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Universidade Estadual de Santa Cruz SILVIA PATRÍCIA BARBOSA ARAÚJO NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici E NOVOS OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE SISTEMA AGROFLORESTAL SERINGUEIRA x CACAUEIRO, NO BRASIL ILHÉUS-BAHIA 2016
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Universidade Estadual de Santa Cruz
SILVIA PATRÍCIA BARBOSA ARAÚJO
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici
E NOVOS OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE
SISTEMA AGROFLORESTAL SERINGUEIRA x
CACAUEIRO, NO BRASIL
ILHÉUS-BAHIA
2016
SILVIA PATRÍCIA BARBOSA ARAÚJO
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici
E NOVOS OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE
SISTEMA AGROFLORESTAL SERINGUEIRA x
CACAUEIRO, NO BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Produção Vegetal da
Universidade Estadual de Santa Cruz como
parte dos requisistos para a obtenção do título
de Mestre em Proteção Vegetal.
Área de Concentração: Proteção de Plantas
Orientadora: Dra. Edna Dora Martins Newman
Luz
Co-orientador: Dr. José Luiz Bezerra
ILHÉUS-BAHIA
2016
SILVIA PATRÍCIA BARBOSA ARAÚJO
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici E NOVOS
OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE SISTEMA
AGROFLORESTAL SERINGUEIRA x CACAUEIRO, NO BRASIL
Ilhéus, Bahia, 24/02/2016
Dra. Edna Dora Martins Newman Luz – DSC
CEPLAC/CEPEC/SEFIT
(Orientadora)
Dr. Jadergudson Pereira – DSC
DCAA/UESC
Dr. Thiago Alves Santos de Oliveira – DSC
UFRB
“ O Senhor é a minha luz e a minha eterna salvação; a quem temerei? O Senhor é a força
da minha vida; de que me recearei? Quando os malvados meus adversários e meus
inimigos, investirem contra mim, para comerem as minhas carnes, tropeçaram e caíram.
Ainda que um exército me cercasse, o meu coração não temeria: ainda que a guerra se
levantasse contra mim, nele confiaria.”
Salmos 27 vs. 1-3
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela sua infinita bondade e misericórdia para comigo em todos os
momentos da minha vida.
Aos meus pais, meu esposo e meus familiares pelos constantes
incentivos, apoio, orações, amor e carinho.
A minha orientadora, Dra. Edna Luz, pelo carinho, orientação,
oportunidade, dedicação, confiança e paciência a mim atribuídos.
Ao Dr. José Luiz Bezerra meu co-orientador e ao Dr. Jadergdson Pereira
pelos primeiros ensinamentos na área científica, pela confiança, oportunidade,
colaboração e amizade concedida.
A Joel Feitosa, companheiro de viagem em coletas, pelo auxílio, apoio e
cuidado.
A Cenilda da Silva Serra Rocha e Edarcy Primo pelos ensinamentos e
assessoramento nas tarefas de laboratório e identicação dos isolados.
A Ananias (Nani), Orlando (Orlandão), Valmir Araújo pelos constantes
auxílios nos trabalhos em campo e na casa de vegetação.
A José Renato do escritório local da CEPLAC em Ituberá pela
disponibilidade e importante apoio durante as coletas realizadas para este
estudo.
Ao pessoal das Fazendas visitadas, em especial a Ricardo da fazenda
Ondulada e a Anderson da fazenda Morro Alto, pela atenção e disponibilidade
durante as visitas.
A equipe do laboratório de biologia molecular da Universidade Federal do
Recôncavo da Bahia, em especial a Dra. Elizabeth Duarte, pela parte molecular.
Ao pessoal do Hérbario CEPEC/CEPLAC pela identificação das espécies
vegetais.
A Carol Benjamim e a Giselle Rodrigues pela paciência, atenção e
importante ajuda na parte estatistica.
A todos do laboratório PHYTOLAB e laboratório de Biodiversidade de
Fungos, em especial, Francis, Tarcila, Tami Ito e Antônio Neto pelas
orientações, apoio e constantes auxílios.
A UESC pelo curso.
A CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
A CEPLAC pelo uso de suas dependências, equipamentos, laboratórios e
casa de vegetação, para realização desta pesquisa.
A todos citados e não citados, obrigado!
SUMÁRIO
EXTRATO............................................................................................................ xi
LISTA DE FIGURAS........................................................................................... xii
LISTA DE TABELAS.......................................................................................... xv
1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................. 3
2.1 Consórcio cacau e seringueira....................................................................... 3
2.2 O Filo Oomycota............................................................................................. 4
2.3 Phytophthora capsici ...................................................................................... 5
2.4 Gênero Phytopythium..................................................................................... 8
3 CAPÍTULO 1 - FONTES DE INÓCULO DE Phytophthora capsici EM
PLANTAÇÕES DE CACAUEIRO E SERINGUEIRA NO SUL DA BAHIA,
BRASIL............................................................................................................... 10
RESUMO............................................................................................................ 10
3.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 12
3.2 MATERIAL E MÉTODO............................................................................... 15
3.2.1 Área de estudo........................................................................................... 15
3.2.2 Coletas....................................................................................................... 15
3.2.3 Isolamento de Phytophthora...................................................................... 16
3.2.4 Caracterização morfobiométrica................................................................ 17
3.2.5 Determinação do tipo de compatibilidade.................................................. 17
3.2.6 Estudos moleculares dos isolados de solo................................................ 17
3.2.7 Teste de patogenicidade realizados com os isolados coletados em frutos e
folhas de cacaueiro e em folhas de seringueira.................................................. 18
3.3 RESULTADOS.............................................................................................. 21
3.3.1 Caracterização morfobiométrica................................................................ 22
3.3.2 Determinação do tipo de compatibilidade.................................................. 23
3.3.3 Teste de patogenicidade............................................................................ 23
3.3.3.1 Inoculações em seringueira.................................................................... 23
3.3.3.2 Inoculações em frutos de cacau............................................................. 29
2.3.3.3 Inoculações em disco de folhas de cacau.............................................. 30
2.3.4 Caracterização molecular dos isolados de Phytophthora da rizosfera...... 31
3.4 DISCUSSÃO................................................................................................. 32
3.5 AGRADECIMENTOS.................................................................................... 37
3.6 REFERÊNCIAS............................................................................................ 38
4 CAPÍTULO 2 - Vriesea procera (BROMELIACEAE) NOVO HOSPEDEIRO
DE Phytophthora tropicalis.............................................................................. 45
RESUMO............................................................................................................ 45
4.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 47
4.2 MATERIAL E MÉTODO................................................................................ 48
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 51
4.4 AGRADECIMENTOS.................................................................................... 55
4.5 REFERÊNCIAS............................................................................................ 55
5 CAPÍTULO 3 - PRIMEIRO RELATO DE Phytophthora tropicalis EM
Ageratum conyzoides NA BAHIA, BRASIL..................................................... 59
RESUMO............................................................................................................ 59
5.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 61
5.2 MATERIAL E MÉTODO................................................................................ 62
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................... 65
5.4 AGRADECIMENTOS.................................................................................... 67
5.5 REFERÊNCIAS............................................................................................. 67
6 CAPÍTULO 4 - OOMICOTAS DO GÊNERO Pythium E Phytopythium DA
RIZOSFERA DE PLANTAS EM CONSÓRCIO DE SERINGUEIRA E
CACAUEIRO NO BRASIL.................................................................................. 69
RESUMO............................................................................................................ 69
6.1 INTRODUÇÃO............................................................................................... 71
6.2 MATERIAL E MÉTODO................................................................................ 72
6.2.1 Área de estudo........................................................................................... 72
6.2.2 Coletas de amostras.................................................................................. 72
6.2.3 Isolamento e quantificação de propágulos de espécies Oomycota do
solo...................................................................................................................... 73
6.2.4 Caracterização morfobiométrica dos isolados .......................................... 73
6.2.5 Estudos moleculares.................................................................................. 74
6.2.6 Teste de patogenicidade dos isolados em cacau e em seringueira.......... 75
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 76
6.4 AGRADECIMENTOS.................................................................................... 81
6.5 REFERÊNCIAS............................................................................................. 83
7 CONCLUSÕES................................................................................................ 87
8 REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES........................................................... 88
xi
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici E NOVOS
OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE SISTEMA AGROFLORESTAL
SERINGUEIRA x CACAUEIRO, NO BRASIL
RESUMO
O cacaueiro e a seringueira são duas culturas de elevada importância
econômica mundial. A Bahia lidera a produção nacional de cacau e ocupa o 3°
lugar na produção de seringueira. Devido a importância econômica destas culturas
no estado, é imprescindível o controle de doenças e pragas, a inspeção
fitossanitária e a eliminação de fontes de inóculo nas plantações, visando diminuir
os danos econômicos causados por elas. Entre patógenos comuns as duas
culturas encontramos espécies de Phytophthora, responsáveis pela podridão parda
nos frutos de cacau e requeima das brotações novas, cancro no painel, podridão
em frutos e a queda anormal das folhas em seringueira. Entre as espécies
relacionadas destaca-se P. capsici, um patógeno polífago e cosmopolita que é a
principal espécie Phytophthora ocorrendo em seringueira. Em outras culturas,
hospedeiras desta espécie, das famílias Solanaceae e Cucurbitacea, já são
conhecidas as fontes de inóculo em que P. capsici pode sobreviver, mas para a
cultura da seringueira principalmente, as fontes de inóculo ainda não foram
determinadas. Visando encontrar as possíveis fontes de inóculo de P. capsici em
consórcios de cacaueiro e seringueira no Sul da Bahia, realizou-se coletas em
fazendas ali localizadas, de material vegetal de ambas culturas, rizosfera, plantas
espontâneas ao redor das plantações e epífitas que apresentassem sintomas
xii
típicos de Phytophthora. Foram obtidos 50 isolados de Phytophthora sp., sendo 42
de P. capsici. Isolou-se P. capsici de folhas de bromélias [Vriesea procera (Mart. Ex
SchultF.) Wittm.], de folhas de mentrasto (Ageratum conyzoides L.) e da rizosfera
em solos cultivados com estas culturas, sendo este o primeiro relato de P. capsici
causando doenças nestes hospedeiros. Os isolados obtidos destes hospedeiros
quando inóculados em frutos de cacau e em folhas de seringueira, ficaram entre os
que causaram as maiores lesões. Provando que estas plantas podem estar
servindo como hospedeiros alternativos e fonte primária de inóculo para o início
das epidemias de doenças de P. capsici nas plantações de seringueira e também
em cacaueiro. Além de P. capsici foram isolados do solo P. heveae e outros
oomicotas: Phytopythium vexans, Phytopythium cucurbitacearum, Pythium
acanthophoron e Pythium splendens. Não há registro da ocorrência destas
espécies no Brasil, exceto P. splendens. Assim a ocorrência destas espécies no
Brasil, estar sendo relatada pela primeira vez no presente trabalho. Testes de
patogênicidade foram realizados com alguns isolados Phytopythium, no entanto,
apesar do gênero abrigar algumas espécies patogênicas, as espécies encontradas
não são consideradas uma ameaça ao cacaueiro e a seringueira, visto que nos
testes de patogenicidade não provocaram lesões nos frutos de cacau e nem em
folhas de seringueira.
Palavras-chave: Hevea brasiliensis, Theobroma cacao, hospedeiros alternativos,
Phytophthora tropicalis, epidemiologia, Pythium spp. Phytopythium spp.
xiii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1. Inoculações em folhas destacadas de seringueira (a) e frutos de cacau
(b) com isolados obtidos nesta pesquisa.............................................................. 20
Figura 2. Inoculação dos discos de folhas (a), escala de notas desenvolvida por
Nyasse et al. (1999) para avaliação de genótipos de cacaueiros quanto a
resistência à podridão-parda em discos de folhas e usada neste experimento (b)
.............................................................................................................................. 20
Figura 3. Frutos de cacau inoculados com isolados de Phytophthora cinco e sete
dias após a inoculação: A-B isolado 2652 de P. capsici, cinco (a) e sete (b) dias;
C-D isolados de P. palmivora, (c) isolado 2687 e (d) isolado 2683..................... 29
CAPÍTULO 2
Figura 1. Vriesea procera (a) e plantas de V. procera sobre planta de
seringueira............................................................................................................ 48
Figura 2. A-B Colônias de P. capsici (a) rosacea, (b) estelar e esporângios
papilados e com pedicelos longos (c).....................................................................51
Figura 3. Lesões causadas por isolados de Phytophthora em folhas destacadas
de V. procena 11 dias após as inoculação: (a) com o isolado 2690 de P. capsici
de seringueira; (b-d) com os isolados 2676, 2638 e 2674 obtidos de V. procena;
xiv
(e-f) lesão causada pelo isolado 1211, aos sete (e) e aos 11 (f) dias após as
inoculções............................................................................................................. 52
CAPÍTULO 3
Figura 1. Mudas de mentrasto cultivadas em casa de vegetação (a) e mudas em
câmara úmida (b).................................................................................................. 64
Figura 2. Mudas de mentrastro 7 dias após a inoculação, com sinais típicos de
Phytophthora: escurecimento das nervuras foliares (a); requeima (b);
tombamento e morte de mudas (c)...................................................................... 66
CAPÍTULO 4
Figura 1. Isolado 2659: Esporângios limoniformes, papilados(a); Oogônios com
anterídios paraginos (b-1) e Clamidósporos terminais (b-2); Esporângio
evidenciando a expansão da papila (c)................................................................ 77
xv
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Número de culturas semelhantes a Phytophthora obtidos do solo da
rizosfera e parte aérea das plantas, por data e município de coleta nos anos de
2014 e 2015, em plantios de consórcio seringueira e cacaueiro no Sul da
Bahia.................................................................................................................... 21
Tabela 2. Características morfobiométricas dos isolados de Phytophthora obtidos
de seringueira, quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar.............. 24
Tabela 3. Características morfobiométricas dos isolados de Phytophthora obtidos
de cacaueiro, quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar................ 26
Tabela 4. Área média das lesões (cm2) em folha de seringueira dos clones
FX3864 e SIAL1005, causada por 17 isolados de P. capsici............................... 27
Tabela 5. Área média das lesões (cm2) em folha de seringueira dos clones
FX3864 e SIAL1005, causada por 5 isolados de P. palmivora............................. 28
Tabela 6. Área média das lesões (cm2) causadas por P. citrophthora em folhas de
seringueira dos clones FX3864 e SIAL1005...................................................... 28
Tabela 7. Área média das lesões (cm2) em frutos de cacau comum, causada por
6 isolados de P. palmivora, sete dias após a inoculação...................................... 30
xvi
Tabela 8. Índice de severidade da doença causados por 14 de isolados de P.
capsici, em disco de folhas de cacaueiro Catongo.............................................. 30
Tabela 9. Índice de severidade da doença causados por 7 isolados de P.
palmivora, em disco de folhas de cacaueiro Catongo.......................................... 31
Tabela 10. Identificação molecular de isolados de Phytophthora sp. obtidos da
rizosfera de T. cacao e H. brasiliensis de fazendas do Sul da Bahia, Brasil....... 31
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Identificação molecular do isolado obtido de bromélia........................ 53
CAPÍTULO 3
Tabela 1. Identificação molecular do isolados obtido de A. conyzoides............... 65
CAPÍTULO 4
Tabela 1. Números dos isolados de oomicetos obtidos da rizosfera de plantas de
cacaueiro e seringueira, por local de coleta, utilizados para a inoculação em folhas
de seringueira e frutos de cacaueiro..................................................................... 75
Tabela 2. Número de isolados de oomicetos obtidos do solo por fazenda e
município de coleta. ............................................................................................. 76
Tabela 3. Características morfobiométricas dos isolados de Phytopythium obtidos
do solo da rizosfera de cacaueiro e seringueira, quando cultivados por sete dias
em meio cenoura-ágar.......................................................................................... 78
Tabela 4. Características morfobiométricas dos isolados de Pythium obtidos do
solo da rizosfera de cacaueiro e seringueira, quando cultivados por sete dias em
meio cenoura-ágar............................................................................................... 79
xvii
Tabela 5. Identificação molecular dos isolados da rizosfera de T. cacao e H.
brasiliensis de fazendas do Sul da Bahia, Brasil.................................................. 82
1
1 INTRODUÇÃO
O cultivo consórciado de seringueira (Hevea brasiliensis (Wild. Ex. A.
Juss.) Muell. Arg.) e cacaueiro (Theobroma cacao L.) tem sido adotado por
muitos produtores do Sul Bahia. Na região vem se destacando os municípios de
Ituberá, Camamu, Uruçuca e Una com muitas áreas cultivadas. As principais
vantagens deste consórcio são a consideravél redução nos custos de
implantação das culturas, aumento da produtividade, sombreamento para o
cacaueiro, geração de emprego e, ainda, possibilita que o produtor tenha uma
fonte de renda, enquanto espera o seringal crescer (PEREIRA et al., 1996).
As duas culturas possuem uma elevada importância econômica no
cenário mundial. Os países do Sudeste Asiático, principalmente Malásia,
Tailândia e Indonésia, são responsáveis por 90% da produção mundial de
borracha. A produção nacional está concentrada nos estados de São Paulo
(34%), Mato Grosso (29%) e Bahia (15%). Na produção de cacau, o Brasil ocupa
a 5° posição no ranking mundial, perdendo apenas para a Costa do Marfim,
Gana, Nigéria e Camarões. E no ranking nacional a Bahia lidera a produção
(AGROLINK, 2015).
Tanto a seringueira quanto o cacaueiro, são atacados por uma grande
diversidade de doenças, que reduzem a produção de frutos e de látex. Um tipo
de patógeno comum entre elas, causador de doenças em ambas culturas,
corresponde às espécies do gênero Phytophthora. Entre as espécies
relacionadas destaca-se Phytophthora capsici Leonian, patógeno polífago,
cosmopolita e muito agressivo (LUZ et al., 2003).
Na seringueira o patógeno pode causar requeima das brotações novas,
cancro no painel, podridão em frutos e a queda anormal e prematura de folhas,
sendo a última predominante nos seringais do sul da Bahia (CERQUEIRA et al.,
2
2011). No cacaueiro P. capsici é uma das espécies responsáveis pela podridão
parda ou podridão de phytophthora, atacando principalmente os frutos da planta,
mas podendo também ocorrer em outras partes da planta, sem causar prejuízos
econômicos (OLIVEIRA & LUZ, 2005). Em condições favoráveis ao
desenvolvimento da doença podridão parda, perdas na produção de até 80% já
foram registradas (LUZ et al., 1997).
Em outras culturas atacadas por P. capsici já é comprovado a sua
sobrevivência na rizosfera, restos de culturas e em plantas espontânea. Mas
para o cacaueiro e a seringueira nunca foi verificado, a sua presença no solo e
se haveriam outras plantas que serviriam como hospedeiros alternativos para
sobrevivência desta espécie. Esta importante lacuna no patossitema da espécie
demonstra a necessidade de pesquisar especificamente, as possíveis fontes
primárias de inóculo nestas culturas.
