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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS APOLIANA DE SOUSA RODRIGUES PADRONIZAÇÃO E UTILIZAÇÃO DE TESTES SOROLÓGICOS COMO FERRAMENTAS PARA CONTROLE DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO LEITEIRO SEMI-INTENSIVO FORTALEZA 2012

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINRIA

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS

VETERINRIAS

APOLIANA DE SOUSA RODRIGUES

PADRONIZAO E UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS

COMO FERRAMENTAS PARA CONTROLE DA ARTRITE

ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO LEITEIRO

SEMI-INTENSIVO

FORTALEZA

2012

2

APOLIANA DE SOUSA RODRIGUES

PADRONIZAO E UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS

COMO FERRAMENTAS PARA CONTROLE DA ARTRITE

ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO LEITEIRO

SEMI-INTENSIVO

Dissertao apresentada ao Programa de Ps Graduao

em Cincias Veterinrias da Universidade Estadual do

Cear, como requisito parcial para obteno do grau de

Mestre em Cincias Veterinrias.

rea de Concentrao: Reproduo e Sanidade Animal.

Linha de Pesquisa: Reproduo e sanidade de pequenos

ruminantes.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Ftima da Silva

Teixeira

FORTALEZA

2012

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4

APOLIANA DE SOUSA RODRIGUES

PADRONIZAO E UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS

COMO FERRAMENTAS PARA CONTROLE DA ARTRITE

ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO LEITEIRO

SEMI-INTENSIVO

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Cincias Veterinrias da Faculdade de

Veterinria da Universidade Estadual do Cear, como

requisito parcial para a obteno do grau de Mestre em

Cincias Veterinrias.

Aprovada em: ____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

_______________________________

Profa. Dra. Maria Ftima da Silva Teixeira

Universidade Estadual do Cear

Orientadora

________________________________

Prof. Dr. Raymundo Rizaldo Pinheiro

EMBRAPA Caprinos e Ovinos/

Universidade Estadual Vale do Acara

Co-orientador/Examinador

________________________________

Prof. Dra. Alice Andrioli Pinheiro

EMBRAPA Caprinos e Ovinos/

Universidade Estadual Vale do Acara

Examinadora

5

O Universo, por si s, exige a existncia de um ser

superior que foi capaz de fazer dele uma realidade. Se

no h um Deus Criador, ento, fica difcil, seno

impossvel, explicar a existncia da vida.

Guttfried Wilhelm Leibnitz

6

AGRADECIMENTOS

A Universidade Estadual do Cear, ao Programa de Ps-Graduao em Cincias

Veterinrias (PPGCV) e ao Laboratrio de Virologia (LABOVIR) pela a oportunidade

que me foi dada para a realizao deste trabalho.

A CAPES pela bolsa concedida e ao CNPq pelo apoio financeiro, o qual foi

imprescindvel para o andamento desta pesquisa.

A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria, Embrapa Caprinos e Ovinos, pela

concesso das condies tcnicas e estruturais para realizao deste estudo.

Ao meu criador, Deus. Sou muito grata pelas bnos recebidas, por guiar a minha vida

e por sempre renovar as minhas foras.

Aos meus pais, Rosa Maria e Francisco Fernandes por seu grande amor e dedicao, os

quais no mediram esforos para me ajudar.

Aos meus irmos, Lidiane, Juliana e Rafael por sempre torcerem por mim e se

alegrarem por mais uma conquista na minha vida.

Ao Adlio Costa pelo grande incentivo.

A Vernica Sousa, minha cunhada, por sempre estar pronta a me ouvir.

A profa. Dra. Maria Ftima pelo carinho, amizade e orientao.

Ao Dr. Raymundo Rizaldo pela a oportunidade de aprendizado que me concedeu ao

tempo que passei na Embrapa, o qual foi imprescindvel para o meu desenvolvimento

acadmico e pessoal. Obrigada pela confiana e auxlio.

Ao Ronaldo pela amizade, mensagens enriquecedoras e oraes.

A Roberta Lomonte pela ateno, pacincia, carinho e por tantas coisas que me ensinou

perto ou longe sempre me ajudou nos momentos que mais precisei. Obrigada!

A Dra. Alice Andrioli pela colaborao e ensinamentos prestados.

Ao prof. Dr. Isaac Neto pela ateno e contribuio.

A Samile Alves, ao Vanderlan Warlington e Daniele Timb pela companhia, grande

ajuda e momentos de descontrao.

A Lauana, por ser essa pessoa sempre prestativa.

Ao Thiago Sampaio, muito obrigada pelos ensinamentos e grande ajuda.

Ao Joo Ricardo que tambm muito me ajudou com sua sabedoria nas atividades do

laboratrio.

7

A Osmarilda, Dona Helena e Nbrega muito obrigada pelo auxlio profissional.

A Dalva Alana pela amizade e carisma.

Ao Leandro, Eduardo Lus, funcionrios do setor leiteiro da Embrapa, muito obrigada!

A todos os bolsistas e funcionrios da Embrapa.

A Dra. Edmara Chaves e profa. Dra. Lucia de Ftima, obrigada pela colaborao.

Aos que fazem parte do LABOVIR, Danilo Saraiva, Kelma Costa, Gabrielle Rosemblit,

Davila Aguiar, Rebeca Marinho, Igor Ciraco, Victor Manuel, Allan Bezerra,

Rosivaldo Jnior, Steffi Arajo, Expedito Maia e Elysngella, obrigada pela amizade e

auxlio.

Aos colegas de mestrado e aos professores do PPGCV muito obrigada pelos grandes

ensinamentos.

8

RESUMO

Este estudo teve como objetivo avaliar um programa de controle da CAE, em rebanho

leiteiro, utilizando testes sorolgicos. Para tanto, foram padronizadas as tcnicas de

Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i) e Western Blot (WB) a fim de diagnosticar

precocemente anticorpos contra o Vrus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV). A partir

das padronizaes realizadas testou-se 222 amostras de soro caprino, as quais tambm

foram avaliadas comparativamente com a prova de rotina, Imunodifuso em Gel de

Agarose (IDGA). Os testes de WB/IDGA, Elisa-i/IDGA e WB/Elisa-i foram

comparados estatisticamente, tendo apresentado sensibilidade de 100%, 70% e 84,6% e

concordncia de 73,9%, 90,1%, e 72,5%, concomitantemente. Desta forma, essas trs

tcnicas foram utilizadas para o acompanhamento de animais leiteiros com prticas de

manejo a fim de controlar a enfermidade. Foram realizadas sete coletas de sangue a

cada quatro meses em matrizes e reprodutores, utilizando os testes de IDGA, Elisa-i e

WB. As crias que tiveram parto assistido foram submetidas a coletas de sangue logo

aps o nascimento. Um total de 283 amostras de soro de neonatos foi analisado pelas

tcnicas de IDGA e WB. A prevalncia dos animais adultos foi de 6,8%, 14,9% e 39,2%

respectivamente por IDGA, Elisa-i e WB. Na ultima anlise detectou-se 1,9% no teste

de IDGA e 7,5% nos testes de Elisa-i e de WB. Dos 283 neonatos avaliados ao

nascimento, quatro apresentaram resultado positivo no teste de WB. Esses dados

revelam que os testes de Elisa-i e WB apresentaram melhores resultados quando

comparados a IDGA, sendo mais sensveis. O WB por sua vez se destacou como o

mtodo mais sensvel para o diagnstico precoce de anticorpos anti-CAEV, porm as

medidas de manejo aliadas as provas sorolgicas adotadas no foram suficientes para

erradicar a CAE, mas favoreceu uma reduo significativa de animais soropositivos no

rebanho estudado. Alm disso, apesar da baixa frequncia a transmisso vertical dos

Lentivrus de Pequenos Ruminantes (LVPR), ocorre.

Palavras-chave: CAEV, controle, diagnstico, Lentivrus de Pequenos Ruminantes.

9

ABSTRACT

This study aimed to evaluate a control program of CAE, in dairy herd, using serological

tests. For this, techniques of Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and

Western Blot (WB) were standardized to diagnose early antibodies the caprine arthritis

encephalitis virus (CAEV). From the patterning were tested 222 goat serum samples,

which were also evaluated by the test routine agarose gel immunodiffusion (AGID) for

comparison. Tests for WB/IDGA, ELISA/IDGA and WB/ELISA were compared

statistically, and presented a sensitivity of 100%, 70% and 84.6% and concordance of

73.9%, 90.1%, and 72.5% concomitantly. Thus, these three techniques were used for

tracking dairy animals with management practices control of disease. Seven surveys

serological were realized, every four months, with collected samples blood the bucks

and matrices, using the AGID tests, Elisa-i and WB. The kids who had delivery assisted

were subjected to blood draws, shortly after birth, 283 serum samples were analyzed by

the AGID and WB. The prevalence of adult animals was 6.8%, 14.9% and 39.2%,

respectively, for AGID, ELISA and WB. In the final analysis detected 1.9% in test

AGID and 7.5% in tests ELISA and WB. Of the 283 newborns evaluated the birth, four

were positive in the WB. These data show that the tests of ELISA and WB shows better

results when compared to AGID, being more sensitive. The WB in turn stood out as the

most sensitive method for early diagnosis of the disease, but the management practices

adopted allied with serologic tests were not sufficient to eradicate CAE, but favored to a

significant reduction of the disease in the herd studied. Furthermore, despite the low

frequency the vertical transmission of Small Ruminant Lentivirus (SRLV) occurs.

Keywords: CAEV, control, diagnostic, small ruminant lentivirus.

