UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO ......pela graça de Deus o sol clariando Quero chegar na...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCOCENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICASPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e

Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

Antonio Marcos Saraiva

Recife, 2007

Antonio Marcos Saraiva

Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl.

frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

Orientadora: Profª. Dra. Maria Nelly Caetano Pisciottano

Co-Orientador: Prof. Dr. Haroudo Satiro Xavier

Recife – 2007

Dissertação de Mestrado, submetida ao Programa de Pós-graduação do Departamento de Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Saraiva, Antônio Marcos

Estudo farmacognóstico e determinação da atividade biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes / Antônio Marcos Saraiva. – Recife : O Autor, 2007.

XXI, 110 folhas : il., fig., tab., gráf., quadros .

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacências, 2007.

Inclui bibliografia, anexos e apêndice.

1. Caesalpinia pyramidalis Tull – Estudo farmacognóstico . 2. Schinopsis brasiliensis Engl. – Estudo farmacognóstico. 3. Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes. I . Título.

615.33 CDU (2.ed.) UFPE 615.32 CDD (22.ed.) CCS2007- 09

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Reitor Prof. Amaro Henrique Pessoa Lins

Vice-Reitor Prof. Gilson Edmar Gonçalves e Silva

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação Anísio Brasileiro de Freitas Dourado

Diretor de Centro de Ciências da Saúde Prof. José Thadeu Pinheiro

Vice-Diretor de Centro de Ciências da Saúde Prof. Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros

Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas Profº. Dra. Jane Sheila Higino

Vice-Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas Prof. Samuel Daniel de S. Filho

Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto

Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Profª. Dra. Beate Saegesser Santos

DEDICATÓRIA

Este trabalho é dedicado em especial ao nosso criador, que foi quem iniciou esta jornada, e também em Memória de Antonio Saraiva Neto, meu pai, e José Martins da Silva, grande amigo e irmão. À minha mãe, Betinha Saraiva que acreditou e não desistiu de mim, me apoiando nos estudos, quanto tudo influenciava para o contrário e bancando meus estudos, no momento mais conturbado de nossas vidas. À minha esposa Cristiane Lopes, pelo companheirismo, amizade, apoio e compreensão nos momentos de ausência do lar.

Às minhas Irmãs, Margareti, Maria da Saúde, Glecia e Glaudey pelo carinho e amizade que superaram a ausência destes onze anos, sendo que no início houve uma grande perda em nossas vidas, e claro aos meus sobrinhos: o trio parada dura: Rhaênio, Rhaeny e Rhaênia; a dupla dinâmica: Marquinhos e Matheus; e aos pequenos: Vitória, Alexandre e Henrique, todo o carinho do tio Ninho. Aos meus tios, excepcionalmente a Cornélio Marcolino, Socorro Marcolino, Beto Marcolino, Manuel Marcolino e José Marcolino (em memória), pela amizade, dedicação e ensinamentos que me fortaleceram em toda minha vida. Aos meus avós: (em memória) Vicente Saraiva e Antônia Gomes; João Marcolino e Almerinda de Jesus, que são anjos em minha vida, trazendo a pura, limpa e cristalina alegria, nos ensinamentos e na vida. Aos meus sogros, Luís Lopes e Ivã Maria, que também fizeram parte desta nova caminhada, pelo apoio e amizade. À Profª. Dra. Nelly Caetano, que faz parte de minha vida desde 1999, quando me orientou na Iniciação Científica (1999-2001), até hoje me ensina e me auxilia na pesquisa e nos estudos científicos e ensino. Ao Prof. Dr. Haroudo S. Xavier, que tão bem me recebeu em seu Laboratório e o disponibilizou-me para que se realizassem todos os ensaios que assim fosse necessários, como também sempre se dispôs a compartilhar seus conhecimentos, orientando-me e ensinando-me. Ao Ms. Risonildo Pereira, aos Farmacêuticos Rogério Ribeiro, Admário Gonçalves, À mestranda Mirtes Gonçalves e a técnica Edna de Menezes por todo o suporte técnico e profissional no desenvolvimento da pesquisa.

Ao Ms. José Guedes, a Mestra Jovita Braga e Dra. Karina Randau pela ajuda, companheirismo e dedicação na elaboração deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

Em especial a Deus, minha esposa Cristiane Lopes, minha mãe Betinha Saraiva e meu pai Antonio Saraiva, que foram sempre um espelho de dignidade, garra e fé para mim, onde eu procurava refletir minha imagem. As minhas irmãs Margareti, Maria da Saúde, Glecia e Glaudey, ao meu tio, Cornélio Marcolino, enfim a todos os meus familiares pela ajuda nos trabalhos e na vida, pela força com uma palavra amiga e confortadora, pela compreensão nos momentos de estresse dos trabalhos árduos, que é para o pesquisador brasileiro, enfim, pelo companheirismo em todos os momentos.

Á Profª. Nelly Caetano, minha Orientadora e ao Prof. Haroudo S. Xavier, meu co-Orientador, pela amizade, auxílio e orientação nos estudos que propiciaram a formulação e desenvolvimento desta Dissertação.

Aos Amigos e Colegas do Laboratório de Análises Microbiológicas1 e do Laboratório de Farmacognosia2: Risonildo P. Cordeiro1, Admário Marques1, Edna Menezes1, Mirtes Gonçalves1, Rogério Ribeiro Soares1, Fabrício Mendes1, Verônica W. Pereira2, Diogo Florencio2, Jovita Braga2, José Guedes Sena Filho2, Karina Randau2, Evani Lemos2, Clébio Pereira2, Kesia Pontual2, Eliane2 pelo companheirismo, amizade e apoio nesta longa jornada do mestrado.

A todos os Colegas de Mestrado, pelo companheirismo, dedicação e amizade. Aos Professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas-UFPE, pela

dedicação, comprometimento e disponibilidade de compartilhar seus conhecimentos com todos os alunos.

À Profª. Dra. Agnes M. S. Figueiredo, e em seu nome a todos aqueles de fazem parte do Laboratório de Biologia Molecular de Bactérias, Instituto de Microbiologia, UFRJ, por classificarem a clonacidade das cepas de S. aureus .Multirresistentes (cepas do estudo de dissertação do Prof. Ms. Risonildo Pereira Cordeiro) estudadas frentes aos estratos de Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl.

À Profª. Dra. Rejane Pimentel (UFRPE) pela amizade, dedicação e ajuda na elaboração deste trabalho.

À Profª. Dra. Ivone Antônia de Souza, pelo profissionalismo e apoio na realização deste trabalho.

Á Prof. Dra. Rita de Cássia Pereira, e em seu nome a todos que fazem parte da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), por classificar as espécimes, lá enviadas e depositadas.

Aos Membros da Banca Examinadora: Profª. Dra. Nelly Caetano (Presidente da Banca), Dra. Karina Randau, Profª. Dra. Janete Magali de Araújo, Prof. Dr. Harouldo S. Xavier, Profª. Dra. Rejane Magalhães de Mendonça Pimentel por participarem da banca de defesa de minha dissertação.

EPÍGRAFE (A Porta do TempoA Porta do TempoA Porta do TempoA Porta do Tempo)

Quando a tampa do tempo destampa e o vento vai Mas a porta do tempo é sem tampa e o vento vem Quem tá leve voa, quem tem o pé no chão não cai Quando a tampa do tempo destampa o bem querer Acende as estrelas, a lua, o sol dourado O futuro é o presente, não nega o passado A têmpera do movimento eternizado Universo no tempo destampado

Quando a porta do tempo destampa a alegria Só se vê revoada de passarinho na vida e o passarinho da vida é a alegria.

Quando a tampa do tempo destampa o tempo E a chuva carinhosa renova a terra, Agradece os animais, a pedra bruta, O mar, as grutas e a luta dos ancestrais

Quando a porta do tempo destampa a emoção que os olhos enchem os rios que enchem o mar O choro às vezes lava o coração e o coração limpo é pérola

Com a graça de Deus estou vivendo, pela graça de Deus o sol clariando

Quero chegar na clareza mas onde estou comigo está Meu jaboti, meu papagaio, minha juriti, meu sabiá

A lua, o sol, o sol que é o mesmo clarão, brilho que a lua nos dá Rios, pontes, porteiras, estrada aberta Rios, pontes, ladeiras, caminho de chegar


No início da vida abriu-se o tempo Tempo que não vai retornar Quem entrou na roda do tempo é pra ser só o tempo é quem dirá

A palavra do tempo é a prática A semente que no homem brota Com chuva ou com sol há de nascer Nasceu não tem volta


Quando a vida destrancou a porta Do tempo derramou semente Da água, do fogo, do vento, Minerais, vegetais, bicho e gente

Quanto tempo não se sabe ainda Pro tempo o eterno é um segundo Enquanto houver planta florida É tempo de gente no mundo Enquanto houver água tem vida E é tempo de gente no mundo

Com a graça de Deus estou crescendo, pela graça de Deus o sol clariando

Compositor: Juraildes da Cruz

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS.............................................................. XI LISTA DE FIGURAS............................................................................................ XIV LISTA DE TABELAS........................................................................................... XVI LISTA DE QUADROS.......................................................................................... XIII LISTA DE GRÁFICOS......................................................................................... XIX RESUMO............................................................................................................... XX ABSTRACT........................................................................................................... XXI

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................... 23 1.1. As plantas como “Antibióticos Naturais”.......................................................... 25 1.2. Staphylococcus aureus.......................................................................................... 27 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................ 30 2.1. Caesalpinia pyramidalis Tull. – Caesalpinaceae................................................ 31 2.1.1. Botânica.................................................................................................................. 31 2.1.2. Uso popular............................................................................................................ 32 2.2.3. Estudos fitoquímicos.............................................................................................. 32 2.2.4. Atividade antimicrobiana....................................................................................... 36 2.2. Schinopsis brasiliensis Engl – Anacardiaceae.................................................... 36 2.2.1. Botânica.................................................................................................................. 37 2.2.2. Uso popular............................................................................................................. 39 2.2.3. Estudos fitoquímicos.............................................................................................. 39 2.2.4. Atividade antimicrobiana....................................................................................... 41 2.3. Staphylococcus aureus - MRSA Multirresistentes............................................. 42 2.3.1. Histórico de Resistência......................................................................................... 43 3. OBJETIVO........................................................................................................... 46 3.1. Objetivo Geral...................................................................................................... 47 3.2. Objetivo Específico............................................................................................... 47 4. CONCLUSÃO...................................................................................................... 48 5. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA.................................................................... 51 6. ANEXOS 6.1. Anexo I 6.2. Anexo II 6.3. Anexo III 6.4. Anexo IV 7. APÊNDICE 7.1. Artigo I - Antimicrobial Activity and Phytochemical Screening of

Schinopsis brasiliensis Engl (Anarcadiaceae) Resumo Abstract Introduction Material And Methods Plant Material Crude Extract Preparation Microorganisms Plate-Hole Diffusion Assay Minimum Inhibitory Concentration (MIC)

Phytochemical ProfileResultsDiscussion References

7.2. Artigo II - Antimicrobial Activity And Phytochemica l Profile Of Caesalpinia Pyramidalis Tull (Fabaceae) Abstract Introduction Material and Methods Plant Material Crude Extract Preparation Microorganisms Plate-Hole Diffusion Assay Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Phytochemical Profile Results Discussion References

7.3. Artigo III - Determinação da Atividade Antimicrobia na de Schinopsis brasiliensis Engl. (Anacardiaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes Resumo Introdução Materiais e Métodos Coleta e Identificação Preparação dos Extratos Bactérias Preparação dos Inóculos Técnica Poços / Difusão Em Agar Determinação da Concentração Mínima Inibitória Cromatografia em Camada Delgada (CCD) / Estudo Fitoquímico Bioautografia Resultados Atividade Antimicrobiana Discussão Referência Bibliográfica

7.4. Artigo IV - Determinação da Atividade Antimicrobian a de Caesalpinia pyramidalis Tull. (Fabaceae) frente a Cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes Resumo Introdução Materiais e Métodos Coleta e Identificação Preparação dos Extratos Bactérias Preparação dos Inóculos Técnica Poços / Difusão Em Agar

Determinação da Concentração Mínima Inibitória Cromatografia Em Camada Delgada (CCD) / Estudo FitoquímicoBioautografia Resultados Atividade Antimicrobiana Discussão Referência Bibliográfica

XI

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

µg.mL-1 - micrograma por mililitro µl - Microlito AcOH - Ácido acético AM - Código da Coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas –

Depto. de Ciências Farmacêuticas - UFPE ATCC - American Type Culture Collection B. subtilis - Bacillus subtilis BCA - Braúna Casca extraída em Acetato de etila BCM - Braúna Casca extraída em Metanol BCVM ou BVCM - Braúna Casca da Vagem extraído em Metanol BFA - Braúna Folha extraída em Acetato de etila BFH - Braúna Folha extraída em Hexano BFLA - Braúna Flor extraída em Acetato de etila BFLH - Braúna Flor extraída em Hexano BFLM - Braúna Flor extraída em Metanol BFM - Braúna Folha extraída em Metanol Bp - Pares de base BPVM - Braúna Pó da Vagem extraída em Metanol BRA - Braúna Casca da Raiz em Acetato de etila BRM - Braúna Casca da Raiz extraída em Metanol BSM - Braúna Semente extraída em Metanol BuOH - Butanol C. albicans - Candida albicansC. pyramidalis - Caesalpinia pyramidaliscAM373 - código de Staphylococcus aureusCA-MRSA e CA-SAMR

- Staphylococcus aureus cepa comunitária

CDC - Center for Disease Control Prevention CEB ou BEC - Clone epidêmico Brasileiro Cip - Ciprofloxacina COL - Clones de S. aureus de Multirresistente DMSO - Dimetilsulfóxido DNA - Desoxirribonucleotídeo Dnase - Enzima Desoxirribonuclease E. coli - Escherichia coliE. faecalis - Enterococcus faecalisEri - Eritromicina EtOAc - Acetato de Etila EUA - Estados Unidos da América FDA - Food and Drug Administration Gen - Gentamicina GISA - Staphylococcus aureus com sensibilidade intermediária aos

glicopeptídeos HCOOH - Ácido Fórmico

XII

Hex - Hexano M. smegmatis - Mycobacterium smegmatis Mdr - Multidrogas ResistênciaMe2CO - Acetona mec - Gene que codifica a PBP mecA - Gene que codifica a PBP2’ ou PBP2a MeOH - Metanol mg.mL-1 - miligramas por mililitro MH - Muller Hinton MIC ou CMI - Concentração Mínima Inibitória Mm - milímetro MRSA252 - Clones de S. aureus de MultirresistenteMRSA - Staphylococcus aureus Meticilina Resistente MSSA476 - Clones de S. aureus de MultirresistenteMSSA - Staphylococcus aureus Meticilina Sensibilidade Mu50 - Clones de S. aureus de MultirresistenteMW2 - Clones de S. aureus de MultirresistenteN. crassa - Neurospora crassa N315 - Clones de S. aureus de Multirresistente NaCl - Cloreto de Sódio NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards NCTC8325 - Clones de S. aureus de Multirresistente NNISS - National Nosocomial Infections Survellance Systen NT - Não Testado Oxa - Oxacilina OMS - Organização Mundial de Saúde PBP - Proteína Fixadora de Penicilina PBP2’ ou PBP2a - Proteína Fixadora de Penicilina de menor afinidade Pen - Penicilina S. aureus - Staphylococcus aureusS. brasiliensis - Schinopsis brasiliensis S. haemolyticus - Staphylococcus haemolyticusSCCmec - Staphylococcus Chromossomal CasseteSi - Sílica Szt - Sulfametoxazol/Trimetroprima Tet - Tetraciclina TLC - Cromatografia em camada delgada TSST - Toxinas da Síndrome do Choque Tóxico UFC - Unidade Formadora de Colônia UFPE - Universidade Federal de Pernambuco UV - Ultravioleta v/v - Volume/volume Van - Vancomicina VanA - Gene de resistência à vancomicina VAnB - Gene de resistência à vancomicina VanC - Gene de resistência à vancomicina

XIII

VISA - Staphylococcus aureus com sensibilidade intermediária a Vancomicina VRSA - Staphylococcus aureus Resistente a Vancomicina

XIV

LISTA DE FIGURAS

Revisão Bibliográfica Figura 1 - Hábito de Caesalpinia pyramidalis Tull............................................ 31Figura 2 - Folhas, Flores e Vagem de Caesalpinia pyramidalis........................ 32 Figura 3 - Hábito de Schinopsis brasiliensis Engl..............................................37 Figura 4 - Folhas e Flores de Schinopsis brasiliensis......................................... 38 Figura 5 - Vagem de Schinopsis brasiliensis...................................................... 38

Anexo I Figura 1 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - CCM e CCA Figura 2 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - CFLM e CSM Figura 3 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - CVM e CVA Figura 4 - Poços/difusão em agar – Clone Esporádico, AM-594 - BCM e

BCA. Figura 5 - Poços/difusão em agar – Clone Epidêmico Brasileiro, AM-723 -

CFM e CFA Figura 6 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-922 - CVM e

CVA Figura 7 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-942 - CVM e

CVA Figura 8 - Poços/difusão em agar – Clone Esporádico, AM-594 - BFM e

BFA Figura 9 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-922 - BCM e BCAFigura 10 - Poços/difusão em agar - ATCC 6538 - BFM e BFA. Figura 11 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-942 - BRM e BRAFigura 12 - Poços/difusão em agar – Clone Pediátrico, AM-922 - CCM e

CCA. Figura 13 - Poços/difusão em agar – Clone Epidêmico Brasileiro, AM-723 -

CFLM e CSM. Anexo II

Figura 1 - Bioautografia – BFLA-CFLA-CFA-CCA-BFA Figura 2 - Bioautografia – BFM-BCM-BRA-BFLM-BCA Figura 3 - Bioautografia – BFA. Figura 4 - Bioautografia – CFM-CFLM

Anexo III Figura 1 - CCD – Pesquisa de Catequinas – Schinopsis brasiliensis Figura 2 - CCD – Pesquisa de Catequinas Caesalpinia pyramidalis. Figura 3 - CCD – Pesquisa de Monoterpenos - Schinopsis brasiliensis Figura 4 - CCD – Pesquisa de Monoterpenos - Caesalpinia pyramidalis Figura 5 - CCD – Pesquisa de Polifenois – Schinopsis brasiliensis Figura 6 - CCD – Pesquisa de Polifenois - Caesalpinia pyramidalis. Figura 7 - CCD – Pesquisa de Açúcares Redutores – Schinopsis brasiliensis. Figura 8 - CCD – Pesquisa de Açúcares Redutores - Caesalpinia pyramidalis.Figura 9 - CCD – Pesquisa de Terpenos – Schinopsis brasiliensis e

Caesalpinia pyramidalisFigura 10 - CCD – Pesquisa de Monoterpenos – Schinopsis brasiliensis BFLM

.