Os objetivos deste trabalho foram: (i) estudar as possíveis fontes de
inóculo de P. capsici em plantações de seringueira e cacaueiro, e testar a
patogenicidade dos isolados encontrados às duas culturas; (ii) relatar novos
hospedeiros para o patógeno na parte áerea da seringueira e no em torno das
plantações entre as plantas nativas; (iii) comprovar a patogenicidade dos
isolados desses hospedeiros à eles próprios, ao cacaueiro e à seringueira; (iv)
isolar e identificar os principais oomicotas encontrados em solo das plantações
consorciadas.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÀFICA
2.1 Consórcio cacau e seringueira
A seringueira é originária da região Amazônica e é a principal fonte de
borracha natural do mundo. O gênero Hevea pertence á família das Euforbiácea,
sendo a espécie H. brasiliensis a mais produtiva e plantada comercialmente,
com superior qualidade de látex. Os países do Sudeste Asiático, principalmente
Malásia, Tailândia e Indonésia, dominam a produção mundial de borracha
natural, responsbilizando-se por 90% dela. No Brasil, São Paulo (34%), Mato
Grosso (29%) e Bahia (15%), são os principais estados produtores.
O cacaueiro, por ser uma espécie neotropical, pode ser encontrado em
praticamente todas as regiões do mundo. O Brasil, que já foi o 2° maior país
produtor de cacau do mundo, ocupa atualmente a 5° posição seguindo a Costa
do Marfim, Gana, Nigéria e Camarões. Cerca de 90% de todo o cacau brasileiro
é exportado, sendo o Estado da Bahia considerado o maior produtor
(AGROLINK, 2015).
Os sistemas agroflorestais (SAFs) representam um conjunto de técnicas
alternativas de uso da terra, que implicam na combinação de espécies florestais
com cultivos agrícolas e com atividades pecuárias, ou ambas. Nos últimos anos,
o desenvolvimento de SAFs tem sido bastante encorajado, defendido e
recomendados aos processos de produção como uma forma de praticar uma
agricultura ambientalmente correta, mais produtiva e sustentável em regiões
tropicais (PEREIRA et al., 1996).
O Sul da Bahia foi a região pioneira, a adotar a modalidade de cultivo
consorciado de seringueira (Hevea brasiliensis (Wild. Ex. A. Juss.) Muell. Arg.) e
4
cacaueiro (Theobroma cacao L.), culturas de relevante importância econômica
no cenário mundial. Inicialmente os produtores decidiram introduzir cacaueiros
sob o dossel de seringais decadentes, parcialmente desfolhados, que permitiam
uma melhor penetração da luz para o cacaueiro. Este consórcio deu certo e vem
sendo bastante difundido pelos produtores da região (MARQUES, 2006).
Segundo Pereira et al. (1996), há muitas vantagens em consorciar o
cacaueiro e a seringueira, e destaca como principais a redução nos custos de
implantação, o aumento da produtividade e maiores oportunidades de emprego
e renda. Contudo, segundo esses autores, um fator importante deve ser levado
em consideração ao se escolher as espécies a serem consorciadas: as espécies
escolhidas não devem apresentar problemas fitossanitários comuns. Mas tanto
a seringueira quanto o cacaueiro são hospedeiras e sofrem com o ataque de um
patógeno bastante agressivo, Phytophthora capsici Leonian.
2.2 O Filo Oomycota
O Filo Oomycota, um grupo monofilético, engloba os organismos
pertencentes ao Reino Straminipila com características semelhantes aos fungos
verdadeiros e por isso, as vezes denominados “pseudo fungos”. Entre as
características similares aos fungos verdadeiros, estão a forma de nutrição,
zoósporos flagelados, parede celular contendo quitina, presença de hifas,
formação de estruturas de resistências e ocupação dos mesmos ninchos
ecológicos (NEAHAUSER et al., 2012; MARANTO et al., 2014; BEAKES et al.,
2014).
Segundo Adl et al. (2012) aprofundando a tentativa de Adl et al. (2005) de
agrupamento dos reinos em Super grupos, o filo Oomycota pertence ao Super
grupo SAR, composto pelos Reinos Straminipila, Alveola e Rhizaria. Beakes et
al. (2014), em recente revisão filogenética e taxonomica levando em
consideração as sequências moleculares e analizando simultaneamente a
biologia e a história evolutiva do Reino Straminipila, propuseram a divisão do filo
Oomycota, até então considerado por Kirk et al. (2008) como possuindo uma
única classe – Oomycetes, em três classes: Peronosporomycetes,
Saprolegniomycetes e outra considerada Incertae sedis. A classe
5
Peronosporomycetes, engloba as ordens Albuginales, Peronosporales sensu
lato e Rhipidiales.
Na ordem Peronosporales, permanecem duas famílias segundo Beakes
et al. (2014) Peronosporaceae sensu lato e Pythiaceae sensu lato. A família
Peronosporaceae sensu lato, incluindo os oomicotas evolucionariamente
superiores e mais ricos em espécies, teria além dos gêneros com muitas
espécies patogênicas às plantas como: Plasmopora; Peronospora;
Pseudoperonospora; Bremia e outros gêneros que causam os chamados mildios
pulverulentos; Phytophthora com dois clados, um para os patógenos que atacam
a parte aérea e outro para os que causam podridões de raízes;
Holophythophthora e Phytopythium. Já a família Pythiaceae sensu lato teria
como integrantes o gênero Pythium, também com dois clados para as espécies
globosas e filamentosas, e as espécies Lagenidiaceas spp. e Salisipitiaceae.
Assim, na mais moderna revisão filogenética (BEAKES et al., 2014) o
gênero Phytophthora petence à família Peronosporaceae e não mais a
Pythiaceae como considerados anteriormente (KIRK et al., 2008).
2.3 Phytophthora capsici
Phytophthora capsici Leonian pertence ao Reino Straminipila, Filo
Oomycota, Classe Oomycetes e Família Peronosporaceae (BEAKES et al.,
2014). A espécie foi assinalada pela primeira vez no Novo México (USA),
causando a doença denominada de requeima ou mela de pimentão (Capsicum
annuum L.), sendo considerada patógeno específico dessa cultura (TUCKER,
1931). No cenário atual, sabe-se que P. capsici é patogênica a mais de 50
gêneros de plantas, inclusive espécies vegetais de elevada importância
econômica em todo o mundo. Devido a isto, a palavra especificidade tem sido
abolida como característica de P. capsici, sendo considerado um patógeno
polífago e cosmopolita (LUZ et al., 2003).
Dentre a vasta gama de hospedeiros de P. capsici destacam-se
hortaliças, como o pimentão, tomate, pimenta-do-reino, berinjela, abóbora,
melancia e várias outras espécies das famílias Solanaceae e Curcubitaceae. No
Sul da Bahia duas culturas de comprovada relevância econômica, sofrem com o
6
ataque de P. capsici, o cacaueiro (Theobroma cacao) e a seringueira (Hevea
brasiliensis) (CERQUEIRA et al., 2011; OLIVEIRA & LUZ, 2005; REIS et al.,
2007, REIS e HENZ, 2008).
No cacaueiro, P. capsici juntamente com outras espécies de
Phytophythora é responsável por causar a podridão parda ou podridão de
phytophthora (CAMPELO & LUZ, 1981; LUZ, 1989; DANTAS et al., 2005;
BAHIA, 2007; GUEST, 2007; CERQUEIRA et al., 2011). O dano econômico
causado no cacaueiro é evidente, pois a doença ataca principalmente os frutos
da planta, mas podendo também ocorrer em outras partes da planta, sem causar
sérios prejuízos econômicos (OLIVEIRA & LUZ, 2005). Em condições favoráveis
ao desenvolvimento da podridão parda na Bahia, perdas na produção de até
80% já foram registradas (LUZ et al., 1997).
De acordo com Dantas et al. (2005) embora as perdas causadas pela
podridão-parda sejam menores do que as ocasionadas por outras doenças
como a vassoura-de-bruxa (Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer), a
monilíase (Moniliophthora roreri (Cif.) Evans et al.) e a murcha-vascular-estriada
(Oncobasidium theobromae Talbot & Keane), estas estão restritas a
determinadas regiões do mundo, enquanto que a podridão-parda ocorre em
todos os países produtores de cacau. Sendo assim, a podridão parda é
considerada atualmente a doença mais importante em termos mundiais
(DANTAS et al., 2005; BAHIA, 2007; CERQUEIRA et al., 2011).
A seringueira é outra cultura importante na região sul baiana, e um dos
seus principais patógenos é P. capsici. O patógeno pode causar requeima ou
queima das brotações novas, cancro no painel, podridão em frutos e a queda
anormal e prematura de folhas, sendo a última predominante nos seringais do
Sul da Bahia (CERQUEIRA et al., 2011) e que vem causando danos
significativos na produção de látex. No entanto, assim como ocorre no cacaueiro,
outras espécies do gênero Phytophthora também podem ser patogênicas à
seringueira, tais como: P. palmivora, P. botryosa, P. citrophthora, P. nicotiniae
var. parasítica, P. citricola, P. meadii e P. cactorum (GASPARETTO, 1997).
Em um primeiro momento, todos os isolados de Phytophthora
encontrados em cacau foram classificados como P. palmivora (BRASIER &
GRIFFIN, 1979), sendo esta espécie posteriormente dividida em quatro grupos
(MF1, MF2, MF3 e MF4) baseados em caracteres morfológicos (GRIFFIN,
7
1977). Depois de mais estudos a espécie teve sua descrição novamente
alterada, passando então o grupo MF4 a ser considerado P. capsici Leonian
(ZENTMYER et al., 1981; TSAO & ALIZADEH, 1988; ERWIN & RIBEIRO, 1996).
Atualmente isolados P. capsici são raramente encontrados infectando frutos de
cacaueiros no Sul da Bahia, predominando espécies de P. palmivora nos
isolamentos (LUZ et al., 2003). Este fato vem ocorrendo de maneira inversa e
paralela na cultura da seringueira, em que existe uma predominância de P.
capsici relacionada as doenças causada por Phytophthora na cultura
(CERQUEIRA et al., 2011).
Regiões e épocas do ano com temperaturas amenas e alta umidade do ar
e do solo, favorecem o crescimento e desenvolvimento de P. capsici. Sua
reprodução compreende duas fases, sendo uma fase somática ou assexual e
uma fase sexual. Na reprodução assexuada, formam-se esporângios e
zoósporos e na reprodução sexuada, oósporos (LUZ & SILVA, 2001). Sua
disseminação no campo se dá via água de irrigação ou chuva, implementos
agrícolas, vento, a partir de lesões esporulantes em frutos, ramos e folhas (REIS
et al., 2007).
A principal estrutura de sobrevivência de P. capsici no solo são os
oósporos (LAMOUR & HAUSBECK, 2002; MARQUE, et al., 2002; REIS et al.,
2007), uma vez que as formas de esporângio ou zoósporos deste patógeno tem
vida muito curta no solo, além disso, não se tem observado a formação de
esporos de resistência (clamidósporos) por isolados de P. capsici (REIS et al.,
2007). Em seringueira no estudo de mais de 370 isolados nenhum apresentou
formação de clamidósporos (CERQUEIRA, 2014).
Em culturas de Solanaceae e Cucurbitaceae já é comprovado que P.
capsici pode sobreviver na rizosfera, em sementes, restos de culturas e
utilizando plantas espontâneas como hospedeiro alternativo. No entanto, para o
cacaueiro e a seringueira essa teoria nunca foi experimentalmente comprovada,
sendo necessário pesquisar especificamente os locais e as plantas de
sobrevivência desta espécie, capazes de servir como fonte primária de inóculo.
Recentemente estudos feitos por Santos e Luz (2011) e Santos et al.
(2013 e 2014) relataram a ocorrência de espécies de Phytophthora na rizosfera
de cultivos agrícolas no Sul da Bahia, bem como a descoberta de novos
hospedeiros de P. nicotianae na mesma região. Tais evidências sustentam a
8
hipótese de que P. capsici, assim como ocorre com outras espécies de
Phytophthora e também com a própria espécie em outras culturas, utilize o solo
como meio de sobrevivência nas culturas de seringueira e cacaueiro. O
isolamento de Phytophthora do solo e raízes muitas vezes é dificultado pela
presença de Pythium spp., além disso as espécies de Phytophthora apresentam
taxa de cresimento relativamente baixa quando cultivadas em meios de cultura
comumente usados em micologia, como BDA (batata-dextrose-agar). Dessa
forma é recomendado o uso de meios seletivos suplementados com hymexazol
para inibir a presença de várias espécies de Pythium, ou o uso de hospedeiros
específicos colocados no solo como iscas (LUZ et al., 2008). No entando estas
técnicas não possuem 100% de eficiência, fazendo com que o isolamento de
Phytophthora do solo seja por vezes sabotado pela presença de outros menbros
do filo Oomycota.
2.4 Gênero Phytopythium
Phytopythium é um gênero pertencente ao Reino Straminipila, Filo
Oomycota, Classe Oomycetes, Ordem Peronosporales e Família
Peronosporaceae (BEAKES et al., 2014). O gênero foi descrito recentemente por
Bala et al. (2010), como a espécie tipo Phytopythium sindhum A.M. Lodhi,
Shahzad & Lévesque, e atualmente existem cerca de 22 espécies registradas no
Index Fungorum (2016). A maioria das espécies é saprobiota de ambientes
naturais (água e solo), mas algumas são patógenos de plantas (DE COCK et al.
2015), incluindo P. helicoides e P. vexans, que já foram relatadas causando
podridão da raiz e podridão do colmo em plantas de Kiwi, evidenciando sua
importância agrícola (YANG et al., 2013; WANG & XIE., 2015).
O gênero foi descrito após resultados de estudos filogenéticos, baseados
em análises moleculares que destinguiu o táxon anteriormente classificado como
pertencente ao clado k do gênero Pythium (LÉVESQUE & DE COCK, 2004). O
gênero Pythium foi dividido por Lévesque e De Cock (2004) em 11 clados de A-
K, com base em análises sistemáticas moleculares. Tal divisão, embora bem
apoiada por características morfológicas (DE COCK et al. 2015), tem sido
contestada por vários autores (BRIARD et al., 1995; BAILEY et al., 2002; VILLA
9
et al., 2006; PALMUCCI, 2011; MARANO, 2014; DE COCK et al. 2015), que
através de estudos filogenéticos, com base nas sequências de ITS, citocromo c
oxidase (coxII), e os genes de β-tubulina, observaram que as espécies
pertencentes ao clado K eram filogeneticamente distintas do resto daquelas
consideradas como pertencentes ao gênero Pythium e apresentavam
características combinadas dos gêneros Pythium e Phytophthora. De Cock et al.
(2015) estabeleceram quais espécies pertenciam ao clade K e fez 14 novas
combinações taxonômicos para estas espécies, além da descrição de uma nova
espécie Phytopythium mirpurense Lodhi, De Cock, Lévesque & Shahzad, sp.
nov.
As principais características morfológicas comuns a Phytopythium são:
esporângios ovóides a globosos com papilas exceto para P. vexans, proliferação
interna semelhante a Phytophthora e modo de descarga de zoósporos
semelhante ao Pythium, formando um tubo de descarga com uma vesícula na
ponta; oogônios grandes, oósporos de paredes espessas e anterídio parágino
com células ligadas lateralmente ao oogônio (BATEN, 2015; DE COCK et al.,
2015). O gênero também é caracterizado por temperaturas ótimas de
crescimento variando ente 30-40 °C (LÉVESQUE & DE COCK, 2004).
10
3 CAPÍTULO 1
FONTES DE INÓCULO DE Phytophthora capsici EM PLANTAÇÕES DE
CACAUEIRO E SERINGUEIRA NO SUL DA BAHIA, BRASIL
RESUMO
O cacaueiro e a seringueira são considerados as culturas mais
importantes economicamente no Sul da Bahia. Muitas vezes cultivadas de forma
consorciada, ambas são hospedeiras de um fitopatógeno muito agressivo:
Phytophthora capsici Leonian. No cacaueiro P. capsici pertence ao complexo de
espécies que causam a podridão-parda, doença mundialmente importante. Na
seringueira P. capsici é o principal agente causal da requeima, do cancro do
painel, da podridão dos frutos e da queda anormal e prematura das folhas. No
entanto, não se sabe ao certo como P. capsici sobrevive nestas plantações,
especialmente para causar as epidemias anuais em seringueira. Objetivou-se
neste trabalho estudar as possíveis fontes de inóculo de P. capsici em
plantações, de cacaueiro e seringueira no Sul da Bahia e aprofundar os
conhecimentos sobre os aspectos ecológicos, epidemiológicos e patológicos das
interações P. capsici com estes hospedeiros. Realizou-se coletas em fazendas
localizadas no Sul da Bahia, de material vegetal de ambas culturas,solo da
rizosfera, plantas espontâneas ao redor das plantações e epífitas sobre
seringueira, que apresentassem sintomas típicos de Phytophthora. Foram
obtidos 50 isolados de Phytophthora sp., sendo 42 de P. capsici (37 de
seringueira, três de epífitas, um de planta espontânea e da rizosfera), seis de P.
pamivora (cinco de cacaueiro e um de seringueira), um de P. citrophthora (do
11
cacaueiro) e um de P. hevea (da rizosfera). Os isolados foram caracterizados
morfologicamente e realizados testes de patogenicidade, em frutos de cacaueiro
e folhas de seringueira com todos os isolados obtidos de cacaueiro, epífitas, e
planta espontânea e com 13 isolados de seringueira. Nos teste de
patogenicidade, os isolados das epífitas e da planta espontânea se mostraram
patogênicos. Dessa forma, estas plantas podem estar servindo como
hospedeiros alternativos de P. capsici nas plantações de cacau e seringueira.
Três fontes de inóculo de P. capsici foram assinaladas: o solo, uma epífita e uma
planta espontânea. A repercussão ecológica e epidemiológica desses achados é
discutida.
Palavras-chave: podridão parda; queda anormal das folhas; epidemiologia;
Theobroma cacao; Hevea brasiliensis
12
3.1 INTRODUÇÃO
Phytophthora capsici Leonian pertence ao Reino Straminipila, Filo
Oomycota, Classe Oomicetes e Família Peronosporaceae (BEAKES et al.,
2014). É considerado um patógeno polífago, cosmopolita (LUZ et al., 2003) e
muito agressivo, causando sérios danos e grandes perdas econômicas em
várias culturas em todo o mundo. Regiões e épocas do ano em que ocorrem
temperaturas inferiores a 18 °C e alta umidade do ar e do solo, favorecem o
desenvolvimento e a esporulação de P. capsici e, consequentemente, as
epidemias das doenças causadas por esta espécie. P. capsici por ser uma
espécie heterotálica (LEONIAN, 1922) é disseminada nas plantações
principalmente por zoósporos e esporângios (ciclo assexual) que são
dispersados pelo vento, água e insetos (LUZ et al., 1995; LUZ e SILVA, 2001)
dando origem nas plantações à populações clonais, pela predominância de
apenas um tipo de compatibilidade sexual (A1) (CERQUEIRA, 2014).
