são submetidas a mudanças redox em células ou tecidos
expostos ao estresse oxidativo (POYNTON e HAMPTON, 2013). Cobos et al (2010)
observou que o aumento de expressão de peroxiredoxinas poderia estar ligado ao
aumento de estresse oxidativo gerado em videiras em resposta à infecção pelo
fitopatógeno Diplodia seriata. Essa proteína foi anteriormente relacionada à maquinaria
de defesa do fungo M. perniciosa como uma das enzimas atuantes no processo de
combate ao estresse oxidativo (MONDEGO et al., 2008). Essa informação corrobora
com nossos dados, uma vez que as folhas das variedades de Cat e TSH de cacau foram
coletadas no banco de germoplasma, essas plantas estavam sujeitas a infecção prévia
pelo M. perniciosa. Portanto, essas plantas deveriam ter níveis aumentados de H2O2 em
resposta à infecção pelo fungo (BOLWELL et al., 2002; DIAS et al., 2011; CEITA et
al., 2007) e, provavelmente, tenham sido responsáveis pelo aumento na expressão das
peroxirredoxinas do Mp565 e repressão pelo Mp553, menos agressivo. Portanto, o
aumento da expressão de peroxirredoxinas em isolados de fungos sugere significante
contribuição ao desenvolvimento de respostas dadas pelo fungo em um processo
infeccioso (COBOS et al., 2010). Especificamente ao M. perniciosa, os dados sugerem
que o Mp565, por causar a doença VB em ambas às variedades, seja mais tolerante aos
compostos reativos do hospedeiro.
A catalase decompõe o H2O2 em água e oxigênio molecular (O2). Essas enzimas
estão envolvidas na virulência e tolerância ao estresse oxidativo (WANG et al., 2013;
ZHANG, HENDERSON e GURR, 2004). O spot 223 de Mp553 foi up-regulado no
tratamento com FA de TSH. No isolado 565, o spot 195 foi reprimido no tratamento
com FA de TSH. Provavelmente, a repressão dessa enzima no isolado 565 sugere a
manutenção da alta concentração de peróxido no meio, facilitando a infecção do
54
hospedeiro pelo M. perniciosa na fase dicariótica do fungo (GOVRIN e LEVINE,
2000).
Aldo-ceto redutases (AKs) se ligam ao cofator nicotinamida e catalisam a
redução de aldeídos e cetonas. Devido à sua metabolização de uma ampla gama de
substratos, é um alvo potencial para o desenvolvimento de drogas (JEZ et al., 1997).
AK foi relacionada com a produção da AF-toxina1, do fitopatógeno A. alternata,
necessária ao desenvolvimento de doença em diferentes plantas (ITO et al., 2004). A
detecção do acúmulo de transcritos de AK foi observada na fase necrotrófica do M.
perniciosa (LEAL JR, ALBUQUERQUE e FIGUEIRA, 2007) e descritas no genoma
do fungo (MONDEGO et al., 2008). Um total de oito spots do Mp553 foram reprimidos
nos tratamentos Cat e de forma mais drástica na presença do FA de TSH. Com destaque
para os spots 78 e 80 que apresentaram repressão de até 15X e 7,7X, respectivamente,
no TSH comparado à amostra Crtl. No isolado 565, os spots 316 e 362 foram exclusivos
em resposta aos tratamentos com FA de Cat e TSH. Os dados sugerem que as AKs
estejam relacionadas à patogenicidade do M. perniciosa, podendo ser considerados
possíveis proteínas-alvos para o estudo desse fungo.
A NADH desidrogenase (NDI1) ou complexo I é uma enzima chave da cadeia
respiratória mitocondrial, sendo crucial para a produção de energia na célula. É uma
importante fonte de espécies reativas de oxigênio na mitocôndria e contribuem de forma
significativa ao estresse oxidativo celular (BRIDGES, BIRRELL e HIRST, 2011). A
NDI1 foi induzida no Mp565, no tratamento com FA de TSH (398 e 399). A respectiva
enzima de S. cerevisae é homóloga aos indutores de apoptose e media apoptose em
resposta a indutores de estresse como o peróxido, independente da sua atividade como
ubiquinona oxirredutase (CUI et al., 2012). A indução de SOD e NDI1 em resposta ao
tratamento com FA de TSH sugere a geração de um ambiente altamente oxidativo nas
mitocôndrias do isolado 565, resultando na alta produção de ATP.
A MDH está envolvida na regeneração de NADH. Essa proteína foi reprimida
(spot 77 e 88) e única no tratamento com Cat (spot 710) no Mp553 e spots exclusivos
foram detectados no isolado 565 em resposta aos FA de Cat e TSH (spots 315, 435, 437,
438 e 453). Semelhante aos nossos resultados, o proteoma de isolados com diferentes
graus de virulência do fungo B. cinerea indicou aumento expressivo de MDH no
isolado mais agressivo, sugerindo que essa proteína tenha ação de um fator de
patogenicidade do fungo (FERNÁNDEZ-ACERO et al., 2007).
55
As álcool desidrogenases (ADHs) são enzimas oxidorredutases que catalisam a
oxidação reversível de álcools para aldeídos ou cetonas, com concomitante redução de
NAD+ou NADP+e representam um importante papel no metabolismo energético de
organismos procariotos e eucariotos (SMIDT, DE, PREEZ, DU e ALBERTYN, 2008).
Nós identificamos uma ADH de cada isolado, porém no 565 o spot foi up-regulado
(319) em resposta a ambos os tratamentos. A identificação de duas ADHs em Diplodia
seriata foi relacionada à patogenicidade desse fungo fitopatógeno que causa doença em
videiras (COBOS et al., 2010). No estudo de proteômica comparativa nas formas de
levedura e micélio, do fungo dimórfico Ustilago maydis, essa proteína apresentou
aumento de expressão no crescimento filamentoso (BÖHMER et al., 2007). O aumento
de expressão em nossas análises também sugere sua função no crescimento micelial ou
na produção de alguns componentes necessários para a síntese da parede celular de
hifas. Também sugere envolvimento dessa proteína na patogenicidade do fungo M.
perniciosa devido à sua up-regulação em resposta aos tratamentos Cat e TSH no
Mp565, capaz de desenvolver a doença VB em ambas as variedades de cacau e por
apresentar intenso crescimento na fase necrotrófica.
O estudo do genoma do M. perniciosa demonstrou que esse fungo apresenta
grande potencial de detoxificação, conferindo alta habilidade adaptativa (MONDEGO et
al., 2008). O número de proteínas diferencialmente expressas relacionadas aos
processos de redução e oxidação em ambos isolados do M. perniciosa (553 e 565)
corrobora com os dados de genoma desse fungo. Na interação planta-fungos
patogênicos o estresse oxidativo é um dos primeiros eventos a ocorrer para ambos os
organismos (BOLWELL et al., 2002). Agentes patogênicos necrotróficos possuem a
capacidade de ativar o sistema antioxidante, podendo causar a PCD no hospedeiro e
favorecer a sua instalação (GOVRIN e LEVINE, 2000). Unger et al (2005) sugere uma
relação na modulação de espécies reativas no hospedeiro de acordo com a agressividade
do patógeno (UNGER et al., 2005). Nesse sentido, em nossas análises foi observada a
diminuição de proteínas relacionadas ao processode redução-oxidação em resposta ao
estresse oxidativo gerado pela presença do FA de Cat e TSH no isolado Mp553, menos
agressivo e a indução dessas proteínas no Mp565 (mais agressivo)
56
5.1.6 Proteínas estruturais
O gene da actina foi interpretado por Jin (JIN et al., 1999) e Leal (LEAL et al.,
2010) como um indicador de crescimento micelial dos fungos hemibiotróficos
Colletotrichum gloeosporioides e M. perniciosa, respectivamente. Em nossas análises
identificamos quatro spots no Mp553 e destes, dois foram reprimidos no tratamento com
FA de Cat e não foi observado spot correspondente no tratamento com TSH. Os dados
sugerem que o crescimento do Mp535 foi reprimido em resposta ao FA de Cat e
provavelmente não houve expressão detectável dessa proteína no fungo crescido com
FA de TSH devido à esse isolado não causar doença nessa variedade. No isolado 565
essa proteína foi up-regulada em ambos os tratamentos em três spots (24, 325, 378) e
sugere um intenso crescimento do fungo na presença de FA de ambas as variedades de
cacau, as quais esse isolado causa doença. O intenso crescimento do fungo M.
perniciosa na fase saprofítica é esperado e já foi documentado em diversos estudos
(DIAS et al., 2011; MONDEGO et al., 2008; CEITA, et al., 2007; RINCONES et al.,
2008).
Outras proteínas que compõe essa categoria e a de síntese de proteínas estão
relacionadas com a montagem da maquinaria ribossomal. Uma é a proteína acídica p0
da subunidade ribossomal 60s, que difere da grande maioria das proteínas do complexo
por ser ácida. Essa proteína faz parte de um grande grupo denominado proteína P. A
proteína p0 ajuda na formação da estrutura do ribossomo através da interação com o
rRNA 28S (HAFRÉN et al., 2013). Em Saccharomyces cerevisiae, as proteínas P
ribossomais não são totalmente necessárias para a síntese proteica, embora elas
modulem a atividade do ribossomo. Essas proteínas parecem participar através da
fosforilação/defosforilação para regulação da sua afinidade pelo ribossomo e podem
participar no controle da tradução nas células eucarióticas (SANTOS; BALLESTA
1994). A outra proteína ribossomal encontrada foi aproteína s0 da subunidade 40s, a
qual é considerada uma proteína multifuncional, sendo encontrada no citoplasma
associado à subunidade ribossomal 40S, na membrana nuclear durante a intérfase e nos
cromossomos durante a mitose.
57
6 CONCLUSÃO
A suplementação do meio de cultura com FA de variedades contrastantes de cacau
e a análise do perfil proteico dos isolados 553 e 565 do M. perniciosa nesse cultivo,
evidenciou proteínas que parecem estar relacionadas com eventos patogênicos do fungo.
Estudos de expressão gênica diferencial das fases mono e dicarióticas do M. perniciosa
mostraram previamente, que a principal diferença entre as fases de vida do fungo
correspondem à metabolização do carbono, com a indução de transcritos da glicólise e
vias de malato na fase saprofítica e repressão dessas na biotrófica. Corroborando com
esses dados, nossa análise foi realizada com o fungo na fase dicariótica e foi observado,
principalmente, a modulação de proteínas da via glicolítica, de síntese de proteínas e de
proteínas relacionadas a processo de redução e oxidação, os quais correspondem ao
intenso crescimento do fungo nessa fase e à indução de proteínas de resposta ao intenso
estresse oxidativo que ocorre na planta durante a infecção, principalmente no fungo 565
(mais agressivo). Os resultados indicam que constituintes do FA de cacau podem ter
importante função na indução de resposta de defesa à infecção pelo M. perniciosa, no
isolado 553. Nossos dados sugerem que constituintes do FA de variedades contrastantes
de T. cacao induzem o remodelamento proteico micelial do M. perniciosa de acordo
com o grau de agressividade dos isolados evidenciando uma interação específica do
patossistema M. perniciosa x T. cacao. Isso pode ser observado uma vez que um
número bastante expressivo de proteínas diferenciais foi evidenciado em resposta ao FA
de TSH no isolado 565 (mais agressivo), e mostra relação com respostas de defesa e
redox no hospedeiro, como proteínas Aldo-ceto redutases, Erilisina b, cisteína
peroxirredoxina e SOD. Os resultados do presente trabalho indicam que a análise de
isolados com diferentes graus de agressividade podem contribuir para a identificação de
alvos direta e indiretamente ligados aos mecanismos de patogenicidade do M.
perniciosa, além de trazer informações importantes a respeito do metabolismo desse
fungo em condições de estresse, simulando a infecção do hospedeiro.
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72
CAPÍTULO 2 - Tc-cAPX, a cytosolic ascorbate peroxidase of Theobroma
cacao L. engaged in the interaction with Moniliophthora perniciosa, the causing agent of witches' broom disease.