10

LISTA DE FIGURAS

REVISO DE LITERATURA

Figura 1 - Estrutura esquemtica dos LVPR (Borderas, 2004). .................................... 22

Figura 2 - RNA genmico do vrus da Artrite Encefalite Caprina (Olsen, 2001). ......... 23

Figura 3 - Aumento de volume articular em caprino infectado com o CAEV. .............. 25

Figura 4 - Mastite causada pelo vrus da CAE. .............................................................. 26

Figura 5 - Teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA) realizado em placas de

petri e em lminas de microscopia, orifcios preenchido com soro controle positivo,

soros teste e com antgeno para CAE. ............................................................................ 29

Figura 6 - Linhas de precipitao do teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA)

realizado com antgeno para CAE. ................................................................................. 29

Figura 7 - Teste de Elisa indireto realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos em placa

rgida. .............................................................................................................................. 31

Figura 8 - Teste de Western Blot (WB) realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos, padro

de protenas, controle positivo, controle negativo e soros testes. Amostra positiva

apresenta reao do mesmo peso molecular do padro (seta). ....................................... 32

Figura 9 - Separao da cria ao nascimento. .................................................................. 35

Figura 10 - Fornecimento de colostro termizado em cabrito recm-nascido. ................ 35

Figura 11 - Animal positivo identificado com brinco e colar. ....................................... 36

CAPTULO I

Figura 1 - Padronizao do Western Blot para diagnstico da Artrite-Encefalite

Caprina............................................................................................................................48

CAPTULO II

Figura 1 - Percentual de animais positivos detectados por IDGA, Elisa-i e WB em sete

levantamentos, com intervalo de quatro meses, em rebanho leiteiro semi-intensivo......61

11

LISTA DE TABELAS

CAPTULO I

Tabela 1 - Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de Elisa-i e

IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. ......................................................... 49

Tabela 2 - Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e

IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. ......................................................... 50

Tabela 3 - Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e

Elisa-i para deteco de anticorpos contra CAEV.......................................................... 50

CAPTULO II

Tabela 1 - Testes de IDGA e WB em cabritos imediatamente aps o nascimento.........64

12

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

A - Ampre

Ag - Antgeno

AIEV - Vrus da Anemia Infecciosa Equina

BIV - Vrus da Imunodeficincia Bovina

CA - Capsdeo

CAE - Artrite Encefalite Caprina

CAEV - Vrus da Artrite Encefalite Caprina

CAPES - Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior

CE - Cear

CEUA - Comit de tica para Uso de Animais

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico

DAB - Diaminobenzidine

DNA - cido desoxirribonucleico

dUTPase - Enzima codificada pelo gene pol

EDTA - Acido etilenodiaminatetraacetico

ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay

Elisa-i - Ensaio Imunoenzimtico Indireto

EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria

env - Gene que codifica as protenas do envelope viral

FIV - Vrus da Imunodeficincia Felina

FUNCAP - Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e

Tecnolgico

gag - Gene viral que codifica as protenas interna do vrus

GP Glicoprotena

HCl cido Clordrico

13

H2O2 - gua Oxigenada

H2SO4 - cido Sulfrico

HIV - Vrus da Imunodeficincia Humana

IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

IDGA - Imunodifuso em Gel de Agarose

IgG - Imunoglobulina G

IN - Integrase

JDV Vrus da Doena de Jembrana

KDa - Kilodaltons

LABOVIR - Laboratrio de Virologia

LTR - Sequncias Longas Repetidas

LVC Lentivrus Caprino

LVPR - Lentivrus de Pequenos Ruminantes

M - Molar

MA - Matriz

mg - Miligramas

MIN - Minuto

mL - Mililitros

mM - mili-molar

MN Membrana de Nitrocelulose

MSC - Membrana Sinovial Caprina

MVV - Vrus Maedi-Visna

Na2CO3 - Carbonato de Sdio

NaCl - Cloreto de Sdio

NaHCO3 - Bicarbonato de Sdio

NA2HPO4 Fosfato de Sdio Dibsico

14

NAH2PO4 Fosfato de Sdio Monobsico

NC - Nucleocapsdeo

nm - Nanmetro

C - Graus Celsius

ORF - Pequena regio do genoma viral

OIE - Organizao Mundial de Sade Animal

OPD - O-phenylenidiamine

PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis

PBS - Soluo de Tampo de Fosfato

PBS-T - PBS-Tween-20

PCR - Reao em Cadeia de Polimerase

PEG - Polietilenoglicol

pH - Potencial de Hidrognio

PM - Peso Molecular

PMSF - Phenylmethylsulphonyl fluoride

pol - Gene encontrado no genoma retroviral que codifica a transcriptase reversa

PP - Percentual de Positividade

PPGCV - Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias

PR Protease

rev - Gene de regulao viral

RNA - cido ribonucleico

SDS - Dodecil Sulfato de Sdio

SFB - Soro fetal bovino

SIV - Vrus da Imunodeficincia Smia

SN - Sobrenadante

SU - Glicoprotena de Superfcie

15

tat - Gene de regulao viral

TI Tampo de Incubao

TM - Glicoprotena Transmembrnica

tm - Trademark

TNE - Tampo Tris -HCl

TR Transcriptase Reversa

UCCS - Ultracentrifugao em Colcho de Sacarose

UECE - Universidade Estadual do Cear

V - Volts

vif - Gene de regulao viral

VPN - Valor Preditivo Negativo

VPP - Valor Preditivo Positivo

W - Watts

WB - Western Blot

g - Micrograma

L - Microlitro

m Micrmetro

g - Unidade da fora centrfuga relativa

2

- Qui-Quadrado

16

SUMRIO

RESUMO ......................................................................................................................... 8

ABSTRACT ..................................................................................................................... 9

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... 10

LISTA DE TABELAS ................................................................................................... 11

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... 12

1 INTRODUO ......................................................................................................... 18

2 REVISO DE LITERATURA ................................................................................. 20

2.1 VISO GERAL DA CAPRINOCULTURA ...................................................................... 20

2.2 VRUS DA ATRITE ENCEFALITE CAPRINA ............................................................... 21

2.2.1 Classificao, morfologia e genoma .............................................................. 21

2.2.2 Replicao ...................................................................................................... 23

2.2.3 Resposta imune .............................................................................................. 24

2.2.4 Sinais clnicos ................................................................................................. 25

2.2.5 Transmisso .................................................................................................... 27

2.2.6 Diagnstico..................................................................................................... 28

2.2.6.1 Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA) ............................................. 28

2.2.6.2 Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i).............................................. 30

2.2.6.3 Western Blot (WB) .................................................................................. 31

2.2.6.4 Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) ................................................. 32

2.2.6.5 Isolamento viral ....................................................................................... 33

2.2.7 Tratamento ..................................................................................................... 33

2.2.8 Medidas de preveno e controle ................................................................... 33

3 JUSTIFICATIVA ...................................................................................................... 38

4 HIPTESE CIENTFICA ........................................................................................ 39

5 OBJETIVOS .............................................................................................................. 40

5.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 40

5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................ 40

6 CAPTULO I ............................................................................................................. 41

PADRONIZAO DO ELISA INDIRETO E WESTERN BLOT PARA

DIAGNSTICO DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA .................................. 42

RESUMO ....................................................................................................................... 42

ABSTRACT ................................................................................................................... 43

INTRODUO .............................................................................................................. 43

MATERIAL E MTODOS ............................................................................................ 44

RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 48

CONCLUSES .............................................................................................................. 52

AGRADECIMENTOS ................................................................................................... 52

17

REFERNCIAS ............................................................................................................. 52

7 CAPTULO II ............................................................................................................ 55

UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS COMO FERRAMENTAS PARA

CONTROLE DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO

LEITEIRO .................................................................................................................... 56

RESUMO ....................................................................................................................... 56

ABSTRACT ................................................................................................................... 57

INTRODUO .............................................................................................................. 57

MATERIAL E MTODOS ............................................................................................ 59

RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 61

CONCLUSES .............................................................................................................. 67

AGRADECIMENTOS ................................................................................................... 68

REFERNCIAS ............................................................................................................. 68

8 CONCLUSES .......................................................................................................... 72

9 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 73

10 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 74

ANEXOS ....................................................................................................................... 86

ANEXO 1 - DECLARAO DO COMIT DE TICA ........................................................ 87

ANEXO 2 - COMPROVANTE DE SUBMISSO DE ARTIGO .............................................. 88

18

1 INTRODUO

A Artrite Encefalite Caprina (CAE) se enquadra no grupo dos Lentivrus de

Pequenos Ruminantes (LVPR) e necessita de vigilncia devido sua disperso mundial.

uma doena multissistmica crnica, com um longo perodo de incubao e evoluo

clnica lenta e progressiva (Franke, 1998). Alm de ser incurvel, pode ainda se

apresentar de forma assintomtica em muitos animais, tornando estes portadores do

vrus, o que favorece a disseminao da enfermidade.

Caprinos infectados com o Vrus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) podem

apresentar leses nas articulaes, pulmes, sistema nervoso e glndula mamria.

Entretanto, a que tem grande impacto econmico a forma mamria, porque

compromete a produo leiteira e a qualidade do leite, por aumentar a contagem de

clulas somticas e diminuir os nveis de gordura do leite (Greenwood, 1995; Brito,

2009; Carneiro, 2011). Esse vrus afeta caprinos de qualquer raa, sexo e faixa etria,

tendo sido observada uma crescente soroprevalncia com o avanar da idade (Jones et

al., 2000; Pinheiro et al., 2001; Radostits et al., 2002; Souza et al., 2005).

A disperso do CAEV vem causando diversas perdas, como a diminuio da vida

produtiva, predisposio para a ocorrncia de infeces bacterianas, sobretudo na

glndula mamria, crescimento deficiente ou aumento da taxa de mortalidade das crias e

diminuio da eficincia reprodutiva (Brito, 2009; Carneiro, 2011).

