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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA DANIELLE DE FREITAS MIZOGUTI Goiânia 2013 Perfil Sorológico à LID-1 e PGL-I em Pacientes com Reação Hansênica Tipo I e Tipo II e em pacientes não reacionais
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
DANIELLE DE FREITAS MIZOGUTI
Goiânia
2013
Perfil Sorológico à LID-1 e PGL-I em Pacientes com Reação
Hansênica Tipo I e Tipo II e em pacientes não reacionais
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TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES
E DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de
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Autor (a): Danielle de Freitas Mizoguti
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Agência de fomento: Sigla:
País: Brasil UF: GO CNPJ:
Título: Perfil Sorológico à LID-1 e PGL-I em Pacientes com Reação Hansênica Tipo I e Tipo II e em pacientes não reacionais
Palavras-chave: Reação Hansênica, sorologia, LID-1, PGL-I
Título em outra língua: Leprosy: Serologic reactivity to LID-1 and PGL-I antigens in patients with type I
, type II reactions and unreactional patients.
Palavras-chave em outra língua: Leprosy reaction, serology, LID-1, PGL-I
Área de concentração: Imunologia
Data defesa: (21/02/2013)
Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador (a): Mariane Martins de Araújo Stefani
E-mail: [email protected]
Co-orientador (a):*
E-mail:
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
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i
DANIELLE DE FREITAS MIZOGUTI
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública da Universidade
Federal de Goiás para obtenção do Título
de Mestre em Medicina Tropical e Saúde
Pública.
Orientadora: Profa. Dra. Mariane Martins
de Araújo Stefani
Goiânia
2013
Perfil Sorológico à LID-1 e PGL-I em Pacientes com Reação
Hansênica Tipo I e Tipo II e em pacientes não reacionais
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ii
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Danielle de Freitas Mizoguti
Orientador (a): Mariane Martins de Araújo Stefani
Co-orientador (a):
Membros:
1. Mariane Martins de Araújo Stefani
2. Samira Buhrer
3. Mirian Lane de Oliveira Rodrigues Castilho
Data: 21/02/2014
iii
SUMÁRIO
SUMÁRIO ....................................................................................................................... iii
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS ................................................................................ v
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ................................................................. vii
RESUMO ........................................................................................................................ xi
ABSTRACT ................................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1. Hanseníase ......................................................................................................... 1
1.2. Mycobacterium leprae ....................................................................................... 2
1.3. Epidemiologia .................................................................................................... 3
1.3.1 A hanseníase no cenário mundial ........................................................................ 3
1.3.1. Epidemiologia da hanseníase no Estado de Goiás...................................... 5
1.4. Classificação das formas de hanseníase ............................................................. 7
1.5. Aspectos imunológicos da hanseníase ............................................................. 10
1.6. Mecanismos do dano ao nervo na hanseníase.................................................. 13
1.7. Reações hansênicas .......................................................................................... 15
1.7.1. Reação hansênica tipo 1 .......................................................................... 16
1.7.2. Reação hansênicas tipo 2 .......................................................................... 17
1.8. Aspectos genéticos das reações hansênicas ..................................................... 20
1.9. Reatividade Sorológica ao PGL-I na Hanseníase e nas Reações Hansênicas . 21
1.10. Uso de proteínas recombinantes do M. leprae na sorologia de pacientes com
hanseníase e nas Reações Hansênicas. ...................................................................... 23
2. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 26
3. OBJETIVOS .............................................................................................................. 27
3.2 Objetivos Específicos .......................................................................................... 27
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 29
4.1 População de Estudo ............................................................................................. 29
.................................................................................................................................... 31
Figura 7. Organograma dos grupos de pacientes Multibacilares. .............................. 31
4.2 Proteína de fusão do M. leprae LID-1 ................................................................. 32
4.3 Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para detecção de IgG para LID-1 ................. 32
4.4 ELISA para detecção de IgM para o PGL-I ......................................................... 33
iv
4.5 Aspectos éticos e financeiros ................................................................................ 33
4.6 Análises estatísticas .............................................................................................. 34
5. RESULTADOS .......................................................................................................... 35
5.1 Características gerais dos grupos de estudo ......................................................... 35
5.2 Reatividade sorológica em amostras pareadas de pacientes MB com RT1 ou RT2
.................................................................................................................................... 36
5.3 Reatividade sorológica em amostras pareadas de pacientes PB com RT1 ........... 41
5.4 Reatividade sorológica nos diferentes grupos reacionais. .................................... 43
6. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 48
7. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 53
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 54
9. ANEXO ...................................................................................................................... 68
v
TABELAS, FIGURAS E ANEXOS
Figura 1. Modelo esquemático do envelope celular do M. leprae. 3
Figura 2. Taxas de prevalência mundial da hanseníase por 100.000 habitantes. 4
Figura 3. Coeficiente de Prevalência de Hanseníase por Estado no Brasil
em 2012. 6
Figura 4. Coeficiente de detecção geral de hanseníase por Estado no Brasil
em 2012. 6
Figura 5. Coeficiente de detecção geral de hanseníase em Goiás
por municípios de 2010. 7
Figura 6. Fluxograma da coleta de amostras. 29
Figura 7. Organograma dos grupos de pacientes Multibacilares. 31
Figura 8. Organograma dos grupos de pacientes Paucibacilares. 31
Tabela 1. Composição e características principais dos grupos de estudo. 35
Figura 9. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras de
soro pareadas de pacientes MB. 38
Tabela 2. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras
de pacientes MB que não desenvolveram reação hansênicas e
em pacientes que desenvolveram RT1 ou RT2. 40
vi
Figura 10. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras
pareadas de pacientes PB. 42
Tabela 3. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras de
pacientes PB que não desenvolveram reação hansênica e
em pacientes que desenvolveram RT1. 43
Figura 11. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I
em grupos de pacientes MB que desenvolveram RT1 ou RT2 ou pacientes
livres de reação ao diagnóstico. 44
Figura 12. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I
em grupos de pacientes MB que desenvolveram RT1 ou RT2 ou pacientes
que não desenvolveram reação durante MDT. 45
Figura 13. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I
em grupos de pacientes PB que desenvolveram RT1 ou pacientes
livres de reação ao diagnóstico. 46
Figura 14. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I
em grupos de pacientes PB que desenvolveram RT1 durante a MDT ou
pacientes livres de reação, no momento após a MDT. 47
vii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
A.C. Antes de Cristo
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ASC Proteína associada a apoptose contendo domínios CARD
BAAR Bacilo álcool ácido resistente
BB Forma borderline
BT Borderline-tuberculóide
BL Borderline-lepromatosa
BSA Soro albumina bovina
CARD Domínios de recrutamento e ativação de caspases
CD Cluster of differentiation
CMI Cell-mediated immunity
CR Receptor de complemento
CRDT Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica
CXCL10 Quimiocina (motivo C-X-C) ligante dez
DATASUS Banco de dados do Sistema Único de Saúde
DC Célula dendrítica
DNA Ácido desoxirribonucleico
DO Densidade ótica
DPP Dual-path platform
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
viii
ENH Eritema nodoso hansênico
ERK1 Extracellular-signal-regulated kinases 1
HAART Highly Active Anti Retroviral Therapy
HIV Vírus da imunodeficiência humana
HLA Antígeno leucocitário humano
HSA Soro albumina humana
H2SO4 Ácido sulfúrico
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IDH Índice de desenvolvimento humano
IDRI “Infectious Disease Research Institute”
IFN Interferon gama
IL Interleucina
iNOS Óxido nítrico sintase induzida
IPTSP “Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública”
KDa Kilodalton
LAM Lipoarabinomanana
LBP Proteína ligadora de laminina
LF Lateral flow
LIAH Laboratório de Imunologia da AIDS e Hanseníase
LID-1 Leprosy IDRI diagnostic 1
LM Lipomanana
ix
LL Forma polar lepromatosa
MAPKs 2 Mitogen-activated protein kinases 2
MB Multibacilar
MDP Dipeptídeos muramil
MDT Multidrogaterapia
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
MIC Genes relacionados às cadeias do MHC de classe I
M-O-BSA Monossacarídeo–octyl–BSA
NF-Кβ Nuclear factor kappa beta
NGS Soro normal de cabra
NRAMP1 Natural resistance associated macrophage protein 1
NOD2 Nucleotide binding oligomerization domain
NT-P-BSA Trissacarídeo natural-phenil–BSA
OMS Organização Mundial da Saúde
PAMP Padrões moleculares associados à patógenos
PB Paucibacilar
PBS-T Tampão fosfato de sódio contendo tween 20
PDGF-BB Platelet-derived growth factor BB
PDIMs Ácidos micoserosóicos e tiocerol dimicoserosatos
PGL-I Glicolípido fenólico I
POC Point of care
x
PRR Receptor de reconhecimento de padrão
RNA Ácido ribonucleico
RR Reação reversa
rRNA Ácido ribonucleico ribossomal
RT1 Reação do tipo 1
RT2 Reação do tipo 2
SLC11A1 Solute carrier family 11 A1
SNP Polimorfismo de nucleotídeo único
SVS Sistema de Vigilância em Saúde
TCLE Termo de Consentimento Livre Esclarecido
TGF Fator de crescimento tumoral beta
Th T helper
TLR Toll like receptor
TMB Tetrametilbenzidina
TMM Monomicolato de trealose
TNFα Fator de necrose tumoral alfa
TT Forma polar Tuberculóide
UFG Universidade Federal de Goiás
VDR Receptor da vitamina D
WHA World Health Assembly
WHO World Health Organization
xi
RESUMO
Introdução: As reações hansênicas (tipo 1/RT1 e tipo 2/RT2) são as principais
complicações no manejo clínico de pacientes com hanseníase e podem ocorrer antes,
durante e após multidrogaterapia (MDT). A RT1 está associada a exacerbação da
imunidade mediada por células (CMI) do tipo Th1 para antígenos do Mycobacterium
leprae. Já a RT2 está associada com a resposta imunitária do tipo Th2, caracterizada por
forte produção de anticorpos e em alguns casos ativação transitória da CMI.
Objetivo: Avaliar a reatividade sorológica a proteína de fusão LID-1 e ao PGL-I do M.
leprae em pacientes com hanseníase multibacilares (MB) e paucibacilares (PB) com
reação hansênica e em pacientes MB e PB que não desenvolveram reação.
Materiais e Métodos: Foram testadas amostras um total de 73 pacientes com
hanseníase MB que desenvolveram RT1 ou RT2 ao diagnóstico ou durante MDT e em
pacientes PB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico ou durante MDT comparados com
pacientes MB e PB que não desenvolveram reação hansênica ao diagnóstico nem
durante MDT. A presença de IgG anti LID-1 e IgM anti PGL-I foi testada por ELISA.
Resultados: O declínio dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I foi
significativo dentre os pacientes MB que estavam em RT1 ao diagnóstico (p< 0.05).
Dentre os pacientes MB que estavam em RT2 ao diagnóstico e pacientes MB não
reacionais, o declínio dos anticorpos foi significante apenas para LID-1 (p< 0.05).
Níveis mais altos de anticorpos anti LID-1 foram observados nos pacientes MB que
desenvolveram RT2 ao diagnóstico quando comparados com pacientes MB que
desenvolveram RT1 ao diagnóstico (p=0.008) ou pacientes MB não reacionais
(p=0.020). Pacientes MB que desenvolveram RT2 durante a MDT também
apresentaram níveis mais altos de anticorpos anti LID-1 comparados com pacientes MB
não reacionais após MDT (p=0.020).
Conclusões: Nossos resultados sugerem que altos níveis de anticorpos anti LID-1
podem estar associados ao maior risco de desenvolvimento de RT2 em pacientes MB.
Palavras chave: Reação Hansênica, sorologia. LID-1, PGL-I
xii
ABSTRACT
Introduction: Leprosy Type 1 ( T1R) and type 2 reactions ( T2R) are considered the
major complicators in the clinical management of leprosy patients. Leprosy reactions
can occur before, during or after multidrug therapy (MDT). T1R is associated with
exacerbated Th1 type cell mediated immunity (CMI) whereas T2R is associated with
Th2 type immunity characterized by strong antibody production and in some cases
transitory CMI to M. leprae antigens.
Objective: Assess the serological reactivity to LID-1 fusion protein and to PGL-I M.
leprae antigens among multibacillary (MB), paucibacillary (PB) leprosy patients that
developed reaction at diagnosis or during MDT compared to reaction free MB and PB
patients.
Material and Methods: Paired serum samples from 73 leprosy patients were tested by
ELISA to detect IgG antibodies to LID-1 and IgM responses to PGL-I. Leprosy
patients included MB that developed T1R or T2R at diagnosis or during MDT and PB
patients that developed T1R at diagnosis or during MDT compared to reaction free MB
and PB patients. For T1R and T2R patients, samples collected during reactions and in
the absence of reactions were tested and for reaction free patients samples collected at
diagnosis and after MDT were tested.
Results: The decline of anti LID-1 and anti PGL-I antibodies levels was significant
among MB patients with T1R at diagnosis (p <0,05). Among MB patients with T2R at
diagnosis and non reactional MB leprosy patients, the decline of antibodies was
significant only to LID-1 (p <0,05). Higher levels of anti LID-1 antibodies were
observed in MB patients who developed T2R at diagnosis compared with unreactional
patients (p = 0.020) and patients who developed T1R at diagnosis (p = 0.008).
Moreover, different antibody levels were seen in patients who developed T2R during
MDT compared with unreactional MB patients after MDT (p = 0.020).
Conclusions: Our data suggest that high anti LID-1 antibody levels may be associated
with higher risk of T2R in MB patients.
Key words: Leprosy reaction, serology, LID-1, PGL-I
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Hanseníase
A hanseníase é uma doença granulomatosa crônica de evolução lenta causada pelo
Mycobacterium leprae, um bacilo intracelular obrigatório que acomete macrófagos da
pele e células de Schwann dos nervos periféricos (SCOLLARD et al., 2006). O
tropismo para células de Schwann e a resposta imune induzida pela infecção pelo M.
leprae podem provocar lesões nos nervos periféricos resultando em incapacidades e
deformidades físicas irreversíveis que são características da hanseníase (SCOLLARD,
2008).
O meio de transmissão do M. leprae não está completamente esclarecido. Estudos
indicam que o contato íntimo e prolongado de indivíduos susceptíveis com pacientes
multibacilares não tratados represente a principal forma de infecção (BROWN, 1959;
DOUGLAS et al., 2004; SHEPARD, 1960). No entanto, é possível que indivíduos com
infecção subclínica possam representar fonte de transmissão do M. leprae (BEYENE et
al., 2003; HATTA et al., 1995). Entre outras possibilidades de contágio estão o contato
direto com lesões de pele ulceradas, urina, fezes, leite materno, suor, secreção vaginal e
esperma contaminados (ABRAHAM et al., 1998).
Apesar da alta infectividade do M. leprae, a susceptibilidade à infecção depende
de inúmeros fatores que resultam na falha do indivíduo em desenvolver resposta imune
protetora contra o bacilo. Na grande maioria dos casos, o indivíduo infectado
desenvolve uma resposta celular eficaz e não apresenta sinais e sintomas clínicos,
constituindo uma infecção subclínica ou cura espontânea (FINE, 1982).
Diversos genes e regiões genômicas já foram relacionados à susceptibilidade à
Hanseníase per se ou a tipos particulares da hanseníase, tais como, genes ligados ao
complexo do antígeno leucocitário humano (HLA) que podem envolver determinados
alelos (HLA-DR2 e HLA-DR3), polimorfismo de genes relacionados às cadeias do
MHC de classe I (MIC) e também genes não ligados ao HLA como o gene da
2
interleucina 10 (IL-10), o gene natural resistance associated macrophage protein 1
(NRAMP1), e o gene do receptor de vitamina D (MIRA et al., 2003; MORAES et al.,
2004; TOSH et al., 2006). Acredita-se que a ação integrada de um conjunto variado de
genes associados à fatores ambientais, sócio econômicos e culturais podem determinar a
susceptibilidade ou resistência do indivíduo ao M. leprae (PREVEDELLO; MIRA,
2007; WALKER; LOCKWOOD, 2006).
1.2. Mycobacterium leprae
O M. leprae foi o primeiro patógeno identificado como causador de doença
humana pelo pesquisador Gerhard Amauer Hansen na Noruega em 1873. O M. leprae é
um bastonete reto ou levemente curvilíneo, imóvel, microaerófilo e não formador de
esporos. É um bacilo álcool ácido resistente de modo que quando corado em vermelho
pela fucsina não se descora pela lavagem em álcool e ácidos orgânicos (LOWY;
RIDLEY, 1954).
Relatos de hanseníase apareceram pela primeira vez por volta de 600 A.C., em
textos antigos que descrevem a existência da hanseníase na Índia, no Egito e na China
(MONOT et al., 2005). Dados moleculares indicam que a hanseníase se originou no
leste da África ou no Oriente Médio e se espalhou com sucessivas migrações humanas.
Europeus e/ou norte-africanos, então, introduziram a hanseníase na África Ocidental e
nas Américas nos últimos 500 anos (MONOT et al., 2009).
A membrana plasmática do M. leprae é envolvida pela parede celular, a qual é
composta por peptidoglicanos ligados a uma camada de galactana, a qual se liga à
cadeias ramificadas de arabinana formando uma zona eletrodensa em torno do M.
leprae. Ácidos micólicos são ligados aos terminais das cadeias de arabinana para formar
o folheto interno da bicamada pseudolipídica. O folheto externo é composto por ácidos
micólicos intercalando monomicolato de trealose (TMM), ácidos micoserosóicos e
tiocerol dimicoserosatos (PDIMs) bem como glicolípidos fenólicos (PGLs), formando
uma zona de eletrotransparência. Foi postulado que muitas dessas mesmas moléculas
em conjunto com Manosídeos de fosfatidilinositol e fosfolípidos são secretadas da
parede celular após a síntese, formando uma cápsula (SCOLLARD et al., 2006).
3
Figura 1. Modelo esquemático do envelope celular do M. leprae.
Adaptado de (SCOLLARD et al., 2006).
O M. leprae se duplica em temperaturas em torno de 27 a 30ºC e a taxa de
duplicação é extremamente lenta (12 a 21 dias) o que contribui para um longo tempo de
incubação que varia em média de 2 a 10 anos (JACOBSON; KRAHENBUHL, 2000;
REES, 1976). Até o momento, este bacilo nunca foi cultivado em meios axênicos e sua
replicação para fins científicos é restrita a modelos animais como camundongos e tatus
de nove bandas (KIRCHHEIMER; STORRS, 1971; SHEPARD, 1962).