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8 Conclusão geral
- O FA de variedades contrastantes de T. cacao induziu o remodelamento proteico
micelial das vias glicolítica, de síntese de proteínas e de proteínas relacionadas
aos processos de redução e oxidação do M. perniciosa.
- A análise de isolados com diferentes graus de patogenicidade sugere uma
interação específica do patossistema M. perniciosa x T. cacao: potencial para a
identificação de alvos direta e indiretamente ligados aos mecanismos de
patogenicidade do fungo
- Variedades de cacau resistentes ao M. perniciosa mostraram aumento da
atividade de peroxidases, especialmente a atividade de APXs e sugere que a rTc-
cAPX esteja associada à essa atividade.
- A rTc-cAPX é uma cAPX com atividade de catalase e apresenta alta estabilidade
- Importância da cAPX de cacau na eliminação de peróxido na interação T. cacao
x M. perniciosa e potencial biotecnológico para futuros estudos
86
9 Anexos
87
Tabela 1A. Spots totais identificados Mp553 Spot
ID
aAcession
number Protein identification Organism
bE-value
Nominal
mass (Mr) pI cal.
cIon
Score
Coverage
%
No
peptides
0 gi|238584639
hypothetical protein MPER_10068 (*protein
kinase subdomain-containing protein pkl
ccin9)
Moniliophthora perniciosa 29565 5.65 81 4 1
1 gi|169869158 ATP-dependent RNA helicase eIF4A Coprinopsis cinerea 45456 5.15 268 15 6
3 gi|1020390 catalase Trametes versicolor 53487 6.16 90 3 1
4 gi|393230056 catalase Auricularia delicata 57462 6.75 199 6 3
5 gi|392562664 catalase Trametes versicolor 57096 6.79 254 7 4
6 gi|390594190 heat shock protein 70 Punctularia strigosozonata 67192 5.51 165 6 3
7 gi|390594190 heat shock protein 70 Punctularia strigosozonata 67192 5.51 458 13 8
8 gi|66473249 translation elongation factor 1-alpha Pycnoporus sp. 44366 8.35 354 17 6
9 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*heat
shock protein 70) Moniliophthora perniciosa 16947 5.85 172 25 4
12 gi|238500493 aryl-alcohol dehydrogenase Aspergillus flavus 42561 7,03 64 5 2
15 gi|170086043 pyruvate kinase Laccaria bicolor 58176 6,29 330 14 6
37 gi|393216393 NADH-quinone oxidoreductase Fomitiporia mediterranea 80924 6.54 146 4 3
43 gi|238579030 hypothetical protein MPER_12017 (*triose
phosphate isomerase) Moniliophthora perniciosa 27289 7.01 145 23 2
46 gi|170088512 20S proteasome subunit Laccaria bicolor 33445 5.29 194 14 4
47 gi|71005690 GTP-binding nuclear protein RAN Ustilago maydis 24485 6,6 336 23 6
55 gi|238589203 hypothetical protein MPER_08546 (*enoyl-
hydratase) Moniliophthora perniciosa 4.51E-165 28846 5.23 114 9 2
57 gi|238614224 hypothetical protein MPER_00744 (*urea
hydro-lyase cyanamide) Moniliophthora perniciosa 6.20E-62 10539 7.03 87 11 1
60 gi|67902134 hypothetical protein AN8054.2 (*proteasome
component pre6) Aspergillus nidulans 3.31E-170 29646 6.93 90 9 2
62 gi|392567169 60S ribosomal protein L7 Trametes versicolor 28757 10.18 131 10 2
63 gi|238610635 hypothetical protein MPER_01744 (*40s
ribosomal protein s1) Moniliophthora perniciosa 2.83E-108 17988 9.59 95 16 2
64 gi|336373360 hypothetical protein SERLA73DRAFT_177135
(*ran-specific gtpase-activating protein) Serpula lacrymans 4.66E-116 22311 4,8 190 15 2
65 gi|238581696 hypothetical protein MPER_11146 Moniliophthora perniciosa 2.60E-96 15511 8.3 264 33 4
88
65 gi|238581696 hypothetical protein MPER_11146
(*glucosamine-6-phosphate isomerase) Moniliophthora perniciosa 2.60E-96 15511 8.3 264 33 4
66 gi|238568133 hypothetical protein MPER_15399 (*voltage-
dependent ion-selective channel) Moniliophthora perniciosa 1.02E-67 10878 8,52 166 21 2
68 gi|148764190 guanine nucleotide binding protein beta
subunit Lentinula edodes 0 34906 5,84 564 35 9
69 gi|169847460 guanine nucleotide binding protein beta
subunit [Coprinopsis cinerea okayama7#130] Coprinopsis cinerea 35168 5.79 176 18 5
71 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 36791 7.07 72 4 1
73 gi|169844935 inorganic diphosphatase Coprinopsis cinerea 33738 5,8 275 24 6
77 gi|238601242 hypothetical protein MPER_04599 (*nad-
malate dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 0 23278 6,58 246 24 4
78 gi|238612042 hypothetical protein MPER_01338 (*aldo
keto reductase) Moniliophthora perniciosa 1.11E-93 14621 7.79 431 50 8
79 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-
keto reductase yakc) Moniliophthora perniciosa 5.08E-109 16947 5.85 257 46 6
80 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-
keto reductase yakc) Moniliophthora perniciosa 5.08E-109 16947 5.85 322 37 6
81 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-
keto reductase yakc) Moniliophthora perniciosa 5.08E-109 16947 5,85 71 14 1
82 gi|389742654 transaldolase Stereum hirsutum 36245 5.84 438 19 8
83 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-
keto reductase yakc) Moniliophthora perniciosa 1.11E-93 16947 5,85 135 26 3
85 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 36791 7.07 67 4 1
88 gi|238593443 hypothetical protein MPER_07111 (*malate
dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 8.70E-121 18178 9,5 108 24 3
90 gi|66473253 translation elongation factor 1-alpha Phaeolus schweinitzii 39018 7.29 269 13 4
92 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7,07 162 6 2
93 gi|238596758 hypothetical protein MPER_06020 (*gtp
binding protein) Moniliophthora perniciosa 6.01E-163 26935 5.6 137 12 2
94 gi|397648758 fructose-bisphosphatase Moniliophthora perniciosa 38450 6.34 107 15 3
89
96 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 77 6 1
97 gi|50313334 guanine nucleotide binding protein beta
subunit 2 Lentinula edodes 38899 6.31 57 3 1
98 gi|238591692 hypothetical protein MPER_07705 (*alpha
beta-hydrolase) Moniliophthora perniciosa 1.05E-179 27724 4.88 230 26 6
99 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 0 37133 7.07 309 14 5
102 gi|238593481 hypothetical protein MPER_07097 Moniliophthora perniciosa 2.22E-49 25022 4.44 79 7 1
104 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 55 14 1
107 gi|238578412 hypothetical protein MPER_12242
(*adenosine kinase) Moniliophthora perniciosa 0 34193 5.49 363 31 7
109 gi|238579620 hypothetical protein MPER_11800
(*glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase)
Moniliophthora perniciosa 0 35911 6.06 159 7 2
111 gi|238588592 hypothetical protein MPER_08751 (*glutamic
oxaloacetic transaminase aat1) Moniliophthora perniciosa 8.07E-147 21992 7.31 443 55 8
112 gi|238579620 hypothetical protein MPER_11800
(*glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase)
Moniliophthora perniciosa 0 35911 6.06 112 7 2
113 gi|395332128 ketol-acid reductoisomerase Dichomitus squalens 44288 9.03 387 19 6
114 gi|397648756 fructose-bisphosphate aldolase Moniliophthora perniciosa 40628 5.27 119 9 2
117 gi|238581109 hypothetical protein MPER_11362 (*aldo
keto reductase) Moniliophthora perniciosa 3.72E-177 27304 5.87 102 8 2
119 gi|238614370 hypothetical protein MPER_00701 (*acetyl-
acetyltransferase) Moniliophthora perniciosa 6.34E-115 17116 9.67 93 6 1
122 gi|238593028 hypothetical protein MPER_07256
(*aspartate aminotransferase) Moniliophthora perniciosa 1.91E-111 17324 5.26 150 22 2
123 gi|299755136 succinate-CoA ligase Coprinopsis cinerea o 45011 5.9 59 2 1
126 gi|336370011 hypothetical protein SERLA73DRAFT Serpula lacrymans 42645 6.82 59 4 2
127 gi|238607932 hypothetical protein MPER_02541 (*3-
isopropylmalate dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 9.57E-136 23173 5.65 194 25 3
131 gi|302672926 Actin-1 Schizophyllum commune 41876 5.3 443 39 10
132 gi|170083999 predicted protein (translation elongation
factor tu) Laccaria bicolor 0 48546 6.05 80 2 1
90
135 gi|154125603 hydrophobin Trichoderma virens 10689 5.12 106 17 1
136 gi|390602667 Diphosphomevalonate decarboxylase Punctularia strigosozonata 43712 6.77 148 4 2
139 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 397 16 8
140 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5,83 396 17 8
141 gi|170091668 predicted protein (*dead-domain-containing
protein) Laccaria bicolor 0 44902 5.38 303 14 6
144 gi|169853382 citrate synthase Coprinopsis cinerea 51798 7.70 136 6 3
146 gi|114155449 citrate synthase Phanerochaete
chrysosporium 49158 7.85 60 5
147 gi|388578795 DEAD-domain-containing protein Wallemia sebi 44502 5.06 196 9 4
151 gi|426201064 hypothetical protein AGABI2DRAFT_189297
(*enolase) Agaricus bisporus 0 47572 5,73 276 12 4
153 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 239 10 4
154 gi|392597904 enolase Coniophora puteana 47350 6,12 355 9 4
155 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 422 14 7
156 gi|238566324 hypothetical protein MPER_15891
(*elongation factor 1-gamma) Moniliophthora perniciosa 8.72E-93 20427 8.8 693 65 11
158 gi|238580487 hypothetical protein MPER_11585
(*uroporphyrin-iii c-methyltransferase) Moniliophthora perniciosa 0 37345 5.7 418 25 9
159 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 33864 5.18 198 16 3
160 gi|238566324 hypothetical protein MPER_15891
(*elongation factor 1-gamma) Moniliophthora perniciosa 8.72E-93 20427 8.8 411 50 8
161 gi|392597536 rab GDP-dissociation inhibitor Coniophora puteana 0 50266 5.18 346 13 6
162 gi|58758727 translation elongation factor EF1-alpha Grifola frondosa 44499 8.55 141 12 4
166 gi|393220215 ATP synthase F1, beta subunit Fomitiporia mediterranea 58129 5.89 884 37 14
167 gi|238590067 hypothetical protein MPER_08253
(*fumarate reductase) Moniliophthora perniciosa 0 35440 7.88 510 46 9
170 gi|238576965 hypothetical protein MPER_12781 (*udp-
xylose synthase) Moniliophthora perniciosa 0 45756 6.41 450 28 8
171 gi|169849981 argininosuccinate synthetase Coprinopsis cinerea 47673 361 16 7