H uma grande preocupao de melhorar o controle dessa enfermidade,

especialmente em rebanhos leiteiros onde o ndice de casos mais elevado. Isso se deve

pela contaminao de crias por meio do colostro e leite de animais positivos, sendo a

via digestiva a principal fonte de transmisso natural do CAEV (Mselli-Lakhal et al.,

1999; Lamara et al., 2001). Alm desta, outras vias de infeco como secrees

salivares, respiratrias, intrauterina e sexual, tambm tm sido estudadas (Blacklaws et

al., 2004; Peterhans et al., 2004; Souza et al., 2012a).

O sucesso do controle depende de boas tcnicas de manejo, no qual visam

preveno da transmisso pelo leite, isolamento dos animais soropositivos (East, 1993),

e de testes diagnsticos mais sensveis (Pinheiro et al., 2010). Para isso, a sorologia

representa uma forma eficaz no diagnstico laboratorial, pois a presena de anticorpos

demonstra indiretamente a existncia de infeco (Castro, 1998). O diagnstico mais

19

rotineiramente utilizado o teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA), porm

outros testes sorolgicos como o ensaio imunoenzimtico indireto (Elisa-i) e o Western

Blotting (WB) tambm so empregados.

A IDGA indicada como teste de triagem, porque de fcil execuo e tem alta

especificidade (Varea et al., 2001). Sua desvantagem a sororreao tardia, pois s

detecta altos nveis de anticorpos. O teste Elisa-i considerado mais sensvel que o

IDGA, porm a sensibilidade e especificidade do teste depende da qualidade do

antgeno. J o WB considerado padro ouro para validao de outros testes, entretanto

uma tcnica bastante laboriosa (Zanoni et al., 1989)

A implantao de testes laboratoriais e boas prticas de manejo para controlar a

CAE so necessrias, pois ainda no existem tratamentos nem vacinas eficazes contra

essa enfermidade.

20

2 REVISO DE LITERATURA

2.1 Viso geral da caprinocultura

A regio Nordeste o local de maior concentrao de caprinos, correspondendo

a 90,61% de animais do rebanho nacional, sendo os Estados da Bahia, Pernambuco,

Piau, Cear e Paraba os que representam os maiores efetivos de caprinos (IBGE,

2009).

No entanto, o desempenho da caprinocultura nessa regio comprometido por

prticas comumente inadequadas de manejo alimentar, reprodutivo e sanitrio, bem

como pela ausncia de escriturao zootcnica e diagnstico tardio de diversas doenas

com etiologias diferentes, e que em sua maioria no so controladas de maneira

apropriada (Pinheiro et al., 2003; Brito, 2009; Carneiro, 2011).

A caprinocultura merece uma maior ateno a respeito da situao sanitria

desses animais, necessitando de maiores cuidados, o que pode repercutir na associao

do valor aos animais e seus produtos (Castro e Melo, 2001). Um dos problemas

sanitrios de relevncia a sndrome da Artrite Encefalite Caprina (CAE) (Silva et al.,

1996). Essa doena determinada pela infeco com o CAEV.

A introduo da CAE na Amrica do Sul ocorreu, possivelmente atravs das

importaes de animais de raas leiteiras estrangeiras, provenientes de rebanhos

europeus (Frana, Sua, Alemanha, Holanda, Inglaterra) e americanos (Estados

Unidos e Canad). Sua primeira descrio no Brasil foi feita no Rio Grande do Sul,

com identificao de caprinos soropositivos (Moojen et al., 1986). H tambm

registros de exames positivos em soros coletados, no Rio de Janeiro, no incio da

dcada de 80 (Cunha e Nascimento, 1995). Posteriormente sua presena foi

confirmada com o isolamento do vrus de caprinos (Castro et al., 1999; Feitosa et al.,

2007).

A disseminao do CAEV vem sendo difundida mundialmente, principalmente

em pases que praticam a caprinocultura leiteira intensiva (Crawford et al., 1981; East

et al., 1987), necessitando assim de constante vigilncia.

21

2.2 Vrus da Atrite Encefalite Caprina

2.2.1 Classificao, morfologia e genoma

O vrus da Atrite Encefalite Caprina (CAEV) pertence famlia Retroviridae,

subfamlia Lentivirinae, gnero Lentivrus (lenti em latim = lento) (Crawford et al.,

1980). Competem tambm a este gnero, o vrus Maedi-Visna (MVV), os vrus das

imunodeficincias felina (FIV), bovina (BIV), smia (SIV) e humana (HIV-1, HIV-2),

vrus da anemia infecciosa equina (AIEV) (Haase, 1986; Clements e Payne, 1994) e o

vrus da doena de Jembrana (JDV) (Burkala et al., 1998). No entanto, os dois

principais grupos filogenticos dos Lentivirus de Pequenos Ruminantes (LVPR) esto

representados pelos prottipos do CAEV e MVV (Shah et al., 2004).

Esses infectam caprinos e ovinos, respectivamente. So considerados patgenos

espcie-especficos, porm estudos evidenciaram que so capazes de contaminar ambas

as espcies (Pisoni et al., 2005; Ravazzolo et al., 2006; Souza et al., 2012a).

A estrutura desses Lentivrus de vrions envelopados de 80 a 100 nm de

dimetro contendo duas molculas idnticas de RNA e protenas estruturais (figura 1)

(Gonda et al., 1986; Joag et al., 1996; Jones et al., 2000). A poro viral mais externa

ligeiramente esfrica constituda por lipdios, onde se encontram inseridas diversas

glicoprotenas codificadas pelo vrus, apresentando ainda uma grande quantidade de

cidos silicos em sua superfcie, os quais promovem uma resistncia degradao do

vrus pelas enzimas proteolticas do trato gastrintestinal, o que possibilita a infeco

intestinal e facilita seu escape do controle humoral (Huso et al., 1988).

Os trs principais genes do genoma so expressos por gene gag, env, pol. As

glicoprotenas do gene env (envelope) so glicoprotenas de superfcie (SU) e

transmembranar (TM) que atuam na penetrao do vrus nas clulas. O ncleo cnico

e denso (Joag et al., 1996; Jones et al., 2000), o qual se constitui por produtos do gene

gag (antigeno grupo-especfico) protenas do capsdeo (CA), nucleocapsdeo (NC) e

matriz (MA). A regio pol (polimerase) codifica as protenas de atividade enzimtica:

transcriptase reversa, protease, integrase e dUTPase, alm de pequenos ORFs (open

reading frames) ou fases abertas de leitura, que codificam protenas que regulam a

22

expresso gnica como os genes acessrios (tat, vif), (ou Q) e (rev), codificantes de

protenas de regulao da expresso viral (Clements e Payne, 1994).

Figura 1 - Estrutura esquemtica dos LVPR (Borderas, 2004).

O genoma viral possui tamanho de aproximadamente 10Kb, formado por duas

regies terminais no codificantes (sequencias longas repetidas ou LTRs), localizadas

nas extremidades 5 e 3, as quais esto envolvidas na habilidade do vrus em sofrer

replicao em clulas distintas, contribuindo para o estabelecimento do tropismo celular

(Agnarsdttir et al., 2000; Clements e Payne, 1994). Entre essas regies extremas esto

os genes gag e pol, que so considerados os mais conservados, e o gene env que

bastante heterogneo (Narayan e Clements, 1989). Alm desses, o gene acessrio tat,

que essencial para a induo da patogenia, e rev e vif, os quais participam da

replicao viral (figura 2) (Harmache et al., 1995; Clements e Zink, 1996; Joag, 1996).

23

Figura 2 - RNA genmico do vrus da Artrite Encefalite Caprina (Olsen, 2001).

2.2.2 Replicao

O vrus possui tropismo principalmente pelas clulas do sistema monoctico-

fagocitrio que proporcionam a replicao viral e funcionam como meio de

distribuio. A replicao restrita permite que o vrus permanea latente nos

moncitos do hospedeiro e no seja detectvel pelo sistema imune (Pugh, 2004). A

replicao geralmente limitada por determinados fatores, entre os quais se destaca a

restrio que mediada por interferon, produzido por linfcitos ativados durante sua

interao com os macrfagos infectados. Contudo, o tropismo do vrus por clulas do

sistema imune, particularmente moncitos e macrfagos, o principal fator responsvel

pela habilidade dos lentivrus em causar infeces crnicas, que persistem por toda a

vida do animal (Pinheiro, 2001).

O lentivirus compartilham trs caractersticas gerais que promovem a

persistncia da infeco em seus hospedeiros. Primeiro, aps a transcrio reversa do

RNA viral nas clulas infectadas, o DNA proviral se integra ao genoma celular,

permitindo que o vrus escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro e preserve o

seu genoma. Segundo, se multiplicam em clulas do sistema imunolgico,

normalmente responsveis pela eliminao de clulas infectadas, assim, o hospedeiro

no consegue desenvolver resposta imunolgica curativa (Narayan et al., 1997,

Callado et al., 1999).

Terceiro, esses vrus acumulam altas taxas de mutao durante o processo de

replicao, devido a falhas da transcriptase reversa em corrigir as novas sequncias de

nucleotdeos, resultando em variabilidade gentica e, consequentemente fenotpica.

Alm disso, a restrio da expresso viral, sem produo de partculas virais, permite

24

que as clulas infectadas pelo vrus escapem do sistema imunolgico do hospedeiro

(Cheevers et al., 1993; Narayan et al., 1997).

2.2.3 Resposta imune

O CAEV est associado covalentemente com as glicoprotenas TM, denominada

de gp 45, e de SU gp135; com o CA cuja protena a p28, com peso molecular em

torno de 28 a 30 KDa; com o NC, que uma pequena protena que interage com o

RNA do vrus e MA, que est situada entre o CA e o envelope, possuindo protena

com peso de cerca de 16 KDa (p16). contra a protena do CA que ocorre a primeira

resposta imune detectada em torno da terceira semana aps infeco e por volta da

quinta semana so produzidos anticorpos para as protenas do NC, MA, TM e SU

(Concha-bermejillo et al., 1995; Pepin et al., 1998; Hirsh e Zee, 2003).