XV

Figura 11 - CCD – Pesquisa de Polifenois – Schinopsis brasiliensis BFLM Anexo IV

Figura 1 - Placa de Oxacilina CMI 256 µg.ml-1. Figura 2 - Placa de Oxacilina CMI 128 µg.ml-1

Figura 3 - Placa de Tetraciclina CMI 64 µg.ml-1.Figura 4 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BFM - CMI 0,5 mg.mL-1

Figura 5 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BRM - CMI 0,5 mg.mL-1

Figura 6 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BCA - CMI 1 mg.mL-1.Figura 7 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BCA - CMI 0,5 mg.mL-1

Figura 8 - Placa de Schinopsis brasiliensis – BRM - CMI 1 mg.mL-1.Figura 9 - Placa de Caesalpinia pyramidalis – CRM - CMI 1 mg.mL-1.Figura 10 - Placa de Caesalpinia pyramidalis – CRM - CMI 0,5 mg.mL-1

Figura 11 - Placa de Controle – meio Agar Muller HintonFigura 12 - Placa de Controle – DMSO 5%. Apêndice 7.3 - Artigo IIIFigura 1 - Bioautografia de Schinopsis brasiliensis – BFM, BCM, BFLM e

BCA. Figura 2 - Bioautografia de Schinopsis brasiliensis – BFA e BFLA.

7.4 - Artigo IVFigura 1 - Bioautografia de Caesalpinia pyramidalis – CFM e CFLM Figura 2 - Bioautografia de Caesalpinia pyramidalis – CFA e CFLA.

XVI

LISTA DE TABELAS

Anexos Tabela 1 - Síglas dos anexos (I, II, III e IV)

Apêndice 7.1 - Artigo I - Antimicrobial Activity and Phytochemical Screening of Schinopsis brasiliensis Engl. (Anacardiaceae)

Tabela 1 - Part of the Plant used and the yield (%) Tabela 2 - Chromatography condition of phytochemistry screening of S.

brasiliensisTabela 3 - Results of the phytochemical analyses Tabela 4 - Antimicrobial activities of the n-hexane, ethyl acetate and methanol

extracts. Tabela 5 - Minimum inhibitory concentration (MIC) of the microorganism

7.2 - Artigo II - Antimicrobial Activity and Phytochemical Profileof Caesalpinia pyramidalis Tull (Fabaceae)

Tabela 1 - Part of the Plant used and the yield (%). Tabela 2 - Chromatography condition of phytochemistry screening of

Caesalpinia pyramidalis.Tabela 3 - Results of the phytochemical analyses Tabela 4 - Antimicrobial activities of the n-hexane, ethyl acetate and methanol

extracts. Tabela 5 - Antimicrobial activities of the n-hexane, ethyl acetate and methanol

extracts. 7.3 - Artigo III - Determinação da Atividade Antibacteriana de Schinopsis brasiliensis Engl. (Anacardiaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

Tabela 1 - Extratos de Schinopsis brasiliensis (Baraúna) Tabela 2 - Cepas de Staphylococcus aureus Tabela 3 - Sistemas cromatográficos utilizados para screening fitoquímico de

Schinopsis brasiliensis EnglTabela 4 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de

Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).

Tabela 5 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).

Tabela 6 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico

Tabela 7 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Pediátrico

Tabela 8 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões

XVII

ATCC. Tabela 9 - Atividade antimicrobiana extratos extraídos em acetato de etila de

Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC.

Tabela 10 - Valores dos Rfs, referente às zonas de inibição dos extratos de Schinopsis brasiliensis obtidos nas bioautografias em CCD, frentes a S. aureus ATCC 6538 7.4 - Artigo IV - Determinação da atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis Tull. (Fabaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

Tabela 1 - Extratos de Caesalpinia pyramidalis (Catingueira) Tabela 2 - Cepas de Staphylococcus aureus Tabela 3 - Sistemas cromatográficos utilizados para screening fitoquímico de

Caesalpinia pyramidalis TullTabela 4 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de

Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).

Tabela 5 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC).

Tabela 6 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico

Tabela 7 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em acetato de etila de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Pediátrico.

Tabela 8 - Atividade antimicrobiana dos extratos extraídos em metanol de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC.

Tabela 9 - Atividade antimicrobiana extratos extraídos em acetato de etila de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC.

Tabela 10 - Valores dos Rfs, referente às zonas de inibição dos extratos de Caesalpinia pyramidalis obtidos nas bioautografias em CCD, frentes a S. aureus ATCC 6538

XVIII

LISTA DE QUADROS

Revisão Bibliográfica Quadro 1 - Levantamento bibliográfico dos isolados de Caesalpinia pyramidalis

Tull.......................................................................................................... 33 Quadro 2 - Levantamento bibliográfico dos isolados de Schinopsis brasiliensis

Engl.......................................................................................................... 39

XIX

LISTA DE GRÁFICOS

Apêndice 7.3 - Artigo III Gráfico 1 - Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus

- Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica

Gráfico 2 - Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus - Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração em Acetato de Etila.

Gráfico 3 Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus - Conc. 5 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica

Gráfico 4 Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus - Conc. 5 mg.mL-1 – Extratos de extração em Acetato de Etila

7.4 - Artigo IV Gráfico 1 - Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S.

aureus - Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica

Gráfico 2 - Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S. aureus -Conc. 10 mg.mL-1 – Extratos de extração em Acetato de Etila.

Gráfico 3 Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S. aureus - Conc. 5 mg.mL-1 – Extratos de extração Metanólica.

Gráfico 4 Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S. aureus - Conc. 5 mg.mL-1 – Extratos de extração em Acetato de Etila

XX

RESUMO

O aumento da resistência bacteriana aos antibióticos é uma ameaça à saúde da população mundial, aumentando as recorrências por doenças infecciosas, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes que dificulta e onera o tratamento antimicrobiano. Um exemplo importante destes germes, é o S. aureus MRSA que no Brasil, como em outras partes do mundo, são os microorganismos frequentemente isolados, tendo sua maior prevalência a nível hospitalar, sendo também uma importante causa de infecções na comunidade. A ocorrência de S. aureus MRSA multirresistentes susceptíveis só a vancomicina, constitui um grave problema a resolver, ainda mais, com o surgimento recente de cepas de S. aureus com susceptibilidade intermediária e resistentes a vancomicina. Deste fato, é de fundamental importância, a pesquisa de compostos alternativos, principalmente a partir de plantas medicinais que constitui uma fonte inesgotável de novas moléculas. No presente trabalho, foram escolhidas duas plantas para estudar o perfil fitoquímico e antimicrobiano: Caesalpinia pyramidalis Tull. (Catingueira), das leguminosas e Schinopsis brasiliensisEngl. (Baraúna ou braúna), das anacardiáceas, ambas as famílias com representantes de reconhecida atividade biológica, incluída a antimicrobiana. Neste sentido foi estudada a atividade dos extratos secos (por extração hexanólica, em acetato de etila ou metanol) da folha, casca do caule, casca da raiz, flor, vagem e semente da Braúna e Catingueira inicialmente frente a padrões ATCC de bactérias Gram negativas e Gram positivas, confirmando-se uma melhor ação para Staphylococcus aureus. Na segunda etapa os ensaios foram realizados com 22 cepas de Staphylococcus aureus, 18 isolados clínicos MRSA multirresistentes identificados como Clones Epidêmicos, 2 isolados S. aureus MSSA e 2 cepas padrões ATCC. Dos resultados obtidos para as plantas em estudo, a Schinopsis brasiliensis apresentou melhor atividade sobre as cepas de S. aureus, inclusive os clones epidêmicos mais resistentes. Os extratos secos de extração metanólica foram mais ativos com dados de CMI para a flor e raiz de Braúna de 125 µg.mL-1 quanto que pela técnica de poços foram obtidos para uma das cepas de Staphylococcus aureus MRSA multirresistente (CEB) halos da ordem de 20 mm. Os extratos secos de extração por acetato de etila mostraram-se menor ação, o que pode ser atribuído à uma difusão diminuída no agar. Nos testes, os antibióticos usados como padrão foram tetraciclina e oxacilina na determinação das CMI e tetraciclina na técnica de poços, confirmando a oxacilina o caráter MRSA ou MSSA das cepas e a tetraciclina seu perfil de resistência. Os dois diluentes utilizados DMSO à 50% e Tween 80 à 4% não apresentaram nenhuma inibição. Concluindo, considera-se que as plantas em estudo e particularmente a Schinopsis brasiliensis apresentou uma atividade promissora sobre as cepas de S. aureus MRSA inclusive os clones multirresistentes, considerando-se que em parte esta atividade é justificada pela presença de flavonóides e, especialmente, ácidos fenólicos que foram detectados experimentalmente por bioautografia confirmando dados da literatura e por “screening” fitoquímico.

Palavras Chaves: Schinopsis brasiliensis, Caesalpinia pyramidalis, Atividade Antimicrobiana, Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes, Clone Epidêmico Brasileiro, Clone Pediátrico, Clone Esporádico, Bioautografia.

XXI

ABSTRACT

The increase of bacterial resistance to antibiotics is a threat to the health of the global population, expanding the recurrence of infectious diseases due to the emergence of multiresistant bacteria, which makes the antimicrobial treatment difficult and costly. An important example of these germs is the MRSA Staphylococcus aureus which in Brazil, and also in other parts of the world, are the microorganisms frequently isolated, in the majority of cases at hospital level, being also an important cause of infections in communities. The occurrence of multiresistant MRSA S. aureus susceptible only to vancomycin represent a serious problem to be resolved, moreover since the appearance of recent strains of S. aureus with intermediate susceptibility and resistant to vancomycin. This fact is of fundamental importance for the study of alternative compositions, particularly on the base of medicinal plants which represent an unexhausted source of new molecules. In the present work, two plants have been chosen to study their phytochemical and antimicrobial action of medical plants: Schinopsis brasiliensis Engl. (Baraúna or Braúna), Anacardiaceae, both families with representatives of well known biological activity, including an antimicrobial one. In this sense has been studied the activity of dry extracts (by hexanolic extraction, in ethyl acetate extraction and methanol extraction) of the leaf, the bark of the Stem, the bark of Roots, the flower, the bean (fruit) and seed of Braúna and Catingueira. Initially, in accordance with ATCC standards of negative Gram and positive Gram bacteria in which a better action against S. aureus was confirmed. In the second phase the tests were performed with 22 strains of S. aureus,18 multiresistant MRSA clinic isolates identified as Epidemic Clones, 2 MSSA S. aureus isolates and 2 ATCC strains. The results obtained from the plants in study, S. brasiliensis presented better activity against the strains of MRSA S. aureus including the more resistant epidemic clones. The dry metanolic extracts were more active with CMI data for the flower and root of Braúna of 125 µg.mL-1 inasmuch as inhibition zones in the order of 20 mm obtained by the techniques of wells were found regarding one of the strains of multiresistant Methicillin-Resistant S. aureus (BEC). The dry extracts obtained by ethyl acetate demonstrate less action, which can be attributed to a diminished diffusion in the agar. In the tests, the antibiotics used as a standard were tetracycline and oxacilin in the determination of MIC and tetracycline in the techniques of wells, which confirmed attribution to oxacilin the MRSA or MSSA character regarding the strains and to tetracycline its resistant profile. The two dilutants used, DMSO of 50% and Tween 80 to 40%, did not present any inhibition. As a conclusion, it may be considered that the plants under study and particularly S. brasiliensis presented a promising activity towards the MRSA S. aureusstrains including the multiresistant clones. It has been considered that in part this action is justified by the presence of the flavonoids and especially phenolics acids which were experimentally detected by bioautography which confirmed data of literature and by phytochemical screening.

Key Words: Schinopsis brasiliensis, Caesalpinia pyramidalis, Antimicrobial activity, Multiresistant Staphylococcus aureus MRSA, Brazilian Epidemic Clone, Pediatric Clone, Sporadic Clone, Bioautography.

1. Introdução

Saraiva, A. M.; Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. eSchinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

24

1. INTRODUÇÃO

Na área farmacêutica, os extrativos vegetais continuam sendo uma rica fonte de novas

moléculas que podem ser utilizadas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e

como fonte de matérias-primas farmacêuticas, tanto para a obtenção de fármacos (princípios

ativos), como para a obtenção de adjuvantes (SIMÕES; SCHENKEL, 2002;

VORAVUTHIKUNCHAI; KITPPIPIT, 2005).

Na indústria farmacêutica, as plantas têm também contribuído significativamente, seja

pelo uso de matérias-primas para o preparo de chás ou através do isolamento de várias

substâncias bioativas, cuja complexidade de muitas estruturas químicas inviabilizaria técnica

e economicamente sua síntese orgânica (TROVÃO et al, 2004). O desenvolvimento de

fármacos derivados de fontes naturais tem centrado esforços em novas categorias de

anticancerígenos, agentes antimicrobianos e antivirais. Estes fármacos representam

respectivamente 51 %, 78% e 70% de todos os fármacos aprovados pelo FDA (Food and

Drug Administration) e outros Órgãos similares no período de 1983-94. Assim, dos 520

novos fármacos aprovados pelo FDA neste período, 30 vieram diretamente de fontes naturais,

120 são semi-sintéticos derivados destas e 46 são sintéticos obtidos a partir de um protótipo

natural. O compreendido restante, produto de origem essencialmente sintético (BAHIA,

2002).

O emprego das plantas medicinais, especialmente na América do Sul e outros países

em desenvolvimento, contribui, significativamente, para os cuidados básicos da saúde

(HOLETZ, 2002). Atualmente, a medicina tradicional é aceita como uma forma alternativa no

cuidado da saúde, sendo reconhecida a sua importância pela própria OMS (AKERELE, 1992).

O Brasil é o país com maior potencial para pesquisas com espécies vegetais, pois

detém a maior e mais rica biodiversidade do planeta, distribuída em seis biomas distintos

(NOLDIN et al, 2006). Sendo que ainda hoje se tem pouco conhecimento desta amplitude

biológica (TROVÃO et al, 2004.).

Entre os ecossistemas ricos em variedades vegetais, destaca-se a floresta amazônica, a

mata atlântica, o cerrado e a caatinga. Estima-se, assim, que existam cerca de 55.000 espécies

floridas, ou seja, cerca de 50% das espécies tropicais (BAHIA, 2002).

O Nordeste Brasileiro, onde está localizada a maior parte da região semi-árida do país,

é coberto por uma vegetação denominada caatinga (TROVÃO et al, 2004), do tupi-guarami:

“floresta branca” (LEAL et al, 2003), com plantas fisiologicamente adaptadas às condições de

deficiência hídrica. A caatinga, como outras vegetações, também passa por um extenso

processo de devastação ambiental, provocado pelo uso indiscriminado dos seus recursos


25

naturais, sendo ainda mais grave por ser um ecossistema, considerado menos valorizado, uma

vez que, até anos recentes era taxado pobre em biodiversidade (TROVÃO et al, 2004).

Desta forma, só na ultima década passou-se a estudá-lo mais detalhadamente e até hoje

pouco se conhece das suas potencialidades, existindo espécies nesta área que sequer foram

descritas e pouco ou quase não se sabe dos seus aspectos fisiológicos (MANSUR;

BARBOSA, 2000).

Assim, no semi-árido brasileiro, região que ocupa 11,5% do território nacional,

estima-se haver oito mil espécies vegetais sendo que destas 318 espécies pertencentes a 42

famílias botânicas são endêmicas da caatinga. Diante desta vasta biodiversidade e da

necessidade da descoberta de novas moléculas bioativas, resulta de fundamental importância,

o estudo farmacológico da flora dessa região (NOVAIS et al, 2003).

