UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PROGRAMA DE PÓS...

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL

NADIA CAROLINA SANABRIA VERON

RESISTÊNCIA AO CMV, DIVERSIDADE MORFO-

REPRODUTIVAEALELOPATIA EM ACESSOS DE MELÃO

ILHÉUS– BAHIA – BRASIL

Novembro de 2018


RESISTÊNCIA AO CMV, DIVERSIDADE MORFO-REPRODUTIVA E

ALELOPATIA EM ACESSOS DE MELÃO

ILHÉUS– BAHIA – BRASIL

Novembro de 2018

Dissertação apresentada à Universidade

Estadual de Santa Cruz, como parte das

exigências para obtenção do título de

Mestre em Produção Vegetal.

Linha de Pesquisa: Melhoramento de

plantas e biotecnologia.

Orientador: Prof. Ronan Xavier Corrêa

Co-orientador: Prof. Jadergudson Pereira




APROVADA: 23 de novembro de 2018

_________________________________________________________________

Prof. Dr. Ronan Xavier Corrêa

UESC/DCB

(Orientador)

_________________________________________________________________.

Profa. Dr

a. Norma Eliane Pereira

UESC/DCB

_________________________________________________________________

Dr. Isamire Silva Andrade

i

DEDICO,

A todas as pessoas, que com muito carinho e apoio, não mediram esforços para que eu

cumprisse esta etapa de minha vida.

ii

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) e ao Programa de Pós-Graduação em

Produção Vegetal (PPGPV), com todo seu corpo docente.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa de estudos.

Ao Grupo Coimbra de Universidades Brasileiras (GCUB) e à Organização dos Estados

Americanos (OEA), pela oportunidade de ingresso na UESC por meio do Programa de

Alianças para Educação e Capacitação (PAEC).

Ao Prof. Dr. Cláusio Melo, pelo apoio e sugestões, que foram fundamentais para a

realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Ronan Xavier Correa, pela orientação, apoio e sugestões durante o curso.

Ao Prof. Dr. Jadergudson Pereira, pela confiança depositada, apoio e pela Co-orientação

durante o curso.

À Caroline Tavares, secretária do PPGPV, pela paciência, gentileza, sempre à disposição.

Aos funcionários e técnicos do Centro de Biotecnologia e Genética da UESC (CBG), por

todas as vezes que me auxiliaram.

À Guillermina Macchi e Alba Liz González, pela confiança e pelo apoio que foram

fundamentais para a realização deste sonho.

Aos colegas de curso, pelo companheirismo e pela ajuda, familiares e a todos que direta e

indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, e ainda que não sejam

citados, jamais serão esquecidos.

Agradeço a todos os meus amigos, antigos e novos, que ficaram ao meu lado cada um de

vocês fizeram uma grande diferença.

iii

ÍNDICE

RESUMO............................................................................................................................... v

ABSTRACT ........................................................................................................................ vii

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 4

2.1 Origem e descrições botânicas de Cucumis melo L. ........................................................ 4

2.2 Interação Cucumis melo-CMV ......................................................................................... 5

2.3 Marcadores associados ao CMV ...................................................................................... 7

2.4 Biologia da reprodução e caracterização reprodutiva ...................................................... 8

2.5 Qualidade fisiológica de sementes de melão e alelopatia ................................................ 9

2.6 Conyza bonariensis ........................................................................................................ 10

2.7 Testes de citotoxicidade ................................................................................................. 11

CAPÍTULO I ...................................................................................................................... 13

3. RESISTÊNCIA AO VÍRUS DO MOSAICO DO PEPINO E BIOLOGIA

REPRODUTIVA DE ACESSOS BRASILEIROS DE MELÃO ................................... 13

RESUMO............................................................................................................................. 13

ABSTRACT ........................................................................................................................ 14

3.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 15

3.2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 17

3.2.1Material Vegetal ........................................................................................................... 17

3.2.2 Inoculações com CMV e avaliação de sintomas ......................................................... 17

3.2.3 Polimorfismo genético em regiões genômicas para a resistência ao CMV ................. 18

3.2.4 Viabilidade polínica e receptividade do estigma ......................................................... 19

3.2.5 Diversidade genética floral e reprodutiva .................................................................... 20

3.3 RESULTADOS ............................................................................................................. 21

3.3.1 Sintomatologia e polimorfismo genético relativo à resistência ao CMV .................... 21

3.3.2 Viabilidade polínica e receptividade do estigma ......................................................... 25

3.3.3 Variabilidade e diversidade genéticafloral e reprodutiva ............................................ 27

3.4 DISCUSSÃO ................................................................................................................. 31

3.5 CONCLUSÕES............................................................................................................. 37

3.6 AGRADECIMENTOS ................................................................................................. 37

3.7 REFERÊNCIA .............................................................................................................. 37

CAPÍTULO II ..................................................................................................................... 42

iv

4. ALELOPATIA DE EXTRATO DE CONYZA BONARIENSIS NA

GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE MELÃO ............................................................. 42

RESUMO............................................................................................................................. 42

ABSTRACT ........................................................................................................................ 43

4.1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 44

4.2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 46

4.2.1 Coleta e preparo do extrato de Conyza bonariensis para o uso nos ensaios de

germinação e citotoxidade .................................................................................................... 46

4.2.2 Ensaios de germinação ................................................................................................ 46

4.2.3 Avaliações de fitotoxicidade ....................................................................................... 46

4.2.4 Avaliação de citotoxidade ........................................................................................... 47

4.5 RESULTADOS ............................................................................................................. 49

4.5.1 Potencial fitotóxico de Conyza bonariensis na germinação e crescimento radicular em

alface e melão ....................................................................................................................... 49

4.5.2 Potencial citotóxico de Conyza bonariensis em células meristemáticas radiculares de

Allium cepa .......................................................................................................................... 52

4.6 DISCUSSÃO ................................................................................................................. 56

4.7 CONCLUSÃO............................................................................................................... 61

4.8 AGRADECIMENTOS ................................................................................................. 62

4.9 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 62

5. CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................................. 68

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS COMPLEMENTARES ................................ 69

v



RESUMO

O presente trabalho objetivou verificar se há variabilidade na resistência ao (Vírus do

Mosaico do Pepino) CMV (estirpe FNY) em diferentes acessos brasileiros de melão

conservados em banco de germoplasma, evidenciar polimorfismo em loci marcadores de

resistência, bem como se há diversidade genética quanto à resistência e aos descritores da

morfologia floral e do comportamento reprodutivo, visando o melhoramento genético.

Outro aspecto estudado foi o potencial alelopático de extrato aquoso da espécie Conyza

bonariensis, com o objetivo de avaliar efeitos fitotóxico e citotóxicos em sementes de

melão utilizando como modelo vegetal Lactuca sativa e Allium cepa. Foram inoculados

com CMV, 52 genótipos de melão (acessos tradicionais cultivares comerciais) e avaliados

quanto a evolução dos sintomas aos 7, 14 e 21 dias após da inoculação. Todo material foi

genotipado com três marcadores de polimorfismos de nucleotídeos únicos relacionados

com resistência ao CMV. Uma amostra de 24 genótipos foi caracterizada quanto a

descritores florais e reprodutivos e teste de fitoxicidade. O ensaio de germinação foi

realizado em caixa de plástico contendo 25 sementes de melão e alface, adicionado 10 mL

da solução nas concentrações de 0, 1, 3, 5, 7 e 10% de extrato aquoso de C. bonariensis.

Diariamente foram feitas as contagens de germinação de sementes e, ao final do período

foram medidos percentagem de germinação, índice de velocidade de germinação,

comprimentos de raiz primária e parte aérea. Para o teste de citotoxidade foram distribuídos

25 bulbos de A. cepa e depositados em copos plásticos de 50 mL, com a área radicular

diretamente em contato com os extratos aquosos que consistiram em cinco concentrações:

0; 0,5; 1; 1,5; e 2%. Foi avaliado o índice mitótico e números de células nas fases de

divisão celular (prófase, metáfase, anáfase, telófase). De acordo com a avaliação dos

sintomas, foi constatada uma variação significativa nos níveis de resistência, permitindo

classificar os acessos em cinco grupos distintos. Os polimorfismos detectados por meio dos

marcadores distribuíram-se de forma independente nesses grupos, o que consiste com a

natureza quantitativa oligogênica da resistência do meloeiro ao CMV. Verificaram-se

diferenças significativas entre acessos nos descritores florais e reprodutivos. A análise

conjunta dos dados de sintomatologia e biologia reprodutiva feita pela estratégia

vi

multivariada Ward-MLM, agrupou os acessos em sete grupos com características

reprodutivas distintas, incluindo-se variabilidade em viabilidade polínica. Os dados de

alelopatia foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas com de Scott-

Knott a 5% de probabilidade onde o extrato aquoso de C. bonariensis não mostrou

diferença significativa na percentagem de germinação, no índice de velocidade de

germinação e no comprimento de parte aérea em melão. Contudo, houve diferença

significativa no efeito fitotóxico nas plântulas com diminuição do comprimento da radícula

primária, na germinação de sementes e desenvolvimento de raízes primárias e no

comprimento de parte aérea em alface; também houve diferença significativa na ação

inibitória da divisão celular e nas alterações nas fases de mitose. Portanto, há acessos

brasileiros que possuem resistência ao CMV, os quais são úteis aos estudos voltados ao

melhoramento para resistência, utilizando esquemas de cruzamentos orientados a partir das

características reprodutivas. Extrato aquoso de C.bonariensispossui efeito citotóxico pela

capacidade de reduzir o índice mitótico e também favorecer erros no comportamento

cromossômico ao longo do ciclo celular mitótico.

Palavras-chave: Marcador molecular, SNP-CAP, variabilidade floral e reprodutiva, Ward-

MLM, compostos alopáticos, alterações mitóticas, citotoxicidade.

vii

ABSTRACT

RESISTANCE TO CMV, MORPHRODUTIVE DIVERSITY AND ALELOPATHY IN

MELON ACCESSIONS

The present work aimed to verify if there is variability in the resistance to CMV (FNY

strain) in different Brazilian accessions of melon conserved in germplasm bank, to evidence

polymorphism in resistance marker loci, as well as if there is genetic diversity resistance

and descriptors of floral morphology and reproductive behavior, aiming at genetic

improvement. Another aspect studied was the allelopathic potential of aqueous extract of

the species Conyza bonariensis, with the objective of evaluating phytotoxic and cytotoxic

effects in melon seeds using as a vegetable model Lactuca sativa and Allium cepa. Fifty-

two melon genotypes (traditional commercial cultivars) were inoculated with CMV and

evaluated for symptoms at 7, 14 and 21 days after inoculation. All material was genotyped

with three unique nucleotide polymorphism markers related to CMV resistance. A sample

of 24 genotypes was characterized in terms of floral and reproductive descriptors and

phytotoxicity tests. The germination assay was carried out in a plastic box containing 25

seeds of melon and lettuce, 10 ml of the solution added at the concentrations of 0, 1, 3, 5, 7

and 10% aqueous extract of C. bonariensis. Seed germination counts were made daily and,

at the end of the period, germination percentage, germination speed index, primary root

length and aerial part length were measured. For the cytotoxicity test, 25 bulbs of A. cepa

strain were deposited in 50 ml plastic cups, with the root area directly in contact with the

aqueous extracts, which consisted of five concentrations: 0; 0.5; 1; 1.5; and 2%. The mitotic

index and cell numbers in the phases of cell division (prophase, metaphase, anaphase,

telophase) were evaluated. According to the evaluation of the symptoms, a significant

variation in the levels of resistance was observed, allowing to classify the accesses in five

different groups. The polymorphisms detected by the markers were independently

distributed in these groups, which consists of the oligogenic quantitative nature of the

melon's resistance to CMV. There were significant differences between accessions in floral

and reproductive descriptors. The joint analysis of data on symptomatology and

reproductive biology by the Ward-MLM multivariate strategy grouped the accesses into

viii

seven groups with distinct reproductive characteristics, including variability in pollen

viability. The allelopathy data were submitted to analysis of variance and the means

compared with Scott-Knott's at a 5% probability where the aqueous extract of C.

bonariensis showed no significant difference in the percentage of germination, germination

speed index and part length aerial in melon. But it had a phytotoxic effect on seedlings with

decreased root length, inhibited seed germination and development of primary roots and

shoot length in lettuce, also had inhibitory action of cell division and presented alterations

in the phases of mitosis. Therefore, there are Brazilian accesses that have resistance to

CMV, which are useful for studies aimed at improving resistance, using crossing schemes

oriented from the reproductive traits. Aqueous extract of C. bonariensis has a cytotoxic

effect for the ability to reduce mitotic index and also favor errors in chromosome behavior

throughout the mitotic cell cycle.

Key words: Molecular marker, SNP-CAP, floral and reproductive variability, Ward-MLM,

allopathic compounds, mitotic alterations, cytotoxicity.

1

1. INTRODUÇÃO

O melão (Cucumis melo L.) é uma hortaliça tropical de alto valor comercial que

pertence à família das cucurbitáceas, originário da região central da Ásia e da África,sendo

sua maior diversidade botânica encontrados na Índia, Irã, Afeganistão e China. Seu fruto é

apreciado por suas características peculiares, tanto no mercado interno, quanto no externo,

devido ao sabor, coloração, valor nutritivo e uniformidade (FABRO, 2012; MULLER et al.

2013).

O desenvolvimento da cultura do melão pode ser conduzido em qualquer região. Ele

desenvolve melhor na região semiárida pela ocorrência de pequenas quantidades de chuvas,

que favorece a baixa incidência de doenças. Adicionalmente, a alta freqüente incidência

solar favorece a qualidade do fruto (CRISÓSTOMO et al., 2002;SOUSA et al, 2014).

O CMV (Cucumber Mosaic Virus) representa uma doença importante do meloeiro é

destrutivo, infecta mais de 1200 espécies de plantas do mundo pertencentes a 100 famílias,

desde monocotiledôneaa até dicotiledôneas (MORRONI et al., 2008;DUBAY et al., 2015).

Um aspecto crítico de uma infecção sistêmica de uma planta por um vírus é a capacidade

do vírus de se mover dentro e entre as células. O movimento exige fatores do hospedeiro

que reflitam a natureza obrigatória dos vírus. Este vírus gera o desenvolvimento de folhas

menores, mosqueadas, com mosaico, enroladas e malformadas. As plantas ficam em forma

de roseta em decorrência do encurtamento dos internódios. As flores podem apresentar

pétalas esverdeadas e os frutos podem ser deformados e de tamanho reduzido.

Em estudo de resistência demonstrou que a ao vírus do mosaico do pepino (CMV)

em melão exótico PI 161375, a cultivar "Sonwang Charmi" (SC) já havia sido descrita

como oligogênica, recessiva e quantitativa, com QTL principal residente no grupo de

ligação XII (LGXII). Os resultados sugerem que a resistência ao CMV presente no SC é

oligogênica, onde diferentes loci conferem resistência a diferentes cepas de CMV, mas não

necessariamente quantitativas, uma vez que pelo menos um desses genes (cmv1) confere

resistência total, semelhante ao dos pais SC, e não precisa da contribuição de outros loci

(ESSAFI et al.,2009). Essa compreensão foi ampliada para a existência de pelo menos

quatro QTL envolvidos em resistência do melão ao CMV, sendo que combinações de três

2

QTLs são requeridos e suficientes para conferir resistência a diferentes estirpes virais

(GUIÚ-ARAGONÈZ et al., 2014).

O meloeiro é uma espécie que possui a maior variabilidade fenotípica do gênero

Cucumis, observada principalmente em seus frutos e conta com alta variabilidade genética

entre os acessos (DANTAS et al., 2012). Marcadores moleculares mostraram ser úteis para

avaliação da diversidade em várias espécies de plantas, variações fenotípicas e moleculares

também têm sido usadas para caracterizar amplas relações genéticas intraespecíficas e

relações estreitas entre raças e linhas de melão (STEPANSKY et al., 1999; MORALES et

al., 2004).

As diferenças fenotípicas Cucumismelo permitiram que os melhoristas de melões

desenvolvessem tipos hortícolas distintos específicos para a área geográfica e exigências

características do mercado. As informações de identidade genética, morfologia e biologia

reprodutivas seriamúteispara o manejo de germoplasma e proteção de acessos de interesse

nas coleções brasileiras resistentes a CMV (DELEU et al., 2009).

O CMV possui ampla gama de hospedeiros e pode ser transmitida por pulgões o que

tornaram muito difícil o controle desse vírus. O (E) -β-farneseno encontradas en óleo de

Conyza bonariensis é o principal componente do feromônio de alarme de muitos afídeos,

podendo desempenhar uma estratégia de controle na transmissão do virus, os ensaios de

fitotoxicidade de extratos de Conyza bonariensis sobre a cultura do meloeiro pode

demonstrar respostas no crescimento e desenvolvimento de meloeiro sem prejudicar na

produção de melão. Em Nesse sentido para um melhor estudo de substâncias aleloquímicas

foram estabelecidos testes de fitotoxicidade e citotoxicidade sendo Lactuca sativa e Allium

cepaas plantas modelo mais utilizadas, as quais podem expressar qualquer alteração devido

à sensibilidade ante meios com certo grau de toxicidade (GRANT, 1982; BAGATINI et al.,

2007; MAZZEO et al., 2011;MACHADO, 2013;BONCIU et al., 2018).