172 gi|238612616 hypothetical protein MPER_01175 (*2-
methylcitrate dehydratase) Moniliophthora perniciosa 5.46E-111 19160 9.18 186 29 4
174 gi|238601164 hypothetical protein MPER_04624 (*26s Moniliophthora perniciosa 1.03E-94 17745 8.01 80 22 3
91
174 gi|238601164 hypothetical protein MPER_04624 (*26s
protease regulatory subunit 7) Moniliophthora perniciosa 1.03E-94 17745 8.01 80 22 3
178 gi|170097731 6-phosphogluconate dehydrogenase Laccaria bicolor 53553 6.58 185 10 4
182 gi|392558475 glycine hydroxymethyltransferase Trametes versicolor 52192 6.53 303 11 4
187 gi|238595798 hypothetical protein MPER_06327
(*glutamine synthetase guanido kinase) Moniliophthora perniciosa 2.17E-61 10577 6.58 65 9 1
189 gi|58758727 translation elongation factor EF1-alpha Grifola frondosa 44499 8.55 113 11 3
190 gi|238601659 hypothetical protein MPER_04475 (*cndp
dipeptidase) Moniliophthora perniciosa 0 36552 6.35 274 28 7
196 gi|170091726 NAD-aldehyde dehydrogenase Laccaria bicolor 54266 5.61 131 4 2
197 gi|409081292 ATP1 alpha subunit Agaricus bisporus 58272 9.15 341 18 7
198 gi|409081292 ATP1 alpha subunit Agaricus bisporus 58272 842 32 14
199 gi|169846774 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase Coprinopsis cinerea 56954 7.72 207 15 6
200 gi|401889058 ATP synthase alpha chain, precursor Trichosporon asahii 58262 8.81 85 6 2
203 gi|169861658 alpha-tubulin Coprinopsis cinerea 49695 5.13 764 41 13
204 gi|173519 alpha-tubulin 1 Schizosaccharomyces
pombe 51834 4.97 74 3 1
206 gi|169861658 alpha-tubulin Coprinopsis cinerea 49695 5.13 399 24 8
209 gi|169846774 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase Coprinopsis cinerea 56954 7.72 536 25 10
210 gi|170097792 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase Laccaria bicolor 56858 8.49 241 12 5
211 gi|389737962 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase Stereum hirsutum 56862 7.25 409 23 8
216 gi|389744866 vacuolar ATP synthase Stereum hirsutum 57577 5.42 155 8 3
217 gi|319893582 enoyl-CoA hydratase [Staphylococcus
pseudintermedius HKU10-03] 85094 5.67 63 3 2
219 gi|443922929 vacuolar ATP synthase subunit B Rhizoctonia solani 111324 8.27 329 10 7
222 gi|170090926 glucose-6-P dehydrogenase Laccaria bicolor 58107 6.63 113 5 6
223 gi|238564627 hypothetical protein MPER_16356
(*catalase) Moniliophthora perniciosa 2.98E-81 13179 7.23 207 18 3
224 gi|238613872 hypothetical protein MPER_00836 (*d-
xylulose 5-phosphate d-fructose 6-phosphate
phosphoketolase)
Moniliophthora perniciosa 2.51E-172 26063 6.75 84 4 1
227 gi|238607079 hypothetical protein MPER_02789 (*protein
14-3-3) Moniliophthora perniciosa 3.69E-139 24041 6.31 85 10 2
92
232 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 (*atp
synthase f1 alpha subunit) 0 38935 9,33 202 15 4
234 gi|409074604 hypothetical protein AGABI1DRAFT_116622
(*catalase) Agaricus bisporus 0 58867 6.45 122 4 2
235 gi|238582313 hypothetical protein MPER_10920
(*catalase) Moniliophthora perniciosa 2.98E-81 25420 7.01 250 35 6
236 gi|409074604 hypothetical protein AGABI1DRAFT_116622
(*catalase) Agaricus bisporus 0 58867 6.45 222 8 4
237 gi|7416050 Ser/Thr protein phosphatase 2A regulatory
subunit A Lentinula edodes 65698 4.88 181 18 4
245 gi|390594669 chaperonin GroL Punctularia strigosozonata 62301 5.38 97 5 2
246 gi|169867040 heat shock protein Coprinopsis cinerea 63590 5.62 84 4 2
248 gi|238579292 hypothetical protein MPER_11918 (*erylysin
b) Moniliophthora perniciosa 0 57257 5,53 114 7 3
250 gi|238592745 hypothetical protein MPER_07351
(*pyruvate decarboxylase) Moniliophthora perniciosa 1.10E-81 12990 9,37 141 18 2
251 gi|238571459 hypothetical protein MPER_14454 (*protein
disulfide isomerase) Moniliophthora perniciosa 3.57E-63 14101 4.73 65 11 1
263 gi|393215641 cobalamin-independent methionine synthase Fomitiporia mediterranea 84456 6.62 143 5 3
265 gi|393245537 heat shock protein 70 Auricularia delicata 67274 5.54 250 8 4
266 gi|299750175 transketolase Coprinopsis cinerea 69756 5.63 183 4 2
271 gi|197104268 hydantoinase/oxoprolinase
[Phenylobacterium zucineum HLK1] 125273 5.51 60 0 1
278 gi|170094730 predicted protein [ S238N-H82] (*heat shock
protein 70) Laccaria bicolor 0 67109 5.49 144 9 4
281 gi|302675266 alcohol oxidase-like protein Auricularia delicata 66574 6.11 71 1 1
282 gi|392558503 heat shock protein 90 Trametes versicolor 79860 4.96 495 11 8
292 gi|402225401 heat shock cognate 70 Dacryopinax sp. 70459 5.12 467 9
293 gi|299741158 hsp70-like protein Coprinopsis cinerea 71962 5.11 496 12 7
297 gi|238596581 hypothetical protein MPER_06078 (*related
to 5-oxoprolinase) Moniliophthora perniciosa 0 33096 5.33 114 12 3
300 gi|390598392 nucleoside diphosphate kinase Punctularia strigosozonata 16822 6.97 151 25 3
303 gi|392558503 heat shock protein 90 Trametes versicolor 79575 4.96 276 10 6
93
308 gi|393215641 cobalamin-independent methionine synthase Fomitiporia mediterranea 84456 6.62 502 8 6
309 gi|170084893 predicted protein (*cobalamin-independent
methionine synthase) Laccaria bicolor
0 84466 6.22 200 6 4
311 gi|238599066 hypothetical protein MPER_05283
(*saccharopine dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa
0 36194 7.08 237 20 5
312 gi|392597600 P-loop containing nucleoside triphosphate
hydrolase protein Coniophora puteana
94732 6.19 86 2 2
318 gi|83839213 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Lilium longiflorum] 35179 6.43 58 12 2
320 gi|170095049 40S ribosomal protein S3 Laccaria bicolor 29347 9.07 165 17 4
330 gi|238573594 hypothetical protein MPER_13892 (*leucyl
aminopeptidase) Moniliophthora perniciosa
3.21E-64 10611 4.81 131 29 2
332 gi|392571029 eukaryotic translation elongation factor 2 Trametes versicolor 94118 6.15 520 19 11
333 gi|390596872 AAA ATPase Punctularia strigosozonata 90644 4.99 440 19 12
334 gi|393213219 P-loop containing nucleoside triphosphate
hydrolase protein Fomitiporia mediterranea 94356 6.08 136 6 4
336 gi|392571029 eukaryotic translation elongation factor 2 Trametes versicolor 94118 6.15 254 5 4
346 gi|238579573 hypothetical protein MPER_11816
(*ubiquitin activating enzyme) Moniliophthora perniciosa
0 80086 5.12 137 3 2
352 gi|336366571 hypothetical protein SERLA73DRAFT_114391
(*actin-like atpase domain-containing
protein)
Serpula lacrymans
93795 6.72 67 3 2
356 gi|238592543 hypothetical protein MPER_07419 (*copper
radical oxidase) Moniliophthora perniciosa
6.53E-61 10676 5,39 101 13 1
360 gi|302688305 hypothetical protein SCHCODRAFT_81685
(*aldo keto reductase) Schizophyllum commune
0 37370 6,05 70 3 2
367 gi|238571459 hypothetical protein MPER_14454 (*protein
disulfide isomerase) Moniliophthora perniciosa
3.57E-63 14101 4.73 60 11 1
378 gi|145228831 eukaryotic translation initiation factor 5A Aspergillus niger 18007 5.31 83 7 1
381 gi|238611634 hypothetical protein MPER_01448 (*duf985
domain-containing protein) Moniliophthora perniciosa
1.83E-67 11742 5.07 112 28 2
396 gi|238604003 hypothetical protein MPER_03743 (*cysteine
peroxiredoxin) Moniliophthora perniciosa
5.37E-81 13731 8,15 282 52 5
397 gi|238579030 hypothetical protein MPER_12017 (*triose Moniliophthora perniciosa 2.40E-173 27289 7.01 257 24 5
94
397 gi|238579030 hypothetical protein MPER_12017 (*triose
phosphate isomerase) Moniliophthora perniciosa
2.40E-173 27289 7.01 257 24 5
400 gi|238600428 hypothetical protein MPER_04860 (*dimeric
alpha+beta barrel) Moniliophthora perniciosa
2.05E-112 18141 6.95 114 22 3
402 gi|238614224 hypothetical protein MPER_00744 (*urea
hydro-lyase cyanamide) Moniliophthora perniciosa
6.25E-62 10539 7.03 58 11 1
403 gi|336369489 hypothetical protein SERLA73DRAFT_182590
(*proteasome subunit) Serpula lacrymans
0 28209 7.03 191 13 4
405 gi|238588357 hypothetical protein MPER_08828
(*argininosuccinate synthetase) Moniliophthora perniciosa
0 32205 5.05 206 13 3
406 gi|71020461 hypothetical protein UM04314.1 (*actin
depolymerizing factor) Ustilago maydis
1.13E-88 15905 5.55 63 8 1
410 gi|302672998 hypothetical protein SCHCODRAFT_79949
(*20s proteasome subunit) Schizophyllum commune
0 28759 5.91 56 5 1
411 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 (*atp
synthase f1 alpha subunit) Moniliophthora perniciosa
0 38935 9,33 352 24 6
414 gi|7141245 26S proteasome regulatory ATPase subunit
S10b [Vitis riparia]
21913 4,86 110 20 3
417 gi|164658722 hypothetical protein MGL_2282 (*60s
ribosomal protein l2) Malassezia globosa
0 27601 10,89 109 11 2
420 gi|33339126 actin Musa acuminata 41893 5,23 119 9 2
421 gi|33339126 actin Musa acuminata 41893 5.23 431 24 6
435.. gi|115452113 Os03g0266300 [Oryza sativa Japonica Group] 17899 5.8 176 19 4
436 gi|238574988 hypothetical protein MPER_13502 (* proline-
specific peptidase) Moniliophthora perniciosa
8.40E-82 12831 5.02 122 21 3
441 gi|255552590 formate dehydrogenase, putative [Ricinus
communis]
42868 6.28 72 6 1
442 gi|238608426 hypothetical protein MPER_02384 (*40s
ribosomal protein s0) Moniliophthora perniciosa
1.67E-172 26620 9,61 251 23 5
444 gi|238581037 hypothetical protein MPER_11386
(*aldolase) Moniliophthora perniciosa
5.17E-115 20261 5.09 143 33 4
446 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 413 15 7
447 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 35911 7.07 389 15 6
95
135 gi|154125603 hydrophobin [Trichoderma virens] 10689 5.12 106 17 1
474 gi|388579309 mitochondrial heat shock protein of the
HSP70 family upregulated 15 fold under
aerobic conditions
Wallemia sebi
70780 5.54 167 5 2
491 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-
keto reductase yakc) Moniliophthora perniciosa
0 16947 5.85 210 23 3
493 gi|238598512 hypothetical protein MPER_05452 (*cysteine
proteinase) Moniliophthora perniciosa