1.1 – As plantas como “antibióticos naturais”

O problema da resistência microbiana torna-se cada vez mais preocupante

comprometendo-se o futuro de novas drogas antimicrobianas. Por isso, ações devem ser

dirigidas buscando minimizar esse problema, tais como um maior controle no uso de

antibióticos; contínuas pesquisas para melhor entender os mecanismos genéticos de

resistência, e por ultimo ampliar os estudos para obtenção de novas drogas naturais, semi-

sintéticas ou sintéticas. Deve-se ainda considerar o problema da baixa imunidade por parte

dos pacientes e o surgimento de cepas bacterians multirresistentes que acarretam infecções

com alta mortalidade, principalemente, em hospitais (NASCIMENTO et al, 2000;

STAPLETON et al, 2004).

Há uma considerável necessidade por novas classes de agentes antimicrobianos para

contra-atacar o rápido aumento da transmissão das multi-drogas resistência (mdr), através de

compartilhamento genético de bactérias patogênicas, ou não, ao homem, podendo ocorrer

entre bactérias da mesma família ou de famílias diferentes. Em particular, a ocorrência e

proliferação de mdr em Staphylcoccus aureus meticilina resistente (MRSA) é uma das

maiores causas de interesse, no âmbito clínico, justificado diretamente pelo baixo efeito dos

agentes terapêuticos que podem ser usados frente a estes organismos (GIBBONS et al, 2002).

Historicamente, o uso dos extratos das plantas medicinais e aromáticas como

antiséptico é reconhecido desde antiguidade, enquanto que desde o início do século XX, os

pesquisadores tentam caracterizar esta propriedade no laboratório (DORMAN; DEANS,

2000).


26

Muitas das propriedades terapêuticas das plantas são relatadas pela população, sendo

confirmadas em sua maioria nos estudos científicos. Tais propriedades proporcionam o

desenvolvimento de vários fármacos, sejam estes obtidos por síntese a partir de molécula

protótipo ou através do isolamento.

Devido a todos estes aspectos, vê-se um interesse crescente na utilização e pesquisa de

plantas medicinais, para fins terapêuticos, aliadas ainda a boa aceitabilidade destes produtos

no mercado farmacêutico e as altas cifras que circundam a comercialização de

fitomedicamentos, desde a ultima década (SIMÕES; SCHENKEL, 2002).

Os metabólitos secundários biossintetizados e estocados nos vegetais tem uma

importante função em sua defesa contra os predadores em geral (herbívoros e

microorganismos), proteção contra raios UV, atração por polinizadores ou animais

dispersores de sementes (SIMÕES et al, 2004). Dentre estes metabólitos, temos as

fitoalexinas, que agem em defesa da planta contra o ataque dos vários parasitas, entre eles, os

microorganismos. Desta forma as fitoalexinas geralmente apresentam atividade antibacteriana

e antifúngica, sendo freqüentemente usadas na profilaxia e na cura de doenças causadas por

microorganismos (SAKAGAMI et al, 1998).

Os componentes bioativos oriundos de plantas são correntemente investigados como

intermediários para o desenvolvimento de quimioterápicos que podem ser aplicados no

tratamento das infecções, algumas das quais causadas por microorganismos que rapidamente

desenvolvem mecanismo de resistência aos antibióticos usuais (HIMEJINA; KUBO, 1991 e

KUBO et al, 1992).

Quanto aos componentes, com potencial ação antibiótica, destacam-se os resultados

obtidos com óleos essenciais ricos em mono e sesquiterpenos, alcalóides, ácidos fenólicos,

flavonóides, taninos, cumarinas, triterpenos, entre outros que apresentam atividade

antimicrobiana frente a bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, Mycobacterium,

leveduras e fungos filamentosos (NEPOMUCENO et al, 2003 e CECHINEL FILHO;

YOUNES, 1998). Justificando a pesquisa de novos constituintes como elemento essencial

para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos (BONJAR, 2004).

As pesquisas dirigidas à obtenção de novas drogas com atividade antimicrobiana

ocorrem em diversas partes do mundo, sendo que boa parte destas, se referem a ativos

oriundos de vegetais. Assim resulta, importante principalmente no Brasil, com a grande

diversidade de sua flora, fazer um “screening” das espécies vegetais, principalmente aquelas

de uso popular, evidenciando por testes laboratoriais a atividade em primeiro termino dos

extratos brutos e prosseguindo com um estudo fitoquímico para avaliar as propriedades das


27

diferentes frações obtidas. No tratamento de infecções comuns, muitas plantas são utilizadas

no Brasil sob forma de extrato bruto, infusões ou emplastos, porém sem nenhuma evidência

científica da sua eficácia (PESSINI et al, 2003).

Ainda interessa a ação dos extratos das plantas, por um efeito de interação sinérgica

aos antibióticos de uso terapêutico. O sinergismo é determinado experimentalmente mediante

uma curva de morte e as técnicas utilizadas, envolvem o uso de várias concentrações das duas

drogas (antibiótico e substância isolada) e observação, usando um critério pré-estabelecido,

para verificar a potencialização da inibição do crescimento microbiano, em comparação aos

compostos isolados, (sinergismo) ou redução deste (antagonismo) (WANG et al, 2003;

STERMITZ et al, 2000).

1.2 - Staphylococcus aureus

As bactérias Gram positivas são as maiores causadoras de infecções adquiridas tanto

na comunidade quanto hospitalares. A resistência aos agentes antimicrobianos é prevalente

entre as muitas destas bactérias, em numerosos países do globo (PALOMBO; SEMPLE,

2002). Dentre as bactérias Gram positivas, destaca-se o gênero Staphylococcus, sendo os S.

aureus seu principal representante, justificado pela importância clínica, devido à prevalência e

resistência destas cepas aos antimicrobianos utilizados na terapêutica das infecções que

afetam os homens.

Os Staphylococcus aureus são cocos dispostos em forma de “cachos de uva”,

produtores de pigmentos amarelo-dourado, caracterizando-se por ser coagulase, Dnase e

catalase positivos. Estes microorganismos são patógenos humanos e de outros mamíferos, e

integram a flora da pele (comensais), embora como patógenos oportunistas possam causar

infecções. O S. aureus é um patógeno que pode ser encontrado na flora de 30 a 70% da

população (LINDSAY; HOLDEN, 2004), colonizando a pele úmida em diferentes regiões

(narinas, axilas, períneo e intestino) de pessoas saudáveis onde podem permanecer

colonizando por longos períodos sem causar nenhuma patologia infecciosa, porém em

determinadas circunstâncias e conjuntamente a seus fatores de virulência exibem sua

patogenicidade, podendo invadir o organismo do indivíduo provocando infecções

freqüentemente agudas e piogênicas. Assim, entre as infecções da pele provocadas por este,

destaque-se pela freqüência: o furúnculo, a celulite, o impetigo, bem como infecções

cirúrgicas, pós-operatórias (CORBELLA et al, 1997).


28

O genoma estafilocócico consiste do cromossomo circular (de aproximadamente 2800

bp), com profagos, plasmídeos e transposons. Os genes que determinam a virulência e

resistência aos antibióticos são encontrados no cromossomo e também nos elementos extra-

cromossomais, que podem ser transferidos entre cepas da mesma espécie, ou entre outras

espécies de Gram-positivas através dos elementos extra-cromossomais (LOWY, 1998).

Staphylococcus aureus produz duas toxemias graves: a síndrome da pele escaldada,

pela a ação de toxinas esfoliativas e a síndrome do choque-tóxico – TSST, além de ser

responsável por intoxicações alimentares, cuja origem está relacionada à produção de

superantígenos, as enterotoxinas (CORDEIRO, 2004).

Ainda, S. aureus apresenta uma variedade relativamente grande de proteínas

extracelulares e polissacarídeos, alguns dos quais correlacionados com sua virulência.

Resultando em efeitos combinados de muitos fatores expressos no curso da infecção

(PEREIRA, 2002), que juntamente com seu amplo arsenal genético, lhes dão a possibilidade

de adaptar-se as variações bruscas, como ficou demonstrado com a emergência das infecções

por cepas de MRSA multirresistentes, desde os anos 90 (JONGE et al, 1994).

A importância das infecções nosocomiais produzidas por S. aureus, principalmente S.

aureus Meticilina Resistente (MRSA), é bem reconhecida pela sua freqüência, morbidade,

mortalidade e principalmente pela dificuldade de tratamento. Recentemente tem emergido, a

nível comunitário, o S. aureus meticilina resistente de origem comunitário, que se denomina

CA – MRSA (Sigla em inglês) ou CA-SAMR (sigla em português e espanhol). Este agente

microbiano é um patógeno emergente e suas infecções são consideradas como enfermidades

emergentes. Estas enfermidades são aquelas que têm surgido recentemente na população ou já

existentes com pequenos casos, mas aumentaram rapidamente em incidência e/ou em

extensão geográfica (NASCIMENTO et al, 2000).

Historicamente, a emergência de cepas de S. aureus com altos níveis de resistência a

penicilina foi seguido pelo desenvolvimento e aumento da resistência as penicilinas semi-

sintéticas (meticilina, oxacilina, nafcilina), aos macrolídeos, as tetraciclinas, as

aminoglicosídeos determinando que a terapêutica das infecções estafilocóccicas constituam

um desafio global (SADERI et al, 2005).

No Brasil, os S. aureus são os microorganismos mais freqüentemente isolados e sua

prevalência ocorre em maior proporção a nível hospitalar, acima de 80% e cerca de 70% dos

isolados comunitários apresentam resistência as penicilinas naturais, e por extensão, à

ampicilina e amoxicilina (TAVARES et al, 2000). Nos resultados obtidos dos isolados

oriundos das infecções hospitalares, a prevalência do isolamento de cepas MRSA varia de 40


29

a 80% nos hospitais brasileiros. Estes isolados são geralmente resistentes a múltiplos

antibióticos (aminoglicosídeos, cloranfenicol, tetraciclina, lincosamidas, macrolídeos,

quinolonas, sulfametoxazol/trimetoprima), com grande susceptibilidade a rifampicina.

De outra parte, estudos realizados no Brasil descreveram um clone de S. aureus

MRSA multirresistente (Clone Epidêmico Brasileiro – BEC) em hospitais do Sul, Sudeste,

Norte e Nordeste do país (TEIXEIRA et al, 1996 e FIGUEIREDO et al, 1991), clone que se

expandiu para outros países da América Latina (Argentina, Chile, Uruguai) e também a

Europa (Portugal, Itália e República Tcheca) (OLIVEIRA et al, 2001 e SOLA et al, 2002).

A resistência destas bactérias aos antimicrobianos é ainda de grande interesse

econômico, cujo impacto eleva os custos com a saúde pública e privada, visto o maior tempo

de internação, o uso de drogas mais potentes e caras (PALOMBO; SEMPLE, 2002) além de

causar maior sofrimento ao doente e seus familiares.

O estudo sobre conhecimento dos mecanismos de resistência dos S. aureus MRSA

multirresistentes, tanto aos antibióticos, de uso clínico, quanto aos germicidas, aplicados na

limpeza e descontaminação do ambiente hospitalar, está sendo realizado em vários países. São

estudos que visa ao entendimento do processo pelo qual o S. aureus penetra e sobrevive no

ambiente hospitalar, fato fundamental para o implemento de ações de controle das infecções.

De início, foi elucidado o sequenciamento do genoma, mapeando as de bases do DNA

bacteriano das várias cepas de S. aureus multirresistente de origem hospitalar e comunitária

(cepas N315, Mu50, MW2, MRSA252, MSSA476, COL e NCTC8325), subseqüentemente

estão sendo estudados os genes que são responsáveis pelos fatores de virulência e resistência

que determina a patogenicidade das infecções estafilococcicas. De qualquer forma ainda não

foram identificados os genes ou combinações de genes necessários para provocar a infecção,

ou quais destes seriam alvos de novas terapias. Sendo assim, foi de fundamental importância

o trabalho realizado pelos cientistas em sequenciar o genoma bacteriano (LINDSAY;

HOLDEN, 2004) e também toda descoberta de novos agentes antibacterianos com

mecanismos de ação diferentes daqueles presentemente existentes (BREITHANPT et al,

1999).

2.Revisão Bibliográfica


31

2. – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 - Caesalpinia pyramidalis Tull. – Caesalpinaceae

A Caesalpinia pyramidalis é uma Leguminosae (Fabaceae), subfamília

Caesalpinioideae e gênero Caesalpinia L. distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais

(BARROSO, 1991 e MELO-PINNA et al, 1999), árvore endêmica do sertão nordestino que

habita em lugares pedregosos (SILVA et al, 1998), conhecida popularmente como:

“catingueira” “pau-de-porco”, “catinga de porco”, (BRAGA, 1960), “pau-de-rato”,

“mussitaiba” e “catingueira-das-folhas-largas” (UMBUZEIRO (b), 2005). Dentre o gênero

Caesalpinia, a espécie mais conhecida é a Caesalpinia echinata “pau-brasil”, cuja madeira

teve grande importância no início da colonização do Brasil (BAHIA, 2002).

2.1.1 – Botânica

A catingueira é uma arvore que atinge até 4 metros de altura (Figura 1) com folhas

bipinadas, 5-11 folíolos, sésseis, alternos, obtusos e oblongos. As flores são amarelas,

dispostas em racemos pouco maiores ou tão longos quanto às folhas e sua vagem é achatada

de cor escura (BRAGA, 1960) (Figura 2). A Catingueira é uma das plantas sertanejas cujos

gomos brotam às primeiras manifestações de umidade, pelo qual é dita como anunciadora de

períodos chuvosos (SILVA et al, 1998).

Figura 1. Hábito de Caesalpinia pyramidalis Tull.


32

Figura 2. Folhas, Flores e Fruto de Caesalpinia pyramidalis.

2.1.2 – Uso Popular

Referentes ao uso, a madeira é recomendada para lenha, carvão e estaca (SILVA et al,

1998), enquanto que as folhas fendadas constituem boa forragem (BRAGA, 1960), sendo

considerado como excelente alimento animal, por conter alto valor protéico e menor de fibras

(ZANINE et al, 2005).

Na medicina popular as flores, folhas e cascas são usadas no tratamento das infecções

catarrais, nas diarréias e disenterias (BRAGA, 1960), ainda apresenta ação antipirética e como

diurética (MENDES et al, 2000).

2.2.3 – Estudos Fitoquímicos

No levantamento bibliográfico da espécie foi assinalado o isolamento de vários

metabólitos secundários, destacando-se polifenois e terpenóides (Quadro 1) mostra as

principais substâncias isoladas e caracterizadas.


33

Quadro 1. Levantamento bibliográfico dos isolados de Caesalpinia pyramidalis Tull.

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS PARTE DA PLANTA REFERÊNCIA

O O

OH

CO2H

H

HOOH

HO

OH

ÁCIDO 4-O-β−β−β−β−D-GLICOPIRANOSILOXI-(Z)-7-HIDROXICINÂMICO

O O

H

CO2H

HO

HOOH

HO

OH

ÁCIDO 4-O-β−β−β−β−D-GLICOPIRANOSILOXI-(Z)-8-HIDROXICINÂMICO

Folha Mendes et al (2000)


34

OOMe

OH

OH

4,4'-DIHIDROXI-2-METOXICHALCONA

OOH

OH

OOH

OH

OH

OH O

O

CAESALFLAVONA (Biflavonóide)

O

OOH

OH

OH O

OOH

OHH

H

OH

AGASTIFLAVONA

O

OOH

OH

OHOCH3

OH O

OOHPODOCAPUSFLAVONA

Folha Bahia (2005)


35

HO

OH

OH

CO2CH3

GALATO DE METILA

O

OOH

OH

OH

R

R = OH (KAEMPFEROL)R = H (APIGENINA)

OCH3

HO

CH3OO

O

HH

OCH3

OH

OCH3

SIRINGARESINOL

ESTIGMASTEROL

HO

β−β−β−β−SITOSTEROL

HH

H

HO

OH

HO

LUPEOL

Folha Bahia (2002)


36

2.2.4 – Atividade Antimicrobiana

Estudos realizados com extratos em acetato de etila, das folhas e caule de C.

pyramidalis frente a cepas de S. aureus e E. coli pelo o método de difusão em disco, obtendo

halos da ordem de 10 mm apenas para a cepa de S. aureus (NOVAIS et al, 2003).

Assim mesmo, no Instituto de Antibiótico - UFPE num “screening” de plantas

superiores, a C. pyramidalis foi estudada frente as sete cepas seguintes: S. aureus, B. subtilis,

M. smegmatis, E. coli, E. faecalis, C. albicans e N. crassa, verificando-se atividade somente

sobre as três primeiras (CHIAPPETA; MELLO, 1984/5).