Na natureza existe fenômeno de interações entre plantas com liberação de

substâncias químicas no meio ambiente que provocam efeitos estimuladores ou inibitórios

conhecida como alelopatia; esse mecanismo ecológico de comunicação desempenha um

papel importante em agroecosistemasnaturais e de manejo, influenciando na sucessão

vegetal primária e secundária, na vegetação, na estrutura, composição, dinâmica e formação

de comunidades vegetais nativas ou cultivadas, além do manejo, germinação, crescimento e

3

produtividade de culturas (DE ALMEIDA et al., 2008; FERREIRA et al., 2000; SINGH et

al., 2001; CALLAWAY, 2003).

Na agricultura, existem vários exemplos da influência alelopática principalmente na

rotação de culturas, sendo a Conyza bonariensis (L.) Cronquist uma espécie considerada

planta danhina, popularmente conhecida como buva (KASPARY, 2014; LAZAROTO et

al., 2008; TREZZI et al., 2011).

Os objetivos deste trabalho foram verificar se diferentes acessos de melão em um

banco de germoplasma brasileiro possuem variabilidade na resistência ao CMV (estirpe

FNY) e no polimorfismo em locos marcadores de resistência, bem como se há diversidade

genética quanto à resistência e aos descritores da morfologia floral e do comportamento

reprodutivo, visando o melhoramento genético. Além disso, objetivou-se avaliar o potencial

alelopático do extrato aquoso da espécie Conyza bonariensis em sementes de melão

utilizando como modelo vegetal L. sativa, bem como, avaliar efeitos citotóxicos em raízes

de células meristemáticas de A. cepa desenvolvidas sob extrato aquoso de C.bonariensis.

4

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Origem e descrições botânicas de Cucumis melo L.

O meloeiro (Cucumis melo L.) é uma hortaliça de cultivo tropical, pertencente à

família Cucurbitaceae. É um táxon originário da região central da Ásia e da África,sendo

centro de maior diversidade botânica encontrados na Índia, Irã, Afeganistão e China

(BISOGNIN, 2002; COSTA e LEITE, 2006).O meloeiro é uma espécie conhecida desde o

século XVI, quando foi trazida, provavelmente, pelos escravos para o Brasil. No Nordeste

brasileiro, o meloeiro chegou por volta dos anos 60 do século passado (ROCHA et al.

2010).

O meloeiro (Cucumis melo L.) é uma espécie de planta diplóide (2n = 2x = 24),

anual, herbácea, com número de hastes ou ramificações variáveis dependendo da cultivar, e

considerado um fruto não climatério; as folhas são alternadas e simples. Sua polinização é

feita por insetos, principalmente por abelhas;é uma espécie polimórfica que é muito

variável nas características das plantas, folhas, flores e frutos; foi inicialmente dividido em

sete grupos botânicos (DANTAS et al., 2012; ARAGÃO et al., 2013).

O meloeiro possui sistema radicular ramificado e pouco profundo. Sendo originário

de regiões tropicais, as condições de clima quente e umidade relativa baixa favorecem o

melhor desenvolvimento das plantas propiciando a alta produtividade e frutos de excelente

qualidade (GARCIA-MAS et al., 2012; MULLER et al., 2013).

A época adequada para o plantio varia de acordo com a região. Em climas quentes

pode ser feito o ano todo. Em climas frios, o plantio em países do hemisfério sul ocorre de

outubro a fevereiro e em clima ameno de agosto a março (COSTA et al., 2012). As

condições ambientais que favorecem o cultivo do meloeiro estão relacionadas aos fatores

climáticos: temperatura, umidade relativa e luminosidade (CRISÓSTOMO et al., 2002).

A combinação de alta temperatura com alta luminosidade e baixa umidade relativa

favorece ao estabelecimento do meloeiro e ao aumento de produtividade com maior número

de frutos de qualidade comercial. Os fatores climáticos são, ainda, importantes indicadores

5

para a escolha da melhor época de plantio do meloeiro que, em geral, podem acontecer em

diferentes períodos do ano, de acordo com localização e altitude da região (FABRO, 2012).

O desenvolvimento da cultura é facilitado, podendo ser conduzido em qualquer

região onde desenvolve melhor na região semiárida pela ocorrência de pequenas

quantidades de chuvas, que favorece a baixa incidência de doenças, e a alta e constante

incidência solar que favorece a formação de frutos com alto teor de açúcares

(GUIMARÃES et al., 2005).

Entre os fatores climáticos que afetam diretamente a cultura do meloeiro, o

principal é a temperatura, tanto do ar quanto do solo, por influenciar desde a germinação

das sementes até a qualidade final do fruto, sendo a faixa ótima de 20 a 30º C. O meloeiro

requer entre 2.500 e 3.000 graus de calor total para completar a maturação e cerca de 1.000

graus de calor desde a floração até a colheita do fruto (SILVA et al., 2000). Essas

condições são facilmente encontradas na Região Nordeste do Brasil, em especial nos

Estados do Rio Grande do Norte, Ceará, Bahia, Pernambuco e na Região Norte de Minas

Gerais (SOUZA et al., 1999).

O meloeiro possui uma grande importância econômica, é apreciado por suas

características peculiares nos mercados interno e externo, devido ao sabor, coloração, valor

nutritivo e uniformidade (BOAS, 1998; MULLER et al., 2013). O Nordeste brasileiro é

responsável da maior produção nacional de melão, sendo a distribuição geográfica de

produção os Estados do Rio Grande do Norte, Ceará, Bahia e Pernambuco.

2.2 Interação Cucumis melo-CMV

O virus de mosaico de pepino pertece a família: Bromoviridae sendo o mais

virulento, este vírus foi relatado infectando mais de 1.200 espécies de plantas do mundo

pertencentes a 100 famílias, desde monocotiledôneassa dicotiledôneas. O CMV é um vírus

tripartido com um genoma de senso positivo de cápside icosaédrica que contem 29

nanometros (nm) de diâmetro e de 180 subunidades de proteína, contendo 18% de RNA

(ROSSINCK, 1991; MORALES et al., 2005;GONZÁLEZ, 2016;).

6

O ciclo viral começa com a penetração do vírus na célula hospedeira. Isto começa

com a desmontagem, a replicação do RNA, tradução da proteína, a montagem, libertação, o

movimento a partir de uma célula para outra e de longa distância (STANGE, 2006).

A infecciosidade dos vírus é estritamente propriedade do seu ácido nucleico

genômico, que na maioria dos vírus das plantas é o RNA, ele se move de uma célula para

outra através dos plasmodesmata conectando células adjacentes. Nas células do parênquima

de folhas, o vírus se move aproximadamente 1 milímetro, ou 8 a 10 células, por dia

(RYABOV et al., 1999; AGRIOS, 2005; HARRIES et al., 2010).

A ampla gama de hospedeiros de CMV e sua capacidade de ser transmitida por mais

de 60 espécies de pulgões, de maneira não persistente, sendo Myzus persicae e Aphis

gossypii as mais importantes tornou muito difícil o controle desse vírus. O uso de

inseticidas foi ineficaz na prevenção da disseminação de CMV devido a sondas breves para

o inseto adquirir e inocular o vírus de plantas infectadas para plantas saudáveis (VIANNA

et al., 2001; MORRONI et al., 2008; DUBEY et al., 2015).

Os sintomas mais comuns de plantas infectadas com vírus geralmente são os que

aparecem nas folhas, mas alguns vírus podem causar sintomas marcantes no tronco, frutas e

raízes, enquanto podem ou não causar qualquer desenvolvimento de sintomas nas folhas.

Em quase todas as doenças de vírus de plantas que ocorrem no campo, o vírus está

presente em toda a planta (infecção sistêmica) e induz a formação de sintomas sistêmicos

(ZECHMANN et al., 2003; HULL, 2009; ANCELOTTI e COSTA, 2010).

Em muitas plantas inoculadas artificialmente o vírus provoca a formação de lesões

pequenas, cloróticas ou necróticas apenas nos pontos de entrada (infecções locais). No

entanto, muitos vírus infectam certos hospedeiros sem causar sintomas visíveis neles

(ZECHMANN et al., 2003; AGRIOS, 2005).

As plantas ficam em forma de roseta em decorrência do encurtamento dos

internódios,as folhas tornam-se menores, mosqueadas, com mosaico, enroladas e

malformadas. As flores podem apresentar pétalas esverdeadas e os frutos podem ser

deformados e de tamanho reduzido (VIANA et al., 2001; PALUKAITI e GARCÍA-

ARENAL, 2003; AL-ANI e ADHAB, 2012).

Tem sido estudado resposta fenotípica de meloeiros à inoculação com CMV em

diferentes dias após inoculação, os sintomas foram classificadas com notas numéricas que

7

variam de 0 a 5, sendo a nota 0correspondente a aquelas que não apresentaram sintomas;

nota 1, com mosaico muito leve apenas nas primeiras uma ou duas folhas; nota 2,mosaico

leve em todas as folhas; nota 3,mosaico mais forte em todas as folhas; nota 4,mosaicos

muito fortes com algumas folhas onduladas; nota 5,mosaicos muito fortes com folhas

onduladas e muito pequenas e plantas pequenas(PALUKAITIS, 1992; GUIU-ARAGONÉS

et al., 2014;).

2.3 Marcadores associados ao CMV

Os marcadores moleculares do DNA podem ser uma ferramenta bastante útil no

processo de transferência de alelos de resistência, monitorando diversos tipos de genes, não

somente aqueles envolvidos com a resistência.O uso de marcadores moleculares é também

justificado em situações em que o fenótipo é de difícil mensuração (MORALES et al.,

2004).

Marcadores do DNA são segmentos de DNA que estão fisicamente ligados a locos

que determinam características de interesse, foram inicialmente utilizados no melhoramento

de plantas no início da década de 80, podem ser evidenciados por métodos que combinam o

uso de enzimas de restrição à hibridização entre sequências complementares de DNA,

como no caso do RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) ou pela técnica de

PCR (Polymerase Chain Reaction) (MORALES et al., 2004).

O melão possui alto nível de polimorfismo, conforme relatado por uma simples

exploração repetitiva de marcadores de sequência (MONFORTE et al., 2003). Devido à sua

alta frequência de ocorrência em genomas, os ensaios de polimorfismos de nucleotídeo

único (SNP) são uma fonte essencialmente inesgotável de marcadores polimórficos para

uso no mapeamento genético de alta resolução de características, e para estudos de

associação que são baseados em genes candidatos ou possivelmente genomas inteiros, não

requerem separação de DNA por tamanho, são mais fáceis de localizar na maioria das

regiões de cópia única do genoma. Por outro lado, os SNPs são bialélicos e sua

heterozigose esperada é baixa (RAFALSKI, 2002).

Uma metodologia otimizada para a detecção de SNP exigiria fácil manuseio, uso de

tecnologia de baixo custo e a possibilidade de genotipar milhares de amostras em uma

8

operação de alta capacidade. A decisão pelo uso de marcadores CAPS é mais direta quando

o SNP ocorre em um sítio de enzima de restrição. Os marcadores baseados em CAPS são

adequados para mapear apenas uma pequena parte dos SNP de melão (CHO et al., 1999).

O mecanismo de resistência pode estar relacionado à incapacidade do vírus de usar

o mecanismo de tradução para se multiplicar ou se acumular na célula resistente, na maioria

das vezes, poligênica ou de caráter quantitativo, normalmente envolvendo uma série de

genes, com efeitos diferenciados, associados a um pronunciado efeito do ambiente, o que

leva a uma variação fenotípica contínua na reação do hospedeiro (GARCIA-MAS et al.,

2000; RAFALSKI, 2002).

Em alguns casos, é necessária uma combinação de mutações nos fatores de

iniciação da tradução eucariótica (eIF) para obter resistência completa. Os marcadores para

genes eIF4E e eIF4G (cum 1 e cum2) têm um papel no movimento CMV incluindo a planta

modelo Arabidopsis thaliana, monocotiledôneas e outras dicotiledôneas participando na

tradução do MP, mas não na tradução de outras proteínas virais. Neste caso, a resistência ao

CMV é responsável pela falta de movimento do vírus, e não pela falta de tradução (DIAZ-

PENDON et al. 2004; ESSAFI et al., 2009;LING et al., 2009).

2.4 Biologia da reprodução e caracterização reprodutiva

O meloeiro e uma cucurbitácea que possui flores monóicas que produzem flores

estaminadas (masculinas) ou pistiladas (femininas) em flores separadas na mesma planta e

andromonoéticas que têm flores estaminadas e hermafroditas (perfeitas) na mesma planta,

enquanto os tipos de plantas ginecosas produzem apenas flores pistiladas. As condições

ambientais podem afetam a expressão sexual (TORRES FILHO et al., 2009; SOUSA et al.,

2009; BOMFIM et al., 2016).

As plantas de melão são autocompatíveis, mas as flores hermafroditas necessitam de

polinizadores (principalmente Apis mellifera) que são responsáveis pela deposição de grãos

de pólen no estigma ( RIBEIRO et al., 2015).

Análise da fertilidade dos grãos de pólen dos progenitores coletados a campo é

condição preliminar indispensável para os cruzamentos (CHAGAS et al., 2010). Ascélulas

germinitativas fornecem informações da viabilidade de grãos de pólen mediante a

9

germinação das mesmas que consistem na sua hidratação e ativação do metabolismo, além

da emissão do tubo polínico para gerar etransportar as células espermáticas até o óvulo

onde ocorre a fertilização (DAÍ et al., 2006; SOUSA, 2009).

Junto com o fator genético, outros fatores como temperatura do ar, umidade,

produtos químicos pulverizados afetam a percentagem de germinação do pólen e o

crescimento do tubo polínico (SORKHEH, 2011).

A fertilidade do pólen e germinação in vitro são usadas em estudos citogenéticos,

fisiológicos e bioquímicos, envolvendo muitas espécies de plantas fundamentais para

estudos de biologia reprodutiva e melhoramento genético de plantas (SOARES, 2008).

2.5 Qualidade fisiológica de sementes de melão e alelopatia

O teste padrão de germinação é conduzido em condições ideais, geralmente

superestima o potencial fisiológico dos lotes, o que torna necessário o aprimoramento dos

testes para avaliação do vigor e da incidência e patógenos em sementes, buscando

informações consistentes, padronizadas e em períodos relativamente curtos (MUNIZ et al.,

2004).

A germinação é uma medida de avaliação que pode explicar as primeiras alterações

nos processos bioquímicos associados à deterioração que ocorrem, geralmente, antes que

sejam verificados declínios na capacidade germinativa (TORRES, 2002).

As sementes de melão têm sido sometidas a estudos de fitotoxidade para determinar

tolerância das plantas ao excesso de sais, a redução do poder germinativo, comparada ao

controle, servindo como indicador do índice de tolerância da espécie à salinidade (SECCO

et al., 2010).

Estudos na composição química e potencial antioxidante de extratos de sementes de

melão amarelo em óleo de soja demonstraram ser uma importante fonte de proteínas,

lipídios e fibras, podendo ser aproveitadas no desenvolvimento de produtos alimentícios

destinados ao consumo humano (MALACRIDA et al., 2007).

Podemos dizer que a alelopatia consiste em qualquer efeito direto ou indireto,

danoso ou benéfico, que uma planta (incluindo microrganismos) exerce sobre a outra pela

produção de compostos químicos liberados no ambiente, essa ação de produtos afeta um

10

grande número de reações bioquímicas resultando em modificações de diferentes funções

fisiológicas (FERREIRA e AQUILA, 2000; PEREIRA et al., 2011; DA SILVA et al.,

2015).

Os resultados da ação aleloquímica podem ser detectados em diferentes níveis de

organização da planta: molecular, estrutural, bioquímica, fisiológica e ecológica,

afetandoatividades enzimáticas, divisão celular e ultraestrutura, permeabilidade da

membrana, absorção de íons e, consequentemente, o crescimento e o desenvolvimento das

plantas. Finalmente, efeitos significativos na fotossíntese e respiração são os melhores

resultados caracterizados de interações alelopáticas (PIRES e OLIVEIRA, 2001; DE

ALMEIDA et al., 2008; SOUZA e PERETIATKO, 2014;COSTA, 2015).

2.6Conyza bonariensis

A Conyza bonariensis (L.) Cronquist considerada uma espécies daninha

cosmopolita que têm sido relatadas como importantes áreas de culturas perenes e lavouras

anuais, incluindo as de semeadura direta, como principalmente a soja (YAMASHITA et al.,

2010).