0 44479 5.12 188 14 4
494 gi|170094206 predicted protein [S238N-H82] (*v-type
atpase) Laccaria bicolor
0 68051 5.46 69 3 2
520 gi|238596758 hypothetical protein MPER_06020 (*gtp
binding protein) Moniliophthora perniciosa
6.06E-163 26935 5.6 101 20 3
529 gi|397648750 NAD-dependent formate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 40509 6.03 161 11 3
534 gi|238589098 hypothetical protein MPER_08578
(*phosphoglycerate mutase-like protein) Moniliophthora perniciosa
0 29383 9.72 168 14 3
536 gi|170087860 predicted protein [ S238N-H82] (*nad -
binding protein) Laccaria bicolor
0 68659 6.02 74 1 1
550 gi|238568923 hypothetical protein MPER_15176
[Moniliophthora perniciosa FA553] Moniliophthora perniciosa
1.16E-126 19714 8.98 63 6 1
553 gi|443926530 adenosylhomocysteinase Rhizoctonia solani 52128 6.35 324 12 6
560 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-
keto reductase yakc) Moniliophthora perniciosa
5.13E-109 16947 5.85 118 29 4
561 gi|238583372 hypothetical protein MPER_10538
[Moniliophthora perniciosa FA553] Moniliophthora perniciosa
5.68E-121 23304 5.24 347 41 6
562 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-
keto reductase yakc) Moniliophthora perniciosa
5.12E-109 16947 5.85 186 25 4
567 gi|238583330 hypothetical protein MPER_10554 (*urease) Moniliophthora perniciosa 1.28E-130 20944 9.14 132 11 2
571 gi|392586812 60S ribosomal protein L5 Coniophora puteana 35073 6.98 112 8 3
572 gi|302685369 60S acidic ribosomal protein Schizophyllum commune 33602 5,23 113 11 3
574 gi|238608426 hypothetical protein MPER_02384 (*40s
ribosomal protein s0) Moniliophthora perniciosa
1.67E-172 26620 9,61 91 10 2
575 gi|170098026 predicted protein (*acetolactate synthase) Laccaria bicolor 0 38352 7.11 155 13 3
579 gi|397648750 NAD-dependent formate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 40509 6,03 733 39 13
96
580 gi|397648750 NAD-dependent formate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 40509 6,03 183 11 3
581 gi|238580781 hypothetical protein MPER_11478 (*pkinase-
domain-containing protein) Moniliophthora perniciosa
0 45852 6.44 202 9 3
582 gi|238588592 hypothetical protein MPER_08751 (*glutamic
oxaloacetic transaminase aat1) Moniliophthora perniciosa
8.14E-147 21992 7.31 146 8 2
584 gi|238608211 hypothetical protein MPER_02448 (*60s
ribosomal protein l4 l1 l2) Moniliophthora perniciosa
4.19E-167 27692 10.62 108 9 2
585 gi|169864162 60S ribosomal protein L4 Coprinopsis cinerea 40999 11.36 114 8 2
588 gi|238573081 hypothetical protein MPER_14021 (*o-
acetylhomoserine ami) Moniliophthora perniciosa
6.80E-59 11457 7.9 81 12 1
589 gi|238577896 hypothetical protein MPER_12437
(*phosphoglycerate kinase) Moniliophthora perniciosa 0 44352 6.37
876 38
6.37 876 38 13
590 gi|169849981 argininosuccinate synthetase Coprinopsis cinerea 47673 5.28 239 8 3
630 gi|238578696 hypothetical protein MPER_12135 (*60s
ribosomal protein l9) Moniliophthora perniciosa
2.77E-137 21675 9.30 85 19 3
645 gi|238574988 hypothetical protein MPER_13502 (*proline-
specific peptidase) Moniliophthora perniciosa
8.40E-82 12831 5.02 59 10 1
653 gi|238574796 hypothetical protein MPER_13555 (*pci
domain-containing protein) Moniliophthora perniciosa
4.31E-46 8625 4.9 62 25 1
660 gi|58260588 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-
homocysteine S-methyltransferase Cryptococcus neoformans 85593 5.89 110 3 2
661 gi|58531910 translation elongation factor 1-alpha Amanita brunnescens 33972 8.32 92 18 3
706 gi|170093417 20S proteasome subunit Laccaria bicolor 27752 5.98 66 7 2
710 gi|238601242 hypothetical protein MPER_04599 (*nad-
malate dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa
3.54E-133 23278 6.58 267 28 5
731 gi|238585695 hypothetical protein MPER_09702 (*fmn-
linked oxidoreductase) Moniliophthora perniciosa
1.84E-135 20750 6.17 77 11 2
732 gi|145228831 eukaryotic translation initiation factor 5A Aspergillus niger 9.21E-117 18007 5,31 118 8 2
733 gi|238596609 hypothetical protein MPER_06068
(*peptidylprolyl isomerase b) Moniliophthora perniciosa
0 21614 7,77 144 14 3
736 gi|238565951 hypothetical protein MPER_15995 (*het-c2
protein) Moniliophthora perniciosa
1.35E-75 12309 8,93 166 23 3
739 gi|238601450 hypothetical protein MPER_04535 Moniliophthora perniciosa 2.70E-129 20107 7,71 178 20 4
97
739 gi|238601450 hypothetical protein MPER_04535
(*adenylate kinase 1) Moniliophthora perniciosa
2.70E-129 20107 7,71 178 20 4
742 gi|302694377 hypothetical protein SCHCODRAFT_13020
(*20s proteasome subunit) Schizophyllum commune
0 29887 6,31 134 10 2
743 gi|238568761 hypothetical protein MPER_15220 (*aldo
keto reductase) Moniliophthora perniciosa
5.43E-122 19779 8,88 276 29 4
749 gi|238584385 hypothetical protein MPER_10155
(*cytochrome b5) Moniliophthora perniciosa
3.06E-89 14254 4,81 257 46 4
750 gi|238607564 hypothetical protein MPER_02648 (*aldo-
keto reductase puatative) Moniliophthora perniciosa
8.10E-38 6839 5,22 59 19 1
754 gi|392595628 E3 ubiquitin ligase SCF complex Skp subunit Coniophora puteana 2.32E-113 18609 4,51 82 12 1
a. Access code for the NCBInr database
b. E-value from the blast of hypothetical proteins by Blast2GO
c. Ions score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event.
Individual ions scores > 55 indicate identity or extensive homology (p<0.05)
*Identification of the respective hypothetical proteins by Blast2GO
98
Spot
ID
aAcession
number Protein identification Organism
bE-value
Nominal
mass (Mr) pI cal.
cIon Score
Coverage
%
No
peptides
0 gi|58531914 translation elongation factor 1-alpha Armillaria mellea 34548 8.22 281 23 5
1 gi|393245760 2-nitropropane dioxygenase Auricularia delicata 37395 8.58 89 10 2
2 gi|238568133 hypothetical protein MPER_15399 (*voltage-
dependent ion-selective channel) Moniliophthora perniciosa 9,86E-63 10878 8.52 250 68 5(2)
3 gi|164646049 40S ribosomal protein Laccaria bicolor 29347 9.07 155 16 4
4 gi|238581109 hypothetical protein MPER_11362 (*aldo keto
reductase) Moniliophthora perniciosa 3,61E-173 27304 5.87 86 10 2
6 gi|238571797 hypothetical protein MPER_14361 (*cobalamin-
independent methionine synthase) Moniliophthora perniciosa 5,58E-30 7125 5.36 82 21 1
7 gi|3318722 hypothetical protein PHACADRAFT_257822
(*fumarate reductase) Phanerochaete carnosa 0 62179 8.38 158 7 2
8 gi|238596200 hypothetical protein MPER_06196 (*s-adenosyl-l-
methionine-dependent methyltransferase) Moniliophthora perniciosa 7,42E-136 23005 7.08 95 12 2
9 gi|238583183 hypothetical protein MPER_10609 (*acetyl-coa
hydrolase) Moniliophthora perniciosa 1,05E-118 19457 7.25 121 12 2
14 gi|238592251 hypothetical protein MPER_07522 (*fad nad -
binding domain-containing protein) Moniliophthora perniciosa 1,06E-124 20212 5.33 61 7 1
18 gi|58260588 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-
homocysteine S-methyltransferase Cryptococcus neoformans 85593 5.89 73 1 1
19 gi|409048599 hypothetical protein PHACADRAFT_26619 (*d-
xylulose 5-phosphate d-fructose 6-phosphate) Phanerochaete carnosa 0 91016 5.94 84 2 2
23 gi|389742654 transaldolase Stereum hirsutum 36245 5.84 145 9 3
24 gi|302672926 Actin-1 Schizophyllum commune 41876 5.3 688 42 12
26 gi|238590442 hypothetical protein MPER_08124 (*heat shock
protein) Moniliophthora perniciosa 3,15E-136 21141 9.67 228 24 4
27 gi|238567698 hypothetical protein MPER_15516 (*uv excision
repair protein rad23) Moniliophthora perniciosa 1,22E-63 16788 5.34 61 8 1
28 gi|302691820 hypothetical protein SCHCODRAFT_65225 (*dead-
domain-containing protein) Schizophyllum commune 0 45407 5.23 205 13 5
29 gi|443919800 RAB GDP-dissociation inhibitor Rhizoctonia solani 6.17 201 8 4
Tabela 2A. Spots totais identificados – Mp565
99
30 gi|169869158 ATP-dependent RNA helicase eIF4A Coprinopsis cinerea 45456 5.15 97 6 3
31 gi|402218402 DEAD-domain-containing protein Dacryopinax sp. 45645 5.25 455 25 8
32 gi|393220215 ATP synthase F1, beta subunit Fomitiporia mediterranea 58129 5.89 820 35 13
32 gi|393245698 ATP synthase F1, beta subunit Auricularia delicata 58080 5.89 1067 34 15
38 gi|170087348 predicted protein (*atp synthase f1 beta subunit) Laccaria bicolor 57818 5.56 237 10 4
40 gi|336366003 hypothetical protein SERLA73DRAFT_125862
(*catalase) Serpula lacrymans 58991 6.52 157 6 3
41 gi|238564627 hypothetical protein MPER_16356 (*catalase) Moniliophthora perniciosa 2,89E-76 13179 7.23 203 37 4
42 gi|238613709 hypothetical protein MPER_00887 (*translation
elongation factor tu) Moniliophthora perniciosa 3,69E-110 17901 6.67 58 11 1
44 gi|238616086 hypothetical protein MPER_00282 (*beta-
lactamase transpeptidase-like protein) Moniliophthora perniciosa 1,38E-40 9867 4.76 138 27 2
46 gi|238586577 hypothetical protein MPER_09389 (*aldo-keto
reductase yakc) Moniliophthora perniciosa 4,93E-104 16947 5.85 264 46 6
47 gi|397648750 NAD-dependent formate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 40509 6.03 122 16 4
48 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 269 10 5
49 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 396 15 7
50 gi|238571459 hypothetical protein MPER_14454 (*protein
disulfide isomerase) Moniliophthora perniciosa 3,47E-58 14101 4.73 86 9 1
53 gi|71005690 GTP-binding nuclear protein RAN 521 Ustilago maydis 24485 6.6 160 14 3
54 gi|71005690 GTP-binding nuclear protein RAN [Ustilago maydis
521] Ustilago maydis 24485 6.6 190 21 4
55 gi|18033194 PriA Pleurotus ostreatus 15241 5.87 71 7 1
56 gi|170094152 20S proteasome subunit Laccaria bicolor 29740 8.35 305 26 6(3)
57 gi|238614163 hypothetical protein MPER_00763 Moniliophthora perniciosa 20463 7.77 131 12 2
58 gi|170087022 predicted protein (*ran spi1 binding protein) Laccaria bicolor 8,90E-102 17394 6.15 102 12 2
