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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR
PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINRIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS
VETERINRIAS
APOLIANA DE SOUSA RODRIGUES
PADRONIZAO E UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS
COMO FERRAMENTAS PARA CONTROLE DA ARTRITE
ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO LEITEIRO
SEMI-INTENSIVO
FORTALEZA
2012
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APOLIANA DE SOUSA RODRIGUES
PADRONIZAO E UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS
COMO FERRAMENTAS PARA CONTROLE DA ARTRITE
ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO LEITEIRO
SEMI-INTENSIVO
Dissertao apresentada ao Programa de Ps Graduao
em Cincias Veterinrias da Universidade Estadual do
Cear, como requisito parcial para obteno do grau de
Mestre em Cincias Veterinrias.
rea de Concentrao: Reproduo e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reproduo e sanidade de pequenos
ruminantes.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Ftima da Silva
Teixeira
FORTALEZA
2012
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4
APOLIANA DE SOUSA RODRIGUES
PADRONIZAO E UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS
COMO FERRAMENTAS PARA CONTROLE DA ARTRITE
ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO LEITEIRO
SEMI-INTENSIVO
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-
Graduao em Cincias Veterinrias da Faculdade de
Veterinria da Universidade Estadual do Cear, como
requisito parcial para a obteno do grau de Mestre em
Cincias Veterinrias.
Aprovada em: ____/_____/_____
BANCA EXAMINADORA
_______________________________
Profa. Dra. Maria Ftima da Silva Teixeira
Universidade Estadual do Cear
Orientadora
________________________________
Prof. Dr. Raymundo Rizaldo Pinheiro
EMBRAPA Caprinos e Ovinos/
Universidade Estadual Vale do Acara
Co-orientador/Examinador
________________________________
Prof. Dra. Alice Andrioli Pinheiro
EMBRAPA Caprinos e Ovinos/
Universidade Estadual Vale do Acara
Examinadora
5
O Universo, por si s, exige a existncia de um ser
superior que foi capaz de fazer dele uma realidade. Se
no h um Deus Criador, ento, fica difcil, seno
impossvel, explicar a existncia da vida.
Guttfried Wilhelm Leibnitz
6
AGRADECIMENTOS
A Universidade Estadual do Cear, ao Programa de Ps-Graduao em Cincias
Veterinrias (PPGCV) e ao Laboratrio de Virologia (LABOVIR) pela a oportunidade
que me foi dada para a realizao deste trabalho.
A CAPES pela bolsa concedida e ao CNPq pelo apoio financeiro, o qual foi
imprescindvel para o andamento desta pesquisa.
A Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria, Embrapa Caprinos e Ovinos, pela
concesso das condies tcnicas e estruturais para realizao deste estudo.
Ao meu criador, Deus. Sou muito grata pelas bnos recebidas, por guiar a minha vida
e por sempre renovar as minhas foras.
Aos meus pais, Rosa Maria e Francisco Fernandes por seu grande amor e dedicao, os
quais no mediram esforos para me ajudar.
Aos meus irmos, Lidiane, Juliana e Rafael por sempre torcerem por mim e se
alegrarem por mais uma conquista na minha vida.
Ao Adlio Costa pelo grande incentivo.
A Vernica Sousa, minha cunhada, por sempre estar pronta a me ouvir.
A profa. Dra. Maria Ftima pelo carinho, amizade e orientao.
Ao Dr. Raymundo Rizaldo pela a oportunidade de aprendizado que me concedeu ao
tempo que passei na Embrapa, o qual foi imprescindvel para o meu desenvolvimento
acadmico e pessoal. Obrigada pela confiana e auxlio.
Ao Ronaldo pela amizade, mensagens enriquecedoras e oraes.
A Roberta Lomonte pela ateno, pacincia, carinho e por tantas coisas que me ensinou
perto ou longe sempre me ajudou nos momentos que mais precisei. Obrigada!
A Dra. Alice Andrioli pela colaborao e ensinamentos prestados.
Ao prof. Dr. Isaac Neto pela ateno e contribuio.
A Samile Alves, ao Vanderlan Warlington e Daniele Timb pela companhia, grande
ajuda e momentos de descontrao.
A Lauana, por ser essa pessoa sempre prestativa.
Ao Thiago Sampaio, muito obrigada pelos ensinamentos e grande ajuda.
Ao Joo Ricardo que tambm muito me ajudou com sua sabedoria nas atividades do
laboratrio.
7
A Osmarilda, Dona Helena e Nbrega muito obrigada pelo auxlio profissional.
A Dalva Alana pela amizade e carisma.
Ao Leandro, Eduardo Lus, funcionrios do setor leiteiro da Embrapa, muito obrigada!
A todos os bolsistas e funcionrios da Embrapa.
A Dra. Edmara Chaves e profa. Dra. Lucia de Ftima, obrigada pela colaborao.
Aos que fazem parte do LABOVIR, Danilo Saraiva, Kelma Costa, Gabrielle Rosemblit,
Davila Aguiar, Rebeca Marinho, Igor Ciraco, Victor Manuel, Allan Bezerra,
Rosivaldo Jnior, Steffi Arajo, Expedito Maia e Elysngella, obrigada pela amizade e
auxlio.
Aos colegas de mestrado e aos professores do PPGCV muito obrigada pelos grandes
ensinamentos.
8
RESUMO
Este estudo teve como objetivo avaliar um programa de controle da CAE, em rebanho
leiteiro, utilizando testes sorolgicos. Para tanto, foram padronizadas as tcnicas de
Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i) e Western Blot (WB) a fim de diagnosticar
precocemente anticorpos contra o Vrus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV). A partir
das padronizaes realizadas testou-se 222 amostras de soro caprino, as quais tambm
foram avaliadas comparativamente com a prova de rotina, Imunodifuso em Gel de
Agarose (IDGA). Os testes de WB/IDGA, Elisa-i/IDGA e WB/Elisa-i foram
comparados estatisticamente, tendo apresentado sensibilidade de 100%, 70% e 84,6% e
concordncia de 73,9%, 90,1%, e 72,5%, concomitantemente. Desta forma, essas trs
tcnicas foram utilizadas para o acompanhamento de animais leiteiros com prticas de
manejo a fim de controlar a enfermidade. Foram realizadas sete coletas de sangue a
cada quatro meses em matrizes e reprodutores, utilizando os testes de IDGA, Elisa-i e
WB. As crias que tiveram parto assistido foram submetidas a coletas de sangue logo
aps o nascimento. Um total de 283 amostras de soro de neonatos foi analisado pelas
tcnicas de IDGA e WB. A prevalncia dos animais adultos foi de 6,8%, 14,9% e 39,2%
respectivamente por IDGA, Elisa-i e WB. Na ultima anlise detectou-se 1,9% no teste
de IDGA e 7,5% nos testes de Elisa-i e de WB. Dos 283 neonatos avaliados ao
nascimento, quatro apresentaram resultado positivo no teste de WB. Esses dados
revelam que os testes de Elisa-i e WB apresentaram melhores resultados quando
comparados a IDGA, sendo mais sensveis. O WB por sua vez se destacou como o
mtodo mais sensvel para o diagnstico precoce de anticorpos anti-CAEV, porm as
medidas de manejo aliadas as provas sorolgicas adotadas no foram suficientes para
erradicar a CAE, mas favoreceu uma reduo significativa de animais soropositivos no
rebanho estudado. Alm disso, apesar da baixa frequncia a transmisso vertical dos
Lentivrus de Pequenos Ruminantes (LVPR), ocorre.
Palavras-chave: CAEV, controle, diagnstico, Lentivrus de Pequenos Ruminantes.
9
ABSTRACT
This study aimed to evaluate a control program of CAE, in dairy herd, using serological
tests. For this, techniques of Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and
Western Blot (WB) were standardized to diagnose early antibodies the caprine arthritis
encephalitis virus (CAEV). From the patterning were tested 222 goat serum samples,
which were also evaluated by the test routine agarose gel immunodiffusion (AGID) for
comparison. Tests for WB/IDGA, ELISA/IDGA and WB/ELISA were compared
statistically, and presented a sensitivity of 100%, 70% and 84.6% and concordance of
73.9%, 90.1%, and 72.5% concomitantly. Thus, these three techniques were used for
tracking dairy animals with management practices control of disease. Seven surveys
serological were realized, every four months, with collected samples blood the bucks
and matrices, using the AGID tests, Elisa-i and WB. The kids who had delivery assisted
were subjected to blood draws, shortly after birth, 283 serum samples were analyzed by
the AGID and WB. The prevalence of adult animals was 6.8%, 14.9% and 39.2%,
respectively, for AGID, ELISA and WB. In the final analysis detected 1.9% in test
AGID and 7.5% in tests ELISA and WB. Of the 283 newborns evaluated the birth, four
were positive in the WB. These data show that the tests of ELISA and WB shows better
results when compared to AGID, being more sensitive. The WB in turn stood out as the
most sensitive method for early diagnosis of the disease, but the management practices
adopted allied with serologic tests were not sufficient to eradicate CAE, but favored to a
significant reduction of the disease in the herd studied. Furthermore, despite the low
frequency the vertical transmission of Small Ruminant Lentivirus (SRLV) occurs.
Keywords: CAEV, control, diagnostic, small ruminant lentivirus.