Os efeitos diretos de alelopatia incluem alterações no crescimento e no metabolismo

vegetal, sendo que compreendem alterações ao nível celular, fotossintético e respiratório,

bem como modificações no funcionamento de membranas, na absorção de nutrientes e nas

relações hídricas, entre outras (SOUZA, et al., 2005). Esses efeitos descrevem relações

alopáticas, as quais têm sido reconhecidas como um importante mecanismo ecológico em

ecossistemas naturais e de manejo, influenciando na sucessão vegetal primária e

secundária, na vegetação clímax, na estrutura, composição, dinâmica e formação de

comunidades vegetais nativas ou cultivadas, além do manejo e produtividade de culturas

(REZENDE et al. 2003; DE CONTI e FRANCO, 2011).

Estudos de fitotoxicidade do extrato de Conyza bonariensis (L.) Cronquist no

desempenho fisiológico de alface evidenciaram efeitos tóxicos em sementes e mudas,

quando concentrações maiores do extrato (6 e 8%) inibiram mais a germinação e o

crescimento precoce das plântulas (DA SILVA et al., 2016).

11

Analises de óleos essenciais de Conyza bonariensis, coletados em locais diferentes

da região de Brasil, obtidos por hidrodestilação e analisados por CG - EM(cromatografia

gasosa acoplada a espectrometria de massas) revelaram que os principais componentes

foram (E) -β-farneseno, germacreno D , β-cariofileno e limoneno (MAIA et al., 2002).

O (E) -β-farneseno é o principal componente do feromônio de alarme de muitos

afídeos, e foram testadas respostas de espécies de afídeos economicamente importantes

sendo avaliada em laboratório; mais de 90% dos Myzus persicae responderam em um

ensaio em larga escala que poderiam impedir a colonização e a transmissão do vírus

mosaico de pepino (CMV) (BOWERS et al., 1977; DAWSON et al., 1982; PALUKAITIS e

GARCIA-ARENAL, 2003).

2.7 Testes de citotoxicidade

Os indicadores de germinação, alongamento de radícula primaria em combinação

com o comprimento de parte aérea são parâmetros que podem mostrar mudanças na

qualidade do meio. As sementes de espécies de importância agrícola em testes fitotóxicos

como Lactuca sativa L. (alface), Solanum lycopersicum (tomate) e Cucumis sativus L.

(pepino), apresentam grandes vantagens que podem ser mantidas em condições adversas

sem perder sua viabilidade, quando as condições favoráveis estão presentes, elas sofrem

mudanças rápidas em seu metabolismo e divisão celular (ALVES et al., 2004;

RODRÍGUEZ-ROMERO et al., 2004).

Nos estudos alelopáticos o uso de Lactuca sativa como alvo reside na sensibilidade

da espécie, apresenta características peculiaridades que favorecem sua utilização como:

germinação rápida, pequeno número de cromossomos, grau de sensibilidade a baixas

concentrações de metabólitos secundários e presença de cromossomos grandes sendo as

duas últimas características facilitadoras para análises citogenéticas(FERREIRA e

AQUILA, 2000; ALVES et al., 2004; MOREIRA, 2018).

Têm sido observados efeitos alelopáticos de diversos extratos voláteis de óleos na

germinação e no cumprimento de raiz de alface com resultados tanto alelopáticos

inibitórios quanto efeito benéfico estimulada pelo crescimento da radícula e não inibição da

germinação de sementes de alface (ALVES et al., 2004; FERREIRA et al., 2007). Vários

12

estudos têm sido conduzidos em biotestes de laboratório com L. sativa, aplicado em

monitoramento da qualidade da água nos ecossistemas aquáticosdevido a extrema

importância do ponto de vista ecotoxicológico (RODRÍGUEZ ROMERO et al., 2014) e

estudos de toxicidade de solos potencialmente contaminados (BOWERS et al., 1997).

Os estudos citogenéticos de espécies vegetais informam a respeito de possíveis

alterações cromossômicas nas plantas decorrentes do seu metabolismo (BAGATINI et al.,

2007; BONCIU et al., 2018).

Allium cepa é a espécie vegetal mais utilizada em testes de toxicidade e

genotoxicidade devido às características que possui como crescimento rápido de suas

raízes, grande número de células em divisão, cromossomos em número reduzido, baixo

custo, e de grande tamanho (2n = 16), possuem grande tolerância a diversas condições de

cultivo, estão disponíveis o ano todo e apresentam fácil manuseio (MAZIVIERO,

2011;SANTOS, 2016).

O teste de A. cepa é amplamente utilizado em farmacologia para estudos de

genotoxicidade de fator químico que pode ser um risco para a saúde do homem, través do

teste de aberrações cromossômicas em linfócitos humanos, procurou-se também, avaliar o

potencial mutagênico de carqueja (Baccharis trimera) utilizando como modelo a A. cepa

(FISKESJÖ, 1985; BAGATINI et al., :2007; PINHO et al., 2010).

Em boas condições de estudo é possível observar diversos distúrbios na divisão

celular, detectar clastogenicidade que consiste na quebra de cromossomos e aneugenicidade

derivando aneuploidia ou segregação cromossômica anormal devido a disfunções no

aparato mitótico por mudanças turbogênicas (GRANT, 1982; BAGATINI et al., 2007;

BELCAVELLO et al., 2012).

Qualquer desvio da progressão ordenada e dirigida do ciclo celular e,

respectivamente, da mitose e citocinese, é refletido em um estado de citotoxicidade e

genotoxicidade. Estes são avaliados pelo índice mitótico, percentagem de células em cada

fase da mitose (prófase, metáfase, anáfase e índice de telófase) (BONCIU et al., 2018).

13

CAPÍTULO I

3. RESISTÊNCIA AO VÍRUS DO MOSAICO DO PEPINO E BIOLOGIA

REPRODUTIVA DE ACESSOS BRASILEIROS DE MELÃO

RESUMO

No meloeiro, a resistência ao Vírus do Mosaico do Pepino(CMV) e o conhecimento sobre

características reprodutivas são importantes para escolha de genitores de populações de

melhoramento. Desta forma, realizou-se este estudo com os objetivos deverificar se

diferentes acessos de melão em um banco de germoplasma brasileiro possuem variabilidade

na resistência ao CMV (estirpe FNY) e no polimorfismo em locos marcadores de

resistência, bem como se há diversidade genética quanto à resistência e aos descritores da

morfologia floral e do comportamento reprodutivo, visando o melhoramento genético. Os

sintomas de CMV foram avaliados 21 dias após inoculação de 50 genótipos de melão

(acessos do banco e cultivares comerciais). Esses mesmos materiais foram genotipados com

três marcadores de polimorfismos de nucleotídeos únicos relacionados com resistência ao

CMV. Uma amostra de 24 genótipos foi caracterizada quanto a descritores florais e

reprodutivos. Foi constatada variação significativa nos níveis de resistência, permitindo

classificar os acessos em cinco grupos. Os polimorfismos detectados por meio dos

marcadores distribuíram-se de forma independente nesses grupos, consistente com a

natureza quantitativa oligogênica da resistência do meloeiro ao CMV. Houve diferenças

significativasentre acessos nos descritores florais e reprodutivos. Por meio da estratégia

multivariada Ward-MLM, esses acessos distribuíram-se em sete grupos com características

reprodutivas distintas, incluindo-se variabilidade em viabilidade polínica. Portanto, há

acessos brasileiros que possuem resistência ao CMV estirpe FNY, os quais são úteis aos

estudos da interação com o CMV e ao melhoramento para resistência, utilizando esquemas

de cruzamentos orientados a partir das características reprodutivas.

Palavras-chave: marcador molecular, SNP-CAP, diversidade genética, variabilidade floral

e reprodutiva, Ward-MLM, CMV.

14

RESISTANCE TO CUCUMBER MOSAIC VIRUS AND REPRODUCTIVE

BIOLOGY OF BRAZILIAN MELON ACCESSIONS

ABSTRACT

In melon the resistance to Cucumber Mosaic Virus (CMV) and the knowledge about

reproductive characteristics are important for the selection of genitors for breeding

population. The aim of this study was to verify if different accessions of melon from a

Brazilian germplasm bank to understand the variability in resistance to CMV (FNY strain)

and polymorphism in resistance loci markers, as well as whether there is genetic diversity

resistance and descriptors of floral morphology and reproductive biology, aiming at genetic

improvement indication. The symptoms of CMV were evaluated in 21 days after

inoculation of 50 melon genotypes (bank access and commercial cultivars). These same

materials were genotyped with three markers of single nucleotide polymorphisms related to

CMV resistance. A sample of 24 genotypes was characterized for floral and reproductive

descriptors. It was verified a significant variation in resistance levels, allowing to classify

the accesses in five groups. The polymorphisms detected by the markers were

independently distributed in these groups, consistent with the oligogenic quantitative

expression of the melon's resistance to CMV. There were significant differences between

accesses in floral and reproductive descriptors. Through the Ward-MLM multivariate

strategy, these accesses were distributed into seven groups with distinct reproductive

characteristics, including variability in pollen viability. Therefore, there are Brazilian

accesses that have resistance to CMV strain FNY, which are useful for studies of

interaction with CMV and resistance improvement, using cross-referencing schemes based

on reproductive characteristics.

Palavras-chave: molecular marker, SNP-CAP, genetic diversity, floral and reproductive

variability, Ward-MLM, CMV.

15

3.1 INTRODUÇÃO

O melão (Cucumis melo L.) é uma culturatropicalde alto valor comercial,originário

da região central da Ásia e África, com a sua maior diversidade botânica encontrada na

Índia, Irã, Afeganistão e China. Adicionalmente, o Brasil possui uma vasta amostragem da

variabilidade do germoplasma, com variedades e cultivares únicas, conservadas e

produzidas por produtores locais (ROCHAet al., 2010; CASTILHOS, 2012;COSTA,

2012).Grande parte da diversidade do germoplasma brasileiro de C. melo está conservada

no banco de germoplasma de Cucurbitaceae doBanco Ativo Germoplasma (BAG) da

Universidade Federal Rural do Semiárido (UFERSA)região produtiva da cultura no Brasil

(DANTAS et al., 2012; ARAGÃO et al., 2013).

O vírus do mosaico do pepino(CucumberMosaicVirus- CMV)pertence à família

Bromoviridae, sendo altamente destrutivo e relatado infestandomais de 1.200 espécies de

plantas em todo o mundo (MORRONI et al., 2008; DUBEY et al., 2015).Os principais

sintomas induzidos pelo vírus são mosaicos, distorção foliar, descoloração das plantas e o

amarelecimento, os quais estão associados a grandes perdas de rendimento no melão. A

resposta fenotípica de meloeiros à inoculação com CMV tem sido avaliada em diferente

número de dias após inoculação, proporcionando o estabelecimento de uma escala

numérica de notas (PALUKAITIS, 1992; GUIU-ARAGONÉS et al., 2014;). As notas

atribuídas aos sintomas variam de 0 a 5, sendo a nota 0correspondente a aquelas que não

apresentaram sintomas; nota 1, com mosaico muito leve apenas nas primeiras uma ou duas

folhas; nota 2,mosaico leve em todas as folhas; nota 3,mosaico mais forte em todas as

folhas; nota 4,mosaicos muito fortes com algumas folhas onduladas; nota 5,mosaicos muito

fortes com folhas onduladas e muito pequenas e plantas pequenas.

Em estudo de resistência foi demonstrado que o acesso coreano silvestre PI161375

("Sonwang Charmi" - SC) apresenta resistência oligogênica ao CMV, sendo recessiva e

quantitativa, com QTL localizados nos grupos de ligação GLIII, GLV e GLXII.Uma

coleção de linhas quase isogênicas (NIL) de SC introduzido no genoma da variedade

suscetível Pele de Sapo (PS) foi desenvolvida para caracterizar os níveis de resistência ao

CMV, mostrandoespecificidade entre NIL ediferentesestirpes de viraisde CMV (GINER et

al., 2017). Um mapeamento mais detalhado desta região mostrou que o gene de resistência

cmv1 em uma área de 2,2 cM localizado no GLXII. Além disso, cmv1 confere resistência

16

total a algumasestirpes virais, indicando que nestes casos a resistência não é quantitativa e

que cmv1 é suficiente para conferir resistência total a essas estirpes de CMV. Contudo, na

cultivar SC a resistência ao CMV é proposta como oligogênica, onde diferentes loci

conferem resistência a diferentes cepas de CMV, mas não necessariamente quantitativas,

uma vez que pelo menos um desses genes (cmv1) confere resistência total, semelhante ao

parental SC, e não precisa da contribuição de outros loci (ESSAFI et al., 2009). Estudos

posteriores demonstraram que a resistência desse cultivar de melão ao CMV é governada

por um gene (de efeito maior) e pelo menos dois QTL dentre as demais três regiões

genômicas de melão envolvidas em resistência ao CMV. Portanto, funciona como

qualitativa em determinados cruzamentos e como quantitativa em outros cruzamentos

(GUIU-ARAGONÉS et al., 2014).

Os genótipos de melão possuem diferentes características morfológicas,

bioquímicas e ampla divergência polimórfica de DNA devido à sua origem, podendo ser

agrupadas em variedades botânicas africanas, espanholas, europeias e norte-americanas. As

características morfológicas relacionadas com os estádios vegetativos e de floração são

parâmetros que permitem manter a estrutura populacional do germoplasma para atividades

comerciais e programas de melhoramento (STEPANSKY et al., 1999; STAUB et al.,2004).

Quanto à expressão sexual, os acessos são classificados como monóicos, isto é, plantas com

flores masculinas e femininas na mesma planta, mas separadas ao longo do ramo, bem

comoandromonóicos, isto é, com plantas de flores masculinas e hermafroditas separadas na

mesma planta (TORRES FILHO et al., 2009). As flores do meloeiro necessitam de

polinização entomófila para atingir um grande número de frutos vingados, e tanto a

polinização cruzada manual quanto a polinização aberta realizada por abelhas melíferas

introduzidas na área cultivada podem assegurar níveis adequados de polinização da cultura

(SOUSA et al., 2009). A produção de flores masculinas ocorre durante aproximadamente

30 dias, iniciando-se entre 14 e 15 dias após o plantio, enquanto que as flores hermafroditas

são produzidas a partir de vinte dias após o transplante em um período de 15 dias (ABREU

et al., 2008).

Apesar da ampla diversidade genética e morfológica nas coleções brasileiras de C.

melo, o conhecimento da variabilidade da resposta de resistência a doença tem sido pouco

explorado. Adicionalmente, o entendimento das relações reprodutivas entre

17

acessoséescasso, o que dificulta as estratégias de melhoramento genético, especialmente

envolvendo cruzamentos entre acessos e variedades. Desta forma, realizou-se este estudo

com os objetivos de verificar se diferentes acessos de melão em um banco de germoplasma

brasileiro possuem variabilidade na resistência ao CMV (estirpe FNY) e no polimorfismo

em locos marcadores de resistência, bem como se há diversidade genética quanto à

resistência e aos descritores da morfologia floral e do comportamento reprodutivo, visando

o melhoramento genético.

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

3.2.1Material Vegetal

O material vegetal utilizado no presente estudo foi obtido do Banco Ativo

Germoplasma (BAG) da Universidade Federal Rural do Semiárido (UFERSA), consistindo

de 44 acessos tradicionais brasileiros, quatro híbridos intervarietais, duas cultivares

comerciais e duas variedades sabidamente contrastantes para resistência ao CMV.

3.2.2 Inoculações com CMV e avaliação de sintomas

A análise da resistência ao CMV foi realizada por meio da inoculação artificial em

folha cotiledonar, levemente pulverizada com agente abrasivo e molhada com a suspensão

viral, seguida de muito leve fricção com um bastão de porcelana. O delineamento utilizado

para a experimentação foi inteiramente casualizado em condições experimentais

controladas em câmara de crescimento de plantas com fotoperíodo de 16 horas dia e 8

horas noite na temperatura fixa de 22° C.

A estirpe FNY foi escolhida por induzir sintomas contrastantes de resistência ao

CMV nos dois acessos utilizados como controle: PI161375"Sonwang Charmi" - SC, daqui

para frente denominado de PI, padrão de resistência; Pele de Sapo, PS (GUIU-

ARAGONÉS et al., 2014). As folhas de Cucurbita pepo (Abobrinha caserta TS) infectadas

pelo CMV foram utilizadas para a produção de inóculo, por maceração em tampão fosfato

[(0,03 mol/L Na2HPO4, 0,2 % diethyldithiocarbamate (DIECA), na proporção de 1:4

peso/volume (folha:tampão)] (LECOQ et al., 1991). Uma alíquota do extrato foliar foi

18

aplicada sobre cada folha cotiledonar expandida dos tratamentos. As avaliações de sintomas

foram realizadas por escala de notas descrita por GUIU-ARAGONÉS et al., (2014),

repetindo avaliações aos 7, 14 e 21 dias após inoculação (DAI), de modo a representar os

sintomas iniciais aos sete dias e os sintomas típicos da doença aos 14 e 21 DAI.

3.2.3 Polimorfismo genético em regiões genômicas para a resistência ao CMV

A análise do polimorfismo genômico associado a resistência ao CMV foi realizada

pela genotipagem com marcadores de polimorfismo de nucleotídeo único detectado por

meio da técnica de clivagem de produtos amplificados por PCR, denominando-se os

marcadores assim gerados de SNP-CAP. Desta forma, foram analisados os locos AI_33-

H11 (DELEU et al., 2009), PS_40-E11 (DELEUet al., 2009) e CmeIF4E(MORENO et al.,

2008), os quais foram escolhidos por representarem três QTL responsáveis pela resistência

ao CMV (ESSAFI et al., 2009).