59 gi|395335098 proteasome subunit alpha type 5 Dichomitus squalens 3,46E-172 27015 5.05 138 12 3
60 gi|148764190 guanine nucleotide binding protein beta subunit Lentinula edodes 34906 5.84 193 17 4
61 gi|148764190 guanine nucleotide binding protein beta subunit Lentinula edodes 34906 5.84 642 38 9
62 gi|148764190 guanine nucleotide binding protein beta subunit Lentinula edodes 34906 5.84 620 38 10
63 gi|169844935 inorganic diphosphatase Coprinopsis cinerea 33738 5.8 176 12 3
64 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 5.79 107 4 1
100
67 gi|238591692 hypothetical protein MPER_07705 (*alpha beta-
hydrolase) Moniliophthora perniciosa 1,02E-174 27724 4.88 309 17 5
68 gi|238594788 hypothetical protein MPER_06663 Moniliophthora perniciosa 26202 6.89 340 31 5
69 gi|238594788 hypothetical protein MPER_06663 Moniliophthora perniciosa 26202 6.89 358 31 5(4)
71 gi|45421755 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase Armillaria tabescens 0 36370 8.22 453 20 7
72 gi|238579620 hypothetical protein MPER_11800
(*glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ) Moniliophthora perniciosa 0 35911 6.06 290 14% 5
74 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 0 37133 7.07 106 4 2
75 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 0 37133 7.07 447 20 8
76 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 0 37133 7.07 443 17 7
77 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 0 37133 7.07 107 4 1
78 gi|238593443 hypothetical protein MPER_07111 (*malate
dehydrogenase ) Moniliophthora perniciosa 8,44E-116 18178 13.5 111 13 2
79 gi|169865690 malate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 35160 9.02 259 17 4
80 gi|238596758 hypothetical protein MPER_06020 (*gtp binding
protein) Moniliophthora perniciosa 5,83E-158 26935 5.6 276 27 6(2)
81 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 36288 5.79 86 4 1
82 gi|238596305 hypothetical protein MPER_06166 (*aliphatic
nitrilase) Moniliophthora perniciosa 6,80E-15 6330 6.12 89 20 1
85 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 115 7 2
87 gi|390602790 Coproporphyrinogen oxidase Punctularia strigosozonata 42575 5.53 117 6 2
89 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 107 4 1
90 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 223 4
92 gi|426198503 mitochondrial NAD-dependent isocitrate
dehydrogenase subunit 2 precursor Agaricus bisporus 40769 8.71 142 7 2
93 gi|397648750 NAD-dependent formate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 40509 6.03 121 12 3
94 gi|393215294 actin 1 Fomitiporia mediterranea 41987 5.31 266 19 5
95 gi|238578412 hypothetical protein MPER_12242 (*adenosine
kinase) Moniliophthora perniciosa 0.0 34479 5.49 418 29 7
96 gi|238587787 hypothetical protein MPER_09018 (*gtp binding
protein) Moniliophthora perniciosa 5,89E-176 31722 4.98 455 30 7
97 gi|389744276 mitochondrial acyl-CoA dehydrogenase Stereum hirsutum 40859 5.54 149 6 2
98 gi|238579336 hypothetical protein MPER_11903 (*alpha beta- Moniliophthora perniciosa 1,19E-107 19243 8.7 356 37 6
101
99 gi|238579336 hypothetical protein MPER_11903 (*alpha beta-
hydrolase) Moniliophthora perniciosa 1,19E-107 19243 8.7 102 12 2
100 gi|238588592 hypothetical protein MPER_08751 (*glutamic
oxaloacetic transaminase aat1) Moniliophthora perniciosa 7,83E-142 21992 7.3 338 40 6
101 gi|443926530 adenosylhomocysteinase Rhizoctonia solani 52128 6.35 407 15 7
102 gi|238579336 hypothetical protein MPER_11903 (*alpha beta-
hydrolase) Moniliophthora perniciosa 1,19E-107 19243 8.7 166 13 3
103 gi|238588592 hypothetical protein MPER_08751 (*glutamic
oxaloacetic transaminase aat1) Moniliophthora perniciosa 7,83E-142 21992 7.31 87 13 2
104 gi|238593028 hypothetical protein MPER_07256 (*aspartate
aminotransferase) Moniliophthora perniciosa 1,85E-106 17324 5.26 232 27 3
105 gi|238593028 hypothetical protein MPER_07256 (*aspartate
aminotransferase) Moniliophthora perniciosa 1,85E-106 17324 5.26 175 22 2
106 gi|238579336 hypothetical protein MPER_11903 (*alpha beta-
hydrolase) Moniliophthora perniciosa 1,19E-107 19243 8.7 321 46 6
107 gi|443925880 succinate-CoA ligase Rhizoctonia solani 47795 8.1 124 5 2
108 gi|302672926 Actin-1 Schizophyllum commune 41876 5.3 651 42 11
109 gi|401886263 ATPase Trichosporon asahii 45037 6.02 243 16 5
110 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 412 17 8
111 gi|401886263 ATPase Trichosporon asahii 45037 6.02 232 12 4
115 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 158 8 3
116 gi|288905378 O-acetylhomoserine sulfhydrylase Streptococcus gallolyticus 46511 5.02 104 2 1
117 gi|114155449 citrate synthase Phanerochaete
chrysosporium 49329 7.85 226 11 4
118 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 135 5 2
119 gi|392568039 DEAD-domain-containing protein Trametes versicolor 44894 5.38 272 13 5
121 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 0 33864 5.18 277 16 3
122 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 0 33864 5.18 303 23 4
123 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 298 14 6
124 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 0 33864 5.18 114 17 3
125 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 0 33864 5.18 482 40 8
102
126 gi|238577896 hypothetical protein MPER_12437
(*phosphoglycerate kinase) Moniliophthora perniciosa 0 44352 6.37 368 25 8
127 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53618 6.17 223 10 4
128 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53618 6.17 281 10 5
129 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 183 8 4
130 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 0 33864 5.18 61 6 1
132 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 0 33864 5.18 73 6 1
133 gi|238580487 hypothetical protein MPER_11585
(*uroporphyrin-iii c-methyltransferase) Moniliophthora perniciosa 0 37345 5.7 598 30 9
134 gi|6323209 methionine adenosyltransferase SAM1 Saccharomyces cerevisiae 42077 5.04 105 7 2
136 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 0 33864 5.18 91 13 2
138 gi|238566324 hypothetical protein MPER_15891 (*elongation
factor 1-gamma) Moniliophthora perniciosa 8,46E-88 20427 8.8 153 23 3
139 gi|238566324 hypothetical protein MPER_15891 (*elongation
factor 1-gamma) Moniliophthora perniciosa 8,46E-88 20427 8.8 453 47 8
140 gi|50422693 DEHA2E14212p Debaryomyces hansenii 42246 5.93 175 9 3
141 gi|238590067 hypothetical protein MPER_08253 (*fumarate
reductase) Moniliophthora perniciosa 0 35440 7.88 285 29 6
142 gi|238588357 hypothetical protein MPER_08828
(*argininosuccinate synthetase) Moniliophthora perniciosa 0 32205 5.5 170 12 3
143 gi|238590067 hypothetical protein MPER_08253 (*fumarate
reductase) Moniliophthora perniciosa 0 35440 7.88 354 32 7
144 gi|238590067 hypothetical protein MPER_08253 (*fumarate
reductase) Moniliophthora perniciosa 0 35440 7.88 302 27 6
145 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 347 14 6
146 gi|238599828 hypothetical protein MPER_05041 (*enolase) Moniliophthora perniciosa 33864 5.18 128 13 2
148 gi|238576965 hypothetical protein MPER_12781 (*udp-xylose
synthase) Moniliophthora perniciosa 45756 6.41 144 11 3
150 gi|238587548 hypothetical protein MPER_09103
(*flavocytochrome c) Moniliophthora perniciosa 1,75E-60 10684 4.89 201 26 2
153 gi|238590067 hypothetical protein MPER_08253 (*fumarate
reductase) Moniliophthora perniciosa 0.0 35440 7.88 250 41 8
103
154 gi|238596200 hypothetical protein MPER_06196 (*s-adenosyl-l-
methionine-dependent methyltransferase) Moniliophthora perniciosa 7,42E-136 23005 7.08 126 24 3
156 gi|389749834 homocitrate synthase Stereum hirsutum 50875 5.61 75 5 2
157 gi|238601659 hypothetical protein MPER_04475 (*cndp
dipeptidase) Moniliophthora perniciosa 0 36552 6.35 178 20 5
158 gi|60477737 beta tubulin 3 Trametes versicolor 43376 5.81 193 14 4
159 gi|238601659 hypothetical protein MPER_04475 (*cndp
dipeptidase) Moniliophthora perniciosa 0 36552 6.35 83 10 2
160 gi|390594124 dihydrolipoyl dehydrogenase Punctularia strigosozonata 53548 6.88 147 5 2
165 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 (*atp synthase
f1 alpha subunit) Moniliophthora perniciosa 0 38935 9.33 129 16 4
166 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 (*atp synthase
f1 alpha subunit) Moniliophthora perniciosa 0 38935 9.33 66 9 2
169 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 (*atp synthase
f1 alpha subunit) Moniliophthora perniciosa 0 38935 9.33 280 19 5
170 gi|390604304 translation elongation factor 1a Punctularia strigosozonata 50494 9.16 680 26 12
171 gi|409081292 ATP1 alpha subunit of the F1 sector of
mitochondrial F1F0 ATP synthase Agaricus bisporus 0 58272 9.15 420 23 8
172 gi|238582313 hypothetical protein MPER_10920 (*udp-n-
acetylglucosamine diphosphorylase) Moniliophthora perniciosa 5,90E-161 25420 7.01 333 50 8
173 gi|169861658 alpha-tubulin Coprinopsis cinerea 49695 5.13 340 16 5
174 gi|58531910 translation elongation factor 1-alpha Amanita brunnescens 33972 8.32 182 19 4
175 gi|169861658 alpha-tubulin Coprinopsis cinerea 49695 5.13 376 24 8
177 gi|169861658 alpha-tubulin Coprinopsis cinerea 49695 5.13 600 28 9
179 gi|173519 alpha-tubulin 1 Schizosaccharomyces
pombe 51834 4.97 72 3 1
181 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 158 7 3
183 gi|238605915 hypothetical protein MPER_03157 (*glucose-6-
phosphate isomerase) Moniliophthora perniciosa 5,39E-60 11204 5.52 86 25 2
185 gi|238595671 hypothetical protein MPER_06368 (*fad nad-
binding domain-containing protein) Moniliophthora perniciosa 31714 6.07 60 7 2
187 gi|238584969 hypothetical protein MPER_09954
(*methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 26622 5.32 100 16 3