10
LISTA DE FIGURAS
REVISO DE LITERATURA
Figura 1 - Estrutura esquemtica dos LVPR (Borderas, 2004). .................................... 22
Figura 2 - RNA genmico do vrus da Artrite Encefalite Caprina (Olsen, 2001). ......... 23
Figura 3 - Aumento de volume articular em caprino infectado com o CAEV. .............. 25
Figura 4 - Mastite causada pelo vrus da CAE. .............................................................. 26
Figura 5 - Teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA) realizado em placas de
petri e em lminas de microscopia, orifcios preenchido com soro controle positivo,
soros teste e com antgeno para CAE. ............................................................................ 29
Figura 6 - Linhas de precipitao do teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA)
realizado com antgeno para CAE. ................................................................................. 29
Figura 7 - Teste de Elisa indireto realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos em placa
rgida. .............................................................................................................................. 31
Figura 8 - Teste de Western Blot (WB) realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos, padro
de protenas, controle positivo, controle negativo e soros testes. Amostra positiva
apresenta reao do mesmo peso molecular do padro (seta). ....................................... 32
Figura 9 - Separao da cria ao nascimento. .................................................................. 35
Figura 10 - Fornecimento de colostro termizado em cabrito recm-nascido. ................ 35
Figura 11 - Animal positivo identificado com brinco e colar. ....................................... 36
CAPTULO I
Figura 1 - Padronizao do Western Blot para diagnstico da Artrite-Encefalite
Caprina............................................................................................................................48
CAPTULO II
Figura 1 - Percentual de animais positivos detectados por IDGA, Elisa-i e WB em sete
levantamentos, com intervalo de quatro meses, em rebanho leiteiro semi-intensivo......61
11
LISTA DE TABELAS
CAPTULO I
Tabela 1 - Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de Elisa-i e
IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. ......................................................... 49
Tabela 2 - Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e
IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. ......................................................... 50
Tabela 3 - Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e
Elisa-i para deteco de anticorpos contra CAEV.......................................................... 50
CAPTULO II
Tabela 1 - Testes de IDGA e WB em cabritos imediatamente aps o nascimento.........64
12
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A - Ampre
Ag - Antgeno
AIEV - Vrus da Anemia Infecciosa Equina
BIV - Vrus da Imunodeficincia Bovina
CA - Capsdeo
CAE - Artrite Encefalite Caprina
CAEV - Vrus da Artrite Encefalite Caprina
CAPES - Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior
CE - Cear
CEUA - Comit de tica para Uso de Animais
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
DAB - Diaminobenzidine
DNA - cido desoxirribonucleico
dUTPase - Enzima codificada pelo gene pol
EDTA - Acido etilenodiaminatetraacetico
ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Elisa-i - Ensaio Imunoenzimtico Indireto
EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
env - Gene que codifica as protenas do envelope viral
FIV - Vrus da Imunodeficincia Felina
FUNCAP - Fundao Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientfico e
Tecnolgico
gag - Gene viral que codifica as protenas interna do vrus
GP Glicoprotena
HCl cido Clordrico
13
H2O2 - gua Oxigenada
H2SO4 - cido Sulfrico
HIV - Vrus da Imunodeficincia Humana
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica
IDGA - Imunodifuso em Gel de Agarose
IgG - Imunoglobulina G
IN - Integrase
JDV Vrus da Doena de Jembrana
KDa - Kilodaltons
LABOVIR - Laboratrio de Virologia
LTR - Sequncias Longas Repetidas
LVC Lentivrus Caprino
LVPR - Lentivrus de Pequenos Ruminantes
M - Molar
MA - Matriz
mg - Miligramas
MIN - Minuto
mL - Mililitros
mM - mili-molar
MN Membrana de Nitrocelulose
MSC - Membrana Sinovial Caprina
MVV - Vrus Maedi-Visna
Na2CO3 - Carbonato de Sdio
NaCl - Cloreto de Sdio
NaHCO3 - Bicarbonato de Sdio
NA2HPO4 Fosfato de Sdio Dibsico
14
NAH2PO4 Fosfato de Sdio Monobsico
NC - Nucleocapsdeo
nm - Nanmetro
C - Graus Celsius
ORF - Pequena regio do genoma viral
OIE - Organizao Mundial de Sade Animal
OPD - O-phenylenidiamine
PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis
PBS - Soluo de Tampo de Fosfato
PBS-T - PBS-Tween-20
PCR - Reao em Cadeia de Polimerase
PEG - Polietilenoglicol
pH - Potencial de Hidrognio
PM - Peso Molecular
PMSF - Phenylmethylsulphonyl fluoride
pol - Gene encontrado no genoma retroviral que codifica a transcriptase reversa
PP - Percentual de Positividade
PPGCV - Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias
PR Protease
rev - Gene de regulao viral
RNA - cido ribonucleico
SDS - Dodecil Sulfato de Sdio
SFB - Soro fetal bovino
SIV - Vrus da Imunodeficincia Smia
SN - Sobrenadante
SU - Glicoprotena de Superfcie
15
tat - Gene de regulao viral
TI Tampo de Incubao
TM - Glicoprotena Transmembrnica
tm - Trademark
TNE - Tampo Tris -HCl
TR Transcriptase Reversa
UCCS - Ultracentrifugao em Colcho de Sacarose
UECE - Universidade Estadual do Cear
V - Volts
vif - Gene de regulao viral
VPN - Valor Preditivo Negativo
VPP - Valor Preditivo Positivo
W - Watts
WB - Western Blot
g - Micrograma
L - Microlitro
m Micrmetro
g - Unidade da fora centrfuga relativa
2
- Qui-Quadrado
16
SUMRIO
RESUMO ......................................................................................................................... 8
ABSTRACT ..................................................................................................................... 9
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... 10
LISTA DE TABELAS ................................................................................................... 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................... 12
1 INTRODUO ......................................................................................................... 18
2 REVISO DE LITERATURA ................................................................................. 20
2.1 VISO GERAL DA CAPRINOCULTURA ...................................................................... 20
2.2 VRUS DA ATRITE ENCEFALITE CAPRINA ............................................................... 21
2.2.1 Classificao, morfologia e genoma .............................................................. 21
2.2.2 Replicao ...................................................................................................... 23
2.2.3 Resposta imune .............................................................................................. 24
2.2.4 Sinais clnicos ................................................................................................. 25
2.2.5 Transmisso .................................................................................................... 27
2.2.6 Diagnstico..................................................................................................... 28
2.2.6.1 Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA) ............................................. 28
2.2.6.2 Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i).............................................. 30
2.2.6.3 Western Blot (WB) .................................................................................. 31
2.2.6.4 Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) ................................................. 32
2.2.6.5 Isolamento viral ....................................................................................... 33
2.2.7 Tratamento ..................................................................................................... 33
2.2.8 Medidas de preveno e controle ................................................................... 33
3 JUSTIFICATIVA ...................................................................................................... 38
4 HIPTESE CIENTFICA ........................................................................................ 39
5 OBJETIVOS .............................................................................................................. 40
5.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................................. 40
5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ................................................................................ 40
6 CAPTULO I ............................................................................................................. 41
PADRONIZAO DO ELISA INDIRETO E WESTERN BLOT PARA
DIAGNSTICO DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA .................................. 42
RESUMO ....................................................................................................................... 42
ABSTRACT ................................................................................................................... 43
INTRODUO .............................................................................................................. 43
MATERIAL E MTODOS ............................................................................................ 44
RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 48
CONCLUSES .............................................................................................................. 52
AGRADECIMENTOS ................................................................................................... 52
17
REFERNCIAS ............................................................................................................. 52
7 CAPTULO II ............................................................................................................ 55
UTILIZAO DE TESTES SOROLGICOS COMO FERRAMENTAS PARA
CONTROLE DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA EM REBANHO
LEITEIRO .................................................................................................................... 56
RESUMO ....................................................................................................................... 56
ABSTRACT ................................................................................................................... 57
INTRODUO .............................................................................................................. 57
MATERIAL E MTODOS ............................................................................................ 59
RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................... 61
CONCLUSES .............................................................................................................. 67
AGRADECIMENTOS ................................................................................................... 68
REFERNCIAS ............................................................................................................. 68
8 CONCLUSES .......................................................................................................... 72
9 PERSPECTIVAS ....................................................................................................... 73
10 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .................................................................. 74
ANEXOS ....................................................................................................................... 86
ANEXO 1 - DECLARAO DO COMIT DE TICA ........................................................ 87
ANEXO 2 - COMPROVANTE DE SUBMISSO DE ARTIGO .............................................. 88
18
1 INTRODUO
A Artrite Encefalite Caprina (CAE) se enquadra no grupo dos Lentivrus de
Pequenos Ruminantes (LVPR) e necessita de vigilncia devido sua disperso mundial.
uma doena multissistmica crnica, com um longo perodo de incubao e evoluo
clnica lenta e progressiva (Franke, 1998). Alm de ser incurvel, pode ainda se
apresentar de forma assintomtica em muitos animais, tornando estes portadores do
vrus, o que favorece a disseminao da enfermidade.
Caprinos infectados com o Vrus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) podem
apresentar leses nas articulaes, pulmes, sistema nervoso e glndula mamria.
Entretanto, a que tem grande impacto econmico a forma mamria, porque
compromete a produo leiteira e a qualidade do leite, por aumentar a contagem de
clulas somticas e diminuir os nveis de gordura do leite (Greenwood, 1995; Brito,
2009; Carneiro, 2011). Esse vrus afeta caprinos de qualquer raa, sexo e faixa etria,
tendo sido observada uma crescente soroprevalncia com o avanar da idade (Jones et
al., 2000; Pinheiro et al., 2001; Radostits et al., 2002; Souza et al., 2005).
A disperso do CAEV vem causando diversas perdas, como a diminuio da vida
produtiva, predisposio para a ocorrncia de infeces bacterianas, sobretudo na
glndula mamria, crescimento deficiente ou aumento da taxa de mortalidade das crias e
diminuio da eficincia reprodutiva (Brito, 2009; Carneiro, 2011).
H uma grande preocupao de melhorar o controle dessa enfermidade,
especialmente em rebanhos leiteiros onde o ndice de casos mais elevado. Isso se deve
pela contaminao de crias por meio do colostro e leite de animais positivos, sendo a
via digestiva a principal fonte de transmisso natural do CAEV (Mselli-Lakhal et al.,
1999; Lamara et al., 2001). Alm desta, outras vias de infeco como secrees
salivares, respiratrias, intrauterina e sexual, tambm tm sido estudadas (Blacklaws et
al., 2004; Peterhans et al., 2004; Souza et al., 2012a).