No entanto, em culturas onde os dois tipos sexuais estão presentes, como
a do pimentão (Capsicum annuum L.), a principal estrutura de sobrevivência de
P. capsici no solo são os oósporos (LAMOUR & HAUSBECK, 2002; REIS et al.,
2007), uma vez que a forma de esporângio ou zoósporos deste patógeno tem
vida muito curta no solo, além disso, não se tem observado a formação de
esporos de resistência (clamidósporos) por isolados de P. capsici (CAMPÊLO &
LUZ, 1981; LUZ & CAMPÊLO, 1985; LUZ, 1989; REIS et al., 2007).
A espécie P. capsici encontra-se amplamente distribuída no país,
podendo ser encontrada em todas as regiões geográficas (SANTOS et al.,
2014b), é a segunda espécie de Phytophthora com maior número de
hospedeiros registrados (21), perdendo apenas para a P. nicotianae com 34
hospedeiros relatados (MENDES et al., 1998; LUZ & MATSUOKA, 2001;
13
SANTOS et al., 2014b). Dentre a vasta gama de hospedeiros de P.capsici
destacam-se hortaliças, como o pimentão (Capsicum annuum L.), tomate
(Solanum lycopersicum L.), pimenta-do-reino (Piper nigrum L.), berinjela
(Solanum melongena L.), abóbora (Cucurbita pepo L.), melancia [Citrullus
lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai] e várias outras espécies das famílias
Solanaceae e Curcubitaceae. Além desses, outros hospedeiros de relevância
econômica, principalmente para o Sul da Bahia, sofrem com o ataque de P.
capsici, como é o caso do cacaueiro e da seringueira (CERQUEIRA et al., 2011;
OLIVEIRA & LUZ, 2005; REIS et al., 2007).
O cacaueiro (Theobroma cacao L.), por ser uma espécie neotropical,
pode ser encontrado em praticamente todas as regiões do mundo. Várias
doenças de importância econômica estão relacionadas ao cultivo do cacaueiro.
A podridão parda ou podridão de phytophthora é uma doença causada por um
complexo de espécies do gênero Phytophthora que inclui as espécies P.
palmivora, P. citrophthora, P. heveae e P. capsici (CAMPELO & LUZ, 1981; LUZ,
1989; DANTAS et al., 2005; BAHIA, 2007; GUEST, 2007; CERQUEIRA et al.,
2011). Estes patógenos atacam além dos frutos do cacaueiro, outras partes da
planta como ramos, chupões, almofadas florais e até o tronco causando o
cancro do cacaueiro (LUZ & SILVA, 2001), no entanto os danos econômicos
importantes são ocasionados nos frutos (OLIVEIRA & LUZ, 2005). Durante a
década de 80, estudos relacionados sobre a virulência, distribuição populacional,
e predominância das espécies de Phytophthora no cacaueiro, demonstraram
que P. capsici apesar de ser a menos virulenta das espécies causadoras da
podridão parda, era a mais prevalente devido principalmente a seu bom
crescimento nas epócas de maior ocorrência da doença na Bahia (LAWRENCE
et al., 1982; CAMPÊLO et al., 1982; CAMPÊLO & LUZ, 1982; LUZ & CAMPÊLO,
1983). Mas, atualmente P. capsici parece ter decrescido das plantações de
cacau, pois raros tem sido os isolados de P. capsici obtidos desta cultura,
predominando P. palmivora nas plantações (CERQUEIRA, 2014).
De acordo com Dantas et al. (2005) embora as perdas causadas pela
podridão-parda sejam menores do que as ocasionadas por outras doenças
como a vassoura-de-bruxa (Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer), a
monilíase (Moniliophthora roreri (Cif.) Evans et al.) e a murcha-vascular-estriada
(Oncobasidium theobromae Talbot & Keane), estas estão restritas a
14
determinadas regiões do mundo, enquanto a podridão-parda ocorre em todos os
países produtores de cacau. Sendo assim, a podridão parda ainda é
considerada como a doença mais importante do cacaueiro em termos mundiais
(DANTAS et al., 2005; BAHIA, 2007; CERQUEIRA et al., 2011).
A seringueira (Hevea brasiliensis (Wild. Ex. A. Juss.) Muell. Arg.) é outra
cultura importante na região sul baiana, e um dos seus principais patógenos é
P. capsici. No entanto, assim como ocorre no cacaueiro, outras espécies do
gênero Phytophthora também podem ser patogênicas para a seringueira, tais
como: P. palmivora, P. botryosa, P. citrophthora, P. nicotianae var. parasítica, P.
citricola, P meadii e P. cactorum (GASPARETTO, 1997).
A requeima ou queima das brotações novas, o cancro do painel, a
podridão dos frutos e a queda anormal e prematura das folhas, são as doenças
causadas por P. capsici nos seringais do Sul da Bahia (CERQUEIRA et al.,
2011).
O principal meio de sobrevivência de P. capsici em outras culturas é o
solo, mas o patógeno também pode sobreviver em sementes, restos de culturas
e plantas espontâneas. Sua disseminação no campo se dá via água de irrigação
ou chuva, implementos agrícolas, vento, a partir de lesões esporulantes em
frutos, ramos e folhas (REIS et al., 2007). No entanto, para o cacaueiro e
especialmente para a seringueira é necessário esclarecer a forma de
sobrevivência desta espécie, e, se existem outras plantas hospedeiras do
patógeno e, existindo, se elas são capazes de servir como fonte primária de
inóculo.
O objetivo deste trabalho foi portanto, estudar a existência de possíveis
fontes de inóculo de P. capsici em plantações de cacaueiro e seringueira no Sul
da Bahia para aprofundar e esclarecer os aspectos epidemiológicos dos
patossistemas P. capsici x seringueira e P.capsici x cacaueiro.
15
3.2 MATERIAL E MÉTODO
3.2.1 Área de estudo
O Sul da Bahia apresenta ótimas condições edafoclimáticas para o
desenvolvimento tanto da cultura de cacau quanto da seringueira. A coleta de
materias para o estudo desse trabalho foi realizada em 11 fazendas com cultivo
em SAF contemplando as duas culturas, nos municípios: Ituberá (faz.
Plantações Michelin, faz. Ondulada, faz. Morro alto, faz. Revolta, faz. Lagoa
Santa e faz. São Francisco); Camamu na fazenda Cultrosa; Una (faz.
Bolandeira, faz. Ghislaine e Estação EDJAB) e Uruçuca na fazenda Porto
Seguro.
3.2.2 Coletas
As coletas foram realizadas em épocas diferentes considerando os
períodos propícios (baixas temperaturas e alta umidade) e adversos (altas
temperaturas e baixa umidade) ao patogéno. Assim, foram feitas três coletas em
cada área, sendo a primeira nos meses de julho a setembro de 2014, a segunda
entre os meses de dezembro de 2014 a março de 2015 e a terceira durante os
meses de junho a agosto de 2015.
No cacaueiro foram coletadas bilros, chupões, frutos, solo da rizosfera e
plantas espontâneas ao redor da plantação. Na seringueira foram coletados
materiais da copa (folhas e plantas epífitas), solo da riszosfera e plantas
espontâneas ao redor da plantação. Para a coleta do solo da rizosfera utilizou-se
um trado com 20 cm de profundidade e retirando amostras em aproximadamente
1m de distância do caule. Foram coletadas três amostras simples de cada árvore
e misturadas em um saco de polietileno formando uma amostra composta.
16
3.2.3 Isolamento de Phytophthora
Os materiais coletados foram trazidos para o Laboratório de Phytophthora
(PHYTOLAB) do Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC), da Comissão
Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC). Fragmentos de folhas,
peciolos, caules e frutos com lesões foram superficialmente esterilizados em
álcool 70%, hipoclorito e água destilada esterilizada, e semeados em placas de
Petri contento meio seletivo PARPH (KANNWISCHER E MITCHELL, 1978). As
placas foram mantidas no escuro a uma temperatura de 22 ± 1 °C por quatro a
cinco dias e posteriormente, discos das bordas das colônias puras em meio
seletivo foram transferidos para placas de Petri contendo meio cenoura-ágar
(CA) onde foram cultivados para melhor crescimento e esporulação dos
isolados.
Para o solo retirado da rizosfera utilizou-se a técnica de plaqueamento
em meio seletivo (LUZ et al., 2008), que consistiu em pesar 10 g de cada
amostra de solo, diluí-la em 90 mL de ágar-água a 0,25% e homogeneizar a
mistura no agitador por cerca de dois minutos. Uma vez homogeneizada, foi
retirado da suspensão uma alíquota de 1 mL com uma pipeta de pasteur e
espalhada na superfície de cada uma das 10 placas contendo meio seletivo
PARPH (KANNWISCHER e MITCHELL, 1978), e em seguida incubadas no
escuro a 24 ± 1 °C. Após 48h foi realizada a lavagem em água corrente para
retirar o solo (LUZ et al., 2008), e feita a observação sob luz da presença de
culturas morfologicamente similares a Phytophthora spp. em cada placa (LUZ et
al., 2008). As culturas foram repicadas novamente em meio seletivo para serem
purificadas e em seguida passadas para placas de Petri contento meio cenoura
ágar (CA) para as análise morfobiométrica.
Todos os isolados obtidos foram mantidos em tubos de Penicilina
contendo meio batata-dextrose-ágar (BDA) e água estéril, de onde foram
retirados para os demais testes.
17
3.2.4 Caracterização morfobiométrica
Após o crescimento de cada isolado em CA e também em meio cenoura
líquido, sob luz contínua e temperatura de 25 °C durante cinco a sete dias foi
realizada a caracterização morfológica dos isolados, determinando-se a forma
das colônias, o tipo de micélio formado, presença ou ausência de clamidósporos,
esporângios e oósporos. Dos esporâgios observou-se o comprimento e largura,
a forma, a caducidade e o comprimento do pedicelo, medindo-se 50
esporângios.
3.2.5 Determinação do tipo de compatibilidade
O tipo de compatibilidade dos isolados obtidos foi determinado pareando-
os consigo e com os isolados 1191 (A1 de P. palmivora ), 216 (A2 de P.
palmivora), 1211 (A1 de P. capsici) e 229 (A2 de P. capsici), todos da coleção
Arnaldo Medeiros do Cepec, utilizando a técnica de sanduíche descrita por Luz e
Silva (2001). As placas contendo os sanduíches dos diferentes cruzamentos
foram incubadas no escuro, à 24 °C. Após cinco dias do pareamento os discos
de CA colocados entre os discos de cultura dos isolados testadores foram
colocados em lâminas e examinados ao microscópio para observar a formação
de oósporos.
3.2.6 Estudos moleculares dos isolados de solo
A identificação molecular dos isolados do solo foi realizada no laboratório
de biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. A
extração do DNA genômico foi realizada a partir da cultura pura em placa
utilizando o kit UltraClean® Microbial DNA Isolation (MoBio, USA), seguindo as
recomendações do fabricante. A integridade e a quantidade do DNA foram
verificadas usando eletroforese em gel de agarose a 0,8% e o Qubit® 2.0
Fluorometer (Invitrogen), respectivamente.
As amplificações por PCR foram realizadas com os primers ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC) e ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) da
18
região ITS-28S (Internal Transcribed Spacers) do DNA ribossomal (WHITE,
1990). E também com os primers LROR (ACCCGCTGAACTTAAGC) e LR6
(CGCCAGACGAGCTTACC) da região LSU 25-28S (Large subunit RNA) do
RNA ribossomal (RIETHMULLER et al., 2002). As reações foram preparadas
com os seguintes reagentes e concentrações: 60 ng de DNA de cada amostra;
1x de tampão da enzima Taq DNA polimerase; 3,7 mM de MgCl2; 0,6 pmol/μL de
dNTPs; 0,4 pmol/μL de cada primer; 2,5 U de Taq DNA polimerase, com volume
final ajustado para 50 μL com água ultra pura. Os ciclos de amplificações foram
realizados no Veriti Thermal Cycler PCR (Appplied Biosystems) sob as seguintes
condições térmicas: 94 ºC por 2 minutos, 35 ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 48 e
53 (ITS e LSU, respectivamente) 56 ºC por 1 minuto, 72 ºC por 1 minuto e
extensão final de 72 ºC por 10 minutos concluindo com o resfriamento a 8 ºC. Os
produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1%, corados com
brometo de etídio e sob luz ultravioleta. Em seguida os amplicons foram
purificados utilizando o kit Illustra® GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE
Healthcare Life Sciences) para posterior identificação nucleotídica utilizando o
sequenciador automático ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
da empresa ACTGene Análises Moleculares LTDA. A edição e montagem das
sequências foi realizada com o programa Sequencher 4.1.4 (Gene Code
Corporation). A identidade taxonômica dos isolados foi estudada a partir do
banco de dados GenBank, utilizando o BLASTn “basic local alignment search
tool” (BLAST) do NCBI.
3.2.7 Teste de patogenicidade realizados com os isolados coletados em
frutos e folhas de cacaueiro e em folhas de seringueira
Apartir das características morfobiométricas, foram escolhidos 17 isolados
de P. capcisi (2636, 2637, 2638, 2639, 2652, 2674, 2676, 2689, 2690, 2691,
2692, 2696, 2697, 2698, 2699, 2700 e 2701) seis isolados de P. palmivora
(2680, 2681, 2682, 2683, 2687e 2695) e um isolado de P. citrophthora (2693)
para inoculações em: folhas destacadas de seringueira dos clones FX3864 (mais
susceptível a Phytophthora) e SIAL1005 (considerado resistente a
Phytophthora); discos de folhas de cacau Catongo e em frutos de cacau comum.
19
O critério da escolha dos isolados baseou-se em inocular pelo menos um
isolados de cada uma das fazendas.
Utilizou-se três folhas destacadas de seringueira (sendo, cada folha com
três folíolos, dois pontos de inoculação por folíolo e um total de 18 pontos de
inoculação) e quatro frutos de cacau (quatro frutos x três pontos de inoculação =
12 pontos de inoculação) para cada isolado, inoculando-os com disco de micélio
de 0,5 cm de diâmetro dos isolados cultivados em CA. Os inóculos foram
cobertos com um chumaço de algodão embebido em água destilada para
manter a umidade (Figura 1). Após a inoculação as folhas foram colocadas em
caixas contendo espuma embebidas com água destilada para manter a umidade
e os frutos foram colocados em sacos plásticos de polietileno transparentes
borrifados com água destiladas formando câmaras-úmidas (LUZ et al., 2001).
Três, cinco e sete dias após as inoculções foram feitas as avaliações, medindo-
se o comprimento e a largura das lesões para o cálculo da área das mesmas.
Os discos de folhas de cacau Catongo, foram inoculados com suspensão
de zoósporos na concentração 3x105 zoósporos/ml, utilizando os mesmos
isolados dos testes anteriores e seguindo a metologia descrita por Nyassé et al.
(1995). Utilizou-se 20 discos de folha para cada isolado. Os discos foram
arrumados em caixas forradas com espuma embebida com água destilada para
manter a umidade, formando assim uma câmara-úmida (Figura 2a). Sete dias
após a inoculação procedeu-se a avaliação usando uma escala de notas
desenvolvida por Nyasse et al. (1999), com valores variando de 0 – 5 (Figura
2b). A partir das notas foram determinados os índices de serveridade da doença
(ID) através da fórmula de Mckinney (1923), conforme Equação:
( ) ∑( )
( )
em que,
ID = índice de doença variando de 0 a 100;
f = número de disco de folhas com determinada nota;
v = grau de infecção (nota);
n = número total de discos de folhas avaliadas;
x= grau máximo de infecção (nota).
20
Os experimentos foram montados em delineamento inteiramente
casualizados e as análises dos índices de severidade da doença causados pelos
isolados em disco de folhas e a área média das lesões em folhas e frutos foram
comparadas pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade, utilizando o
software SISVAR® versão 5.6.
Figura 1. Inoculações em folhas destacadas de seringueira (a) e frutos de cacau
(b) com isolados obtidos nesta pesquisa.
Figura 2. Inoculação dos discos de folhas (a), escala de notas desenvolvida por
Nyasse et al. (1999) para avaliação de genótipos de cacaueiros quanto a
resistência à podridão-parda em discos de folhas e usada neste experimento (b).
a b
a a
21
3.3 RESULTADOS
Foram encontrados isolados de Phytophthora em todas as fazendas
visitadas nos quatro municípios. No presente estudo foram obtidos 50 isolados
de Phytophthora, sendo 46 de material vegetal e quatro encontrados no solo da
rizosfera. Ituberá foi o município onde encontrou-se a maioria dos isolados, 31.
Todos os isolados de material vegetal foram encontrados apenas no período
propício ao patógeno, entre os meses de julho a setembro e os de solo nos
meses mais quentes (Tabela 1).
Tabela 1. Número de culturas semelhantes a Phytophthora obtidas do solo da
rizosfera e parte aérea das plantas, por data e município de coleta nos anos de
2014 e 2015, em plantios de consórcio seringueira e cacaueiro no Sul da Bahia.
DATA
Ituberá Camamu Uruçuca Una
Parte aérea
Solo Parte aérea
Solo Parte aérea
Solo Parte aérea
Solo
jul/14 4 - - 1 - - 8 2
ago/14 12 3 2 1 - - 1 -
set/14 5 5 - - - - - -
out/14 - 3 - - - - - -
mar/15 - 6 - 4 - 3 - -
abr/15 - 10 - - - 3 - 2
jul/15 5 - 3 - 1 1 - -
ago/15 5 - - 1 - - - -
TOTAL 56 12 8 13
*- não encontrados.
A maioria dos isolados de material vegetal (36) foi oriunda de seringueira,
sendo 23 do clone FX3864, três de SIAL1005, dois de PUA, três de IAN873, um
22
de MDF180 e quatro de policlones em viveiro. Foram obtidos cinco isolados de
frutos de cacaueiro, três em folhas de epífitas e um isolado em folhas de uma
planta espontânea.
O meio seletivo PARPH (KANNWISCHER E MITCHELL, 1978), inibiu o
crescimento de muitos fungos Oomycota de outros gêneros, mas não todos.
Principalmente do solo, onde existe uma microbiota enorme, muitas espécies de
Pythium e outros Oomycota são também isolados. Foram obtidos 43 isolados do
solo rizosferico, com crescimento semelhante a Phytophthora porém, apenas
dois foram confirmados até o momento como Phytophthora. Os demais,
pertencem aos gêneros Pythium e Phytopythium, os quais serão abordados no
capítulo 4.
3.3.1 Caracterização morfobiométrica
Os isolados de Phytophthora foram separados por espécies de acordo
com a caducidade dos esporângios e o tamanho dos pedicelos. Esporângios
não caducos P. citrophthora e se caducos com pedicelos longos P. capsici e
com pedicelos curtos P. palmivora (LUZ & MATSUOKA, 1996).
No estudo das características morfobiométricas, observou-se que nos
isolados de seringueira houve predominância de colônias do tipo rosacea (mas
com algumas do tipo petalóide e estelar), esporângios do tipo limoniforme
medindo 44,5 x 23,6 μm (22-68 x 14-30 μm), papilas com média de
profundidade do poro apical (PPA) de 4,3 μm e com largura do poro apical
(LPA) de 6,1 μm, pedicelo 47μm (20-82 μm). Características estas similares a P.
capsici (Tabela 2) e de acordo com as chaves taxonômicas (WATERHOUSE,
1963, 1983; STAMPS et al., 1990). Em seringueira observou-se apenas um
isolado de P. palmivora, com colônia do tipo colapsada, esporângios obpiriforme
com média 40,6 X 24,1 μm, papilas com PPA de 5,6 μm e LPA de 6,8 μm, com a
presença de clamidósporos com diâmetro médio de 24,7 μm (19-29,5 μm).