2.2 - Schinopsis brasiliensis Engl. – Anacardiaceae

A Schinopsis brasiliensis Engl. da família Anacardiaceae, é o principal representante,

do gênero Schinopsis, nativo do Brasil. Dentre as anacardiáceas, nativos brasileiros,

destacam-se as espécies de Anacardium (cajueiros), Schinus (aroeira), árvores de madeira

dura que produzem alergia em indivíduos susceptíveis. Muitas anacardiáceas produzem

taninos, utilizados na indústria de curtumes (Schinus, Schinopsis e Rhus) (JOLY, 2002). A S.

brasiliensis é uma espécie característica das caatingas e de grande valor econômico para a

região nordestina. Sua distribuição, embora com poucos indivíduos, se dá por toda a região da

caatinga, deste a Bahia até Paraíba (PRADO et al, 1995). É uma árvore endêmica brasileira,

popularmente conhecida por “braúna”, “baraúna” (CARDOSO, 2005), “braúna-do-sertão” e

“braúna-parda” (UMBUZEIRO (a), 2005), “quebracho”, “chamacoco”, “chamucoco”

(INSTITUTO PLANTARUM), dentre as árvores de valor econômico, a unidade de dispersão

da espécie S. brasiliensis, apresenta dificuldade quanto ao processo de germinação (PRADO

et al, 1995), sendo que este fato juntamente ao uso abusivo de sua madeira, contribuiu para

que a braúna fosse considerada pelo “First Report National for the Convention on Biological

Diversity (CBD)” como uma espécie ameaçada de extinção (CARDOSO, 2001).

A maioria dos estudos sobre a Braúna deve-se ao caráter alergênico evidenciado por

intensa dermatite de contato em indivíduos sensíveis. Este caráter alergênico se deveria à

presença de alquil e alquenil fenois, presente em muitas das espécies da família e que foram

encontrados nesta espécie por CARDOSO et al (2005). Ainda são citadas atividades

citotóxica e antimicrobiana (CARDOSO, 2001).


37

2.2.1 – Botânica

A Schinopsis brasiliensis Engl. (Figura 3) é uma árvore de copa arredondada e densa,

altura de 8-12 m na caatinga do Nordeste e de 12-22 m no pantanal mato-grossense, de ramos

providos de espinhos rígidos de até 3-5 cm de comprimento, de tronco mais ou menos

cilíndrico de 40-70 cm de diâmetro, com casca áspera de cor cinza-escura (INSTITUTO

PLANTARUM, 2006), folhas arguloso-pecioladas, subcoriáceas, verde-escura na face

superior e pálida na inferior, compostas, 10 multijugas; folíolos oblongos, obtusos no ápice,

emarginados, oblíquo-agudos na base. As flores em panículas (Figura 4), enquanto que a

drupa tem 3 cm de comprimento e de cor castanho-clara (BRAGA, 1960). Os frutos são

vagens (Figura 5) de natureza lenhosa, grossa e em forma de foice, arredondadas, cobertas por

pêlos finos (GONZAGA et al, 2003) de 2,5-3,5 cm de comprimento, contendo uma única

semente (INSTITUTO PLANTARUM, 2006).

Figura 3. Hábito de Schinopsis brasiliensis Engl.


38

Figura 4. Folhas e Flores de S. brasiliensis.

Figura 5. Fruto de S. brasiliensis.


39

2.2.2 – Uso Popular

A Baraúna fornece madeira de excelente qualidade, pelo seu cerne muito duro,

vermelho-castanho, de enorme resistência aos decompositores (PRADO et al, 1995), sendo

ideal para o fabrico de móveis, na construção civil (GONZAGA et al, 2003), produção de

postes, vigas e dormentes.

Na medicina popular a baraúna é usada como anti-histérica e nevrostênica (BRAGA,

1960), também no tratamento das verminoses de animais (CARDOSO, 2001) e antiséptico da

pele.

2.2.3 – Estudo Fitoquímico

No levantamento bibliográfico a cerca das propriedades fitoquímicas da espécie foi

assinalado o isolamento de vários metabólitos secundário, destacando-se os terpenóides,

lignanas e polifenois, como as principais substâncias isoladas e caracterizadas (Quadro 2).

Quadro 2. Levantamento bibliográfico dos isolados de Schinopsis brasiliensis Engl.

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS PARTE DA PLANTA REFERÊNCIA

C

(CH2)19 CH3

O

O

O CH3

H3C

6-EICOSANIL-2-HIDROXI-4-METOXIBENZOATO DE METILA

ALQUIL FENOL

β−β−β−β−SITOSTEROL

HH

H

HO

Caule Cardoso et al (2005)


40

5α, 8α −α, 8α −α, 8α −α, 8α −EPIDIOXIERGOSTA-6,22-DIEN-3-ββββ-OL

O O

HO

O

H

CICLOARTENONA

24-METILENO-CICLOARTENONA

O

H

O

H

H

H

ESTIGMAST-4-EN-3-ONA

ESTIGMAST-4-EN-3-ONA-6 ββββ-OL

H

O

OH

H

H

Caule Cardoso (2001)

HO

OH

OH

CO2CH3

GALATO DE METILA



41

CHO

OCH3

OH

VANILINA

OH

CH3

H3C

HO

CO2CH3

2,4-DIHIDROXI-3,6-DIMETIL-BENZOATO DE METILA

O

CO2CH3

CH3

OH

O

OH

Cl

CH3

Cl

CH3O2C

H3C

3,5-DICLORO-6-(6-HIDROXI-4-METOXI-3-METOXICARBONIL -2-METIL-FENOXI)-2-HICROXI-4-METIL

OCH3

HO

CH3OO

O

HH

OCH3

OH

OCH3

SIRINGARESINOL


2.2.4 - Atividade Antimicrobiana

Foram realizados estudos prévios de “screening” de várias plantas superiores, dentre

estas, a braúna, os estudos aconteceu no Departamento de Antibióticos da UFPE, por

(CHIAPPETTA et al, 1982/3), que evidenciou atividade da Schinopsis brasiliensis sobre

cepas de S. aureus e M. smegmatis.


42

2.3 - Staphylococcus aureus - MRSA Multirresistentes

As doenças infecciosas são as principais causas de mortes prematuras no mundo,

matando milhares pessoas por dia (AQIL et al, 2005). Assim, das 57 milhões de mortes anual

em todo o mundo, estima-se que 15 milhões (mais de 25%) destas aconteçam devido às

doenças infecciosas (MORENS et al, 2004).

O crescimento da resistência bacteriana aos antibióticos é uma ameaça a população

mundial, aumentando as recorrências por doenças infecciosas, devido ao surgimento de

bactérias multirresistentes que dificulta o tratamento quimioterápico (AQIL et al, 2005). A

resistência dos S. aureus aos antibióticos tem bases genéticas, porem outros fatores favorecem

também sua emergência, como o uso abusivo dos antimicrobianos seja pela administração

indiscriminada como pela automedicação (WITTE et al, 1997).

Os S. aureus tem sido reconhecido ao longo dos tempos como um dos maiores

patógenos humanos responsáveis por grande parte das infecções ocorridas ao homem. Há

indicação que esta bactéria patogênica afeta aos humanos desde a pré-história. Anteriormente,

a era dos antibióticos, os S. aureus foram à razão de alta mortalidade em hospitais da cidade

de Boston.

A versatilidade estratégica deste microorganismo, os números de fatores de virulência,

a capacidade de sobreviver e multiplicar-se em diversos ambientes, tornou o S. aureus um

grave problema para a saúde pública. Assim, sua capacidade de adaptar-se foi repetidamente

mostrada pela emergência das cepas de S. aureus que adquiriram um mecanismo de

resistência virtualmente a todos os agentes antimicrobianos brevemente depois da introdução

destas drogas na terapêutica clínica (OLIVEIRA et al, 2002).

As cepas de S. aureus MRSA multirresistentes, representam um grande problema no

controle das infecções adquiridas no hospital. Algumas destas cepas mostram a capacidade de

propagarem-se desde a introdução no hospital. Diferentes estirpes de MRSA identificadas

pelo seu fenótipo têm-se propagado de uma região a outra nos hospitais britânicos. Estudos

multi-cêntricos conduzidos pela Paul Ehrlich Society for Chemotherapy, têm mostrado que a

freqüência de MRSA entre as infecções por S. aureus adquiridas nos hospitais da Alemanha

aumentou de 1,7% para 8,7% entre 1990 e 1995 (WITTE; EDMOND, 1997).

De 1980 a 1990, Montelli e Levy documentaram uma alta incidência de resistência

entre microorganismos, em microbiologia clínica no Brasil (NASCIMENTO et al, 2000) e em

particular, por S. aureus MRSA, levando ao conhecimento do clone de S. aureus (MRSA)

multirresistente (Clone Epidêmico Brasileiro) que foi isolado e identificado primeiramente em

hospitais do Sul, Sudeste, Norte e Nordeste (TEIXEIRA et al, 1996 e FIGUEIREDO et al,


43

1991), sendo que hoje está presente em todas as regiões do Brasil e em vários países da

América Latina e Europa (OLIVEIRA et al, 2001 e SOLA et al, 2002).

Algumas destas formas resistentes (MRSA) são susceptíveis a um único tipo de

antibiótico clinicamente disponível, da família dos glicopeptídeos (vancomicina e

teicoplamina) (SMITH et al, 1999) o que limita as opções de tratamento (DIEP et al, 2006).

Os Glicopeptídeos tem sido usados com bons resultados no tratamento das infecções

por MRSA multirresistentes, só sensível a vancomicina, porém, com o relato de isolados de S.

aureus com sensibilidade reduzida a vancomicina no Japão (HIRAMATSU(a) et al, 1997) e

posteriormente nos Estados Unidos, França entre outros países (CDC, 2002) incluído também

o Brasil (OLIVEIRA et al, 2001).

A incidência de infecções por MRSA tem aumentado grandemente nos últimos 5 anos

em todo mundo, por causa da emergência comunitária da cepas de S. aureus MRSA (DIEP et

al, 2006)

A aplicação das técnicas moleculares tem permitido a identificação de vários clones de

Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA), os quais foram responsáveis por vários

surtos de infecções hospitalares em vários países (TEIXEIRA et al, 1995). Os MRSA estão

sendo analisados quanto a tipagem cromossomal. Isto tem mostrado a predominância de

alguns clones de MRSA epidêmicos que podem se disseminar rapidamente, podendo ser

encontrados locados em hospitais da mesma área ou separados por grandes distâncias

(COIMBRA et al, 2000).

2.3.1 – Histórico de Resistência

O problema de resistência bacteriana aos quimioterápicos surgiu, na prática médica,

com o uso de sulfonamidas, empregadas pela primeira vez em 1935, logo essas drogas

começaram a perder a sua eficácia terapêutica, com o aparecimento de cepas resistentes entre

os gonococos e estreptococos (FREITAS et al, 1989).

A era dos antibióticos, tem apenas 60 anos de idade, está atualmente ameaçada por

uma seleção de organismos resistentes a essas drogas. Com a introdução da penicilina em

1940, virtualmente todos os S. aureus foram susceptíveis (HUBERT et al, 1999), traduzindo-

se numa verdadeira revolução na terapêutica para a cura de doenças estafilocóccicas outrora

intratáveis (OLIVEIRA et al, 2002). Em apenas cinco anos, 50% das culturas destes

organismos tiveram habilidade para resistir ao antibiótico por causa da penicilinase, uma

enzima capaz de clivar o anel β-lactâmico que foi concebida por aquisição de plasmídeo


44

(HUBERT et al, 1999), sendo que por volta 1950 os números de S. aureus isolados,

apresentavam altos níveis de resistência à penicilina, tornando-se inapto uso o deste, como

agente terapêutico frente a infecções estafilocóccicas.

A introdução dos antibióticos na prática clínica, teve início com a penicilina seguido

da streptomicina em 1948, tetraciclina em 1950 e eritromicina em 1953. Cepas resistentes a

esses antibióticos foram já relatadas em 1957.

Em 1960 com a disponibilidade de meticilina, originalmente chamada de celbinine,

semi-sintético derivado quimicamente da penicilina, foi o primeiro agente antimicrobiano

baseado no mecanismo: resistir à ação degradatória das penicilinases (OLIVEIRA et al,

2002). Esta droga abriu um novo capítulo na antibiótico-terapia,: todos os S. aureus, incluindo

as cepas penicilina-resistentes, foram susceptíveis a nova droga. Infortunadamente, dentre um

ano, organismos resistentes a meticilina foram isolados na Europa, e, em 1970, infecções

causadas por MRSA foram reportadas em muitos hospitais europeus.

Na década de 80 cepas de MRSA foram aumentando as notificações como patógenos

hospitalares nos EUA. O organismo versátil que adquiriu o gene (mec) responsável pela

alteração na proteína fixadora de penicilina (PBP) para a PBP2A ou PBP2’, permitiu que o

organismo crescesse na presença não somente de meticilina, como também de todos

antibióticos β-lactâmicos (HUBERT et al, 1999).

A emergência e disseminação de MRSA tem sido uma causa de acelerada evolução, na

qual, estas bactérias são propelidas por uma pressão seletiva de vasta quantidade de agentes

antimicrobianos em todo o ambiente (OLIVEIRA et al, 2002). A evolução inicial deste

processo está na aquisição de determinantes genéticos central dos MRSA, o gene mecA, um

pedaço de DNA que não é nativo para a espécie de S. aureus e que é chamado “elemento mec

ou fita cromossômica estafilococcica” (Staphylococcal Chromossomal Cassete, SCCmec)

(WATSON, 2003) que juntos com o mecA é incorporado entre o cromossomo de S. aureus em

uma locação sítio específico, que modifica a “penicilina-binding protein” (PBP) para a

PBP2A que tem baixa afinidade por antibióticos β-lactâmicos (OLIVEIRA et al, 2002 e

MONNO et al, 2003)

Com a expansão na ocorrência de MRSA, na década de 80, a terapêutica empírica para

infecções estafilocóccicas, particularmente em sepsis nosocomiais foram mudados para

vancomicina em muitos dos institutos de cuidado de saúde (SADERI et al, 2005). A

vancomicina, uma droga que foi produzida em 1958, tinha aumentado a sua importância no

tratamento das infecções por MRSA.


45

Em 1996 foi publicado o primeiro caso de S. aureus com sensibilidade intermediária a

vancomicina (MIC, 8 mg/L) no Japão (HIRAMATSU(b) et al, 1997) e subseqüente em New

Jersey, Michigan, Nova York, Reino Unido, França, Coréia, África do Sul, Brasil e Escócia

(HIRAMATSU, 2001). Mais recentemente, a transmissão de cepas S. aureus com hetero-

resistência entre hospitais do Japão foi reportado, sendo ≤ 20% das culturas resultante de

infecções nosocomiais por S. aureus MRSA, tiveram níveis intermediário de resistência à

vancomicina (HIRAMATSU (a) et al, 1997). A intermediária resistência de cepas de S.

aureus não tiveram identificado a presença dos genes vanA, vanB e vanC, responsáveis pela

resistência dos Enterococcus a vancomicina (WENZEL et al, 1998). O mecanismo de

resistência intermediária à vancomicina se deu por aumento na espessura da parede celular,

formada principalmente por peptídeoglicanos que funcionaram como armadilha, dificultando

a passagem da vancomicina pela parede celular, não chegando ao seu sítio de ação no

citoplasma, onde inibiria a produção dos monômeros de mureína (HIRAMATSU, 2001).

No ano de 2002, surge a primeira cepa de S. aureus resistentes a vancomicina (VRSA)

(CDC, 2002), com um mecanismo de resistência claramente distinto daqueles das cepas VISA

(NISHI et al, 2004).

3. Objetivos


47

3. OBJETIVOS

3.1. Geral

Contribuir para o estudo farmacognóstico e biológico de Caesalpinia pyramidalis e

Schinopsis brasiliensis frente às cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes.

3.2. Específicos

3.2.1. Identificação Botânica da Caesalpinia pyramidalis.

3.2.2. Identificação Botânica da Schinopsis brasiliensis.

3.2.3. Desenvolvimento de estudos farmacognósticos

3.2.3.1. Determinação da marcha analítica, para preparação dos extratos brutos

em solventes de polaridade crescente (hexano, acetato de etila e metanol).

3.2.3.2. Estudo dos extratos quanto ao rendimento, relativo à massa da planta

triturada.

3.2.3.3. Screening fitoquímico dos extratos Metanólicos das Plantas.

3.2.3.3.1. Identificação dos grupos funcionais (Taninos, Fenóis,

Terpenos, etc).

3.2.3.4.Técnica Bioautografia (para detectar atividade do grupamento ativo).

3.2.4. Screening de atividade antimicrobiana frente a representantes de bactérias

Gram negativos e Gram positivos

3.2.4.1.Técnica de poços/ difusão em Agar.

3.2.4.2.Determinação do CMI dos extratos e frações dos mais ativos.

3.2.5. Determinação da atividade antimicrobiana frente a cepas de S. aureus

MRSA Multirresistentes, MSSA e cepas padrões.

3.2.5.1.Técnica de poços/ difusão em Agar.

3.2.5.2.Determinação do CMI dos extratos e frações dos mais ativos.

4. Conclusão


49

4. CONCLUSÃO

As plantas estudadas foram confirmativamente identificadas como Caesalpinia

pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl.

A determinação da atividade antibacteriana de S. brasiliensis e C. pyramidalis frente

as cepas padrões (Escherichia coli, Klebisiella pneumonae, Salmonellaspp., Pseudomonas

aeruginosa, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus), para comprovar o que relatava a

literatura e também as cepas de Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes por

determinação das zonas de inibição pela técnica de poços difusão em agar e determinação do

CMI e bioautografias dos extratos mais ativos.