1.3. Epidemiologia
1.3.1 A hanseníase no cenário mundial
Em maio de 1991, a Organização Mundial da Saúde (OMS) por meio da 44ª
Assembleia Mundial da Saúde aprovou a Resolução WHA 44.9, e estabeleceu como
meta a eliminação global da hanseníase até o ano de 2000 (WHO, 1991a). O objetivo
desta resolução era reduzir a prevalência da hanseníase para menos do que 1 caso em
4
10.000 habitantes. A implementação da multidrogaterapia (MDT) em 1980 tornou
curável uma doença que anteriormente era tratada ao longo de toda a vida (WHO,
1982).
A OMS recomendou a redução do tratamento da hanseníase multibacilar de 24
para 12 meses após o 7 º Encontro de Peritos em 1997 (WHO, 1998). Esta redução na
duração da doença possibilitou o cumprimento da meta de eliminação global, resultando
em uma redução rápida e significativa da prevalência global da hanseníase, em mais de
80% nos últimos 30 anos (WHO, 1988, 2005). Em 2005 houve um significante declínio
nas taxas de prevalência da hanseníase e foram registrados 211.845 casos, com taxa de
prevalência global menor que um caso/10.000 habitantes (WHO, 2005).
O boletim da OMS informou que a prevalência global da hanseníase registrada
no primeiro trimestre de 2012 foi de 181.941 casos (0.34 casos/10.000 habitantes),
mesmo sem os dados do continente Europeu. A hanseníase foi eliminada globalmente,
mas alguns países ainda registram altas taxas de prevalência e incidência como Angola,
Brasil, República Central Africana, Índia, Madagascar, Nepal e República Unida da
Tanzânia (WHO, 2012a).
Figura 2. Taxas de prevalência mundial da hanseníase por 100.000 habitantes.
Adaptado de (WHO, 2012b).
5
A incidência global da Hanseníase no ano de 2011 foi de 219.075 (4.06 casos/
100.000 habitantes). A alta incidência em alguns países demonstra transmissão ativa do
M. leprae apesar da estratégia de eliminação baseada na MDT. A transmissão atual do
bacilo pode ser devida a manutenção de reservatórios de M. leprae em contatos
infectados e em pessoas com infecção subclínica (FINE, 2006).
A incapacidade física decorrente da hanseníase é classificada em três graus (0, 1
e 2). No “grau zero”, o paciente não apresenta perda de sensibilidade ou deformidade
física. O “grau 1” de incapacidade física é caracterizado pela presença de regiões
anestésicas, sensibilidade corneana diminuída e ausência de deformidades físicas. O
“grau 2” de incapacidade física é caracterizado por presença de mão em garra, pé caído,
reabsorção óssea e alterações como lagoftalmo e/ou ectrópio nos olhos (MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2002).
Uma nova Estratégia Global de eliminação da hanseníase está sendo
implementada através de programas nacionais em países endêmicos. Esta estratégia visa
reduzir a taxa global de novos casos diagnosticados com grau de incapacidade 2 em
pelo menos 35% até o final de 2015. Esta abordagem destaca a importância do
diagnóstico precoce e a qualidade dos cuidados ao paciente (WHO, 2009).
No Brasil, o coeficiente de prevalência da hanseníase em 2011 foi considerado
médio, de 1.24/10.000 habitantes. O Coeficiente de detecção geral foi de 15.88, sendo
que o coeficiente de detecção em menores de 15 anos foi de 4.77 (SINAN/SVS-MS
2012 a e b).
1.3.1. Epidemiologia da hanseníase no Estado de Goiás
O Estado de Goiás está na região Centro-Oeste e possui um Índice de
Desenvolvimento Humano (IDH) de 0.735. Nele estão situados 246 municípios, com
um total de 6.154.996 habitantes (DATASUS, 2012). Conforme dados do Ministério da
Saúde de 2012, o Estado de Goiás teve coeficiente de prevalência de hanseníase de
3.00/10.000 habitantes, um coeficiente considerado médio (Figura 3). O coeficiente de
detecção geral da hanseníase, que é o índice mais aproximado da incidência, foi de
35.82/100.000 habitantes, que é considerado muito alto (Figura 4).
Com relação ao grau de incapacidade dos pacientes com hanseníase, no Brasil o
percentual de casos novos avaliados com grau de incapacidade em 2012 foi de 88,6%,
sendo 1,15% apresentaram grau 2 de incapacidade física. No Estado de Goiás o
6
percentual de casos novos com grau de incapacidade foi de 91,2%, sendo que destes
2,13% apresentaram grau de incapacidade 2. No momento da cura, o percentual de
avaliação de grau de incapacidade foi de 71,3% no Brasil e 63,8% em Goiás
(SINAN/SVS-MS, 2013).
Figura 3. Coeficiente de Prevalência de Hanseníase por Estado no Brasil em 2012.
(SINAN/SVS-MS, 2013)
Figura 4. Coeficiente de detecção geral de hanseníase por Estado no Brasil em 2012.
(SINAN/SVS-MS, 2013)
7
Em 2010, entre os municípios do Estado de Goiás verificaram-se áreas de maior
endemicidade no centro e noroeste do Estado. A capital Goiânia registrou 27.4
casos/100 mil habitantes, padrão de alta endemicidade (MINISTÉRIO DA
SAÚDE/SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2011).
Figura 5. Coeficiente de detecção geral de hanseníase em Goiás por municípios de
2010.
1.4. Classificação das formas de hanseníase
A hanseníase é uma doença espectral associada a diversas manifestações clínicas
que são determinadas pelo tipo de resposta imunológica do paciente (RIDLEY;
JOPLING, 1966). As principais manifestações clínicas sao lesões de pele com
distúrbios de sensibilidade térmica, tátil e dolorosa, em qualquer região do corpo. A
sensibilidade nas lesões pode estar diminuída (hipoestesia), ausente (anestesia) ou, em
menor freqüência, aumentada (hiperestesia) (RIDLEY, 1955). A classificação das
formas clínicas da hanseníase utilizada para fins científicos é baseada em critérios
clínico, baciloscópico, histopatológico e imunológico (RIDLEY; JOPLING, 1966).
8
Sendo assim, a hanseníase pode ser classificada em formas polares e intermediárias. A
forma polar tuberculóide (TT) apresenta poucas lesões de pele, baixa produção de
anticorpos e forte resposta imune celular caracterizada pela produção de interferon
gama (IFN) (MODLIN, 1994). A forma polar lepromatosa (LL) é caracterizada por
múltiplas lesões de pele, alta carga bacilar e vigorosa produção de anticorpos. As
formas intermediárias borderline-tuberculóide (BT), borderline-borderline (BB) e
borderline-lepromatosa (BL) são consideradas imunologicamente instáveis e podem
apresentar alterações para qualquer um dos pólos da doença (MODLIN, 1994;
RIDLEY; JOPLING, 1966).
Clinicamente a forma TT é representada por poucas lesões cutâneas constituídas
por pápulas ou placas bem delimitadas com perda de sensibilidade. A lesão hansênica
tuberculóide clássica é uma placa ou mácula que pode ser eritematosa ou
hipopigmentada. Ao histopatológico, observa-se a formação de granuloma único ou
múltiplos granulomas confluentes de células epitelióides, com ou sem a presença de
células de Langhans no centro da lesão. Observa-se também a presença de linfócitos que
conferem um halo denso contornando o granuloma, sem bacilos detectáveis. O
granuloma se extende para a epiderme sem uma zona clara intermediária (RIDLEY;
JOPLING, 1966).
Clinicamente a forma Borderline-tuberculóide (BT) é caracterizada por lesões
cutâneas bem definidas e avermelhadas semelhantes à forma TT, porém menos extensas
e mais numerosas podendo estar acompanhadas de pequenas lesões satélites. A forma
BT pode também apresentar um maior número de troncos nervosos acometidos.
Histopatologicamente observa-se a formação de granulomas de células epitelióides, com
presença de células gigantes tipo Langhans, contornada de linfócitos e a presença de
escassos bacilos (RIDLEY; JOPLING, 1966).
A forma Boderline-Borderline (BB) é caracterizada clinicamente por lesões com
tamanho e número intermediários com formas irregulares e limites imprecisos que
apresentam moderado grau de anestesia. Algumas lesões podem apresentar aparência
“perfurada” ou de “queijo suíço” e podem estar acompanhadas de lesões satélites. O
número de bacilos encontrados no histopatológico é maior, com células epitelióides
difusamente disseminadas próximas ao granuloma e sem manto linfocitário. Células
gigantes tipo Langhans estão ausentes e linfócitos são geralmente escassos e difusos
(RIDLEY; JOPLING, 1966).
9
A forma Borderline-lepromatosa (BL) apresenta clinicamente numerosas lesões
mal delimitadas e eritematosas semelhante à hanseníase lepromatosa (LL), no entanto,
as lesões não são simetricamente distribuídas bilateralmente em toda a região afetada.
No histopatológico, observa-se histiócitos espumosos ou não com numerosos bacilos
sem formação de globias (RIDLEY; JOPLING, 1966).
Na forma Lepromatosa-lepromatosa (LL) as lesões mais precoces são múltiplas
pápulas e máculas eritematosas com limites imprecisos distribuídas de forma bilateral e
simétrica. Com a progressão da doença, novas pápulas e máculas aparecem, enquanto as
lesões antigas se tornam nódulos e placas respectivamente. A pele do rosto se torna
espessa aprofundando as linhas da testa, presença de infiltração de nariz e orelha e perda
eventual de cílios e sobrancelhas caracterizando a chamada face leonina. Pode haver
também ulceração nasal, deformidade de nariz em sela, irite e queratite lepromatosa,
deformidades ósseas nas mãos e nos pés e perda do dente incisivo central superior. Nos
homens, o dano testicular leva a atrofia com consequente impotência, esterilidade e
ginecomastia. Na fase avançada, nervos periféricos sofrem degeneração hialina ou
fibrose levando a anestesia e perda muscular nas mãos e nos pés (RIDLEY; JOPLING,
1966). O exame histopatológico apresenta extenso infiltrado de histiócitos
multivacuolados, contendo inúmeros bacilos e citoplasma com grande quantidade de
lipídeos, conhecidos como células de Virchow (BOURGES et al., 1966).
Para fins operacionais e definição do tipo e duração do tratamento específico, a
Organização Mundial de Saúde (OMS) propôs uma classificação simplificada da
hanseníase baseada na contagem do número de lesões de pele. Segundo esta
classificação pacientes que apresentam até cinco lesões de pele são considerados
paucibacilares (PB) e o esquema terapêutico recomendado pela OMS inclui uma dose
mensal supervisionada de rifampicina (600 mg) e doses diárias auto-administradas de
dapsona (100 mg) durante 6 meses. Pacientes com hanseníase multibacilar (MB)
apresentam mais de 5 lesões de pele e o tratamento preconizado pela OMS é de 12
meses, com uma dose mensal supervisionada de rifampicina (600 mg), clofazimina (300
mg) e dapsona (100 mg) e doses diárias autoadministradas de clofazimina (50 mg) e
dapsona (100 mg) (WHO, 1991b).
10
1.5. Aspectos imunológicos da hanseníase
A hanseníase fornece um modelo atrativo para investigação da resposta imune a
infecção porque apresenta um amplo espectro na qual as manifestações clínicas se
correlacionam com o tipo de resposta imune do hospedeiro ao patógeno (BLOOM,
1986; RIDLEY; JOPLING, 1966). Funções chave da resposta imune inata incluem
fagocitose, atividade antimicrobiana contra o patógeno e direcionamento da resposta
imune adaptativa de células T pelas células dendríticas. A capacidade da resposta imune
inata de combater agentes patogênicos envolve receptores codificados pela linha
germinativa, os receptores de reconhecimento padrão (PRRs). Estes receptores detectam
padrões moleculares evolutivamente conservados do invasor microbiano (PAMPs) e
podem ativar vias pelas quais os monócitos se diferenciam em macrófagos e células
dendríticas para regular a resposta do hospedeiro contra a infecção (BRIGHTBILL et
al., 1999; MEDZHITOV; JANEWAY, 1997).
Os receptores das proteínas do complemento CR1 (CD35) e principalmente CR3
(CD11b/CD18) são PRRs que participam do reconhecimento do M. leprae, promovendo
sua fagocitose ao se ligar ao PGL-I (glicolipídeo fenólico I), existente na capsula do M.
leprae (TABOURET et al., 2010).
Os receptores Toll-like (TLR) são PRRs que compreendem uma família de
receptores transmembrana do tipo I. Até o momento já foram identificados dez TLRs
em humanos (AKIRA et al., 2001). Os heterodímeros de TLR2-TLR1 reconhecem
lipoglicanos micobacterianos como lipoarabinomanana (LAM) (TAPPING; TOBIAS,
2003) e lipoproteínas de 19 KDa (KRUTZIK et al., 2003). Homodímeros de TLR4
também desempenham um papel no reconhecimento de Mycobacterium tuberculosis
(M.tb) e de M. leprae (MEANS et al., 1999). TLR4 reconhece proteína do choque
térmico 65 secretada pelo M.tb. (BULUT et al., 2005). Entretanto, o agonista
reconhecido por TLR4 na hanseníase não está completamente esclarecido. A ativação
destes receptores por agonista estimulam a produção de peptídeos e proteínas
antimicrobianas, citocinas e quimiocinas que coletivamente induzem uma resposta
inflamatória local, aumentam a atividade fagocítica e morte mediada por macrófagos
ativados (PASARE; MEDZHITOV, 2004).
Como o M. leprae é um bacilo intracelular, receptores citoplasmáticos como
nucleotide binding oligomerization domain 2 (NOD2) da família de receptores NOD-
like (NLR) desempenham papel no reconhecimento do bacilo. O receptor NOD2
11
reconhece dipeptídeos muramil (MDP) presentes nos peptideoglicanos do M. leprae. O
MDP é capaz de ativar o inflamassoma, um complexo multiproteíco composto por
NLRs, proteína adaptadora ASC (proteína associada a apoptose contendo domínios
CARD- domínios de recrutamento e ativação de caspases) e a caspase -1. Após ativação
do complexo inflamassoma ocorre a clivagem de pró-citocinas pela caspase-1 e
secreção das formas ativas de IL-1β, IL-18 e IL-33 (CHEN; PEDRA, 2010; MODLIN,
2010). Polimorfismos no gene NOD2 foram associados com hanseníase per se em
pacientes chineses e nepaleses (BERRINGTON et al., 2010; ZHANG et al., 2010).
A célula dentrítica é capaz de reconhecer o M. leprae através dos PRRs,
fagocitar, processar e apresentar o M. leprae para os linfócitos T. Após o
reconhecimento e fagocitose do M. leprae ocorre a secreção de citocinas e quimiocinas
que regulam a inflamação e modulam a resposta imune adaptativa para o tipo Th1 ou
Th2 (SCOLLARD et al., 2006).
Um estudo mostrou que o M. leprae pode ativamente suprimir a
ativação/maturação das células dendríticas (DCs). Expressão de moléculas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I e II foi regulado negativamente em
DCs derivadas de monócitos infectados com bacilos do M. leprae (HASHIMOTO et al.,
2002). Outro estudo que avaliou a capacidade de induzir proliferação e ativação de
células T em resposta à DCs expostas ao M. leprae, M. tuberculosis e Mycobacterium
bovis mostrou que o M. leprae, não induziu ativação / maturação de DCs e também não
induziu proliferação de células T em resposta à DCs estimuladas pelo M. leprae
(MURRAY et al., 2007).
O paradigma Th-1/Th-2, baseado em discriminação funcional das células T-
helper de acordo com o seu padrão de produção de citocinas é importante na
compreensão do amplo espectro clínico da hanseníase (SCOLLARD et al., 2006). No
pólo tuberculóide da hanseníase, há predomínio de resposta imune com perfil Th1 com
produção das citocinas próinflamatórias, como IFN-, fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α), IL-12, IL18, IL-23 e IL-2, que estimulam a atividade fagocítica e microbicida
dos macrófagos promovendo destruição dos bacilos (BARNES et al., 1992; FOSS,
1999). Na forma lepromatosa os pacientes apresentam resposta do tipo Th2, produzindo
principalmente IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 que induzem vigorosa produção de anticorpos
que são ineficientes para a eliminação dos bacilos. Os linfócitos Th2 produzem ainda
IL-10 que atua inibindo tanto a diferenciação dos linfócitos em Th1 como a ativação dos
macrófagos (SCOLLARD et al., 2006).
12
O mecanismo de defesa efetivo contra a infecção pelo M. leprae está relacionado
com resposta imune celular Th1 que promove aumento da produção de mediadores
reativos do oxigênio e do nitrogênio que são importantes para atividade microbicida dos
macrófagos (MURRAY et al., 1985). Entretanto, o M. leprae dispõe de mecanismos de
escape que impedem a fusão do fagossoma com o lisossoma, conseguindo muitas vezes
escapar da destruição pelos reativos do oxigênio e nitrogênio contidos nos lisossomos
dos macrófagos (PIETERS, 2001).
Os antígenos PGL-I e LAM apresentam função supressora na ativação dos
macrófagos, favorecendo a polarização para resposta do tipo Th2 com a produção de
citocinas supressoras. Neste contexto de resposta imune Th2, o M. leprae se dissemina
sem resistência da resposta imune (FOSS, 1999). Pacientes do polo lepromatoso não
desenvolvem resposta imune celular, mas não são imunocomprometidos e não são
propensos aos cânceres ou infecções oportunistas que acometem pessoas com
imunodeficiência. A anergia imunológica associada a pacientes LL é específica para os
antígenos do M. leprae (SCOLLARD et al., 2006).
A família de genes solute carrier family 11 A1(SLC11A1), também conhecido
como NRAMP1, foi descrita pela primeira vez como o gene Ity / Lsh / Bcg que controla
a susceptibilidade de camundongos endogâmicos à patógenos intracelulares, incluindo
M. leprae. Já foi demonstrado que NRAMP1 tem diversos efeitos sobre a função dos
macrófagos, incluindo o controle da ativação e transporte de ferro, mas o mecanismo
pelo qual este gene regula a morte de organismos patogênicos intracelulares permanece
incerto (MISCH et al., 2010). O fenótipo do sistema imunitário adaptativo de
camundongos com mutação em NRAMP apresenta tendência para montar resposta
imune do tipo Th2 (BLACKWELL; SEARLE, 1999).