O DNA genômico dos 52 acessos foi extraído de folhas maceradas em nitrogênio

líquido, misturadas ao tampão 2% CTAB (DOYLE e DOYLE, 1990), modificado a partir

de protocolos previamente estabelecidos para outras plantas (CORRÊA et al., 1999). A

quantificação e análise da integridade do DNA extraído foram realizadas por eletroforese

em gel de agarose 1% com corante para DNA SYBR Safe (InvitrogenTM

), em comparação

com o marcador para concentração Lambda, seguindo de diluição do DNA para a

concentração de 5 ng/μL.

As reações de amplificação em cadeia da polimerase(PRC) foram realizadas para

um volume final de 25 μL com o acréscimo de: 15ng de DNAgenômico, tampão para PCR

1X (Tris-HCl a 10mMol.L-1

, KCl a 50 mMol.L-1

, MgCl2 a 2 mMol.L-1

, pH 8,5), TBT-PAR

[trehalose a 750 mMol.L-1

; BSA a 1 mg/mL; Tween-20 a 1%] (SAMARAKOON et al.,

2013), dNTPs a 250 μMol.L-1

, primera 0,2 μMol.L-1

(DELEU et al., 2009; MORENO et al.,

2008), 1,5 U de Taq DNA polimerase (InvitrogenTM

). As amplificações foram realizadas

em termocicladorVeriti® (AppliedBiosystems) programado para o seguinte protocolo:

desnaturação inicial a 94ºC por 2 min, seguindo de 30 ciclos de 94ºC por 20 s, 55ºC por 20

s e 72ºC por 2 min; a extensão final foi realizada a 72ºC por 5 min. Os produtos de

amplificação dos lociSNP-CAP foram visualizados em gel de agarose 1,8% contendo o

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Samarakoon%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=25202481

19

corante para DNA SYBR®Safe (InvitrogenTM

) e marcador de peso molecular Ladder

100pb (Sinapse Biotecnologia).A detecção do polimorfismo foi verificada por meio de

eletroforese em gel de agarose 3% dos produtos PCR, previamente digeridos com enzima

de restrição específica: lócus AI_33-H11 com a enzima Hind III; locus PS_40-E11,Alu I;

elocusCmeIF4E, AfaI (RsaI). O total de 10 μL do produto de PCR mais 2 μL de tampão

10X específico para a enzima e 0,5 μL de enzima foram incubados em banho Maria por 1

hora a 37ºC. A separação dos produtos gerados pela digestão enzimática foi realizada por

eletroforese em gel de agarose 3%, utilizando corante de DNA SYBR®Safe (InvitrogenTM

)

com marcador de peso molecular Ladder 100 pb (Sinapse Biotecnologia).

3.2.4 Viabilidade polínica e receptividade do estigma

As flores previamente marcadas no dia anterior foram coletadas às 7h da manhã e

colocadas em placas de Petri devidamente protegidas com papel alumínio, fechadas e

levados para o laboratório de Centro de biotecnologia e genética (CBG)para a realização

dos ensaios. A suspensão de pólen foi produzida em 50 µL de água destilada ou solução

saturada de sacarose, pressionando-se as anteras delicadamente três ou quatro vezes com

auxílio de uma ponteira de micropipeta. Quatro gotas dessa suspensão foramcolocadas nas

extremidades de cada placa de Petri contendo o meio de cultura,onde, após um período de

tempo pré-determinado procedeu-se à avaliação da germinação dos grãos de pólen.

Para a avaliação da viabilidade do pólen, o método de coloração morfológica foi

utilizado com corante Alexander para realizar uma classificação visual sob o microscópio

de grãos viáveis e não viáveis, e calcular a percentagem de viabilidade. Os grãos com

núcleo corado foram considerados viáveis, enquanto aqueles que não o mostraram foram

considerados mortos. Para essas observações foram utilizadas o microscópio de Leica 10X.

A germinação in vitro de grãos de pólen foi realizada em meio de cultura utilizado

por Bruckner et al., (2000). A observação da emissão do tubo polínico foi realizada com

auxílio do microscópio de luz, depois de determinado período, o número de grãos que

produzem tubo polínico viável, com comprimento maior que o diâmetro do pólen

(SALLES et al., 2006). Foram avaliados o número de grãos de pólen por campo visual e a

percentagem de grãos de pólen germinados. Em cada gota de suspensão quatro campos de

20

visão no microscópio foram analisados, o que equivale a quatro repetições. São

considerados germinados os grãos cujos tubos polínicos tenham ultrapassados o

comprimento do diâmetro do próprio grão de pólen. Cada flor coletada foi submetida as

duas concentrações e observado em um determinado horário. Para a receptividade de

estigma foi coletado a flor feminina retirada às pétalas para posteriormente submergir em

solução de benzidina e peróxido de hidrogênio a 3%, foi considerada estigma receptiva

aquelas que mudarem de cor por oxidação e apresentar borbulhas uma vez em contato com

a solução (teste duplo).O experimento foi realizado em delineamento inteiramente

casualizado, com cinco repetições métricas em cada planta para cada descritor quantitativo.

A verificação de diferença significativa foi realizada por meio da análise de variância

(ANOVA) com a utilização do software SISVAR (FERREIRA, 2011).Adicionalmente, foi

realizado o teste de Tukey a 5% de probabilidade para as variáveis de biologia reprodutiva,

bem como o agrupamento de Scott-Knott a 5% de probabilidade visando agrupar a médias

distribuídas entre os acessos dentro de variedade.

3.2.5 Diversidade genética floral e reprodutiva

A semeadura dos diferentes acessos de melão foi realizada no período de janeiro,

em copos de poliestirenos, preenchidas com substrato comercial e solo em uma proporção

1:1. O transplante foi aos quinze dias após a semeadura, em vaso de poliestireno de 10

litros. O manejo da adubação foi feito via fertilização química e irrigação (DE CASTRO

LIMA et al., 2018).

A mensuração das variáveis citadas abaixo foi realizada com paquímetro digital

graduado em milímetro. Número de dias para o florescimento: foram contados o número de

dias para o aparecimento da primeira flor masculina em 50% das plantas da parcela;

Comprimento das pétalas (CP): correspondeu à distância das duas extremidades

longitudinais; Largura da flor (LF): correspondeu a maior distância horizontal entre as

bordas; Comprimento de receptáculo (CR): O Comprimento das brácteas (CB): da inserção

da bráctea no receptáculo. Largura de receptáculo (LR): Da maior dimensão do diâmetro do

receptáculo. Comprimento da flor (CF): correspondeu à distância das duas extremidades

longitudinais.

21

Além da análise de variância (ANOVA) para dos descritores florais quantitativos, a

análise multivariada Ward-MLM também foi realizada.O procedimento multivariado

Ward-MLM foi realizado por meio da matriz de distância obtida pela função logarítmica do

coeficiente de Gower (GOWER, 1971), segundo o método utilizado por MELO et al.

(2015)em plataforma de análise do Software SAS (SAS, 2000).Os valores médios das

variáveis quantitativas foram incluídos na análise em conjunto com os dados qualitativos de

acesso. Adicionalmente, foram adicionadas na análise a informação de sintomatologia

observadas no laboratório, pela codificação para a doenças de CMV aos 21 DAI.

3.3 RESULTADOS

3.3.1 Sintomatologia e polimorfismo genético relativo à resistência ao CMV

Na avaliação baseada em escala de notas atribuídas às modificações fenotípicas

após inoculação artificial do CMV, foram observadas diferenças altamente significativas

nos sintomas entre os diferentes números de DAI. Os valores médios de notas aumentaram

em função do aumento do número de DAI, os quais foram dispostos em cinco grupos

distintos pelo teste de comparação de média (Tukey a 5%; DMS: 0.1419). Quanto ao

germoplasma avaliado, houve diferenças significativas entre os diferentes acessos dentro de

cada momento de observação, comprovando a existência de variabilidade genética para

resistência ao CMV nesses materiais. A distribuição das notas entre os acessos nos 7 DAI

revelou elevado coeficiente de variação (CV = 62%), sendo esse parâmetro estatístico

reduzido aos 14 DAI (54%) e consideravelmente menor nos 21 DAI (34%), adotando-se

esse último ponto de observação para as demais análises porque os sintomas dos dois

controles (PI e PS) foram típicos da doença, tal como descrito na literatura.

A avaliação fenotípica dos sintomas com base na escala de notas observadas aos 21

DAI apresentou consistência para os controles experimentais (Tabela 1). O genótipo

exótico PI, utilizado como controle de resistência,revelou a menor nota (média 0,3), ao

passo que a cultivar PS, utilizada como o padrão de suscetibilidade, apresentou elevada

nota média de sintoma (4,8), com morte de algumas repetições ao longo da experimentação.

Quanto ao germoplasma avaliado, os acessos A16 e A42 apresentaram notas menores que

0,5, contrastando com os acessos A43 e A45 que exibiram os maiores valores (nota 5,0). Os

22

híbridos PSaxA16 e A16x PI, exibiram notas médias de 2,4 e 1,8, respectivamente.

Contudo, o híbrido A16 x PIb revelou nota média abaixo de 0,8 (várias repetições sem

sintoma).

Tabela 1.Genótipos de Cucumis melo analisados no presente estudo, indicando-se os

respectivos grupos botânicos, nota média de sintomas aos 21 dias após inoculação (DAI)

artificial com CMV, Grupo definido pelo teste Scott-Knott a partir das notas médias, e

padrão genotípico obtido em três locos-marcadores SNP-CAP dos principais QTL para a

resistência ao CMV.

Genótipo Grupo botânico1 Nota Grupo

QTL SNP-CAP de resistência ao CMV

PS_40-E11 AI_33-H11 CmeIF4E

A1 Cantaloupensis 1,7 II ab Ab Bb

A2 Cantaloupensis 2,4 II bb Ab Aa

A3 Cantaloupensis 2,6 III ab Bb Aa

A4 Cantaloupensis 2,0 II bb Bb Aa

A5 N/D 4,3 IV ab Aa Aa

A6 Cantaloupensis 2,3 II bb Bb Ab

A7 Cantaloupensis 0,8 I bb Bb Ab

A8 N/D 1,9 II ab Bb Aa

A9 Conomon 1,1 I ab Aa Aa

A10 Cantaloupensis 2,7 III ab Bb Aa

A11 Conomon 1,6 II aa Aa Ab

A12 N/D 2,0 II aa Ab Aa


A14 Cantaloupensis 1,2 I ab Aa Aa

A15 Momordica 2,7 III ab Ab Aa

A16 Conomon 0,4 I ab Ab Bb

A17 Conomon 4,3 IV ab Ab Ab

A18 Cantaloupensis 2,7 III ab Ab Ab

A19 N/D 2,7 III aa Aa Ab

A20 Momordica 3,7 IV bb Ab -

A21 Conomon 2,1 II aa Bb Aa

A22 Cantaloupensis 2,6 III ab Ab Aa

A23 Momordica 3,2 III ab Aa Aa

A24 Cantaloupensis 2,0 II bb Aa Aa

A25 Cantaloupensis 3,0 III bb Aa Aa

A26 N/D 2,5 III ab Ab Aa

A27 N/D 2,3 II bb Bb Aa

A28 Cantaloupensis 1,3 I aa Ab Aa

A29 Cantaloupensis 0,8 I ab Aa Aa

A34 Cantaloupensis 4,3 IV ab Ab Ab

A35 N/D 1,4 II ab Aa Aa

A36 Cantaloupensis 1,0 I ab Bb Aa

A37 Momordica 1,0 I bb Bb Bb


23

A41 Cantaloupensis 3,5 III ab Ab Ab

A42 Momordica 0,5 I ab Aa Ab

A43 Inodorus 5,0 V ab Aa Aa

A44 Inodorus 2,8 III ab Ab Aa

A45 Inodorus 5,0 V ab Aa Aa

D1 N/D 3,9 IV ab Aa Ab

D2 N/D 3,2 III - - -

D6 N/D 2,7 III bb Bb Aa

D7 N/D 3,9 IV bb Ab Aa

D8 N/D 2,7 III ab Bb Ab

PI2 Chinensis 0,3 I bb Bb Bb

PS2 Inodorus 4,8 V ab Ab Aa

Galia3 Inodorus 1,0 I bb Bb Bb

Cantaloupe3 Cantaloupensis 1,8 II ab Bb Bb

PSa x A164 N/D 2,4 II bb Bb Ab

A16 X PIb4 N/D 0,8 I ab Ab Ab

PI X A164 N/D 1,8 II bb Ab Ab

E66 Inodorus 2,3 II - - - 1Classificação taxonômica estabelecida por TORRES FILHO et al. (2009) segundo

STEPANSKY et al. (1999); 2cultivares de referência para níveis de resistência ao CMV;

3cultivar comercial;

4híbrido intervarietal; N/D significa que o grupo taxonômico não

definido; - dado faltante.

Uma ampla variação nos valores das notas atribuídas aos sintomas nos acessos

testados foi observada (Figura 1). Os cinco grupos formados pelo teste Scott-Knott a partir

dessas notas revelam existência de diferentes níveis de resistência dos acessos brasileiros de

melão ao CMV. No grupo I, formado pelas plantas com níveis de resistência que não

diferem estatisticamente de PI (controle resistente), incluíram-se nove acessos e o cultivar

Gália. No outro extremo da distribuição encontra-se o cultivar PS (controle suscetível)

juntamente com dois acessos que não diferem dele estatisticamente quanto à intensidade

dos sintomas de doença.

24

Figura 1. Distribuição da frequência de notas de sintomas observados em 52genótipos de

melão avaliados aos 21 dias após inoculação artificial com CMV, indicando-se os grupos (I

a V) formados pelo teste Scott-Knott a partir das notas médias. Os genótipos são assim

denominados: a série identificada com A ou D, seguidas de um numeral, são acessos do

banco de germoplasma; controles experimentais são o resistente (PI) e o suscetível (PS) ao

CMV; os demais são cultivares comerciais e híbridos.

A genotipagem com os marcadores SNP-CAP localizados em QTL de resistência de

meloeiros ao CMV (ESSAFI et al., 2009;GUIU-ARAGONÉS et al., 2014) explicitou

polimorfismos nesses locos entre os acessos(Tabela 1). O loco PS_40-E11 amplificou uma

banda com cerca de 390 pb que, após a digestão com enzima de restrição, evidenciou alelos

distintos entre PI e OS (Figura 2). Esses alelos estão presentes nos acessos brasileiros, os

quais possuem 40% genótipos homozigotos e 60% heterozigotos. Apenas cinco genótipos

foram homozigotos para o alelo sem o sítio de restrição que é considerado selvagem (a), o

que representa 10% da população analisada. O alelo mutante (b) apresentou uma elevada

frequência populacional (0,6) com 30% dos genótipos portadores da mutação de ponto

G→A em homozigose. De forma semelhante ao caso anterior, os alelos do loco AI_33-

H11, gerados a partir do amplicon de cerca de 260 pb, distribuíram-se nessas mesmas

frequências entre os acessos analisados. Contudo, 28%dos genótipos foram considerados

25

homozigotos para o alelo selvagem (a), com o sítio de restrição. Já para o alelo com

mutação de ponto T→C, os homozigotos para esse alelo representam 32% da população,

havendo frequência alélica populacional de 0,52. O loco CmeIF4E ligado ao gene cmv1

indicou a presença de apenas oito genótipos com o mesmo perfil alélico que a cultivar

resistente PI161375, o qual apresenta o alelo mutante em homozigose(Tabela 1). A maior

percentagem do germoplasma analisado possui o alelo em sua composição de base

selvagem, com 55% da população em homozigose.

Figura 2.Genotipagem em gel de agarose 3% de uma amostragem da população revelando

o polimorfismo em marcadores SNPs-CAPs em acessos brasileiros de Cucumis melo. A)

Acessos PI e PS genotipados quanto os lociPS_40-E11 e AI_33-H11. B) Acessos

genotipados quanto os lociPS_40-E11. M100pb = Marcador de peso molecular Ladder 100

pb.

3.3.2 Viabilidade polínica e receptividade do estigma

A coloração com o uso de solução de Alexander apresentou padrão microscópico

típico demonstrativo da viabilidade de grãos de pólen (Figura 3A). Na avaliação feita às 8 h

apresentou diferença significativa entre os acessos (Tabela 3). Nessa avaliação, acesso A28

26

apresentou menor viabilidade (117 grãos de pólen) enquanto que o acesso A8 foi o de

maior valor (196,66). Para a viabilidade de grãos de pólen avaliados às 15 h, o acesso A28

apresentou menor viabilidade e foi estatisticamente diferente dos demais acessos. Contudo,

maior viabilidade às 15 h foi observada no acesso A8 (193,33), sendo a média de 183,08 e

coeficiente de variação de 3,41% (Tabela 3).