O sucesso do controle depende de boas tcnicas de manejo, no qual visam
preveno da transmisso pelo leite, isolamento dos animais soropositivos (East, 1993),
e de testes diagnsticos mais sensveis (Pinheiro et al., 2010). Para isso, a sorologia
representa uma forma eficaz no diagnstico laboratorial, pois a presena de anticorpos
demonstra indiretamente a existncia de infeco (Castro, 1998). O diagnstico mais
19
rotineiramente utilizado o teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA), porm
outros testes sorolgicos como o ensaio imunoenzimtico indireto (Elisa-i) e o Western
Blotting (WB) tambm so empregados.
A IDGA indicada como teste de triagem, porque de fcil execuo e tem alta
especificidade (Varea et al., 2001). Sua desvantagem a sororreao tardia, pois s
detecta altos nveis de anticorpos. O teste Elisa-i considerado mais sensvel que o
IDGA, porm a sensibilidade e especificidade do teste depende da qualidade do
antgeno. J o WB considerado padro ouro para validao de outros testes, entretanto
uma tcnica bastante laboriosa (Zanoni et al., 1989)
A implantao de testes laboratoriais e boas prticas de manejo para controlar a
CAE so necessrias, pois ainda no existem tratamentos nem vacinas eficazes contra
essa enfermidade.
20
2 REVISO DE LITERATURA
2.1 Viso geral da caprinocultura
A regio Nordeste o local de maior concentrao de caprinos, correspondendo
a 90,61% de animais do rebanho nacional, sendo os Estados da Bahia, Pernambuco,
Piau, Cear e Paraba os que representam os maiores efetivos de caprinos (IBGE,
2009).
No entanto, o desempenho da caprinocultura nessa regio comprometido por
prticas comumente inadequadas de manejo alimentar, reprodutivo e sanitrio, bem
como pela ausncia de escriturao zootcnica e diagnstico tardio de diversas doenas
com etiologias diferentes, e que em sua maioria no so controladas de maneira
apropriada (Pinheiro et al., 2003; Brito, 2009; Carneiro, 2011).
A caprinocultura merece uma maior ateno a respeito da situao sanitria
desses animais, necessitando de maiores cuidados, o que pode repercutir na associao
do valor aos animais e seus produtos (Castro e Melo, 2001). Um dos problemas
sanitrios de relevncia a sndrome da Artrite Encefalite Caprina (CAE) (Silva et al.,
1996). Essa doena determinada pela infeco com o CAEV.
A introduo da CAE na Amrica do Sul ocorreu, possivelmente atravs das
importaes de animais de raas leiteiras estrangeiras, provenientes de rebanhos
europeus (Frana, Sua, Alemanha, Holanda, Inglaterra) e americanos (Estados
Unidos e Canad). Sua primeira descrio no Brasil foi feita no Rio Grande do Sul,
com identificao de caprinos soropositivos (Moojen et al., 1986). H tambm
registros de exames positivos em soros coletados, no Rio de Janeiro, no incio da
dcada de 80 (Cunha e Nascimento, 1995). Posteriormente sua presena foi
confirmada com o isolamento do vrus de caprinos (Castro et al., 1999; Feitosa et al.,
2007).
A disseminao do CAEV vem sendo difundida mundialmente, principalmente
em pases que praticam a caprinocultura leiteira intensiva (Crawford et al., 1981; East
et al., 1987), necessitando assim de constante vigilncia.
21
2.2 Vrus da Atrite Encefalite Caprina
2.2.1 Classificao, morfologia e genoma
O vrus da Atrite Encefalite Caprina (CAEV) pertence famlia Retroviridae,
subfamlia Lentivirinae, gnero Lentivrus (lenti em latim = lento) (Crawford et al.,
1980). Competem tambm a este gnero, o vrus Maedi-Visna (MVV), os vrus das
imunodeficincias felina (FIV), bovina (BIV), smia (SIV) e humana (HIV-1, HIV-2),
vrus da anemia infecciosa equina (AIEV) (Haase, 1986; Clements e Payne, 1994) e o
vrus da doena de Jembrana (JDV) (Burkala et al., 1998). No entanto, os dois
principais grupos filogenticos dos Lentivirus de Pequenos Ruminantes (LVPR) esto
representados pelos prottipos do CAEV e MVV (Shah et al., 2004).
Esses infectam caprinos e ovinos, respectivamente. So considerados patgenos
espcie-especficos, porm estudos evidenciaram que so capazes de contaminar ambas
as espcies (Pisoni et al., 2005; Ravazzolo et al., 2006; Souza et al., 2012a).
A estrutura desses Lentivrus de vrions envelopados de 80 a 100 nm de
dimetro contendo duas molculas idnticas de RNA e protenas estruturais (figura 1)
(Gonda et al., 1986; Joag et al., 1996; Jones et al., 2000). A poro viral mais externa
ligeiramente esfrica constituda por lipdios, onde se encontram inseridas diversas
glicoprotenas codificadas pelo vrus, apresentando ainda uma grande quantidade de
cidos silicos em sua superfcie, os quais promovem uma resistncia degradao do
vrus pelas enzimas proteolticas do trato gastrintestinal, o que possibilita a infeco
intestinal e facilita seu escape do controle humoral (Huso et al., 1988).
Os trs principais genes do genoma so expressos por gene gag, env, pol. As
glicoprotenas do gene env (envelope) so glicoprotenas de superfcie (SU) e
transmembranar (TM) que atuam na penetrao do vrus nas clulas. O ncleo cnico
e denso (Joag et al., 1996; Jones et al., 2000), o qual se constitui por produtos do gene
gag (antigeno grupo-especfico) protenas do capsdeo (CA), nucleocapsdeo (NC) e
matriz (MA). A regio pol (polimerase) codifica as protenas de atividade enzimtica:
transcriptase reversa, protease, integrase e dUTPase, alm de pequenos ORFs (open
reading frames) ou fases abertas de leitura, que codificam protenas que regulam a
22
expresso gnica como os genes acessrios (tat, vif), (ou Q) e (rev), codificantes de
protenas de regulao da expresso viral (Clements e Payne, 1994).
Figura 1 - Estrutura esquemtica dos LVPR (Borderas, 2004).
O genoma viral possui tamanho de aproximadamente 10Kb, formado por duas
regies terminais no codificantes (sequencias longas repetidas ou LTRs), localizadas
nas extremidades 5 e 3, as quais esto envolvidas na habilidade do vrus em sofrer
replicao em clulas distintas, contribuindo para o estabelecimento do tropismo celular
(Agnarsdttir et al., 2000; Clements e Payne, 1994). Entre essas regies extremas esto
os genes gag e pol, que so considerados os mais conservados, e o gene env que
bastante heterogneo (Narayan e Clements, 1989). Alm desses, o gene acessrio tat,
que essencial para a induo da patogenia, e rev e vif, os quais participam da
replicao viral (figura 2) (Harmache et al., 1995; Clements e Zink, 1996; Joag, 1996).
23
Figura 2 - RNA genmico do vrus da Artrite Encefalite Caprina (Olsen, 2001).
2.2.2 Replicao
O vrus possui tropismo principalmente pelas clulas do sistema monoctico-
fagocitrio que proporcionam a replicao viral e funcionam como meio de
distribuio. A replicao restrita permite que o vrus permanea latente nos
moncitos do hospedeiro e no seja detectvel pelo sistema imune (Pugh, 2004). A
replicao geralmente limitada por determinados fatores, entre os quais se destaca a
restrio que mediada por interferon, produzido por linfcitos ativados durante sua
interao com os macrfagos infectados. Contudo, o tropismo do vrus por clulas do
sistema imune, particularmente moncitos e macrfagos, o principal fator responsvel
pela habilidade dos lentivrus em causar infeces crnicas, que persistem por toda a
vida do animal (Pinheiro, 2001).
O lentivirus compartilham trs caractersticas gerais que promovem a
persistncia da infeco em seus hospedeiros. Primeiro, aps a transcrio reversa do
RNA viral nas clulas infectadas, o DNA proviral se integra ao genoma celular,
permitindo que o vrus escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro e preserve o
seu genoma. Segundo, se multiplicam em clulas do sistema imunolgico,
normalmente responsveis pela eliminao de clulas infectadas, assim, o hospedeiro
no consegue desenvolver resposta imunolgica curativa (Narayan et al., 1997,
Callado et al., 1999).
Terceiro, esses vrus acumulam altas taxas de mutao durante o processo de
replicao, devido a falhas da transcriptase reversa em corrigir as novas sequncias de
nucleotdeos, resultando em variabilidade gentica e, consequentemente fenotpica.
Alm disso, a restrio da expresso viral, sem produo de partculas virais, permite
24
que as clulas infectadas pelo vrus escapem do sistema imunolgico do hospedeiro
(Cheevers et al., 1993; Narayan et al., 1997).
2.2.3 Resposta imune
O CAEV est associado covalentemente com as glicoprotenas TM, denominada
de gp 45, e de SU gp135; com o CA cuja protena a p28, com peso molecular em
torno de 28 a 30 KDa; com o NC, que uma pequena protena que interage com o
RNA do vrus e MA, que est situada entre o CA e o envelope, possuindo protena
com peso de cerca de 16 KDa (p16). contra a protena do CA que ocorre a primeira
resposta imune detectada em torno da terceira semana aps infeco e por volta da
quinta semana so produzidos anticorpos para as protenas do NC, MA, TM e SU
(Concha-bermejillo et al., 1995; Pepin et al., 1998; Hirsh e Zee, 2003).