Nos isolados de P. palmivora de cacaueiro houve predominância de
colônias do tipo colapsada, esporângios do tipo obpiriforme medindo 44,4 x 29,5
μm (21,8-67,8 x 18,7-36,4 μm), papilas com PPA de 5,3 μm e LPA de 9,5 μm,
pedicelos 3,5 μm (1,8-5,5 μm), clamidósporos 28,5 μm (17-49 μm). No cacaueiro
23
apenas um isolado de P. citrophthora foi obtido com colônia do tipo colapsada,
esporângios do tipo obpiriforme medindo 50,9 x 27,8 μm (35-65 x 21,7-35 μm),
papilas com PPA de 5 μm e LPA de 7,3 μm, clamidósporos com 27 μm (17,9-
39,8 μm) (Tabela 3) .
Os isolados obtidos do solo da rizosfera foram homotálicos sendo que o
isolado de P. capcisi apresentou colônias do tipo estelar, oogônios com média
18 μm (17-19,6 μm), anterídios parágino e não foi observado a presença de
esporângios e clamidósporos. O isolado de P. heveae apresentou colônias do
tipo colapsada, oogônio com média 24,3 μm (18,2-34,1 μm), anterídios
anfígenos com média 12,8 x 10,3 μm (9,3-16-9 x 7,3-14,7 μm), clamidósporos
terminais com 29,8 μm de diâmetro (25,6-32,9 μm) e não foi observada a
presença de esporângios.
3.3.2 Determinação do tipo de compatibilidade
Os isolados de P. capsici formaram oogônio, anterídios e oósporos
quando pareados com o isolado 229, de P. capsici, do tipo compatível A2. Essas
estruturas não foram observadas no auto-pareamento dos isolados e nem nos
pareamentos com o isolados do tipo compatível A1, comprovando que os
isolados de P. capsici obitidos no presente estudo são heterotálicos do tipo
compatível A1. Todos os isolados de P. palmivora, formaram oogônio, anterídios
e oósporos quando pareados com o isolado 1191 do tipo compatível A1.
3.3.3 Teste de patogenicidade
3.3.3.1 Inoculações em seringueira
Todos os isolados de P. capsici inoculados nos dois clones de seringueira
causaram lesões. No entanto, houve variação no grau de agressividade entre os
isolados. No clone FX3864 os isolados de P. capsici 2636, 2699, 2700, 2691,
2692 e 2639 apresentaram menores valores de área de lesão variando de 0,9 a
2,72 cm2.
24
Tabela 2. Características morfobiométricas dos isolados de Phytophthora obtidos de seringueira, quando cultivados por sete dias
em meio cenoura-ágar.
Continua
N° do
ISOLADO LOCAL¹ ÓRGÃO ESPÉCIE
TIPO DE
COLÔNIA
TIPO DE
ESPO.
ESPORÂNGIO
Comp. X Largura C/L²
PAPILA PEDI.
5 CLAM.6
PPA3
LPA4
2636 1 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 44±5,6 X 23,2±1,7 1,9:1 3,6±0,8 6±0,5 41±22,8 -
2637 2 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 42±5,3X 23,3±2,1 1,8:1 3,6±0,4 5,8±0,6 44,6±8,2 -
2639 1 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 42,6±7 X 23,3±1,8 1,9:1 4,3±1,5 6,5±1,7 25,6±6,7 -
2641 3 Hastes P.capsici Petalóide limoniforme 39,9±5,9 X 21,5±1,6 1,9:1 4,3±1,2 5,9±0,7 37,5±13,2 -
2642 1 Caule P.capsici Rosacea limoniforme 48,1±5,4 X 24,4±3,4 1,9:1 4±0,7 6,4±0,7 43,8±15,7 -
2662 5 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 41,4±5,2 X 21,7±1,5 2,0:1 3,9±7 6,6±0,5 20±9,8 -
2663 4 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 39,4±6,5 X 22,1±2 1,9:1 4,1±0,6 6,3±0,6 22,9±12,2 -
2664 4 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 41,6±7,1 X 22,6±2,8 1,9:1 4,4±0,9 6,8±0,9 18,9±7,1 -
2666 4 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 37,7±4,1 X 23,1±2,3 1,6:1 3,8±3,5 6,6±0,8 34,2±10,3 -
2667 6 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 36,8±4,9 X 21,6±2,2 1,7:1 3,5±0,5 6,7±0,8 30,6±11,8 -
2668 2 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 37,4±6,1 X 21,6±2,9 1,7:1 4±0,6 5,6±0,6 46,8±17,1 -
2669 3 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 41,9±7,3 X 20,4±2,9 2,1:1 4,1±0,7 5,8±0,6 46,7±16,5 -
2670 2 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 39,5±6,3 X 23,4±3,5 1,7:1 3,8±0,7 7,5±0,6 34,4±11,2 -
2671 4 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 44,2±4 X 23,5±1,1 1,8:1 4,8±0,7 6,7±0,7 43,7±12,8 -
2672 4 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 37,8±5,4 X 21,7±2 1,8:1 7±0,7 3,6±0,5 28,2±8,9 -
2675 4 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 36,7±5,7 X 22,2±3,1 1,7:1 4±0,7 7,3±0,7 30,1±10,7 -
2677 6 Peciolo P.capsici Rosacea globoso 42,8±4,1 X 29,9±4,8 1,4:1 4,3±1 7,8±1 24,4±9,6 -
2678 3 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 46,8±6,2 X 23,2±3,1 2,0:1 4,1±0,6 6±0,8 49,3±14,3 -
2679 2 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 39,4±10,7 X 23,1±2,6 1,9:1 3,7±0,8 7±0,8 36,8±11,1 -
2682 1 Peciolo P.palmivora Colapsada obpiriforme 40,6±5,1 X 24,1±2,4 1,7:1 5,6±1,2 6,8 ± 1 - 24,7±2,3
2684 2 Peciolo P.capsici Petalóide limoniforme 48,9±7,8 X 24,4±2,4 2,1:1 4±0,5 6,4±0,7 47,4±9,9 -
25
Tabela 2. Continuação.
¹ LOCAL: 1 (Faz. Michelin Plantações-Ituberá); 2 (Faz. Ondulada-Ituberá); 3 (Faz. Moro Alto-Ituberá); 4 (Faz.Lagoa Santa-Ituberá); 5 (Faz. Revolta-Itubera); 6
(Faz. Cultrosa-Camamu); 7 (EDJAB-Una); 8 (Faz. Ghislaine Esmeralda).
² C/L = relação comprimento/largura dos esporângios 3 PPA = profundidade do poro apical
4 LPA = largura do poro apical
5 PEDI. = pedicelo
6 CLAM. = clamidósporos
N° do
ISOLADO LOCAL¹ ÓRGÃO ESPÉCIE
TIPO DE
COLÔNIA
TIPO DE
ESPO.
ESPORÂNGIO
Comp. X Largura C/L²
PAPILA PEDI.
5 CLAM.6
PPA3 LPA
4
2685 2 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 48,8±7,8 X 24±3,3 2,0:1 5,3±0,7 6,5±0,8 36,9±10,3 -
2686 6 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 50,9±7,9X 24,9±3 2,1:1 4,3±0,8 6,3±0,7 43,4±14,2 -
2688 3 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 54,7±8,4 X 27±2,3 2,1:1 4,9±0,7 7,4±0,7 48,2±14,4 -
2689 3 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 47,4±8,7 X 26±2 2,0:1 4,8±0,8 7±0,8 35,6±12,5 -
2690 7 Peciolo P.capsici Petalóide Limoniforme 43,5±5,8 X 23,1±2,4 1,9:1 4,3±0,5 6,2±0,4 42,9±15,5 -
2691 1 Peciolo P.capsici Rosacea Limoniforme 43,3±9,2 X 22,5±3,7 2,00:1 4,2±0,6 6,3±0,6 34,5±10,5 -
2692 1 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 45,3±6,2 X 24±2 1,9:1 4±0,6 6,6±1 47,6±20,7 -
2694 2 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 45,8±5,9 X 24,6±2,7 1,89:1 5,1±0,8 6,6±0,7 23,7±5,3
2696 7 Folhas P.capsici Petalóide limoniforme 33,2±6,5 X 20,8±2,7 1,7:1 2,5±0,4 5±0,8 53,3±8,1 -
2697 7 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 33,5±5,7 X 20,5±7,3 1,4:1 3,6±0,5 5,2±0,9 37,4±11,1 -
2698 7 Folhas P.capsici Petalóide limoniforme 33,8±7 X 19,5±2,7 1,8:1 3,8±0,7 5,9±0,8 41,2±4,6 -
2699 7 Peciolo P.capsici Petalóide limoniforme 44,1±5,9 X 23,6±2,5 1,9:1 4,7±0,7 6,6±0,8 47,7±7,4 -
2700 7 Caule P.capsici Petalóide limoniforme 37,7±4,9 X 22,1±2,1 1,7:1 4,1±0,6 6,1±0,4 40,5±10,5 -
2701 8 Folhas P.capsici Petalóide limoniforme 36,3±5,4X 20,2±3,4 1,7:1 3,5±0,4 5,6±0,5 36,5±4,9 -
2702 8 Peciolo P.capsici Petalóide limoniforme 40,6±4,9 X 22,3±3,2 1,8:1 4,3±0,6 6,1±0,4 36,9±5,9 -
26
Tabela 3. Características morfobiométricas dos isolados de Phytophthora obtidos de cacaueiro, quando cultivados por sete dias
em meio cenoura-ágar.
¹LOCAL: 1 (Fazenda Santo Antônio-Ituberá); 2 (Faz. Michelin Plantações-Ituberá); 3 (Faz. Ondulada-Ituberá); 4 (Faz. Moro Alto-Ituberá); 5 (Faz.Lagoa Santa-
Ituberá); 6 (Faz. Porto Seguro-Uruçuca).
² C/L = relação comprimento/largura dos esporângios 3 PPA = profundidade do poro apical
4 LPA = largura do poro apical
5 PEDI. = pedicelo
6 CLAM. = clamidósporos
N° do
ISOLADO LOCAL¹ ÓRGÃO ESPÉCIE
TIPO DE
COLÔNIA TIPO DE
ESPO. ESPORÂNGIO
Comp. X Largura C/L²
PAPILA
PEDI.5
CLAM.6
PPA3
LPA4
2680 5 Folhas P.palmivora Rosacea obpiriforme 53,8±6,9 X 33±2,4 1,7:1 5,3±0,8 9,5±0,5 - -
2681 2 Fruto P.palmivora Rosacea obpiriforme 42,6±8 X 26,8±3,2 1,7:1 4,1±1,2 6,2±0,9 3,5±0,7 27,4±6,3
2683 3 Peciolo P palmivora Colapsada ovoide 40,8±8,2 X 25,3±2,9 1,7:1 4,2±0,8 6,4±0,6 3,5±0,9 28,1±8,5
2687 4 Fruto P.palmivora Colapsada globoso 36,6±7,6 x 26,5±3,7 1,5:1 4,8±0,9 6,3±0,7 3,7±1,3 31,1±7,8
2693 1 Fruto P.citrophthora Colapsada obpiriforme 50,9±10,2 X 27,8±3,5 1,9:1 5±1,1 7,3±0,7 - 27 ± 6,7
2695 6 Folhas P.palmivora Colapsada obpiriforme 48±6,3 X 25,1±1,7 2,0:1 5,1±0,9 6,4±0,7 4,1±1 -
27
Em seringueira clone FX3864 as maiores áreas de lesão entre 10,2 a
12,5 cm2, foram causados pelos isolados 2696, 2690 e 2674, sendo os dois
primeiros obtidos de seringueira e o último da planta epífita (Tabela 4).
No clone SIAL1005 os menores valores de área de lesão foram
causados pelos isolados 2697, 2690 e 2676 de P. capsici com: 2,2 cm2; 3,7
cm2 e 3,8 cm2 respectivamente. E as maiores áreas de lesão foram causados
pelos isolados 2638, 2674, 2698, 2639 e o 2652 (os dois primeiros obtidos da
planta epífita, em seguida dois de seringueira e o último de planta espontânea)
com médias variando entre 6,7 a 7,6 cm2 (Tabela 4).
Tabela 4. Área média das lesões (cm2) em folha de seringueira dos clones
FX3864 e SIAL1005, causada por 17 isolados de P. capsici.
*Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade.
Isolado Área da Lesão (cm2)
FX3864 SIAL1005
2636 0,9 a 5,8 b
2699 0,9 a 5,5 b
2700 1,3 a 5,0 b
2691 2,3 a 5,4 b
2692 2,5 a 5,1 b
2639 2,7 a 7,5 c
2698 3,1 b 7,3 c
2676 3,2 b 3,8 a
2701 4,2 b 4,9 b
2638 4,6 b 7,0 c
2652 5,9 b 7,6 c
2697 6,8 c 2,2 a
2689 7,3 c 5,8 b
2637 8,7 c 5,0 b
2696 10,2 d 4,9 b
2674 12,4 d 6,7 c
2690 12,5 d 3,7 a
28
As inoculações com os seis isolados de P. palmivora em folhas de
seringueira também resultaram na formação de lesões, com exceção do
isolado 2682. Embora houvesse variação na reação de cada um dos clones
aos diferentes isolados, os isolados de número 2681 e 2683, foram os menos
agressivos aos dois clones, causando as menores áreas médias de lesão.
Porém, no clone FX3864, o isolado 2695 foi significativamente diferente dos
dois primeiros isolados mencionados, tendo um comportamento intermediário,
mas não diferiu destes em relação ao SIAL1005 (Tabela 5).
Tabela 5. Área média das lesões (cm2) em folha de seringueira dos clones
FX3864 e SIAL1005, causada por 5 isolados de P. palmivora.
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade.
Nas inoculações com o isolado de P. citrophthora, as médias de áreas
de lesão diferiram estatisticamente entre os dois clones, sendo menor no clone
SIAL1005 (Tabela 6).
Tabela 6. Área média das lesões (cm2) causadas por P. citrophthora em folhas
de seringueira dos clones FX3864 e SIAL1005.
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade.
Isolado Área da Lesão (cm2)
FX3864 SIAL1005
2681 6,1 a 0,5 a
2683 8,0 a 1,3 a
2695 11,5 b 0,4 a
2687
2680
18,6 c
18,7 c
7,9 c
8,1 c
Clone Área da Lesão (cm2)
SIAL1005 0,3 a
FX3864 16,0 b
29
3.3.3.2 Inoculações em frutos de cacau
As inoculações com isolados de P. capsici, mostraram que o isolado
2652 obtido da planta espontânea, foi o único que diferiu estatisticamente dos
demais, causando manchas de coloração marron-clara na superficie dos frutos,
com área média de lesão 26,7 cm2 (Figura 3a e b). Os isolados obtidos de
seringueira e da epífita causaram apenas pequenas lesões no ponto de
inoculação, não diferindo estatisticamente entre si.
Figura 3. Frutos de cacau inoculados com isolados de Phytophthora cinco e
sete dias após a inoculação: a-b isolado 2652 de P. capsici, cinco (a) e sete (b)
dias; c-d isolados de P. palmivora, (c) isolado 2687 e (d) isolado 2683.
Os isolados de P. palmivora estatisticamente foram divididos em três
grupos de virulência, sendo mais agressivos ao hospedeiro os isolados 2687 e
2683 obtidos de cacaueiro. E no grupo intermediário ficou o isolado 2682 obtido
de seringueira (Tabela 7). Sete dias após a inoculação, os frutos inoculados
com isolados de P. palmivora estavam completamente apodrecidos e cobertos
com micélio esbranquiçado (Figura 3c e d).
a b
c d
30
Tabela 7. Área média das lesões (cm2) em frutos de cacau comum, causada
por 6 isolados de P. palmivora, sete dias após a inoculação.
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade.
3.3.3.3 Inoculações em disco de folhas de cacau
Após sete dias da inoculação, as caixas foram cuidadosamente abertas
e procedeu-se a avaliação. Os resultados das inoculações em discos de folhas
de cacau inoculados com isolados de P. capsici, mostraram que três isolados,
2652 da planta espontânea, 2638 e 2674 da epífita, não causaram lesões nos
discos de folha de Catongo, com ID igual a 0%. Dez isolados apresentaram
baixo índice de severidade entre 2 a 9 %. E o isolado 2689 apresentou o maior
índice de severidade 48%, sendo considerado o isolado de P. capsici mais
agressivo (Tabela 8).
Tabela 8. Índice de severidade da doença causados por 14 isolados de P.
capsici, em disco de folhas de cacaueiro Catongo.
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Isolado Tamanho da Lesão (cm2)
2681 6,8 a 2695 8,2 a 2682 14,1 b 2680 18,2 b 2687 2683
32,0 c 32,9 c
Isolado Índice de Severidade (%)
2700 2,0 a 2691 3,0 a 2698 4,0 a 2692 4,0 a 2637 4,0 a 2636 4,0 a 2676 5,0 a 2690 6,0 a 2697 7,0 a 2701 9,0 a 2699 15,0 b 2696 15,0 b 2639 21,0 c 2689 48,0 d
31
Em relação aos isolados de P. palmivora, quando inoculados em disco
de folhas de cacaueiro, observou-se ampla variação de patogenicidade em
relação ao cultivar Catongo, com o índice de severidade variando de 3%
(isolado 2683) a 97% (2680). Os isolados 2681, 2687 e 2680, foram os mais
agressivos, sendo o último estatisticamente diferente dos demais (Tukey p <
0,05) com quase 100% de severidade. O cultivar Catongo é considerado
suscetível a P. palmivora (Tabela 9).
Tabela 9. Índice de severidade da doença causados por 7 isolados de P.
palmivora, em disco de folhas de cacaueiro Catongo.
* Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
3.3.3.4 Caracterização molecular dos isolados de Phytophthora da
rizosfera
A análise das sequências obtidas para a região ITS-28S do DNA
ribossômico (rDNA) e LSU confirmaram a idêntificação de dois isolados
encontrados na rizosfera como P. tropicalis (02361) e P. heveae (02595). As
sequências foram depositadas no GenBank (Tabela 10).
Tabela 10. Identificação molecular de isolados de Phytophthora sp. obtidos da
rizosfera de T. cacao e H. brasiliensis de fazendas do Sul da Bahia, Brasil.
1Os amplicons foram sequenciados em ambas as orientações e os segmentos
de consulta apresentados correspondem à sequência obtida. 2'e-values "eram
iguais a zero para os isolados. 3Os números de acesso que correspondem às
sequências descritivas a taxonomia indicada na coluna anterior.