O horário mais propício para a coleta de grãos de pólen e polinização foi às

8h(média de grãos de pólen viáveis às 8 h foi de 192,38 e às 15 h foi de 183,03). Também

foram contabilizados grãos de pólen vazios (Figura 3B), havendo diferenças significativas

para diferentes horários de coleta às 8 h houve a menor quantidade de grãos de pólen vazios

(média de 7,02) e às 15 horas a maior (média de 16,27). O acesso A8 foi o de melhor

desempenho com menor quantidade de grãos de pólen vazios, enquanto que os acessos A28

e Gália foram a que apresentaram mais grãos de pólen vazios. Não houve diferença

significativa para grãos de pólen contraídos (Figura 3C), sendo a média geral de 0,579.As

percentagens de grãos de pólen germinados in vitro (Figura 3D) apresentam diferença

significativa e grande variabilidade, sendo que o acesso A16 apresentou menor

percentagem de germinação (19,62%) e o acesso A41 a maior (95,62%). Todas a flores

femininas dos acessos avaliados foram positivos segundo a teste de receptividade

estigmática (Figura 3E - F).

Figura3. Características das células germinativas da flor masculina e receptividade de

estigma. A) Grãos de pólen inteiros com viabilidade corada em Alexander; B) Grão de

pólen vazio, não viável para polinização; C) Grão de pólen colapsado considerado inviável

27

para a fecundação de óvulo; D)Grãos de pólen com tubo polínico germinados em meio de

cultura, indicando-se pólen sem tubo polínico germinado (seta) e pólen com tubo polínico

curto (ponta de seta). E) Receptividade de estigma borbulhando em solução de benzidina e

peróxido de hidrogênio a 3%. F) Estigmas de cor preta resultado da oxidação em diferentes

acessos brasileiros de melão.

3.3.3Variabilidade e diversidade genética floral e reprodutiva

A análise da diversidade em características florais foi realizada em 24 genótipos,

sendo 22 acessos brasileiros, uma variedade comercial e um híbrido de meloeiro (Tabela 3).

Foram observadas diferenças altamente significativas nesse germoplasma para todos os

descritores florais analisados. O comprimento de pétalas variou de 8,81mm (acesso A3) a

16,31mm (A35), apresentando um coeficiente de variação de 13,10% e média de 13,57

mm. A largura de flor foi maior para A5 com 33,29 mm e A3 apresentou menor largura

com 14,06 mm sendo a média geral de 27,78 mm. O comprimento de receptáculo variou de

6,01 mm para A17 e 4,29 mm para o acesso A3 sendo a média de 5,35 mm. Para a

característica de comprimento de brácteas a variedade comercial Gália com 4,60 mm foi

maior e o acesso A3 apresentou menor comprimento com 1,93 mm e a média geral foi de

2,78 mm. Com relação à LR, o acesso A29 foi o que apresentou o menor valor de 2,26 mm

e a cultivar Gália o maior valor com 3,40 mm. Também para CF, Gália apresentou o maior

valor (35,01 mm) e o acesso A42 foi que apresentou menor comprimento (19,39 mm).

Tabela 3.Valores médios para os descritores florais e de viabilidade e germinação polínica

reprodutiva em diferentes genótipos de melão.

Descritor*

Genótipos CP LF CR CB LR CF VGP 8h VGP 15h GGP

A2 13,44b 28,69c 5,17a 2,10a 2,67a 25,57b 194,33c 198,16c 68,87e

A3 8,81a 14,06a 4,29a 1,93a 2,47a 20,33a 196,00c 195,16c 65,00e

A4 14,80b 29,29c 5,58b 3,07c 3,08b 26,11b 197,66c 198,16c 92,12h

A5 16,21b 33,29c 5,12a 2,52b 2,94b 28,55c 192,00c 192,33c 84,50g

A8 14,92b 30,59c 5,89b 3,74c 3,14b 30,27c 199,33c 199,33c 86,00g

A13 15,28b 29,44c 5,57b 2,77b 3,30b 25,85b 194,25c 193,50c 59,75d

A14 12,34a 25,67b 5,44b 2,79b 2,97b 25,00b 195,16c 192,83c 78,75f

A15 12,34a 26,27b 4,87a 2,31a 2,46a 24,40b 198,75c 198,33c 75,75f

A16 11,62a 23,35b 5,42b 3,08c 3,17b 20,54a 193,50c 192,16c 19,62ª

A17 15,73b 31,26c 6,01b 2,88b 3,05b 26,68b 192,58c 191,33c 84,37g

A22 15,52b 28,89c 5,78b 2,55b 3,10b 27,40b 197,50c 197,83c 85,37g

A25 14,47b 28,42c 5,40b 3,38c 3,14b 29,12c 185,83c 191,16c 79,00f

A26 13,05a 27,93c 5,92b 2,46b 3,03b 26,31b 195,50c 196,83c 62,00d

A28 13,47b 29,13c 4,97a 2,57b 2,82b 29,40c 117,00a 38,83a 73,00e

A29 11,78a 24,86b 4,83a 2,45b 2,26a 25,00b 196,66c 196,83c 71,12e

28

A35 16,31b 32,57c 5,06a 2,89b 2,94b 28,35c 188,83c 194,83c 27,87b

A36 14,37b 30,12c 5,85b 3,31c 3,15b 27,02b 197,41c 196,50c 95,12h

A37 10,92a 23,38b 4,75a 2,25a 2,90b 20,93a 137,16b 77,50b 77,87f

A39 10,32a 22,01b 5,11a 2,22a 2,94b 21,78a 194,33c 194,50c 33,12b

A41 15,81b 32,76c 6,11b 3,68c 3,11b 30,53c 195,91c 195,33c 95,62h

A42 10,80a 22,92b 5,03a 1,68a 2,54a 19,39a 195,00c 194,16c 95,12h

A45 15,43b 32,44c 5,25b 2,78b 2,98b 26,48b 187,83c 183,33c 93,62h

Gália 15,44b 32,44c 5,48b 4,6c 3,40b 35,01c 169,25c 193,50c 53,75c

A16 x PIb 12,49a 26,87b 5,49b 2,63b 3,20b 27,60b 193,83c 191,50c 50,50c

CV% 13,10 12,15 8,69 16,46 10,17 11,80 11,64 3,41 7,44

Média 13,57 27,78 5,35 2,78 2,95 26,15 187,73 183,08 71,16

*CP comprimento das pétalas, LF largura da flor, CR comprimento de receptáculo, CB

comprimento de brácteas, LR largura de receptáculo, CF comprimento da flor,

VGPviabilidade de grão de pólen, GGP germinação de grão de pólen, CV % coeficiente e

variação. Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não diferem estatisticamente

pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. Os genótipos identificados com a letra A

seguida de números são acessos do banco de germoplasma; Gália é uma cultivar comercial

A16 x PIb é um híbrido.

A dupla estratégia Ward-MLM permitiu a análise da diversidade genética no

germoplasma em estudo, utilizando-se os parâmetros reprodutivos conjuntamente com as

médias de notas fenotípicas de resistência ao CMV aos 21 DAI. Com essa estratégia, o

germoplasma ficou distribuído em sete grupos geneticamente distintos entre si(Tabela 4). A

definição desse número ideal de grupos foi realizada com base no maior aumento da função

de verossimilhança, o qual ocorreu no número sete com incremento de 23,37(Figura

4A).No grupo 1 foram alocados seis acessos, enquanto que no 7 associou-se apenas a

cultivar comercial Gália. O acesso A16 foi distribuído no mesmo grupo que o híbrido

intervarietal A16 x PIb.

29

Figura4. Agrupamento dos 24 genótipos de melão com base nas características

quantitativas de resistência ao CMV e características florais. A) Definição do número de

grupos pela função logarítmica de probabilidade (Log-Likelihood), formando-se sete grupos

(seta) pela estratégia multivariada Ward-MLM. B) Distribuição de 86,53% da variação com

o uso das duas primeiras variáveis canônicas no germoplasma de melão analisado.

Tabela 4. Grupos formados pelos métodos Ward-MLM pela análise dos dados

quantitativos.

Grupo Genótipo Principal característica*

1 A4; A13; A14; A25; A28; A36 Maior número de acessos

2 A8; A22; A41 Maiores médias de CR

3 A2; A3; A15; A26; A29 Menores médias de CR

4 A5; A17; A45 Maiores médias de CP

5 A16; A37; A42; A16 x PIb Menores médias para CP

6 A35; A39 -

7 Gália Apenas cultivar comercial

*CP comprimento das pétalas, CR comprimento de receptáculo.

Apesar dos descritores florais possuírem papel importante na distribuição da

variação pela técnica multivariada Ward-MLM, as características reprodutivas relacionadas

a viabilidade e germinação in vitro de grão de pólen foram as que mais contribuíram com a

distribuição do germoplasma (Tabela 5). Contudo, dentre as características reprodutivas, a

viabilidade polínica avaliada às 15 horas foi a que menos contribuiu para o entendimento da

variação. O grupo 7, representado pela cultivar Gália apresentou menor viabilidade polínica

e também a baixa capacidade de emissão de tubos polínicos in vitro de grãos de pólen.

A distância genética menor entre os grupos 1 e 2, seguindo dos grupos 5 e 6 (Tabela

6). Por outro lado, a cultivar comercial Gália apresentou-se distante dos demais grupos,

30

principalmente do grupo 2, representado por seis genótipos. O gráfico de distribuição da

variação com o uso das duas primeiras variáveis canônicas permitiu a visualização das

distâncias entre os grupos, sendo a soma das duas variáveis canônicas, o suficiente para

explicar 86,53% da variação no germoplasma analisado quanto a características florais e

reprodutivas (Figura 4B).

Tabela 5. Médias dos descritores quantitativos florais e de viabilidade e germinação in

vitro de grão de pólen para cada um dos sete grupos formados pelo método Ward-MLM e

as duas primeiras variáveis canônicas (CAN).

Descritor Grupo Variável canônica

1(6) 2(3) 3(5) 4(3) 5(4) 6(2) 7(1) CAN1 CAN2

CP 14,14 15,41 11,89 15,79 11,46 13,32 15,44 0,2598 0,6407

LF 28,68 30,75 24,36 32,33 24,14 27,29 32,44 0,1672 0,5935

CR 5,47 5,92 5,01 5,46 5,17 5,09 5,49 0,3624* 0,5345

CB 2,99 3,33 2,25 2,73 2,41 2,55 4,61 0,1321 0,8453

LR 3,08 3,12 2,58 2,99 2,95 2,94 3,41 0,0115** 0,6742

CF 27,08 29,40 24,36 27,23 22,11 25,07 35,01 -0,0184 0,7798

VIM 96,97 98,83 97,71 96,30 97,96 94,25 72,50 0,7767* -0,5795

VIT 84,25 98,75 98,53 94,50 81,91 97,33 96,75 0,0152** -0,0157

GER 79,62 89,00 68,55 87,50 60,78 30,50 53,75 0,6095 0,3721

CP) Comprimento das pétalas; LF) Largura da flor; CR) Comprimento de receptáculo; CB)

Comprimento de brácteas, LR) Largura de receptáculo; CF) Comprimento da flor; VIM)

Viabilidade polínica as 8h; VIT) Viabilidade polínica as 15h; GER) Germinação polínica.

CAN1) variável canônica 1; CAN2) variável canônica 2. *descritor com maior contribuição

na distribuição na variação na primeira variável canônica; **descritor com menor

contribuição na distribuição na variação na primeira variável canônica.

Tabela 6. Distância genética entre os grupos formados pelo método Ward-MLM

verificados em diferentes acessos de meloeiro, utilizando-se informações florais e

reprodutivas de natureza quantitativa e qualitativa.

Grupo 1 2 3 4 5 6 7

1 0 10,28 22,73 3,92 18,28 39,15 168,58

2

0 42,92 16,21 50,99 77,18 222,38

3

0 21,74 12,77 13,55 182,47

4

0 19,36 35,43 178,69

5

0 11,20 162,52

6

0 153,19

7

0

As variáveis qualitativas relacionadas com sintomas causados pelo CMV

possibilitaram a distribuição da variação baseando-se nos níveis de resistência ao vírus

(Tabela 7). No grupo 1 todas as plantas apresentaram-se moderadamente resistentes ao

31

CMV, enquanto que nos grupos 2, 3 e 4 a maior porção do germoplasma se apresentou

suscetível, representando 37% do germoplasma analisado. Apenas dois genótipos,

somando-se os grupos 5 e 6, apresentaram-se potencialmente resistentes ao CMV.

O tempo de floração masculina variou de precoce a mediana, sendo as plantas nos

grupos 2 e 5, exclusivamente de floração precoce (Tabela 7). Por outro lado, nos grupos 1,

6 e 7, o germoplasma analisado apresentou floração masculina mediana. O tempo de

floração feminina variou de precoce, mediana e tardia, diversificando-se entre as plantas de

todos os grupos, exceto no grupo 6 e 7, com plantas de floração feminina precoce e

mediana, respectivamente (Tabela 7).

Tabela 7. Distribuição das características qualitativas analisadas na estratégia multivariada

Ward-MLM. Frequência absoluta da variação em níveis de resistência de meloeiros ao

CMV em cada um dos sete grupos formados. Frequência no estágio de floração masculina e

feminina. Valores indicam o número de plantas em cada grupo com o nível de resistência

avaliado.

Grupo

Característica

qualitativas 1(6) 2(3) 3(5) 4(3) 5(4) 6(2) 7(1)

Nív

el d

e

resi

stên

cia Suscetível - 2 4 3 - - -

Moderadamente

resistente 6 1 1 - 3 1 1

Potencialmente

resistente - - - - 1 1 -

Flo

raçã

o

masc

uli

na Precoce - 3 1 2 4 - -

Mediana 6 - 4 1 - 2 1

Tardia - - - - - - -

Flo

raçã

o

fem

inin

a Precoce - 1 1 - 1 2 -

Mediana 3 1 4 2 3 - 1

Tardia 3 1 - 1 - - -

3.4 DISCUSSÃO

O CMV é um importante fator de estresse biótico, responsável por perda de

produtividade ou morte de meloeiros, afetando essa cultura no Brasil e em outros países

32

produtores como Espanha, Índia e China (VARMA e GIRI, 1998). A busca e a

identificação de recursos genéticos resistentes ao CMV para o melhoramento do meloeiro é

dificultada pela ampla variação nos sintomas, sugerindo o controle quantitativo da

resistência. O estudo baseando na segregação da resistência, baseando-se nas notas dos

sintomas juntamente com a caracterização genômica, demonstram que a resistência segue o

modelo de herança oligogênica com a prospecção de genes e indicações de QTLs

associados aos diversos níveis de resistência(DIAZ et al., 2003; GUIU-ARAGONÉS et al.,

2014).

No presente trabalho, a avaliação dos sintomas realizada semanalmente (7, 14 e 21

DAI), possibilitou definir o tempo de 21 DAI como adequado para avaliar os acessos

brasileiros de melão, por dois motivos: (i) os acessos brasileiros de melão suscetíveis não

morreram até 21 DAI e apresentaram sintomas comparáveis ao padrão suscetível (PS),

quando inoculados com a estirpe FNY, considerada muito virulenta para o meloeiro; (ii) as

médias dos sintomas dos controles ficam próximos dos valores máximos e mínimos da

escala de nota, de forma consistente ao descrito previamente para esses controles em

avaliações feitas de 16 a 20 DAI (GUIU-ARAGONÉS et al., 2014). Nas duas primeiras

semanas de avaliação dos sintomas não há distribuição normal das notas, o que é refletido

no elevado coeficiente de variação.

A formação de cinco grupos de genótipos representativos dos diferentes níveis de

resistência pelo agrupamento de Scott-Knott, aos 21 DAI, comprova que a população

analisada possui ampla variação nos níveis de resistência à doença. Ao menos nove acessos

brasileiros, mais a cultivar comercial Gália e o híbrido intervarietal A16 x PIB

apresentaram-se com resistência estatisticamente semelhante ao cultivar resistente PI, sendo

um indício de semelhanças nos genes de resistência ao CMV entre si, existindo potencial

para a seleção nesse germoplasma. Por outro lado, os acessos A43 e A45, distribuídos

juntamente com a cultivar suscetível PS, comprovam sua baixa resistência a infecção viral,

com mosaico característico em todas as folhas e morte de algumas plantas a partir de 21

DAI.

A variação genômica tem sido utilizada para o entendimento da natureza

oligogênica e quantitativa presentes na resistência encontrada no fitopatossistema

CMV/Cucumis melo. A identificação de QTL envolvidos na resistência ao CMV em

33

meloeiro foi realizada com utilização de marcadores moleculares do tipo sequência simples

repetida (SSR), SSR associados às sequências expressas (EST-SSR) e polimorfismo de

nucleotídeo único (SNP). Nesses estudos, quatro regiões genômicas contendo QTL foram

identificadas, demonstrando-se que pelo menos três delas são requeridas na expressão do

caráter resistente (GUIU-ARAGONÉS et al., 2014).