Dentre as protenas citadas, duas esto mais diretamente envolvidas com a
produo de anticorpos pelo hospedeiro: uma glicoprotena do envelope, de peso
molecular de 135 kDa (gp135), e uma nucleoprotena de peso molecular de 28 kDa
(p28) (Gogolewski et al., 1985; Johnson et al., 1983; Knowles et al., 1991).
A resposta celular caracterizada pela proliferao de linfcitos T CD4+
(Reyburn et al., 1992b) e T CD8+ (Lichtensteiger et al., 1993; Blacklaws et al., 1994)
que so responsveis pela destruio de clulas infectadas, porm no destroem as que
no expressam as protenas vricas. Os anticorpos passivos adquiridos pela ingesto de
colostro persistem em nveis detectveis no soro de cabritos por menos de seis meses
(Adams et al., 1983; Cutlip et al., 1988).
O alto grau de variabilidade gentica do vrus, como evidenciado pela gerao de
uma populao altamente divergente de genoma viral nos indivduos infectados pode
ser relatado como um dos fatores da persistncia viral (Clements et al., 1988). Estas
variantes escapam da ao do sistema de defesa do hospedeiro (Knowles et al., 1990). E
o vrus capaz de replicar-se independentemente da sntese de DNA celular, fazendo
com que a clula o hospede por longos perodos (Klevjer-Anderson e Cheeveres, 1981).
25
2.2.4 Sinais clnicos
A presena de leses nas articulaes, pulmo, sistema nervoso e glndula
mamria so indicativos infeco por Artrite Encefalite Caprina. Mesmo o CAEV
causando infeces persistentes, os animais podem no apresentar sintomatologias.
Porm em aproximadamente um tero desses, h um progresso para uma ao
inflamatria degenerativa nesses rgos-alvo, causando perda de peso e debilidade at a
morte (Pisoni et al., 2007).
A forma articular, por ser mais comum, considerada a mais importante,
geralmente observada em animais com mais de oito meses de idade. Com o avanar da
enfermidade o animal apresenta aumento de volume da articulao (figura 3),
claudicao intensa e dificuldade de locomoo. As articulaes crpicas so as mais
afetadas, j as do jarrete, a patelar e a atlanto-occiptal so acometidas com menor
frequncia (Crawford e Adams, 1981; Oliver et al., 1981; Gonzalez et al., 1987; Cutlip
et al., 1988).
Figura 3 - Aumento de volume articular em caprino infectado com o CAEV.
Quanto apresentao pulmonar bastante rara e de pouca gravidade. Os
sintomas so tosse, dispnia aps exerccios fsicos, taquipnia, consolidao
pulmonar, som mido auscultao e comprometimento do estado geral (Narayan e
Cork, 1985, Cutlip et al., 1988; Pereira, 1995).
A sintomatologia nervosa da CAE ocorre mais frequentemente em crias e,
ocasionalmente em adultos. Os sinais incluem ataxia secundria uni ou bilateral. Neste
estgio os cabritos apresentam dificuldade em abduzir os membros posteriores, que
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progride para uma paralisia ascendente e paresia total dos posteriores, evoluindo para
tetraplegia. Com a evoluo da enfermidade, os cabritos se tornam cegos, apresentam
rotao, desvio e balanceios de cabea, que pode se manter voltada para cima ou em
outra posio, paralisia facial e opisttono (Radostits et al., 2002; Pugh, 2004).
Na forma mamria as cabras podem desenvolver mamite aguda ou crnica (Figura
4). Essa se instala durante a lactao e caracteriza-se por uma mamite intersticial com
endurecimento do bere, em que a consistncia da glndula mamria apresenta-se dura
palpao, embora o aspecto do leite esteja aparentemente normal. Aquela por sua vez
observada no incio da lactognese, ocorrendo um endurecimento no edematoso do
rgo, com baixa ou nenhuma produo leiteira (Peretz et al., 1993, Lara et al., 2005).
Figura 4 - Mastite causada pelo vrus da CAE.
Essa forma clnica traz grande preocupao ao caprinocultor, pois o CAEV est
diretamente relacionado com a produo leiteira na qual diminui significativamente
(Konishi et al., 2011). Alm disto, o vrus pode indiretamente reduzir os nveis de
gordura do leite. Como este componente est ligado ingesto de forragem, foi
observado que cabras com aumento no ndice articular apresentam dificuldade em
pastejar e produziram leite com menos gordura e consequentemente menos slidos
totais (Brito, 2009).
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27
2.2.5 Transmisso
Pesquisas para elucidar as formas de transmisso do CAEV vm sendo
largamente estudadas a fim de estabelecer eficientes programas de controle das
lentiviroses de caprinos e ovinos (Pinheiro, 2001).
A transmisso do CAEV pode ser classificada de duas formas, vertical ou
horizontal direta e indireta (Blacklaws et al., 2004). A forma horizontal pode ser
intensificada em rebanhos infectados quando se aumenta a concentrao de animais,
pois quanto maior a aproximao desses animais maior a probabilidade de contato com
secrees contendo macrfagos ou moncitos infectados (Narayan et al., 1983).
Materiais como sangue, leite ou colostro contem clulas do sistema moctico-
fagocitrio e so comumente analisados por serem vias passveis de infeco. Alm
dessas clulas, as clulas epiteliais, presentes nas secrees lcteas cuja infeco pelos
lentivrus pode ocorrer in vitro e in vivo podem contribuir para transmisso da infeco
aos animais lactentes (Mselli-Lakhal et al., 1999). As clulas endoteliais e clulas do
fibroblasto tambm so permissivas infeco in vivo (Carrozza et al., 2003).
A transmisso horizontal ocorre pelo contato com fludos nasais e orais contendo
os vrus ou clulas infectadas (Zink e Johnson, 1994). A principal fonte de transmisso
da enfermidade por meio da via digestiva com ingesto do colostro e/ou leite de
cabras infectadas (Rowe et al., 1992).
A transmisso de forma vertical pode ocorrer, por via transplacentria ou
intrauterina, visto que o vrus est presente no fluido uterino (Andrioli, 2001). O DNA
pr-viral tambm foi detectado no oviduto e ovrio (Fieni et al., 2003), nas clulas do
cumulus oophorus (Ali Al Ahamad et al., 2005) em clulas do crtex ovariano, folculos
pr-antrais (Silva, 2006), em smen (Andrioli et al., 1999; Travassos et al., 1999; Paula
et al., 2009), como tambm no canal vaginal, neste ltimo caso possibilitando a ingesto
de fluidos maternos contaminados pela cria (Adams et al., 1983; Ellis et al., 1986; East
et al., 1993).
Diante das formas de transmisso j estabelecidas a implantao de programas de
controle baseados somente na transmisso por leite e colostro entre a me infectada e
sua prole so limitados, necessitando da adio de outros mtodos de controle que
considerem um maior espectro de vias de infeco (Pinheiro et al., 2001a).
28
2.2.6 Diagnstico
possvel observar que muitos animais infectados no apresentam sintomatologia
clnica, porm permanecem soropositivos durante toda a sua existncia (Cutlip et al.,
1992). Os exames clnicos no so suficientes para detectar um animal como positivo
para CAE, o que tambm pode ser confundido com outras enfermidades. Devido a isso
necessrio a realizao de testes laboratoriais (Oliveira, 2006).
Caprinos infectados podem ser detectados com base na presena de anticorpos
antivirais no soro, pela deteco de protenas ou do cido nuclico, alm do isolamento
viral (Demartini et al., 1999). Devido praticidade na coleta de amostras e baixo custo,
a deteco de anticorpos o mtodo mais empregado para diagnosticar a infeco
(Knowles, 1997). No entanto, a resposta de anticorpo em cada caprino infectado pelo
CAEV varia ao longo do tempo, e muitos animais infectados mostram sororeao
intermitente ou um atraso na soroconverso aps a infeco (Mackenzie et al., 1987;
Rimstad et al., 1993; Hanson et al., 1996), havendo a necessidade de provas sorolgicas
sensveis para obteno de um diagnstico precoce.
Dentre as tcnicas laboratoriais, os mtodos de diagnsticos indiretos
(sorolgicos) podem ser realizados por meio das tcnicas de Imunodifuso em Gel de
Agarose (IDGA), Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i) e Western Blot (WB), e os
mtodos diretos podem ser aplicados pela Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) e
isolamento viral.
2.2.6.1 Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA)
O IDGA possui alta especificidade, sendo considerado como padro no
diagnstico de triagem (Varea et al., 2001). o mtodo mais utilizado para a deteco
de anticorpos contra os lentivrus e caracteriza-se por ser barato e de fcil
aplicabilidade no campo (Pinheiro et al., 2006a).
A tcnica baseia-se na formao de complexos antgeno-anticorpo que se
insolubilizam e precipitam no gel, em uma placa de Petri ou em uma lmina de
microscopia (figura 5), onde se desenvolve a linha de precipitao visvel entre os
29
orifcios no ponto em que alcanada a relao tima entre antgeno e anticorpo
(figura 6) (Roitt et al., 1998; Tortora et al., 2000).
Figura 5 - Teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA) realizado em placas de
petri e em lminas de microscopia, orifcios preenchido com soro controle positivo,
soros teste e com antgeno para CAE.
Figura 6 - Linhas de precipitao do teste de Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA)
realizado com antgeno para CAE.
Um resultado negativo no IDGA no descarta uma possvel infeco, pois pode
ocorrer uma demora significativa entre a infeco e a produo de anticorpos, como
tambm pode acontecer que em alguns caprinos acometidos exista expresso
insuficiente do vrus para ocasionar uma resposta humoral (Mcguire et al., 1990;
Hanson et al., 1996). Assim a grande desvantagem desse teste, detectar somente altos
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nveis de imunoglobulinas, o que permite a ocorrncia de falso-negativos no rebanho
(Andrioli et al., 2006a; Tigre et al., 2006).