Dentre as protenas citadas, duas esto mais diretamente envolvidas com a

produo de anticorpos pelo hospedeiro: uma glicoprotena do envelope, de peso

molecular de 135 kDa (gp135), e uma nucleoprotena de peso molecular de 28 kDa

(p28) (Gogolewski et al., 1985; Johnson et al., 1983; Knowles et al., 1991).

A resposta celular caracterizada pela proliferao de linfcitos T CD4+

(Reyburn et al., 1992b) e T CD8+ (Lichtensteiger et al., 1993; Blacklaws et al., 1994)

que so responsveis pela destruio de clulas infectadas, porm no destroem as que

no expressam as protenas vricas. Os anticorpos passivos adquiridos pela ingesto de

colostro persistem em nveis detectveis no soro de cabritos por menos de seis meses

(Adams et al., 1983; Cutlip et al., 1988).

O alto grau de variabilidade gentica do vrus, como evidenciado pela gerao de

uma populao altamente divergente de genoma viral nos indivduos infectados pode

ser relatado como um dos fatores da persistncia viral (Clements et al., 1988). Estas

variantes escapam da ao do sistema de defesa do hospedeiro (Knowles et al., 1990). E

o vrus capaz de replicar-se independentemente da sntese de DNA celular, fazendo

com que a clula o hospede por longos perodos (Klevjer-Anderson e Cheeveres, 1981).

25

2.2.4 Sinais clnicos

A presena de leses nas articulaes, pulmo, sistema nervoso e glndula

mamria so indicativos infeco por Artrite Encefalite Caprina. Mesmo o CAEV

causando infeces persistentes, os animais podem no apresentar sintomatologias.

Porm em aproximadamente um tero desses, h um progresso para uma ao

inflamatria degenerativa nesses rgos-alvo, causando perda de peso e debilidade at a

morte (Pisoni et al., 2007).

A forma articular, por ser mais comum, considerada a mais importante,

geralmente observada em animais com mais de oito meses de idade. Com o avanar da

enfermidade o animal apresenta aumento de volume da articulao (figura 3),

claudicao intensa e dificuldade de locomoo. As articulaes crpicas so as mais

afetadas, j as do jarrete, a patelar e a atlanto-occiptal so acometidas com menor

frequncia (Crawford e Adams, 1981; Oliver et al., 1981; Gonzalez et al., 1987; Cutlip

et al., 1988).

Figura 3 - Aumento de volume articular em caprino infectado com o CAEV.

Quanto apresentao pulmonar bastante rara e de pouca gravidade. Os

sintomas so tosse, dispnia aps exerccios fsicos, taquipnia, consolidao

pulmonar, som mido auscultao e comprometimento do estado geral (Narayan e

Cork, 1985, Cutlip et al., 1988; Pereira, 1995).

A sintomatologia nervosa da CAE ocorre mais frequentemente em crias e,

ocasionalmente em adultos. Os sinais incluem ataxia secundria uni ou bilateral. Neste

estgio os cabritos apresentam dificuldade em abduzir os membros posteriores, que

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progride para uma paralisia ascendente e paresia total dos posteriores, evoluindo para

tetraplegia. Com a evoluo da enfermidade, os cabritos se tornam cegos, apresentam

rotao, desvio e balanceios de cabea, que pode se manter voltada para cima ou em

outra posio, paralisia facial e opisttono (Radostits et al., 2002; Pugh, 2004).

Na forma mamria as cabras podem desenvolver mamite aguda ou crnica (Figura

4). Essa se instala durante a lactao e caracteriza-se por uma mamite intersticial com

endurecimento do bere, em que a consistncia da glndula mamria apresenta-se dura

palpao, embora o aspecto do leite esteja aparentemente normal. Aquela por sua vez

observada no incio da lactognese, ocorrendo um endurecimento no edematoso do

rgo, com baixa ou nenhuma produo leiteira (Peretz et al., 1993, Lara et al., 2005).

Figura 4 - Mastite causada pelo vrus da CAE.

Essa forma clnica traz grande preocupao ao caprinocultor, pois o CAEV est

diretamente relacionado com a produo leiteira na qual diminui significativamente

(Konishi et al., 2011). Alm disto, o vrus pode indiretamente reduzir os nveis de

gordura do leite. Como este componente est ligado ingesto de forragem, foi

observado que cabras com aumento no ndice articular apresentam dificuldade em

pastejar e produziram leite com menos gordura e consequentemente menos slidos

totais (Brito, 2009).

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08

)

27

2.2.5 Transmisso

Pesquisas para elucidar as formas de transmisso do CAEV vm sendo

largamente estudadas a fim de estabelecer eficientes programas de controle das

lentiviroses de caprinos e ovinos (Pinheiro, 2001).

A transmisso do CAEV pode ser classificada de duas formas, vertical ou

horizontal direta e indireta (Blacklaws et al., 2004). A forma horizontal pode ser

intensificada em rebanhos infectados quando se aumenta a concentrao de animais,

pois quanto maior a aproximao desses animais maior a probabilidade de contato com

secrees contendo macrfagos ou moncitos infectados (Narayan et al., 1983).

Materiais como sangue, leite ou colostro contem clulas do sistema moctico-

fagocitrio e so comumente analisados por serem vias passveis de infeco. Alm

dessas clulas, as clulas epiteliais, presentes nas secrees lcteas cuja infeco pelos

lentivrus pode ocorrer in vitro e in vivo podem contribuir para transmisso da infeco

aos animais lactentes (Mselli-Lakhal et al., 1999). As clulas endoteliais e clulas do

fibroblasto tambm so permissivas infeco in vivo (Carrozza et al., 2003).

A transmisso horizontal ocorre pelo contato com fludos nasais e orais contendo

os vrus ou clulas infectadas (Zink e Johnson, 1994). A principal fonte de transmisso

da enfermidade por meio da via digestiva com ingesto do colostro e/ou leite de

cabras infectadas (Rowe et al., 1992).

A transmisso de forma vertical pode ocorrer, por via transplacentria ou

intrauterina, visto que o vrus est presente no fluido uterino (Andrioli, 2001). O DNA

pr-viral tambm foi detectado no oviduto e ovrio (Fieni et al., 2003), nas clulas do

cumulus oophorus (Ali Al Ahamad et al., 2005) em clulas do crtex ovariano, folculos

pr-antrais (Silva, 2006), em smen (Andrioli et al., 1999; Travassos et al., 1999; Paula

et al., 2009), como tambm no canal vaginal, neste ltimo caso possibilitando a ingesto

de fluidos maternos contaminados pela cria (Adams et al., 1983; Ellis et al., 1986; East

et al., 1993).

Diante das formas de transmisso j estabelecidas a implantao de programas de

controle baseados somente na transmisso por leite e colostro entre a me infectada e

sua prole so limitados, necessitando da adio de outros mtodos de controle que

considerem um maior espectro de vias de infeco (Pinheiro et al., 2001a).

28

2.2.6 Diagnstico

possvel observar que muitos animais infectados no apresentam sintomatologia

clnica, porm permanecem soropositivos durante toda a sua existncia (Cutlip et al.,

1992). Os exames clnicos no so suficientes para detectar um animal como positivo

para CAE, o que tambm pode ser confundido com outras enfermidades. Devido a isso

necessrio a realizao de testes laboratoriais (Oliveira, 2006).

Caprinos infectados podem ser detectados com base na presena de anticorpos

antivirais no soro, pela deteco de protenas ou do cido nuclico, alm do isolamento

viral (Demartini et al., 1999). Devido praticidade na coleta de amostras e baixo custo,

a deteco de anticorpos o mtodo mais empregado para diagnosticar a infeco

(Knowles, 1997). No entanto, a resposta de anticorpo em cada caprino infectado pelo

CAEV varia ao longo do tempo, e muitos animais infectados mostram sororeao

intermitente ou um atraso na soroconverso aps a infeco (Mackenzie et al., 1987;

Rimstad et al., 1993; Hanson et al., 1996), havendo a necessidade de provas sorolgicas

sensveis para obteno de um diagnstico precoce.

Dentre as tcnicas laboratoriais, os mtodos de diagnsticos indiretos

(sorolgicos) podem ser realizados por meio das tcnicas de Imunodifuso em Gel de

Agarose (IDGA), Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i) e Western Blot (WB), e os

mtodos diretos podem ser aplicados pela Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) e

isolamento viral.

2.2.6.1 Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA)

O IDGA possui alta especificidade, sendo considerado como padro no

diagnstico de triagem (Varea et al., 2001). o mtodo mais utilizado para a deteco

de anticorpos contra os lentivrus e caracteriza-se por ser barato e de fcil

aplicabilidade no campo (Pinheiro et al., 2006a).

A tcnica baseia-se na formao de complexos antgeno-anticorpo que se

insolubilizam e precipitam no gel, em uma placa de Petri ou em uma lmina de

microscopia (figura 5), onde se desenvolve a linha de precipitao visvel entre os

29

orifcios no ponto em que alcanada a relao tima entre antgeno e anticorpo

(figura 6) (Roitt et al., 1998; Tortora et al., 2000).

Figura 5 - Teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA) realizado em placas de

petri e em lminas de microscopia, orifcios preenchido com soro controle positivo,

soros teste e com antgeno para CAE.

Figura 6 - Linhas de precipitao do teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA)

realizado com antgeno para CAE.

Um resultado negativo no IDGA no descarta uma possvel infeco, pois pode

ocorrer uma demora significativa entre a infeco e a produo de anticorpos, como

tambm pode acontecer que em alguns caprinos acometidos exista expresso

insuficiente do vrus para ocasionar uma resposta humoral (Mcguire et al., 1990;

Hanson et al., 1996). Assim a grande desvantagem desse teste, detectar somente altos

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nveis de imunoglobulinas, o que permite a ocorrncia de falso-negativos no rebanho

(Andrioli et al., 2006a; Tigre et al., 2006).