Isolado Índice de Severidade (%)
2683 3,0 a 2695 8,0 a 2682 37,0 b 2681 2687
78,0 c 80,0 d
2680 97,0 e
Isolado Tamanho (pb) 1
Cobertura (%)
Identidade (%) 2
Número de acesso GenBank3
02361 752 100 100 FJ801928.1; AY207010.1; U564665.1
02595 680 100 100 KP295301.1 KJ755106.1; JX996048.1
32
3.4 DISCUSSÃO
Objetivou-se neste trabalho estudar a existência de possíveis fontes de
inóculo de P. capsici em plantações de cacaueiro e seringueira no Sul da
Bahia e aprofundar os conhecimentos sobre os aspectos ecológicos,
epidemiológicos e patológicos das interações de P. capsici com estas culturas.
Foram encontrados três fontes primárias de inóculo de P. capsici: o solo, uma
epífita e uma planta espontânea. A sobrevivência de P. capsici no solo já é
comprovada para a maioria dos hospedeiros que abrigam o patógeno (KIMATI
et al., 1997; MENDES et al., 1998; LUZ e MATSUOKA, 2001; LAMOUR &
HAUSBECK, 2002; REIS e HENZ, 2008; PEREIRA et al., 2013), no entanto
estruturas de sobrevivência desta espécie ainda não haviam sido encontradas
em solos cultivados com seringueira e nem com cacaueiro (LUZ et al., 1991).
P. capsici e P. nicotianae são as espécies de Phytophthora com maior
número de hospedeiros e com distribuição em todo território nacional
(MENDES et al., 1998; LUZ & MATSUOKA., 2001; SANTOS et al., 2014b). A
lista de hospedeiros destas e de outras espécies são ampliadas
constantemente com novos relatos em todo o mundo, bem como, com registros
da sobrevivência na rizosfera de seus hospedeiros. Recentemente estudos
feitos por Santos e Luz (2011) e Santos et al. (2013 e 2014a) relataram a
ocorrência de espécies de Phytophthora na rizosfera de cultivos agrícolas no
Sul da Bahia e a descoberta de novos hospedeiros de Phytophthora nicotianae
na mesma região. Dados morfobiométricos combinados com estudos
moleculares permitiram identificar duas espécies de Phytophthora na rizosfera
de seringueira e cacaueiro, P. capsici e P. heveae. Ambas espécies integram o
complexo de espécies de Phytophthora relacionadas a podridão parda nos
frutos de cacaueiro, embora P. hevea seja considerada apenas
moderadamente agressiva (LUZ & SILVA., 2001). Levantamentos realizados
entre as décadas de 70 e 80 apontavam P. capsici como a espécie
predominante nas plantações de cacaueiro na Bahia e no Espírito Santo,
porém levantamentos posteriores mostraram um aumento das populações de
P. palmivora e P. citrophthora (LUZ et al., 2005). O grau de agressividade
destas espécies ao cacaueiro vem aumentando, em contrapartida à redução da
33
agressividade de P.capsici, pois atualmente raramente isolados de P. capsici
são encontrados nesta cultura. Este fato, esta intimamente relacionado com a
predominância de P. palmivora e P. citrophthora nas plantações de cacaueiro
(LUZ et al., 2005). O fato é que também no presente estudo só foram obtidos
de cacaueiro isolados de P. palmivora (5) e um de P. citrophthora.
Os dados morfobiométricos dos isolados de material vegetal obtidos no
estudo foram comparados com as características morfológicas e biométricas
preconizadas pelas chaves de Waterhouse (1963), Newhook et al. (1978) e
Stamps et al. (1990) e classificados em P. capsici, P. palmivora e P.
citrophthora. Dos isolados de P. capsici, 37 foram obtidos de seringueira, três
de epífitas, um de planta espontânea e um da rizosfera.
Todos os isolados de P. capsici apesentaram compatibilidade sexual do
tipo A1, ocorrendo uma predominância deste tipo compatível na região. Este
fato já havia sido observado por Cerqueira (2014), em estudos realizados com
mais de 300 isolados de P. capsici obtidos de seringais no Sul da Bahia, onde
todos foram do tipo compatível A1. Enquanto há um predominância do tipo
compatível sexual A1 em P. capsici, o inverso ocorre com os isolados de P.
palmivora, pois todos são do tipo compatível A2.
Embora as características morfologicas enquadrassem os isolados das
epífitas, da rizosfera e da planta espontânea como P. capsici, estudos
moleculares apontaram estes isolados como sendo P. tropicalis. Uchida e
Aragaki (1989), observaram que alguns isolados de P. capsici obtidos de
hospedeiros tropicais como macadâmia, eram pouco virulentos ou não eram
patogênicos a pimentão. Tais fatos levaram os autores a questionar a
permanência ou não dos isolados obtidos de hospedeiros tropicais dentro da
espécie P. capsici. Oudemans e Coffey (1991) através de análises
isoenzimáticas de 84 isolados de P. capsici obtidos de diferentes hospedeiros,
demostraram a existência de três subgrupos dentro desta espécie, CAP1,
CAP2 e CAP3. Dentro do grupo CAP2 ficaram os isolados descritos por Uchida
e Aragaki (1989), e no grupo CAP3 os isolados de cacaueiro do Brasil
(OUDEMANS & COFFEY, 1991).
Em 2001, P. tropicalis foi descrita por Aragaki & Uchida (2001), como
uma nova espécie, distinta de P. capsici por apresentar: ausência de
crescimento a 35 °c; comprimento do pedicelo do esporângio maior que 50 μm
34
e a formação de clamidósporo. Entretanto, a validade ou não da espécie P.
tropicalis vem sendo discutida por muitos autores. Os isolados do presente
estudo considerados como P. tropicalis pelas análises moleculares, não foram
capazes de formar clamidósporos e alguns isolados apresentaram pedicelos
com comprimento inferiores a 50 μm. Estes resultados já haviam sido
observados por Cerqueira (2005), que estudando a diversidade genética e a
taxonomia de P. capsici de isolados de diversos hospedeiros tropicais e através
de teste de patogenicidade dos mesmos ao pimentão, encontrou várias
contradições relacionadas aos critérios que destinguem P. capsici de P.
tropicalis. Dentre as contradições encontradas por Cerqueira (2005) estão: o
não agrupamento dos isolados por hospedeiros e origem geográfica, quando
sequenciados para três genes nucleares (DNA ribossomal, fator de elongação
1-α e β-tubulina); a patogenicidade de isolados de hospedeiros tropicais como
macadâmia, cacau e seringueira a frutos de pimentão e o comprimento do
pedicelo de esporângios de alguns isolados inferiores a 50 μm. Esses dados
parecem comprovar a invalidade da espécie P. tropicalis que seria um sinônimo
de P. capsici.
Os isolados de P. palmivora e P. citrophthora, quando inoculados em
frutos e discos de folhas de cacau, se mostraram altamente agressivos.
Estudos recentes mostraram que o cultivar Catongo de cacaueiro é
considerado um dos mais suscetível a estas espécies de Phytophthora, quando
comparado ao clone Scavina 6 (IWARO et al., 1997; BAHIA et al., 2015;
BARRETO et al., 2015). A maioria dos isolados de P. capsici, inoculados em
frutos e disco de folhas de cacaueiro, ficou no grupo de menor e intermediária
virulência, com exceção do isolado obtido da planta espontânea que, se
mostrou patogênico aos frutos, diferindo estatisticamente dos demais. Esse
resultado comprova que P. capsici vem utilizando plantas espontânea como
meio de sobrevivência na cultura do cacaueiro, e daí pode ocorrer a infecção
principalmente dos frutos que se desenvolvem na base do caule do cacaueiro.
A infecção ocorre normalmente no período de chuvas através dos respingos
d‟água (LUZ e SILVA, 2001).
Os testes de patogenicidade realizados em folhas destacadas de
seringueira dos dois clones, demostraram que 100% dos isolados de P. capsici
foram patogênicos com diferenças nos diâmetro das lesões. No clone FX3864
35
os isolados 2696, 2690 (provenientes de seringueira - Estação EDJAB) e 2674
(provenientes da epífita – Faz. Morro Alto) causaram as maiores lesões (10,2
cm; 12,5 cm2 e 12,4 cm2) respectivamente. Em SIAL1005 os isolados 2674,
2638 (obtidos de epífitas – Faz. Morro Alto e Michelin plantações
respectivamete) 2698, 2639 (obtidos de seringueira – Michelin plantações e
Estação EDJAB) e 2652 (obtido de planta espontânea – Faz. Ghislaine
Esmeralda) causaram as maiores áreas de lesão (6,7 cm2; 6,9 cm2; 7,3 cm2;
7,5 cm2; 7,6 cm2) respectivamente. Nas inoculações com P. palmivora, os
isolados 2687, 2680 causaram as maiores áreas de lesão nos dois clones,
18,6 cm2 e 18,7 cm2, respectivamente, para o FX3864 e 8,1 cm2 e 7,8 cm2,
respectivamente, para SIAL1005. Quando inoculado com P. citrophthora o
SIAL1005 apresentou elevada resistência ao patógeno (com 0,3 cm2 de área
média de lesão) comparada ao FX3864 (com 16,0 cm2 de área média de
lesão).
Apesar de apresentar lesões quando inoculado com as três espécies de
Phytophthora, o clone SIAL1005 mostrou ser mais resistente aos patógenos
quando comparado ao clone FX3864, considerado altamente sucetível. O
SIAL1005 tem sido um dos clones de seringueira mais recomendados pela
Ceplac, especialmente em substituição ao clone FX3864, principalmente pela
sua alta produção de borracha e madeira, e sua tolerância ao Microcyclus ulei
P. Henn, e às doenças causadas por Phytophthora spp., consideradas as
principais enfermidades da seringueira nas Américas (MARQUES, 2006;
FILHO, 2011).
Ao comparar as lesões em folhas de seringueira causadas pelas três
espécies de Phytophthora, é possível observar que os isolados P. palmivora
obtidos de cacaueiro, causaram as maiores áreas de lesão nos dois clones, do
que os isolados de P. capsici obtidos de seringueira. Isso indica, ser P.
palmivora a espécie mais agressiva. Em cacaueiro, os isolados de P. capsici
também são menos virulentos que os de P. palmivora para todos os órgãos do
cacaueiro testados (CAMPÊLO e LUZ, 1981; LOWRENCE et al., 1982; LUZ,
1989). No entanto, apesar de P. palmivora ter se mostrado mais virulenta à
seringueira, não é a mais predominante nas plantações desta cultura, mas sim
P. capsici, pois, de 36 isolados de Phytophthora obtidos de seringueira, apenas
um foi de P. palmivora (o isolado 2682), e que curiosamente, nos teste de
36
patogenicidade não causou nenhuma lesão nas folhas de seringueira. Este fato
mostra que, embora não seja a espécie mais agressiva à seringueira, P. capsici
é a principal responsável por causar doenças nesta cultura no Sul da Bahia. As
razões desta predominância, permanecem ainda inexplicadas, embora possa
estar relacionada a maior capacidade de sobrevivência de P. capsici no
ambiente de seringal.
O isolado 2674 obtido de epífita ficou entre os isolados que causaram as
maiores lesões nos dois clones de seringueira. Outro isolado de epífita que
também se destacou entre os mais agressivos ao clone SIAL1005 foi o 2638,
ficando entre os isolados de virulência intermediária ao clone FX3864. Estes
resultados nos levam a afirmar, que uma das principais fontes de inóculo de P.
capsici na cultura da seringueira sejam as epífitas. Assim como ocorre no
cacaueiro, no período de chuva, as folhas de seringueira são infectadas com
esporos de P. capsici, pelo escoamento da água que se acumula no fitotelmo
das epífitas. Se as plantas estiverem infectadas, vai haver a formação de
esporângios e liberação de zoósporos, propágulos móveis que se locomovem
com facilidade na água e que podem ser disseminados pelos respingos de
chuva na copa das seringueiras, dando início as infecções nos folíolos novos e
podem iniciar as epidemias de requeima, que ocorrem frequentemente na
região.
Ituberá e municípios vizinhos, constituem um grande pólo de
diversificação de culturas no Estado da Bahia, sendo favorecidos
principalmente pelas condições climáticas e a expansão da agroindústria
(CERQUEIRA, 2005). Nesta região as culturas de seringueira, cacaueiro e
pimenta-do-reino estão entre as mais relevantes. Contudo, todas elas são
hospedeiras de Phytophthora spp. A maioria dos isolados obtidos no estudo
foram oriundos de fazendas do município de Ituberá e Camamu, inclusive as
espécies de P. capsici obtidos de epífitas. O que revela a evidente ameaça
desse hospedeiro alternativo às culturas de importância econômica nesta
região, que sofrem com o ataque de P. capsici. Foi elucidado neste estudo uma
parte importante dos aspectos ecológicos e epidemiológicos das doenças
causadas por Phytophthora em seringueira.
Verifica-se, no entanto, a necessidade de novas inspeções, afim de
identificar outras possíveis fontes de inóculo de P. capsici nas culturas de
37
seringueira e cacaueiro, para direcionar estudos epidemiológicos e formas de
controle desse patógeno nestas culturas.
3.5 AGRADECIMENTOS
A Joel Feitosa, companheiro de viagem em coletas, pelo auxílio, apoio e
cuidado. A Cenilda da Silva Serra Rocha e Edarcy Primo pelos ensinamentos
e assessoramento nas tarefas de laboratório e identicação dos isolados. A
Ananias (Nani), Orlando (Orlandão), Valmir Araújo pelos constantes auxílios
nos trabalhos em campo e na casa de vegetação. A Carol Benjamin e Giselle
Rodrigues pela preciosa ajuda nas análises estatisticas. A José Renato do
escritório local da CEPLAC em Ituberá pela disponibilidade e importante apoio
durante as coletas realizadas para este estudo. A Professora Dra. Elizabeth
Duarte e toda sua equipe do laboratório de biologia molecular da Universidade
Federal do Recôncavo da Bahia. Á CAPES pela concessão da bolsa de estudo,
á Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira pela utilização dos
laboratórios do Centro de Pesquisa para realização deste trabalho.
38
3.6 REFERÊNCIAS
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45
4 CAPÍTULO 2
Vriesea procera (BROMELIACEAE) NOVO HOSPEDEIRO DE
Phytophthora tropicalis
RESUMO
Vriesea procera (Mart. Ex Schult. F) Wittm. é uma espécie epífita, da
Família Bromeliaceae, popularmente chamada de “gravatá” e facilmente
encontrada sobre plantas de seringueira no Sul da Bahia. Em coletas
realizadas em plantações de seringueira nos municípios de Camamu e Ituberá–
BA, foram encontradas e coletadas folhas de V. procera que apresentavam
algumas lesões na base, estando as plantas localizadas na copa de
seringueiras em produção. O patógeno foi isolado e as três culturas obtidas
foram caracterizadas morfologicamente, molecularmente e por meio de testes
de patogenicidade. As culturas apresentaram colônias do tipo rosacea (duas) e
estelar (uma), esporângios deiscentes do tipo limoniforme medindo 35,4-60,2 x
17,5-29,4 μm (média 47,4 X 23,9 μm), papilas com profundidade do poro apical
de 3,9 μm e largura do poro apical 7,1 μm, pedicelos longos 25-63 μm (média
32,2 μm), heterotálicos do tipo compatível A1. Os dados morfobiométricos
combinados com o sequenciamento das regiões ITS-28S e LSU 25-28S,
permitiram a identificação do isolado como Phytophthora tropicalis. Os isolados
46
causaram lesões nas folhas inoculadas de V. procera sendo delas re-isolado.
Este é o primeiro relato de P. tropicalis como patógeno de V. procera.
Palavras-chaves: epífitas, bromélias, hospedeiro alternativo.
47
4.1 INTRODUÇÃO
Vriesea procera (Mart. Ex Schult. F) Wittm. é uma planta da Família
Bromeliaceae, uma das mais representativas famílias da flora neotropical, que
abrange cerca de 56 gêneros e 3.086 espécies (PROENÇA e SAJO, 2007;
FAVRETTO et al., 2011). Popularmente chamada de “gravatá”, V. procera é
uma espécie herbácea, perene e de hábito epífito, ou seja, vive sobre outras
plantas, utilizando-as como apoio para conseguir maior luminosidade (ROCHA,
2002) (Figura 1a). Não é considerada uma espécie parasita, pois suas raízes
superficiais não absorvem a seiva da planta hospedeira, ou seja, a presença de
epífitas não prejudica a árvore ou arbusto onde elas vegetam.
Uma característica marcante das bromélias é a disposição de suas
folhas formando uma roseta, que permitem o acúmulo de água entre as
mesmas (fitotelmo), criando verdadeiros ecossistemas sobre a planta e
permitindo o abrigo e desenvolvimento de microrganismos e diversos
vertebrados e invertebrados. Entre os invertebrados presentes nas bromélias
muitos podem ser mosquitos (Diptera, Culicidae), incluindo vetores de doenças
como a dengue e a malária (VAREJÃO et al., 2005; FAVRETTO et al., 2011;
QUARESMA e JARDIM, 2013).
No Brasil podem ser encontradas em todas regiões, com maior
diversidade nas regiões da Mata Atlântica (ROCHA, 2002). Na seringueira
(Hevea brasiliensis (Wild. Ex. A. Juss.) Muell. Arg.) no Sul da Bahia ocorrem
muitas bromélias sobre seu tronco e ramos. Nesta região, mais precisamente
nos municípios de Camamu e Ituberá a espécie de bromélia mais comum sobre
seringueiras é V. procera (Figura 1b). Sabe-se que o cultivo da seringueira é
de suma importância econômica mundial, e que sofre com o ataque de várias
doenças, dentre estas as causadas por Phytophthora spp. (GASPARETTO,
1997; CERQUEIRA et al., 2011).
48
Em viagem aos municípios de Camamu e Ituberá– BA, afim de detectar
potenciais hospedeiros de P. capsici na cultura da seringueira, foram
encontradas e coletadas folhas de V. procera apresentando algumas lesões na
base das folhas. O objetivo deste estudo foi isolar, identificar e caracterizar o
patógeno encontrado infectando folhas de V. procera através de estudos
morfobiométricos, molecular e patológicos.
Figura 1. Vriesea procera (a) e plantas de V. procera sobre seringueira (b).
4.2 MATERIAL E MÉTODO
Folhas de bromélias (V. procera) coletadas nos municípios de Camamu
(Fazenda Cultrosa) e Ituberá-BA (Fazendas: Michelin Pantações e Morro Alto),
foram trazidas ao Laboratório de Phytophthora do Centro de Pesquisa do
Cacau (CEPEC), da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira
(CEPLAC). Fragmentos das folhas com lesões foram retirados passados por
a b
49
assepsia em álcool 70%, hipoclorito e água destilada esterilizada, e semeados
em placas de Petri contento meio seletivo PARPH (KANNWISCHER E
MITCHELL, 1978). As placas foram mantidas no escuro a uma temperatura de
22 ± 1 °C por quatro a cinco dias e posteriormente, discos das bordas das
colônias em meio seletivo foram tranferidos para placas de Petri contendo meio
cenoura-ágar (CA).
Após o crescimento dos isolados em CA e em meio cenoura líquido, sob
luz contínua e incubados a 25 °C durante 7 dias foi realizada a caracterização
morfológica das colônia observando: a forma das colônias; o tipo de micélio; a
presença de clamidósporos, esporângios e oósporos; comprimento, largura,
forma e caducidade dos esporângios e profundidade e largura da papila. E
foram medidos 50 esporângios por cada isolado.