Para o monitoramento de um rebanho essa tcnica importante para verificar a
presena do agente infeccioso. De acordo com os dados de Pinheiro et al. (2001a) a
prevalncia da CAE em rebanhos leiteiros no Estado do Cear foi de 4,6% (37/810), j
Sobrinho et al. (2009) relatou que a prevalncia no Estado de Tocantins foi de 2,7%
(23/843) de animais positivos. Esses dados confirmam que essa enfermidade encontra-
se disseminada em todo territrio brasileiro, indicando, portanto a importncia da
necessidade da implantao de medidas de controle das lentiviroses.
2.2.6.2 Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i)
O IDGA e Elisa-i so os testes preconizados pela Organizao Mundial de Sade
Animal para o diagnstico sorolgico de infeco por LVPR (OIE 2006). O Elisa-i
usado para a deteco e/ou quantificao de anticorpos em amostras de soro a partir da
utilizao de anti-anticorpos marcados com enzimas (figura 7). A especificidade dessa
prova garantida principalmente pela qualidade do antgeno adsorvido placa
(Madruga et al., 2001). considerado um teste bastante sensvel que requer cuidados
quanto padronizao da tcnica.
Recentemente, foi demonstrado que o Elisa-i pode ser realizado com antgeno
produzido por microfiltrao seriada com uso do sistema de filtrao AMICON, para
separao da poro referente protena p28 do capsdeo, no qual mostrou-se alm do
custo reduzido uma alta sensibilidade e boa especificidade, podendo ser comparado
com outros kits de diagnstico Elisa-i disponveis para comercializao nacional e
internacional (Alves et al., 2012)
31
Figura 7 - Teste de Elisa indireto realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos em placa
rgida.
Ao comparar ELISA e IDGA verificou-se que a tcnica de ELISA detectou
animais com baixos nveis de anticorpos o que no ocorreu com a IDGA. O ELISA
obteve assim uma sensibilidade de 93,93% e especificidade de 100%. A concordncia
entre os testes foi de 97,43%, demonstrando um bom desempenho. Ainda assim, cogita-
se a necessidade de mais estudos para o desenvolvimento de tcnicas de diagnsticos
mais eficazes para facilitar a identificao da CAEV e possibilitar maior identificao
de focos de infeco no rebanho nacional (Cruz et al., 2009).
2.2.6.3 Western Blot (WB)
A tcnica de WB consiste na imunodeteco de protenas em filtro de
nitrocelulose pela reao com anticorpos especficos desenvolvidos para reconhecer o
polipeptdio em exame. O anticorpo especfico adicionado membrana e deixado
reagir por certo perodo de tempo, aps o qual uma frao de anticorpo fica retida na
regio da membrana que contm o polipeptdeo especfico (Brgido, 2003).
Esse anticorpo adsorvido especificamente sobre o polipeptdio detectado com
um anti-soro, ou seja, um anticorpo anti-anticorpo especfico (conhecido tambm de
segundo anticorpo ou conjugado) que foi quimicamente modificado pelo acoplamento
covalente de uma ou mais molculas de uma enzima. Esse reagente serve para detectar
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o anticorpo especfico e permite a sua visualizao em razo da atividade enzimtica
associada (figura 8). Devido utilizao de anticorpos acoplados a enzimas e
substratos sintticos coloridos, esse teste tambm conhecido como ensaio
imunoenzimtico (Brgido, 2003).
Figura 8 - Teste de Western Blot (WB) realizado na Embrapa Caprinos e Ovinos,
padro de protenas, controle positivo, controle negativo e soros testes. Amostra
positiva apresenta reao do mesmo peso molecular do padro (seta).
O WB classificado como teste complementar, sendo denominado padro ouro
na validao de outros testes. Apresenta como vantagem menor ocorrncia de reaes
inespecficas, o que reduz o aparecimento de resultados falso-positivos (Zanoni et al.,
1989). O seu alto custo e a necessidade de um tempo mais extenso para obteno do
resultado so desvantagens em relao s outras tcnicas.
2.2.6.4 Reao em Cadeia de Polimerase (PCR)
Mtodos de diagnsticos diretos podem ser aplicados por meio da tcnica de
Reao em cadeia de polimerase (PCR) na qual permite a identificao por
amplificao direta de parte especfica do cido nuclico viral contido em fluidos e
tecidos de um animal infectado (Pinheiro, 2001). capaz de detectar animais com
infeco recente ou que ainda no soroconverteram, alm de detectar microrganismos
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em estado latente, mortos ou que estejam unidos ao material gentico do hospedeiro,
porm uma tcnica que requer equipamentos especiais e tcnicos qualificados
(Andrioli et al., 2006b; Tigre et al., 2006).
2.2.6.5 Isolamento viral
aplicvel ao diagnstico de quase todas as viroses de interesse veterinrio
inclusive da CAE, com capacidade de detectar quantidades mnimas de vrus, sendo
considerado um teste padro de diagnstico em virologia. Existem, no entanto,
algumas restries, uma vez que uma tcnica demorada, dispendiosa, necessita da
implantao de cultivos celulares especiais e, alm disso, incapaz de detectar vrus
que no causem efeito citoptico (Knowles, 1997; Dantas, 2004).
2.2.7 Tratamento
O princpio de vacinas virais clssicas como varola, sarampo evitar o
desenvolvimento da doena clnica atravs da memria imunolgica que garantir a
defesa do indivduo vacinado. No caso dos retrovrus ainda no foi possvel tais aes.
Desta forma, ainda no foi relatado na literatura tratamento nem vacinas eficazes
contra a CAE (Castro, 1998; Jnior et al., 2009).
2.2.8 Medidas de preveno e controle
O controle de qualquer enfermidade baseia-se na reduo da morbidade e
mortalidade da doena. Esse mtodo tambm considerado um termo geral que
abrange todas as medidas com as quais se deseja interferir na ocorrncia ilimitada de
uma doena, qualquer que seja sua causa. Pode ser alcanado por meio do tratamento
de animais doentes, reduzindo a prevalncia da enfermidade e pela preveno da
doena, diminuindo tanto a incidncia quanto a prevalncia (Done, 1985).
Para tanto, o manejo sanitrio de grande importncia em qualquer sistema
pecurio produtivo, pois a ausncia de enfermidades evita perdas na produo.
Atualmente sabe-se que as doenas crnicas so as que mais contribuem para a reduo
34
da produtividade, impedindo que os animais atinjam a totalidade do seu potencial
produtivo (Modolo et al., 2003). Portanto, em primeira anlise necessrio levantar a
prevalncia das doenas. Nos rebanhos que apresentam uma alta prevalncia deve-se
reduzir esse quadro para baixa prevalncia. Aps essa fase, estratgias devem ser
estabelecidas para erradicar a infeco no rebanho (Peterhans et al., 2004).
A ausncia de meios teraputicos para a CAE torna as prticas de manejo e as
tcnicas de diagnstico os mtodos recomendados para controle dessa enfermidade. No
caso de rebanhos leiteiros a vigilncia mais complexa e trabalhosa principalmente
por que os animais permanecem mais tempo em contato direto uns com os outros do
que em sistemas de criao extensivos (Joag et al., 1996). No entanto, uma das formas
mais importantes de controle se d pelo correto manejo das crias aps o parto, a fim de
se evitar a transmisso pelo colostro e/ou leite de cabras infectadas (Radostits et al.,
2002).
Aproximadamente 69% das infeces pelo CAEV ocorrem pela ingesto de leite
ou colostro contaminado e os 31% restantes devem ser creditadas a outras vias de
infeco (Rowe et al., 1991). Alm das clulas do sistema moctico-fagocitrio que
esto presentes no leite e que conhecidamente so responsveis pela transmisso dos
LVPR, as clulas epiteliais presentes nas secrees lcteas so permissivas infeco
pelos lentivrus in vitro e in vivo, podendo contribuir para transmisso da infeco aos
animais lactentes (Mselli-Lakhal et al., 1999).
Para diminuir a disseminao do vrus em rebanhos leiteiros, os cabritos devem
ser separados de suas mes logo ao nascimento (figura 9) e ser alimentados com
colostro (figura 10) e leite termicamente tratados (Reilly et al., 2002). O tratamento
trmico deve ser a 56C por uma hora para inativar o vrus. Aps a termizao o
colostro deve ser congelado e armazenado para formao de um banco, para um
posterior fornecimento aos animais. Deve ser fornecido em mamadeiras individuais,
vontade, trs vezes ao dia durante as primeiras 36 horas de vida (Gouveia, 1996;
Bomfim et al., 2006). Alguns autores recomendam ainda o estabelecimento de um
banco de colostro de vacas, pois uma fonte rica de IgG e livre do vrus (Argello et
al., 2004).
35
Figura 9 - Separao da cria ao nascimento.
Figura 10 - Fornecimento de colostro termizado em cabrito recm-nascido.
Outra medida de controle a identificao de animais soropositivos (figura 11),
esses devem ser mantidos em instalaes isoladas com o intuito de evitar o contato
fsico com os no infectados ou descartar os soropositivos do rebanho (Radostits et al.,
2002). A identificao pode ser feita com o uso de cordes e utenslios de uso no
manejo em cores distintas para animais soropositivos e soronegativos (Carneiro, 2011).
Deve-se tambm impedir a entrada de animais infectados no plantel (Castro, 1998),
estabelecer uma linha de ordenha onde as fmeas soropositivas e/ou suspeitas sejam
ordenhadas por ltimo (Oliveira, 2006), realizar monta com bodes negativos ou ainda
as cabras devem ser inseminadas com smen livres do vrus (Smith, 1993).
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Figura 11 - Animal positivo identificado com brinco e colar.
Com a finalidade de evitar perdas de material gentico provocada pelo descarte
dos animais doentes, programas de controle buscam a obteno de crias de animais
enfermos antes de descart-los (Pinheiro et al., 2001a), uma vez que o comrcio de
material de multiplicao animal, que em muitos casos imprescindvel para
manuteno ou aumento da produtividade pecuria, no est isento de riscos (Carvalho
et al., 2007). Desta forma, vrias biotcnicas so utilizadas na reproduo animal,
visando preservao de smen, folculos ovarianos e embries de animais
geneticamente melhorados (Silva e Lima, 2007).