104
189 gi|238579292 hypothetical protein MPER_11918 (*erylysin b) Moniliophthora perniciosa 57257 5.53 118 6 2
191 gi|238582313 hypothetical protein MPER_10920 (*udp-n-
acetylglucosamine diphosphorylase) Moniliophthora perniciosa 5,90E-161 25420 7.01 201 18 4
192 gi|238582313 hypothetical protein MPER_10920 (*udp-n-
acetylglucosamine diphosphorylase) Moniliophthora perniciosa 5,90E-161 25420 7.01 107 28 4
195 gi|238564627 hypothetical protein MPER_16356 (*catalase) Moniliophthora perniciosa 2,89E-76 13179 7.23 234 37 4
197 gi|336368978 hypothetical protein SERLA73DRAFT_92389
(*chaperonin) Serpula lacrymans 0 62726 5.57 628 20 10
198 gi|390594669 chaperonin GroL Punctularia strigosozonata 62301 5.38 379 13 7
199 gi|336366003 hypothetical protein SERLA73DRAFT_125862
(*catalase) Serpula lacrymans 0 58991 6.52 206 6 3
200 gi|170097792 UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase Laccaria bicolor 56858 8.49 124 8 4
201 gi|238585247 hypothetical protein MPER_09856 (*atp synthase
f1 alpha subunit) Moniliophthora perniciosa 0 38935 9.33 221 17 4
202 gi|169843774 pyruvate kinase Coprinopsis cinerea 57889 5.99 191 12 5
203 gi|169843774 pyruvate kinase Coprinopsis cinerea 57889 5.99 96 6 3
204 gi|58265840 aspartate-tRNA ligase Cryptococcus neoformans 64265 6.17 79 2 1
205 gi|170086043 pyruvate kinase Laccaria bicolor 58176 6.29 245 14 6
208 gi|238579292 hypothetical protein MPER_11918 (*erylysin b) Moniliophthora perniciosa 0 57257 5.53 79 4 2
209 gi|238579292 hypothetical protein MPER_11918 (*erylysin b) Moniliophthora perniciosa 0 57257 5.53 225 10 5
210 gi|238579292 hypothetical protein MPER_11918 (*erylysin b) Moniliophthora perniciosa 0 57257 5.53 148 8 3
211 gi|238579292 hypothetical protein MPER_11918 (*erylysin b) Moniliophthora perniciosa 0 57257 5.53 400 17 7
212 gi|238579292 hypothetical protein MPER_11918 (*erylysin b) Moniliophthora perniciosa 0 57257 5.53 459 23 9
213 gi|389745762 Thiamin diphosphate-binding protein Stereum hirsutum 70073 5.83 283 6 3
214 gi|392564289 Thiamin diphosphate-binding protein Trametes versicolor 69770 5.93 261 6 4
216 gi|238602347 hypothetical protein MPER_04260
(*transketolase) Moniliophthora perniciosa 1,80E-111 17734 5.09 108 35 3
219 gi|409044687 hypothetical protein PHACADRAFT_257822
(*fumarate reductase) Phanerochaete carnosa 0.0 62179 8.38 215 6 3
220 gi|389749243 heat shock protein 70 Stereum hirsutum 67104 5.26 566 13 9
221 gi|389749243 heat shock protein 70 Stereum hirsutum 67104 5.26 366 13 7
222 gi|392595638 heat shock protein 70 Coniophora puteana 67219 5.32 312 12 5
105
223 gi|389749243 heat shock protein 70 Stereum hirsutum 67104 5.26 595 17 9
224 gi|170097978 fumarate reductase Laccaria bicolor 62823 7.71 281 8 5
226 gi|389749243 heat shock protein 70 Stereum hirsutum 67104 5.26 635 19 11
228 gi|238596657 hypothetical protein MPER_06052 (*fumarate
reductase) Moniliophthora perniciosa 1,71E-120 19156 6.71 79 16 2
231 gi|58258689 heat shock protein Cryptococcus neoformans 67371 5.37 61 2 1
235 gi|170094730 predicted protein (*heat shock protein 70) Laccaria bicolor 0 67109 5.49 163 11 4
236 gi|392595638 heat shock protein 70 Coniophora puteana 67219 5.32 153 11 4
238 gi|402225401 heat shock cognate 70 Dacryopinax sp 70687 5.12 849 22 12
239 gi|25229078 heat shock protein 70 Cryptosporidium parvum 10891 6.84 68 14 1
240 gi|402225401 heat shock cognate 70 Dacryopinax sp 70687 5.12 951 18 12
241 gi|402225401 heat shock cognate 70 Dacryopinax sp 70687 5.12 718 19 12
242 gi|302681991 hypothetical protein SCHCODRAF (*heat shock
protein) Schizophyllum commune 0 68371 5.22 234 8 4
243 gi|328853573 hypothetical protein MELLADRAFT (*heat shock
protein) Melampsora larici-populina 0 68502 5.75 64 2 1
244 gi|392591019 heat shock protein 70 Coniophora puteana 72196 5.75 150 4 3
246 gi|336363523 hypothetical protein SERLA73DRAFT_117989
(*alcohol oxidase-like protein) Serpula lacrymans 65906 6.04 78 2 1
248 gi|238590442 hypothetical protein MPER_08124 (*heat shock
protein) Moniliophthora perniciosa 3,15E-136 21141 9.67 148 16 2
250 gi|238603891 hypothetical protein MPER_03775
(*metallopeptidase) Moniliophthora perniciosa 6,90E-144 24196 5.25 109 12 2
251 gi|397648746 dihydroxyacetone synthase Moniliophthora perniciosa 71858 6.27 337 14 7
253 gi|238603891 hypothetical protein MPER_03775
(*metallopeptidase) Moniliophthora perniciosa 6,90E-144 24196 5.25 158 16 3
254 gi|397648746 dihydroxyacetone synthase Moniliophthora perniciosa 71858 6.27 81 3 2
256 gi|238576970 hypothetical protein MPER_12779 (*prolyl-trna
synthetase) Moniliophthora perniciosa 64963 6.02 119 5 2
257 gi|238599066 hypothetical protein MPER_05283 (*saccharopine
dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 0 36194 7.08 105 11 3
258 gi|238599066 hypothetical protein MPER_05283 (*saccharopine
dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 0 36194 7.08 165 10 3
106
259 gi|170094674 aconitate hydratase Laccaria bicolor 82919 6.02 366 9 7
260 gi|170094674 aconitate hydratase Laccaria bicolor 82919 6.02 110 2 2
261 gi|170094674 aconitate hydratase Laccaria bicolor 82919 6.02 138 3 3
263 gi|393215641 cobalamin-independent methionine synthase Fomitiporia mediterranea 84456 6.62 268 5 4
265 gi|169861261 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-
homocysteine S-methyltransferase Coprinopsis cinerea 84662 6.22 411 8 6
268 gi|169861261 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-
homocysteine S-methyltransferase Coprinopsis cinerea 84662 6.22 261 5 4
269 gi|169861261 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-
homocysteine S-methyltransferase Coprinopsis cinerea 84662 6.22 301 6 4
274 gi|320593198 heat shock protein hsp88 Grosmannia clavigera 80655 5.06 170 3 2
275 gi|238586468 hypothetical protein MPER_09428 (*heat shock
protein 70) Moniliophthora perniciosa 0 38972 5.36 236 21 5
277 gi|409051882 hypothetical protein PHACADRAFT_247908 Phanerochaete carnosa 94359 6.03 155 4 3
278 gi|170084477 predicted protein (*eukaryotic translation
elongation factor 2) Laccaria bicolor 0 94069 6.24 233 12 6
279 gi|170084477 predicted protein (*eukaryotic translation
elongation factor 2) Laccaria bicolor 0 94069 6.24 107 3 2
281 gi|395334437 eukaryotic translation elongation factor 2 Dichomitus squalens 94217 6.0 317 11 7
283 gi|169848944 valosin-containing protein Coprinopsis cinerea 90192 4.91 373 9 7
284 gi|238579573 hypothetical protein MPER_11816 (*ubiquitin
activating enzyme) Moniliophthora perniciosa 0 80086 5.12 245 6 4
285 gi|365894815 Glutamine--fructose-6-phosphate transaminase
(Isomerizing) Bradyrhizobium sp 35752 5.49 79 3 2
288 gi|169848944 valosin-containing protein Coprinopsis cinerea 90192 4.91 88 2 2
291 gi|156099426 translation elongation factor 1-alpha, partial [Issatchenkia sp. NRRL Y-12830] 35703 7.18 137 10 3
293 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 88 4 1
294 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 252 14 6
296 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 127 5 2
297 gi|238604121 hypothetical protein MPER_03710 (*trehalose
synthase) Moniliophthora perniciosa 6,16E-113 19362 6.59 100 13 2
298 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 316 14 6
107
299 gi|170106570 predicted protein (*acetyl- hydrolase) Laccaria bicolor 0 60155 6.56 100 2 1
300 gi|238614130 hypothetical protein MPER_00772 Moniliophthora perniciosa 10745 8.89 404 78 7(3)
301 gi|170090832 20S proteasome subunit Laccaria bicolor 27636 6.0 156 16 3
303 gi|238604003 hypothetical protein MPER_03743 (*cysteine
peroxiredoxin) Moniliophthora perniciosa 5,21E-76 13731 8.15 148 21 4
304 gi|238604003 hypothetical protein MPER_03743 (*cysteine
peroxiredoxin) Moniliophthora perniciosa 5,21E-76 13731 8.15 520 67 8
307 gi|238576814 hypothetical protein MPER_12846 (*o-
methyltransferase family 3 protein) Moniliophthora perniciosa 1,68E-151 23599 5.19 201 17 3
308 gi|238576814 hypothetical protein MPER_12846 (*o-
methyltransferase family 3 protein) Moniliophthora perniciosa 1,68E-151 23599 5.19 452 40 6
309 gi|238614163 hypothetical protein MPER_00763 Moniliophthora perniciosa 20463 7.77 269 48 7
311 gi|238586629 hypothetical protein MPER_09371 Moniliophthora perniciosa 14353 5.10 74 14 2
312 gi|238614163 hypothetical protein MPER_00763 Moniliophthora perniciosa 20463 7.77 143 25 4
315 gi|70986899 malate dehydrogenase, NAD-dependent Aspergillus fumigatus
Af293] 35876 9.08 176 11 3
316 gi|238612042 hypothetical protein MPER_01338 (*aldo keto
reductase) Moniliophthora perniciosa 1,08E-88 14678 7.79 191 22 3
318 gi|20210 glutelin? [Oryza sativa] 57039 9.33 162 6 3
319 gi|238597208 hypothetical protein MPER_05877 (*arylalcohol
dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 0 37877 6.62 150 13 4
320 gi|238588592 hypothetical protein MPER_08751 (*glutamic
oxaloacetic transaminase aat1) Moniliophthora perniciosa 7,83E-142 21992 7.31 370 45 6
322 gi|238598967 hypothetical protein MPER_05313
(*diphosphomevalonate decarboxylase) Moniliophthora perniciosa 3,55E-75 13102 9.26 98 18 2
323 gi|83999566 alpha tubulin Amanita muscaria 49855 5.08 122 6 2
324 gi|393215294 actin 1 Fomitiporia mediterranea 41987 5.31 100 7 2
325 gi|302672926 Actin-1 Schizophyllum commune 41876 5.3 450 30 6
326 gi|238585695 hypothetical protein MPER_09702 (*fmn-linked
oxidoreductase) Moniliophthora perniciosa 1,78E-130 20750 6.17 231 32 4
327 gi|302677927 S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Schizophyllum commune 47366 5.83 340 12 6
330 gi|326475904 alpha-aminoadypil-cysteinyl-valine synthetase Trichophyton tonsurans 426354 5.94 60 0 1
108
332 gi|238611425 hypothetical protein MPER_01512 (*arm repeat-