Quanto aos resultados dos valores das determinações das CMIs frente as cepas padrões

citadas anteriormente, os melhores valores de CMI frente a E. coli foi o extrato metanólico da

flor (250 µg.mL-1) e da folha (500 µg.mL-1) de C. pyramidalis. Para os resultados frente a P.

aeruginosa observou-se CMI da ordem de 125 µg.mL-1 para o extrato metanólico da folha de

C. pyramidalis e de 250 µg.mL-1 e 500 µg.mL-1 para os extratos metanólicos da flor e folha de

S. brasiliensis, respectivamente. Ainda o extrato metanólicos da folha de S. brasiliensis

obteve bons valores de CMI frente a Salmonella spp., E. faecalis e S. aureus, sendo que para

este último, os extratos que obtiveram os menlhores CMIs foram aqueles de extração em

acetato de etila de casca da raiz de C. pyramidalis e casca do caule de S. brasiliensis com

valores da ordem de 250 µg.mL-1.

Para os resultados das CMIs frente as cepas de S. aureus MRSA multirresistentes

(Clone Epidêmico Brasileiro – “CEB”, Clone Pediátrico – “CP”e Clone Esporádicos – “CE”)

e ainda S. aureus MSSA resistente a penicilina e outra classe de antibiótico. Os melhores CMI

frente as cepas de S. aureus MRSA Multirresistentes e MSSA foram os extratos BFLM,

CRM, BCA, CRA como valores de CMIs entre 250 e 500 µg.mL-1.

Pela bioautografia, visualisou-se várias zonas de inibição tanto para os extratos

metanólicos, que foram, na sua maioria, mais ativos, quanto aqueles em acetato de etila, o que

pode se supor, que estes poderiam ser mais ativos se não houvesse problemas de solubilidade

dos constituintes de menor polaridade, que causaria menor velocidade de difusão em meio

aquoso. Ainda, observou-se pelo o screening fitoquímico a presença de vários metabólitos

secundários relacionados com a atividade antimicrobiana, como: β-sitosterol, β-amirina, ácido

gálico, ácido elágico, quercetina, canferol, agliconas de flavonóides, proantocianidinas,

leucoantocianidinas, entre outros (Apêndice: Artigo III – Tabela 9, Artigo IV – Tabela 10).


50

É importante ressaltar, que os diluentes utilizados (DMSO à 50% e Tween 80 à 4%)

não ocasionaram nenhuma inibição frente a todas bactérias testadas.

Finalizando, as duas plantas ensaidas C. pyramidalis Tull. e Schinopsis brasilienis

Engl. apresentaram ótima atividade antimicrobiana, principalmente a folha, casca do caule,

casca da raiz e flor de Caesalpinia pyramidalis, sendo que a folha, pelos resultados

observados nas duas técnicas, é uma importante fonte, a ser investigada, de molécula ativa

frente a P. aeruginosa (CMI: 125 µg.mL-1) e casca da raiz e flor extratos metanólicos frente

as cepas de S. aureus multirresistente com CMI’s da ordem de 0,5 µg.mL-1 e flor extrato

metanólico mostrou os maiores halos, da ordem de 22 mm. Os extratos metanólicos de S.

brasiliensis da flor, casca do caule e raiz e folha apresentaram excelentes valores de CMI’s

para as diversas cepas de S. aureus multirresistentes. Em relação a folha de S. brasiliensis,

esta obteve halos expressivos frente as cepas de S. aureus Multirresistentes (CEB, CP e CE)

da ordem de 24 mm e bactérias padrões Gram positivas e Gram negativas da ordem de 22

mm.

Estas plantas representam uma opção para maiores estudos de seus compostos ativos,

no intuito de evidenciar a atividade antimicrobiana frente a outras bactérias, fungos e novos

testes biológicos, analisando seus constituíntes ativos isolados, frente ao mecanismo de ação e

toxicidade dos mesmos e também outras atividades farmacológicas.

5. Referência Bibliográfica


52

5. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

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6. Anexos


6. – ANEXOS

6.1. ANEXOS I - Determinação da atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis e Schinopsis brasiliensis frentes aos Clones Epidêmicos e Padrão.

Figura 1.

1 Tetraciclina 30µµµµg/Poço

2 CCM 10 mg/Poço

3 CCM 5 mg/Poço

4 CCA 10mg/Poço

5 CCA 5mg/Poço

6 Controle à DMSO 50%


2 CFLM 10 mg/Poço

3 CFLM 5 mg/Poço

4 CSM 10mg/Poço

5 CSM 5mg/Poço



Figura 2.

Figura 3.

Figura 4.


2 CFRM 10 mg/Poço

3 CFRM 5 mg/Poço

4 CFRA 10mg/Poço

5 CFRA 5mg/Poço



2 BCM 10 mg/Poço

3 BCM 5 mg/Poço

4 BCA 10mg/Poço

5 BCA 5mg/Poço



Figura 5.

Figura 6.


2 CFM 10 mg/Poço

3 CFM 5 mg/Poço

4 CFA 10mg/Poço

5 CFA 5mg/Poço



2 CFRM 10 mg/Poço

3 CFRM 5 mg/Poço

4 CFRA 10mg/Poço

5 CFRA 5mg/Poço

6 Controle à Tween 80 4%


Figura 7.

Figura 8.


2 CFRM 10 mg/Poço

3 CFRM 5 mg/Poço

4 CFRA 10mg/Poço

5 CFRA 5mg/Poço



2 BFM 10 mg/Poço

3 BFM 5 mg/Poço

4 BFA 10mg/Poço

5 BFA 5mg/Poço

6 Controle Tween 80 à 4%


Figura 9.

Figura 10.


2 BCM 10 mg/Poço

3 BCM 5 mg/Poço

4 BCA 10mg/Poço

5 BCA 5mg/Poço



2 BFM 10 mg/Poço

3 BFM 5 mg/Poço

4 BFA 10mg/Poço

5 BFA 5mg/Poço



Figura 11.

Figura 12.


2 BRM 10 mg/Poço

3 BRM 5 mg/Poço

4 BRA 10mg/Poço

5 BRA 5mg/Poço



2 CCM 10 mg/Poço

3 CCM 5 mg/Poço

4 CCA 10mg/Poço

5 CCA 5mg/Poço



Figura 13.


2 CFLM 10 mg/Poço

3 CFLM 5 mg/Poço

4 CSM 10mg/Poço

5 CSM 5mg/Poço



6.2. ANEXOS II - Bioautografias e CCD dos extratos de C. pyramidalis e S. brasiliensis frente a S. aureus ATCC 6538 (AM-103).

Figura 1.

Figura 2.


Figura 3. Figura 4.


6.3. ANEXO III - Screening dos extratos metanólicos deCaesalpinia pyramidalis e Schinopsis brasiliensis.

Figura 1.

Figura 2.

Placa de CCD, para a pesquisa Catequinas de Schinopsis brasiliensis(ver. Artigo I, Tabela 3)

Placa de CCD, para a pesquisa catequinas de Caesalpinia pyramidalis(ver. Artigo II, Tabela 3)


Figura 3.

Figura 4.

Placa de CCD, para a pesquisa Monoterpenos de Schinopsis brasiliensis(ver. Artigo I, Tabela 3)

Placa de CCD, para a pesquisa Monoterpenos – Caesalpinia pyramidalis(ver. Artigo II, Tabela 3)


Figura 5.

Figura 6.

Placa de CCD, para a pesquisa Polifenois – Schinopsis brasiliensis(ver. Artigo I, Tabela 3)

Placa de CCD, para a pesquisa Polifenois – Caesalpinia pyramidalis(ver. Artigo II, Tabela 3)


Figura 7.

Figura 8.

Placa de CCD, para a pesquisa acúcares redutores – Schinopsis brasiliensis (ver. Artigo I, Tabela 3)

Placa de CCD, para a pesquisa acúcares redutores – Caesalpinia pyramidalis (ver. Artigo II, Tabela 3)


Figura 9.

Figura 10.

Placa de CCD, para a pesquisa de polifenois (Flavonóides e ácidos fenólicos) de Schinopsis brasiliensis (ver. Artigo I, Tabela 3)

Placa de CCD, para a pesquisa de catequinas e Monoterpenos de Schinopsis brasiliensis(ver. Artigo I, Tabela 3)

Placa de CCD, para a pesquisa Triterpenos e Esteróides de Schinopsis brasiliensis e Caesalpinia pyramidalis (ver. Artigo I e II, Tabela 3)

Figura. 11


6.4. ANEXO IV. Determinação da aitividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis e

Schinopsis brasiliensis frente a 22 cepas de Staphylococcus aureus pela técnica de CMI /

difusão em agar (multiinoculador de Stears)(ver Artigo III e IV, tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9).

Figura 1.

Figura 2.

Placa de agar Muller Hinton acrescido de 2% NaCl + Antibiótico Oxacilina.

Na concentração de 128 µg/ml, cresceu 6 cepas de Staphylococcus aureus, destas 5 são Clone Epidêmico Brasileiro e 1 Clone Esporádico, com o CMI equivalente de 256 µg/ml (Artigo, III, Tabela 4 e 8)

Placa de agar Muller Hinton acrescido de 2% NaCl + Antibiótico Oxacilina.

Nenhuma das 22 cepas de Staphylococcus aureus cresceu na concentração de 256 µg/ml (Artigo III, Tabela 4).


Figura 3.

Figura 4.

Placa de agar Muller Hinton + Extrato da folha de Schinopsis brasiliensis extraído em metanol.

Na concentração de 0,5 mg.mL, cresceu 10 cepas de Staphylococcus aureus (ver Artigo III, Tabela 4, 6, 8).

Placa de agar Muller Hinton + Antibiótico Tetraciclina.

Na concentração de 64 µg/ml, duas cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente Clone Epidêmico Brasileiro (Artigo III, Tabela 4).


Figura 5.

Figura 6.

Placa de agar Muller Hinton + Extrato da casca da raiz de Schinopsis brasiliensis extraído em metanol.


Placa de agar Muller Hinton + Extrato da casca do caule de Schinopsis brasiliensis extraído em metanol.

Na concentração de 1 mg.mL, não cresceu nenhuma das cepas de Staphylococcus aureus (ver Artigo III, Tabela 4, 6, 8).


Figura 7.

Figura 8.

Placa de agar Muller Hinton + Extrato da casca da raiz de Schinopsis brasiliensis extraído em metanol.

Na concentração de 1 mg.mL, cresceu apenas uma cepas de Staphylococcus aureus, sendo esta um Clone Epidêmico Brasileiro (ver Artigo III, Tabela 4).

Placa de agar Muller Hinton + Extrato da casca do caule de Schinopsis brasiliensis extraído em metanol.



Figura 9.

Figura 10.

Placa de agar Muller Hinton + Extrato da casca da raiz de Caesalpinia pyramidalis extraído em metanol.

Na concentração de 0,5 mg.mL, cresceu 10 cepas de Staphylococcus aureus (ver Artigo IV, Tabela 4, 6 e 8).

Placa de agar Muller Hinton + Extrato da casca da raiz de Caesalpinia pyramidalis extraído em metanol.

Na concentração de 1 mg.mL, não cresceu nenhuma das cepas de Staphylococcus aureus (ver Artigo IV, Tabela 4, 6 e 8).


Figura 12.

Figura 11.

Crescimento das 22 cepas de Staphylococcus aureus, no meio controle – Agar Muller Hinton

Crescimento das 22 cepas de Staphylococcus aureus, no meio controle DMSO 5%– Agar Muller Hinton + DMSO 50% (9:1 v/v).


Tabela 1. Síglas dos anexos (I, II, III e IV).

SÍGLAS SIGNIFICADO SOLVENTES Metanol (M)

BFM Braúna folha Acetato (A) Metanol (M)

BCM Braúna Casca do Caule Acetato (A) Metanol (M)

BRM Braúna Casca da Raiz Acetato (A)

BFLM Braúna Flor Metanol (M) BENM Braúna Endocarpo do fruto Metanol (M) BEXM Braúna Exocarpo do fruto Metanol (M) BSM Braúna Semente Metanol (M)

Metanol (M) CFM Catingueira folha

Acetato (A) Metanol (M)

CCM Catingueira Casca do Caule Acetato (A) Metanol (M)

CRM Catingueira Casca da Raiz Acetato (A) Metanol (M)

CFRM Catingueira Fruto Acetato (A)

CFLM Catingueira Flor Metanol (M) CSM Catingueira Semente Metanol (M) AG Ácido Gálico TIM Timol CAT Catequina AE Ácido Elágico GLI Glicose TRI β-Sitosterol, β-Amirina e Ác. Ursólico QUE Quecertina e Canferol

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De: "Emidio Vasconcelos Leitão da Cunha" <[email protected]>

Para: [email protected]

Assunto: Revista Brasileira de Farmacognosia - FG 379

Data: Mon, 18 Dec 2006 16:24:20 -0200

Prezado Prof. Antônio, Confirmamos o recebimento do seu manuscrito intitulado “ Antimicrobial activity and phytochemical screening of Schinopsis brasiliensis Engl (Anacardiaceae)”, de autoria de Saraiva e col., o qual recebeu o código FG 379, para publicação na REVISTA BRASILEIRA DE FARMACOGNOSIA (RBFgnosia). De acordo com as normas vigentes, o seu manuscrito será enviado a 2 avaliadores para que emitam seus pareceres relativos ao trabalho. Para tanto, ainda de acordo com as normas vigentes, se faz necessária a indicação dos nomes e endereços eletrônicos de pelo menos 5 (cinco) prováveis avaliadores para o seu trabalho, lembrando ainda que os mesmos devem ser de instituições outras que não a sua. Atenciosamente, Prof. Dr. Emidio V. Leitão da CunhaEditor Associado da RBFPresidente da Sociedade Brasileira de Farmacognosia

Página 1 de 1Yahoo! Mail - [email protected]

1/3/2007http://br.f515.mail.yahoo.com/ym/ShowLetter?box=Marcos&MsgId=9018_110898_943...

7. APÊNDICE

7.1.Apêndice - Artigo I Artigo submetido a Revista Brasileira de Farmacognosia

Saraiva, A. M.; Estudo Farmacognóstico e Determinação da Atividade Biológica de Caesalpinia pyramidalis Tull. e Schinopsis brasiliensis Engl. frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

Antimicrobial Activity and Phytochemical Screening of Schinopsis brasiliensis

Engl. (Anarcadiaceae)

Antônio M. Saraiva 2, Cristiane L. Saraiva 2, Jose G. Sena Filho1, Admário M. Gonçalves2, Rogério

R. Soares2, Haroudo S. Xavier1, Nelly Caetano2

1Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de

Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brazil, 2Laboratório de Análises Microbiológicas, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Federal de Pernambuco, 50740-52,1 Recife, PE, Brazil

RESUMO: “Atividade antimicrobiana e prospecção fitoquímica de Schinopsis brasiliensis

Engl. (Anacardiaceae)”.

Neste trabalho avaliou-se a atividade antimicrobiana dos extratos: hexânico, acetato de etila e

metanólico de diferentes partes de Schinopsis brasiliensis usando métodos de difusão em poços e

fitoquímicos. Os resultados obtidos mostraram que os extratos acetato de etila e metanólico das

folhas e endocarpo do fruto apresentaram atividade antimicrobiana contra Escherichia coli (ATCC

9723, AM-31) Enterococcus faecalis (ATCC 33186, AM-128), Pseudomonas aeruginosa (ATCC

14502, AM-206), Salmonella spp serotipo Montevideo (ATCC 8387, AM-149), Staphylococcus

aureus (ATCC 6538) e Klebsiella pneumonia (ATCC 10031). Flavonóides, esteróides, terpenóides,

proantocianidinas condensadas e leucoantocianidinas e açucares redutores foram detectados na

análise fitoquímica.

Unitermos: Schinopsis brasiliensis, atividade antimicrobiana, análise fitoquímica.

ABSTRACT: This work evaluated the antimicrobial activity of n-hexane, ethyl acetate, and

methanolic extracts from different extracts of Schinopsis brasiliensisusing plates-wells diffusion

assay and the phytochemical screening. The results obtained showed that the ethyl acetate and

methanol from the leaves and endocarp of the fruit of Schinopsis brasiliensis presented

antimicrobial activity against Escherichia coli (ATCC 9723, AM-31) Enterococcus faecalis

(ATCC 33186, AM-128), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 14502, AM-206), Salmonella spp

serotype Montevideo (ATCC 8387, AM-149), Staphylococcus aureus (ATCC 6538) e Klebsiella

pneumonia (ATCC 10031). Flavonoids, steroids, terpenoids, condensed proanthocianidins and

leucoanthocyanidins and sugars reducers were detected in the phytochemical analysis.


Keywords: Schinopsis brasiliensis, antimicrobial activity, phytochemical analysis.

INTRODUCTION

Long before mankind discovered the existence of microbes, the idea that certain plants had

healing potential, indeed, that they contained what we would currently characterize as antimicrobial

principles, was well accepted. Since antiquity, man has used plants to treat common infectious

diseases and some of these traditional medicine are still included as part of the habitual treatment of

various maladies (Heinrich et al., 2004; Ríos et al., 2005; Sena Filho et al., 2006).