Os marcadores SNP-CAP AI_33-H11 e PS_40-E11 foram identificados

previamente (DELEUet al., 2009), mapeados nos grupos de ligação GLIII e GLX,

respectivamente, e encontram-se localizados na região franqueadora (AI_33-H11) e interna

(PS_40-E11)dos QTL associados a variação nos níveis de resistência ao CMV (GUIU-

ARAGONÉS et al., 2014). No presente estudo a presença dos alelos mutantes nesses dois

locos moleculares em frequências acima de 0,4 é indício da existência de variabilidade nos

acessos brasileiros. O grande número de heterozigotos nos acessos brasileiros pode ser

explicado pela natureza alógama do meloeiro.

No presente estudo também foi utilizado o marcador CmeIF4E que está localizado

próximo ao gene cmv1de resistência do meloeiro ao CMV. O gene cmv1 possui papel na

resistência ao CMV em linhagens obtidas pelo cruzamento com o acesso homozigoto e

resistente PI. Sabe-se que esse gene, localizado no cromossomo XII de meloeiro, possui

efeito maior na variação da expressão de sintomatologia associada a infecção pelo CMV,

combinado com efeitos menores advindos de pelo menos dois dentre os demais QTL

(GUIU-ARAGONÉS et al., 2014).Alguns dos acessos brasileiros de melão mostraram-se

homozigotos para os alelos marcadores semelhantes ao cultivar resistente PI e apresentaram

baixos valores médios de sintomas (presentes nos grupos fenotípicos I e II definidos no

presente estudo). Isso permite levantar a hipótese de que o gene de efeito maior presente no

grupo de ligação XII do meloeiro esteja naturalmente presente em alguns acessos

brasileiros de melão. Essa hipótese requer estudos futuros de mapeamento genético para

que seja testada. De fato, os materiais brasileiros que possuem esse alelo em homozigose

integram os grupos I e II no presente estudo, os quais possuem os menores valores médios

de notas/sintomas. Além da indicação de variabilidade no marcador relacionado à

resistência ao CMV, esses dados permitem escolher genitores promissores para estudos de

resistência ao CMV nos acessos brasileiros.

34

As variações das notas atribuídas aos sintomas causados por CMV observadas nos

acessos de melão corroboram a hipótese que o recurso genético brasileiro nessa cultura

possui potencial tanto para a produção de linhagens contrastantes para o entendimento das

relações genômicas entre o meloeiro e o CMV, como para o melhoramento genético da

cultura. Entretanto, a segregação dos múltiplos genes associados a resistência ao vírus

dificulta o melhoramento do meloeiro visando a fixação da resistência em populações

agronomicamente importantes. Estudos mais detalhados são necessários para melhor

compreender a natureza genética da resistência ao CMV encontrada em alguns acessos

brasileiros de melão.

A estratégia multivariada Ward-MLM possibilitou verificar a variabilidade e

quantificar a diversidade genética com base nos descritores florais, reprodutivos e de

resistência ao CMV, incluindo-se descritores quantitativos e qualitativos. A seleção e o

estabelecimento de descritores para o estudo da variação fenotípica e sua inferência na

diversidade genética pela estratégia Ward-MLM têm sido amplamente utilizadas em

diversas culturas e grupos vegetais (CAMPOS et al., 2013; MELO et al., 2015;

GONÇALVES et al., 2018). Contudo, este é o primeiro trabalho que utiliza dados florais,

reprodutivos e de resistência a estresse biótico na análise multivariada conjunta. Essa

análise mostrou-se necessária porque os caracteres reprodutivos e de resistência são úteis ao

melhoramento genético do meloeiro.

No presente trabalho, sete grupos foram definidos e distribuídos em relação a

distância genética entre os acessos. O acesso A16 foi disposto juntamente com o híbrido

intervarietal A16 x PIb, indicando a confiabilidade na análise multivariada uma vez que o

genótipo híbrido compartilha pelo menos metade dos alelos idênticos ao genitor A16. A

utilização na análise multivariada em plantas híbridas, refletindo o agrupamento esperado

em função dos genitores, tem sido observada também em outros grupos vegetais. Espécies

ornamentais e progênies híbridas analisadas quanto aos descritores florais têm apresentado

também agrupamentos consistentes com sua diversidade genética pela técnica Ward-MLM

(MELO et al., 2015).

A cultivar comercial Gália apresentou-se em grupo isolado, mais distante dos

demais grupos formados pela técnica multivariada Ward-MLM, possuindo particularidades

atribuídas a seleção ao longo do intenso processo de melhoramento genético. Nessa

35

cultivar, a baixa viabilidade polínica foi o fator principal para a sua distribuição isolada dos

demais acessos. Contudo, o seu elevado comprimento floral pode compensar essa baixa

viabilidade, pela maior atração de polinizadores, como já relatado em híbridos intervarietais

de meloeiro (KIILL et al., 2016).

A análise multivariada Ward-MLM pode ser utilizada para a definição de estratégias

para o melhoramento de plantas, como por exemplo, a contribuição na seleção de genitores

promissores (MELO et al., 2015). A distribuição de plantas potencialmente resistentes nos

grupos 4 e 6, sugere que esses dois grupos podem apresentar plantas promissoras ao

melhoramento para a resistência ao CMV. Contudo, a hibridação entre plantas

potencialmente resistentes ou entre plantas com baixas notas de sintomas induzidos na

inoculação artificial com CMV, não garantem a obtenção de progênies resistentes, tendo

em vista a ampla segregação dos níveis de resistência, em parte por causa da natureza

quantitativa da resistência ao CMV. Esse fato é reforçado pela comparação dos valores

médios de nota de inoculação artificial dos híbridos intervarietais A16 x PI com as médias

dos seus genitores com elevados níveis de resistência ao CMV.

A biologia reprodutiva do meloeiro revela ampla variabilidade no tempo de

floração,na diversidade floral, bem como na viabilidade reprodutiva. O conhecimento do

tempo da emissão de flores masculinas e femininas é essencial para as estratégias de

melhoramento, principalmente para a obtenção de híbridos intervarietais. O meloeiro

produz flores masculinas no início da floração e, posteriormente, também flores

hermafroditas.Considerando a importância da biologia reprodutivas em programas de

melhoramento os resultados obtidos neste e outros trabalhos contêm informações relevantes

para os trabalhos de polinizações com sucesso, por ser uma planta dependente de agentes

polinizadores bióticos para garantir a fecundação dos óvulos e assim produzir sementes e

frutos (RIBEIRO et al., 2015; DE FÁTIMA RIBEIRO e DA SILVA LIMA, 2017).

Os acessos brasileiros com características potenciais de resistência ao CMV

possuem estruturas florais correspondentes a média geral. Por outro lado, a variedade

comercial Gália apresentou valores maiores que a média para morfologia das

flores.Segundo Nogueira et al., (2015),os maiores valores relativos à morfologia floral

conferem vantagem ambiental para polinização por abelhas que têm maior intensidade nas

horas mais quentes do inverno e primavera favorecendo aumento de produtividade.

36

Portanto, nossos resultados corroboram essa observação.

O acesso A16 e a cultivar Gália têm as mesmas respostas das células germinativas,

apresentando grãos de pólen inteiros e vigorosos com alto valor de viabilidade, com baixa

percentagem de germinação. No entanto, o melhor horário de coleta foi às 8 h para o acesso

A16 e às 15 h para a variedade Gália. Além da importância do horário de polinização, a

melhor germinação de grãos de pólen está associada principalmente à umidade relativa do

ar e à temperatura, sendo que a melhor germinação de grãos de pólen de muitas espécies

costuma ocorrer nas primeiras horas da manhã, contudo variações podem ocorrer conforme

o grau de tolerância do grão de pólen à dessecação.

A composição do meio e o pH estão entre os fatores que afetam a germinação in

vitro. Os grãos de pólen das angiospermas invariavelmente precisam de uma fonte de

carbono, de boro e, frequentemente, de outros nutrientes para promovê-la. O açúcar

empregado no meio de cultura tem por finalidade proporcionar o equilíbrio osmótico entre

o pólen e o meio de cultura e fornecer energia para auxiliar o processo de desenvolvimento

do tubo polínico, sendo a sacarose, o açúcar mais utilizado, pelo fato de ser a principal

forma de transporte de fotoassimilados entre fonte e dreno nas plantas superiores (ALVES

DOS SANTOS et al., 2016). Desta forma, os testes de viabilidade polínica e da

receptividade do estigma contribuem para a definição do melhor horário para a condução

de cruzamentos artificiais, visando, por exemplo, a obtenção de cultivares por hibridação

entre genitores promissores (DAÍ et al., 2006; SOARES, 2008; SOUSA, 2015).

A análise da fertilidade dos grãos de pólen dos progenitores coletados no campo é

condição preliminar indispensável para os cruzamentos (CHAGAS et al., 2010).A

percentagem de germinação do pólen e o crescimento do tubo polínico são muito

importantes para espécies e cultivares cuja fecundação é necessária para a produção de

frutos, afetando diretamente a produtividade. Juntamente com os fatores genéticos, os

fatores abióticos, como a temperatura do ar, umidade, produtos químicos pulverizados

afetam também os parâmetros qualitativos e quantitativos de viabilidade polínica e

recetividade estigmática (SORKHEH, 2011).Os grãos de pólen do meloeiro perdem sua

viabilidade após a antese, em especial após 7 horas da antese. Redução da viabilidade dos

grãos de pólen ao longo do dia não foi constatada como influência de horários de coleta 8 e

12 horas(ABREU et al., 2008).

37

A diversidade em estruturas florais e nas características reprodutivas observadas

principalmente entre os acessos brasileiros indicam que pode haver diferentes mecanismos

envolvidos na reprodução e na distribuição da variabilidade no meloeiro. O conhecimento

do potencial reprodutivo e de sua dinâmica contribui para a definição do intervalo de

plantio entre acessos visando a hibridação para a obtenção de híbridos intervarietais e

também como para escolha do melhor horário para condução de polinizações artificiais.

3.5 CONCLUSÕES

Os acessos de melão disponíveis no banco de germoplasma de Curcubitáceas da

UFERSA possuem variabilidade nos níveis de resistência ao CMV (estirpe FNY). Esses

acessos apresentam também elevados polimorfismo nos loci marcadores de resistência

localizados nos principais QTL previamente associados à resistência do meloeiro ao CMV.

Diversidade genética quanto à resistência ao CMV e aos descritores da morfologia floral e

da biologia da reprodução pode ser aplicável ao melhoramento genético do meloeiro e nos

estudos dos mecanismos moleculares envolvidos na determinação dessas características.

3.6 AGRADECIMENTOS

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), pelo apoio à pesquisa.

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42

CAPÍTULO II

4. ALELOPATIA DE EXTRATO DE CONYZA BONARIENSIS NA

GERMINAÇÃO DE SEMENTES DE MELÃO

RESUMO

Efeitos alelopáticos em espécies vegetais trazem informações sobre possíveis alterações

devido a alterações do metabolismo e podem ser estudadas mediante a análise de plantas

modelo. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial alelopático do extrato aquoso da

espécie Conyza bonariensis em sementes de meloeiro e em espécies modelo, como Lactuca

sativa. Paralelamente, avaliou-se os efeitos citotóxicos em células meristemáticas

radiculares de Allium cepa sob o extrato aquoso de C.bonariensis. Os ensaios de

germinação e os testes de fitoxicidade foram realizados em 25 sementes de melão dispostas

em caixas com repetições. Em alface foi adicionado 10 mL da solução nas concentrações

de 1, 3, 5, 7 e 10% em paralelo ao controle sem o extrato aquoso. Diariamente foram feitas

as contagens de germinação de sementes e, ao final do período foram medidos percentagem

de germinação, índice de velocidade de germinação, comprimentos de raiz primária e parte

aérea. Para o teste de citotoxidade foram distribuídos 25 bulbos de A. cepa e depositados

em copos plásticos de 50 mL, com a área radicular diretamente em contato com os extratos

aquosos com que consistiram em cinco concentrações 0, 0,5; 1; 1,5 e 2%. Foi avaliado o

índice mitótico e números de células nas fases de divisão celular (prófase, metáfase,

anáfase, telófase). Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias

comparadas com de Scott-Knott a 5% de probabilidade utilizando-se o programa Infostat.

O extrato aquoso de C. bonariensis não mostrou diferença significativa na percentagem de

germinação, índice de velocidade de germinação e comprimento de parte aérea em melão,

mas teve efeito fitotóxico nas plântulas com diminuição do comprimento da radícula, os

extratos aquosos de C. bonariensis inibiram a germinação de sementes e desenvolvimento

de raízes primárias e comprimento de parte aérea em alface, sendo que as maiores

concentrações do extrato também tiveram ação inibitória da divisão celular e apresentou

alterações nas fases de mitose.

Palavras-chave: compostos alelopáticos, metabolismo, alterações mitóticas,

citotoxicidade.

43

ALELOPATIC AND CITOTOXIC EFFECT OF CONYZA BONARIENSIS

EXTRACT IN THE GERMINATION OF MELON SEEDS

ABSTRACT

Allelopathic effects on plant species inform about possible changes due to metabolism and

can be studied by model plants. The objective of this work was to evaluate the allelopathic

potential of the aqueous extract of the Conyza bonariensis species in melon seeds using as a

vegetable model Lactuca sativa, to evaluate the cytotoxic effects in roots of Allium cepa

meristematic cells grown under aqueous extract of C.bonariensis. Germination test and

phytotoxicity test in each plastic box containing 25 seeds of melon and lettuce was added

10 mL of the solution in the concentrations of 0, 1, 3, 5, 7 and 10%. Seed germination

counts were made daily and, at the end of the period, germination percentage, germination

speed index, primary radicular and shoot length were measured. For the cytotoxicity test,

25 bulbs of A. strain were deposited in 50 ml plastic cups, with the root area directly in

contact with the aqueous extracts, which consisted of five concentrations of 0.5, 0.5; 1; 1.5

and 2%. The mitotic index and cell numbers in the phases of cell division (prophase,

metaphase, anaphase, and telophase) were evaluated. The data were submitted to analysis

of variance and the means compared with Scott-Knott's at 5% probability using the Infostat

program. The aqueous extract of C. bonariensis showed no significant difference in the

percentage of germination, germination speed index and shoot length in melon, but had a

phytotoxic effect on seedlings with a decrease in the primary radicular length, aqueous

extracts of C. bonariensis inhibited seed germination and development of primary roots and

shoot length in lettuce, and the highest concentrations of the extract also had an inhibitory

action of the cell division and presented alterations in the phases of mitosis.

Key words: allopathic compounds, metabolism, mitotic changes, cytotoxicity.

.

44

4.1 INTRODUÇÃO

Alelopatia é o fenômeno de interações entre plantas com liberação de substâncias

químicas no meio ambiente que provocam efeitos estimuladores ou inibitórios na

germinação, crescimento e desenvolvimento de outras plantas (FERREIRA et al., 2000;

CHOU, 2006; DE ALMEIDA et al., 2008).Os aleloquímicos presentes em extratos de

origem vegetal podem variar em qualidade e quantidade de espécie para espécie, na

quantidade do metabólito de um local de ocorrência ou ciclo de cultivo.

Todas as partes das plantas podem conter compostos alelopáticos, sendo estes

encontrados nas folhas, caules aéreos, rizomas, raízes, flores, frutos e sementes de diversas

espécies, as folhas e raízes são as fontes mais importantes de aleloquímicos (DE

ALMEIDA et al., 2008; VIECELLI at al., 2009; DE CONTI e FRANCO, 2011). Vários

estudos incluem alterações no crescimento e no metabolismo vegetal, sendo que

compreendem alterações em nível celular, fotossintético e respiratório, bem como

modificações no funcionamento de membranas, na absorção de nutrientes e nas relações

hídricas, entre outras (MARASCHIN-SILVA e AQUILA, 2006).

Na agricultura, existem vários exemplos da influência alelopática principalmente na

rotação de culturas, por exemplo, em extratos de folhas do trigo que inibem a germinação

de suas próprias cariopses, além do desenvolvimento de suas plântulas. Desta forma, o resto

da cultura anterior de trigo retarda o crescimento de plantas de algodão, assim como o

restos de palhada de arroz podem inibir o crescimento de aveia, trigo e lentilha

(FERRERIRA e AGUILA, 2000; EINHELLIG, 2004; GATTI et al., 2004).

Conyza bonariensis (L.) Cronquist espécie que pertencente à família Asteraceae, é

uma planta autógama originária da América do Sul, popularmente conhecida como buva

(LAZAROTO et al., 2008; TREZZI et al., 2011;KASPARY, 2014). Essa espécie possui

ciclo anual e caracteriza-se por ser muito prolífera, podendo produzir mais de 200 mil

sementes de longevidade de pelo menos três anos no solo e padrões de emergência

prolongados entre o outono e a primavera apresentado grandes dificuldades para o manejo

em longo prazo (VARGAS et al., 2007; WU et al., 2007).