Para o monitoramento de um rebanho essa tcnica importante para verificar a

presena do agente infeccioso. De acordo com os dados de Pinheiro et al. (2001a) a

prevalncia da CAE em rebanhos leiteiros no Estado do Cear foi de 4,6% (37/810), j

Sobrinho et al. (2009) relatou que a prevalncia no Estado de Tocantins foi de 2,7%

(23/843) de animais positivos. Esses dados confirmam que essa enfermidade encontra-

se disseminada em todo territrio brasileiro, indicando, portanto a importncia da

necessidade da implantao de medidas de controle das lentiviroses.

2.2.6.2 Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i)

O IDGA e Elisa-i so os testes preconizados pela Organizao Mundial de Sade

Animal para o diagnstico sorolgico de infeco por LVPR (OIE 2006). O Elisa-i

usado para a deteco e/ou quantificao de anticorpos em amostras de soro a partir da

utilizao de anti-anticorpos marcados com enzimas (figura 7). A especificidade dessa

prova garantida principalmente pela qualidade do antgeno adsorvido placa

(Madruga et al., 2001). considerado um teste bastante sensvel que requer cuidados

quanto padronizao da tcnica.

Recentemente, foi demonstrado que o Elisa-i pode ser realizado com antgeno

produzido por microfiltrao seriada com uso do sistema de filtrao AMICON, para

separao da poro referente protena p28 do capsdeo, no qual mostrou-se alm do

custo reduzido uma alta sensibilidade e boa especificidade, podendo ser comparado

com outros kits de diagnstico Elisa-i disponveis para comercializao nacional e

internacional (Alves et al., 2012)

31

Figura 7 - Teste de Elisa indireto realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos em placa

rgida.

Ao comparar ELISA e IDGA verificou-se que a tcnica de ELISA detectou

animais com baixos nveis de anticorpos o que no ocorreu com a IDGA. O ELISA

obteve assim uma sensibilidade de 93,93% e especificidade de 100%. A concordncia

entre os testes foi de 97,43%, demonstrando um bom desempenho. Ainda assim, cogita-

se a necessidade de mais estudos para o desenvolvimento de tcnicas de diagnsticos

mais eficazes para facilitar a identificao da CAEV e possibilitar maior identificao

de focos de infeco no rebanho nacional (Cruz et al., 2009).

2.2.6.3 Western Blot (WB)

A tcnica de WB consiste na imunodeteco de protenas em filtro de

nitrocelulose pela reao com anticorpos especficos desenvolvidos para reconhecer o

polipeptdio em exame. O anticorpo especfico adicionado membrana e deixado

reagir por certo perodo de tempo, aps o qual uma frao de anticorpo fica retida na

regio da membrana que contm o polipeptdeo especfico (Brgido, 2003).

Esse anticorpo adsorvido especificamente sobre o polipeptdio detectado com

um anti-soro, ou seja, um anticorpo anti-anticorpo especfico (conhecido tambm de

segundo anticorpo ou conjugado) que foi quimicamente modificado pelo acoplamento

covalente de uma ou mais molculas de uma enzima. Esse reagente serve para detectar

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o anticorpo especfico e permite a sua visualizao em razo da atividade enzimtica

associada (figura 8). Devido utilizao de anticorpos acoplados a enzimas e

substratos sintticos coloridos, esse teste tambm conhecido como ensaio

imunoenzimtico (Brgido, 2003).

Figura 8 - Teste de Western Blot (WB) realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos,

padro de protenas, controle positivo, controle negativo e soros testes. Amostra

positiva apresenta reao do mesmo peso molecular do padro (seta).

O WB classificado como teste complementar, sendo denominado padro ouro

na validao de outros testes. Apresenta como vantagem menor ocorrncia de reaes

inespecficas, o que reduz o aparecimento de resultados falso-positivos (Zanoni et al.,

1989). O seu alto custo e a necessidade de um tempo mais extenso para obteno do

resultado so desvantagens em relao s outras tcnicas.

2.2.6.4 Reao em Cadeia de Polimerase (PCR)

Mtodos de diagnsticos diretos podem ser aplicados por meio da tcnica de

Reao em cadeia de polimerase (PCR) na qual permite a identificao por

amplificao direta de parte especfica do cido nuclico viral contido em fluidos e

tecidos de um animal infectado (Pinheiro, 2001). capaz de detectar animais com

infeco recente ou que ainda no soroconverteram, alm de detectar microrganismos

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67KDa

30KDa

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em estado latente, mortos ou que estejam unidos ao material gentico do hospedeiro,

porm uma tcnica que requer equipamentos especiais e tcnicos qualificados

(Andrioli et al., 2006b; Tigre et al., 2006).

2.2.6.5 Isolamento viral

aplicvel ao diagnstico de quase todas as viroses de interesse veterinrio

inclusive da CAE, com capacidade de detectar quantidades mnimas de vrus, sendo

considerado um teste padro de diagnstico em virologia. Existem, no entanto,

algumas restries, uma vez que uma tcnica demorada, dispendiosa, necessita da

implantao de cultivos celulares especiais e, alm disso, incapaz de detectar vrus

que no causem efeito citoptico (Knowles, 1997; Dantas, 2004).

2.2.7 Tratamento

O princpio de vacinas virais clssicas como varola, sarampo evitar o

desenvolvimento da doena clnica atravs da memria imunolgica que garantir a

defesa do indivduo vacinado. No caso dos retrovrus ainda no foi possvel tais aes.

Desta forma, ainda no foi relatado na literatura tratamento nem vacinas eficazes

contra a CAE (Castro, 1998; Jnior et al., 2009).

2.2.8 Medidas de preveno e controle

O controle de qualquer enfermidade baseia-se na reduo da morbidade e

mortalidade da doena. Esse mtodo tambm considerado um termo geral que

abrange todas as medidas com as quais se deseja interferir na ocorrncia ilimitada de

uma doena, qualquer que seja sua causa. Pode ser alcanado por meio do tratamento

de animais doentes, reduzindo a prevalncia da enfermidade e pela preveno da

doena, diminuindo tanto a incidncia quanto a prevalncia (Done, 1985).

Para tanto, o manejo sanitrio de grande importncia em qualquer sistema

pecurio produtivo, pois a ausncia de enfermidades evita perdas na produo.

Atualmente sabe-se que as doenas crnicas so as que mais contribuem para a reduo

34

da produtividade, impedindo que os animais atinjam a totalidade do seu potencial

produtivo (Modolo et al., 2003). Portanto, em primeira anlise necessrio levantar a

prevalncia das doenas. Nos rebanhos que apresentam uma alta prevalncia deve-se

reduzir esse quadro para baixa prevalncia. Aps essa fase, estratgias devem ser

estabelecidas para erradicar a infeco no rebanho (Peterhans et al., 2004).

A ausncia de meios teraputicos para a CAE torna as prticas de manejo e as

tcnicas de diagnstico os mtodos recomendados para controle dessa enfermidade. No

caso de rebanhos leiteiros a vigilncia mais complexa e trabalhosa principalmente

por que os animais permanecem mais tempo em contato direto uns com os outros do

que em sistemas de criao extensivos (Joag et al., 1996). No entanto, uma das formas

mais importantes de controle se d pelo correto manejo das crias aps o parto, a fim de

se evitar a transmisso pelo colostro e/ou leite de cabras infectadas (Radostits et al.,

2002).

Aproximadamente 69% das infeces pelo CAEV ocorrem pela ingesto de leite

ou colostro contaminado e os 31% restantes devem ser creditadas a outras vias de

infeco (Rowe et al., 1991). Alm das clulas do sistema moctico-fagocitrio que

esto presentes no leite e que conhecidamente so responsveis pela transmisso dos

LVPR, as clulas epiteliais presentes nas secrees lcteas so permissivas infeco

pelos lentivrus in vitro e in vivo, podendo contribuir para transmisso da infeco aos

animais lactentes (Mselli-Lakhal et al., 1999).

Para diminuir a disseminao do vrus em rebanhos leiteiros, os cabritos devem

ser separados de suas mes logo ao nascimento (figura 9) e ser alimentados com

colostro (figura 10) e leite termicamente tratados (Reilly et al., 2002). O tratamento

trmico deve ser a 56C por uma hora para inativar o vrus. Aps a termizao o

colostro deve ser congelado e armazenado para formao de um banco, para um

posterior fornecimento aos animais. Deve ser fornecido em mamadeiras individuais,

vontade, trs vezes ao dia durante as primeiras 36 horas de vida (Gouveia, 1996;

Bomfim et al., 2006). Alguns autores recomendam ainda o estabelecimento de um

banco de colostro de vacas, pois uma fonte rica de IgG e livre do vrus (Argello et

al., 2004).

35

Figura 9 - Separao da cria ao nascimento.

Figura 10 - Fornecimento de colostro termizado em cabrito recm-nascido.

Outra medida de controle a identificao de animais soropositivos (figura 11),

esses devem ser mantidos em instalaes isoladas com o intuito de evitar o contato

fsico com os no infectados ou descartar os soropositivos do rebanho (Radostits et al.,

2002). A identificao pode ser feita com o uso de cordes e utenslios de uso no

manejo em cores distintas para animais soropositivos e soronegativos (Carneiro, 2011).

Deve-se tambm impedir a entrada de animais infectados no plantel (Castro, 1998),

estabelecer uma linha de ordenha onde as fmeas soropositivas e/ou suspeitas sejam

ordenhadas por ltimo (Oliveira, 2006), realizar monta com bodes negativos ou ainda

as cabras devem ser inseminadas com smen livres do vrus (Smith, 1993).

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Figura 11 - Animal positivo identificado com brinco e colar.