A deteco do DNA pr-viral do CAEV no smen fundamental para o programa
de controle da CAE, considerando-se o risco de transmisso por meio de infectados,
utilizado em monta natural ou inseminao artificial (IA). Segundo Andrioli et al.
(2006a), o dano testicular um fator que influencia significativamente a presena do
lentivrus no smen, e a lavagem apenas reduz a presena, mas no suficiente para
elimin-lo.
As medidas de controle para LVPR vem sendo adotadas em vrios pases (Rowe
et al., 1999). A Europa iniciou uma erradicao da MVV em pases baixos no incio da
dcada de 80, a qual foi bem sucedida. No entanto, a Irlanda no est livre de CAEV de
acordo com as estatsticas da OIE (Nuotio, 2006). Os mtodos aplicados nestes
programas forneceram muitas informaes sobre o controle das LVPR, no somente em
ovelhas, mas tambm em cabras. A partir de ento vrios outros programas similares
foram desenvolvidos como na Frana, Itlia, Alemanha, Espanha, Filndia e Sua
(Sihvonen et al., 2000).
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No Japo foi realizado, durante quatro anos, um programa de erradicao contra a
CAE. O programa utilizou trs estratgias, primeira, remoo de cabrito imediatamente
aps o parto, segunda, separao de cada nova gerao e terceira, abate de caprinos
positivos em testes (IDGA e PCR) peridicos. O conjunto desses permitiu o
estabelecimento de um rebanho livre de caprinos infectados pelo CAEV (Konishi et al.,
2011). Relatos demonstram que o nmero de caprinos e ovinos no rebanho pode ser um
fator de risco para a infeco das LVPR (Brlisauer et al., 2005). No caso do Japo, por
exemplo, o nmero de caprinos mantidos < 20.000, provavelmente esse fator tenha
contribudo para um melhor controle da enfermidade, o que favoreceu para que o
programa terminasse com xito.
Segundo apontamentos de Nuotio (2006), a separao de crias ao nascimento e o
fornecimento de colostro termizado so aes viveis como medidas temporrias, como
por exemplo, para preservar valores genticos. J a aplicao de testes peridicos e o
abate de animais soropositivos praticamente a nica abordagem efetiva nos rebanhos.
38
3 JUSTIFICATIVA
A CAE uma enfermidade de carter crnico e debilitante. Estudos sobre os
prejuzos diretos causados por esta doena ainda so limitados, mas os resultados
disponveis indicam que, ocorrem perdas produtivas como: diminuio da produo
lctea; dos nveis de gordura e de slidos totais do leite; reduo do perodo de
lactao; crescimento deficiente ou aumento da taxa de mortalidade das crias e
diminuio da eficincia reprodutiva. Alm da predisposio verminose
gastrintestinal por Haemonchus spp. e a ocorrncia de infeces bacterianas,
especialmente na glndula mamria; (Greenwood, 1995; Pinheiro et al., 1999; Andrioli
et al., 2003; Turin et al., 2005; Lilenbaum et al., 2007; Brito, 2009; Carneiro, 2011).
As perdas indiretas referem-se desvalorizao dos rebanhos, reposio precoce
dos animais que desenvolvem sintomas, despesas com o controle, comprometimento
das barreiras comerciais para matrizes, reprodutores, smen e embries (Andrioli et al.,
2003).
Diante das perdas mencionadas causadas pela CAE, ausncia de meios
teraputicos e presena de animais assintomticos nos rebanhos, torna-se importante a
implantao de programas de controle utilizando testes de diagnsticos mais sensveis
para deteco precoce de animais soropositivos bem como o emprego de boas prticas
de manejo.
39
4 HIPTESE CIENTFICA
Programas de controle que empregam prticas de manejo que visam inibir a
propagao do vrus em rebanho infectado pela CAE aliadas as tcnicas sensveis de
diagnstico indiretas como ELISA e Western Blot so eficazes no controle do CAEV.
40
5 OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar um programa de controle da CAE, em rebanho leiteiro, utilizando testes
sorolgicos.
5.2 OBJETIVOS ESPECFICOS
Padronizar tcnicas de Elisa-i e de WB;
Comparar as tcnicas de diagnstico para Artrite Encefalite Caprina;
Controlar a CAE em um rebanho leiteiro baseado em prticas que impeam a
propagao do CAEV e em testes peridicos de IDGA, Elisa-i e WB.
Diagnosticar por meio de IDGA e WB se as crias recm-nascidas apresentam
anticorpos anti-CAEV.
Avaliar a transmisso transplacentria (vertical).
41
6 CAPTULO I
PADRONIZAO DO ELISA INDIRETO E WESTERN BLOT PARA
DIAGNSTICO DA ARTRITE-ENCEFALITE CAPRINA
(Standardization of indirect ELISA and Western Blot for diagnosis of caprine
arthritis-encephalitis)
Peridico: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia (Submetido em
outubro de 2012).
42
Padronizao do Elisa indireto e Western Blot para diagnstico da Artrite-
Encefalite Caprina
[Standardization of indirect ELISA and Western Blot for diagnosis of Caprine
Arthritis-Encephalitis]
A.S. Rodrigues1, R.L.L. Brito
2, R.R. Pinheiro
3, R.P. Dias
1, S.M. Alves
4, T.S. Souza
5,
K.C. Souza1, D.A.A. Azevedo
4, A. Andrioli
3, D.C.T. Magalhes
6, M.F.S. Teixeira
1*
1Faculdade de Veterinria - Universidade Estadual do Cear - Fortaleza, CE
* Endereo: Av. Paranjana, 1700, Fortaleza-CE, Cep: 60740-903, e-mail: [email protected]
2 Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias Universidade Estadual Paulista Jaboticabal, SP
3Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria, Embrapa Caprinos e Ovinos Sobral, CE
4Departamento de Cincias Biolgicas e Agrrias Universidade Estadual Vale do Acara, Sobral, CE
5Escola de Medicina Veterinria e Zootecnia - Universidade Federal da Bahia Salvador, BA
6Agncia de Defesa Agropecuria do Estado do Cear ADAGRI, Sobral, CE
RESUMO
Artrite-Encefalite Caprina (CAE) diagnosticada rotineiramente pela tcnica de
Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA), que considerada pouco sensvel.
Objetivou-se com este estudo padronizar testes de Elisa-i e Western Blot (WB) para
deteco de baixos nveis de anticorpos em caprinos contra CAEV e comparar os
resultados obtidos nesses testes com a prova de IDGA. Para a padronizao dos testes
Elisa-i e WB utilizaram-se diferentes concentraes e diluies de antgeno, soros e
conjugado. No Elisa-i adotou-se microplacas rgidas com 96 poos, sendo a combinao
de concentrao de 0,5g/poo de antgeno e diluies de 1:100 de soro e 1:1500 de
conjugado a que apresentou melhor resultado. No WB foi utilizado membranas de
nitrocelulose, definindo-se as diluies de 1:50 de soro e 1:15000 de conjugado. Para
avaliar o desempenho das tcnicas, 222 amostras de soro caprino foram testadas e os
dados obtidos foram comparados com o IDGA. A soropositividade do WB, Elisa-i e
IDGA foram de 30,6%, 11,7% e 4,5%, concomitantemente. A concordncia de Elisa-
i/IDGA, WB/IDGA e WB/Elisa-i foi de 90,1%, 73,9% e 72,5%, respectivamente. As
mailto:[email protected]
43
tcnicas de Elisa-i e WB apresentaram-se mais sensveis que a IDGA, podendo ser
utilizadas como ferramentas para o diagnstico precoce da CAE.
Palavras-chave: infeco, LVPR, testes sorolgicos.
ABSTRACT
Caprine arthritis-encephalitis (CAE) is routinely diagnosed by the technique of Agarose
Gel Immunodiffusion (AGID), which is considered sensitive low. The objective of this
study was to standardize testing i-ELISA and Western Blot for early detection of
antibodies against CAEV in goats and compare the results obtained in these tests with
proof of AGID. For standardization of i-ELISA and WB were used different
concentrations and dilutions of antigen, sera and conjugate. In the i-ELISA, was
adopted rigid microplate with 96 wells, the combination that showed the best result was
concentration of 0.5g/ well of antigen and dilutions of the serum of 1:100 and
conjugate of 1:1500. In the WB was used nitrocellulose membranes, was defining the
dilutions of the serum of 1:50 and conjugate of 1:15000. To evaluate the performance of
the techniques, 222 goat serum samples were tested and the data were compared with
the AGID. Seropositivity of the WB, i-ELISA and AGID were 30.6%, 11.7% and 4.5%,
concomitantly. The agreement i-ELISA/AGID, WB/AGID and WB/i-ELISA was
90.1%, 73.9% and 72.5%, respectively. The techniques of i-ELISA and WB were more
sensitive than the AGID and can be used as tools for early diagnosis of CAE.
Keywords: infection, serological tests, SRLV.
INTRODUO
Vrus da Artrite Encefalite Caprina (CAEV) infecta caprinos de qualquer raa,
sexo e idade, possui extenso perodo de incubao e se enquadra no grupo dos
Lentivrus de Pequenos Ruminantes (LVPR), necessitando de vigilncia epidemiolgica
constante devido sua disperso mundial (Franke, 1998).
Artrite-Encefalite Caprina (CAE) causada por esse vrus considerada uma
enfermidade multissistmica crnica, incurvel, com evoluo clnica lenta e
44
progressiva. Os sinais clnicos so: artrite, com aumento do volume das articulaes;
pneumonia com dificuldade respiratria; encefalite com paresia e paralisia; mastite
indurativa com nodulaes no bere (Greenwood, 1995).