O desenvolvimento de estratégias efetivas para o manejo de plantas daninhas

resistentes requer entendimento da dinâmica populacional e o potencial impacto dos

biótipos resistentes no ambiente sendo que a densidade de sementes no banco de sementes

45

de buva não é afetada nas rotações de cultura (DALAZEN, 2010; MOREIRA et al., 2010;

TREVIZAN, 2014). Estes procedimentos podem ter limitações provenientes da

incorporação de restos da cultura anterior no solo, podendo desempenhar função

alelopáticas devido aos compostos químicos liberados. A natureza e a quantidade de

substâncias alelopáticas diferem com a espécie, idade do órgão da planta, temperatura,

intensidade luminosa, disponibilidade de nutrientes, atividade microbiana da rizosfera e

composição dos solos em que se encontram a raízes (DE ALMEIDA et al., 2008;

VIECELLI et al., 2009).

A alelopatia desempenha um papel importante nos agroecossistemas, levando a uma

ampla gama de interações entre culturas, plantas daninhas e culturas de árvorestais

interações são prejudiciais às plantas receptoras, mas proporcionam um benefício seletivo

ao doador (SINGH et al., 2001; CALLAWAY, 2003).

A resistência ou tolerância aos metabólitos secundários que funcionam como

aleloquímicos é mais ou menos específica, existindo espécies mais sensíveis que outras

como Lactuca sativa (alface).Mesmo que o metabolismo vegetal seja diferente, o sistema

teste de Allium cepa é um excelente parâmetro de análise citotóxica, além de que a

observação da ocorrência de alterações cromossômicas no ciclo celular de A. cepa tem sido

usada como indicativo para prevenir a população humana sobre o consumo do produto

(BAGATINI et al., 2007; MAZZEO et al., 2011; MACHADO, 2013; SANTOS, 2016).

Allium cepa tem uma vantagem devido aos seus grandes cromossomos, facilmente

observados com um microscópio de luz; também em relação às características que podem

revelar um efeito mesmo a um nível relativamente baixo de interação da substância testada

com o material genético, além de sua longa história de uso como teste citotóxico. Por se

tratar de um teste in vivo, os dados podem ser utilizados para avaliação da genotoxicidade

em plantas e até mesmo em eucariotos em geral, inclusive em humanos (GRANT, 1982;

BONCIU et al., 2018).

A análise do índice mitótico é um método eficiente usado para avaliar o efeito

alelopático de uma planta sobre outra. A observação em microscópio torna-se

imprescindível na detecção de anomalias nas fases da mitose, bem como de formas atípicas

das estruturas celulares (DE ALMEIDA et al., 2008).

46

Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial alelopático do

extrato aquoso da espécie Conyza bonariensis em sementes de melão utilizando como

modelo vegetal L. sativa. Avaliar efeitos citotóxicos em raízes de células meristemáticas de

Allium cepa desenvolvidas sob extrato aquoso de C.bonariensis.

4.2 MATERIAL E MÉTODOS

4.2.1 Coleta e preparo do extrato de Conyza bonariensis para uso nos ensaios de

germinação e citotoxidade

As plantas de buva foram coletadas em Vitória da Conquista - Bahia em vasos de

plásticos para posterior transporte para casa de vegetação de herbário da UESC. Foram

selecionadas as folhas, caule e flores sendo colocadas em envelope de papel e levadas para

laboratório de Centro de Biotecnologia e Genética (CBG) da Universidade Estadual de

Santa Cruz (UESC). O material selecionado foi colocado em estufa 60°C por 72 horas e

depois foi pesado para o preparo do extrato aquoso, por cada grama de planta seca foi

adicionada 10 mL de água destilada e trituradas em liquidificador. A mistura foi deixada

em repouso por 48 horas na geladeira (5 ±1°C) sendo posteriormente filtradas em funil de

vidro por duas vezes usando papel filtro.

4.2.2 Ensaios de germinação

Foram avaliadas sementes de Lactuca sativa (variedade Crespa) e Cucumis melo

(variedade Ouro). O delineamento inteiramente casualizado foi adotado com três repetições

de 25 sementes de alface e 25 de melão, dispostas sobre papel umedecido em caixas de

plástico (11 × 11 × 3,5 cm), nas concentrações do extrato aquoso que constituíram o espaço

amostral do experimento. As caixas foram distribuídas em três repetições, por sete dias em

temperatura de 25 °C.

4.2.3 Avaliações de fitotoxicidade

Teste de germinação (%):25 sementes de cada material vegetal, semeadas em caixas

de plástico (11 × 11 × 3,5 cm), sobre duas folhas de papel umedecidas na proporção de 2,5

vezes a massa do papel seco, com as diferentes concentrações do extrato (0, 1, 3, 5, 7,

47

10%). Posteriormente, as caixas foram transferidas para câmara de germinação tipo BOD a

25 °C e período luminoso de 16 horas. As avaliações foram efetuadas diariamente por sete

dias e os resultados foram expressos em percentagem de plântulas normais (BRASIL,

2009).

Primeira contagem da germinação (%): realizada aos quatro dias após a semeadura,

conjuntamente ao teste de germinação. Os resultados foram expressos em percentagem de

plântulas normais (BRASIL, 2009).

Índice de velocidade de germinação (IVG): obtido a partir de contagens diárias das

sementes germinadas, com protrusão radicular mínima de 3 a 4 mm. As contagens foram

realizadas até a estabilização da germinação e o cálculo do índice de velocidade de

germinação determinado conforme equação de Maguire (1962).

Comprimento de parte aérea e de raiz primária de plântulas: foram utilizadas 10

plântulas, ao final do teste de germinação. O comprimento de parte aérea foi obtido pela

distância entre a inserção da porção basal da raiz primária ao ápice da parte aérea. O

comprimento da raiz primária foi determinado pela distância entre sua parte apical e basal.

Os resultados foram expressos em milímetros por plântula.

4.2.4 Avaliação de citotoxidade

4.2.4.1 Material Vegetal

Foram utilizados vinte cinco bulbos de cebola (Allium cepa) de tamanho pequeno e

homogêneo sem a pele e foram removidas as raízes e amostras de buva (Conyza

bonariensis) para preparo de extrato aquoso descrito anteriormente.

4.2.4.2 Potencial citotóxico de Conyza bonariensis em células meristemáticas

radiculares de Allium cepa

Para o teste de citotoxicidade foram utilizados bulbos de cebolas A. cepa (2n = 16)

de diâmetros homogêneos, que foram adquiridos comercialmente no município de Itabuna,

Estado da Bahia. Os grupos experimentais foram distribuídos em 25 bulbos e depositados

em copos plásticos de 50 mL, com a área radicular diretamente em contato com os extratos

aquosos com que consistiram em cinco concentrações 0,5%; 1%; 1,5% e 2% (p/v),

48

enquanto que para o controle foi usada apenas água destilada. A cada 24 horas, a água

destilada e os extratos foram renovados e os bulbos observados no desenvolvimento das

raízes para a coleta no tamanho ideal para análises. Após 24 horas de exposição nas

concentrações dos extratos aquosos, coletaram-se raiz de alguns bulbos que apresentavam

cinco mm e fixadas em Carnoy (etanol: ácido acético [3:1]) e assim permaneceram em

temperatura ambiente por 48 h, posteriormente foram levados à geladeira a 5°C até o

momento da análise.

Para as análises citológicas, os meristemas radiculares de cada amostra foram

submergidos cuidadosamente por cinco minutos em água destilada em placa de Petri. As

raízes foram secas em papel absorvente e colocadas na solução de HCl 5N por um período

de 20 minutos e recolocadas na água por mais cinco minutos.O material a ser analisado foi

colocado sobre a lâmina com uma pinça e com o auxílio de uma lupa e de um bisturi foi

seccionada a região meristemática apical que possui maior atividade celular, o restante do

material foi descartado. Após este procedimento, acrescentou-se ácido acético a 45% e o

material foi macerado através da técnica de esmagamento de acordo com protocolo de

Guerra e Souza (2002). O material vegetal foi e coberto com lamínula 20×20 mm e

submersa em nitrogênio líquido para a remoção das lamínulas. Logo após a secagem foi

utilizado corante Giemsa 2% sobre toda região do material macerado, onde assim

permaneceu por 20 minutos e lavadas posteriormente com água destilada. Após secas foi

utilizado meio de montagem Neomount (Merck).

As preparações citológicas foram observadas em microscópio óptico Leika,

binocular com magnitude de 40×. Para cada tratamento foram preparadas cinco lâminas,

avaliando-se quatro campos/lâmina. O índice mitótico foi obtido dividindo-se o número de

células em mitose (prófase + metáfase + anáfase + telófase) pelo número total de células

(interfase + mitose) multiplicando-se por 100. Os dados foram submetidos à análise de

variância e as médias comparadas com o teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade

utilizando-se o programa Infostat (DI RIENZO et al. 2013).

49

4.5 RESULTADOS

4.5.1 Potencial fitotóxico de Conyza bonariensis na germinação e no crescimento

radicular em alface e melão

Para L. sativa, os maiores valores de germinação, com 84, 81 e 78 foram obtidos

para as concentrações de 0, 1% e 3% respectivamente seguida por 56 e 25 para

concentrações de 5 e 7% resultando de menor valor a concentração de 10% com 17. Não

houve diferença significativa para C. melo (Tabela 1). Nas concentrações maiores do que

7% houve redução da velocidade de germinação de sementes em L. sativa no caso de C.

melo a germinação não foi afetada o que indica menor sensibilidade das sementes em

extrato aquoso de C. bonariensis.

Tabela 1. Germinação (GER), índice de velocidade de germinação (IVG) e comprimento

de radícula primária (CRP) e parte aérea de sementes (CPA) de melão germinadas sob

diferentes concentrações de extrato aquosos de Conyza bonariensis.

Tratamentos GER (%) IVG CRP

(mm)

CPA

(mm)

0% 84a 6,39a 36,51a 37,14a

1% 80a 6,72a 39,51a 34,15a

Cucumis melo 3% 82a 6,22a 28,78b 32,10a

5% 77a 6,71a 26,71b 31,52a

7% 84a 6,71a 25,31b 32,83a

10% 75a 6,22a 19,53b 20,54a

CV% 9,50 10,12 13,16 22,15

CV % coeficiente de variação. Médias seguidas pelas mesmas letras nas colunas não

diferem estatisticamente pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.

Quanto a comprimento de parte aérea em alface o menor valor com 26,84 mm foi

verificado na concentração de 10%; nas demais concentrações não houve diferença

estatisticamente significativa. No caso de melão não houve diferença significativa entre os

tratamentos (Tabela 1).

Foram verificadas diferenças significativas (p<0.05) para germinação, índice de

velocidade de germinação, comprimento de raiz primário e comprimento de parte aérea de

L. sativa em função de concentrações de extrato aquoso de C. bonariensis (Figura 1).Para

sementes de melão houve diferença significativa no comprimento de raiz primária.Em

alface a partir da concentração de 5%, houve redução significativa dos valores para

50

germinação e índice de velocidade de germinação em relação ao controle. Esta diferença

tornou-se mais acentuada na concentração de 7%. Em alface a avaliação de percentagem de

germinação (Figura 1A) o e índice de velocidade de germinação (Figura 1B) mostrou que

nas concentrações 0, 1, e 3% do extrato houve maior estímulo na germinação e apenas na

dose de 5 e 7 % do extrato houve uma redução da velocidade ate o mínimo que resultou na

concentração maior de 10% de extrato.

Figura 1. Curvas de resposta (modelo polinomial e linear) para características avaliadas de

percentagem de germinação e índice de germinação de sementes de alface submetidas a

diferentes concentrações do extrato aquoso da C. bonariensis.

Para o comprimento de raiz primária em L. sativa houve diferença significativa

sendo de maior valor 30,19 mm que corresponde ao tratamento controle, seguidas por

16,26; 15,45;13,72 mm para concentrações de 1, 3 e 5%, respectivamente, o menor valor

com 9,75 mm de comprimento foi para contrações de 7% e 8,83 mm para a concentração de

10%(Figura 1A).

Para C. melo houve diferença significativa para comprimento raiz primaria, sendo

de maior valor e igual estatisticamente as concentrações controle e 1% com médias de

36,51 e 39,51 mm, respectivamente, a concentração de 10% foi o de menor valor com

19,53 mm de comprimento sendo igual estatisticamente com as concentrações de 3, 5 e 7%

(Figura 3B).

y = -59,56x + 7,101

R² = 0,899

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 4 6 8 10 IV

G

Extrato aquosos de C. bonariensis (%)

y = -0,2631x2 - 4,801x + 85,981

R² = 0,8987

0

20

40

60

80

100

0 2 4 6 8 10

Ger

min

açã

o (

%)

Extrato aquosos de C. bonariensis (%)

B A

51

Comparação no crescimento de raízes primária em L. sativa e C. melo(Figura 2A),em que o

comprimento foi diminuindo na medida em que se aumentoua concentração de extrato

aquoso de C. bonariensis.O desenvolvimento foi mais homogêneo em melão sugerindo que

a inibição da divisão celular provavelmente tem maior efeito nas células de alface com

menor atividade metabólica (Figura 4).

Figura 2. A) Distribuição de frequência entre alface e melão quanto ao comprimento de

raiz primária.B)Distribuição de frequência entre alface e melão quanto ao comprimento de

parte aérea.

Quanto ao comprimento de raiz primária em alface (Figura 3A), o maior

crescimento foi para o tratamento controle (0%), onde as concentrações de 1, 3 e 5% foram

mais estáveis, sendo que para as concentrações de 7 e 10% o desempenho foi menor. Em

melão (Figura 3B) os maiores comprimentos foram para as concentrações de 0 e 1%, e o

menor foi para 7 e 10%.

Figura 3.Curvas de resposta (modelo exponencial e quadrático) para comprimento de raiz

primária em alface e melão.

0 5

10 15 20 25 30 35 40 45

0 1 3 5 7 10

Co

mp

rim

ento

ra

iz

pri

má

ria

(m

m)

Extrato aquoso de C. bonariensis (%)

CRP alface

CRP melão

0

10

20

30

40

50

0 1 3 5 7 10

Co

mp

rim

ento

pa

rte

aér

ea (

mm

)


CPA alface

CPA melão

A A

B A

y = 0,0743x2 - 2,5651x + 38,168

R² = 0,9145

0

10

20

30

40

50

0 2 4 6 8 10

Co

mp

rim

ento

ra

iz

pri

ma

ria

(m

m)


y = 22,798e-0,106x

R² = 0,8313

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8 10 Co

mp

rim

ento

de

raiz

pri

má

ria

(m

m)


A B

52

Figura 4.Avaliação de comprimento de raiz primária e comprimento de parte aérea em

plântulas oriundas de sementes de melão germinadas e desenvolvidas sob concentrações de

0% (A), 1%, (B), 3% (C), 5% (D), 7% (E) e 10% (F) de extrato aquoso de C.bonariensis.

4.5.2 Potencial citotóxico de C. bonariensis em células meristemáticas radiculares de

A. cepa

A proporção de células em divisão de células meristemáticas radiculares de A. cepa

mostrou que com o aumento da concentração do extrato houve drástica redução no índice

mitótico, com menor crescimento radicular em L. sativa e C. melo avaliadas a partir da dose

de 5% de extrato aquoso de C. bonariensis(Tabela 2). Essa interferência na divisão celular

causada pela ação do extrato com acentuado efeito sobre o comprimento da parte aérea

também foi verificada para L. sativa, já o C. melo não apresentou efeito significativo.

53

Tabela 2.Frequência das diferentes fases da mitose em células meristemáticas de raízes de

plântulas de A. cepa desenvolvidas sob diferentes concentrações do extrato de

C.bonariensis.

Concentração do

extrato de

C.bonariensis

(%)

N° de células nas fases

Prófase Metáfase Anáfase Telófase

0 30,8a 17,4a 11,4a 3,0a

0,5 54,2b 14,2a 12,4a 2,0a

1 17,4c 10,4a 4,0b 2,4a

1,5 12,8c 7,8b 4,6b 1,8a

2 11,4c 4,8c 2,0b 1,2a

Na avaliação defases de ciclo celular, ocorre um aumento significativo do número

de células na prófase na concentração de 0,5%, em comparação como o tratamento

controle, já a menor foi para a concentração de 2% sendo estatisticamente iguales ás de 1 e

1,5%. Para a metáfase houve maior capacidade proliferativa para a concentrações 0, 0,5 e

1%, em quanto que não houve diferença significativa entre as concentrações de 1,5 e 2%.

No caso de anáfase a concentração de controle e 0,5% foram estatisticamente iguais com

valores de 11,4 e 12,4, respectivamente, sendo a menor o de 2% com valor de 2 e

estatisticamente iguais as concentrações de 1 e 1,5%. Na telófase não houve diferença

significativa entre os tratamentos (Tabela 2).

O comportamento das células meristemáticas radiculares de A. cepa com aumento

de células em prófase em baixas concentrações de extrato até uma drástica redução para

concentrações acima de 1% (Figura 5).

54

Figura 5. Fases da mitose em células meristemáticas de raízes de Allium cepa

desenvolvidas sob diferentes concentrações do extrato de C.bonariensis.