Para a determinação dos tipos de compatibilidade dos isolados obtidos
das bromélias foram realizados o auto pareamento e o pareamento com os
isolados 1191 (A1 de P. palmivora ), 216 (A2 de P. palmivora), 1211 (A1 de P.
capsici) e 229 (A2 de P. capsici) da coleção de Phytophthora Arnaldo Medeiros
do CEPEC/CEPLAC, utilizando a técnica de sanduíche descrita por Luz e Silva
(2001). As placas contendo os sanduíches dos diferentes cruzamentos foram
incubadas no escuro, à temperatura ambiente (25 ± ° C). Após cinco dias do
pareamento, os discos de de meio CA colocados entre os discos de cultura dos
isolados testadores foram colocados em lâminas e examinados ao microscópio
para observar a formação de oósporos.
A identificação molecular do isolado foi realizada no laboratório de
biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. A
extração DNA genômico foi realizada a partir da cultura pura em placa
utilizando o kit UltraClean® Microbial DNA Isolation (MoBio, USA), seguindo as
recomendações do fabricante. A integridade e a quantidade do DNA foram
verificadas usando eletroforese em gel de agarose a 0,8% e o Qubit® 2.0
Fluorometer (Invitrogen), respectivamente.
As amplificações por PCR foram realizadas com os primers ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC) e ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) da
região ITS-28S (Internal Transcribed Spacers) do DNA ribossomal (WHITE,
1990). E também com os primers LROR (ACCCGCTGAACTTAAGC) e LR6
(CGCCAGACGAGCTTACC) da região LSU 25-28S (Large subunit RNA) do
50
RNA ribossomal (RIETHMULLER et al., 2002). As reações foram preparadas
com os seguintes reagentes e concentrações: 60 ng de DNA de cada amostra;
1x de tampão da enzima Taq DNA polimerase; 3,7 mM de MgCl2; 0,6 pmol/μL
de dNTPs; 0,4 pmol/μL de cada primer; 2,5 U de Taq DNA polimerase, com
volume final ajustado para 50 μL com água ultra pura. Os ciclos de
amplificações foram realizados no Veriti Thermal Cycler PCR (Appplied
Biosystems) sob as seguintes condições térmicas: 94 ºC por 2 minutos, 35
ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 48 e 53 (ITS e LSU, respectivamente) 56 ºC por 1
minuto, 72 ºC por 1 minuto e extensão final de 72 ºC por 10 minutos concluindo
com o resfriamento por 8 ºC. Os produtos amplificados foram visualizados em
gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados sobre luz
ultravioleta. Em seguida os amplicons foram purificados utilizando o kit Illustra®
GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences) para
posterior identificação nucleotídica utilizando o sequenciador automático ABI-
Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) da empresa ACTGene
Análises Moleculares LTDA. A edição e montagem das sequências foi
realizada com o programa Sequencher 4.1.4 (Gene Code Corporation). A
identidade taxonômica dos isolados foi estudada a partir do banco de dados
GenBank, utilizando o BLASTn “basic local alignment search tool” (BLAST) do
NCBI.
Folhas sadias de V. procera coletadas em Ituberá foram superficialmente
desinfestadas e inoculadas com os três isolados obtidos de gravatá (2638,
2674 e 2676) e dois isolados de seringueira (2690 e 1211). Oito folhas de V.
procera foram inoculadas com cada um dos isolados em dois pontos de
inoculação em cada folha, totalizando 16 pontos de inoculação. As folhas foram
arrumadas em caixas contendo espumas umidecidas com água destilada,
formando assim uma câmara-úmida e inoculadas com disco de cultura de 0,5
cm de diâmetro dos isolados cultivados em CA (LUZ et al., 2001). Os discos
foram cobertos com um chumaço de algodão embebido em água destilada
para manter a umidade. Três, cinco e sete dias após as inoculações foram
feitas as avaliações, observando o aparecimento ou não de lesões.
51
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As análises morfobiométricas dos isolados obtidos das bromélias
mostraram que as culturas apresentaram colônias do tipo rosacea (duas) e
estelar (uma) (Figura 2a e b), esporângios do tipo liminiforme medindo 47,4 X
23,9 μm (35,4-60,2 x 17,5-29,4 μm) papilas proeminentes com profundidade do
poro apical de 3,9 μm e largura do poro apical 7,1 μm, pedicelos com média
32,2 μm (25-63 μm) (Figura 2c). Não foram observados clamidósporos. O
comprimento do pedicelo é uma das características usadas por Aragaki e
Uchida (2001), para separar P. capsici de P. tropicalis, atribuindo a P. tropicalis
pedicelos com comprimento médio superior a 50 μm. Ocorreram para a espécie
isolada de V. procera alguns esporângios com pedicelos maiores que 50 μm,
no entanto, isto não ocorreu para os isolados de seringueira (ver capítulo 1).
Assim identificou-se morfologicamente os isolados como P. capsici.
Figura 2. A-B Colônias de P. capsici (a) rosacea, (b) estelar e esporângios
papilados e com pedicelos longos (c).
Todos os isolados de bromélias formaram oogônio, anterídios e
oósporos quando pareado com o isolado 229, de P. capsici, do tipo compatível
A2. Essas estruturas não foram observadas no auto-pareamento dos isolados e
nem nos pareamentos com os isolados do tipo compatível A1, comprovando-se
que os isolados obtidos das bromélias são heterotálicos do tipo compatível A1.
As folhas destacadas de bromélia, apresentaram lesões em ao menos
em um ponto de inoculação com cada isolado. Porém, as lesões
desenvolveram-se a partir do oitavo dia após as inoculações. Devido a isto
a b c
52
procedeu-se mais duas leituras no experimento, totalizando cinco leituras (a
primeira após três dias e as demais a cada dois dias). Nas últimas duas leituras
observou-se o aumento das lesões (área total lesionada variando entre 1,6-
18,86 cm2) e o isolado 2674 obtido de bromélia (coletado na fazenda Morro
Alto-Ituberá) foi o que causou maior lesões (Figura 3d).
A caracterização morfométrica permitiu classificar o isolado 2638 de V.
procera como P. capsici, no entanto, a analogia das sequências das regiões
ITS-28S e LSU 25-28S registrada no Genbank, para P. tropicalis, mostrou que
o isolado de V. procera correspondem a P. tropicalis (Tabela 1).
Figura 3. Lesões causadas por isolados de Phytophthora em folhas
destacadas de V. procena 11 dias após as inoculações: (a) com o isolado
2690 de P. capsici de seringueira; (b-d) com os isolados 2676, 2638 e 2674
obtidos de V. procena; (e-f) lesão causadas pelo isolado 1211, aos sete (e) e
aos 11 (f) dias após as inoculações.
a b
c d
e f
53
Tabela 1. Identificação molecular do isolado obtido de bromélia.
1Os amplicons foram sequenciados em ambas as orientações e os fragmentos
de consulta apresentados correspondem à sequência obtida. 2 “e-values " eram
iguais a zero para os isolados. 3Os números de acesso que correspondem às
sequências descritivas da taxonomia indicada na coluna anterior.
Um dos maiores problemas envolvendo o estudo das espécies
fitopatogênicas de Phytophthora spp. reside na sua taxonomia, devido à sua
extrema variabilidade inter e intraespecífica (CERQUEIRA et al., 1999). No
estudo taxonômico do gênero, são utilizados principalmente características
morfológicas e biométricas preconizadas pelas chaves de Waterhouse (1963),
Newhook et al. (1978) e Stamps et al. (1990). No entanto, as vezes tais
características tornam-se insuficientes para a separação das espécies e
também para estudos de diversidade genética, sendo necessário o uso de
marcadores genéticos adicionais como aqueles obtidos por eletroforese de
proteínas totais, isoenzimas, polimorfismos de DNA e RNA, análise de
cariótipo, serologia e antígenos (LUZ & MATSUOKA, 1996; FALEIRO et al.,
2004).
Uma nova chave combinando dados de morfologia e moleculares para
identificação de espécies de Phytophthora (GALLEGLY & HONG, 2008) visou
dirimir mais as dúvidas dos taxonomistas do gênero Phytophthora. Os autores
desta chave baseiam a descrição de P. capsici na original de Leonian (1922),
rejeitando a emenda de Tsao e Alizadeh (1988) que incluiam os isolados do
antigo grupo MF4 de P. palmivora e os de pimenta do reino (Piper nigrum L.),
que apresentam clamidósporos, como P. capsici. Gallegly e Hong (2008)
aceitaram portanto a prosposta de Aragaki e Uchida (2001), da descrição de P.
tropicalis para englobar os isolados acima mencionados. Deste modo, os
isolados de seringueira também estariam no táxon P. tropicalis, o que não foi
confirmado na pesquisa de Cerqueira (2005) que também questionou esta
Isolado Tamanho
(pb) 1
Cobertura
(%)
Identidade
(%) 2
Espécie
Fúngica
N° de acesso
GenBank3
2638 840 100 100 Phytophthora
tropicalis
GU564664.1;
LN846130.1;
FJ801320.1
54
identidade. Nos dois casos, as pesquisas foram realizadas tomando por base
de comparação o isolado de macadâmia, que é o isolado tipo de P. tropicalis.
Sendo assim, permanece a dúvida: são P. capsici ou P. tropicalis os isolados
de seringueira? São P. capsici e P. tropicalis espécies diferentes? Novos
sequenciamentos serão realizados com os isolados de seringueira obtidos
nesta pesquisa, para comparar com as sequências mais recentes do Genbank.
Diversas sequências tem sido depositadas como P. tropicalis, pós descrição
desta espécie (ORLIKOWSKI et al., 2006; DONAHOO e LAMOUR, 2008;
OLSON e BENSON, 2010; LUONGO et al., 2013). Gallegly e Hong (2008)
encontraram diferenças para os fingerprints das duas espécies em PCR-SSCP.
No entanto, Leonian (1922) descreve P. capsici como patógeno específico de
Capsicum annum L. e estes autores admitem ser ela uma espécie cosmopolita
e com ampla gama de hospedeiros, conforme citam Erwin e Ribeiro (1996).
A espécie P. capsici encontra-se amplamente distribuída no país,
podendo ser encontrada em todas as regiões geográficas (SANTOS et al.,
2014), sendo a segunda espécie em número de hospedeiros já identificados no
Brasil. Atualmente um imenso volume de trabalhos tem sido publicados
relacionados com o gênero Phytophthora, quer seja pela descoberta de novos
taxas e hospedeiros, além do reenquadramento de espécies já registradas
(SANTOS et al., 2014). Dessa forma, o uso das ferramentas moleculares para
a idenficação de Phytophthora spp. tem sido cada vez mais requerida.
Podendo ser utilizados os sequenciamentos da região ITS, da β-tubulina, do
fator de elongação e genes do DNA mitocondrial (COX I e II) (FALEIRO et al.,
2004; SANTOS et al., 2014).
Embora existam muitos trabalhos com bromélias relacionados
principalmente com o seu papel ecológico e ambiental, não existem estudos na
literatura relatando nenhuma espécie de Phytophthora associada a bromélias,
sendo este o primeiro relato de P. tropicalis/P. capsici como patógenos desta
espécie vegetal.
55
4.4 AGRADECIMENTOS
A Joel Feitosa, companheiro de viagem em coletas, pelo auxílio, apoio e
cuidado. A Cenilda da Silva Serra Rocha e Edarcy Primo pelos ensinamentos e
assessoramento nas tarefas de laboratório e identicação dos isolados. A
Ananias (Nani), Orlando (Orlandão), Valmir Araújo e Virgínio da Conceição
pelos constantes auxílios nos trabalhos em campo e na casa de vegetação. Á
CAPES pela concessão da bolsa de estudo, á Comissão Executiva do Plano da
Lavoura Cacaueira pela utilização dos laboratórios do Centro de Pesquisa para
realização deste trabalho. A Professora Dra. Elizabeth Duarte e toda sua equipe
do laboratório de biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da
Bahia. Ao pessoal do Hérbario CEPEC/CEPLAC pela identificação das
espécies vegetal.
4.5 REFERÊNCIAS
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Commonwealth Mycological Institute. Mycological Papers 92. 1963.
59
5 CAPÍTULO 3
PRIMEIRO RELATO DE Phytophthora tropicalis EM Ageratum conyzoides
NA BAHIA, BRASIL
RESUMO
Ageratum conyzoides L. (mentrasto) é uma planta pertencente à Família
Asteraceae amplamente utilizada na medicina tradicional no Brasil e em outros
países por suas propriedades farmacológicas. A espécie possui baixa
exigência em fertilidade, o que lhe confere boa adaptabilidade em diversas
condições ambientais, sendo por vezes considerada uma planta invasora e
podendo servir de hospedeiro alternativo de pragas e doenças. Foram
encontradas e coletadas algumas folhas de A. conyzoides no município de
Una-BA, apresentando sintomas semelhantes aos causados por Phytophthora,
como o escurecimento das nervuras, manchas clóroticas e algumas plantas
tombadas. Objetivou-se neste estudo identificar e caracterizar o patógeno
através do uso de métodos morfobiométricos, moleculares e teste de
patogenicidade. A cultura em cenoura-ágar é petalóide, com micélio aéreo
denso, esporângios caducos, uniformes, do tipo limoniforme e com base afilada
medindo em média 45,2 x 23,1 μm, papilas proeminentes com média 3,7 x 5,8
μm e pedicelos longos apresentando média 46,5 μm. A análise de
compatibilidade demonstrou que o isolado é do tipo compatível A1. O dados
morfobiométricos combinados com o sequenciamento das regiões ITS-28S e
60
LSU 25-28S, permitiram a identificação do isolado como P. tropicalis. No teste
de patogenicidade em plantas de mentrasto o isolado causou lesões
necróticas, escurecimento das nervuras foliares, requeima das folhas, além de
tombamento de algumas mudas. O patógeno foi re-isolado das mudas
inoculadas. Este é o primeiro relato na literatura de P. tropicalis como patógeno
de A. conyzoides.
Palavras-chaves: Asteraceae, planta medicinal, hospedeiro alternativo,
mentrasto.
61
5.1 INTRODUÇÃO
O mentrasto (Ageratum conyzoides L.) é uma planta pertencente à
Família Asteraceae, nativa da América tropical, desde o México até o Brasil. A
espécie apresenta plantas eretas, pilosas, aromáticas e de porte herbáceo,
atingindo aproximadamente um metro de altura. Possuem caules e folhas
cobertas com tricomas glandulares, flores variando nas cores lilás ao branco,
dispostas em inflorescências terminais e fruto do tipo aquênio com fácil
dispersão pelo vento (LORENZI & MATOS, 2002; OKUNADE, 2002). É
amplamente utilizado na medicina tradicional no Brasil e em outros países,
como anti-inflamatório, analgésico, digestivo, cicatrizante, antirreumático,
diurético, vasodilatador, febrífuga, expectorante e tônica, com aplicação
variando a depender da região (MING, 1999; MILLANI et al, 2010; NOUR et al.,
2010). Tais propriedades estão relacionadas a abundância de compostos
químicos, incluindo alcalóides, flavonóides, cromenos, benzofuranos e
terpenóides que conferem a espécie características farmacológicas. Apesar da
importância medicinal são escassos os investimentos e o interesse dos
produdores em cultiva-lo em escala comercial, sendo seu abastecimento no
mercado principalmente oriundo do extrativismo (MILLANI et al., 2010).
No Brasil, pode ser encontrado em quase todo o território, com pequena
frequência no sul e grande abundância na região Centro-Oeste (IKEDA et al.,
2008). Dependendo da região A. conyzoides pode apresentar nomes vulgares
distintos como: agerato, cacália-mentrasto, câmara-opela, catinga-de-barrão,
catinga-de-bode, celestina, celestina-azul, cúria, erva-de-Santa-Lúcia, erva-de-
São João, erva-de-São José, mentraço, mentrasto, mentraz, mentruz e picão-
roxo (MING, 1999).
62
Em virtude da sua baixa exigência em fertilidade, a espécie se adapta
em diversas condições ambientais e vegeta praticamente o ano todo, sendo
por vezes considerada uma planta daninha em cerca de 50 países e em
aproximadamente 40 culturas, podendo servir de hospedeiro alternativo de
pragas e doenças para as mesmas (IKEDA et al., 2008; MOMESSO et al.
2009). A. conyzoides é comumente encontrato ao redor das plantações de
seringueira e cacau no Sul da Bahia, sendo considerado nestas uma planta
espontânea e facilmente eliminada com o uso de herbicidas.
Em viagem ao município de Una – BA, afim de detectar potenciais
hospedeiros de P. capsici nestas culturas, foram encontradas e coletadas
folhas de plantas de mentrasto apresentando sintomas de escurecimento das
nervuras, manchas clóroticas e algumas plantas tombadas, sintomas similares
aos causados por espécies do gênero Phytophthora. O objetivo deste estudo
foi isolar, identificar e caracterizar o patógeno encontrado infectando as folhas
de mentrasto através de estudos morfobiométricos e moleculares.
5.2 MATERIAL E MÉTODO
Folhas de mentrasto coletados em Una, BA foram trazidas ao
Laboratório de Phytophthora do Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC), da
Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC). Fragmentos
da folhas com lesões foram retirados, superficialmente assepsiados em álcool
70%, hipoclorito e água destilada esterelizada, e semeados em placas de Petri
contento meio seletivo PARPH (KANNWISCHER E MITCHELL, 1978). As
placas foram mantidas no escuro a uma temperatura de 22 ± 1 °C por cinco
dias e posteriormente, discos das bordas das colônias em meio seletivo foram
tranferidos para placas de Petri contendo meio cenoura-ágar (CA) onde foram
cultivados por cinco a sete dias, sob luz constante para estimular a esporulação
nas culturas.
Após o crescimento do isolado em CA e também em meio cenoura
líquido, sob luz contínua e temperatura de 25 °C durante cinco a sete dias foi
realizada a caracterização morfológica do isolado, determinando-se a forma
das colônias, o tipo de micélio formado, presença ou ausência de
63
clamidósporos, esporângios e oósporos. Dos esporâgios determinou-se o
comprimento e largura, a forma, a caducidade e o comprimento do pedicelo,
medindo-se 50 esporângios.
O tipo de compatibilidade do isolado obtido de mentrasto foi determinado
pareando-o consigo mesmo e com os isolados 1191 (A1 de P. palmivora ), 216
(A2 de P. palmivora), 1211 (A1 de P. capsici) e 229 (A2 de P. capsici), todos da
coleção Arnaldo Medeiros do Cepec, utilizando a técnica de sanduíche descrita
por Luz e Silva (2001). As placas contendo os sanduíches dos diferentes
cruzamentos foram incubadas no escuro, à ± 24 °C. Após cinco dias do
pareamento os discos de CA colocados entre os discos de cultura dos isolados
testadores foram colocados em lâminas e examinados ao microscópio para
observar a formação de oósporos.
A identificação molecular do isolado foi realizada no laboratório de
biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. A
extração DNA genômico foi realizada a partir da cultura pura em placa
utilizando o kit UltraClean® Microbial DNA Isolation (MoBio, USA), seguindo as
recomendações do fabricante. A integridade e a quantidade do DNA foram
verificadas usando eletroforese em gel de agarose a 0,8% e o Qubit® 2.0
Fluorometer (Invitrogen), respectivamente.