Com a finalidade de evitar perdas de material gentico provocada pelo descarte

dos animais doentes, programas de controle buscam a obteno de crias de animais

enfermos antes de descart-los (Pinheiro et al., 2001a), uma vez que o comrcio de

material de multiplicao animal, que em muitos casos imprescindvel para

manuteno ou aumento da produtividade pecuria, no est isento de riscos (Carvalho

et al., 2007). Desta forma, vrias biotcnicas so utilizadas na reproduo animal,

visando preservao de smen, folculos ovarianos e embries de animais

geneticamente melhorados (Silva e Lima, 2007).

A deteco do DNA pr-viral do CAEV no smen fundamental para o programa

de controle da CAE, considerando-se o risco de transmisso por meio de infectados,

utilizado em monta natural ou inseminao artificial (IA). Segundo Andrioli et al.

(2006a), o dano testicular um fator que influencia significativamente a presena do

lentivrus no smen, e a lavagem apenas reduz a presena, mas no suficiente para

elimin-lo.

As medidas de controle para LVPR vem sendo adotadas em vrios pases (Rowe

et al., 1999). A Europa iniciou uma erradicao da MVV em pases baixos no incio da

dcada de 80, a qual foi bem sucedida. No entanto, a Irlanda no est livre de CAEV de

acordo com as estatsticas da OIE (Nuotio, 2006). Os mtodos aplicados nestes

programas forneceram muitas informaes sobre o controle das LVPR, no somente em

ovelhas, mas tambm em cabras. A partir de ento vrios outros programas similares

foram desenvolvidos como na Frana, Itlia, Alemanha, Espanha, Filndia e Sua

(Sihvonen et al., 2000).

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37

No Japo foi realizado, durante quatro anos, um programa de erradicao contra a

CAE. O programa utilizou trs estratgias, primeira, remoo de cabrito imediatamente

aps o parto, segunda, separao de cada nova gerao e terceira, abate de caprinos

positivos em testes (IDGA e PCR) peridicos. O conjunto desses permitiu o

estabelecimento de um rebanho livre de caprinos infectados pelo CAEV (Konishi et al.,

2011). Relatos demonstram que o nmero de caprinos e ovinos no rebanho pode ser um

fator de risco para a infeco das LVPR (Brlisauer et al., 2005). No caso do Japo, por

exemplo, o nmero de caprinos mantidos < 20.000, provavelmente esse fator tenha

contribudo para um melhor controle da enfermidade, o que favoreceu para que o

programa terminasse com xito.

Segundo apontamentos de Nuotio (2006), a separao de crias ao nascimento e o

fornecimento de colostro termizado so aes viveis como medidas temporrias, como

por exemplo, para preservar valores genticos. J a aplicao de testes peridicos e o

abate de animais soropositivos praticamente a nica abordagem efetiva nos rebanhos.

38

3 JUSTIFICATIVA

A CAE uma enfermidade de carter crnico e debilitante. Estudos sobre os

prejuzos diretos causados por esta doena ainda so limitados, mas os resultados

disponveis indicam que, ocorrem perdas produtivas como: diminuio da produo

lctea; dos nveis de gordura e de slidos totais do leite; reduo do perodo de

lactao; crescimento deficiente ou aumento da taxa de mortalidade das crias e

diminuio da eficincia reprodutiva. Alm da predisposio verminose

gastrintestinal por Haemonchus spp. e a ocorrncia de infeces bacterianas,

especialmente na glndula mamria; (Greenwood, 1995; Pinheiro et al., 1999; Andrioli

et al., 2003; Turin et al., 2005; Lilenbaum et al., 2007; Brito, 2009; Carneiro, 2011).

As perdas indiretas referem-se desvalorizao dos rebanhos, reposio precoce

dos animais que desenvolvem sintomas, despesas com o controle, comprometimento

das barreiras comerciais para matrizes, reprodutores, smen e embries (Andrioli et al.,

2003).

Diante das perdas mencionadas causadas pela CAE, ausncia de meios

teraputicos e presena de animais assintomticos nos rebanhos, torna-se importante a

implantao de programas de controle utilizando testes de diagnsticos mais sensveis

para deteco precoce de animais soropositivos bem como o emprego de boas prticas

de manejo.

39

4 HIPTESE CIENTFICA

Programas de controle que empregam prticas de manejo que visam inibir a

propagao do vrus em rebanho infectado pela CAE aliadas as tcnicas sensveis de

diagnstico indiretas como ELISA e Western Blot so eficazes no controle do CAEV.

40

5 OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar um programa de controle da CAE, em rebanho leiteiro, utilizando testes

sorolgicos.

5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Padronizar tcnicas de Elisa-i e de WB;

Comparar as tcnicas de diagnstico para Artrite Encefalite Caprina;

Controlar a CAE em um rebanho leiteiro baseado em prticas que impeam a

propagao do CAEV e em testes peridicos de IDGA, Elisa-i e WB.

Diagnosticar por meio de IDGA e WB se as crias recm-nascidas apresentam

anticorpos anti-CAEV.

Avaliar a transmisso transplacentria (vertical).

41

6 CAPTULO I

PADRONIZAO DO ELISA INDIRETO E WESTERN BLOT PARA

DIAGNSTICO DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA

(Standardization of indirect ELISA and Western Blot for diagnosis of caprine

arthritis-encephalitis)

Peridico: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia (Submetido em

outubro de 2012).

42

Padronizao do Elisa indireto e Western Blot para diagnstico da Artrite-

Encefalite Caprina

[Standardization of indirect ELISA and Western Blot for diagnosis of Caprine

Arthritis-Encephalitis]

A.S. Rodrigues1, R.L.L. Brito

2, R.R. Pinheiro

3, R.P. Dias

1, S.M. Alves

4, T.S. Souza

5,

K.C. Souza1, D.A.A. Azevedo

4, A. Andrioli

3, D.C.T. Magalhes

6, M.F.S. Teixeira

1*

1Faculdade de Veterinria - Universidade Estadual do Cear - Fortaleza, CE

* Endereo: Av. Paranjana, 1700, Fortaleza-CE, Cep: 60740-903, e-mail: [email protected]

2 Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias Universidade Estadual Paulista Jaboticabal, SP

3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria, Embrapa Caprinos e Ovinos Sobral, CE

4Departamento de Cincias Biolgicas e Agrrias Universidade Estadual Vale do Acara, Sobral, CE

5Escola de Medicina Veterinria e Zootecnia - Universidade Federal da Bahia Salvador, BA

6Agncia de Defesa Agropecuria do Estado do Cear ADAGRI, Sobral, CE

RESUMO

Artrite-Encefalite Caprina (CAE) diagnosticada rotineiramente pela tcnica de

Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA), que considerada pouco sensvel.

Objetivou-se com este estudo padronizar testes de Elisa-i e Western Blot (WB) para

deteco de baixos nveis de anticorpos em caprinos contra CAEV e comparar os

resultados obtidos nesses testes com a prova de IDGA. Para a padronizao dos testes

Elisa-i e WB utilizaram-se diferentes concentraes e diluies de antgeno, soros e

conjugado. No Elisa-i adotou-se microplacas rgidas com 96 poos, sendo a combinao

de concentrao de 0,5g/poo de antgeno e diluies de 1:100 de soro e 1:1500 de

conjugado a que apresentou melhor resultado. No WB foi utilizado membranas de

nitrocelulose, definindo-se as diluies de 1:50 de soro e 1:15000 de conjugado. Para

avaliar o desempenho das tcnicas, 222 amostras de soro caprino foram testadas e os

dados obtidos foram comparados com o IDGA. A soropositividade do WB, Elisa-i e

IDGA foram de 30,6%, 11,7% e 4,5%, concomitantemente. A concordncia de Elisa-

i/IDGA, WB/IDGA e WB/Elisa-i foi de 90,1%, 73,9% e 72,5%, respectivamente. As

mailto:[email protected]

43

tcnicas de Elisa-i e WB apresentaram-se mais sensveis que a IDGA, podendo ser

utilizadas como ferramentas para o diagnstico precoce da CAE.

Palavras-chave: infeco, LVPR, testes sorolgicos.

ABSTRACT

Caprine arthritis-encephalitis (CAE) is routinely diagnosed by the technique of Agarose

Gel Immunodiffusion (AGID), which is considered sensitive low. The objective of this

study was to standardize testing i-ELISA and Western Blot for early detection of

antibodies against CAEV in goats and compare the results obtained in these tests with

proof of AGID. For standardization of i-ELISA and WB were used different

concentrations and dilutions of antigen, sera and conjugate. In the i-ELISA, was

adopted rigid microplate with 96 wells, the combination that showed the best result was

concentration of 0.5g/ well of antigen and dilutions of the serum of 1:100 and

conjugate of 1:1500. In the WB was used nitrocellulose membranes, was defining the

dilutions of the serum of 1:50 and conjugate of 1:15000. To evaluate the performance of

the techniques, 222 goat serum samples were tested and the data were compared with

the AGID. Seropositivity of the WB, i-ELISA and AGID were 30.6%, 11.7% and 4.5%,

concomitantly. The agreement i-ELISA/AGID, WB/AGID and WB/i-ELISA was

90.1%, 73.9% and 72.5%, respectively. The techniques of i-ELISA and WB were more

sensitive than the AGID and can be used as tools for early diagnosis of CAE.

Keywords: infection, serological tests, SRLV.

INTRODUO

Vrus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) infecta caprinos de qualquer raa,

sexo e idade, possui extenso perodo de incubao e se enquadra no grupo dos

Lentivrus de Pequenos Ruminantes (LVPR), necessitando de vigilncia epidemiolgica

constante devido sua disperso mundial (Franke, 1998).