Schinopsis brasiliensis Engl. is a deciduous tree, about 8-12 m tall that belongs to the

Anarcadiaceae family, branches come from rigid thorns up to 3-5 cm of length, more or less

cylindrical trunk of 40-70 cm of diameter, with rough rind of ash-dark color (INSTITUTE

PLANTARUM). It is commonly known as "Braúna", "Baraúna" (CARDOSO, 2005), "Braúna-do-

Sertão" and "Braúna-Parda" (UMBUZEIRO, 2005). Previous studies on the Braúna is related to

allergic character evidenced by intense dermatitis in susceptible individuals (CRONQUIST, 1981).

This allergic character is mentioned due to the presence of alquil and alquenil phenols, present in

many species of this family. Previous work evaluated the hexanic and cloroformic compounds from

the bark of the stem of S. brasiliensis, in which phenols, steroids (β-sitosterol, estigmast-4en-3-ona,

estgmast-4-em-ona-6-β-ol e 5α, 8α-epidioxiergosta-6,22-dien-3β-ol) and triterpenes were found

(CARDOSO, 2001).

The antimicrobial activity of S. brasiliensis was evaluated by CHIAPPETTA (1982/3) in

which was evidenced the activity against Staphylococcus aureus e Mycobacterium Smegmatis. For

this reason, this work aims to further investigate the different extracts of S. brasiliensis, against

Escherichia coli (ATCC 9723/AM-31), Enterococcus faecalis (ATCC 33186/ AM-128), Klebsiella

pneumonia (ATCC 10031/AM-50), Salmonella spp (ATCC 8387/AM-149), Staphylococcus aureus

(ATCC 6538/AM-103), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P/AM-106) and Pseudomonas

aeruginosa (ATCC14502 /AM-206) and phytochemical analyses.

MATERIAL AND METHODS

Plant material:

The plant specimens (Schinopsis brasiliensis Engl.) were collected in Carnaubeira da Penha

(08º19’09”S; 38º44’41”W), Pernambuco State, Brazil in July 2004. The Plant was identified by


Prof. Dra. Rita de Cassia Pereira. A voucher specimen was deposited under nº 70007 at the

Herbarium Dárdano de Andrade Lima, in Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuaria (IPA)-

Pernambuco State - Brazil.

Crude extract preparation

The air dried and powdered plant particles Engl. (leaf, bark of the stem, peel of the root,

flower) of Schinopsis brasiliensis were extracted successively and exhaustively with increase

polarity of hexane, ethyl acetate and methanol, already the exocarp and endocarp of the fruit were

extracted only with methanol. All the extracts ones were left at room temperature (48 h for each

solvent). Solvents were evaporated at 50 ºC under reduced pressure producing the extracts coded as

Baraúna (B), leaf – hexane (BLH), ethyl acetate (BLA), methanol (BLM); stem bark - ethyl acetate

(BSBA), methanol (BSBM); roots - ethyl acetate (BRA), methanol (BRM); Flower - hexane

(BFLH), ethyl acetate (BFLA), methanol (BFLM); endocarp of the fruit – methanol (BENM) and

exocarp of the fruit - methanol (BEXM).

Microorganisms

Seven microbial species taken from international collections were analyzed: Escherichia

coli (ATCC 9723/AM-31), Enterococcus faecalis (ATCC 33186/ AM-128), Klebsiella pneumonia

(ATCC 10031/AM-50), Salmonella spp. (ATCC 8387/AM-149), Staphylococcus aureus (ATCC

6538/AM-103), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P/AM-106) and Pseudomonas aeruginosa

(ATCC14502 /AM-206).

Plate-hole diffusion assay

The microorganism cultures were grown in Müller Hinton agar at 37 ºC. After 18 h of

growth, each microorganism culture, were dissolved in NaCl 0.9% solution sterile until a

concentration of 0.5 at MacFarland scale (108 UFC.mL-1) (NCCLS, 2003), which then was

inoculated on the surface of Müller Hinton (MH) agar plates. The methodology used was the plate-

wells diffusion assay (Ieven et al, 1979; Caetano et al., 2002). The plates were incubated at 37 ºC

for 24 h; after this period, the zones of growth inhibition around the wells were measured.

The concentrations of 100 mg.mL-1 e 50 mg.mL-1 were tested against the strains.

Tetracycline was the positive control (0,3 mg.mL-1). All determinations were made in

duplicate.


Minimum inhibitory concentration (MIC)

The extracts were tested at concentrations of 2.103 µg.mL-1 to 31,25 µg.mL-1 against the

above indicated microorganisms.

Phytochemical profile

The chromatographic analyses were made by TLC on Si gel (MERCK-Germany, 105553)

developed by different solvent systems and revelator. The presence or absence of terpenoids (β-

amyrin and ursólico acid), steroids (β-sitosterol), saponins, redutors sugars (glucose), flavonoids

(kaempferol and quercetin), phenolics acids (gallic acid and ellagic acid), phenylpropanoids,

alkaloids (pilocarpin), coumarins, condensed proanthocyanidins, leucoanthocyanidins (catechin)

using standard secondary metabolites was verified. (See Table 1)

Table 1

RESULTS

The phytochemical profile from different extracts of Schinopsis brasiliensisdetected the

presence of phenolic compounds, most flavonoids (aglycones), phenolic acid (galic acid, elagic

acid) and steroids (β-sitosterol), and cinamic derivates. Phenolic acid was present in leaves,

kaempferol in the roots, quercetine in the endocarp. Also detected were the presence of β-amirina in

the leaves, glucose in the whole plant. On the other hand, the presence of coumarins, saponins,

phenylpropanoids, iridoids and quinones was not verified.

Table 2

Table 3

Table 4

DISCUSSION

A total of 7 microorganisms were tested and the results are summarized in Table 3,

following by the minimum inhibitory concentration in Table 4.


As can be observed in Table 3, the crude extracts possessed the antimicrobial activity

against some microorganism tested. In the assays against microorganisms by plates-wells diffusion

method, the zones obtained were between 11 to 26 mm.

The BLM and BRM extracts of Schinopsis brasiliensis were active against Escherichia coli

(ATCC 9723, AM-31) Enterococcus faecalis (ATCC 33186, AM-128), Pseudomonas aeruginosa

(ATCC 14502, AM-206), Salmonella spp serotipo Montevideo (ATCC 8387, AM-149),

Staphylococcus aureus (ATCC 6538) and Klebsiella pneumonia (ATCC 10031, AM-50).

The MIC values obtained ranged between 250 >2000 µg.mL-1 (Table 4). The best results

were observed for the BLM, BRM, BSBA and BFLM extracts against K. pneumonia (ATCC

10031, AM-50) and S. aureus (ATCC 6538/AM-103).

The phytochemical profile from different extracts of S. brasiliensis detected the presence of

aglycones of flavonoids, cynnamic derivates, β-sitosterol, gallic acid and ellagic acid in all extracts

assay. The β-amyrin was only present in the extracts of the leaf and flower, catechin in the extract

of the fruit’s endocarp, quercetin in the extract of the fruit’s exocarp and kaempferol in the extract

of the roof. For all secondary metabolites mentioned above, antimicrobial action against several

microorganisms, among these, the bacteria is related in the literature. On the other hand, the

presence of coumarins, saponins, phenylpropanoids, iridoids and quinines was not verified (Table

2).

REFERENCES

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Table 1. Chromatography condition of phytochemistry screening of Schinopsis brasiliensis.

Metabolites ChromotographicsSistems Revelatores References

Alkaloids A Dragendorff WAGNER, 1996

Triterpenoids / Steroids B Liebermann Burchard

HARBONE, 1998

Iridoids A Vanillin sulphuric acid WAGNER, 1996

Saponins A Anisaldehyde WAGNER, 1996

Sugars C 2,3,5 Triphenyltetrazolium WALLENFELS, 1950

Coumarins D U.V WAGNER, 1996

Phenolics Acids A NEU WAGNER, 1996

Cynamic Derivates A NEU WAGNER, 1996

Flavonoids A NEU WAGNER, 1984

MARKHAM, 1982 Phenylpropanoids A NEU WAGNER, 1996

Condensed Proanthocyanidins, Leucoanthocyanidins

A Vanillin Chloridric ROBERTS, 1957

A-EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 11 : 11 : 26 v/v) B- EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v/v) C- n-BuOH-Me2CO-Buffer Phosphate pH = 5,0 (40 : 50 : 10 v/v) D- Et2O-toluene-AcOH 10 % (50 : 50 : 50 v/v)


Table 2. Phytochemical Screening of Schinopsis brasiliensis Engl.

Schinopsis brasiliensis (MeOH)Secondary metabolites Leaf Stem

Bark Root Fruit Endocarp

Fruit Exocarp Seed Flower

Alkaloids (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Triterpenoids + (-) (-) (-) (-) (-) +

Steroids + + + + + + +

Iridoids (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Saponins (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Sugars (-) + + + + + (-)

coumarins (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Phenolics Acids + + + + + + +

Cynamic derivates + + + + + + +

Flavonoids + + + + + + +

phenylpropanoids (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

condensed proantocianidines

(-) + + + (-) (-) (-)

leucoantocianidines (-) (-) (-) + (-) (-) (-)

(-): There was no presence of metabolite;


Table 3: Antimicrobial activities of the n-hexane, ethyl acetate, methanol extracts of Schinopsis brasiliensis

Conc. / Extracts Solvents Well

Bactérias Cepas (AM) - Holes (mm)

31 50 103 106 128 149 206 10mg 25 25 22 NT# 22 25 22 MeOH 5mg 24 23 21 NT 18 22 20 10mg 12 21 19 18 20 17 18 AcOEt 5mg (-) 20 17 17 17 13 16 10mg (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Leaf

Hex 5mg (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 10mg (-) 23 21 NT 12 14 12

MeOH 5mg (-) 21 19 NT 11 (-) (-) 10mg (-) 14 22 NT 12 14 13

Steam Bark AcOEt

5mg (-) 11 18 NT 11 (-) 11 10mg (-) 24 20 20 18 12 11

MeOH 5mg (-) 23 19 19 16 10 (-) 10mg 12 16 15 12 13 13 15

Root AcOEt

5mg (-) (-) 11 (-) 12 12 14 10mg 15 26 24 26 20 15 18 Endocarp MeOH 5mg 12 17 18 19 18 11 16 10mg 11 16 19 21 18 11 16

Exocarp MeOH 5mg (-) 14 17 18 16 (-) 15 10mg 11 23 23 NT 20 16 14

MeOH 5mg (-) 21 20 NT 17 13 12 10mg 13 20 21 NT 13 20 15

AcOEt 5mg (-) 17 16 NT (-) 18 12 10mg (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Flower

Hex 5mg (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 10mg (-) 19 21 23 21 15 18 Seed MeOH 5mg (-) 16 19 20 17 14 16

Tetracycline Média 30µg 23 30 25 25 26 29 17 DMSO 50% (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Control Tween 80 4% (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

,#NT: Not tested; (-): There was not inhibition hole zone.AM : Collection coded of the Laboratório de Análises Microbiológicas-Departamento de Ciências Farmacêuticas - UFPE; 31: Escherichia coli; 50: Klebsiella pneumonia; 103 and 106: Staphylococcus aureus; 128: Enterococcus faecalis; 149: Salmonella spp.; 206: Pseudomonas aeruginosa;


Table 4. Minimum inhibitory concentration (MIC) of the microorganism against Schinopsis brasiliensis Engl

MIC ( µµµµg.mL-1) Part of Plant used Solvents

Bacteria (AM) 31 50 103 106 128 149 206

MeOH** 1000* 500 500 NT# 1000 500 500 Leaf AcOEt >2000 >2000 2000 NT >2000 >2000 500 MeOH 1000 1000 1000 NT 2000 1000 1000 Stem Bark

AcOEt*** >2000 500 250 NT 2000 NT >2000 MeOH >2000 500 500 500 2000 1000 2000

Root AcOEt >2000 500 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000

Fruit Exocarp MeOH >2000 >2000 1000 >2000 2000 2000 >2000 Fruti Endocarp MeOH 2000 2000 2000 2000 2000 >2000 1000

MeOH 1000 250 500 NT 500 >2000 250 Flower AcOEt >2000 2000 >2000 NT >2000 >2000 >2000

Seed MeOH >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 >2000 Tetracycline 1 0,5 0,5 0,25 0,5 0,5 0,125

DMSO 50% + + + + + + +Control

Tween 80 4% + + + + + + +DMSO at 50% and Tween 80 at 4%: control solution; +: The controls solution did not inhibit any activity of the bacterial tested. *The Minimal Inhibitory Concentration same or smaller than 1000 µg.mL-1 were marked. **MeOH: Methanol; ***AcOET: Ethyl Acetate; #NT: Not tested; 31: Escherichia coli; 50: Klebsiella pneumonia; 103 and 106: Staphylococcus aureus; 128: Enterococcus faecalis; 149: Salmonella spp.; 206: Pseudomonas aeruginosa;

7.2. Apêndice - Artigo II Artigo a ser submetido ao Journal of Ethnopharmacology


Antimicrobial Activity and Phytochemical Profile of Caesalpinia

pyramidalis Tull (Fabaceae)

Antônio M. Saraiva 2, Jose G. Sena Filho1*, Cristiane L. Saraiva 2, Admário M.

Gonçalves2, Rogério R. Soares2, Haroudo S. Xavier1, Nelly Caetano2.

1Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brazil, 2Laboratório de Análises Microbiológicas, Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco, 50740-52,1 Recife, PE, Brazil

ABSTRACT: Dry extracts by sequential extraction with hexane, ethyl acetate and methanol

from Leaf, bark of the stem, peel of the root, fruit and seed of Caesalpinia pyramidalis Tull.

were investigated for their antimicrobial activity and secondary metabolites. The results

obtained showed that methanolic extracts from the leaf, bark of the stem and flower presented

antimicrobial activity against Escherichia coli (ATCC 9723/AM-31), Enterococcus faecalis

(ATCC 33186/ AM-128), Klebsiella pneumonia (ATCC 10031/AM-50), Salmonella spp

(ATCC 8387/AM-149), Staphylococcus aureus (ATCC 6538/AM-103), Staphylococcus

aureus (ATCC 6538P/AM-106) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC14502 /AM-206).

Flavonoids, terpenoids, steroids (β-sitosterol), gallic acid, condensed proanthocyanidins,

leucoanthocyanidins and sugar reducers were detected in the phytochemical analysis.

Keywords: Caesalpinia pyramidalis, antimicrobial activity, phytochemical analysis.

INTRODUCTION

Long before mankind discovered the existence of microbes, the idea that certain plants had

healing potential, indeed, that they contained what we would currently characterize as

antimicrobial principles, was well accepted. Since antiquity, man has used plants to treat

common infectious diseases and some of these traditional medicines are still included as part

of the habitual treatment of various maladies (Heinrich et al, 2004; Rios and Recio, 2005;

Sena Filho et al, 2006). The genus Caesalpinia (Fabaceae), comprised of tropical or

subtropical trees or shrubs, contains more than 150 species worldwide (Joly, 1998).


Caesalpinia pyramidalis Tull is an endemic tree (about 4 m tall) of northeastern region of

Brazil and one of the predominant species in the caatinga vegetation (SEPLANTEC),

commonly known as “Catingueira”, “Pau-de-Porco”, “Catinga de Porco”, “Pau-de-

Rato”(Braga, 1960). In traditional medicine it is used as diuretic, stomach diseases and for

fever. Previous work on organic extracts from C. pyramidalis leaves succeeded the isolation

of phenylpropanoids, lupeol, sitosterol, caesalflavone, podocarpusflavone A, apigenin,

kaempferol and aghatisflavone, (Mendes et al, 2000). In addition, phenolic compounds from

the trunk woods were also isolated, such as 4,4'-dihydroxy-2'-methoxychalcone, (-)-

syringaresinol, and methyl gallate (Bahia et al, 2005). This work aims to further investigate

the Leaf, fruit, bark of the stem, peel of the root and seed’s extracts, in order to evaluate the

antimicrobial activity against 7 microbial specimens.

MATERIAL AND METHODS

Plant material:

The plant specimens (Caesalpinia pyramidalis Tull) were collected in Carnaubeira da

Penha (08º19’09”S; 38º44’41”W), State of Pernambuco, Brazil in July 2004. The Plant was

identified by Prof. Dra Rita de Cassia Pereira. A voucher specimen was deposited under nº

70008 at the Herbarium Dárdano de Andrade Lima, in Empresa Pernambucana de Pesquisa

Agropecuaria (IPA)-Pernambuco State -Brazil.

Crude extract preparation

The air dried and powdered plant (leaf, bark of the stem, peel of the root, flower, and

fruit) of Caesalpinia pyramidalis were extracted successively and exhaustively with increase

polarity of Hexane, ethyl acetate and methanol at room temperature (48 h for each solvent).

Solvents were evaporated at 40 ºC under reduced pressure affording the extracts coded as

Catingueira (C), leaf – hexane (CLH), ethyl acetate (CLA), methanol (CLM); bark of the stem

- hexane (CSH), ethyl acetate (CSA), methanol (CSM); peel of the roots - hexane (CRH),

ethyl acetate (CRA), methanol (CRM); flower - methanol (CFLM); and fruits - hexane

(CFH), ethyl acetate (CFA), methanol (CFM).