Um papel importante dos macrófagos na defesa do hospedeiro é a fagocitose de
patógenos microbianos para facilitar a sua remoção. No entanto, na doença
micobacteriana, a fagocitose pode contribuir para a progressão da doença, se os
macrófagos não forem ativados. Macrófagos estimulados por IL-10, citocina presente
em lesões lepromatosas, realizam fagocitose excessiva de bacilos via receptores
scanvenger e receptores de manose, formando células espumosas, repletos de bacilos
que são chamadas de células de Virchow, mas apresentam atividade microbiana
limitada, dessa forma o bacilo se acumula dentro do macrófago. Por outro lado,
macrófagos estimulados por IL-15, presente em lesões tuberculóides, apresentam uma
13
atividade fagocítica menor, entretanto apresentam eficientes vias antimicrobianas e
conseguem eliminar os bacilos fagocitados (MONTOYA et al., 2009).
Várias subpopulações de linfócitos T CD4 tem sido descritas, entre elas as
células T regulatórias (SAKAGUCHI et al., 1995). Um estudo desenvolvido no Egito
observou um maior número de células T regulatórias na circulação sanguínea de
pacientes com hanseníase do que nos controles saudáveis. Uma maior porcentagem de
células T regulatórias foram encontrada em pacientes TT em comparação com os
pacientes LL e com reação do tipo 2 (ATTIA et al., 2010). Estudo brasileiro mais
recente que avaliou a proporção de células T reguladoras em pacientes multibacilares
(LL e BL), paucibacilares (TT e BT) e contatos domiciliares de multibacilares observou
maior proporção da expressão destas células na circulação e em lesões de pacientes
multibacilares (PALERMO et al., 2012).
1.6. Mecanismos do dano ao nervo na hanseníase
Em meados de 1800 patologistas dessecaram nervos periféricos para tentar
determinar se a neuropatia da hanseníase era de origem central ou periférica. A
inflamação foi observada em nervos cutâneos e seus troncos subcutâneos surgindo de
lesões de pele e se extendendo por distâncias variadas (DEHIO, 1897). Com o
desenvolvimento de novas técnicas de histologia foi possível observar inflamação
perineural e intraneural, e a infecção intraneural pelo M. leprae foi reconhecida como
característica patognomônica da doença. Estudos clínicos demonstram que fibras não
mielinizadas também estão envolvidas na lesão do nervo na hanseníase (SURESH et al.,
2008).
O M. leprae pode infectar células de Schwann com e sem mielina, mas infecta
primeiramente células de Schwann sem mielina. Assim, pequenas fibras nervosas são
facilmente afetadas. Este fato pode ser observado clinicamente pela perda da sensação à
estímulos térmicos e dolorosos. A sensação tátil, a qual é conduzida por extensos
axônios com mielina, é afetada tardiamente conforme a progressão da doença
(ILLARRAMENDI et al., 2012).
As células de Schwann fornecem um ambiente favorável à sobrevivência do M.
leprae, primeiramente devido a uma menor resposta do sistema imune nestas células e
14
pela ausência de produção de moléculas antimicrobianas capazes de limitar o
crescimento do bacilo nas células de Schwann. Além disso, a barreira entre o sangue e
os nervos limita a ação de drogas antimicrobianas. Um mecanismo descrito para a
infecção das células de Schawann pelo M. leprae acontece pela ligação do PGL-I do M.
leprae à cadeia alfa 2 da laminina 2 na lâmina basal em volta da célula de Schwann
(RAMBUKKANA, 2001). Estudos in vitro mostram que a ligação do PGL-I à lâmina
basal é suficiente para provocar a internalização do M. leprae (NG et al., 2000). Outros
estudos também demonstraram a capacidade da proteína ligadora de laminina (LBP) de
se ligar às células de Schwann (LIMA et al., 2005).
Granulomas bem organizados que são característicos de lesões tuberculóides
também estão presentes nos nervos e a capacidade destrutiva da inflamação
granulomatosa é provavelmente uma das causas do dano ao nervo de pacientes BB e
BT. Similarmente, o infiltrado cutâneo desorganizado e altamente bacilífero é
reproduzido nos nervos de pacientes lepromatosos. No entanto, o mecanismo de injúria
ao nervo desses pacientes é de mais difícil entendimento, considerando que o nervo
conserva por algum tempo sua integridade básica e é capaz de manter sua função
mesmo estando infectado (JOB, 1971). As células de Schwann sintetizam mielina e a
desmielinização é a última consequência da neurite hansênica. A hipótese de que a
infecção das células de Schwann pelo M. leprae seria a causa direta da disfunção das
células de Schwann ainda não foi provada (SCOLLARD, 2008).
Foi reportado que a ligação de uma lipoproteína de 19 kDa do M. leprae ao
TLR2 na célula de Schwann resulta em apoptose. O papel das citocinas TNF-α, IL-6 e
IL-8 na apoptose mediada pela ativação de TLR2 ainda não está claro. A apoptose gera
injúria nervosa e perda de sensibilidade, contudo é uma via que aumenta a liberação de
antígenos intracelulares que podem ser fagocitados por macrófagos e células dentríticas
e assim ativar a resposta imune adaptativa (OLIVEIRA et al., 2003). O TNF é uma
citocina que causa desmielinização e necrose de oligodendrócitos, mas a introdução de
glicocorticóides pode inibir a secreção dessa citocina (SARNO et al., 1991).
A recuperação clínica e histopatológica dos danos ao nervo após MDT são
variáveis. Um estudo brasileiro avaliou a regeneração nervosa de um total de 45
pacientes: 3 pacientes com hanseníase indeterminada, 35 pacientes PB e 7 com
hanseníase MB. Após o tratamento foi observado que a capacidade regenerativa de
fibras nervosas sem mielina é maior que a das fibras nervosas com mielina, o que reflete
na maior frequência na recuperação da nocicepção (percepção da sensação dolorosa) e
15
sensação térmica comparada à função tátil. A recuperação desta última parece estar
mais associada à remissão do infiltrado inflamatório. Neste mesmo estudo, de 17
pacientes que não tiveram evidência de células de Schwann ou axônio avaliados por
imunohistoquímica com anticorpos anti S-100 (uma proteína específica do tecido
neural) ao diagnóstico, foram encontadas células de Schwann após tratamento apenas
em 2 pacientes, sugerindo que se o dano estiver estabelecido é refratário ao tratamento
(ILLARRAMENDI et al., 2012).
1.7. Reações hansênicas
Um dos maiores complicadores no manejo clínico dos pacientes com hanseníase
é a ocorrência das reações hansênicas. As reações hansênicas são complicações
inflamatórias agudas, que podem ocorrer antes, durante ou após a MDT. Na grande
maioria dos casos o surgimento das reações está relacionado com a instabilidade
imunológica do paciente. Entretanto, alguns fatores predispõe ao aparecimento de
episódios reacionais hansênicos, tais como: doenças intercorrentes, gravidez,
aleitamento, parto, estresse físico ou emocional e uso de algumas drogas (BRITO et al.,
2008; KAHAWITA et al., 2008). Se as reações hansênicas não forem imediatamente
diagnosticadas e tratadas, lesões graves do nervo podem desenvolver-se rapidamente,
com subsequente perda de sensibilidade, deformidades físicas e paralisia (RIJK, DE;
BYASS, 1994).
Estudos populacionais indicam que durante o curso da hanseníase 16-56% dos
pacientes desenvolvem comprometimento irreversível da função do nervo, ocasionado
principalmente devido à estas reações (BRITTON; LOCKWOOD, 2004).
Existem dois tipos mais comuns de reações hansênicas: a reação do tipo 1 (RT1)
ou reversa (RR) e reação do tipo 2 (RT2) ou eritema nodoso hansênico (ENH). Além
disso pode ocorrer também um terceiro tipo de episódio reacional caracterizada por
neurite isolada com dor e espessamento neural sem associação com quadros cutâneos -
denominada neuropatia silenciosa (BRAKEL, VAN; KHAWAS, 1994; BRITO et al.,
2008; KAHAWITA et al., 2008).
16
1.7.1. Reação hansênica tipo 1
A RT1 é caracterizada por imunidade do tipo Th1 in situ, com aumento
espontâneo da imunidade mediada por células e produção de várias citocinas: IFN, IL-
12 (SREENIVASAN et al., 1998), TNF-α, IL-1β (SARNO et al., 1991), IL-2, IL-6 e
IL-8 (MORAES et al., 1999). Recente estudo realizado em uma coorte de 303
indivíduos na Índia, observou além de altos níveis de TNF, fator de crescimento
tumoral beta (TGF) e óxido nítrico sintase induzida (iNOS) em fragmentos de pele de
pacientes com RT1. O mesmo foi encontrado para lesões de nervo com exceção da
iNOS. A concentração de TNF foi elevada antes do episódio reacional e antes do dano
neural. Este estudo demonstra a associação de iNOS e TGF e RT1 (JADHAV et al.,
2011). Outro estudo, do nosso grupo, que avaliou um painel de 27 citocinas em
pacientes com RT1, RT2 e pacientes que não desenvolveram reação hansênica,
verificou elevações nos níveis de CXCL-10 e IL-6 em pacientes com RT1 (STEFANI et
al., 2009).
Clinicamente, a RT1 se apresenta com um quadro de inflamação, infiltração de
lesões pré-existentes e surgimento de novas lesões dermatológicas, com ou sem neurite.
A neurite aguda se não for tratada rapidamente de forma adequada pode causar perda
permanente da função nervosa provocando neuropatia sensorial e motora
(BARNETSON et al., 1975; GODAL et al., 1973). A RT1 é frequentemente recorrente
(KAHAWITA et al., 2008) e usualmente ocorre em pacientes classificados com BT, BB
e BL (BARNETSON et al., 1976; BJUNE, 1983; BRAKEL, VAN et al., 1994).
Entretanto, indivíduos com forma polar TT da hanseníase também podem desenvolver
RT1 (KAHAWITA et al., 2008). Ao histopatológico a RT1 apresenta edema, infiltrado
de linfócitos e células gigantes de Langhans com perda da organização normal do
granuloma (JOB, 1994).
Na hanseníase PB a RT1 precisa ser diferenciada de recidiva para que o
tratamento adequado possa ser administrado. O diagnóstico de recidiva deve ser
confirmado pelo exame de esfregaço de pele ou por uma biópsia de pele. Clinicamente,
na RT1, o início dos sintomas é súbito, com exacerbação das lesões pré-existentes e
algumas novas lesões. A inflamação dos nervos é comum e se desenvolve rapidamente.
Em contraste, na recidiva, o início dos sintomas é insidioso apresentando novas lesões
sem exacerbação das lesões pré-existentes. O dano neural geralmente se desenvolve
lentamente (YAWALKAR, 2009). Além disto, devem ser considerados no diagnóstico
17
diferencial da RT1 a psoríase, infecções por dermatófitos e linfoma cutâneo de células T
(NUNZI; FIALLO, 1994).
Pacientes co-infectados com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e M.
leprae podem desenvolver RT1 após a introdução da HAART (Highly Active Anti
Retroviral Therapy) devido a Síndrome da Reconstituição Imune que consiste em uma
reorganização da imunidade devido ao aumento das células CD4+ (PEREIRA et al.,
2004; USTIANOWSKI et al., 2006). Outros fatores de risco para a ocorrência da RT1
são maior número de lesões; idade mais avançada; índice baciloscópico mais alto
(KUMAR et al., 2004; RANQUE et al., 2007); grau de incapacidade fisica 1 ou 2 ao
diagnóstico (SCHREUDER, 1998); puerpério (LOCKWOOD; SINHA, 1999); e uso de
infliximab para tratamento de outras doenças como Doenca de Crohn, artrite reumatoide
e psoriase. O infliximab é um inibidor do TNFα, citocina importante no controle da
infecção micobacteriana (KEANE, 2004). Em um estudo, houve uma tendência de
aumento da presença de células T regulatórias em biópsias de pacientes com RT1 em
comparação com pacientes com RT2 e pacientes sem reação (MASSONE et al., 2010).
Para o tratamento da RT1 o Ministério da Saúde recomenda a administração de 1
a 2 mg/kg/dia de corticoesteróides com diminuição gradual da dosagem, conforme
avaliação clínica (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002).
1.7.2. Reação hansênicas tipo 2
A RT2 ou Eritema Nodoso Hansênico (ENH) foi originalmente descrita pelo
dermatologista japonês Mouske Murata em 1912. A RT2 se caracteriza por uma
resposta inflamatória sistêmica, com infiltração de neutrófilos, ativação do
complemento, deposição de complexos imunes extravasculares e altos níveis de TNFα
nas lesões e na circulação (MABALAY et al., 1965; RIDLEY; RIDLEY, 1983;
WEMAMBU et al., 1969). Pacientes com RT2 apresentam um aumento na proporção
de linfócitos T helper, especialmente do tipo Th2 que estimulam a diferenciação de
plasmócitos e produção de imunoglobulinas, e diminuição do número de células T
reguladoras (CUEVAS et al., 2007; VIEIRA et al., 1996). Entretanto, há evidência do
envolvimento de ambos os tipos de respostas, Th2 e aumento transitório da resposta
Th1 na patogênese da RT2 (MORAES et al., 1999; NATH et al., 2000;
SREENIVASAN et al., 1998; TELES et al., 2002).
18
A RT2 pode ocorrer em pacientes classificados como BL e LL e manifesta -se
através do aparecimento abrupto de nódulos eritematosos e dolorosos que podem se
desenvolver na face, extremidades, ou tronco, além de pápulas e placas, que podem
ulcerar ou pustulizar-se nos locais onde há lesões e infiltrados prévios. O paciente com
RT2 pode apresentar sintomas sistêmicos como febre, mal-estar, aumento dos
linfonodos, dores articulares, neurites, hepato-esplenomegalia, irites, iridiciclites,
orquites, orquiepididimites (GOMEZ; GARCIA, 1950; JOPLING, 1970; WALLACE;
JOPLING, 1969). As lesões são geralmente eritematosas, com infiltração, calor local e
dor, podendo chegar à necrose e ulceração (YAWALKAR, 2009). A maioria dos
pacientes apresentam múltiplos episódios reacionais no decorrer da infecção e após o
tratamento (KAHAWITA et al., 2008; POCATERRA et al., 2006).
A RT2 pode se apresentar de forma contínua ou intermitente. A forma contínua
pode persistir por muitos meses e é comumente grave. A forma intermitente é
caracterizada por episódios de RT2 seguidos por um período livre de reação e pode ser
classificada como leve ou grave. Na forma leve, a RT2 pode ser associada com dor
suave ou sensibilidade do nervo, sem perda de função. Frequentemente existe alguma
febre e mal-estar. A RT2 intermitente é classificada como grave se for acompanhada por
alta temperatura e mal-estar geral, se as lesões de pele tornarem-se purulentas e / ou
com ulceração, se os nervos tornarem-se dolorosos ou se ocorrer perda da função do
nervo, se houver evidência de iridociclite, orquite, albuminúria persistente ou inchaço
nas articulações. Muitas vezes, na RT2 há edema sem depressões da face, mãos e / ou
pés (YAWALKAR, 2009).
Existe uma variante rara, e associada à altas taxas de mortalidade, da reação
hansênica tipo 2, denominada Fenômeno de Lúcio ou eritema necrosante,
primeiramente descrito no México por Lúcio e Alvarado, em 1852 e revisado por Latapi
e Chavez-Zamora em 1948. A apresentação clínica é caracterizada pela proliferação
exacerbada de bacilos, que invadem a parede dos vasos sanguíneos, causando
proliferação endotelial e diminuição do lúmen vascular, que associado à reações
inflamatórias e alterações no sistema da coagulação, causa trombose vascular, isquemia,
infarto e necrose tecidual. A análise de DNA de amostras de autópsias e biópsia de
pacientes com Fenômeno de Lúcio detectou variação no gene 16S de RNA ribossomal
(rRNA), o qual é um marcador altamente conservado da evolução bacteriana, e em
outros genes menos conservados. Este resultado forneceu evidências suficientes para
apoiar a conclusão de que este DNA é distinto do M. leprae, consistente com a presença
19
de uma nova espécie micobacteriana, o Mycobacterium lepromatosis (HAN et al., 2008,
2009).
Lesões de RT2 podem ser confundidas com nódulos eritematosos que podem se
desenvolver em casos de recidiva de hanseníase multibacilar. Em pacientes com
hanseníase multibacilar, a recidiva pode se manifestar como um agravamento clínico
das lesões já existentes ou como o aparecimento de novas lesões que podem se
assemelhar à RT2. No entanto, nódulos ou placas de RT2 tendem a apresentar edema,
são geralmente dolorosos e desaparecem em poucos dias (YAWALKAR, 2009).
A celularidade presente no histopatológico varia de acordo com o momento da
biópsia. Em lesões agudas há predomínio de neutrófilos com aumento posterior de
linfócitos, plasmócitos e histiócitos. Outras características são edema da derme e
subcutânea, vasculite e paniculite (MABALAY et al., 1965). Dentre as células T, o
predomínio é de células T CD4+ em contraste com pacientes lepromatosos, nos quais
predominam células T CD8+ (MODLIN et al., 1983). Na lesão são detectadas as
citocinas TNFα e IL-6 enquanto a IL-4 está ausente ou em baixas concentrações o que
reforça o papel Th1 na RT2 (TELES et al., 2002). Foram também observados altos
níveis de proteína C reativa , IL-7 e platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB) em
pacientes com RT2 (FOSS et al., 1993; SILVA et al., 2007; STEFANI et al., 2009).
Para o tratamento da RT2 moderadas a graves deve ser administrado
corticosteroides e talidomida. A administração de anti-inflamatórios não esteroidais
como a clofazimida é uma possibilidade para tratamento de RT2 leve. Ainda são
necessários mais estudos sobre a dosagem de corticosteróides e seu impacto a longo
termo no tratamento de pacientes com reação hansênica. Taquifilaxia (redução do efeito
da droga por consequência do uso continuo) aos corticosteróides pode ser desenvolvida
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002; POCATERRA et al., 2006; YAWALKAR, 2009).
A talidomida tem ação rápida na redução do número de lesões, febre e sintomas
sistêmicos. Entretanto, sua recomendação deve ser extremamente cautelosa devido ao
potencial teratogênico da droga (IYER; RAMU, 1976; LARY et al., 1999). Deve ser
apresentado resultado de teste de gravidez negativo antes da prescrição do tratamento. O
teste de gravidez deve ser repetido mensalmente, além da prescrição de dois métodos
contraceptivos (WALKER et al., 2007).
Apesar de vários estudos desenvolvidos, o mecanismo de ação da Talidomida
para o controle da RT2 não está completamente elucidado (MARTINIUK et al., 2012).