As amplificações por PCR foram realizadas com os primers ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC) e ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) da
região ITS-28S (Internal Transcribed Spacers) do DNA ribossomal (WHITE,
1990). E também com os primers LROR (ACCCGCTGAACTTAAGC) e LR6
(CGCCAGACGAGCTTACC) da região LSU 25-28S (Large subunit RNA) do
RNA ribossomal (RIETHMULLER et al., 2002). As reações foram preparadas
com os seguintes reagentes e concentrações: 60 ng de DNA de cada amostra;
1x de tampão da enzima Taq DNA polimerase; 3,7 mM de MgCl2; 0,6 pmol/μL
de dNTPs; 0,4 pmol/μL de cada primer; 2,5 U de Taq DNA polimerase, com
volume final ajustado para 50 μL com água ultra pura. Os ciclos de
amplificações foram realizados no Veriti Thermal Cycler PCR (Appplied
Biosystems) sob as seguintes condições térmicas: 94 ºC por 2 minutos, 35
ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 48 e 53 (ITS e LSU, respectivamente) 56 ºC por 1
minuto, 72 ºC por 1 minuto e extensão final de 72 ºC por 10 minutos concluindo
com o resfriamento por 8 ºC. Os produtos amplificados foram visualizados em
64
gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados sobre luz
ultravioleta. Em seguida os amplicons foram purificados utilizando o kit Illustra®
GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences) para
posterior identificação nucleotídica utilizando o sequenciador automático ABI-
Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) da empresa ACTGene
Análises Moleculares LTDA. A edição e montagem das sequências foi
realizada com o programa Sequencher 4.1.4 (Gene Code Corporation). A
identidade taxonômica dos isolados foi estudada a partir do banco de dados
GenBank, utilizando o BLASTn “basic local alignment search tool” (BLAST) do
NCBI.
Além do isolado obtido do mentrasto, dois outros isolados obtidos de
seringueira (1211 e 2699) ambos classificados como P. capsici foram usados,
para a realização dos teste de patogenicidade. Suspensões de zoósporos
foram preparadas apartir de culturas em CA dos isolados com 10 dias de idade.
Seguindo o procedimento descrito por Luz et al. (2008), as suspensões foram
ajustadas para a concentração 3x105 zoósporos/ml. Após o cultivo em sacos
de polietileno contendo solo esterelizado e sob regime de irrigação por 20 dias,
as plantas de mentrasto foram pulverizadas com a suspensão de inóculo dos
três isolados (10 plantas para cada isolado) e cobertas com sacos de
polietileno umidecidos (Figura 1b), e mantidas em casa de vegetação por sete
dias, á temperatura ambiente e regadas diariamente.
Figura 1. Mudas de mentrasto cultivadas em casa de vegetação (a) e mudas
em câmara úmida (b).
Foram utilizados como controle igual número de mudas, pulverizadas
apenas com água destilada estéril. O experimento foi montado em
a b
65
delineamento inteiramente casualizado com quatro tratamentos (três inóculos +
testemunha) e 10 repetições. A avaliação consistiu em observar o
aparecimento de lesões ou a morte de plantas no decorrer de sete dias.
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O isolado obtido do mentrasto apresentou colônias do tipo petalóide,
com micélio aéreo denso, esporângios caducos, uniformes, do tipo limoniforme
e com base afilada medindo 45,2 x 23,1 μm (32-56 x 16-26 μm); papilas com
profundidade do poro apical de 3,7 μm e largura do poro apical de 5,8 μm e
pedicelos entre 46,5 μm (30-76 μm). Não foram observados clamidósporos.
O isolado de mentrasto formou oogônio, anterídios e oósporos quando
pareado com o isolado 229, de P. capsici, do tipo compatível A2. Essas
estruturas não foram observada no auto-pareamento do isolado e nem nos
pareamentos com o isolados do tipo compatível A1. Comprovando que o
isolado obtido do mentrasto é heterotálico do tipo compatível A1. Os oogônios
são esféricos, os anterídios anfígenos e os oósporos pleróticos.
A caracterização morfométrica permitiu a classificação do isolado 2652
de mentrasto como P. tropicalis, o que foi confirmado molecularmente através
de analogia com as sequências das regiões ITS-28S e LSU 25-28S e
registrada no Genbank, conforme a tabela 1.
Tabela 1. Identificação molecular do isolados obtido de Ageratum conyzoides.
1Os amplicons foram sequenciados em ambas as orientações e os fragmentos de
consulta apresentados correspondem à sequência obtida. 2 “e-values " eram iguais a
zero para os isolados. 3Os números de acesso que correspondem às sequências
descritivas da taxonomia indicada na coluna anterior.
Isolado Tamanho
(pb) 1
Cobertura
(%)
Identidade
(%) 2
Espécie
Fúngica
N° de acesso
GenBank3
2652 840 100 100 Phytophthora
tropicalis
FJ849839.1;
KT250631.1;
GU564664.1
66
Sete dias após a inoculação, as mudas de mentrasto começaram a
apresentar lesões típicas de Phytophthora, como escurecimento das nervuras
foliares, requeima das folhas e tombamento de algumas mudas (Figura 2).
Todos os isolados demostraram patogenicidade ao mentrasto. As mudas
controle não apresentaram lesões. Os patógenos foram re-isolados das folhas
com lesões em meio seletivo para completar os postulados de Koch.
Fontem et al. (2004), identificaram cinco espécies de Asteraceae como
hospedeiras de P. infestans em cultivo de batata (Solanum tuberosum L.) no
Camarões, sendo A. conyzoides uma das cinco espécies consideradas como
hospedeira de P. infestans o agente causal da requeima da batata. Esta foi a
única referência encontrada na literatura sobre a ocorrência de Phytophthora
nesta espécie.
Os resultados do teste de patogenicidade do presente estudo,
confirmam que P. tropicalis é o agente causal da requeima e morte de plantas
de A. conyzoides. Dessa forma, identificou-se A. conyzoides como mais um
hospedeiro de P. tropicalis na região, sendo este o primeiro relato para ciência,
de P. tropicalis como patógeno de A. conyzoides.
c
Figura 2. Mudas de mentrastro 7 dias após a inoculação, com sinais típicos de
Phytophthora: escurecimento das nervuras foliares (a); requeima (b);
tombamento e morte de mudas (c).
b a
67
5.4 AGRADECIMENTOS
A Joel Feitosa, companheiro de viagem em coletas, pelo auxílio, apoio e
cuidado. A Cenilda da Silva Serra Rocha e Edarcy Primo pelos ensinamentos e
assessoramento nas tarefas de laboratório e identicação dos isolados. A
Ananias (Nani), Orlando (Orlandão), Valmir Araújo e Virgínio da Conceição
pelos constantes auxílios nos trabalhos em campo e na casa de vegetação. Á
CAPES pela concessão da bolsa de estudo, á Comissão Executiva do Plano da
Lavoura Cacaueira pela utilização dos laboratórios do Centro de Pesquisa para
realização deste trabalho. A Professora Dra. Elizabeth Duarte e toda sua equipe
do laboratório de biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da
Bahia. Ao pessoal do Hérbario CEPEC/CEPLAC pela identificação das
espécies vegetal
5.5 REFERÊNCIAS
IKEDA, F.S.; CARMONA, R.; MITJA, D.; GUIMARÃES, R.M. Luz e KNO3
na
germinação de sementes de Ageratum conyzoides L. sob temperaturas
constantes e alternadas. Revista Brasileira de Sementes, vol. 30, nº 2, p.193-
199, 2008.
KANNWISCHER, M.E. & MITCHELL, D.J. The influence of a fungicide on the
epidemiology of black shank of tobacco. Phytopathology, v. 68, p. 1760-1765,
1978.
LORENZI, H.E.; MATOS, F.J. A. Plantas medicinais no Brasil/ Nativas e
exóticas. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 512p. 2002.
LUZ, E.D.M.N. e SILVA, S.D.V.M. Podridão-parda dos frutos, cancro e outras
doenças causadas por Phytophthora no cacaueiro. In: Doenças causadas por
Phytophthora no Brasil. (Ed.) Luz, E.D.M.N, Santos, A.F., Matsuoka, K. E
Bezerra, J.L. Livraria Rural, Campinas. P. 175-265, 2001.
68
LUZ, E.D.M.N.; SILVA, S.D.V.M.; BEZERA, J.L.; SOUZA, J.T.; SANTOS, A.F.
Glossário ilustrado de Phytophthora: Técnicas especiais para o estudo de
oomicetos, 204p. Itabuna, 2008.
MILLANI, A.A. e ROSSATTO, D.R.; RUBIN FILHO, C.J.; KOLB, R.M. Análise
de crescimento e anatomia foliar da planta medicinal Ageratum conyzoides L.
(Asteraceae) cultivada em diferentes substratos. Revista Brasileira de
Plantas Medicinais, Botucatu, v.12, n.2, p.127-134, 2010.
MING, L.C. Ageratum conyzoides: A Tropical Source of Medicinal and
Agricultural Products. In: Perspectives on new crops and new uses. (Ed.)
Janick, J. Alexandria: ASHS Press. p. 469-473. 1999.
MOMESSO, L.S.; MOURA, R.M.X.; CONSTANTINO, D.H.J. Atividade
antitumoral do Ageratum conyzoides L. (Asteraceae). Revista Brasileira de
Farmacognosia, v. 19, n. 3, p. 660-663, Jul./Set. 2009.
NOUR, A.M.M. et al. The antiprotozoal activity of methylated flavonoids from
Ageratum conyzoides L. Journal of Ethnopharmacology, v. 129, p. 127–130,
2010.
OKUNADE, A.L. Ageratum conyzoides L. (Asteraceae). Fitoterapia, v. 73, p.
1-16, 2002.
RIETHMULLER, A. et al. Phylogenetic relationships of the downy mildews
(Peronosporales) and related groups based on nuclear large subunit ribosomal
DNA sequences. Mycologia, v. 94, n. 5, p. 834-849, 2002.
69
6 CAPÍTULO 4
OOMCETOS DO GÊNERO Pythium E Phytopythium DA RIZOSFERA DE
PLANTAS EM CONSÓRCIO DE SERINGUEIRA E CACAUEIRO NO BRASIL.
RESUMO
O Filo Oomycota abriga em maioria, espécies sapróbias de ambientes
naturais, mas dentro deste filo muitas espécies são consideradas patogênicas
à plantas. Destacam-se principalmente as espécies das Famílias
Peronosporaceae e Pythiaceae, onde são encontrado os gêneros
Phytophthora, Phytopythium e Pythium. O objetivo deste estudo foi verificar a
ocorrência de espécies de Oomycota em solo cultivado com cacaueiro e
serigueira. Foram realizadas coletas de amostra de solo em fazendas com as
duas culturas consórciadas, situadas nos munícipios de Ituberá, Camamu,
Uruçuca e de Una, localizados no Sul da Bahia, Brasil. Os dados
morfobiométricos combinados com sequências das regiões ITS-28S e LSU 25-
28S do DNA ribossomal permitiram identificar quatro táxons diferentes nestes
locais: Phytopythium cucurbitacearum, Phytopythium vexans, Pythium
acanthophoron e Pythium splendens. As espécies de Phytopythium
predominaram, sendo isoladas de seis das 11 fazendas visitadas. O município
de Ituberá teve o maior número de fazendas amostradas, sendo portanto, onde
encontrou-se a maioria dos isolados. Foram obtidos 12 isolados, sendo: oito de
Phytopythium vexans; um de Phytopythium cucurbitacearum; dois de Pythium
splendens e um de Pythium acanthophoron. Os isolados de Phytopythium
70
foram inoculados em frutos de cacau e folhas de seringueira, mas não se
comprovou a sua patogenicidade a esses órgãos das plantas, pois não houve
infecção. É relatada pela primeira vez a ocorrência de Phytopythium vexans,
Phytopythium cucurbitacearum, Pythium acanthophoron e Pythium splendens
no Sul da Bahia e também para o Brasil de P. acanthophoron e Phytopythium
cucurbitacearum. Todos os quatros são relatados pela primeira vez em solos
de seringueira e cacaueiro.
Palavras-chaves: Oomycota, Phytopythium spp., Pythium spp., rizosfera,
Theobroma cacao, Hevea brasiliensis.
71
6.1 INTRODUÇÃO
O Filo Oomycota pertencente ao Reino Straminipila, engloba organismos
com características semelhantes aos fungos verdadeiros e por isso, as vezes
denominados “pseudo fungos”. Entre as características similares estão a forma
de nutrição, zoósporos flagelados, parede celular composta de quitina,
presença de hifas, formação de estruturas de resistências e ocupação dos
mesmos ninchos ecológicos (NEAHAUSER et al., 2012; MARANTO et al.,
2014; BEAKES et al., 2014). Baseado em sequências moleculares e
analizando simultaneamente a biologia e a história evolutiva do Reino
Straminipila, Beakes et al. (2014) dividiram recentemente o Filo Oomycota em
três Classes: Peronosporomycetes, Saprolegniomycetes e outra considerada
Incertae sedis. Dentro da classe Peronosporomycetes, se encontram as
famílias Peronosporaceae e Pythiaceae, a primeira com representantes dos
gêneros Phytophthora e Phytopythium e a segunda com as espécies de
Pythium (BEAKES et al., 2014).
Os oomicetos patogênicos às plantas e animais são os mais conhecidos
e estudados (BEAKES et al., 2012), no entanto, representantes do grupo estão
presentes como sapróbios ou parasitas tanto em ecossistemas aquáticos como
terrestres. No Brasil, a presença de oomicetos em áreas de manguezal, onde
atuam, juntamente com bactérias e outros fungos, como importantes
decompositores de substratos foliares (NAKAGIRI et al., 1989), tem sido
estudada no estado de São Paulo, onde, das 195 espécies de oomicetos já
assinaladas no Brasil (MAIA et al., 2015) 66% foram registros ocorridos no
estado de São Paulo, e grande parte deles provenientes de estudos em
reservas de manguezais da Mata Atlântica paulista (MILANEZ et al., 1994,
72
1996, 2003; PIRES-ZOTTARELLI et al., 1995, 1996 a, b; GOMES & PIRES-
ZOTTARELLI, 2006; PIRES-ZOTTARELLI & ROCHA, 2007; MIRANDA &
PIRES-ZOTTARELLI, 2008; JESUS et al., 2013; JESUS, 2015).
Nenhum estudo sobre a presença de outros oomicetos, além do gênero
Phytophthora, havia sido feito até então em solos da região Sul da Bahia e em
áreas consorciadas com cacaueiro e seringueira, embora sempre sejam
encontrados esses organismos concorrendo com Phytophthora nas
amostragens de solo.
Neste estudo, diversos oomicetes, não confirmados como Phytophthora,
foram isolados de solo da rizosfera de plantas de cacaueiro e seringueira no
polo heveícola do Sul da Bahia. São apresentados alguns dos que foram
identificados através de sequenciamento das regiões ITS-28S e LSU 25-28S
do DNA ribossomal. Foram realizadas coletas de amostras de solo em
fazendas produtoras de cacau (Theobroma cacao L.) e serigueira [Hevea
brasiliensis (Wild. Ex. A. Juss.) Muell. Arg.], situadas nos munícipios de Ituberá,
Camamu, Uruçuca e de Una, localizados no Sul da Bahia, Brasil.
6.2 MATERIAL E MÉTODO
6.2.1 Área de estudo
As coletas do material para estudo foram realizadas em 11 fazendas
produtoras de cacau e seringueira em consórcios no Sul da Bahia: Faz. Lagoa
Santa, Faz. Michelin Plantações, Faz. Morro Alto, Faz. Ondula, Faz. Revolta,
Faz. Santo Antônio situadas no município de Ituberá; Faz. Cultrosa município
de Camamu; Faz. Porto Seguro município de Uruçuca; Faz. Bolandeira,
Estação EDJAB e Faz. Ghislaine Esmeralda localizadas no município de Una.
6.2.2 Coletas de amostras
As amostras do solo foram coletadas na rizosfera de plantas de T. cacao
e H. brasiliensis, nas 11 fazendas do Sul da Bahia, totalizando 22 amostras
(duas espécies x 11 áreas). O solo rizosférico foi coletado no horizonte A (0 –
73
20 cm) homogeneizado em amostra composta a partir de quatro pontos
cardeais distando 1 m do caule. Em seguida as amostras foram armazenadas e
transportadas sob refrigeração para o Laboratório de Phytophthora do
CEPEC/CEPLAC.
6.2.3 Isolamento e quantificação de propágulos de espécies Oomycota do
solo
Para o isolamento dos Oomycota utilizou-se a técnica de plaqueamento
de solo em meio seletivo (LUZ et al., 2008) que consistiu em pesar alícotas de
10 g de cada amostra de solo e dilui-las em 90 mL de ágar-água a 0,25%. Uma
vez homogeneizada, foi retirado da suspensão de cada amostra composta,
uma alíquota de 1 mL e espalhada na superfície de cada uma das 10 placas
contendo meio seletivo PARPH (KANNWISCHER e MITCHELL, 1978), e em
seguida incubadas no escuro. Após 48h foi realizada a lavagem em água
corrente para retirar o solo, observando o meio de cultura para localização das
colônias que mais se assemelhavam às de espécies de Oomycota. (LUZ et al.,
2008). Os isolados obtidos foram cultivados em meio seletivo e posteriormente
em meio cenoura ágar (CA) para análise morfobiométrica. Em seguida os
isolados foram tranferidos para frascos de Penicilina contendo batata-dextrose-
ágar (BDA) e para frascos contendo água estéril e foram depositados na
coleção de Phytophthora Arnaldo Medeiros do Centro de Pesquisa do Cacau
(CEPEC).
6.2.4 Caracterização morfobiométrica dos isolados
Após o crescimento dos isolados em placas de Petri com meio CA sob
luz contínua e incubado a 25 °C durante sete dias, foram avaliadas a
morfologia das colônias, o tipo de micélio formado, a forma dos esporângios,
oósporos e clamidósporos quando presentes. Foram medidos 50 esporângios,
oósporos e clamidósporos usando-se uma escala ocular de 100x (Carl Zeiss
Inc., Germany) para aferição do comprimento e largura das estruturas.
74
6.2.5 Estudos moleculares
As etapas de identificação molecular dos isolados foram realizadas no
laboratório de biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da
Bahia. A extração do DNA genômico foi realizada a partir da cultura pura em
placa utilizando o kit UltraClean® Microbial DNA Isolation (MoBio, USA),
seguindo as recomendações do fabricante. A integridade e a quantidade do
DNA foram verificadas usando eletroforese em gel de agarose a 0,8% e o
Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen), respectivamente.