Artrite-Encefalite Caprina (CAE) causada por esse vrus considerada uma

enfermidade multissistmica crnica, incurvel, com evoluo clnica lenta e

44

progressiva. Os sinais clnicos so: artrite, com aumento do volume das articulaes;

pneumonia com dificuldade respiratria; encefalite com paresia e paralisia; mastite

indurativa com nodulaes no bere (Greenwood, 1995).

A tcnica laboratorial mais comumente utilizada para diagnstico da CAE a

Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA), que no muito sensvel (McConnell et al.,

1998) e baseia-se na formao de complexos antgeno-anticorpo que se insolubilizam e

precipitam no gel, sob uma base rgida, onde se desenvolve a linha de precipitao

visvel entre os orifcios no ponto em que alcanada a relao tima entre antgeno e

anticorpo (Varea et al., 2001).

Seguido do Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i) que usado para a

deteco e/ou quantificao de anticorpos em amostras de soro, com destaque em

estudos soroepidemiolgicos. A especificidade dessa prova garantida principalmente

pela qualidade do antgeno adsorvido placa (Madruga et al., 2001) e considerado um

teste bastante sensvel que requer cuidados quanto padronizao da tcnica.

Como padro ouro na validao desses testes, tem-se o Western Blot (WB) ou

immunoblotting, que classificado como um teste complementar. Apresenta como

vantagem menor ocorrncia de reaes inespecficas, o que reduz o aparecimento de

resultados falso-positivos (Zanoni et al., 1989).

Devido aos prejuzos causados pela CAE (Greenwood, 1995; Brito, 2009;

Carneiro, 2011) e considerando que a sorologia por IDGA apresenta desvantagens na

deteco de anticorpos contra o vrus, favorecendo a permanncia de animais

soropositivos no rebanho, objetivou-se com este estudo padronizar testes de Elisa-i e

Western Blot para diagnstico precoce de anticorpos em caprinos contra CAEV e

comparar os resultados obtidos nesses testes com a prova de IDGA.

MATERIAL E MTODOS

Para a produo de antgenos, foram utilizados cultivos secundrios de membrana

sinovial caprina (MSC). Garrafas roller (850 cm) foram cultivadas com MSC at 70 a

80% de confluncia e inoculadas com a amostra padro CAEV-Cork, com titulao de

10-5,3

TCID50/mL. As coletas do sobrenadante do cultivo celular foram submetidas a trs

ciclos de congelamento a -80C e descongelamento a 37C para a lise celular e liberao

45

de partculas virais, conforme metodologia descrita por Pinheiro et al. (2006). Este

estudo seguiu as normas estabelecidas pela a Comisso de tica no Uso de Animais da

Universidade Estadual Vale do Acara (CEUA/UVA) de acordo com o protocolo de N

014.12.

O antgeno utilizado na tcnica de IDGA foi preparado conforme metodologia de

Pinheiro et al. (2010). O sobrenadante foi clarificado por centrifugao a 3.300 g (rotor

IEC 216) a 4C por 20 minutos. Submetido tcnica de ultrafiltrao em sistema

AMICON, em membrana de 10 KDa onde o material retido no sistema foi retirado e

tratado com ter durante 10 minutos para destruio das glicoprotenas e liberao das

protenas internas do virion, em seguida foi armazenado a -20C at a realizao dos

testes.

Para Elisa-i o material foi clarificado por centrifugao a 10.000 rpm durante 30

minutos. O pellet de clulas foi ressuspenso em soluo de PBS (proporo de 1:10 do

volume inicial), e em seguida foi tratado com dodecil sulfato de sdio (SDS), a uma

concentrao final de 0,1% (v/v). O tratamento foi realizado durante 10 minutos, em

temperatura ambiente, sob homogeneizao. Posteriormente, o material foi centrifugado

a 10.000g durante 15 minutos, a 4C (Torres et al., 2009). A concentrao da protena

total do antgeno foi determinada pelo mtodo de Bradford (1976). Aps esse

procedimento o antgeno foi mantido a -20C.

O antgeno utilizado na tcnica de WB foi submetido precipitao com

polietilenoglicol - PEG-8000 a 40% at a concentrao final de 8%, durante um perodo

de 18h a 4C, subsequentemente foi centrifugado a 4C a 12000 g por 60 minutos. O

sedimento foi resuspenso em TNE (10,0mM tris-HCl, pH 7,4; 10,0mM NaCl;1,0mM

EDTA) na proporo de 10% do volume original da suspenso viral, em seguida foi

ultracentrifugado em colcho de sacarose (UCCS) (25% em TNE) conforme protocolo

de Dantas et al. (2008), a 42000 g por 120 minutos. O sedimento foi ressuspenso em

PBS (0,05M; 0,15M NaCl; pH 7,4) contendo 2x10-4

M de phenylmethylsulphonyl

fluoride (PMSF) sendo a concentrao proteica total determinada pelo mtodo de

Bradford (1976), e o antgeno mantido a -80C at a realizao dos ensaios

laboratoriais.

Para a execuo da microtcnica de IDGA seguiu protocolo de Gouveia et al.

(2000). Foi preparado gel de agarose a 0,9% em tampo fosfato salino. Esse gel foi

46

distribudo em lminas de vidro, perfurado com uma roseta padro de seis poos

equidistantes e preenchidos com uma quantidade de 30L de soros testes, soro padro e

antgeno para cada poo correspondente. Para a visualizao das linhas de precipitao

a leitura foi realizada 48-72 horas, com luz indireta sobre fundo escuro, sendo

considerada definitiva a segunda leitura.

Para o teste Elisa-i utilizou microplacas rgidas com 96 poos (Nunc immuno

plate/ M9410 1CS). O volume de solues distribudo em todas as etapas foi de

100L por poo. O antgeno foi diludo em tampo carbonato-bicarbonato (0,05 M, pH

9,6) e distribudo nos poos em diferentes concentraes: 1,0; 0,5; 0,25 e 0,125 g/mL,

sendo cada linha da placa uma concentrao. A placa ficou incubando por 60 minutos a

37C, e posteriormente ficou over night sob refrigerao. Aps esse processo de

sensibilizao a placa foi lavada duas vezes com soluo de lavagem (soluo salina

0,9%, 0,05% de Tween 20).

Em seguida bloqueou-se os stios livres com tampo PBS-casena (casena a 2%)

por 1 hora e 30 minutos a 37C e aps esse perodo a placa foi lavada duas vezes. Na

primeira coluna da placa foram distribudos 100L de tampo de incubao (TI - PBS,

0,25% de casena e 0,05% de Tween 20), correspondendo assim coluna do branco. Os

soros controle positivo, negativo e reagente do kit de IDGA (Veterinary Diagnostic

Technology, Inc, USA), foram diludos em TI, nas propores de 1:50 e 1:100. As

placas foram incubadas em estufa a 37C por 60 minutos.

Os soros foram descartados e a placa foi lavada seis vezes. Distribuiu-se o

conjugado DONKEY (Anti-Sheep IgG Peroxidase - SIGMA) nas diluies de 1:1000 e

1:1500 em TI. A placa foi incubada a 37C por 60 minutos. Repetiu-se o processo de

descarte e seis lavagens. Para a revelao utilizou-se o substrato tampo citrato-fosfato

(0,1M, pH 5,0) com adio de 0,02% de H2O2 e 0,2 mg/mL de -phenylenediamine

(OPD), por 15 minutos temperatura ambiente e ao abrigo da luz. A reao foi

bloqueada pela adio de 20L de 0,4 M H2SO4. A intensidade da cor da reao foi

determinada por absorbncia em leitor de microplacas de Elisa-i com comprimento de

onda de 492nm.

A diluio tima do soro foi determinada pela diferena entre as densidades

pticas obtidas nas leituras dos soros positivos e negativos, aquela que apresentou maior

diferena nas diferentes concentraes de antgeno foi escolhida (Pinheiro, 2001). A

47

partir da, foi determinado o ponto de corte (cut off) do Elisa-i, com a utilizao de duas

placas, sendo 41 soros diferentes de caprinos adultos sabidamente soronegativos para

cada placa, totalizando 82 amostras.

A tcnica de Western Blot foi padronizada a partir de modificaes no protocolo

de Arago et al. (2008). Para determinao das bandas proteicas do vrus foi preparado

um gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE) a 4% de

concentrao e 12,5% de separao. Nos locais de aplicao das amostras foram

utilizadas concentraes de 6g, 12g e 18g de antgeno, acompanhado com padro

de peso molecular LMW Electrophoresis (Pharmacia Biotech), com bandas de 20; 30;

43; 67 e 94 KDa.

Para a migrao eletrofortica utilizou aparelho da BIO-RAD modelo Power

PacTM

HC, ajustado para a programao inicial de 300 Watts (W), 1,00 Ampres (A) e

170 volts (V). As protenas do gel foram coradas com azul de Comassie, escaneadas e

analisadas atravs do software Bio Doc-IT-LS 6.0 do VisiDoc-IT, gel documentation

System da UVP.

Para padronizao das diluies do soro, conjugado e tempo de revelao no WB

foi preparado um gel utilizando a menor concentrao de antgeno, ou seja, 6g/L por

poo, porm para facilitar a tcnica, foi confeccionado um pente com duas canaletas,

uma com a largura convencional utilizada para o padro de protena e outro 10 vezes

mais larga que a padro, sendo utilizada uma quantidade de 13 L de antgeno.

As bandas proteicas inicialmente separadas por SDS-PAGE foram transferidas

para uma Membrana de Nitrocelulose (MN) (PROTAN BA 85 is stuck 150 X 200 mm

de 0,45 m), com auxlio de equipamento da BIO-RAD modelo Power PacTM

HC,

programado inicialmente para 300 W, 1,00 A e 100 V, por 60 minutos.

Aps a transferncia a MN foi colocada em recipiente contendo corante Ponceaus

(cat. 6226-79-5 - SIGMA), sob agitao, at que fossem visualizadas as bandas de

protenas, aps isto o corante foi retirado e a membrana lavada com gua destilada at

que as bandas fossem observadas com mais nitidez. A faixa de membrana

correspondente ao padro de peso molecular foi retirada e guardada at a revelao.