Inibição da fosforilação de p38 e extracellular-signal-regulated kinases 1 (ERK1)/
20
mitogen-activated protein kinases 2 (MAPKs 2), resultando na modulação do fator
nuclear kappa beta (NF-Кβ) com consequente redução da produção de TNF-α
(HERNANDEZ et al., 2011), e o equilíbrio entre imunoestimulação e regulação de
citocinas Th17 (MARTINIUK et al., 2012) foram alguns dos mecanismos propostos por
estudos recentes.
1.8. Aspectos genéticos das reações hansênicas
Conforme revisão de Fava et al. (2012), até o momento, um número limitado de
estudos investigou os efeitos de variações genéticas que controlam a susceptibilidade às
reações hansênicas. Alguns resultados são inconclusivos ou não foram replicados. Em
um estudo realizado na Etiópia um alelo de microssatélite de 280 bp de comprimento de
TLR2 foi associado com um risco aumentado de desenvolver RT1, enquanto que o
polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), rs3804099 foi associado como fator protetor
pra RT1 (BOCHUD et al., 2008). Um polimorfismo TLR1 não-sinônimo (rs5743618;
I602S), alelo G, foi associado como fator protetor para RT1 (MISCH et al., 2008), mas
este resultado não foi confirmado para a população de Bangladesh. Neste mesmo estudo
em Bangladesh, um polimorfismo não sinônimo de TLR1, rs4833095 (N248S) foi
descrito como fator protetor para RT2 (SCHURING et al., 2009).
A forma ativa da vitamina D (1,25 (OH) 2D3) é conhecida reguladora da
resposta imune do hospedeiro contra a infecção e polimorfismos do gene do receptor da
vitamina D (VDR) estão associados com hanseníase (MIRA, 2006). Em uma amostra
do Nepal, o alelo T do SNP rs2228570 do gene VDR foi um fator de risco
estatisticamente significante para RT1 (SAPKOTA et al., 2010).
NRAMP1 foi descrito como um gene envolvido na resistência/susceptibilidade à
patógenos intracelulares em camundongos. Um estudo brasileiro de 201 casos de
hanseníase revelou que o SNP 274C / T do NRAMP1 está associado com reações
hansênicas. A presença do alelo "C" foi observado como fator de risco para RT1 e fator
protetor para RT2 (MALIK et al., 2005).
Com base nos potentes efeitos pró-inflamatórios associados com a sua
capacidade para induzir a produção de anticorpos, a hipótese que a IL-6 desempenha um
papel da IL-6 na patogênese da RT2 têm sido proposta. Em um estudo, os níveis de IL-6
foram mais elevados em RT2 comparado com RT1 (SOUSA et al., 2012). No mesmo
21
estudo, o impacto das variantes genéticas de IL-6 na suscetibilidade às reações foi
investigado em uma amostra populacional de 409 casos de hanseníase. Tag SNPs foram
selecionados para cobrir o gene IL-6 e a sua região promotora. Não foi observada
associação entre os marcadores de IL-6 e RT1. No entanto, três tag SNPs (rs2069832,
rs2069840 e rs2069845) foram significativamente associados com RT2, quando os
casos foram comparados aos pacientes sem reação do pólo lepromatoso.
RT2 é uma doença mediada por imunocomplexos e os componentes do sistema
do complemento C3b e C4b são conhecidos por induzir a opsonização dos componentes
microbianos para facilitar a fagocitose pelos macrófagos. A freqüência do alelo C4B *
Q0 foi associado com risco à hanseníase per se quando os casos foram comparados com
controles saudáveis e significativamente maiores entre os casos RT2, quando
comparados com os pacientes lepromatosos que não tiveram reação (MESSIAS, DE et
al., 1993).
1.9. Reatividade Sorológica ao PGL-I na Hanseníase e nas Reações
Hansênicas
Brennan e Barrow (1980) encontraram frações lipídicas do M. leprae sorologicamente
ativas que continham um importante componente glicolipídico. Em um trabalho
subsequente, foi demonstrado que este glicolipídeo fenólico estava estreitamente
relacionado, mas não era idêntico ao micosídeo A do Mycobacterium kansasii. A
diferença fundamental entre os dois produtos estava na composição de trissacarídeos. O
micosídeo A é composto por 2,4-di-O-metil-rhamnose, 2-O-metil-rhamnose e 2-0-
metil-fucose, enquanto que o glicolipídeo derivado do M. leprae era composto por 2,3-
di-O-metil-rhamnose, 3-O-metil-rhamnose e 3,6-di-O-metil-glicose. Portanto, embora a
atividade sorológica do glicolipídio fenólico ainda fosse uma questão discutível, havia
pouca dúvida de que a combinação de açúcares no produto do M. leprae fosse única,
pois a presença de 3,6-di-O-metil-glicose na natureza não tinha sido previamente
relatada, nem tinha sido encontrado anteriormente 2,3-di-O-metil-rhamnose e 3-O-
metil-rhamnose em um oligosacárido(HUNTER; BRENNAN, 1981).
O glicolipídeo fenólico I (PGL-I) estimula a produção de anticorpos da classe
IgM devido a sua natureza glicolipídica. A sorologia anti PGL-I não apresenta reação
cruzada com o M. tuberculosis ou com outras micobactérias conhecidas (CHO et al.,
22
1992). Devido a imunogenicidade da porção glicídica do PGL-I, vários estudos
propuseram a produção sintética da porção trissacarídea ou dos terminais
monossacarídeo e dissacarídeo associados a carreadores hidrossolúveis (BSA/HSA).
Dentre os análogos sintéticos do PGL-I estão: monossacarídeo–octyl–BSA (M-O-BSA)
(FUJIWARA et al., 1987), dissacarídeo natural-octyl–BSA (ND–O–BSA)
(CHATTERJEE et al., 1986) e o trissacarídeo natural-phenil–BSA (NT-P-BSA)
(FUJIWARA et al., 1987).
Atualmente, o ensaio sorológico para hanseníase melhor avaliado e padronizado
baseia-se na detecção de anticorpos IgM para este glicolipídeo fenólico específico do M.
leprae, o PGL-I (MOURA et al., 2008). A sorologia anti-PGL-I não permite distinguir
entre infecção antiga ou recente e não deve ser utilizada de forma isolada como
ferramenta de diagnóstico (OSKAM et al., 2003). A sorologia anti-PGL-I se
correlaciona com a carga bacilar do paciente, pacientes MB apresentam alta taxa de
soropositividade enquanto a grande maioria dos pacientes PB tem sorologia negativa.
Esta correlação justifica sua aplicação como ferramenta auxiliar na classificação correta
entre hanseníase MB ou PB dos pacientes recém diagnosticados contribuindo para
decisões terapêuticas adequadas (BÜHRER et al., 1998; BUHRER-SEKULA et al.,
2000; BÜHRER-SEKULA et al., 1998; BÜHRER-SÉKULA et al., 2001, 2003; CHO et
al., 2001). A alta prevalência de soropositivos entre contatos de pacientes de hanseníase
pode evidenciar infecção subclínica com M. leprae (DESFORGES et al., 1989;
MENZEL et al., 1987; SAAD et al., 1990).
Estudos têm demonstrado que a presença de altos níveis de anticorpos anti PGL-
I pode ser um fator de risco para o desenvolvimento de reações hansênicas e danos aos
nervos. Pacientes que apresentam persistência de sorologia anti-PGL-I após o
tratamento apresentaram 10,4 vezes maior risco de desenvolver reação quando
comparados aos pacientes com sorologia negativa (BRITO et al., 2008). Outros estudos
mostraram que pacientes com hanseníase apresentando altas concentrações de
anticorpos anti-PGL-I no início do tratamento têm um risco maior de desenvolver
reação do Tipo 1 (JADHAV et al., 2011; ROCHE et al., 1997). Diante disso, o PGL-I
poderia ser utilizado como uma ferramenta prognóstica no desenvolvimento de reações
hansênicas. Portanto, o monitoramento destes pacientes, bem como a introdução
precoce do tratamento são fatores importantes na redução de um possível dano neural e
incapacidades físicas resultantes das reações.
23
Testes em formato “point of care” (POC) baseados na detecção de anticorpos
específicos para o PGL-I, que fornecem resultado rápido e sem necessidade de
condições especiais de armazenamento e mão de obra especializada, foram
desenvolvidos com o objetivo de facilitar o diagnóstico/classificação da hanseníase
(MB/PB), e identificar contatos domiciliares que estão em risco de desenvolver a
doença em áreas endêmicas (BÜHRER et al., 1998; BUHRER-SEKULA et al., 2000;
BÜHRER-SÉKULA et al., 2003, 2009). Estes testes poderiam ser úteis na identificação
de pacientes com maior risco de desenvolver reação hansênica.
1.10. Uso de proteínas recombinantes do M. leprae na sorologia de pacientes
com hanseníase e nas Reações Hansênicas.
Após a decodificação do genoma completo do M. leprae, a engenharia genética
permitiu a produção de proteínas recombinantes para serem utilizadas como antígenos
em vários imunoensaios e na produção de vacinas (COLE et al., 2001). Testes
sorológicos (ELISA) para detecção de anticorpos contra proteínas recombinantes do M.
leprae tem revelado novos antígenos candidatos ao uso no diagnóstico da hanseníase,
especialmente para pacientes com hanseníase MB (ARÁOZ et al., 2006; DUTHIE et
al., 2007, 2010; GELUK et al., 2009; SPENCER et al., 2005).
O desenvolvimento de testes laboratoriais para o diagnóstico da hanseníase,
representa prioridade em pesquisa e tem sido explorado por vários grupos no mundo.
Este tema representa uma linha de pesquisa consolidada pelo nosso grupo do
Laboratório de Imunologia da AIDS e da Hanseníase IPTSP/UFG, que conta com
parcerias e financiamentos internacionais. Até o momento, nosso grupo de pesquisa
avaliou a imunoreatividade humoral e celular de mais de 50 novos antígenos do M.
leprae (DUTHIE et al., 2007, 2008; SAMPAIO et al., 2011).
A imunoreatividade sorológica a proteínas recombinantes do M. leprae, em
ensaios de ELISA para detecção de IgG revelaram potenciais antígenos candidatos ao
uso no diagnóstico sorológico da hanseníase MB. Um estudo realizado nas Filipinas
demonstrou que em pacientes MB as proteínas ML0405 e ML2331 foram consideradas
específicas e imunogênicas (REECE et al., 2006). Estes achados foram confirmados em
24
estudo semelhante realizado utilizando em amostras de pacientes com hanseníase
provenientes das Filipinas, Brasil e Japão (DUTHIE et al., 2007).
Foi previsto em uma análise bioinformática que ML0405 seria uma das proteínas
do M. leprae mais promíscuas estudadas até a data, contendo epítopos de células T
reconhecidos por 50 dos 51 alelos de HLA-DR, juntamente com sete potenciais
epítopos de células T e 39 potenciais epítopos de células B. Enquanto que ML2331
continha 24 potenciais epítopos de célula B (SAMPAIO et al., 2011). A fusão destas
duas proteínas, a qual foi denominada leprosy IDRI diagnostic 1 (LID-1) tem
demonstrado ser eficaz na detecção de respostas de anticorpos em praticamente todos os
pacientes MB, com especificidade e sensibilidade maior quando comparadas com as
proteínas recombinantes isoladas, sugerindo que a proteína de fusão poderia ser
utilizada para o diagnóstico da hanseníase antes do aparecimento dos sintomas
(DUTHIE et al., 2007, 2010).
Estudo recente que testou LID-1 e outras proteínas recombinantes do M. leprae
em duas regiões endêmicas para hanseníase no Brasil mostrou que estas proteínas foram
imunogênicas e específicas quando avaliadas em um largo painel de amostras de
pacientes MB e PB, controles endêmicos e contatos domiciliares (HUNGRIA et al.,
2012). Estes estudos de imunoreatividade sorológica indicam que a detecção de IgG
frente às proteínas recombinantes do M.leprae são antígenos potenciais que podem
auxiliar o diagnóstico da hanseníase, associadas ao PGL-I, histopatológico e
baciloscopia.
Um estudo que avaliou o desenvolvimento de um teste em formato POC para
proteínas mostrou que um teste dual-path platform (DPP) usando LID-1 como antígeno
foi 100 vezes mais sensível que o teste lateral flow (LF) convencional (DUTHIE et al.,
2008). Esse estudo demonstra que um teste simples pode ser realizado dentro de
minutos e sem conhecimentos técnicos especializados, para facilitar o diagnóstico da
hanseníase em locais onde quando as instalações de laboratório não estão disponíveis ou
quando os resultados são necessários no ponto de atendimento.
Até o momento nenhum imunomarcador individual ou combinação de
marcadores foi associado com o surgimento das reações, condição esta necessária para
habilitar seu uso diagnóstico ou prognóstico para pacientes com RT1 ou RT2
(STEFANI et al., 2009). Devido à gravidade dos episódios reacionais e como podem ser
confundidos com recidivas quando ocorrem após o tratamento, a identificação de
potenciais marcadores laboratoriais para seu diagnóstico pode representar importante
25
ferramenta no manejo clínico e na prevenção de deformidades e incapacidades em
pacientes com hanseníase.
A potencial aplicação dos testes sorológicos empregando novos antígenos/
proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com reação hansênica ainda não foi
explorada. Desta forma, o valor diagnóstico e ou prognóstico dos testes sorológicos com
proteínas recombinantes do M. leprae merece ser investigado.
26
2. JUSTIFICATIVA
As reações hansênicas são as principais responsáveis pela morbidade na
hanseníase representando a maior causa de incapacidades físicas e deformidades
permanentes decorrentes do dano ao nervo que pode se desenvolver rapidamente
durante os episódios reacionais. Além disso, as reações hansênicas podem ocorrer
antes, durante ou mesmo após a conclusão da terapia específica e cura microbiológica
da infecção podendo ser erroneamente diagnosticadas como recidiva quando ocorrem
após término do tratamento.
Até o momento não dispomos de biomarcadores que indiquem predisposição à
ocorrência de episódios reacionais. Portanto, a identificação de potenciais marcadores
imunológicos das reações hansênicas pode contribuir para o diagnóstico precoce e para
o desenvolvimento de estratégias profiláticas em indivíduos com maior risco,
prevenindo assim os danos neurais e incapacidades físicas permanentes irreversíveis
associadas às reações hansênicas.
Neste sentido este estudo visa avaliar o potencial de testes sorológicos
empregando novos antígenos do M. leprae para o diagnóstico e/ou prognóstico das
reações hansênicas.
27
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a reatividade sorológica à proteína recombinate de fusão do M. leprae LID-
1 e ao glicolipídio fenólico PGL-I do M. leprae em amostras de soro de pacientes com
reação hansênica tipo 1 e tipo 2, e em pacientes com hanseníase que não desenvolveram
reação hansênica.
3.2 Objetivos Específicos
3.2.1. Avaliar a presença de anticorpos da classe IgM para PGL-I e IgG para LID-1 em
amostras pareadas de pacientes MB que não desenvolveram reação hansência colhidas
ao diagnóstico e após MDT;
3.2.2. Avaliar a presença de anticorpos da classe IgM para PGL-I e IgG para LID-1 em
amostras pareadas de pacientes MB colhidas na vigência e na ausência de reação tipo 1;
3.2.3. Comparar a reatividade sorológica de IgM anti PGL-I e IgG anti LID-1 em
pacientes MB que desenvolveram reação tipo 1 com a reatividade de pacientes com
hanseníase e que não desenvolveram reação;
3.2.4. Avaliar a reatividade de anticorpos da classe IgM para PGL-I e IgG para LID-1
em amostras de soro pareadas de pacientes MB colhidas na vigência e na ausência de
reação tipo 2;
3.2.5. Comparar a reatividade sorológica IgM anti PGL-I e IgG anti LID-1 em pacientes
MB que desenvolveram reação tipo 2 com a reatividade de pacientes com hanseníase
com e que não desenvolveram reação;
3.2.6. Avaliar a presença de anticorpos da classe IgM para PGL-I e IgG para LID-1 em
amostras pareadas de pacientes PB que não desenvolveram reação hansênica colhidas
ao diagnóstico e após MDT;
28
3.2.7. Avaliar a reatividade de anticorpos da classe IgM para PGL-I e IgG para LID-1
em amostras de soro pareadas de pacientes PB colhidas na vigência e na ausência de
reação tipo 1;
3.2.8. Comparar a reatividade sorológica IgM anti PGL-I e IgG anti LID-1 em pacientes
PB que desenvolveram reação tipo 1 com a reatividade de pacientes com hanseníase e
que não desenvolveram reação.
29
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 População de Estudo
Este é um estudo retrospectivo analítico com amostras de soro de uma coorte de
72 pacientes com hanseníase que foram monitorados durante MDT quanto ao
surgimento de reações hansênicas. Os pacientes foram recrutados no Centro de
Referência em Diagnóstico e Terapêutica (CRDT) em Goiânia- Goiás no período de
2004 a-2005 e 2009 -2012, após avalição dermato-neurológica e assinatura do termo de
consentimento livre esclarecido (TCLE) .
Todos os pacientes incluídos neste estudo foram classificados de acordo com os
critérios de Ridley e Jopling baseados em dados clínicos, de baciloscopia,
histopatológicos e imunológicos. Os pacientes com as formas Ridley Jopling LL,BL ou
BB foram agrupados na categorias multibacilar (MB) e pacientes TT e BT foram
agrupados como paucibacilares (PB).
4.1.2 Fluxograma da coleta de amostras
Figura 6. Fluxograma da coleta de amostras.
Pacientes
diagnosticados durante
a reação hansênica
(sem tratamento para
reação)
MB com RT1
MB com RT2
PB com RT1
1ª coleta Término do
tratamento
para reação
2ª coleta
Pacientes com
hanseníase PB/MB
sem reação e
virgens de
tratamento
1ª coleta
Manifestação
de reação
durante a
MDT
Final da MDT sem
manifestação de reação
MB com RT1
MB com RT2
PB com RT1
2ª coleta
30
4.1.3 Coleta
As reações hansênicas podem se manifestar antes, durante e após a MDT. Em
geral, quando a reação se manifesta antes da MDT o diagnóstico de hanseníase e de
reações hansênicas ocorre no mesmo momento. Independentemente do momento da
reação (ao diagnóstico ou durante MDT) todos os pacientes foram acompanhados e
tiveram amostra biológica colhida na vigência e na ausência de reação hansênica.