Com o aumento da concentração do extrato de C. bonariensis, o valor do índice

mitótico foi continuamente reduzido (Figura 6), sendo o maior efeito depressivo verificado

na concentração de 2 %, em que o índice mitótico não atingiu mais do que 6,5% comparado

a 21% do tratamento controle. Com o aumento da concentração do extrato, houve uma

drástica redução no índice mitótico, com paralisação do crescimento radicular a partir da

dose de 1,5 %, em consequência principalmente com a diminuição de anáfase e telófase.

Figura 6. Curva de resposta (modelo exponencial) para índice mitótico das células

meristemáticas radiculares de Allium cepa.

0

10

20

30

40

50

60

0 0,5 1 1,5 2

N°

de

célu

las

em

mit

ose

s


Prófase

Metafase

Anáfase

Telófase

y = 26,996e-0,706x

R² = 0,8294

0

5

10

15

20

25

30

35

0 0,5 1 1,5 2

Índ

ice

mit

óti

co


55

Figura 7. Microfotografias das células meristemáticas das raízes de Allium cepa, nas fases

de prófase, metáfase, anáfase e telófase sob diferentes concentrações do extrato de

C.bonariensis. A) Células no tratamento controle com núcleo interfásico (seta azul), célula

no início de prófase (seta vermelha), células em prófase (seta branca); B) Metáfase no

tratamento controle; C) Anáfase no tratamento controle; D) Metáfase na concentração de

0,5%; E) Início de anáfase em concentração de 1%, F) Anáfase tardia, cromossomos

chagando nos pólos na concentração de1,5%, G) Metáfases na concentração de 2%, H)

Início de anáfase na concentração de 1%, I) anáfase na concentração de 2%.Barra = 10 µm.

Os resultados de citotoxicidade realizados mostraram algumas fases mitóticas

anormais (Figura 8) com aparecimento de pontes em anáfase, cromossomas superpostos,

desorganização de cromossomos no plano equatorial na fase de metáfase é a conseqüência

da quebra cromossômica, evidenciando claramente a manifestação de distúrbios do

processo mitótico de raízes de A. cepa em concentrações de extrato aquoso de C.

bonariensis.

56

Figura 8. Microfotografias das células meristemáticas das raízes de Allium cepa sob

diferentes concentrações do extrato de C.bonariensis. A) Células na concentração de 0,5%,

mostrando célula no início de prófase (seta preta) e células na metáfase (seta preta); B)

Anáfase com pontes (seta) na concentração de 2%; C) Anáfase na concentração de 2% com

cromossomo superposto (seta); D) Anáfase na concentração de0,5% com cromossomo

dobrado (seta); E) Anáfase com cromossomo isolado (seta)na concentração de 2%; F)

Metáfase com cromossomos isolado (seta)na concentração de 1,5%. Barra = 10 µm.

4.6 DISCUSSÃO

Os efeitos mais conhecidos de alelopatia em plantas são das reduções da

germinação, queda de vigor vegetativa ou a morte das plântulas, amarelecimento ou clorose

das folhas, redução do perfilhamento e atrofiamento ou deformação das raízes (REZENDE

et al., 2003). As maiores concentrações do extrato aquoso de C.bonariensis proporcionaram

maior inibição da germinação e do crescimento de raiz primária e comprimento de parte

aérea de plântulas de alface. A menor atividade metabólica deve-se ao aumento da

condutividade elétrica em sementes de alface, níveis de peróxido de hidrogênio, da

peroxidação lipídica e atividade das enzimas superóxido-dismutase, catalase, ascorbato-

peroxidase (AUMONDE et al., 2013; SILVA, 2015).

57

Nas condições testadas, o extrato de C. bonariensis possui efeito fitotóxico em

sementes e plântulas de alface. As maiores concentrações do extrato (7 e 10 %)

proporcionam maior inibição da germinação e do crescimento inicial de plântulas.

A germinação de sementes de melão mostrou-se menos sensível quando expostos ao

extrato aquoso de C. bonariensis provavelmente por ter maior teor de lipídios armazenados,

sendo o ciclo do glioxalato responsável da mobilização dos triglicerídeos no início da

germinação. As enzimas isocitratoliase aumentam sua atividade devido ao metabolismo de

lipídeos armazenados nos tecidos das sementes. Os compostos fenólicos reduzem a

atividade de enzimas envolvidas na glicólise e na via oxidativa das pentoses fosfato, as

quais asseguram níveis de ATP e esqueletos de carbono suficientes para a germinação das

sementes (GNIAZDOWSKA e BOGATEK, 2005). Grande parte dos aleloquímicos atua no

estresse oxidativo, produzindo espécies reativas de oxigênio, que atuam diretamente ou

como sinalizadores para os processos de degradação celular, impedindo assim a germinação

e o desenvolvimento inicial, bem como processos fisiológicos vitais às plantas (DE

ALMEIDA et al., 2008; DE PAULA et al., 2011).

O aumento das concentrações do extrato de C. bonariensis proporcionou estresse às

sementes e plântulas de alface e afetaram negativamente o desempenho fisiológico das

sementes de alface e, em menor escala, das sementes de melão.Dados da literatura indicam

que esse menor desempenho é causado pelo acúmulo de peróxido de hidrogênio com o

aumento da concentração, prejudicando a integridade de membranas celulares, colaborando

para o estresse oxidativo e a redução da incidência de plântulas normais (DOS SANTOS

SOARES e MACHADO, 2007;AUMONDE, 2012). No Brasil, restos de cultura anterior de

trigo (Triticum aestivum), aveia preta (Avena strigosa) ou centeio (Secale cereale) não

influenciou a germinação de culturas de verão como milho, feijão e soja, mas afetou o

crescimento destas plantas (FERREIRA et al., 2000; DE OLIVEIRA, 2017;) o que coincide

com este experimento no qual a germinação de sementes de melão não foi afetada,mas

houve problemas no desenvolvimento posterior. Também foi encontrado que restos

culturais de soja ou azevém inibiram o desenvolvimento das raízes de milho em até 34%

(MARTIN et al., 1990).

Alterações no padrão de germinação podem resultar de efeitos sobre; a

permeabilidade de membranas; a transcrição e tradução do DNA; o funcionamento dos

58

mensageiros secundários; a respiração, por sequestro de oxigênio (fenóis); a conformação

de enzimas e de receptores, ou ainda pela combinação destes fatores (FERREIRA e

AQUILA, 2000).

Existem vários tipos de compostos orgânicos produzidos por plantas superiores ou

microrganismos, identificados como aleloquímicos: terpenos, esteróides, ácidos orgânicos

solúveis em água, aldeídos alifáticos, cetonas, ácidos graxos de cadeia longa,

poliacetilenos, naftoquinonas, antraquinonas e quinonas complexas, originados da rota

metabólica do acetato mevalonato (DE ALMEIDA et al., 2008). Já os fenóis simples,

ácidos benzóicos e derivados, ácidos cinâmicos e derivados, cumarinas, aminoácidos, e

polipeptídeos sulfetos e glicosídeos, alcalóides, cianidrina, flavonóides, purinas e

nucleosídeos, derivados de quinonas e taninos hidrolizáveis e condensados são originados

da rota metabólica do ácido chiquímico (REZENDE et al., 2003).

Quanto a índice de velocidade de germinação (Figura 1B) houve diferença

significativa em alface, já a germinação em melão foi mais homogênea, o efeito alelopático

não é sobre a germinabilidade, mas sobre a velocidade de germinação ou outro parâmetro

do processo, como pode ser visto a bioatividade das substâncias fitotóxicas está

condicionada à capacidade de absorção, translocação e mecanismo de ação dos seus

compostos potencialmente alelopáticos (CORREIA et al., 2005). O efeito alelopático pode

provocar alterações na curva de distribuição da germinação, o acompanhamento da

germinação deve ser diário ou em tempos mais curtos que 24 horas. A interferência no

desenvolvimento da radícula é um dos melhores indicadores para o estudo de extratos com

potencial alelopático (SOUZA FILHO et al. 1997; PIRES et al., 2001). Existem

aleloquímicos como o 2(3H)-benzo-oxazolinoni (BOA) e 2,4-dihidroxi-1,4-benzoxazin-

3(4H) (DIBOA) que podem reduzir a capacidade regenerativa de células radiculares, alguns

estudos apontam que compostos fenólicos podem inibir o desenvolvimento das raízes e a

divisão celular, causando atraso no crescimento (DE ALMEIDA et al., 2008;LI et al.

2010,RIBEIRO et al. 2012).

Com o aumento da concentração de extrato foi também diminuindo o comprimento

de raiz primária e parte aérea em alface e melão. Esses parâmetros são importantes, pois a

redução acentuada da raiz pode afetar a capacidade competitiva e a produtividade da planta,

59

e a redução da parte aérea (hipocótilo), diminuindo a capacidade da planta em competir por

luz principalmente (NINKOVIC, 2003; CANDIDO et al., 2015;).

Micrografias de luz revelaram células corticais de 0,5 a 1,0 mm acima da ponta da

raiz que aleloquímicos produzidos por Secale cereale L. reduz o crescimento radicular de

Cucumis sativus L., causando mudanças nas estruturas celulares das raízes.

Eletromicrografias de células da raiz cortical do pepino, cerca de 1 mm acima da ponta da

raiz, mostraram que as raízes não tratadas têm organelas bem desenvolvidas, como o

aparelho de Golgi, mitose, mitocôndria, retículo endoplasmático rugoso (RER) e

polirribossomas altamente abundantes (BURGOS et al., 2004).

Em trabalho semelhante, Da Silva et al. (2017), evidenciaram que aumento das

concentrações do extrato de C. bonariensis proporcionou um ambiente mais estressante às

sementes e plântulas de alface, tendo resultado nos maiores teores de peróxido de

hidrogênio em plântulas e na maior peroxidação lipídica. A elevação nos teores de peróxido

de hidrogênio, provavelmente, conduziu à elevação da atividade das enzimas

superoxidodismutase, catalase e ascorbato-peroxidase. Estas enzimas são responsáveis pela

defesa das células contra os radicais livres gerados sob condições de estresse.

A família Asteraceae possui compostos tóxicos como ácidos tanínicos,

hidrociânicos, fórmicos e málicos, rutina e furfural (DUKE, 2000). Os testes de

citotoxicidade utilizando sistema teste vegetal in vivo, como o de A. cepa, estão validados

por vários pesquisadores que realizam de forma conjunta teste animal in vitro e os

resultados obtidos são similares (VICENTINI et al., 2001; PAULSEN, 2002; TEIXEIRA et

al., 2003; FACHINETTO et. al,2007).

Em trabalhos semelhantes, extratos aquosos de B. trimera e B. articulata que

pertence á família de Asteraceae apresentou efeitos na inibição da divisão celular em teste

de A. cepa. Essas espécies contêm taninos e flavonóides dentre outras substâncias em sua

composição química onde a atividade enzimática associada aos taninos pode ser

responsável pela inibição da divisão celular de A. cepa. Estas espécies também contêm

flavonóides, os quais têm demonstrado possuir atividade citotóxica (TEIXEIRA et al.,

2003; FACHINETTO e TEDESCO, 2009)

O índice mitótico é um indicador de proliferação adequada das células (GADANO

et al., 2002), mesmo que o metabolismo vegetal seja diferente, o sistema teste de A. cepa é

60

um excelente parâmetro de análise citotóxica, além de que a observação da ocorrência de

alterações cromossômicas no ciclo celular (FACHINETTO e TEDESCO, 2009). O índice

mitótico (IM) mostrou ser um parâmetro indicativo da citotoxicidade, porque valores de IM

menores que o controle negativo pode indicar citotoxicidade em que o crescimento e

desenvolvimento de alface foram afetados pelos tratamentos (AMANCIO, 2016).

Os compostos aneugênicos são compostos que interferem na mitose e embora não

necessariamente afetem o DNA diretamente, inibem a formação e função do fuso mitótico e

desordenam as segregações cromossômicas (PEREIRA, 2015). Desse modo, sugere-se que

os distúrbios nas membranas celulares podem ser consequência da peroxidação das

membranas de lipídeos ou proteínas (resultando em mudanças na permeabilidade das

membranas, destruição dos cloroplastos, mitocôndria, núcleo e retículo endoplasmático.

Esses processos fisiológicos anormais resultam na redução da fotossíntese bem como no

aumento da respiração, contribuindo para a redução do crescimento das plantas (SONG et

al., 1996).

A presença de pontes anafásicas seria gerada devido aos efeitos cleistogênicos ao

nível das regiões teloméricas do DNA, devido à interação entre os compostos oxidativos

presentes no extratos aquosos testados em diferentes concentrações e DNA, que aderiram

aos cromossomos, possibilitando a formação dessas figuras cromossômicas anômalas

(QUISPE e FABIOLA, 2017).

Estes resultados reforçam importância do sistema teste de A. cepa, já que o mesmo

apresenta resultados similares aos obtidos com outros sistemas testes (BAGATINI et al.,

2007). Resultados semelhantes foram observados por Pires et al.,(2001) onde o efeito do

extrato aquoso de leucena possui efeito negativo no índice mitótico em plântulas de milho.

Efeitos tóxicos de substâncias contidas nos extratos podem desequilibrar a proporção de

proteínas estruturais, tais como as histonas, podendo levar a aglomeração e condensação

dos cromossomos (PINHEIRO et al., 2015; AMÂNCIO, 2016).

A presença das anormalidades cromossômicas (Figura 8) demonstra o potencial

citotóxico da espécie avaliada, podendo interferir no ciclo celular. As anormalidades que

apresentaram maior frequência foram à aderência (stickness cromossômica) na metáfase e

anáfase evidenciada pelas alterações no fuso mitótico e na estrutura dos cromossomos

interrompendo o ciclo celular normal. Trabalhos com resultados semelhantes foram

61

encontrados Andrade-vieira et al. (2014) e Amâncio (2016) neste modelo A. cepa,

utilizando diferentes extratos vegetais.

A sobrevivência de plantas sob condições de estresse de alelopatia depende da

defesa da planta, levando à desintoxicação aleloquímica, o processo que pode continuar, em

paralelo, com a resposta de defesa celular ao estresse oxidativo (GNIAZDOWSKA e

BOGATEK, 2005). A alopatia está fortemente associada a outras tensões do ambiente de

cultivo, incluindo insetos e doenças, temperaturas extremas, variáveis de nutrientes e

umidade, radiações e herbicidas (DEL MORAL, 1997).

Óleos essenciais de Conyza bonariensis obtidos por hidrodestilação revelaram que

unos dos principais componentes foi (E) -β-farneseno que é o principal componente do

feromônio de alarme de muitos afídeos, e foram testadas respostas de espécies de afídeos

economicamente importantes sendo avaliada em laboratório, onde mais de 90% dos Myzus

persicae responderam em um ensaio em larga escala que poderiam impedir a colonização e

a transmissão do vírus mosaico de pepino (BOWERS et al., 1977; DAWSON et al., 1982;

PALUKAITIS e GARCIA-ARENAL, 2003).

Nesse estudo, foi analisado apenas o extrato aquoso, que possui composição

complexa. Novos estudos poderão ser realizados para investigar a hipótese de que o óleo de

buva aplicados em meloeiros controlam os afídios, diminuindo ação do vetor na

transmissão de virus, sem comprometer o crescimento e desenvolvimento do melão.

4.7 CONCLUSÃO

O extrato aquoso de C. bonariensis não afetou a germinação das sementes de melão,

mas teve efeito fitotóxico nas plântulas com diminuição do comprimento da raiz primária,

sendo que as maiores concentrações do extrato também tiveram ação inibitória da divisão

celular e causou alterações nas fases da mitose à medida que a concentração aumentou.

Pequenas concentrações extrato aquoso de C. bonariensisafetam a passagem da

prófase para metáfase, ao passo que altas concentrações afetam todas as fases da mitose.

Os extratos aquosos de C. bonariensis inibiram a germinação de sementes e

desenvolvimento de raízes primárias e comprimento de parte aérea em alface, reduzindo a

capacidade de divisão celular e capacidade proliferativa das raízes.

62

4.8 AGRADECIMENTOS

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela

concessão da bolsa, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), pelo apoio à pesquisa.

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68

5. CONCLUSÕES GERAIS

A grande variação na resposta entre acessosde melão à inoculação artificial com o

vírus CMV,no germoplasma brasileiro de melão, comprova que existe diversidade

genética na resistência a esse fitopatógeno. Os descritores florais e a biologia da

reproduçãopossibilitam gerar os agrupamentos dosacessos brasileiros de melão.

O germoplasma brasileiro de meloeiro apresenta polimorfismo nos três

marcadores SNP em regiões flaqueadoras e internas aos QTL associados a

variação da resistência ao vírus CMV.

Compostos molecularesalelopáticos em extrato de C. bonariensispossuemefeito

fitotóxico em sementes de meloeiro e alface, inibindo a germinação de sementes e

o desenvolvimento e crescimento de raízes e também da parte aérea.

Extrato aquoso de C.bonariensis possui efeito citotóxico sobre A. cepa pela

capacidade de reduzir o índice mitóticoe também favorecer erros no

comportamento cromossômico ao longo do ciclo celular mitótico.

69

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