A tcnica laboratorial mais comumente utilizada para diagnstico da CAE a
Imunodifuso em Gel de Agarose (IDGA), que no muito sensvel (McConnell et al.,
1998) e baseia-se na formao de complexos antgeno-anticorpo que se insolubilizam e
precipitam no gel, sob uma base rgida, onde se desenvolve a linha de precipitao
visvel entre os orifcios no ponto em que alcanada a relao tima entre antgeno e
anticorpo (Varea et al., 2001).
Seguido do Ensaio Imunoenzimtico Indireto (Elisa-i) que usado para a
deteco e/ou quantificao de anticorpos em amostras de soro, com destaque em
estudos soroepidemiolgicos. A especificidade dessa prova garantida principalmente
pela qualidade do antgeno adsorvido placa (Madruga et al., 2001) e considerado um
teste bastante sensvel que requer cuidados quanto padronizao da tcnica.
Como padro ouro na validao desses testes, tem-se o Western Blot (WB) ou
immunoblotting, que classificado como um teste complementar. Apresenta como
vantagem menor ocorrncia de reaes inespecficas, o que reduz o aparecimento de
resultados falso-positivos (Zanoni et al., 1989).
Devido aos prejuzos causados pela CAE (Greenwood, 1995; Brito, 2009;
Carneiro, 2011) e considerando que a sorologia por IDGA apresenta desvantagens na
deteco de anticorpos contra o vrus, favorecendo a permanncia de animais
soropositivos no rebanho, objetivou-se com este estudo padronizar testes de Elisa-i e
Western Blot para diagnstico precoce de anticorpos em caprinos contra CAEV e
comparar os resultados obtidos nesses testes com a prova de IDGA.
MATERIAL E MTODOS
Para a produo de antgenos, foram utilizados cultivos secundrios de membrana
sinovial caprina (MSC). Garrafas roller (850 cm) foram cultivadas com MSC at 70 a
80% de confluncia e inoculadas com a amostra padro CAEV-Cork, com titulao de
10-5,3
TCID50/mL. As coletas do sobrenadante do cultivo celular foram submetidas a trs
ciclos de congelamento a -80C e descongelamento a 37C para a lise celular e liberao
45
de partculas virais, conforme metodologia descrita por Pinheiro et al. (2006). Este
estudo seguiu as normas estabelecidas pela a Comisso de tica no Uso de Animais da
Universidade Estadual Vale do Acara (CEUA/UVA) de acordo com o protocolo de N
014.12.
O antgeno utilizado na tcnica de IDGA foi preparado conforme metodologia de
Pinheiro et al. (2010). O sobrenadante foi clarificado por centrifugao a 3.300 g (rotor
IEC 216) a 4C por 20 minutos. Submetido tcnica de ultrafiltrao em sistema
AMICON, em membrana de 10 KDa onde o material retido no sistema foi retirado e
tratado com ter durante 10 minutos para destruio das glicoprotenas e liberao das
protenas internas do virion, em seguida foi armazenado a -20C at a realizao dos
testes.
Para Elisa-i o material foi clarificado por centrifugao a 10.000 rpm durante 30
minutos. O pellet de clulas foi ressuspenso em soluo de PBS (proporo de 1:10 do
volume inicial), e em seguida foi tratado com dodecil sulfato de sdio (SDS), a uma
concentrao final de 0,1% (v/v). O tratamento foi realizado durante 10 minutos, em
temperatura ambiente, sob homogeneizao. Posteriormente, o material foi centrifugado
a 10.000g durante 15 minutos, a 4C (Torres et al., 2009). A concentrao da protena
total do antgeno foi determinada pelo mtodo de Bradford (1976). Aps esse
procedimento o antgeno foi mantido a -20C.
O antgeno utilizado na tcnica de WB foi submetido precipitao com
polietilenoglicol - PEG-8000 a 40% at a concentrao final de 8%, durante um perodo
de 18h a 4C, subsequentemente foi centrifugado a 4C a 12000 g por 60 minutos. O
sedimento foi resuspenso em TNE (10,0mM tris-HCl, pH 7,4; 10,0mM NaCl;1,0mM
EDTA) na proporo de 10% do volume original da suspenso viral, em seguida foi
ultracentrifugado em colcho de sacarose (UCCS) (25% em TNE) conforme protocolo
de Dantas et al. (2008), a 42000 g por 120 minutos. O sedimento foi ressuspenso em
PBS (0,05M; 0,15M NaCl; pH 7,4) contendo 2x10-4
M de phenylmethylsulphonyl
fluoride (PMSF) sendo a concentrao proteica total determinada pelo mtodo de
Bradford (1976), e o antgeno mantido a -80C at a realizao dos ensaios
laboratoriais.
Para a execuo da microtcnica de IDGA seguiu protocolo de Gouveia et al.
(2000). Foi preparado gel de agarose a 0,9% em tampo fosfato salino. Esse gel foi
46
distribudo em lminas de vidro, perfurado com uma roseta padro de seis poos
equidistantes e preenchidos com uma quantidade de 30L de soros testes, soro padro e
antgeno para cada poo correspondente. Para a visualizao das linhas de precipitao
a leitura foi realizada 48-72 horas, com luz indireta sobre fundo escuro, sendo
considerada definitiva a segunda leitura.
Para o teste Elisa-i utilizou microplacas rgidas com 96 poos (Nunc immuno
plate/ M9410 1CS). O volume de solues distribudo em todas as etapas foi de
100L por poo. O antgeno foi diludo em tampo carbonato-bicarbonato (0,05 M, pH
9,6) e distribudo nos poos em diferentes concentraes: 1,0; 0,5; 0,25 e 0,125 g/mL,
sendo cada linha da placa uma concentrao. A placa ficou incubando por 60 minutos a
37C, e posteriormente ficou over night sob refrigerao. Aps esse processo de
sensibilizao a placa foi lavada duas vezes com soluo de lavagem (soluo salina
0,9%, 0,05% de Tween 20).
Em seguida bloqueou-se os stios livres com tampo PBS-casena (casena a 2%)
por 1 hora e 30 minutos a 37C e aps esse perodo a placa foi lavada duas vezes. Na
primeira coluna da placa foram distribudos 100L de tampo de incubao (TI - PBS,
0,25% de casena e 0,05% de Tween 20), correspondendo assim coluna do branco. Os
soros controle positivo, negativo e reagente do kit de IDGA (Veterinary Diagnostic
Technology, Inc, USA), foram diludos em TI, nas propores de 1:50 e 1:100. As
placas foram incubadas em estufa a 37C por 60 minutos.
Os soros foram descartados e a placa foi lavada seis vezes. Distribuiu-se o
conjugado DONKEY (Anti-Sheep IgG Peroxidase - SIGMA) nas diluies de 1:1000 e
1:1500 em TI. A placa foi incubada a 37C por 60 minutos. Repetiu-se o processo de
descarte e seis lavagens. Para a revelao utilizou-se o substrato tampo citrato-fosfato
(0,1M, pH 5,0) com adio de 0,02% de H2O2 e 0,2 mg/mL de -phenylenediamine
(OPD), por 15 minutos temperatura ambiente e ao abrigo da luz. A reao foi
bloqueada pela adio de 20L de 0,4 M H2SO4. A intensidade da cor da reao foi
determinada por absorbncia em leitor de microplacas de Elisa-i com comprimento de
onda de 492nm.
A diluio tima do soro foi determinada pela diferena entre as densidades
pticas obtidas nas leituras dos soros positivos e negativos, aquela que apresentou maior
diferena nas diferentes concentraes de antgeno foi escolhida (Pinheiro, 2001). A
47
partir da, foi determinado o ponto de corte (cut off) do Elisa-i, com a utilizao de duas
placas, sendo 41 soros diferentes de caprinos adultos sabidamente soronegativos para
cada placa, totalizando 82 amostras.
A tcnica de Western Blot foi padronizada a partir de modificaes no protocolo
de Arago et al. (2008). Para determinao das bandas proteicas do vrus foi preparado
um gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sdio (SDS-PAGE) a 4% de
concentrao e 12,5% de separao. Nos locais de aplicao das amostras foram
utilizadas concentraes de 6g, 12g e 18g de antgeno, acompanhado com padro
de peso molecular LMW Electrophoresis (Pharmacia Biotech), com bandas de 20; 30;
43; 67 e 94 KDa.
Para a migrao eletrofortica utilizou aparelho da BIO-RAD modelo Power
PacTM
HC, ajustado para a programao inicial de 300 Watts (W), 1,00 Ampres (A) e
170 volts (V). As protenas do gel foram coradas com azul de Comassie, escaneadas e
analisadas atravs do software Bio Doc-IT-LS 6.0 do VisiDoc-IT, gel documentation
System da UVP.
Para padronizao das diluies do soro, conjugado e tempo de revelao no WB
foi preparado um gel utilizando a menor concentrao de antgeno, ou seja, 6g/L por
poo, porm para facilitar a tcnica, foi confeccionado um pente com duas canaletas,
uma com a largura convencional utilizada para o padro de protena e outro 10 vezes
mais larga que a padro, sendo utilizada uma quantidade de 13 L de antgeno.
As bandas proteicas inicialmente separadas por SDS-PAGE foram transferidas
para uma Membrana de Nitrocelulose (MN) (PROTAN BA 85 is stuck 150 X 200 mm
de 0,45 m), com auxlio de equipamento da BIO-RAD modelo Power PacTM
HC,
programado inicialmente para 300 W, 1,00 A e 100 V, por 60 minutos.
Aps a transferncia a MN foi colocada em recipiente contendo corante Ponceaus
(cat. 6226-79-5 - SIGMA), sob agitao, at que fossem visualizadas as bandas de
protenas, aps isto o corante foi retirado e a membrana lavada com gua destilada at
que as bandas fossem observadas com mais nitidez. A faixa de membrana
correspondente ao padro de peso molecular foi retirada e guardada at a revelao.