Portanto, os pacientes diagnosticados durante a vigência de reação hansênica foram
acompanhados e nova amostra colhida após o término do tratamento das reações. Para
os pacientes diagnosticados sem sinais e sintomas de reações e que vieram a manifestar
reações durante o tratamento, amostras biológicas foram colhidas ao diagnóstico (sem
reação) e durante a manifestação da reação. As amostras de pacientes que não
desenvolveram reação foram colhidas ao diagnóstico e após a MDT.
As amostras de soro separadas por centrifugação foram armazenadas a -20ºC no
Laboratório de Imunologia da AIDS e Hanseníase (LIAH) no IPTSP/UFG, onde os
testes sorológicos foram realizados.
4.1.4 Critérios de inclusão:
- Pacientes com diagnóstico de hanseníase sem tratamento específico, de ambos os
sexos, de qualquer faixa etária que não tenham desenvolvido nenhum tipo de reação
hansênica durante acompanhamento.
- Pacientes com diagnóstico de hanseníase sem tratamento específico, de ambos os
sexos, de qualquer faixa etária que estavam em reação hansênica tipo 1ou tipo 2, ao
diagnóstico, sem medicação específica para o quadro reacional.
4.1.5 Critérios de exclusão:
- Pacientes com hanseníase que possuíam a forma neural pura ou indeterminada-
Gestantes.
- Pacientes com hanseníase que desenvolveram Fenômeno de Lúcio.
- Individuo HIV positivo.
- Pacientes com doenças crônicas como diabetes e hipertensão
- Hepatites, doenças renais crônicas e neoplasias
31
4.1.6 Grupos de estudo:
Figura 7. Organograma dos grupos de pacientes Multibacilares.
Figura 8. Orgamograma dos grupos de pacientes Paucibacilares.
32
4.2 Proteína de fusão do M. leprae LID-1
LID-1 é uma proteína de fusão gerada a partir das proteínas recombinantes
ML2331 e ML0405 previamente identificadas como fortemente reativas em pacientes
com hanseníase multibacilar de diferentes regiões geográficas. A proteína LID-1, lote
#509-02, utilizada neste estudo foi produzida pelo IDRI (Infectious Disease Research
Institute - Seattle, WA, EUA).
4.3 Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para detecção de IgG para LID-1
A reatividade sorológica à LID-1 em pacientes com reações hansênicas foi
avaliada por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA) conforme descrito abaixo:
Placas de poliestireno para ELISA (Nunc Maxisorp) foram sensibilizadas com 100
μL de LID-1 (2 μg/mL), em tampão bicarbonato, pH 9.6, seguido de uma incubação
‘overnight’ a 4°C. Após o período de sensibilização, as placas foram incubadas por 1h a
temperatura ambiente (15-25ºC) com 200 μL de solução de bloqueio (tampão fosfato de
sódio contendo 0.04 % de tween 20 [PBS-T] e 1% de albumina bovina [BSA]). As
placas foram lavadas cinco vezes com PBS-T e duas vezes com PBS e em seguida
adicionados, a cada poço da placa, 100 μL dos soros em duplicata diluídos 1/200 em
PBS-T com 0.1% de BSA. Após 2 h de incubação a temperatura ambiente, as placas
foram lavadas e foram adicionados 100 μL de conjugado (anti IgG – peroxidase) diluído
1/5000 em PBS-T e 0.1% de BSA. As placas contendo o conjugado foram incubadas
por 1 h, seguido de mais uma etapa de lavagem. A reação foi desenvolvida mediante o
uso do cromógeno Tetrametilbenzidina (TMB) contendo o substrato, peróxido de
hidrogênio, seguida de uma incubação de 15 min a temperatura ambiente. A reação foi
finalizada com a adição de ácido sulfúrico (H2SO4) a 1 N. A densidade óptica foi
detectada em um leitor de ELISA (Thermo Labsystems) usando filtro de 450 nm.
O limiar de reatividade (cutoff) foi definido como duas vezes o desvio padrão da
média da densidade ótica (DO) de indivíduos saudáveis de área endêmica (Goiás).
Desta forma, amostras com DO superiores a 0.300 foram consideradas positivas e
amostras com DO abaixo de 0.300 foram consideradas negativas (DUTHIE et al.,
2007). Os resultados foram expressos como a média de absorbância das duplicatas.
Foram usadas amostras com DO conhecido como controles positivos e negativos.
33
4.4 ELISA para detecção de IgM para o PGL-I
O ensaio de ELISA para detecção de anticorpos IgM contra o PGL-I do M. leprae
foi realizado usando como antígeno análogo sintético do PGL-I, o trissacarídeo NT-P-
BSA, o qual foi generosamente concedido pelo Dr. Fujiwara (Universidade de Nara,
Japão). O antígeno foi diluído com base na sua concentração de açúcar (0,01 µg de
açúcar/ml) em tampão volátil de acetato de amônia carbonado (pH 8.2). Placas para
ELISA (Nunc Maxisorp) foram sensibilizadas com 50 μL de NT-P-BSA ou BSA (que
foi usado como controle) e incubadas overnight a temperatura ambiente. Os sítios não
sensibilizados pelo antígeno nas placas foram bloqueados por incubação de 60 minutos
com 100μL de solução bloqueio de PBS 1% (m/v) BSA a 37 oC. Após quatro lavagens
com PBS 0,1% (v/v) Tween-20 (PBS-T), adicionou-se soro diluído 1:300 em PBS-T
contendo 10% (v/v) soro normal de cabra (NGS). As placas foram incubadas a 37oC por
60 minutos, seguido por outro passo de lavagem. Foi adicionado 50μL do conjugado
anti IgM humana ligada a peroxidase (Jackson ImmunoResearch-EUA) diluído a
1:2000 em PBS-T-10% BSA. Após incubação a 37oC por 60 minutos, o procedimento
de lavagem foi repetido. A reação foi desenvolvida pela adição do substrato e
cromógeno (TMB – Sigma-Home made) em cada poço. Visando controlar a variação
intra teste, um soro de referência foi incluído em quadruplicata em cada placa. A reação
foi interrompida adicionando-se 2.5N H2SO4 quando a densidade ótica (DO) do soro de
referência atingia um valor de 0.6 a 450 nm. Todas as amostras de soro foram testadas
em duplicata e os resultados de ELISA foram expressos como a média de absorbância
das duplicatas. O valor da DO das amostras foi calculado subtraindo do valor da DO de
cada amostra de soro frente ao PGL-I, a média dos valores da DO obtidos para cada
amostra nos poços sensibilizados com BSA, este sendo referente a ligações
inespecíficas (BÜHRER-SEKULA et al., 1998). O limiar de reatividade (cutoff) foi
definido como 0.25. Foram usadas amostras com DO conhecido como controles
positivos e negativos.
4.5 Aspectos éticos e financeiros
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das
Clinicas/UFG e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP). Todos os
34
participantes foram informados sobre os objetivos da pesquisa e sobre os procedimentos
envolvidos e recrutados após assinatura do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE) de acordo com a resolução 196/1996 do Conselho Nacional de
Saúde. Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro das seguintes agências de
fomento dos EUA: Heiser Program for Research in Leprosy NY Community Trust, e
da American Leprosy Missions.
4.6 Análises estatísticas
Os programas GraphPad Prism (versão 5) e MS Excel (2007) foram utilizados
para os cálculos de média, mediana, desvios padrões e elaboração dos gráficos. A
avaliação da significância estatística foi realizada por meio do teste de Kruskall-Wallis
para comparação de múltiplos grupos e por Mann-Whitney para comparação entre dois
grupos. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando o valor
de p < 0.05. Análises da frequência de reatividade foram feitas em amostras pareadas
do mesmo paciente, colhidas na vigência e ausência de reação hansênica e em amostras
colhidas ao diagnóstico e após MDT para pacientes que não desenvolveram reação
hansênica. Foram realizadas análises das amostras estratificadas por grupos segundo a
classificação dos pacientes (MB e PB), tipo de reação hansênica (RT1 e RT2) e tempo
de ocorrência das reações (ao diagnóstico e durante MDT) e comparados aos resultados
de pacientes com hanseníase que não desenvolveram reação hansênica.
35
5. RESULTADOS
5.1 Características gerais dos grupos de estudo
Um total de 73 participantes foi incluído no estudo segundo a clínica ao diagnóstico
ou a evolução clínica durante MDT. A idade dos pacientes variou de 17 a 87 anos com
mediana de 49 anos. O grupo de pacientes que desenvolveram RT2 apresentou
diferença estatisticamente significativa de idade quando comparados ao grupo controle
MB (p=0.026). Quanto ao gênero, a maior proporção dos pacientes era do sexo
masculino. A mediana de índice baciloscópico (IB) entre os pacientes MB não
apresentou diferença significativa, os pacientes MB que desenvolveram reação do tipo 1
e tipo 2 tiveram mediana de IB de 3+, enquanto que os pacientes MB que não
desenvolveram reação tiveram a mediana de 2.5+. Nos pacientes PB (com RT1 e
controle PB) a mediana de IB foi 0 (±0.0). As principais características dos grupos de
estudo estão descritas na Tabela 1.
Tabela 1. Composição e características principais do grupo de estudo.
RJ: Classificação de Ridley e Jopling; MB: Hanseníase Multibacilar; PB: Hanseníase
Paucibacilar; IB: Índice baciloscópico; RT1: reação tipo 1; RT2: reação tipo 2; TT:
Tuberculóide; BT: Boderline Tuberculóide; BB: Boderline; BL: Boderline
Lepromatosa; LL: Lepromatosa; IC: intervalo de confiança; dp; desvio padrão.
Grupos de
estudo
n Classificação RJ Mediana
do IB
(intervalo)
Gênero
(M/F)
Mediana de idade
(anos)
(IC-dp)
MB RT1 26 5BT/4BB/17BL 3 (1-5) 21/5 49 (19-79)±18.00
MB RT2 12 3BL/9LL 3 (1-5) 11/1 36 (17-58) ±14.99
MB
sem reação
12 2BT/1BB/6BL/3LL 2.9 (0-6) 6/6 49 (20-65) ±12.00
PB RT1 17 17BT 0 (0) 8/9 53 (21-87)±18.49
PB
sem reação
6 4BT/2TT 0 (0) 4/2 48 (28-68) ±15.00
Total 73 12LL/26BL/5BB/28BT/2TT 49/23 49 (17-87)±16.61
36
5.2 Reatividade sorológica em amostras pareadas de pacientes MB com RT1
ou RT2
A. PACIENTES MB COM RT1 AO DIAGNÓSTICO: amostras pareadas
Dentre os pacientes MB que apresentaram RT1 ao diagnóstico 78% (14/18) foram
sororeativos à LID-1 (mediana de DO: 0.67, variação de 0.13-2.56). Após o episódio
reacional a taxa de sororeatividade caiu para 22% (4/18) (mediana de DO: 0.10,
variação de 0.00-1.85). A soropositividade para PGL-I nesses mesmos pacientes, ao
diagnóstico, foi de 50% (9/18) (mediana de DO: 0.23, variação de 0.00-0.78), e caiu
para 11% (2/18) (mediana de DO: 0.04, variação de 0.00-0.40), após a RT1. O declínio
do nível de anticorpos após o episódio reacional foi significativo para LID-1 e PGL-I
(p=0.0009 e p=0.003, respectivamente) (Fig.6 A e B).
B. PACIENTES MB QUE DESENVOLVERAM RT1 DURANTE MDT: amostras
pareadas
Cinquenta por cento (4/8) dos pacientes MB que desenvolveram RT1 durante a
MDT, reconheceram LID-1 ao diagnóstico (mediana de DO: 0.50, variação de 0.00-
1.37). A soropositividade à LID-1 permaneceu 50% durante o episódio reacional
(mediana de DO: 0.34, variação de 0.00-0.96) (Fig. 6 C). A mesma porcentagem de
pacientes, 50% (4/8), reconheceram PGL-I ao diagnóstico, (mediana de DO: 0.24,
variação de 0.00-0.74). Esta soropositividade, para PGL-I, caiu para 25% (2/8) durante
a RT1 (mediana de DO: 0.13, variação de 0.00-0.58). A queda nos níveis de anticorpos
anti LID-1 e anti PGL-I, para os pacientes MB que desenvolveram RT1 durante MDT
não foi estatisticamente significativa (Fig.6 D).
C. PACIENTES MB COM RT2 AO DIAGNÓSTICO: amostras pareadas
Todos os pacientes MB (7/7) diagnosticados durante RT2 foram soropositivos para
LID-1 (mediana de DO: 1.70, variação de 0.70-2.55), ao diagnóstico. Após a RT2, 85%
(6/7) dos pacientes permaneceram com sorologia positiva para LID-1 (mediana de DO:
0.76, variação de 0.03-1.78). Entretanto o declínio dos níveis de anticorpos foi
significativo (p=0.026). Aproximadamente metade dos pacientes, (3/7) foram
37
sororeativos para PGL-I, ao diagnóstico, durante a RT2 (mediana de DO: 0.20, variação
de 0.02-0.94). Após a RT2, apenas um paciente, daqueles que apresentaram
soropositividade para PGL-I, apresentou queda dos anticorpos para níveis negativos
(mediana de DO: 0.01, variação de 0.00-0.87). A queda nos níveis de anticorpos anti-
PGL-I após RT2 não foi significativa (Fig. 6 E e F).
D. PACIENTES MB QUE DESENVOLVERAM RT2 DURANTE MDT: amostras
pareadas
Para os pacientes que desenvolveram RT2 durante a MDT, todos (5/5) foram
sororeativos frente a LID-1 (mediana de DO: 1.66, variação de 0.80-2.05) e 80% (4/5)
foram positivos ao PGL-I (mediana de DO: 0.48, variação de 0.00-0.78), no momento
do diagnóstico, quando estavam ainda livres de reação. Durante a RT2, 80% (4/5) dos
pacientes ainda mantiveram altos títulos de anticorpos frente LID-1 (mediana de DO:
0.94, variação de 0.13-2.47) e 40% (2/5) dos pacientes que foram positivos para PGL-I
permaneceram positivos (mediana de DO: 0.18, variação de 0.00-0.59). Não houve
diferença significativa no declínio dos níveis de anticorpos para LID-1 e PGL-I em
pacientes que desenvolveram RT2 durante a MDT (Fig. 6 G e H).
E. PACIENTES MB QUE NÃO DESENVOLVERAM RT1 NEM RT2: amostras
pareadas
Entre os pacientes MB que não desenvolveram reação hansênica, o reconhecimento
sorológico ao diagnóstico foi de 75% (9/12) para LID-1 (mediana de DO: 0.79, variação
de 0.05-2.09) e 67% (8/12) para PGL-I (mediana de DO: 0.47, variação de 0.0-1.77).
Após a MDT, apenas 25% dos pacientes (3/12) permaneram com títulos positivos para
LID-1 e os níveis de anticorpos caíram significativamente (p=0.017). Curiosamente, a
soropositividade ao PGL-I foi de 50% (6/12) mesmo após a MDT. A queda dos níveis
de anticorpos anti PGL-I não foi significativa e houve aumento dos níveis de anticorpos
de 4 pacientes após o tratamento (Fig 6. I e J).
38
LID-1
RT1 SEM REAÇÃO0
1
2
3
0.3
***p=0.0009
14/1878%
4/1822%
A
DO
PGL-I
RT1 SEM REAÇÃO0.0
0.5
1.0
0.25
**p=0.003
9/1850%
2/1811%
B
DO
SEM REAÇÃO RT10
1
2
3
0.3
p=0.290
4/850%
4/850%
C
DO
SEM REAÇÃO RT10.0
0.5
1.0
0.25
p=0.344
4/850%
2/825%
D
DO
RT2 SEM REAÇÃO0
1
2
3
0.3
100% 7/7
85% 6/7
* p=0,026E
DO
RT2 SEM REAÇÃO0.0
0.5
1.0
0.25
43%3/7
29%2/7
F
p=0.128
DO
SEM REAÇÃO RT20
1
2
3
100%5/5
80%4/5
0.3
p=0.841
G
DO
SEM REAÇÃO RT20.0
0.5
1.0
80%4/5
0.25
p=0.346
40%2/5
H
DO
Ao Diagnóstico Pós MDT0
1
2
3
0.3
9/1275%
3/1225%
*p=0.017I
DO
Ao Diagnóstico Pós MDT0
1
2
0.25
8/1267%
6/1250%
p=0.621J
DO
39
Figura 9. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras de soro pareadas de
pacientes MB. A. Sororeatividade à LID-1 de pacientes MB que desenvolveram RT1 ao
diagnóstico (n=18). B. Sororeatividade ao PGL-I de pacientes MB que desenvolveram
RT1 ao diagnóstico (n=18). C. Sororeatividade à LID-1 de pacientes MB que
desenvolveram RT1 durante a MDT (n=8). D. Sororeatividade ao PGL-I de pacientes
MB que desenvolveram RT1 durante a MDT (n=8). E. Sororeatividade à LID-1 de
pacientes MB que desenvolveram RT2 ao diagnóstico (n=7). F. Sororeatividade ao
PGL-I de pacientes MB que desenvolveram RT2 ao diagnóstico (n=7). G.
Sororeatividade à LID-1 de pacientes MB que desenvolveram RT2 durante a MDT
(n=5). H. Sororeatividade ao PGL-I de pacientes MB que desenvolveram RT2 durante a
MDT (n=5). I. Sororeatividade à LID-1 de pacientes MB que não desenvolveram reação
(n=12). J. Sororeatividade ao PGL-I de pacientes MB que não desenvolveram reação
(n=12). Cada linha representa a DO no ELISA com amostras pareadas do mesmo
paciente colhidas na vigência e ausência da reação; a linha tracejada representa o cutoff
(DO>0.3) e (DO>0.25) para LID-1 e PGL-I, respectivamente. DO: Densidade ótica.
40
Tabela 2. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras de pacientes MB que
não desenvolveram reação hansênicas e em pacientes que desenvolveram RT1 ou RT2.
Pacientes LID-1
% soropositivos(n)
Mediana de DO
(variação)
PGL-I
% soropositivos(n)
Mediana de DO
(variação)
LID-1
Declínio
Acs.
PGL-I
Declínio Acs.