containing protein) Moniliophthora perniciosa 7,74E-102 7.82 254 23 3
333 gi|170089231 predicted protein (*26s proteasome subunit p45) Laccaria bicolor 0 45171 5.48 282 18 6
334 gi|238588009 hypothetical protein MPER_08942 (*ketol-acid
reductoisomerase) Moniliophthora perniciosa 0 35901 8.85 242 20 5
335 gi|238583085 hypothetical protein MPER_10645 (*citrate
synthase) Moniliophthora perniciosa 0 30913 6.19 108 16 3
336 gi|169865823 acyl-CoA carboxylate CoA-transferase Coprinopsis cinerea 61067 6.4 65 2 1
337 gi|336376944
hypothetical protein SERLA73DRAFT_118840 (*p-
loop containing nucleoside triphosphate hydrolase
protein)
Serpula lacrymans 0.0 168676 4.74 95 2 3
338 gi|238608426 hypothetical protein MPER_02384 (*40s
ribosomal protein s0) Moniliophthora perniciosa 1,61E-167 26620 9.61 194 23 4
339 gi|392594871 ketol-acid reductoisomerase Coniophora puteana 39864 5.69 73 3 2
342 gi|238583372 hypothetical protein MPER_10538 Moniliophthora perniciosa 23304 5.24 258 25 5
343 gi|238608426 hypothetical protein MPER_02384 (*40s
ribosomal protein s0) Moniliophthora perniciosa 1,61E-167 26620 9.61 370 38 6
344 gi|238608426 hypothetical protein MPER_02384 (*40s
ribosomal protein s0) Moniliophthora perniciosa 1,61E-167 26620 9.61 124 13 2
345 gi|238608426 hypothetical protein MPER_02384 (*40s
ribosomal protein s0) Moniliophthora perniciosa 1,61E-167 26620 9.61 269 23 4
348 gi|238577896 hypothetical protein MPER_12437
(*phosphoglycerate kinase) Moniliophthora perniciosa 0.0 44352 6.37 168 3
349 gi|395333549 HSP90-domain-containing protein Dichomitus squalens 79871 5.08 666 15 11
350 gi|299741158 hsp70-like protein Coprinopsis cinerea 71962 5.11 345 8 5
351 gi|146271032 actin Amanita muscaria 41816 5.31 210 14 3
361 gi|3086 UBI 3 fusion protein (149 AA) Neurospora crassa 17337 9.82 216 31 4(2)
362 gi|238568761 hypothetical protein MPER_15220 (*aldo keto
reductase) Moniliophthora perniciosa 5,23E-118 19779 8.88 117 17 2
364 gi|390594746 hypothetical protein PUNSTDRAFT_47677
(*cytoplasmic protein) Punctularia strigosozonata 0.0 34804 5.63 110 13 4
369 gi|238614130 hypothetical protein MPER_00772 Moniliophthora perniciosa 10745 8.89 168 25 3
375 gi|170088512 20S proteasome subunit Laccaria bicolor 33445 5.29 171 12 3
109
376 gi|238584385 hypothetical protein MPER_10155 (*cytochrome
b5) Moniliophthora perniciosa 2,95E-84 14254 4.81 263 40 3
377 gi|238614130 hypothetical protein MPER_00772 Moniliophthora perniciosa 10745 8.89 206 48 4
378 gi|71020461 hypothetical protein UM04314.1 (*actin
depolymerizing factor) Ustilago maydis 1,08E-83 15905 5.55 94 10 2
379 gi|237824249 cyclophilin Moniliophthora perniciosa 17721 8.99 230 30 4
380 gi|302680575 40S ribosomal protein Schizophyllum commune 18136 10.43 72 14 2
381 gi|170091302 40S ribosomal protein S12 Laccaria bicolor 16216 5.40 198 28 4
382 gi|170091302 40S ribosomal protein S14 Laccaria bicolor 16216 5.40 194 23 4
383 gi|302689525 40S ribosomal protein Schizophyllum commune 17596 5.46 271 38 5
384 gi|238611634 hypothetical protein MPER_01448 (*duf985
domain-containing protein) Moniliophthora perniciosa 1,78E-62 11742 5.07 307 51 5
386 gi|345561105 hypothetical protein AOL_s00210g8 (*eukaryotic
translation initiation factor 5a) Arthrobotrys oligospora 2,51E-109 17691 5.26 114 12 2
387 gi|302689525 40S ribosomal protein S19 Schizophyllum commune 17596 5.46 187 35 4
388 gi|70990614 Eukaryotic translation initiation factor eIF-5A Aspergillus fumigatus 21492 5.58 120 6 2
389 gi|390598392 nucleoside diphosphate kinase Punctularia strigosozonata 16822 6.97 180 25 3
390 gi|390598392 nucleoside diphosphate kinase Punctularia strigosozonata 16822 6.97 183 25 3
398 gi|238597794 hypothetical protein MPER_05683 (*nadh-
quinone oxidoreductase) Moniliophthora perniciosa 4,02E-127 19773 7.07 152 75 6
399 gi|238597794 hypothetical protein MPER_05683 (*nadh-
quinone oxidoreductase) Moniliophthora perniciosa 4,02E-127 19773 7.07 569 55 7
402 gi|238601734 hypothetical protein MPER_04451 (*manganese
superoxide dismutase) Moniliophthora perniciosa 1,33E-84 14078 7.98 193 23 4
406 gi|336373360 hypothetical protein SERLA73DRAFT_177135
(*ran-specific gtpase-activating protein) Serpula lacrymans 4,53E-111 22311 4.8 79 9 1
407 gi|238604003 hypothetical protein MPER_03743 (*cysteine
peroxiredoxin) Moniliophthora perniciosa 5,21E-76 13731 8.15 185 45 4
408 gi|238579030 hypothetical protein MPER_12017 (*triose
phosphate isomerase) Moniliophthora perniciosa 2,31E-168 27289 7.01 242 29 5
415 gi|238585304 hypothetical protein MPER_09836 (*zn-
dependent exopeptidase) Moniliophthora perniciosa 7,05E-118 18944 5.35 80 6 1
416 gi|238614224 hypothetical protein MPER_00744 (*urea hydro- Moniliophthora perniciosa 6,02E-57 10539 7.03 125 24 2
110
416 gi|238614224 hypothetical protein MPER_00744 (*urea hydro-
lyase cyanamide) Moniliophthora perniciosa 6,02E-57 10539 7.03 125 24 2
418 gi|238580855 hypothetical protein MPER_11450 (*20s
proteasome subunit) Moniliophthora perniciosa 6,88E-148 27393 5.62 215 17 4
419 gi|170093417 20S proteasome subunit Laccaria bicolor 27752 5.98 134 11 3
420 gi|392597175 hypothetical protein CONPUDRAFT_161234
(*prohibitin) Coniophora puteana 0 29741 6.86 145 11 3
421 gi|392566194 voltage-dependent ion-selective channel Trametes versicolor 31131 9.17 62 4 1
422 gi|170106343 20S proteasome subunit Laccaria bicolor 29031 7.03 142 11 3
425 gi|238594858 hypothetical protein MPER_06640 Moniliophthora perniciosa 27113 6.19 226 37 5
428 gi|238568133 hypothetical protein MPER_15399 (*voltage-
dependent ion-selective channel) Moniliophthora perniciosa 9,86E-63 10878 8.52 252 69 5
430 gi|336373360 hypothetical protein SERLA73DRAFT_177135
(*ran-specific gtpase-activating protein) Serpula lacrymans 4,53E-111 22311 4.8 113 15 2
432 gi|170091548 14-3-3 protein Laccaria bicolor 0 29025 4.72 816 59 14
433 gi|238605728 hypothetical protein MPER_03217 (*short-chain
dehydrogenase reductase sdr) Moniliophthora perniciosa 5,87E-53 11553 8.26 136 43 3
434 gi|238615771 hypothetical protein MPER_00367
(*carbohydrate-binding module family 13 protein) Moniliophthora perniciosa 1,21E-52 10541 5.73 130 29 2
435 gi|392567511 malate dehydrogenase Trametes versicolor 34558 6.10 164 12 4
437 gi|238601242 hypothetical protein MPER_04599 (*nad-malate
dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 3,41E-128 23278 6.58 90 9 2
438 gi|4029338 malate dehydrogenase Piromyces sp. 33521 6.12 92 9 2
443 gi|169856373 hypothetical protein CC1G_08491 Coprinopsis cinerea 32055 5.96 93 3 1
449 gi|70780048 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 37133 7.07 86 4 1
450 gi|238575793 hypothetical protein MPER_13274 (*sec14
cytosolic factor) Moniliophthora perniciosa 0 38029 6.08 281 22 7
451 gi|238575793 hypothetical protein MPER_13274 (*sec14
cytosolic factor) Moniliophthora perniciosa 0 38029 6.08 233 15 5
452 gi|170094148 predicted protein (*2-nitropropane dioxygenase) Laccaria bicolor 37143 9.2 178 12 3
453 gi|169865690 malate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 35160 9.02 429 21 7
455 gi|397648750 NAD-dependent formate dehydrogenase Moniliophthora perniciosa 40509 6.03 294 27 6
111
458 gi|238605566 hypothetical protein MPER_03269
(*uroporphyrinogen decarboxylase) Moniliophthora perniciosa 31402 5.91 133 17 3
459 gi|238579336 hypothetical protein MPER_11903 (*alpha beta-
hydrolase) Moniliophthora perniciosa 1,19E-107 19243 8.7 89 13 2
461 gi|238614370 hypothetical protein MPER_00701 (*acetyl-
acetyltransferase) Moniliophthora perniciosa 6,15E-110 17116 9.67 78 26 3
462 gi|6692796 14-3-3- Lentinula edodes] 29009 4.67 100 5 1
464 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 245 14 5
465 gi|169844380 6-phosphogluconate dehydrogenase Coprinopsis cinerea 53846 6.17 300 12 5
468 gi|238589579 hypothetical protein MPER_08419
(*transaminase) Moniliophthora perniciosa 1,75E-120 19797 5.43 73 13 2
474 gi|388579309
mitochondrial heat shock protein of the HSP70
family upregulated 15 fold under aerobic
conditions
Wallemia sebi 70780 5.54 167 5 2
475 gi|388579309
mitochondrial heat shock protein of the HSP70
family upregulated 15 fold under aerobic
conditions
Wallemia sebi 70780 5.54 116 5 2
476 gi|238599066 hypothetical protein MPER_05283 (*saccharopine
dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 0 36194 7.08 103 10 2
477 gi|238603039 hypothetical protein MPER_04035 Moniliophthora perniciosa 13408 5.43 58 8 1
478 gi|336373463 hypothetical protein SERLA73DRAFT_103829
(*nad-dependent formate dehydrogenase) Serpula lacrymans 0 22597 5.07 177 22 4
482 gi|238596609 hypothetical protein MPER_06068
(*peptidylprolyl isomerase b) Moniliophthora perniciosa 1,80E-106 21614 7.77 68 10 2
483 gi|238577896 hypothetical protein MPER_12437
(*phosphoglycerate kinase) Moniliophthora perniciosa 0 44352 6.37 373 23 7
488 gi|392589813 40S ribosomal protein S4 Coniophora puteana 29885 10.25 62 4 1
493 gi|85102845 60S ribosomal protein L12 Neurospora crassa 17740 9.57 79 9 1
495 gi|6692796 14-3-3- Lentinula edodes 29009 4.67 68 5 1
496 gi|238568133 hypothetical protein MPER_15399 (*voltage-
dependent ion-selective channel) Moniliophthora perniciosa 9,86E-63 10878 8.52 107 22 1
499 gi|58531914 translation elongation factor 1-alpha Armillaria mellea 34548 8.22 187 17 3
502 gi|169862561 glycine hydroxymethyltransferase Coprinopsis cinerea 53167 6.62 70 3 1
112
504 gi|238580209 hypothetical protein MPER_11684 (*udp-glucose
dehydrogenase) Moniliophthora perniciosa 42387 6.9 109 7 2
a. Access code for the NCBInr database
b. E-value from the blast of hypothetical proteins by Blast2GO
c. Ions score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event.