Microorganisms


Seven microbial species taken from international collections were analyzed:

Escherichia coli (ATCC 9723/AM-31), Enterococcus faecalis (ATCC 33186/ AM-128),

Klebsiella pneumonia (ATCC 10031/AM-50), Salmonella spp (ATCC 8387/AM-149),

Staphylococcus aureus (ATCC 6538/AM-103), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P/AM-

106) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC14502 /AM-206).

Plate-hole diffusion assay

The microorganism cultures were grown in Müller Hinton (MH) agar at 37 ºC. After

18 h of growth, each microorganism culture, were dissolved in NaCl 0.9% solution sterile

until a concentration of 0.5 at MacFarland scale (108 UFC/ml) (NCCLS, 2003), was

inoculated on the surface of MH agar plates. The methodology used was the plate-wells

diffusion assay (Ieven et al, 1979). The plates were incubated at 37 ºC for 24 h; after this

period, the zones of growth inhibition around the wells were measured.

The concentrations of 100 mg.mL-1 e 50 mg.mL-1 were tested against the strains.

Tetracycline was the positive control (0,3 mg.mL-1). All determinations were made in

duplicate.

Minimum inhibitory concentration (MIC)

The extracts were tested at concentrations of 2.103µg.mL-1 to 31,25 µg.mL-1 against

the above indicated microorganisms.

Phytochemical profile

The chromatographic analyses were made by TLC on Si gel (MERCK-Germany,

105553) developed by different solvent systems. It was verified the presence or absence of

terpenoids, steroids, saponins, sugars reducers, flavonoids, phenylpropanoids, alkaloids,

coumarins, condensed proanthocyanidins, leucoanthocyanidins and quinines, using known

metabolites standards as reference (See Table 1)

Table 1


RESULTS

The phytochemical profile from different extracts of Caesalpinia pyramidalis detected

the presence of phenolic compounds, most flavonoids (aglycones), phenolic acid (gallic acid,

ellagic acid) and steroids (β-sitosterol), condensed proanthocyanidins, leucoanthocyanidins

and cynamic derivates. On the other hand, the presence of alkaloids, coumarins, saponins,

glycoside of phenylpropanoids, iridoids and quinones was not verified (Table 2 )

Table 2

A total of 7 microorganisms were tested and the results are summarized in Graphic 1,

2, 3, 4, 5 and 6, following by the Minimum inhibitory concentration in Table 3.

Graphic 1

Graphic 2

Graphic 3

Graphic 4

Graphic 5

Graphic 6

Table 3

DISCUSSION

As can be observed in Graphic 1 to 6, the crude extracts possessed the antimicrobial

activity against some microorganism tested. In the assays against microorganisms by plates-

wells diffusion method, the zones obtained were between 10 to 22 mm.

The methanolic extracts in Graphic 1 and 4 (CLM, CSM, CRM and CFLM) of Caesalpinia

pyramidalis were active against Escherichia coli (ATCC 9723/AM-31), Enterococcus

faecalis (ATCC 33186/ AM-128), Klebsiella pneumonia (ATCC 10031/AM-50), Salmonella

spp (ATCC 8387/AM-149), Staphylococcus aureus (ATCC 6538/AM-103), Staphylococcus

aureus (ATCC 6538P/AM-106) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC14502 /AM-206). The

ethyl acetate extracts (Graphic 2 and 5) and hexane extracts (Graphic 3 and 6) obtained

smaller antimicrobial activity, when compared with the results of the inhibition zones of the


methanolic extracts. This can be due to the constituents of the ethyl acetate extracts and

hexane extracts with smaller polarity and this cause difficulties in the half aqueous diffusion.

The MIC values obtained ranged from 250 to >2000 µg.mL-1 (Table 3). Moreover the

phytochemical analysis detected the presence of flavonoids in all MeOH crude extracts; those

compounds are responsible for many antimicrobial activities (Simões et al 2004). The

infusion of C. pyramidalis has been used in traditional medicine as natural antiseptic (Braga,

1960), this work ratify such activity, being an alternative medicine,that belong to the

“caatinga” vegetation.

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404.


TABLE 1. Chromatography condition of phytochemistry screening of Caesalpinia

pyramidalis.

METABOLITE CHROMATOGRAPHY SISTEM REVELADOR REFERENCE

Alkaloids A Dragendorff (11)

Triterpenoids / Steroids B Liebermann Burchard (12)

Iridoids A Vanillin sulphuric acid (11)

Saponins A Anisaldehyde (11)

Sugars C 2,3,5 Triphenyltetrazolium (14)

Coumarins D U.V (11)

Cynamic Derivates A 2-Aminoethyldiphenyl

borinate (11); (13)

Flavonoids A 2-Aminoethyldiphenyl

borinate (11); (13)

Phenylpropanoids A 2-Aminoethyldiphenyl

borinate (11); (13)

Condensed Proanthocyanidins, Leucoanthocyanidins

A Vanillin Chloridric (15)

A-EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 11 : 11 : 26 v/v) B- EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v/v) C- n-BuOH-Me2CO-Buffer Phosphate pH = 5,0 (40 : 50 : 10 v/v) D- Et2O-Toluene-AcOH 10 % (50 : 50 : 50 v/v)


TABLE 2. Results of the phytochemical analyses of Caesalpinia pyramidalis Tull.

Caesalpinia pyramidalis (MeOH)Metabolites

Leaf Stem Bark Root Fruit (exosperm) Flower

Alkaloids (-) (-) (-) (-) (-)

Triterpenoids (-) (-) + (-) (-)

Steroids + + + + +

Iridoids (-) (-) (-) (-) (-)

Saponins (-) (-) (-) (-) (-)

Sugars + + + + +

coumarins (-) (-) (-) (-) (-)

Phenolic Acid (-) (-) + + +

Cynamic derivates + + + + +

Flavonoids + + + + +

phenylpropanoids (-) (-) (-) (-) (-) condensed

proantocianidines (-) + + (-) (-)

leucoantocianidines (-) + ++ (-) (-)


Catingueira extract Metanolic - Concentration 10 mg / Well

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

CLM CSM CRM CFM CFLM TT DMSO 50%

Inhibition zone (mm)

AM 31 - E. coli

AM 50 - K. pneumonia

AM 103 - S. aureus

AM 128 - E. faecalis

AM 149 - Salmonella spp.

AM 206 - P. aeruginosa

Graphic 1. Antibacterial activity of the methanolic extract ofCaesalpinia pyramidalis against

strains standard in concentration of 10 mg for wells.

M : Methanol; C: Catingueira; L : Leaf; S: Bark of the stem; R: Peel of the root; F: Fruti; FL : Flower; TT :

Tetracycline. DMSO at 50%: Control Solution.

AM : Collection coded of the Laboratório de Análises Microbiológicas-Departamento de Ciências Farmacêuticas

- UFPE;


Catingueira extract Ethyl acetate - Concentration 1 0 mg / Well

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

CLA CSA CRA CFA TT Tween 80 à4%


AM 31 - E. coli


AM 103 - S. aureus




Graphic 2. Antibacterial activity of the ethyl acetate extractCaesalpinia pyramidalis against

strains standard in the concentration of 10 mg for wells.

A Ethyl acetate; C: Catingueira; L : Leaf; S: Bark of the stem; R: Peel of the root; F: Fruti; TT : Tetracycline.

Tween 80 at 4%: Control Solution.


- UFPE;


Catingueira extract Hexane - Concentration 10 mg / Well

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

CLH CSH CRH CFH TT Tween 80 à4%


AM 31 - E. coli


AM 103 - S. aureus




Graphic 3. Antibacterial activity of the hexane extract Caesalpinia pyramidalis against


H: Hexane; C: Catingueira; L : Leaf; S: Bark of the stem; R: Peel of the root; F: Fruit; TT : Tetracycline. Tween

80 at 4%: Control Solution.


- UFPE;


Catingueira extract Methanolicl - Concentration 5 m g / Well

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

CLM CSM CRM CFM CFLM TT DMSO 50%


AM 31 - E. coli


AM 103 - S. aureus




Graphic 4. Antibacterial activity of the methanolic extract Caesalpinia pyramidalis against


M : Methanol; C: Catingueira; L : Leaf; S: Bark of the stem; R: Peel of the root; F: Fruit; FL : Flower; TT :

Tetracycline. DMSO at 50%: Control Solution.


- UFPE;


Catingueira extract Ethyl acetate - Concentration 5 mg / Well

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

CLA CSA CRA CFA TT Tween 80 à4%


AM 31 - E. coli


AM 103 - S. aureus




Graphic 5. Antibacterial activity of the ethyl acetate extractCaesalpinia pyramidalis against


A Ethyl acetate; C: Catingueira; L : Leaf; S: Bark of the stem; R: Peel of the root; F: Fruit; TT : Tetracycline.



- UFPE;


Catingueira extract Hexane - Concentration. 5 mg / Well

02468

101214161820222426283032

CLH CSH CRH CFH TT Tween 80 à4%


AM 31 - E. coli


AM 103 - S. aureus




Graphic 6. Antibacterial activity of the hexane extract Caesalpinia pyramidalis against


H: Hexane; C: Catingueira; L : Leaf; S: Bark of the stem; R: Peel of the root; F: Fruit; TT : Tetracycline.



- UFPE;


TABLE 3 Minimum inhibitory concentration (MIC) of the Caesalpinia pyramidalis against some standard strains.

MIC ( µµµµg.mL-1) Bacteria (AM) Extracts Solvents

31 50 103 106 128 149 206 Leaf MeOH* 500# >2000 2000 2000 >2000 2000 125

MeOH >2000 1000 2000 1000 >2000 >2000 1000 Stem Bark AcOEt** 1000 >2000 2000 >2000 2000 2000 >2000 MeOH 2000 1000 500 500 1000 2000 1000 Roots AcOEt 1000 500 250 250 2000 >2000 500 MeOH >2000 >2000 2000 2000 >2000 >2000 >2000

Fruits AcOEt >2000 2000 2000 2000 >2000 >2000 >2000

Flowers MeOH 250 1000 500 500 2000 1000 1000 Tetraciclina - 1 0,5 0,5 0,25 0,5 0,5 0,125

DMSO 50% + + + + + + + Control

Tween 80 4% + + + + + + + +: The controls solution did not inhibit any activity of the bacterial tested; #The Minimal Inhibitory Concentration same or smaller than 1000 µg.mL-1 were marked. *MeOH: Methanol; **AcOET: Ethyl Acetate; AM : Collection coded of the Laboratório de Análises Microbiológicas-Departamento de Ciências Farmacêuticas - UFPE; 31: Escherichia coli; 50: Klebsiella pneumonia; 103 and 106: Staphylococcus aureus; 128: Enterococcus faecalis; 149: Salmonella spp.; 206: Pseudomonas aeruginosa;

7.3. Apêndice - Artigo III Artigo a ser submetido ao Mem. Instituto Oswaldo Crus


Determinação da Atividade Antibacteriana de Schinopsis brasiliensis Engl.

(Anacardiaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

Antonio Marcos Saraiva1, Cristiane Lopes Saraiva1, Risonildo Pereira Cordeiro1,

Admário Marques Gonçalves1, Rogério Ribeiro Soares1, José Guedes Sena

Filho2, Haroudo Satiro Xavier2, Maria Nelly Caetano Pisciottano1.

1Laboratório de Análises Microbiológicas, Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521,Recife, PE, Brasil.

2Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brasil.

Resumo

A determinação da atividade antibacteriana dos extratos metanólico e acetato de etila da

folha, casca do caule e raiz, flor e dos extratos metanólicos do exocarpo e endocarpo do

fruto e da semente de Schinopsis brasiliensis (Baraúna), foi realizada frente 18 isolados

de Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes (nove Clone Epidêmico Brasileiro,

cinco Clone Pediátrico e quatro Clone Esporádico), mais dois S. aureus MSSA e duas

cepas padrão. Estas foram ensaiadas pelas técnicas de poço/difusão em agar e

determinação da CMI, método de diluição em agar usando o multiinoculador de Stears.

O extrato metanólico da casca da raiz e flor e a casca do caule extraída em acetato de

etila indicaram uma boa atividade, com CMI inferior a 0,5 mg.ml-1. Os extratos secos

por extração em acetato de etila, pela técnica de poço/difusão em agar, na sua maioria,

apresentaram menor atividade, que poderia explicar-se por problemas de solubilidade e


menor difusão no meio agar. Resultados das bioautografias confirmaram zonas de

inibição correspondente as substâncias ativas presente na folha, casca do caule e flor de

S. brasilieinsis. No estudo fitoquímico permitiu evidenciar a presença de ácidos

fenólicos, flavonóides, triterpenos, esteróides, proantocianidinas e Leucoantocianidinas,

entre outros, metabólitos com reconhecida atividade antimicrobiana.

Palavras Chaves: Schinopsis brasiliensis, Atividade Antimicrobiana, Multirresistência,

Staphylococcus aureus, Clone Epidêmico Brasileiro, Clone Pediátrico, Clone

Esporádico, Bioautografia.

Abstract

The determination of the antimicrobial activity of methanolic and ethyl acetate extracts

of the leaf, bark of the stem, peel of the root, flower and only methanolic extract of the

fruit (endocarp and exocarp) and seed of Schinopsis brasiliensis (Baraúna) against 18

isolates of Staphylococcus aureus MRSA multiresistant strains (nine 9 Brazilian

Epidemic Clone, five Pediatric Clone and four Sporadic Clone), more two S. aureus

MSSA and two standard ATCC strain. These were assayed by the agar well diffusion

technique and MIC determination by the agar dilution method using the Stears’s

multiinoculator. The methanolic dry extracts of the peel of the roots and flower and

ethyl acetate dry extracts of the stem bark indicated an excellent activity, with MIC less

than 0,5 mg.ml-1. The dry ethyl acetate extracts, on the agar well diffusion method

presented, in its majority, smaller activity that could be explained by solubility problems

and reduced diffusion in the agar medium. Results of the bioautographies confirmed

inhibition zones formatted corresponding to active substances in the leaf, bark of the


stem and flower of the S. brasilieinsis. In the phytochemical assay allowed to evidence

the presence of phenolic acids, flavonoids, triterpenes, steroids, proanthocianidins and

leucoanthocyanidins, among others with recognized antimicrobial activity.

Key Words: Schinopsis brasiliensis, Antimicrobial activity, Multiresistant MRSA

Staphylococcus aureus, Brazilian Epidemic Clone, Pediatric Clone, Sporadic Clone,

Bioautography

INTRODUÇÃO

A ocorrência e proliferação de cepas de Staphylococcus aureus MRSA

multirresistente são causa de muita preocupação não somente no meio hospitalar, mas

também na comunidade, desde que poucos agentes podem tratar infecções por estes

microorganismos. Virtualmente as cepas de MRSA estão resistentes a todos os β-

lactâmico, macrolídeos, tetraciclina, aminoglicosídeos, sendo vancomicina e

teicoplamina, os dois glicopeptídeos usados na clínica para o tratamento destas

infecções por S. aureus MRSA multirresistentes (Shibata 2005). Recentemente, porém,

S. aureus com susceptibilidade intermediária à vancomicina (VISA) ou S. aureus

glicopeptídeos intermediários (GISA) têm sido isolados em diversos países.

Posteriormente, cepas de S. aureus resistentes a vancomicina (VRSA), tem também

emergido com um mecanismo de resistência claramente distinto daqueles das cepas

VISA (Nishi 2004).

Embora, este tenha sido somente um primeiro relato de VRSA, a elevada

prevalência de MRSA, o amplo uso de vancomicina, o surgimento de cepas de

Staphylococcus coagulase negativo multirresistente (Veach 1990) e Enterococcus


resistentes à vancomicina, permitia prever o isolamento S. aureus MRSA também

resistente a vancomicina (Billot-Klein 1996), visto que esta cepa possui vários

mecanismos de resistência e ampla disseminação (Saderi 2005).

No Brasil, os S. aureus são os microorganismos mais freqüentemente isolados e

sua prevalência ocorre em maior proporção a nível hospitalar (Tavares 2000). Os

resultados obtidos de isolados oriundos das infecções hospitalares, a prevalência de

cepas MRSA variam de 40 a 80% nos hospitais brasileiros. Estes isolados são

geralmente resistentes a múltiplos antibióticos (aminoglicosídeos, cloranfenicol,

tetraciclina, lincosamidas, macrolídeos, quinolonas, sulfametoxazol/trimetoprima), com

susceptibilidade a rifampicina. Estudos realizados no Brasil descreveram um clone de S.

aureus meticilina resistente (Clone Epidêmico Brasileiro – BEC) em hospitais do Sul,

Sudeste, Norte e Nordeste (Teixeira 1996, Figueiredo 1991), sendo que este clone se

expandiu para outros países da América Latina (Argentina, Chile, Uruguai) e também

na Europa (Portugal, Itália e República Tcheca) (Oliveira 2001, Sola 2002).

O crescimento da resistência bacteriana aos antibióticos é uma ameaça a

população mundial, aumentando as recorrências por doenças infecciosas, devido ao

surgimento de bactérias multirresistentes que dificulta o tratamento quimioterápico

(Aqil 2005). Por tudo isso, é importante a descoberta de novos agentes antibacterianos

com mecanismo de ação radicalmente diferente dos compostos existentes (Breithanpt

1999).