MB
sem reação
Ao diag. Pós MDT Ao diag. Pós MDT *p=0.017 p=0.621
75% (9/12) 25% (3/12) 67% (8/12) 50% (6/12)
0.79
(0.05-2.09)
0.12
(0.00-1.39)
0.47
(0.00-1.77)
0.26
(0.00-1.36)
MB em RT1
ao
diagnóstico
Ao diag.
em RT1
Pós reação Ao diag.
em RT1
Pós reação ***p=0.0009 **p=0.003
78% (14/18) 22% (4/18) 50% (9/18) 11% (2/18)
0.67
(0.13-2.56)
0.10
(0.00-1.85)
0.23
(0.00-0.78)
0.04
(0.00-0.40)
MB em RT1
Durante MDT
Ao diag. Em RT1 Ao diag. Em RT1 p=0.290 p=0.344
50% (4/8) 50% (4/8) 50% (4/8) 25% (2/8)
0.50
(0.00-1.37)
0.34
(0.00-0.96)
0.24
(0.00-0.74)
0.13
(0.00-0.58)
MB em RT2
ao
diagnóstico
Ao. diag.
em RT2
Pós reação Ao diag.
em RT2
Pós reação *p=0.026 p=0.128
100% (7/7) 85% (6/7) 43% (3/7) 29% (2/7)
1.70
(0.70-2.55)
0.76
(0.03-1.78)
0.20
(0.02-0.94)
0.01
(0.00-0.87)
MB em RT2
Durante MDT
Ao diag. Em RT2 Ao diag. Em RT2 p=0.841 p=0.346
100% (5/5) 80% (4/5) 80% (4/5) 40% (2/5)
1.66
(0.80-2.05)
0.94
(0.13-2.47)
0.48
(0.00-0.78)
0.18
(0.00-0.59)
MB: multibacilar; RT1: reação tipo 1; RT2: reação tipo 2; Ao diag.: ao diagnóstico;
MDT: multidroga terapia; Acs.: anticorpos; DO: Densidade ótica; ns: não significativo.
41
5.3 Reatividade sorológica em amostras pareadas de pacientes PB com RT1
A. PACIENTES PB COM RT1 AO DIAGNÓSTICO: amostras pareadas
A soropositividade entre os pacientes PB diagnosticados durante RT1 foi de 18%
para LID-1 (2/11) (mediana de DO: 0.18, variação de 0.00-0.81) e 18% para PGL-I
(2/11) (mediana de DO: 0.06, variação de 0.00-0.45). Após o episódio reacional todos
os pacientes apresentaram sorologia negativa para LID-1 e para PGL-I. O declínio da
sorologia não foi significativo (Fig. 7 A e B).
B. PACIENTES PB QUE DESENVOLVERAM RT1 DURANTE MDT: amostras
pareadas
Dentre os pacientes PB que desenvolveram RT1 durante a MDT todos apresentaram
DO negativa frente à LID-1 e PGL-I nos dois momentos da análise (ausência e vigência
da reação) (Fig. 7 C e D).
C. PACIENTES PB QUE NÃO DESENVOLVERAM RT1: amostras pareadas
Do mesmo modo, pacientes PB que não desenvolveram reação, tiveram sorologia
negativa para LID-1 e PGL-I ao diagnóstico e também após MDT (Fig. 7 E e F).
42
Figura 10. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras pareadas de pacientes
PB. A. Sororeatividade à LID-1 de pacientes PB que desenvolveram RT1 ao
diagnóstico (n=11). B. Sororeatividade ao PGL-I de pacientes PB que desenvolveram
RT1 ao diagnóstico (n=11). C. Sororeatividade à LID-1 de pacientes PB que
desenvolveram RT1 durante a MDT (n=6). D. Sororeatividade ao PGL-I de pacientes
PB que desenvolveram RT1 durante a MDT (n=6). E. Sororeatividade à LID-1 de
LID-1
RT1 SEM REAÇÃO0.0
0.5
1.0
0.3
p=0.065
2/1118%
0/110%
A
DO
PGL-I
RT1 SEM REAÇÃO0.0
0.5
1.0
0.25
p=0.216
2/1118%
0/110%
B
DO
SEM REAÇÃO RT10.0
0.5
1.0
0.3
p=0.797
0/60%
0/60%
C
DO
SEM REAÇÃO RT10.0
0.5
1.0
0.25
p=0.222
0/60%
0/60%
DD
O
Ao Diagnóstico Pós MDT0.0
0.5
1.0
0.3
0/60%
0/60%
p=0.125E
DO
Ao Diagnóstico Pós MDT0.0
0.5
1.0
0.25
0/60%
0/60%
p=0.807F
DO
43
pacientes PB que não desenvolveram reação (n=6). F. Sororeatividade ao PGL-I de
pacientes PB que não desenvolveram reação (n=6).Cada linha representa a DO das
amostras pareadas do mesmo paciente colhidas na vigência e ausência da reação; a linha
tracejada representa o cutoff (DO>0.3) e (DO>0.25) para LID-1 e PGL-I,
respectivamente. DO: Densidade ótica.
Tabela 3. Reatividade sorológica à LID-1 e PGL-1 em amostras de pacientes PB
que não desenvolveram reação hansênica e em pacientes que desenvolveram RT1.
Pacientes LID-1
% soropositivos(n)
Mediana de DO
(variação)
PGL-I
% soropositivos(n)
Mediana de DO
(variação)
LID-1
Declínio
Acs.
PGL-I
Declínio
Acs.
PB sem reação Ao diag. Pós MDT Ao diag. Pós MDT p=0.126 p=0.807
0% (0/6) 0% (0/6) 0% (0/6) 0% (0/6)
0.04
(0.03-0.13)
0.02
(0.01-0.06)
0.01
(0.00-0.18)
0.05
(0.00-0.12)
PB em RT1
ao diagnóstico
Ao diag.
em RT1
Pós reação Ao diag.
em RT1
Pós reação p=0.065 p=0.216
18% (2/11) 0% (0/11) 18% (2/11) 0% (0/11)
0.18
(0.00-0.81)
0.04
(0.00-0.13)
0.06
(0.00-0.45)
0.01
(0.00-0.19)
PB em RT1
Durante MDT
Ao diag. Em RT1 Ao diag. Em RT1 p=0.797 p=0.222
0%(0/6) 0% (0/6) 0% (0/6) 0% (0/6)
0.02
(0.00-0.15)
0.01
(0.00-0.09)
0.12
(0.00-0.14)
0.02
(0.00-0.06)
PB: paucibacilar; RT1: reação tipo 1; Ao diag.: ao diagnóstico; Acs.: anticorpos; MDT:
multidroga terapia; DO: Densidade ótica; ns: não significativo.
5.4 Reatividade sorológica nos diferentes grupos reacionais.
Para melhor identificar as diferenças da magnitude da resposta imune humoral
frente LID-1 e PGL-I, as amostras dos pacientes com hanseníase durante o episódio
reacional foram agrupadas e analisadas por grupos estratificados segundo a classificação
dos pacientes (MB e PB), tipo de reação hansênica (RT1 e RT2) e tempo de ocorrência
44
das reações (ao diagnóstico e durante MDT) e comparados aos resultados de pacientes
com hanseníase que não desenvolveram reação hansênica.
Análise dos dados da sorologia em grupos estratificados por tipo de hanseníase
(MB/PB), tipo de reação (RT1 /RT2) e por período de ocorrência da reação (ao
diagnóstico/durante MDT) permite excluir o efeito da MDT na análise dos resultados
sorológicos para pacientes que apresentaram reação hansênica ao diagnóstico e permite
ainda avaliar grupos com ou sem reação e com exposição à MDT. Dentre os pacientes
MB que foram diagnosticados no momento da reação observou-se níveis mais altos de
anticorpos anti LID-1 nos pacientes que desenvolveram RT2 quando comparados com
pacientes que desenvolveram RT1 ou pacientes não reacionais (p<0.05) (Fig. 8A). Não
foi observado diferença estatisticamente significativa na sorologia anti-PGLI entre estes
grupos.
Figura 11. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I em grupos de
pacientes MB que desenvolveram RT1 ou RT2 ou pacientes livres de reação ao
diagnóstico. As caixas incluem os percentis 25 e 75 das DO de cada sorologia. Linhas
na caixa se referem às medianas das DO de cada sorologia. A. Sorologia anti-LID-1. B.
Sorologia anti-PGL-1. DO: Densidade ótica.
LID-1
MB R
T1 Ao D
iagnóst
ico
MB R
T2 Ao D
iagnóst
ico
MB- S
em re
ação
-Ao D
iagnóst
ico
0
1
2
3
**p=0,008 *p=0,020
n=18 n=7 n=12
p=0.683
DO
A PGL-I
MB R
T1 Ao D
iagnóst
ico
MB R
T2 Ao D
iagnóst
ico
MB- S
em re
ação-A
o Dia
gnóstico
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0n=18 n=7 n=12
p=0.650 p=0.966
p=1.000
BD
O
45
A análise da sorologia em pacientes MB que desenvolveram RT1 e RT2 durante
MDT e em pacientes MB que não desenvolveram reação, no momento pós MDT,
mostrou também níveis mais altos de anticorpos anti LID-1 nos pacientes que
desenvolveram RT2 (p=0.020) (Fig. 9 A) enquanto não se observou diferença
estatisticamente significativa na sorologia anti-PGLI entre estes grupos.
Figura 12. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I em grupos de
pacientes MB que desenvolveram RT1 ou RT2 ou pacientes que não desenvolveram
reação durante MDT. As caixas incluem os percentis 25 e 75 das DO de cada
sorologia. Linhas na caixa se referem as medianas das DO de cada sorologia. A.
Sorologia anti-LID-1. B. Sorologia anti-PGL-1. DO: Densidade ótica.
LID-1
MB- R
T1- D
uran
te M
DT
MB- R
T2- D
uran
te M
DT
MB- S
em rea
ção-
Pós
MDT
0
1
2
3n=8 n=5 n=12
*p=0,020p=0.066
p=0.697
A
DO
PGL-I
MB- R
T1- D
uran
te M
DT
MB- R
T2- D
uran
te M
DT
MB- S
em rea
ção-
Pós
MDT
0.0
0.5
1.0
1.5 n=8 n=5 n=12
p=0.660 p=0.874
p=0.615
B
DO
46
Entre os pacientes PB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico, não foi observada
diferença significativa nos níveis de reatividade sorológica anti LID-1 e anti PGL-I
quando comparados aos pacientes que não desenvolveram reação (Fig. 10 A e B).
Figura 13. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I em grupos de
pacientes PB que desenvolveram RT1 ou pacientes livres de reação ao diagnóstico. As
caixas incluem os percentis 25 e 75 das DO de cada sorologia. Linhas na caixa se
referem as medianas das DO de cada sorologia. A. Sorologia anti-LID-1. B. Sorologia
anti-PGL-1. DO: Densidade ótica.
LID-1
PB R
T1 A
o Diagn
ótico
PB- S
em rea
ção
-Ao
Diagn
óstic
o
0.0
0.5
1.0
n=10 n=6
p= 0.192
n=10
A
DO
PGL-I
PB R
T1 A
o Dia
gnót
ico
PB- S
em rea
ção
-Ao
Dia
gnós
tico
0.0
0.5
1.0
n=10 n=6
p=0.296
DO
B
47
Entre os pacientes PB que desenvolveram RT1 durante a MDT, também não foi
observada diferença significativa nos níveis de reatividade sorológica anti LID-1 e anti
PGL-I quando comparados aos pacientes PB que não desenvolveram reação (Fig. 11 A
e B).
Figura 14. Distribuição dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I em grupos de
pacientes PB que desenvolveram RT1 durante a MDT ou pacientes livres de reação, no
momento após a MDT. As caixas incluem os percentis 25 e 75 das DO de cada
sorologia. Linhas na caixa se referem as medianas das DO de cada sorologia. A.
Sorologia anti-LID-1. B. Sorologia anti-PGL-1. DO: Densidade ótica.
LID-1
PB- R
T1- D
uran
te M
DT
PB- S
em rea
ção-
Pós
MDT
0.0
0.5
1.0
n=6 n=6
p=0.570
A
DO
PGL-I
PB- R
T1- Dur
ante
MDT
PB- S
em rea
ção-
Pós
MDT
0.0
0.5
1.0
n=6 n=6
p=0.463
B
DO
48
6. DISCUSSÃO
Com o objetivo de identificarmos marcadores sorológicos para o diagnóstico ou
prognóstico das reações hansênicas tipo 1 ou tipo 2, no presente estudo avaliamos o
nível de anticorpos a nova proteína de fusão LID-1 e a sorologia anti PGL-I. Neste
estudo foram examinados retrospectivamente amostras de pacientes que apresentaram
RT1 ou RT2 ao diagnóstico ou durante MDT. Foram testadas amostras pareadas
coletadas na vigência e ausência do episódio reacional e análises foram feitas tanto em
amostras pareadas como em diferentes grupos.
Devido à dicotomia da resposta imune na hanseníase na qual pacientes
multibacilares são caracterizados por forte resposta imune do tipo Th2 e consequente
produção de anticorpos, enquanto pacientes paucibacilares se caracterizam por resposta
imune celular do tipo Th1, a resposta sorológica nas reações hansênicas pode ser melhor
avaliada em pacientes multibacilares. Os pacientes MB podem apresentar RT1 ou RT2,
ao diagnóstico ou durante MDT e uma minoria pode ainda desenvolver reação anos
após MDT. Embora o foco principal do nosso estudo tenha sido a avaliação da resposta
imune humoral de pacientes MB com e sem reação hansênica, este estudo avaliou
também o perfil sorológico de pacientes PB, que geralmente apresentam fraca resposta
sorológica. Além disso, pacientes PB só desenvolvem RT1 que está associada a CMI.
Entretanto, investigamos se durante RT1 ocorre alguma alteração da resposta sorológica
nos pacientes PB. Sabe-se que pacientes MB embora apresentem fraca ou ausente CMI
ao M. leprae, durante episódios de RT1 estes apresentam ativação transitória da resposta
imune celular (SREENIVASAN et al., 1998). De acordo com um relato de caso que
realizou análise longitudinal de um paciente com hanseníase MB na presença e ausência
de RT1, IFN-γ foi produzido apenas durante RT1, enquanto que a percentagem de
células T reguladoras produtoras de CCL4 diminuiu em quantidade e intensidade. As
células T reguladoras produtoras de CCL4 podem inibir a ativação das células T
podendo afetar a regulação destas células durante RT1 (GELUK et al., 2013).
Neste cenário complexo com tantas variáveis, diferentes formas de hanseníase
(MB/PB), que podem desenvolver diferentes tipos de reação (RT1/RT2), em momentos
distintos da doença (ao diagnóstico/durante MDT), identificar biomarcadores de
diagnóstico ou prognóstico das reações hansênica é uma meta desafiadora.
Reconhecemos que apesar do esforço de monitorar 73 pacientes bem caracterizados
49
clinica e laboratorialmente, a estratificação dos pacientes nos diferentes desfechos
clínicos resultou em grupos pequenos, indicando a necessidade de novos estudos
incluindo um número maior de pacientes para validar nossos achados. No entanto,
alguns resultados deste estudo merecem destaque, principalmente quanto ao uso recente
da proteína de fusão LID-1 na sorologia em pacientes reacionais, sendo que o PGL-I
representa o antígeno do M. leprae melhor avaliado até o momento. Neste sentido,
nosso grupo de pesquisa está no momento testando a sororeatividade anti PGL-I (IgM),
anti LID-1(IgG) e anti LID-NDO (IgM e IgG) de 564 pacientes que foram selecionados
de uma coorte de pacientes recrutados e monitorados em Manaus e Fortaleza que
participaram do Uniform MDT Trial (U-MDT) que investiga o uso de um esquema de
tratamento único, o qual administra rifampicina, dapsona e clofazimina durante 6 meses
tanto para pacientes PB como para MB (GONÇALVES et al., 2012). Dentre os
pacientes selecionados desta coorte foram incluídos 404 pacientes que não
desenvolveram reação hansênica e 160 que desenvolveram RT1 ou RT2. Esses
pacientes foram acompanhados mensalmente durante a MDT e anualmente após
finalização do tratamento. Desta forma, este estudo em andamento será fundamental
para elucidar o papel da sorologia principalmente anti LID-1 para o diagnóstico ou
prognóstico das reações hansênicas.
Ao avaliar algumas variáveis relacionando-as com reações hansênicas observamos
que o grupo de pacientes que desenvolveram RT2 apresentou mediana de idade
significativamente menor comparada a mediana de idade do grupo de pacientes MB não
reacionais. Conforme um estudo que avaliou fatores de risco para o desenvolvimento de
RT2, pacientes com mais de 40 anos tinham significativa diminuição do risco
(MANANDHAR et al., 1999).
Estudos prévios com sorologia anti PGL-I e anti LID-1 mostraram que a MDT causa
queda significativa nos níveis de anticorpos específicos indicando que a sorologia anti
LID-1 e anti PGL-I pode ser uma ferramenta útil no monitoramento da eficiência do
tratamento da hanseníase (CHO et al., 2001; RADA et al., 2012; DUTHIE et al., 2011).
De fato, nossos dados mostram que após MDT o declínio dos níveis de anticorpos anti
LID-1 em pacientes MB que não desenvolveram reação foi estatisticamente
significativo. Observamos também, declínio significativo do nível de anticorpos anti
LID-1 em pacientes MB diagnosticados durante RT1 e RT2. Entretanto, a queda dos
níveis de anticorpos anti LID-1 em pacientes que desenvolveram RT1/RT2 durante a
MDT não foi significativa. Em concordância com este resultado, estudo realizado nas
50
Filipinas que monitorou níveis de anticorpos de 12 pacientes MB por ELISA e Western
Blot em 6 visitas durante 12 meses, mostrou manutenção de altos títulos de anticorpos
anti LID-1 em um paciente que desenvolveu RT1 (SPENCER et al., 2012).
Na sorologia anti-PGL-I não observamos diferença no padrão de declínio de
anticorpos entre pacientes que desenvolveram RT1/RT2 e pacientes que não
desenvolveram reação, o que já foi demonstrado em estudo anterior (ROCHE et al.,
1993). Entretanto, houve declínio de anticorpos em pacientes com RT1 ao diagnóstico
diferentemente do observado em pacientes que desenvolveram RT1 durante a MDT.
Esses dados em conjunto, sugerem manutenção de altos níveis ou menor declínio do
nível de anticorpos em pacientes MB tratados e que desenvolvem reação durante MDT.
Porém, dado o efeito da MDT no declínio dos anticorpos não podemos descartar a
influência da MDT na flutuação dos níveis de anticorpos em episódios reacionais
observados durante a MDT.
Neste estudo, entre os pacientes MB que não desenvolveram reação durante o
acompanhamento, metade deles manteve altos níveis de anticorpos anti PGL-I após
MDT. Isso pode indicar que estes pacientes ainda apresentam risco de desenvolver
reação e sugere a necessidade de acompanhamento. Em 2008, um estudo de caso
controle mostrou que pacientes que tiveram persistência de sorologia anti-PGL-I
positiva após o tratamento apresentavam maior risco de desenvolver reação quando
comparados aqueles com sorologia negativa (BRITO et al., 2008).