As protenas foram bloqueadas em soluo de bloqueio PBS Tween 0,3% por 60

minutos e lavadas com soluo de PBS-Tween 0,05% por trs vezes cinco minutos cada

lavagem. A membrana foi recortada em tiras, que foram enumeradas e colocadas em

48

tubos de ensaio de 5mL. Foi utilizado o soro controle positivo e negativo para CAEV do

kit comercial usado no IDGA (Veterinary Diagnostic, ICA - USA) e cinco amostras. O

conjugado foi o anti-IgG caprino marcado com peroxidase (SIGMA).

Os soros e o conjugado foram diludos em soluo PBS 1X. Foram testados dois

protocolos, no primeiro foi adotado para o soro a diluio de 1:50 por 30 minutos e do

conjugado de 1:15000 por 60 minutos, e no segundo de 1:100 para o soro por 30

minutos e conjugado 1:18000 por 30 minutos. Aps o tempo de reao dos soros testes,

as tiras foram submetidas a trs lavagens com PBS-Tween 0,05% de cinco minutos

cada. Em seguida foi adicionado o conjugado. Aps o tempo de incubao do

conjugado de 60 ou 30 minutos, para os protocolos I e II, respectivamente, as tiras da

membrana foram lavadas duas vezes com PBS-Tween 0,05% e uma vez com PBS 1X,

cinco minutos cada, em seguida, foram retiradas dos tubos de ensaio e colocadas em um

recipiente.

Para a revelao foi utilizado os substratos, 4-Cloro-1-Naphthol e 3,3

Diaminobenzidine (DAB), acrescido de perxido de hidrognio a 30%. As bandas de

protena ficaram ao abrigo da luz e a reao foi interrompida com adio de gua

destilada. Na leitura foi considerado positiva a amostra que apresentou polipeptdio

com peso molecular prximo a 28 KDa, considerando os parmetros de referncia,

padro de peso molecular e controle positivo (Oliveira et al., 2008).

As tcnicas de IDGA, Elisa-i e WB foram aplicadas utilizando 222 amostras de

soro caprino provenientes de um rebanho leiteiro pertencente a Embrapa Caprinos e

Ovinos, localizado no municpio de Sobral numa regio semirida do serto Cearense.

Os dados foram tabulados no programa Excel e analisados estatisticamente nos

programas Win Episcope 2.0 e EPI InfoTM

7.0, obtendo-se os resultados de

sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo,

concordncia dos testes, ndice Kappa e Qui-Quadrado (2).

RESULTADOS E DISCUSSO

O antgeno produzido para o Elisa-i apresentou uma concentrao proteica de 0,82

g/L. A padronizao do teste Elisa-i foi realizada variando a concentrao de protena

de antgeno por poo, de soro e conjugado. A melhor diluio obtida de soro e

49

conjugado foram de 1:100 e 1:1500, respectivamente, na concentrao de antgeno de

0,5g/poo. O ponto de corte foi obtido atravs das mdias dos 82 soros negativos mais

trs vezes o desvio padro, resultando no valor de 0,398.

A concentrao proteica do antgeno produzido para o WB obtida no Bradford foi

de 4,25 g/L. Em eletroforese, as bandas de protenas encontradas no gel em KDa

foram: 14; 22; 26; 28; 33; 36; 39; 45; 55; 67; 79; 86; 95; 103; 115; 127; 135 e 142. Com

a realizao da transferncia e WB somente algumas bandas proteicas foram

evidenciadas, dentre elas as de 28 KDa; 45 KDa e a de 67KDa.

As melhores diluies do WB de soro e conjugado foram 1:50 e 1:15000,

respectivamente. A escolha desta foi por exibir melhor reao equivalente a protena de

peso molecular 28 KDa (Fig. 1), que a mais imunognica.

Assim, a banda proteica para o vrus da CAE mais visvel foi da protena do

capsdeo viral cujo peso molecular varia de 28 a 29 KDa e representa o maior

componente estrutural do ncleo (Hirsh e Zee, 2003), sendo a protena de base para a

interpretao dos testes sorolgicos.

Na metodologia de produo de antgenos no diagnstico da CAE, a escolha da

estirpe viral e os componentes do vrus so fatores que podem influenciar nos resultados

quanto sensibilidade e a veracidade dos testes sorolgicos (Celler Jr. et al., 1998).

Desta forma, a escolha de um antgeno influencia marcadamente os resultados.

Na prova de IDGA a utilizao de um antgeno com as duas protenas (gp 135 e p

28) aumentam a sensibilidade (Pinheiro et al., 2006). No entanto, o antgeno

94Kda

67Kda

43Kda

30Kda

p28

Figura 1. Padronizao do Western Blot

para diagnstico da Artrite-Encefalite

Caprina. Diluio do soro 1:50 e do

conjugado 1:15000. Padro de peso

molecular (P), controle positivo (+),

controle negativo (-) e soros testes (1 a 5).

P + - 1 2 3 4 5

50

empregado neste trabalho para a tcnica de IDGA, evidenciou apenas a p 28. Estudos

apontam que o emprego de testes com a glicoprotena de superfcie (gp 135) do vrus do

CAEV mostrou-se mais sensvel do que utilizando os da nucleoprotena (p 28) (Pinheiro

et al., 2010). No WB, a gp 135 no foi transferida para MN. Na padronizao do teste

Elisa-i foi observada que o soro reagente do Kit comercial, abundante em anticorpos

contra a gp 135, demonstrou boa reao. O soro positivo rico em gp 135 e p 28 foi

altamente positivo. Baseado nisso, considerou que o antgeno produzido para o teste de

Elisa-i possua quantidades suficientes das duas protenas para serem detectadas.

O SDS utilizado no tratamento do antgeno viral do teste Elisa-i um detergente

inico que, em baixas concentraes, ajuda a expor eptopos ou determinadas protenas

antignicas para melhorar o reconhecimento entre antgeno-anticorpo, o que, por

conseqncia, aumenta a sensibilidade na deteco de anticorpos. Esse tratamento

aparentemente no alterou o perfil protico viral de CAEV, mantendo-se similar ao

perfil-padro, contribuindo para aumentar a sensibilidade na relao entre antgeno viral

e antgeno celular (Torres et al., 2009).

H grande dificuldade em se determinar o verdadeiro status sanitrio do animal,

pois a CAE se trata de uma doena com progresso lenta e soroconverso muitas vezes

tardia (Castro et al., 1999). O IDGA e Elisa-i so os testes preconizados pela

Organizao Mundial de Sade Animal para o diagnstico sorolgico de infeco por

LVPR (OIE 2010). A tcnica de IDGA amplamente utilizada para o diagnstico do

CAEV, porm possui desvantagem devido possibilidade de permanncia de animais

infectados no rebanho, detectando somente animais com altos nveis de anticorpos

(Melo e Franke 1997; Pinheiro et al., 2001; Moura Sobrinho et al., 2010).

O teste de Elisa-i detectou 11,7% (26/222) de animais soropositivos enquanto que

apenas 4,5% (10/222) foram reagentes no IDGA (Tab.1).

Tabela 1. Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de Elisa-i e

IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. IDGA

Elisa-i

Positivo Negativo Total

Positivo 7 19 26 Negativo 3 193 196

Total 10 212 222 Sensibilidade: 70%; Especificidade: 91%; Valor preditivo positivo: 26,9%; Valor preditivo negativo:

98,5%; Concordncia: 90,1%; ndice kappa= 0,35; Qui-quadrado: 28,76.

51

O Elisa-i apresentou resultado superior ao teste de IDGA, sendo um teste mais

recomendado para deteco precoce. Torres et al. (2009) observaram que a

sensibilidade e especificidade do Elisa-i quando comparado ao IDGA foi de 73,3% e

84%, respectivamente. Em estudo semelhante concordncia desses testes foi de

97,43% (Cruz et al., 2009).

Das amostras testadas por WB observou que 30,6% (68/222) foram soropositivas.

Os valores estimados de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP),

valor preditivo negativo (VPN), concordncia, ndice Kappa e Qui-quadrado (2) quanto

a comparao dos resultados obtidos para os testes de WB e IDGA esto demonstrados

na Tab.2.

Tabela 2. Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e

IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. IDGA

Western

Blot

Positivo Negativo Total

Positivo 10 58 68 Negativo 0 154 154

Total 10 212 222 Sensibilidade: 100%; Especificidade: 72,6%; Valor preditivo positivo: 14,7%; Valor preditivo negativo:

100%; Concordncia: 73,9%; ndice kappa= 0,2; Qui-quadrado: 20,42.

Todas as amostras reagentes no IDGA concordaram com os resultados do WB,

mas trs no foram consideradas soropositivas para o ponto de corte estabelecido no

Elisa-i. Quando o WB e Elisa-i foram comparados, foi observada uma concordncia

entre os testes de 72,5% (Tab. 3).

Tabela 3. Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e

Elisa-i para deteco de anticorpos contra CAEV. Elisa-i

Western

Blot

Positivo Negativo Total

Positivo 22 46 68 Negativo 4 150 154

Total 26 196 222 Sensibilidade: 84,6%; Especificidade: 76,5%; Valor preditivo positivo: 32,4%; Valor preditivo negativo:

97,4%; Concordncia: 72,5%; ndice kappa= 0,36; Qui-quadrado: 37,56.

O WB conseguiu ser mais eficaz na deteco precoce quando comparada com os

outros mtodos aplicados neste estudo, mostrando uma sensibilidade de 100% e

especificidade 72,5% quando comparado ao IDGA, e de 84,6% e 76,5%

52

respectivamente em relao ao Elisa-i. Os dados mostraram significativos para o qui-

quadrado (p

53

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