As amplificações por PCR foram realizadas com os primers ITS4
(TCCTCCGCTTATTGATATGC) e ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) da
região ITS-28S (Internal Transcribed Spacers) do DNA ribossomal (WHITE,
1990). E também com os primers LROR (ACCCGCTGAACTTAAGC) e LR6
(CGCCAGACGAGCTTACC) da região LSU 25-28S (Large subunit RNA) do
RNA ribossomal (RIETHMULLER et al., 2002). As reações foram preparadas
com os seguintes reagentes e concentrações: 60 ng de DNA de cada amostra;
1x de tampão da enzima Taq DNA polimerase; 3,7 mM de MgCl2; 0,6 pmol/μL
de dNTPs; 0,4 pmol/μL de cada primer; 2,5 U de Taq DNA polimerase, com
volume final ajustado para 50 μL com água ultra pura. Os ciclos de
amplificações foram realizados no Veriti Thermal Cycler PCR (Appplied
Biosystems) sob as seguintes condições térmicas: 94 ºC por 2 minutos, 35
ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 48 e 53 (ITS e LSU, respectivamente)56 ºC por 1
minuto, 72 ºC por 1 minuto e extensão final de 72 ºC por 10 minutos concluindo
com o resfriamento por 8 ºC. Os produtos amplificados foram visualizados em
gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e visualizados sobre luz
ultravioleta. Em seguida os amplicons foram purificados utilizando o kit Illustra®
GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences) para
posterior identificação nucleotídica utilizando o sequenciador automático ABI-
Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) da empresa ACTGene
Análises Moleculares LTDA. A edição e montagem das sequências foi
realizada com o programa Sequencher 4.1.4 (Gene Code Corporation). A
identidade taxonômica dos isolados foi estudada a partir do do banco de dados
75
GenBank, utilizando o BLASTn “basic local alignment search tool” (BLAST) do
NCBI.
6.2.6 Teste de patogenicidade dos isolados em cacau e em seringueira
Para os testes de patogenicidade foram escolhidos os isolados 2642,
2646, 2648, 2649, 2654 e 2659 representando cada um dos município de onde
os isolados foram obtidos (Tabela 1). Discos de colônias 0,5 cm de diâmetro,
foram inoculados em folhas destacadas de seringueira (sendo três folhas, cada
folha com três folíolos, dois pontos de inoculação por folíolo e um total de 18
pontos de inoculação para cada isolado) e em frutos de cacau (quatro frutos x
dois pontos de inoculação = 8 pontos de inoculação para cada isolado). Os
inóculos foram cobertos com um chumaço de algodão embebido em água
destilada para manter a umidade. Após as inoculação as folhas e os frutos
foram colocados em câmara-úmida formada por sacos plásticos borrifados com
água destiladas (LUZ et al., 2001). A avaliação consistiu em observar a
existência de lesões após três, cinco e sete dias ulteriores as inoculções.
Tabela 1. Números dos isolados de oomicetos obtidos da rizosfera de plantas
de cacaueiro e seringueira, por local de coleta, utilizados para a inoculação em
folhas seringueira e frutos de cacaueiro.
*número de registro na coleção de Phytophthora Arnaldo Medeiros CEPEC/CEPLAC.
REGISTRO* LOCAL
2641 Estação EDJAB- Una
2646 Faz. Revolta-Ituberá
2648 Faz. Bolandeira-Una
2649 Faz. Ondulada-Ituberá
2654 Faz. Morro Alto-Ituberá
2659 Faz. Lagoa Santa-Ituberá
76
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram obtidos 43 isolados da rizosfera das duas espécies vegetais
estudadas. Foram encontrados isolados de outros Oomycota em todos os
locais de coleta, exceto nas Fazendas Santo Antônio (Ituberá) e Ghislaine
Esmeralda (Una). A maioria dos isolados encontrados foram oriundos de
Ituberá (Tabela 2). Tal resultado pode ser explicado pelo fato do município ter
concentrado o maior número de fazendas visitadas, e consequentemente o
maior número de coletas. Ressalta-se a fazenda Ondulada em Ituberá, de onde
foram obtidos 12 isolados, em seguida a fazenda Cultrosa em Camamu com
sete isolados.
Tabela 2. Número de isolados de oomicetos obtidos do solo por fazenda e
município de coleta.
MUNICÍPIO LOCAL N° de ISOLADOS
Camamu Faz. Cultrosa 7
Uruçuca Faz. Porto Seguro 6
Una
Faz. Bolandeira 4
Faz. EDJAB 2 Faz. Ghislaine Esmeralda -
Ituberá
Faz. Lagoa Santa 4
Faz. Michelin Plantações 2
Faz. Moro Alto 5
Faz. Ondulada 12
Faz. Revolta 1
Faz. Santo Antônio - *-Não foram encontrados.
Os isolados de 2654, 2641, 2648, 2659, 2649, 2561, 2582 e 2540 foram
bastantes similares morfometricamente, mas com algumas variações,
principalmente, na forma dos esporângios (Tabela 3). De forma geral este
grupo de isolados apresentou: colônias do tipo rosacea; esporângios semi-
papilados de formas variáveis, na maioria limoniforme, piriforme e alguns
globosos, medindo 16,8-25,6 x 10,2-16 μm (média 22,8 x 12,5 μm); oogônios
globosos, medindo 4,6-19 μm de diâmetro (média 17,5 μm); a maioria
apresentaram anterídios paráginos e alguns anfígenos medindo entre 4,5-5,2 x
77
8-10,6 μm; clamidósporos terminais e alguns intercalares com diâmetro
variando entre 16,7-25,4 μm (média 21μm). Também observou-se o
crescimento da papila (Figura 1c), que possivelmente estaria formando uma
vesícula de descarga de zoósporos, sendo esta uma característica de
Phytopythium sp. comum com as éspecies de Phythium (DE COCK et al.,
2015).
Figura 1. Isolado 2659: Esporângios limoniformes, papilados(a); Oogônios
com anterídios paráginos (b-1) e Clamidósporos terminais (b-2); Esporângio
evidenciando a expansão da papila (c).
O isolado de (2646) apresentou colônias do tipo rosacea; esporângios
semi-papilados de formas variáveis, do tipo piriforme, com média 21,7 x 10,2
μm; oogônios globosos, medindo 17,5 μm de diâmetro; anterídios anfígenos;
clamidósporos terminais e com diâmetro médio de 21μm (Tabela 3).
Para os isolados de 2657, 2647 e 2658 não foram observados
esporângios. Observou-se apenas a presença de clamidósporos terminais,
para os isolados de Pythium, sendo 25,6-42,5 μm de diâmetro (média 31,8 μm)
para os isolados 25762 e 25768, e 30-48,5 μm de diâmetro (média 32,5 μm)
para o isolado 25611 (Tabela 4).
a
c
b
15 μm
20 μm 15 μm
1 1
2
78
Tabela 3. Características morfobiométricas dos isolados de Phytopythium obtidos do solo da rizosfera de cacaueiro e seringueira,
quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar.
ISOLADO LOCAL¹ TIPO DE
ANTERÌDIO
TIPO DE
CLAM.
TIPO DE
ESPOR.
OOGÔNIO
(μm)
ANTERÍDIO
(μm)
CLAM.
(μm)
ESPORÂNGIO
(μm)
Comp. X Larg.
2654 2 Anfígeno TERM. PIRIFORME 15, ±0,82 - 19,1±2,0 21,9 ± 3,2 X 11,2± 2,6
2648 6 Parágino - - 18,3 ± 0,9 - - -
2653 2 Parágino TERM. LIMONIFORME 17,7 ± 1,8 - 19,7±3,0 21,0± 3,3 x 12,3 ± 2,6
25822 4 Parágino - GLOBOSO 16,4 ±0,8 - - 16,8 ± 1,9
2641 5 Anfígeno TERM. LIMONIFORME 17,5 ± 1,0 4,5±0,5 X 8,0 ± 1,1 20,4±1,6 27,2± 2,7 X 16,0 ± 1,4
2659 2 Parágino TERM. PIRIFORME 17,8 ± 0,9 - 19,8 ± 1,8 25,2 ± 6,3 X 12,1 ±4,2
2649 1 Anfígeno TERM./INT. PIRIFORME 17,5 ±0,5 5,2±0,7 X 10,5±0,5 16,7±2,2 22,4± 2,9 X 12,5 ± 1,2
2646 3 Anfígeno TERM. PIRIFORME 17,7±0,9 - 19,8±1,5 21,7 ± 2,3 X 10,2± 2,6
2657 4 Parágino TERM. PIRIFORME 17,7 ± 1,1 - 18,1±2,2 21,9 ± 3,2 X 15,2± 1,4
¹LOCAL (Fazendas): 1(Ondulada-Ituberá); 2(Moro Alto-Ituberá); 3(Revolta-Itubera); 4(Cultrosa-Camamu); 5(EDJAB-Una); 6(Bolandeira-Una).
79
Tabela 4. Características morfobiométricas dos isolados de Pythium obtidos do
solo da rizosfera de cacaueiro e seringueira, quando cultivados por sete dias
em meio cenoura-ágar.
ISOLADO LOCAL¹ CLAMIDÓSPORO
(μm)
TIPO DE
CLAMIDÓSPORO
25762 1 31,4 ±3,4 Terminal
25768 1 31,6 ± 3,1 Terminal
25611 2 32,4 ± 5,6 Terminal ¹LOCAL (Fazendas): 1(Ondulada-Ituberá) e 2(Bolandeira-Una).
Sete dias após as inoculações com os isolados de Phytopythium não foi
observado o aparecimento de lesões nem nos frutos de cacau e nem nas
folhas de seringueira. Isso mostra que a presença destes isolados não
representa um risco para ambas as culturas, pois não foram patogênicos às
duas culturas. Segundo De Cock et al. (2015), a maioria das espécies de
Phytopythium são sapróbios de ambientes naturais (água e solo), mas algumas
são patógenos de plantas, como P. helicoides e P. vexans, que já foram
relatadas causando podridão da raiz e podridão do colmo de plantas de kiwi
(BATEN, 2015), e P. cucurbitacearum causando amarelecimento de folhas e
gavinhas de pimenta do reino (PETCHAYO et al., 2015), evidenciando sua
importância agrícola.
O estudo molecular foi realizado em apenas 12 isolados, que são os que
estão sendo apresentados no trabalho. Os demais isolados serão também
sequênciados para posterior confirmação. A análise das sequências obtidas
para as regiões ITS-28S LSU 25-28S do DNA ribossômico (rDNA),
confirmaram a identificação de três isolados de Pythium spp. e nove isolados
de Phytopythium spp. As sequências foram depositadas no GenBank (Tabela
5). Entre os isolados foram confirmadas as seguintes espécies: Phytopythium
cucurbitacearum, Phytopythium vexans, Pythium acanthophoron e Pythium
splendens.
O gênero Phytopythium foi descrito recentemente por Bala et al. (2010),
com a espécie tipo Phytopythium sindhum A.M. Lodhi, Shahzad & Lévesque, e
conta atualmente com 22 espécies registradas no Index Fugorum (2016). A
descoberta desse gênero ocorreu após estudos filogenéticos baseados em
análises moleculares que destinguiu o táxon anteriormente classificado como
80
pertencente ao clado k do gênero Pythium (LÉVESQUE & DE COCK, 2004),
como um novo gênero com características combinadas dos gêneros Pythium e
Phytophthora, daí o nome dado por Bala et al. (2010) ao gênero em questão.
No entanto, estudos filogenéticos posteriores mais detalhados (PALMUCCI,
2011; MARANO, 2014; DE COCK et al., 2015) levaram a retirada do clado K do
gênero Pythium por conter espécies que eram filogeneticamente distintas dele.
As pesquisas de De Cock et al. (2015) deram nova luz ao assunto,
considerando o sequênciamento das regiões LSU rRNA (28S), SSU rRNA
(18S) e DNA mitocondrial citocromo oxidase1 (COI), para estabelecer quais
espécies pertenciam ao clade K, e fazendo 14 novas combinações
taxonômicas para estas espécies, além da descrição de uma nova espécie
Phytopythium mirpurense Lodhi, De Cock, Lévesque & Shahzad, sp. nov.
As principais características morfológicas comuns a Phytopythium são:
esporângios ovóides a globosos com papilas exceto para P. vexans,
proliferação interna semelhante a Phytophthora e modo de descarga de
zoósporos semelhante ao Pythium, formando um tubo de descarga com uma
vesícula na ponta; oogônios grandes e lisos, oósporos de paredes espessas e
anterídio parágino com células ligadas lateralmente ao oogônio (BATEN, 2015;
DE COCK et al., 2015). Outra característica marcante do gênero segundo
Lévesque & De Cock (2004) é o crescimento preferencial em temperaturas
elevadas entre 30-40°C, quando poucos oomicotas suportam temperaturas
próximas a 40 °C.
Foram encontradas neste trabalho, em solo na Bahia, as espécies
Phytopythium vexans e P. cucurbitacearum. P. vexans, anteriormente descritas
como Pythium vexans por de Bary (1896), e assinalado no Brasil pela primeira
vez por Carvalho (1965) causando podridão radicular de Strelitzia sp. na região
Canavieira de São Paulo. Recentemente já como Phytopythium vexans foi
isolado de folhas de Laguncularia racemosa em manguezal no Parque
Estadual da Ilha do Cardoso em São Paulo por Jesus (2015).
Estudos recentes de Petchayo et al. (2015), relatam P. cucurbitacearum
como patógeno responsável pelo amarelecimento das folhas e gavinhas de
pimenta do reino em Camarões. Segundo o autor, apesar dos sintomas
causados por P. cucurbitacearum serem semelhantes aos de Phytophthora
capsici, o isolado obtido era homotálico como evidenciado pela presença de
81
oósporos, descartando portanto, a hipótese do isolado ser P. capsici, que é
uma espécie heterotálica (LEONIAN, 1922).
O gênero Pythium, foi descrito por Nees em 1823, e atualmente conta
com 308 espécies (INDEX FUNGORUM, 2016), sendo a maioria patogênica a
plantas, outras são parasitas de animais e algumas micoparasitas, como é o
caso de P. acanthophoron que é um micoparasita de outras espécies de
Pythium e também de algumas espécies de Fusarium, com potêncial para o
uso como agente de controle biológico (LODHA & WEBSTER, 1990;
JONES & DEACON, 1995). Entre as espécies fitopatogênicas encontra-se P.
splendens, responsável por causar podridões radicular e do colo em plantas de
Eucalyptus grandis W. Hill ex Maiden, Elaeis guineensis Jacq, Averrhoa
carambola L. (carambola) e Peperomia orba Bunt (ADERUNGBOYE &
ESURUOSO, 1976; KIDNEY, 1979; PLOETZ , 2004).
Estes quatros táxons foram encontrados em 12 dos 43 isolados obtidos
na rizosfera de cacaueiro e seringueira. Espera-se que ao concluir os estudos
morfobiométricos e moleculares dos demais isolados, novos taxa sejam
encontrados. Este é o primeiro registro dos quatro táxons para a Bahia e de
Phytopythium cucurbitacarum e Pythium acanthophoron para o Brasil e de
todos eles para na rizosfera de plantas de cacaueiro e seringueira
consorciadas.
6.4 AGRADECIMENTOS
A Joel Feitosa, companheiro de viagem em coletas, pelo auxílio, apoio e
cuidado. A Cenilda da Silva Serra Rocha e Edarcy Primo pelos ensinamentos e
assessoramento nas tarefas de laboratório e identicação dos isolados. A José
Renato do escritório local da CEPLAC em Ituberá pela disponibilidade e
importante apoio durante as coletas realizadas para este estudo. Á CAPES
pela concessão da bolsa de estudo, á Comissão Executiva do Plano da
Lavoura Cacaueira pela utilização dos laboratórios do Centro de Pesquisa. A
Professora Dra. Elizabeth Duarte e toda sua equipe do laboratório de biologia
molecular da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia.
82
Tabela 5. Identificação molecular dos isolados da rizosfera de T. cacao e H. brasiliensis de fazendas do Sul da Bahia, Brasil.
Isolado Tamanho
(pb) 1
Cobertura
(%)
Identidade
(%) 2
Taxonomia Número de acesso GenBank3
2561 863 100 99 Phytopythium vexans KT148890.1; FJ415977.1; JQ898479.1; JQ898479.1;
HQ643400.2
2641 380 99 99 Phytopythium vexans GU133598.1; KP183942.1; KJ002694.1
2646 801 96 98 Phytopythium cucurbitacearum KT148890.1; FJ415977.1; JQ898479.1
2647 476 98 99 Pythium splendens AB562912.1; GU983648.1; FJ415950.1
2648 880 97 98 Phytopythium vexans LM651012.1; KP183942.1; GU133598.1
2649 682 98 99 Phytopythium vexans GU133585.1; FJ415977.1; HQ643954.1
2654 359 98 100 Phytopythium vexans GU133598.1; KP183942.1; KJ002694.1
2658 718 96 99 Pythium splendens AB562912.1; GU983648.1; FJ415950.1
2659 639 99 100 Phytopythium vexans GU133566.1; KP183961.1; LM651023.1
24428 880 100 100 Pythium acanthophoron AY598711.2; HQ643413.1; JQ898452.1
25822 859 99 99 Phytopythium vexans KT148890.1; FJ415977.1; JQ898479.1; JQ898479.1;
HQ643400.2
25403 871 98 99 Phytopythium vexans KT148890.1; FJ415977.1; JQ898479.1; JQ898479.1;
HQ643400.2 1Os os amplicons foram sequenciados em ambas as orientações e os fragmentos de consulta apresentados correspondem à sequência obtida.
2 “e-values” eram
iguais a zero para os isolados. 3Os números de acesso que correspondem às sequências descritivas da taxonomia indicada na coluna anterior.
83
6.5 REFERÊNCIAS
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87
7. CONCLUSÕES
1. Phytophthora capsici foi identificada como agente etiológico da queima
das folhas e morte de plantas de mentrasto (Ageratum conyzoides) e
lesões na base de folhas de bromélia (Vriesea procera), sendo este o
primeiro relato mundial desta espécie nestes hospedeiros;
2. Os isolados obtidos do mentrasto quando inoculados em frutos de cacau,
juntamente com outros isolados de seringueira, foram os que causaram
as maiores lesões, mostrando-se altamente agressivo ao cacaueiro se
comparado aos demais;
3. Os isolados obtidos das bromélias e do mentrasto estão entre os que
causaram as maiores lesões às folhas de seringueira, tanto do clone
FX3864 quanto do clone SIAL1005;
4. Os testes de patogenicidade comprovam que o A. conyzoides pode servir
como fonte primária de inóculo de P. capsici para a cultura do cacau.
5. A bromélia (Vriesea procera) pode ser considerada como fonte primária
de inóculo de P. capsici para a seringueira.
6. Em solos cultivados com cacaueiro e seringueira no Sul da Bahia, foram
isolados os seguintes oomicotas: Phytophthora tropicalis, Phytophthora
heveae, Phytopythium vexans, Phytopythium cucurbitacearum, Pythium
acanthophoron e Pythium splendens.
7. Phytopythium vexans e P. cucurbitacearum não causaram lesões em
folhas de seringueira e nem em frutos de cacau e não se constituem
ameaça a estas culturas.
8. É relatada pela primeira vez a ocorrência de Phytopythium vexans,
Phytopythium cucurbitacearum, Pythium acanthophoron e Pythium
splendens no Sul da Bahia e também para o Brasil de P. acanthophoron e
Phytopythium cucurbitacearum. Todos os quatros são relatados pela
primeira vez em solos de seringueira e cacaueiro.
88
8 REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES
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