Na tentativa de excluir o efeito da MDT na análise dos resultados sorológicos para
pacientes com reação ao diagnóstico e permitir ainda avaliar grupos com ou sem reação
e com exposição à MDT, as amostras dos pacientes foram agrupadas e analisadas por
grupos estratificados segundo a classificação dos pacientes (MB e PB), tipo de reação
hansênica (RT1 e RT2) e tempo de ocorrência das reações (ao diagnóstico e durante
MDT) e comparados aos resultados de pacientes com hanseníase que não
desenvolveram reação hansênica. Esta análise permitiu comparar os resultados da
sorologia dos pacientes que desenvolveram RT1 ou RT2 ao diagnóstico com pacientes
que não desenvolveram reação hansênica, no momento do diagnóstico, sem
interferência da MDT. Esta abordagem permitiu ainda comparar os resultados dos
pacientes, que já estavam em tratamento, que desenvolveram RT1 ou RT2 com aqueles
que não desenvolveram reação hansênica. A análise das amostras agrupadas mostrou
que os níveis de anticorpos anti PGL-I em pacientes MB que desenvolveram RT1/RT2
ao diagnóstico não foi diferente quando comparados com aqueles que não
51
desenvolveram reação hansênica. Em concordância, estudo prévio do nosso grupo de
pesquisa também não observou diferença na presença de anticorpos IgM e IgG anti
PGL-I em pacientes que desenvolveram RT1 ou RT2 ao diagnóstico, em pacientes que
não apresentavam sintomas de reação e controles saudáveis (STEFANI et al., 1998).
Além disso, outro estudo realizado com pacientes de Nepal e controles saudáveis do
Reino Unido também confirmaram esses resultados (WEIR et al., 1998).
Observamos também, a partir desses resultados, maior reatividade anti LID-1 e anti
PGL-I em pacientes PB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico quando comparada a de
pacientes PB que não desenvolveram reação, no entanto, sem significância estatística
apesar de que dentre os pacientes PB que desenvolveram RT1 durante a MDT e não
reacionais, nenhum apresentou sororeatividade à LID-1 ou ao PGL-I. Estes resultados
sugerem que apesar dos pacientes PB serem considerados fracos produtores de
anticorpos e da RT1 ser caracterizada por aumento da imunidade celular, os anticorpos
estão presentes em maior nível nos pacientes PB que desenvolvem RT1 ao diagnóstico.
Conforme estudo envolvendo 534 pacientes com hanseníase MB e PB, dos quais 279
desenvolveram RT1 (187 ao diagnóstico e 92 durante a MDT), pacientes com
hanseníase que apresentavam altas concentrações de anticorpos anti-PGL-I no início do
tratamento apresentaram maior risco de desenvolver RT1 (ROCHE et al., 1997). Outro
estudo realizado no Norte da Índia que acompanhou 303 pacientes indicou que aqueles
que desenvolveram reação apresentavam níveis mais altos de anticorpos anti PGL-I do
que pacientes que não desenvolveram reação (JADHAV et al., 2011). Deste modo, altos
títulos de anticorpos anti PGL-I tem sido sugeridos como fator de risco para o
desenvolvimento de reações, porém com resultados conflitantes. No entanto, um estudo
que testou dois reagentes diferentes de substrato no ELISA 2,2 '-azino-di-(-6-sulfónico
ácido 3-etilbenzotiazolina) (ABTS), e o-fenilenodiamina (OPD), em 121 pacientes
mostrou que os níveis sorológicos de IgM anti PGL-I foram significativamente menores
nos pacientes com RT2, em comparação com aqueles sem reação hansênica, quando
usado o substrato ABST (SCHWERER et al., 1984). Este estudo mostra que a
discrepância de resultados talvez esteja relacionada a diferenças metodológicas nos
ensaios realizados.
A avaliação do perfil sorológico frente às proteínas recombinantes do M. leprae em
pacientes com hanseníase durante episódios reacionais ainda não foi descrita. Os
resultados das análises das amostras agrupadas demonstraram maior reatividade
sorológica frente à proteína de fusão LID-1 entre os pacientes que desenvolveram RT2
52
ao diagnóstico quando comparados com pacientes que não desenvolveram reação
hansênica e com pacientes MB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico. Além disto, a
diferença dos níveis de anticorpos entre pacientes que desenvolveram RT2 durante a
MDT em comparação com pacientes controles MB, após a MDT, foi significativa. Em
conjunto, estes resultados sugerem que altos níveis de anticorpos anti LID-1 podem
estar associados à ocorrência de RT2, independente se o episódio reacional ocorrer ao
diagnóstico ou durante a MDT.
Várias pesquisas estão sendo desenvolvidas no sentido de encontrar um marcador
laboratorial ou um conjunto de marcadores para o diagnóstico e prognóstico das reações
hansênicas. Dentre os potenciais biomarcadores relacionados aos episódios reacionais
estudados estão diversas citocinas, quimiocinas e proteínas de fase aguda não
específicas como IFN, IL-12 (SREENIVASAN et al., 1998), TNF-α, IL-1β (SARNO
et al., 1991), IL-2, IL-8 (MORAES et al., 1999), IL-6, CXCL-10 (STEFANI et al.,
2009) e neopterina (FABER et al., 2004) as quais foram associadas com RT1, e TNF-α,
IL-1 (PARIDA et al., 1992), proteína C reativa e IL-6 (FOSS et al., 1993; SILVA et
al., 2007) foram associados a RT2.
No presente estudo sorológico observamos associação entre altos níveis de
anticorpos anti LID-1, proteína de fusão específica do M. leprae, com a ocorrência de
RT2. A associação de um conjunto de biomarcadores não específicos com sorologia anti
LID-1 pode ser útil no diagnóstico e prognóstico de RT2 em pacientes MB.
53
7. CONCLUSÕES
Amostras de soro pareadas de pacientes MB colhidas na vigência e ausência de
reação RT1/RT2 mostraram perfis sorológicos variáveis, no entanto com tendência de
queda nos níveis de anticorpos pós/na ausência de reação. Entretanto, não se pode
excluir a influência da MDT no declínio dos anticorpos em pacientes que
desenvolveram reação durante a MDT.
A análise dos resultados da sorologia por grupos de pacientes, tipo de reação e
período de ocorrência das reações sugere que altos níveis de anticorpos anti LID-1 pode
estar associado com maior risco de desenvolvimento de RT2 ao diagnóstico ou durante
MDT em pacientes MB.
54
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Health Organization. 2012b. Disponível em:
<http://www.who.int/lep/situation/Leprosy_PR_2011.pdf >. Acesso em: 23 set.2013.
YAWALKAR, S. Leprosy: For Medical Practitioners and Paramedical Workers:
to Those who Lived for the Cause of Leprosy. 8th ed. Ed: Novartis Foundation for
Sustainable Development, 2009.
ZHANG, F.; HUANG, W.; CHEN, S.; et al. Genomewide association study of leprosy.
The New England journal of medicine, v. 362, n. 15, p. 1447–8, 15 abr 2010.
68
9. ANEXO
9.1. Manuscrito
Title: Leprosy: Serologic reactivity to LID-1 and PGL-I antigens in patients with type
I , type II reactions and unreactional patients.
Author's names:
Mizoguti, D.F. 1; Hungria, E.M.1; Freitas, A.A.1; Oliveira, R.M. 1; Cardoso, L.P.V.1;
Costa, M.B.1; Sousa, A.L.M.1; Reed S.G.2, Duthie, M.S. 2; Stefani, M.M.A.1.
1 Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia,
Brazil
2 Infectious Disease Research Institute, Seattle, United States
Abstract
Leprosy Type 1 (T1R) and type 2 reactions (T2R) are considered the major
complicators in the clinical management of leprosy patients. Leprosy reactions can
occur before, during or after multidrug therapy (MDT). T1R is associated with
exacerbated Th1 type cell mediated immunity (CMI) whereas T2R is associated with
Th2 type immunity characterized by strong antibody production and in some cases
transitory CMI to M. leprae antigens. Assess the serological reactivity to LID-1 fusion
protein and to PGL-I M. leprae antigens among multibacillary (MB), paucibacillary
(PB) leprosy patients that developed reaction at diagnosis or during MDT compared to
reaction free MB and PB patients. Paired serum samples from 73 leprosy patients were
tested by ELISA to detect IgG antibodies to LID-1 and IgM responses to PGL-I.
Leprosy patients included MB that developed T1R or T2R at diagnosis or during MDT
and PB patients that developed T1R at diagnosis or during MDT compared to reaction
free MB and PB patients. For T1R and T2R patients, samples collected during
reactions and in the absence of reactions were tested and for reaction free patients
samples collected at diagnosis and after MDT were tested. The decline of anti LID-1
and anti PGL-I antibodies levels was significant among MB patients with T1R at
diagnosis (p <0.05). Among MB patients with T2R at diagnosis and non reactional MB
leprosy patients the decline of antibodies was significant only to LID-1 (p <0.05).
Higher levels of anti LID-1 antibodies were observed in MB patients who developed
T2R at diagnosis compared with unreactional patients (p = 0.020) and patients who
developed T1R at diagnosis (p = 0.008). Moreover, different antibody levels were seen
69
in patients who developed T2R during MDT compared with unreactional MB patients
after MDT (p = 0.020).
Key words: Leprosy reaction, serology, LID-1, PGL-I
Introduction
Leprosy is a complex chronic, infectious granulomatous disease that affects the skin and
peripheral nerves and its clinical manifestations depend on the patient's immune
response to the pathogen (1). The disease is characterized by spectral manifestations in
which at the tuberculoid end (TT) patients develop strong Th1 type cell-mediated
immunity (CMI) to M. leprae characterized by INF- production, low or absent
antibody production, low bacillary load and few lesions. The lepromatous pole (LL) is
characterized by low or absent to Mycobacterium leprae- specific CMI, vigorous
antibody production, and multiple skin lesions. The borderlines forms (borderline
tuberculoid/BT, borderline borderline/BB borderline lepromatous/BL) are considered
immunologically unstable and may show changes to any side of the spectrum (2). For
operational purposes, a simplified classification system based on counting the number
of skin lesions was proposed by the World Health Organization (WHO): patients with
up to five skin lesions are considered paucibacillary (PB) and patients with more than 5
skin lesions are considered multibacillary (MB) (3).
During the chronic course of the disease some patients may develop acute
inflammatory complications before, during or after the specific treatment known as
multi drug therapy (MDT). The main types of leprosy reactions are the type 1 reaction
(T1R) and type 2 reaction (T2R) that represent the major cause of permanent physical
disabilities and deformities due to irreversible nerve damage (4, 5). T1R is associated
with alterations in CMI while T2R is associated with Th2 type immune response with
immune complex deposition and transient CMI activation (6).
Anti PGL-I serology for the detection of IgM antibodies represents the most
evaluated and standardized serologic assay for leprosy and high antibody levels
correlate with high bacillary loads seen in multibacillary patients (7). Moreover high
anti-PGL-I levels have been suggested as risk factors for the development of both type
of leprosy reactions, however with conflicting results (8-11). After M. leprae whole
genome was decoded more than a decade ago, new protein antigens have been evaluated
in serologic and CMI assays (12-17). The fusion protein of the two best protein antigens
for serology, ML0405 and ML2331, known as LID-1 has been shown to be recognized
70
by IgG antibodies mostly from multibacillary patients from different endemic sites
around the world (18-22).
No laboratory markers are available to predict the risk to develop reactional
episodes. Therefore, the identification of potential immunological markers of leprosy
reactions may contribute to early diagnosis and to the development of prophylactic
strategies in patients with higher risk, thus preventing nerve damage and irreversible
permanent disabilities associated with leprosy reactions. In this sense this study aims to
evaluate the potential of serological tests using new protein antigens of M. leprae for the
diagnosis or prognosis of leprosy reactions.
Material and Methods
1. Study groups
This is a retrospective analytical study based on serum samples from a cohort of 73
patients with leprosy enrolled at diagnosis with or without leprosy reaction and
monitored during MDT regarding the development of leprosy reactions. Participants
were recruited at the main regional outpatient clinic (Centro de Referência em
Diagnóstico e Terapêutica, Goiânia/GO). Newly diagnosed, untreated leprosy patients
(both genders, any age range) were classified according to Ridley and Jopling criteria
considering clinical, bacilloscopic and histopathology data. All participants signed an
informed consent before blood collection, sera samples were stored at -20ºC.
The following groups were enrolled: A. MB patients diagnosed for leprosy during
T1R (n=18) or T2R (n=7); B. PB patients diagnosed for leprosy during T1R (n=11); C.
MB leprosy patients that developed T1R (n=8) or T2R (n=5) during MDT; D. PB
leprosy patients that developed T1R during MDT (n=6); E. MB and PB leprosy patients
that did not develop reactions during follow up (MB, n=12; PB, n= 6). Paired samples
were tested from reactional and unreactional patients. Reactional patients had blood
samples collected in the presence and absence of leprosy reaction and for unreactional
patients, samples were collected at diagnosis and at the end of MDT. This study was
approved by the Research Ethics Committee of the Hospital das Clinicas / UFG and by
the National Research Ethics (CONEP).
2. Detection of IgM antibodies to PGL-I
71
Serum IgM antibodies to M. leprae phenolic glycolipid (PGL-I) were detected by
enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Polysorp 96-well plates (Nunc
Maxisorp) were coated with 0.01 μg/ml NT-P-BSA, the trisaccharide synthetic analog
of PGL-I conjugated to BSA (kindly provided by Dr Fujiwara, Nara University, Japan),
and blocked with PBS-1% BSA. Serum samples diluted 1/300 in 1% BSA were tested
in duplicates either with NTP- BSA or BSA-coated wells. After incubation and
washings, HRP-conjugated to antihuman IgM (Jackson ImmunoResearch-EUA) was
added. After incubation and washings, peroxidase color substrate (TMB – Sigma-Home
made) was added and the reaction was quenched by the addition of 2.5N H2SO4. The
OD was read at 450 nm using a Multiskan Ex microplate reader (Thermo Scientific,
USA).
3. Detection of IgG antibodies to LID-1
The seroreactivity of the di-fusion protein LID-1 (ML2331+ML0405) were
similarly detected by ELISA. Polysorp 96-well plates (Nunc Maxisorp) were coated
with 2 μg/ml of LID-1 (produced by Infectious Disease Research Institute - IDRI -
Seattle, WA, EUA) at 4°C and blocked with PBS/Tween-20 with 1% BSA. Serum
samples diluted 1/200 in 0.1% BSA were added in duplicates and incubated for 2 hours
at RT. Plates were washed and incubated with 100 μL of HRP-conjugated with anti-
human IgG (Sigma) diluted to 1/5000 PBS-T, 0.1% BSA. After washings, reactions
were developed with peroxidase color substrate (KPL, Gaithersburg, MD, USA) and
quenched by the addition of 1N H2SO4. The corrected optical density (OD) of each
well at 450 nm was read using a Multiskan Ex microplate reader (Thermo Scientific,
USA). Based on previous data, the threshold for positive responses was calculated as 2
x standard deviation (SD) of the OD of sera from healthy endemic controls, such that
samples with OD> 0,3 were considered positive (18).
4. Statistical analyses
GraphPad Prism (version 5) were used for the calculation of the median, mean
values of OD and for dot blot graphics. Statistical significance was assessed by Mann-
Whitney for comparison between two groups. Results were considered statistically
significant when p-values < 0.05 were obtained. Serologic reactivity of reactional
72
patients was assessed in paired samples collected in the presence and absence of the
reactional episode and for unreactional patients in samples collected at diagnosis and at
the end of MDT. Analyses were also performed in groups stratified by the type of
disease (MB or PB leprosy); by the type of reaction (type 1 or type 2 reaction) and by
the period of development of reactions (at diagnosis or during MDT) and compared to
serologic reactivity of leprosy patients who did not develop leprosy reaction.
Results
A total of 73 participants were enrolled in the study and stratified taking into
account the type of leprosy (multibacillary/paucibacillary), the type of reaction
developed (MB with T1R/MB with T2R/PB with T1R/no reaction), time of occurrence
of the leprosy reaction (at diagnosis/during MDT). The main characteristics of the study
groups are shown in Table 1. The majority of patients was male, from 17 to 87 years old
(median=49 years old). The age of patients who developed T2R was statistically
significant different when compared to unreactional MB group (p = 0.026). Likewise,
according to a study that evaluated risk factors for the development of T2R, patients
older than 40 years had significantly decreased risk of develop T2R (23). The median
bacterial index (BI) among reactional (T1R and T2R) and unreactional MB patients was
similar (p>0.05): MB patients who developed T1R or T2R had a median of 3 +, while
unreactinal MB patients had median BI of 2.5 +. None of the PB patients had
detectable BI.
73
Table 1. Main characteristics of the study participants.
1. Immunoreactivity in paired samples collected in the presence/absence of
reaction
A. Results of paired samples of MB patients
A.1. MB patients with T1R at diagnosis and MB patients that developed T1R
during MDT
Most MB patients with T1R at diagnosis 78% (14/18) recognized LID-1 antigen
(median OD 0.67, range 0.13-2.56) and 50% (9/18) was anti PGL-I positive (median
OD: 0.24, range 0-0.74). Compared to serological reactivity observed during reaction,
immunoreactivity after leprosy reaction declined both to LID-1 and to PGL-I (p=0.0009
and p=0.003, respectively). On the other side, for MB patients who developed T1R
during MDT, there was no difference in antibody levels during T1R or in the absence of
T1R (p> 0.05).
Study groups n Ridley Jopling
Classification
BI
(medianrange)
Gender
(M/F)
Age
years
(median
range),
PB
unreactional
6 4BT/2TT 0 (0) 4/2 48 (28-
68)
MB
unreactional
12 2BT/1BB/6BL/3LL 2.9 (0-6) 6/6 49 (20-
65)
PB T1R 17 17BT 0 (0) 8/9 53 (21-
87)
MB T1R 26 5BT/4BB/17BL 3 (1-5) 21/5 49 (19-
79)
MB T2R 12 3BL/9LL 3 (1-5) 11/1 34 (17-
58)
Total 73 12LL/26BL/5BB/28BT/2TT 49/23 49 (17-
87)
74
A.2. MB with T2R at diagnosis and MB patients that developed T2R during
MDT
All MB patients with T2R at diagnosis (n=7) were seropositive for LID-1 (median
OD: 1.70, range 0.70-2.55), while 43% (3/7) was positive for PGL-I (median OD: 0.20,
range 0.02-0.94). After leprosy reaction, LID-1 seropositivity declined (p = 0.026) and
29% remained anti PGL-I positive (p> 0.05).