Individual ions scores > 55 indicate identity or extensive homology (p<0.05)
*Identification of the respective hypothetical proteins by Blast2GO
113
Match ID Ctrl x Cat1
Fold Anova Ctrl x TSH1
Fold Anova Cat x TSH1
Fold Anova Sequence Identification
7 - < 1.5 >0.005 up 1,95 0,0028 up 1,91 0,0029 heat shock protein 70
9 down < 1.5 >0.005 down 2,16 0,0036 down 2,43 0,0022 aldo-keto reductase yakc
64 up < 1.5 >0.005 down 1,61 0,0011 down 1,74 0,0014 ran-specific gtpase-activating protein
77 down < 1.5 >0.005 down 3,43 3,14E-05 down 2,37 0,0024 nad-malate dehydrogenase
78 down < 1.5 >0.005 down 15,06 3,90E-04 down 10,54 >0.005 aldo keto reductase
80 down < 1.5 >0.005 down 7,75 2,48E-04 down 6,38 >0.005 aldo-keto reductase yakc
81 up 1,94 0,0017 up 2,49 0,001 up 1,28 >0.005 aldo-keto reductase yakc
83 down 1,52 >0.005 down 3,33 0,001 down 2,18 0,0013 aldo keto reductase
88 down < 1.5 >0.005 down 2,25 0,0019 down 1,87 >0.005 malate dehydrogenase
92 up < 1.5 >0.005 up 1,84 1,37E-04 up 1,56 0,0021 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
96 up < 1.5 >0.005 up 1,78 0,0018 up 1,6 0,002 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
119 down < 1.5 >0.005 down 5,03 0,0043 down 3,62 >0.005 acetyl- acetyltransferase
122 down < 1.5 >0.005 down 2,35 0,0058 down 2,09 0,0043 aspartate aminotransferase
131 down < 1.5 >0.005 down 2,27 0,0013 down 2,34 0,0059 actin 1
154 up < 1.5 >0.005 up 2,01 0,0025 up < 1.5 >0.005 enolase
158 up 1,9 5,45E-04 up 2,6 7,44E-05 up < 1.5 0,0034 uroporphyrin-iii c-methyltransferase
197 - < 1.5 >0.005 up 1,72 0,0019 up 1,63 >0.005 atp synthase f1 alpha subunit
216 up < 1.5 0,0032 down 1,66 0,00194 down 2,04 1,97E-04 v-type atpase
219 - < 1.5 >0.005 down 1,4 4,25E-04 down 1,43 2,84E-05 v-type atpase
223 down < 1.5 >0.005 up < 1.5 nsv up 1,52 0,0025 catalase
248 up 1,73 0,0032 up 2,54 7,72E-04 up 1,46 0,0027 erylysin b
282 up 1,63 0,0034 up 1,75 nsv up < 1.5 >0.005 hsp90-domain-containing protein
297 down < 1.5 >0.005 up 2,37 9,18E-05 up 2,72 4,33E-05 related to 5-oxoprolinase
330 down < 1.5 >0.005 up 1,53 nsv up 1,94 1,38E-04 leucyl aminopeptidase
356 up 3,08 0,0012 up < 1.5 nsv down 2,43 0,004 copper radical oxidase
360 down 2,08 9,48E-04 down < 1.5 1,71E-05 down < 1.5 3,76E-04 aldo keto reductase
Tabela 1B. Expressão diferencial de proteínas – Mp553 -
114
378 up 2,64 2,18E-04 down < 1.5 9,36E-05 down < 1.5 1,94E-05 eukaryotic translation initiation factor eif-5a
381 down 4,77 1,10E-03 down < 1.5 1,74E-04 down < 1.5 >0.005 duf985 domain-containing protein
396 down < 1.5 >0.005 down < 1.5 0,00379 down < 1.5 1,80E-04 cysteine peroxiredoxin
397 down < 1.5 5,53E-06 down < 1.5 5,11E-09 down < 1.5 3,39E-08 triose phosphate isomerase
402 - < 1.5 >0.005 down < 1.5 5,59E-06 down < 1.5 4,23E-04 urea hydro-lyase cyanamide
403 down < 1.5 1,17E-04 down < 1.5 3,54E-08 down < 1.5 9,25E-07 proteasome subunit
405 down < 1.5 >0.005 down < 1.5 6,54E-07 down < 1.5 1,90E-04 argininosuccinate synthetase
414 down < 1.5 >0.005 down < 1.5 1,25E-04 down < 1.5 7,15E-04 protein
420 down 1,48 9,30E-06 down < 1.5 4,11E-08 down < 1.5 7,91E-08 actin- expressed
436 down < 1.5 >0.005 down < 1.5 0,0012 down < 1.5 5,30E-05 proline-specific peptidase
442 igual < 1.5 >0.005 down 4,17 3,02E-04 down 4,05 1,63E-04 40s ribosomal protein s0
444 down 2,89 0,0011 down < 1.5 9,15E-05 down < 1.5 0,002 aldolase
446 - < 1.5 >0.005 up 2,27 3,33E-04 up 2,06 2,00E-04 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
454 - < 1.5 >0.005 down < 1.5 1,21E-03 down < 1.5 >0.005 acetyl- acetyltransferase
491 up 3,04 0,0015 down < 1.5 2,92E-04 down < 1.5 2,70E-04 aldo-keto reductase yakc
561 down 2,35 >0.005 down < 1.5 0,0015 down < 1.5 1,04E-05 hypothetical protein MPER_10538
572 down 2,35 >0.005 down < 1.5 0,0025 down < 1.5 2,41E-04 60s acidic ribosomal protein p0
574 - < 1.5 >0.005 down < 1.5 0,0043 down < 1.5 8,12E-04 40s ribosomal protein s0
579 - < 1.5 >0.005 down < 1.5 8,93E-05 down < 1.5 1,85E-04 nad-dependent formate dehydrogenase
589 down < 1.5 >0.005 down < 1.5 0,0012 down < 1.5 8,20E-06 phosphoglycerate kinase
594 - < 1.5 >0.005 down < 1.5 0,003 down < 1.5 >0.005 orotidine-5 -monophosphate decarboxylase
630 0,252827 60s ribosomal protein l9
645 1,00E+06 proline-specific peptidase
653 1,00E+06 pci domain-containing protein
660 1,00E+06 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine
s-methyltransferase
661 1,00E+06 translation elongation factor 1- partial
706 1,00E+06 20s proteasome subunit
710 1,00E+06 nad-malate dehydrogenase
731 1,00E+06 fmn-linked oxidoreductase
115
731 1,00E+06 fmn-linked oxidoreductase
732 1,00E+06 eukaryotic translation initiation factor 5a
733 1,00E+06 peptidylprolyl isomerase b
736 1,00E+06 het-c2 protein
739 1,00E+06 adenylate kinase 1
742 1,00E+06 20s proteasome subunit
743 1,00E+06 aldo keto reductase
749 0,12545 cytochrome b5
750 0,104849 aldo-keto reductase puatative
754 1,00E+06 s-phase kinase-associated protein 1a-like protein 1 reference treatment
(-) no expression difference
116
Match ID Ctrl x Cat1
Fold Anova Ctrl x TSH1
fold Anova Cat x TSH1
fold Anova Sequence Identification
3 down 4,12 0,00115 - < 1.5 > 0.005 up < 1.5 > 0.005 40s ribosomal protein s3
9 up 7,01 0,0021 up 5,8 0,0016 down < 1.5 > 0.005 acetyl-coa hydrolase
24 up 3,83 0,005 up 3,44 0,0022 down < 1.5 > 0.005 actin 1
26 down 0 0,0013 - < 1.5 > 0.005 up < 1.5 1,18E-05 heat shock protein
31 down 3,07 0,0012 down 2,14 1,33E-04 up < 1.5 > 0.005 dead-domain-containing protein
38 down < 1.5 > 0.005 down 4,18 0,0032 down < 1.5 > 0.005 atp synthase f1 beta subunit
57 up 4,25 0,0022 up 5,07 1,30E-04 up < 1.5 > 0.005 hypothetical protein MPER_00763
59 up 2,31 0,0029 down < 1.5 > 0.005 down 2,56 0,0034 proteasome subunit alpha type 5
68 down 2,72 2,43E-04 down 1,99 3,41E-04 up < 1.5 > 0.005 hypothetical protein MPER_06663
69 down 1,9 > 0.005 down 1,66 0,0032 up < 1.5 > 0.005 hypothetical protein MPER_06663
71 down < 1.5 > 0.005 down 2,1 0,0026 down < 1.5 > 0.005 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
76 down 2,68 0,0024 down < 1.5 > 0.005 up < 1.5 > 0.005 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
96 down < 1.5 > 0.005 down 1,62 8,75E-04 down < 1.5 > 0.005 gtp binding protein
106 up < 1.5 > 0.005 down < 1.5 > 0.005 down 1,8 0,0021 alpha beta-hydrolase
126 up 2,04 0,003 up < 1.5 > 0.005 down < 1.5 > 0.005 phosphoglycerate kinase
127 down < 1.5 > 0.005 down 2,57 0,0015 down < 1.5 > 0.005 6-phosphogluconate dehydrogenase
128 down < 1.5 > 0.005 down 1,91 4,20E-04 down < 1.5 > 0.005 oxysterol-binding protein
158 up 4,25 0,003 up 4,71 0,005 up < 1.5 > 0.005 beta-tubulin 1 tubb1
174 up < 1.5 > 0.005 down 1,7 6,50E-04 down < 1.5 > 0.005 translation elongation factor 1- partial
177 down < 1.5 > 0.005 down 1,73 0,002 down < 1.5 > 0.005 tubulin alpha
195 down < 1.5 > 0.005 down 1,72 0,00173 down < 1.5 > 0.005 catalase
204 up < 1.5 > 0.005 down 2,09 0,001 down < 1.5 > 0.005 aspartate-trna ligase
210 up < 1.5 > 0.005 down < 1.5 > 0.005 down 2,6 0,0028 erylysin b
212 down < 1.5 > 0.005 down 2,4 8,52E-04 down < 1.5 > 0.005 erylysin b
243 down < 1.5 > 0.005 down 1,9 0,0044 down < 1.5 > 0.005 heat shock protein
254 down < 1.5 > 0.005 down 2,13 0,0045 down < 1.5 > 0.005 transketolase
293 down < 1.5 > 0.005 down 3,92 0,0021 down < 1.5 > 0.005 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
300 up up up 12,37 0,000118 hypothetical protein MPER_00772
301 up up up < 1.5 > 0.005 20s proteasome subunit
303 up up up 3,51 6,94E-05 cysteine peroxiredoxin
304 up up up 4,9 > 0.005 cysteine peroxiredoxin
Tabela 2B. Expressão diferencial de proteínas Mp565 -
117
308 up up up < 1.5 > 0.005 o-methyltransferase family 3 protein
309 up up up < 1.5 > 0.005 hypothetical protein MPER_00763
311 up up up < 1.5 > 0.005 hypothetical protein MPER_09371
312 up up up < 1.5 1,10E-03 hypothetical protein MPER_00763
315 up up up 2,45 > 0.005 malate nad-dependent
316 up up up < 1.5 > 0.005 aldo keto reductase
318 up up up < 1.5 > 0.005 glutelin
319 up up up 2,12 > 0.005 arylalcohol dehydrogenase
320 up up up < 1.5 > 0.005 glutamic oxaloacetic transaminase aat1
323 up up up 2,81 > 0.005 tubulin alpha
325 up up up < 1.5 > 0.005 actin 1
327 up up down 1,84 3,00E-03 s-adenosyl-l-homocysteine hydrolase
333 up up down 1,84 > 0.005 26s proteasome subunit p45
334 up < 1.5 0,001028 up < 1.5 0,0057 down < 1.5 > 0.005 ketol-acid reductoisomerase
335 up up up 4,5 2,98E-03 citrate synthase
336 up up down < 1.5 > 0.005 acetyl- hydrolase
338 up up down 2,69 8,54E-04 40s ribosomal protein s0
343 up up up < 1.5 > 0.005 40s ribosomal protein s0
344 up up up 2 0,004 40s ribosomal protein s0
345 up up up < 1.5 > 0.005 40s ribosomal protein s0
350 - down down 1,65 0,0031 heat shock protein 70
361 up up ubiquitin-40s ribosomal protein
362 up up aldo keto reductase
364 up up cytoplasmic protein
369 up up hypothetical protein MPER_00772
375 up up 20s proteasome subunit
376 up up cytochrome b5
377 up up hypothetical protein MPER_00772
378 up up actin depolymerizing factor
379 up up peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
380 up up 40s ribosomal protein s18
381 up up 40s ribosomal protein s12
382 up up 40s ribosomal protein s12
383 up up 40s ribosomal protein s19
118
384 up up duf985 domain-containing protein
386 up up eukaryotic translation initiation factor 5a
387 up up 40s ribosomal protein s19
388 up up eukaryotic translation initiation factor eif-5a
389 up up nucleoside diphosphate kinase
390 up up nucleoside diphosphate kinase
398 up up nadh-quinone oxidoreductase
399 up up nadh-quinone oxidoreductase
402 up up manganese superoxide dismutase
406 up up ran-specific gtpase-activating protein
407 up up cysteine peroxiredoxin
408 up up triose phosphate isomerase
415 up up zn-dependent exopeptidase
416 up up urea hydro-lyase cyanamide
418 up up 20s proteasome subunit
419 up up 20s proteasome subunit
420 up up prohibitin
421 up up voltage-dependent ion-selective channel
422 up up 20s proteasome subunit
425 up up hypothetical protein MPER_06640
428 up up voltage-dependent ion-selective channel
430 up up ran-specific gtpase-activating protein
432 up up 14-3-3 protein
433 up up short-chain dehydrogenase reductase sdr
434 up up carbohydrate-binding module family 13 protein
435 up up nad-malate dehydrogenase
437 up up nad-malate dehydrogenase
438 up up malate dehydrogenase
443 up up hypothetical protein CC1G_08491
449 up up glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
450 up up sec14 cytosolic factor
451 up up sec14 cytosolic factor
452 up up 2-nitropropane dioxygenase
453 up up malate dehydrogenase
119
455 up up nad-dependent formate dehydrogenase
456 up up nad-dependent formate dehydrogenase
458 up up uroporphyrinogen decarboxylase
459 up up alpha beta-hydrolase
461 up up acetyl- acetyltransferase
462 up up 14-3-3 protein
464 up up 6-phosphogluconate dehydrogenase
465 up up 6-phosphogluconate dehydrogenase
468 up up transaminase
474 up up heat shock protein
475 up up heat shock protein
476 up up saccharopine dehydrogenase
477 up up hypothetical protein MPER_04035
478 up up nad-dependent formate dehydrogenase
482 up up peptidylprolyl isomerase b
483 up up phosphoglycerate kinase
488 up up 40s ribosomal protein s4
493 up up 60s ribosomal protein l12
495 up - down 14-3-3 protein
496 up - down voltage-dependent ion-selective channel
499 down down translation elongation factor 1- partial
502 down down glycine hydroxymethyltransferase
504 down down udp-glucose gdp-mannose dehydrogenase 1 reference treatment
(-) no expression difference
120