As protenas foram bloqueadas em soluo de bloqueio PBS Tween 0,3% por 60
minutos e lavadas com soluo de PBS-Tween 0,05% por trs vezes cinco minutos cada
lavagem. A membrana foi recortada em tiras, que foram enumeradas e colocadas em
48
tubos de ensaio de 5mL. Foi utilizado o soro controle positivo e negativo para CAEV do
kit comercial usado no IDGA (Veterinary Diagnostic, ICA - USA) e cinco amostras. O
conjugado foi o anti-IgG caprino marcado com peroxidase (SIGMA).
Os soros e o conjugado foram diludos em soluo PBS 1X. Foram testados dois
protocolos, no primeiro foi adotado para o soro a diluio de 1:50 por 30 minutos e do
conjugado de 1:15000 por 60 minutos, e no segundo de 1:100 para o soro por 30
minutos e conjugado 1:18000 por 30 minutos. Aps o tempo de reao dos soros testes,
as tiras foram submetidas a trs lavagens com PBS-Tween 0,05% de cinco minutos
cada. Em seguida foi adicionado o conjugado. Aps o tempo de incubao do
conjugado de 60 ou 30 minutos, para os protocolos I e II, respectivamente, as tiras da
membrana foram lavadas duas vezes com PBS-Tween 0,05% e uma vez com PBS 1X,
cinco minutos cada, em seguida, foram retiradas dos tubos de ensaio e colocadas em um
recipiente.
Para a revelao foi utilizado os substratos, 4-Cloro-1-Naphthol e 3,3
Diaminobenzidine (DAB), acrescido de perxido de hidrognio a 30%. As bandas de
protena ficaram ao abrigo da luz e a reao foi interrompida com adio de gua
destilada. Na leitura foi considerado positiva a amostra que apresentou polipeptdio
com peso molecular prximo a 28 KDa, considerando os parmetros de referncia,
padro de peso molecular e controle positivo (Oliveira et al., 2008).
As tcnicas de IDGA, Elisa-i e WB foram aplicadas utilizando 222 amostras de
soro caprino provenientes de um rebanho leiteiro pertencente a Embrapa Caprinos e
Ovinos, localizado no municpio de Sobral numa regio semirida do serto Cearense.
Os dados foram tabulados no programa Excel e analisados estatisticamente nos
programas Win Episcope 2.0 e EPI InfoTM
7.0, obtendo-se os resultados de
sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo,
concordncia dos testes, ndice Kappa e Qui-Quadrado (2).
RESULTADOS E DISCUSSO
O antgeno produzido para o Elisa-i apresentou uma concentrao proteica de 0,82
g/L. A padronizao do teste Elisa-i foi realizada variando a concentrao de protena
de antgeno por poo, de soro e conjugado. A melhor diluio obtida de soro e
49
conjugado foram de 1:100 e 1:1500, respectivamente, na concentrao de antgeno de
0,5g/poo. O ponto de corte foi obtido atravs das mdias dos 82 soros negativos mais
trs vezes o desvio padro, resultando no valor de 0,398.
A concentrao proteica do antgeno produzido para o WB obtida no Bradford foi
de 4,25 g/L. Em eletroforese, as bandas de protenas encontradas no gel em KDa
foram: 14; 22; 26; 28; 33; 36; 39; 45; 55; 67; 79; 86; 95; 103; 115; 127; 135 e 142. Com
a realizao da transferncia e WB somente algumas bandas proteicas foram
evidenciadas, dentre elas as de 28 KDa; 45 KDa e a de 67KDa.
As melhores diluies do WB de soro e conjugado foram 1:50 e 1:15000,
respectivamente. A escolha desta foi por exibir melhor reao equivalente a protena de
peso molecular 28 KDa (Fig. 1), que a mais imunognica.
Assim, a banda proteica para o vrus da CAE mais visvel foi da protena do
capsdeo viral cujo peso molecular varia de 28 a 29 KDa e representa o maior
componente estrutural do ncleo (Hirsh e Zee, 2003), sendo a protena de base para a
interpretao dos testes sorolgicos.
Na metodologia de produo de antgenos no diagnstico da CAE, a escolha da
estirpe viral e os componentes do vrus so fatores que podem influenciar nos resultados
quanto sensibilidade e a veracidade dos testes sorolgicos (Celler Jr. et al., 1998).
Desta forma, a escolha de um antgeno influencia marcadamente os resultados.
Na prova de IDGA a utilizao de um antgeno com as duas protenas (gp 135 e p
28) aumentam a sensibilidade (Pinheiro et al., 2006). No entanto, o antgeno
94Kda
67Kda
43Kda
30Kda
p28
Figura 1. Padronizao do Western Blot
para diagnstico da Artrite-Encefalite
Caprina. Diluio do soro 1:50 e do
conjugado 1:15000. Padro de peso
molecular (P), controle positivo (+),
controle negativo (-) e soros testes (1 a 5).
P + - 1 2 3 4 5
50
empregado neste trabalho para a tcnica de IDGA, evidenciou apenas a p 28. Estudos
apontam que o emprego de testes com a glicoprotena de superfcie (gp 135) do vrus do
CAEV mostrou-se mais sensvel do que utilizando os da nucleoprotena (p 28) (Pinheiro
et al., 2010). No WB, a gp 135 no foi transferida para MN. Na padronizao do teste
Elisa-i foi observada que o soro reagente do Kit comercial, abundante em anticorpos
contra a gp 135, demonstrou boa reao. O soro positivo rico em gp 135 e p 28 foi
altamente positivo. Baseado nisso, considerou que o antgeno produzido para o teste de
Elisa-i possua quantidades suficientes das duas protenas para serem detectadas.
O SDS utilizado no tratamento do antgeno viral do teste Elisa-i um detergente
inico que, em baixas concentraes, ajuda a expor eptopos ou determinadas protenas
antignicas para melhorar o reconhecimento entre antgeno-anticorpo, o que, por
conseqncia, aumenta a sensibilidade na deteco de anticorpos. Esse tratamento
aparentemente no alterou o perfil protico viral de CAEV, mantendo-se similar ao
perfil-padro, contribuindo para aumentar a sensibilidade na relao entre antgeno viral
e antgeno celular (Torres et al., 2009).
H grande dificuldade em se determinar o verdadeiro status sanitrio do animal,
pois a CAE se trata de uma doena com progresso lenta e soroconverso muitas vezes
tardia (Castro et al., 1999). O IDGA e Elisa-i so os testes preconizados pela
Organizao Mundial de Sade Animal para o diagnstico sorolgico de infeco por
LVPR (OIE 2010). A tcnica de IDGA amplamente utilizada para o diagnstico do
CAEV, porm possui desvantagem devido possibilidade de permanncia de animais
infectados no rebanho, detectando somente animais com altos nveis de anticorpos
(Melo e Franke 1997; Pinheiro et al., 2001; Moura Sobrinho et al., 2010).
O teste de Elisa-i detectou 11,7% (26/222) de animais soropositivos enquanto que
apenas 4,5% (10/222) foram reagentes no IDGA (Tab.1).
Tabela 1. Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de Elisa-i e
IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. IDGA
Elisa-i
Positivo Negativo Total
Positivo 7 19 26 Negativo 3 193 196
Total 10 212 222 Sensibilidade: 70%; Especificidade: 91%; Valor preditivo positivo: 26,9%; Valor preditivo negativo:
98,5%; Concordncia: 90,1%; ndice kappa= 0,35; Qui-quadrado: 28,76.
51
O Elisa-i apresentou resultado superior ao teste de IDGA, sendo um teste mais
recomendado para deteco precoce. Torres et al. (2009) observaram que a
sensibilidade e especificidade do Elisa-i quando comparado ao IDGA foi de 73,3% e
84%, respectivamente. Em estudo semelhante concordncia desses testes foi de
97,43% (Cruz et al., 2009).
Das amostras testadas por WB observou que 30,6% (68/222) foram soropositivas.
Os valores estimados de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP),
valor preditivo negativo (VPN), concordncia, ndice Kappa e Qui-quadrado (2) quanto
a comparao dos resultados obtidos para os testes de WB e IDGA esto demonstrados
na Tab.2.
Tabela 2. Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e
IDGA para deteco de anticorpos contra CAEV. IDGA
Western
Blot
Positivo Negativo Total
Positivo 10 58 68 Negativo 0 154 154
Total 10 212 222 Sensibilidade: 100%; Especificidade: 72,6%; Valor preditivo positivo: 14,7%; Valor preditivo negativo:
100%; Concordncia: 73,9%; ndice kappa= 0,2; Qui-quadrado: 20,42.
Todas as amostras reagentes no IDGA concordaram com os resultados do WB,
mas trs no foram consideradas soropositivas para o ponto de corte estabelecido no
Elisa-i. Quando o WB e Elisa-i foram comparados, foi observada uma concordncia
entre os testes de 72,5% (Tab. 3).
Tabela 3. Comparao dos resultados dos soros caprinos entre as tcnicas de WB e
Elisa-i para deteco de anticorpos contra CAEV. Elisa-i
Western
Blot
Positivo Negativo Total
Positivo 22 46 68 Negativo 4 150 154
Total 26 196 222 Sensibilidade: 84,6%; Especificidade: 76,5%; Valor preditivo positivo: 32,4%; Valor preditivo negativo:
97,4%; Concordncia: 72,5%; ndice kappa= 0,36; Qui-quadrado: 37,56.
O WB conseguiu ser mais eficaz na deteco precoce quando comparada com os
outros mtodos aplicados neste estudo, mostrando uma sensibilidade de 100% e
especificidade 72,5% quando comparado ao IDGA, e de 84,6% e 76,5%
52
respectivamente em relao ao Elisa-i. Os dados mostraram significativos para o qui-
quadrado (p
53
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