Among MB patients who developed T2R during the MDT no significant difference
was observed in seropositivity during and after T2R (p> 0.05).
1.3. MB unrectional patients
At diagnosis the seropositivity to LID-1 in MB patients who did not develop
leprosy reaction was 75% (9/12) (median OD: 079, range 0.05-2.09) and after MDT
positivity declined to 25% (3/12) (p = 0.003). The seropositivity to PGL-I was 67%
(8/12) at diagnosis and 50% (6/12) remained positive after MDT (p> 0.05) (Fig.1).
75
LID-1
T1R Post reaction0
1
2
3
0.3
***p=0.0009
14/1878%
4/1822%
A
OD
PGL-I
T1R Post reaction0.0
0.5
1.0
0.25
**p=0.003
9/1850%
2/1811%
B
OD
No reaction T1R0
1
2
3
0.3
4/850%
4/850%
C
OD
ns
No reaction T1R0.0
0.5
1.0
0.25
4/850%
2/825%
D
OD
ns
T2R NO REACTION0
1
2
3
0.3
100% 7/7
85% 6/7
* p=0,026
E
OD
T2R NO REACTION0.0
0.5
1.0
0.25
43%3/7
29%2/7
F
ns
OD
NO REACTION T2R0
1
2
3
100%5/5
80%4/5
0.3
G
ns
OD
NO REACTION T2R0.0
0.5
1.0
80%4/5
0.25
40%2/5
H
ns
OD
At Diagnosis Post MDT0
1
2
3
0.3
I9/1275%
3/1225%
*p=0.017
OD
At Diagnosis Post MDT0
1
2
0.25
J 8/1267%
6/1250%
ns
OD
76
Figure 1. Serological reactivity to LID-1 and to PGL-I in paired serum samples from
MB patients who developed T1R or T2R at diagnosis or during MDT, and among
unreactional MB. MB patients who developed T1R at diagnosis (n = 18) A.
Seroreactivity to LID-1 . B. Seroreactivity to PGL-I. MB patients who developed T1R
during MDT (n = 8) C. Seroreactivity to LID-1; D. Seroreactivity to PGL-I MB
patients who developed T2R at diagnosis (n = 7) E. Seroreactivity to LID-1; F.
Seroreactivity to PGL-I. MB patients who developed T2R during MDT (n = 5) G.
Seroreactivity to LID-1; H. Seroreactivity to PGL-I. Unreactional MB patients (n =
12) I. Seroreactivity to LID-1; H. Seroreactivity to PGL-I. For reactional patients, each
point represents the OD in each sample taken from the same patient in the presence and
in the absence of the reaction; for unreactional patients paired samples were collected at
diagnosis and after MDT. The dashed line represents the cutoff: OD> 0.3 to LID-1and
OD> 0.25 to PGL-I. OD: Optical density.
B. Results of paired samples of PB patients
B.1. PB patients with T1R at diagnosis
Among PB patients with T1R at diagnosis the seropositivity to LID-1 was 18%
(2/11) (median OD: 0.18, range 0-0.81) and 18% (2/11) to PGL-I (median OD: 0.06,
range 0-0.45). After leprosy reaction all patients became seronegative to both LID-1 and
PGL-I, however the decline of seropositivity was not significant (p>0.05).
2.2. PB patients with T1R during MDT and unreactional PB patients
Among PB patients that developed T1R during MDT the seroreactivity to LID-1
and PGL-I was low before and during T1R. Likewise, PB patients who did not develop
leprosy reaction were seronegative to LID-1 and PGL-I before and after MDT (Fig.2).
77
Figure 2. Serological reactivity to LID-1 and PGL-I in paired serum samples from PB
patients who developed T1R at diagnosis or during MDT and among unreactional PB
patients. PB patients who developed T1R at diagnosis (n = 11) A. Seroreactivity to
LID-1
T1R Post reaction0.0
0.5
1.0
0.3
p=0.065A
2/1118%
0/110%
OD
PGL-I
T1R Post reaction0.0
0.5
1.0
0.25
p=0.216B
0/110%
2/1118%
OD
No reaction T1R0.0
0.5
1.0
0.3
p=0.797C
0/60%
0/60%
OD
No reaction T1R0.0
0.5
1.0
0.25
p=0.222D
0/60%
0/60%
OD
At Diagnosis Post MDT0.0
0.5
1.0
0.3
E
0/60%
0/60%
p=0.125
OD
At Diagnosis Post MDT0.0
0.5
1.0
0.25
0/60%
0/60%
Fp=0.807
OD
78
LID-1; B. Seroreactivity to PGL-I. PB patients who developed T1R during MDT (n =
6) C. Seroreactivity to LID-1; D. Seroreactivity to PGL-I. Unreactinal PB patients (n
= 6). E. Seroreactivity to LID-1 ; F. Seroreactivity to PGL-I. For reactional patients,
each point represents the OD in each of paired samples taken from the same patient in
the presence and in the absence of the reaction; for unreactional patients paired samples
were collected at diagnosis and after MDT. The dashed line represents the cutoff (OD>
0.3) to LID-1 and (OD> 0.25) to PGL-I. OD: Optical density.
2. Immunoreactivity among groups
Among leprosy patients, several factors are known to impact serologic response:
MB and PB patients are known to develop strong and weak humoral responses, MDT is
known to cause a decline in serology in MB patients and immunosuppressive treatment
to leprosy reactions also impact serologic responses. As an attempt to minimize these
factors, serologic responses to LID-1 and PGL-I antigens were evaluated in groups
stratified taking into account the classification of patients (MB and PB), the type of
leprosy reaction (T1R and T2R) and the time of occurrence of reactions (at diagnosis or
during MDT) while unreactional patients were tested at diagnosis and after MDT.
Among MB patients who were diagnosed during a reactional episode higher levels of
anti LID-1 antibodies were seen in patients who developed T2R when compared to
patients who developed T1R or unreactional MB patients (p<0.05). Anti PGL-I serology
in these patients showed no statistically significant difference (Fig.3).
79
Figure 3. Distribution of levels of antibodies anti LID-1 and anti-PGL-I in groups of
MB patients who developed T1R or T2R at diagnosis and MB patients who did not
develop leprosy reaction. The boxes include the 25th and 75th percentiles of the OD of
each serology. Lines in the box refer the median OD of each serology. A. Serology anti-
LID-1. B. Serology anti-PGL-1. OD: Optical Density.
Serological analysis of MB patients who developed T1R and T2R during MDT
and of MB patients who did not developed reaction after MDT also showed higher
levels of anti LID-1 in patients who developed T2R (p = 0.020), while there was no
statistically significant difference in serology PGL-I between these groups (Fig. 4).
LID-1
MB T
1R A
t Dia
gnosis
MB T
2R A
t Dia
gnosis
MB- R
eact
ion fr
ee-A
t Dia
gnosis
0
1
2
3
**p=0,008
n=18 n=7 n=12
*p=0,020
A
OD
PGL-I
MB T
1R A
t Dia
gnosis
MB T
2R A
t Dia
gnosis
MB- R
eact
ion fr
ee-A
t Dia
gnosis
0
1
2n=18 n=7 n=12
OD
B
LID-1
MB- T
1R- Durin
g MDT
MB- T
2R- Durin
g MDT
MB- R
eactio
n free-
Post
MDT
0
1
2
3n=8 n=5 n=12
*p=0,020
A
OD
PGL-I
MB- T
1R- D
uring M
DT
MB- T
2R- D
uring M
DT
MB- R
eactio
n free
- Post
MDT
0.0
0.5
1.0
1.5n=8 n=5 n=12
B
OD
80
Figure 4. Distribution of anti LID-1 and anti-PGL-I antibody levels in groups of MB
patients who developed T1R or T2R during MDT and among unreactional MB patients.
The boxes include the 25th and 75th percentiles of the OD to LID-1 and anti PGL-I
serology. Lines in the box refer the median OD value. A. Anti-LID-1 serology. B. Anti-
PGL-1 serology. OD: Optical Density.
Among PB patients with T1R at diagnosis and unreactional patients there was no
statistically significant difference anti LID-1 and anti PGL-I antibody levels (Fig. 5).
Immunoreactivity of PB patients who developed T1R during MDT and unreactinal PB
patients was not statistically different (Fig. 6).
Figure 5. Distribution of anti LID-1 and anti-PGL-I antibody levels among PB patients
diagnosed during a T1R and among unreactional PB patients. The boxes include the
25th and 75th percentiles of the OD to LID-1 and anti-PGL-I serology. Lines in the box
refer to the median OD. A. Anti-LID-1 serology. B. Anti-PGL-1 serology. OD: Optical
Density.
LID-1
PB T
1R A
t Dia
gnosis
PB- R
eact
ion fr
ee-A
t Dia
gnosis
0.0
0.5
1.0n=10 n=6
A
OD
PGL-I
PB T
1R A
t Dia
gnosis
PB- R
eact
ion fr
ee-A
t Dia
gnosis
0.0
0.5
1.0
n=10 n=6
B
OD
81
Figure 6. Distribution of anti LID-1 and anti-PGL-I antibody levels among PB patients
who developed T1R during MDT and among unreactional PB. The boxes include the
25th and 75th percentiles of the OD to LID-1 and anti-PGL-I serology. Lines in the box
refer to the median OD value. A. Anti-LID-1 serology. B. Anti-PGL-1 serology. OD:
Optical Density.
Discussion
The search for serological markers for the diagnosis or prognosis of leprosy type
1 or type 2 reactions is challenged by several factors. In this study we evaluated
antibody levels to the new LID-1 fusion protein and to the well known PGL-I antigen.
As leprosy reactions may develop before, during or after MDT we have tested samples
collected in a cohort study to investigate leprosy reactions. Paired samples collected in
the presence and absence of a reactional episode were tested. Due to the dichotomy of
the immune response seen in leprosy patients in which in MB patients are characterized
by strong Th2 immune response and antibodies production whereas PB patients are
characterized by Th1 type cellular immune response and low antibody titers, the
antibody response in leprosy can be better evaluated in MB patients. On the other side,
MB patients may develop T1R or T2R at different periods, at diagnosis or during MDT
and a minority can still develop leprosy reaction years after MDT. However the impact
of T1R on the antibody production of PB patients has not been investigated. Although
LID-1
PB- T
1R- D
uring M
DT
PB- R
eact
ion fr
ee- P
ost M
DT
0.0
0.5
1.0 n=6 n=6
AO
DPGL-I
PB- T
1R- D
uring M
DT
PB- R
eact
ion fr
ee- P
ost M
DT
0.0
0.5
1.0 n=6 n=6
B
OD
82
PB patients are low antibody producers and T1R I considered a CMI phenomenon,
precedent form this comes form the fact that although MB patients are anergic, they
develop transitory CMI during T2R. In order to evaluate the possible impact of T1R and
T2R on antibody production in both MB and PB patients we have investigated both
T1R that are considered CMI phenomena and T2R that are related to antibody
production among PB and MB leprosy patients. Leprosy reactions are acute immune
inflammatory episodes characterized by dysregulated and exacerbated immune
response. In this complex scenario of different forms of leprosy (MB/PB) that can
develop different types of reaction (T1R/T2R) at different times of the disease
(diagnosis/during MDT), we tried different approaches to analyze the data either in
paired samples or in groups.
Despite the efforts to monitor 73 well-characterized patients, stratification of
patients in different clinical outcomes resulted in small groups so that our results need
to be validated in larger samples. However, some findings of this study are noteworthy,
especially about the recent use of the LID-1 fusion protein LID- 1 in serology. In this
sense, our research group is currently testing the anti-PGL-I (IgM), anti LID-1 (IgG)
and anti-LID NDO (IgM and IgG) seroreactivity in sequential samples collected in a
cohort of 564 patients recruited and monitored in Manaus and Fortaleza who
participated in the Uniform Trial MDT (U-MDT) designed to investigate the use of a
single treatment scheme with rifampicin, dapsone and clofazimine for 6 months for both
PB and MB patients (29). This cohort recruited 404 patients who did not develop
leprosy reaction and 160 who developed T1R or T2R. These patients were followed
monthly during MDT and annually after completion of treatment. Thus, this study will
be critical to elucidate the role of mainly anti LID-1 serology, in the diagnosis or
prognosis of leprosy reactions.
Previous studies investigating serologic anti PGL-I and anti LID-1 responses
during treatment have shown that MDT leads to a significant drop in the levels of
specific antibodies suggesting that anti LID-1 and anti PGL-I serology can be useful
tools in monitoring the effectiveness of MDT (24-26). Our data confirm the decline of
anti LID-1 antibodies levels in unreactional MB patients after MDT. Similarly, we
observed a significant decline of anti LID-1 antibody level in MB patients diagnosed
during T1R and T2R. However, the drop of anti LID- 1 antibodies in MB patients who
83
developed T1R or T2R during MDT was not significant. In agreement with our data, a
study conducted in the Philippines monitoring antibody titers of 12 MB patients by
ELISA and Western blot in 6 visits for 12 months showed maintenance of high anti
LID-1 antibody titers in a MB patient who developed T2R (27). In our study the decline
of anti PGL-I antibodies among MB patients who developed T1R or T2R did not differ
from unreactional MB patients as shown in a previous study (10). However, the decline
of anti PGL-I antibodies in MB patients with T1R at diagnosis was significant
compared to MB patients who developed leprosy reactions during MDT, however given
the effect of MDT in the decline of the antibody titers, we cannot rule out the influence
of MDT in the fluctuation of antibody levels in leprosy reactions observed during MDT.
In this study, most reaction-free MB patients had high anti-PGL-I levels after
MDT suggesting that these patients were still at risk of developing reaction and
indicating the need for further monitoring. In 2008, a case-control study showed that
patients who had persistent positive anti-PGL-I serology after treatment had a higher
risk to develop leprosy reaction when compared to those with negative serology (8).
In an attempt to exclude the effect of MDT on the analysis of serological results
for patients with reaction at diagnosis and allow further analysis of patients that
developed reactions during MDT, results were stratified according to the patients’
classification (MB or PB), type of leprosy reaction (T1R or T2R) and time of
occurrence of reactions (at diagnosis or during MDT) and compared to results from
leprosy patients who did not develop leprosy reaction. This analysis allowed us to
compare the results of serology in the absence of MDT in patients who developed T1R
or T2R at diagnosis and in patients who did not develop leprosy reaction at the time of
diagnosis. This approach also allowed us to compare the outcomes of patients who were
already receiving treatment, who developed T1R or T2R with those who did not
develop leprosy reaction. Anti-PGL-I antibodies levels in MB patients who developed
T1R/T2R at diagnosis, were similar to the levels observed in reaction- free patients.
Accordingly, a previous study of our research group did not detect differences in anti-
PGL-I IgM and IgG antibodies in patients who developed T1R or T2R at diagnosis
compared to patients who had no symptoms of leprosy reaction at diagnosis and to
healthy endemic controls (11). Furthermore, another study that enrolled patients from
Nepal and healthy controls from the UK also confirmed these results (39).
84
Furthermore, a higher anti LID-1 and anti-PGL-I reactivity was seen in PB
patients who developed T1R at diagnosis compared to unreactional PB patients who did
not show any reactivity to the LID-1 and PGL-I antigens. These results indicate that
despite the fact that PB are considered weak antibody-producers and T1R are
characterized by increased cellular immunity, antibodies are present in greater levels in
PB patients who develop T1R at diagnosis. A previous study involving 534 patients
with MB and PB leprosy, of which 279 developed T1R (187 at diagnosis and 92 during
MDT), had shown that leprosy patients who had high levels of anti-PGL-I antibodies at
baseline had a higher risk of developing T1R (9). Another study conducted in North
India which followed 303 patients showed that those who developed leprosy reactions
had higher levels of anti-PGL-I antibodies than patients who did not develop leprosy
reaction (28). Thus, high anti-PGL-I levels have been suggested as risk factors for the
development of both type of leprosy reactions, however with conflicting results.
The serological response to recombinant proteins of M. leprae during leprosy
reaction has not been described. In this study among MB leprosy higher reactivity to
LID-1 was seen among patients who developed T2R at diagnosis compared with
unreactional patients and patients who developed T1R at diagnosis. Moreover, different
antibody levels were seen in patients who developed T2R during MDT compared with
unreactional MB patients after MDT. Together, these results indicate that high levels of
anti LID-1 may be associated with the occurrence of T2R, regardless of whether the
episode occurs at diagnosis or during MDT.
Several studies are being performed to find a laboratory marker or a set of
biomarkers for the diagnosis and prognosis of leprosy reactions. Among the potential
biomarkers related to reactional episodes, various cytokines, chemokines and acute
phase protein such as IFN , IL -12 (31) , TNFα , IL- 1β (32) , IL-2 , IL-8 (33) , IL-6 ,
CXCL -10 (34), neopterin (35) were associated with T1R , and TNFα , IL -1 (36) , C-
reactive protein and IL-6 (37,38) have been associated with T2R. In the present study
we observed an association between high levels of anti LID -1 antibodies with the
occurrence of T2R. The association of a set of non-specific biomarkers as cytokine with
specific anti LID-1 serology may be useful in diagnosis and prognosis of T2R in MB
patients.
85
Conclusions
Results of serology of paired serum samples in MB patients collected in the
presence and absence of T1R/T2R showed variable serological profiles however with a
declining trend in antibody levels after the reactional episode. However, the influence of
MDT in the decline of antibodies in patients who developed leprosy reactions during
MDT cannot be rulled out.
The results of the serology by groups of patients, type of reaction and time of
occurrence of the leprosy reaction suggest that in MB patients, high anti LID-1 antibody
levels may be associated with increased risk of developing T2R at diagnosis or during
MDT.
Acknowledgements
The authors thank Greg Ireton, Jeff Guderian, Raodoh Mohamath and Ayesha Misquith
(IDRI, USA) for the production of high quality recombinant proteins. We are also
thankful to Dr. Tsuyoshi Fujiwara (Nara University, Japan) for generously providing the
NT-P-BSA antigen. Mizoguti D.F. were supported by scholarships from the National
Council for Technological and Scientific Development/CNPq and from the
Coordination of Improvement of Higher Education Personnel/CAPES respectively
(Brazil); Stefani MMA is a recipient of a fellowship from CNPq (grant # 310582/2011-
3). We are grateful to the patients and staff of the “Centro de Referência em Diagnóstico
e Terapêutica” in Goiânia/GO for their cooperation and support during recruitment.
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