Uma fonte abundante de novas moléculas é o reino vegetal, com algumas plantas

medicinais utilizadas como antiséptico desde a antiguidade, sendo que somente no

início do século XX, os pesquisadores tentam caracterizar estas propriedades no

laboratório (Dorman 2000). Os metabólitos secundários biosintetizados e estocados nas


plantas tem uma importante função na defesa da mesma, contra herbívoros,

microorganismos, para proteção contra os raios UV, ou na a atração de polinizadores ou

animais dispersores de sementes (Santos 2004). Estas substâncias geralmente

apresentam atividade antibacteriana e antifúngicas, sendo frequentemente usadas na

medicina popular como profilático ou na cura de doenças causadas por

microorganismos (Sakagami 1998). Estes componentes bioativos, oriundos das plantas,

são ainda correntemente investigados como intermediários para o desenvolvimento de

agentes quimioterápicos no tratamento das infecções por bactérias, vírus, fungos e

protozoários (Himejima 1991, Kubo 1992).

Entre os componentes com reconhecida atividade antimicrobiana, destacam-se

os resultados obtidos com: óleos essenciais, alcalóides, ácidos fenólicos, flavonóides,

taninos, cumarinas, terpenóides, entre outros que apresentam atividade inibitória sobre o

crescimento de bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, Mycobacterium,

leveduras e fungos filamentosos (Nepomuceno 2003, Cechinel Filho 1998).

A Schinopsis brasiliensis Engl., família das Anacardiaceae, é uma espécie

característica das caatingas e de grande valor econômico para a Região Nordestina. Sua

distribuição, embora com poucos indivíduos, se dá por toda a região do semi-árido

brasileiro, deste a Bahia à Paraíba (Prado 1995). É uma árvore endêmica brasileira

popularmente conhecida como “Braúna”, “Baraúna” (Cardoso 2005). Dentre as árvores

de valor econômico, a unidade de dispersão da espécie S. brasiliensis apresenta

dificuldade quanto ao processo de germinação, ao que se agrega à exploração

indiscriminada de sua madeira de lei especial (Prado 1995), que determinou sua

inclusão no catálogo de espécies ameaçada de extinção pelo “First Report National for

the Convention on Biological Diversity (CBD)” (CARDOSO, 2001).


Na literatura, é relatado o isolamente de algumas substâncias isoladas dos

extratos hexânicos e clorofórmicos do caule da Braúna, como: esteróides (β-sitosterol,

estigmast-4en-3-ona, estigmast-4-em-ona-6-β-ol e 5α, 8α-epidioxiergosta-6,22-dien-

3β-ol), triterpenos, alquil fenol e alquenil fenol (Cardoso 2001).

O “Screening” de plantas superiores realizado por Chiappeta (1982/3), dentre

estas, a S. brasiliensis, avaliou a ação antimicrobiana destas frente a algumas cepas

Gram negativas e Gram positivas (Padrões - ATCC), sendo encontrado atividade da S.

brasiliensis frente às cepas de S. aureus e Mycobacterium smegmatis, avaliado pelo

método disco difusão em agar.

MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta e identificação

A coleta da Schinopsis brasiliensis aconteceu entre os meses de março e junho

de 2004, na cidade de Carnaubeira da Penha, sertão de Pernambuco, latitude: 08º19’09”,

longitude: 38º44’41” e altitude: 446 metros. A mesma foi identificada pela curadora do

Herbário da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), Dra. Rita de

Cássia Pereira, e depositada neste, sob registro de n° 70.007.

Preparação dos extratos

Na determinação da atividade antimicrobiana da Schinopsis brasiliensis Engl.,

Baraúna (B), foram ensaiadas diferentes partes da planta, material a fresco, como: folha

(BF), casca do caule (BC), casca da raiz (BR) e flor (BFL) que foram trituradas, pesadas

e submetidas a três extrações sucessivas pelo processo de infusão, em intervalos médios

de 72 horas para cada solvente. A ordem dos solventes foi n-hexano (H), seguido de


acetato de etila (A) e por ultimo metanol (M). O exocarpo do fruto (BEX), endocarpo

do fruto (BEM) e semente (BS) sofreram o mesmo processo inicial, mas extraído por

infusão apenas em metanol. Os extratos, assim obtidos, foram filtrados e levados à

secura no rota-vapor, subseqüentemente pesados e calculados seus rendimentos.

Os extratos secos obtidos da extração metanólica foram ressuspendidos em

água/DMSO (1:1 v/v; DMSO 50%) (Sakagami 2005) na concentração de 100 mg.ml-1.

Os extratos secos obtidos por extração em acetato de etila e n-hexano foram, por sua

vez, ressuspendidos em água-Tween 80 (4,8: 0,2 v/v; Tween 80 4%) na mesma

concentração anterior.

Bactérias

As cepas de Staphylococcus aureus utilizadas no estudo, no total de vinte e duas,

das quais vinte isolados clínicos e duas cepas padrões, apresentados na Tabela 1.

Os S. aureus MRSA multirresistentes e S. aureus MSSA foram cepas da coleção

do Laboratório de Análise Microbiológica, proveniente de um estudo do perfil de

susceptibilidade/resistência de S. aureus no Recife-PE (Cordeiro 2004). No qual foi

determinado os fenótipos de resistência, sendo escolhido oito antibióticos, de sete

classes diferentes: ciprofloxacino, penicilina, vancomicina, gentamicina, oxacilina,

sulfatrim, tetraciclina e eritromicina, conforme indicação sugerida para informes com

fins epidemiológico. O caráter de MRSA ou MSSA foi confirmado pelas técnicas de

antibiograma, determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMI) pelo método

de multiinoculador de Stears, E-test assim como a técnica de screening de oxacilina.

O caráter de MRSA e MSSA foi confirmado também pela amplificação do gene

mecA por PCR e da proteína PBP2a pelo teste de aglutinação em látex. Este estudo foi


realizado em conjunto com o grupo de Biologia Molecular da Profª. Drª. Agnes

Figueiredo da Universidade Federal do Rio de Janeiro, onde foram realizadas as

análises de clonacidade das cepas, entre outras, pela técnica de eletroforese em campo

elétrica alternado (PFGE).

Os nove isolados de S. aureus MRSA multirresistentes pertencentes ao Clone

Epidêmico Brasileiro (BEC) foram só sensíveis ao glicopeptídeo vancomicina,.

Os cinco isolados correspondentes ao Clone Epidêmico Pediátrico apresentam

uma maior susceptibilidade aos antibióticos testados, alguns deles são principalmente

resistente aos antibióticos oxacilina, penicilina, gentamicina e ocasionalmente

eritromicina.

Os quatro isolados restantes correspondem a clones esporádicos, assim

denominados pela sua relativa pouca freqüência.

Tabela 1

Preparação dos inóculos

A partir de cultura de 24h em agar Muller Hinton (MH) de S. aureus

suspendidas em soro fisiológico estéril, comparando as turvações com o tubo 0,5 da

escala MacFarland, os inóculos foram preparados (108 UFC.ml-1) (NCCLS 2003,

Hatano 2005).

Técnica Poços / Difusão em Agar

O semeio dos inóculos foram realizados com swab de algodão estéril em placas

de Petri contendo 20 ml de agar Muller-Hinton, procedendo subseqüentemente à

perfuração dos poços (perfurador de 6 mm de diâmetro) e aplicado os extratos com

pipeta automática (100 µl por poço), nas concentrações de 100 mg.ml-1 e 50 mg.ml-1

para os extratos brutos e de 300 µg.ml-1, para o antibiótico padrão, tetraciclina. Após


incubação à 36 °C ± 1 por 24 horas, foram medidos o diâmetro dos halos de inibição e

seus resultados avaliados conforme seguinte parâmetro: halos < 9 mm, inativo; 9-12

mm, pouco ativo; 13-18 mm, ativo; > 18 mm, muito ativo (Alves 2000).

Determinação da Concentração Mínima Inibitória

Na determinação da concentração mínima inibitória para os extratos metanólicos

e em acetato de etila, seguindo procedimento já citado anteriormente, foram preparadas

diluições nas concentrações de 312,5 µg.ml-1 à 20.103 µg.ml-1 e incorporadas no agar

Muller Hinton (1:9 v/v), ficando assim, concentrações finais de 31,5 µg.ml-1 a 2000

µg.ml-1 dos extratos em meio de cultura. Neste teste os antibióticos padrões foram a

tetraciclina (0,31 µg.ml-1 à 640 µg.ml-1) e oxacilina (1,25 µg.ml-1 à 2560 µg.ml-1)

(Sigma), em agar Muller Hinton e agar Muller Hinton agregado com 2% cloreto de

sódio, para oxacilina, também na proporção de 9:1 (v/v) (NCCLS 2003).

Com uma pipeta automática de 100 µl foram distribuídos assepticamente os 22

inóculos no Multiinoculador de Stears, depositados na superfície do meio, incubando-se

a 36ºC ± 1 por 24h.

Foram feitos controles em duplicata no início e no final do processo, em meio

agar Muller-Hinton (controle de cepas) e controle dos diluentes (Tween 80 à 4% e

DMSO à 50%).

Estudo Fitoquímico - Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

As placas cromatográficas de Sílica-Gel usadas foram GF254 (Merck), 20 x 20

cm com 1 mm de espessura. Os extratos metanólicos e em acetato de etila da folha, da

casca do caule e da flor de S. brasiliensis na concentração de 20 mg.ml-1 foram

aplicados usando um capilar analítico (15 µl), tendo como fase móvel para os extratos

metanólico da folha, da flor e aqueles casca do caule extraído em metanol e em acetato


de etila o sistema cromatográfico (1): AcOEt/HCOOH/AcOH/H2O (100:11:11:27), para

os extratos da folha e flor extraído em acetato de etila, sistema (2):

AcOEt/HCOOH/AcOH/H2O (100:2:2:2 e 100:3:3:3). As placas cromatográficas foram

eluídas em duplicata, sendo uma usada como referência cromatográfica e a segunda

para bioautografia.

No estudo fitoquímico foram utilizados como marcadores: padrões de ácido

gálico; ácido elágico; quercetina; canferol, catequina; ácido ursólico; β-sitosterol, β-

amirina, pilocarpina, Iridóides, glicose, para identificação das bandas.

Na placa cromatográfica as bandas foram visualizadas sob luz UV (254 e 366

nm), então reveladas conforme a Tabela 2 e visualizadas novamente sob luz UV.

Tabela 2

Bioautografia

As placas desenvolvidas pelo sistema (1) e aquelas desenvolvidas no sistema (2)

ficaram sob corrente de ar por 8h e 6h, respectivamente, numa capela de fluxo laminar.

As placas cromatográficas foram instaladas, cada uma, numa placa de Petri (12 cm de

diâmetro) e recobertas com 20 ml de meio fundido, agar Muller Hinton à 45 ºC,

inoculado com uma suspensão salina de S. aureus ATCC 6538 108 UFC.ml-1 (18 ml de

meio agar Muller Hinton + 2 ml da suspensão bacteriana) e distribuído

homogeneamente por toda a placa. Após solidificação houve um tempo de pré-difusão

de 30 minutos à temperatura ambiente (25 ºC). Seguindo a placa foi incubada por 24

horas a 36 ± 1ºC. Passado este período a bioautografia foi revelada com uma solução de

2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) à 2,5 mg.ml-1 e novamente incubada por 4 horas.

A presença de zonas de inibição indica a existência de compostos ativos (Pessini

2003).


RESULTADOS

Atividade Antimicrobiana

Os resultados dos extratos ensaiados de Schinopsis brasiliensis sobre quatro

isolados clínicos de Staphylococcus aureus e a cepa padrão S. aureus ATCC 6538 são

apresentados no gráfico 1 e 3 na concentração de 10 mg.100 µL-1 e os gráfico 2 e 4 na

concentração de 5 mg.100 µL-1. Os diâmetros dos halos expressos em milímetros são

representados na forma de colunas para cada extrato e para cada bactéria. Os extratos

hexânicos de Schinopsis brasiliensis não apresentaram atividade.

Os resultados das concentrações mínimas inibitórias (CMI), expressas em

mg.ml-1, são apresentadas nas Tabelas 3, 5 e 7 para os extratos metanólicos (M) e

Tabelas 4, 6, e 8 para os extratos extraídos em acetato de etila (A).

Os valores das CMI dos extratos ensaiados foram apresentadas separadamente

por tipo de clone de S. aureus MRSA multirresistente e solventes extrativos, desta

forma, nas tabelas 3 (M) e 4 (A) figuram os resultados para os clones epidêmicos

brasileiros, nas tabelas 5 (M) e 6 (A) os correspondentes para os clones pediátricos e

finalmente nas tabelas 7 (M) e 8 (A), os valores dos CMI para quatro clones

multirresistentes esporádicos, as duas cepas de S. aureus MSSA e as cepas padrões.

Gráfico 1

Gráfico 2

Gráfico 3

Gráfico 4

Tabela 3

Tabela 4


Tabela 5

Tabela 6

Tabela 7

Tabela 8

Estudo fitoquímico

Os metabólitos secundários, de reconhecida atividade antimicrobiana,

identificados, são apresentados na tabela 9.

Tabela 9

Bioautografia

Nas bioautografias em CCD, observaram-se zonas de inibição em todos os

extratos testados, destacando-se os extratos da BCM e BCA que apresentaram

respectivamente: quatro e cinco zonas de inibição (Tabela 10).

Tabela 10

Figura 1 Figura 2

DISCUSSÃO

Das técnicas utilizadas para determinação da atividade antimicrobiana, a técnica

de poços/difusão em agar apesar de empregar volumes maiores (100 µl) (CAETANO,

2001), em relação aos empregados nos discos (10µl) (VORAVUTHIKUNCHAI, 2005),

tem a vantagem de possibilitar, o emprego de adjuvantes de dissolução para melhorar a


solubilidade dos constituintes do extrato e também permite uma difusão tanto radial

como superfície, condições estas que resultam em melhores halos de inibição.

Quanto às cinco cepas de Staphylococcus aureus escolhidas para determinação

das zonas de inibição, estas representam, os três tipos de clones MRSA multirresistente

juntamente com a cepa padrão (Gráficos 1 – 4).

Pelos gráficos 1 e 3, o extrato metanólico da folha (BFM) mostrou os maiores

halos de inibição frente as cinco cepas testadas, dando valores da ordem de 25 mm, na

maior concentração de10mg/Poço e 23 mm na menor concentração (5mg/Poço), que

corresponderia à classificação de muito ativo (Alves 2000).

De igual forma, os extratos oriundos de extração em acetato de etila da folha,

casca do caule, casca da raiz e flor apresentaram halos da ordem de 22 mm para a folha

e de 16 mm para os extratos restantes (Gráficos 2 e 4).

Cabe destacar também que no caso da casca da raiz houve uma diferença para o

extratos metanólicos e acetato de etila, com referência aos dois clones mais resistentes

(S. aureus MRSA AM-594 e AM-723), para os quais, o extrato da casca da raiz extraído

em acetato de etila não apresentou atividade. Segundo Lenette (1987), isto pode ser

devido a polaridade dos constituintes do extrato, o que dificulta a difusão destes em

meio aquoso.

Os halos mais expressivos tanto nas concentrações de 10 ou de 5 mg / poço

foram aqueles do extrato metanólico da folha (BFM), cuja explicação pode ser

justificada, pela presença de três polifenois visualizados na bioautografia (Figura 1;

Tabela 10) Rf: 0,58 - ácido gálico; Rf: 0,84 - ácido elágico; e mais um no Rf: 0,34, que

foram caracterizados, por padrões revelados com Alumen de Ferro 1%. Todas as outras

partes da planta também evidenciaram a presença de ácido gálico e ácido elágico, mas


não o outro polifenol, ainda não identificado (Rf: 0,34). Outros metabólitos com

atividade antimicrobiana nos Rfs: 0,27 e 0,44 estão presentes em três extratos BFLM,

BCM e BCA. O polifenol visualizado no Rf: 0,62 obteve maior zona de inibição no

extrato da casca do caule extração em acetato de etila (BCA), que no BCM, sendo que

ainda está presente na flor e casca da raiz de Schinopsis brasiliensis, este foi

caracterizado como um flavonóide através de CCD (Tabela 2), por observação direta e

também do revelado sob luz UV (354-366 nm) de suas características colorimétricas.

Os halos produzidos pelo antibiótico tetraciclina, confirmam o fenótipo de

resistência dos clones testados, ou seja, Staphylococcus aureus MRSA (AM 594, AM

723 e AM 942) resistentes à tetraciclina tiveram halos da ordem de 13 mm ou inferior e

as cepas S. aureus MRSA AM 922 e S. aureus ATCC 6538 sensíveis à tetraciclina

apresentaram halos da ordem de 26 mm.

Finalmente em todos os gráficos observou-se que os dois diluentes DMSO à

50% e Tween 80 à 4% não apresentaram inibição.

Os dados apresentados foram médias de duas determinações.

Quanto às CMI, na análise dos resultados observa-se no caso dos

Staphylococcus aureus MRSA Clone Epidêmico Brasileiro (Tabela 3 e Tabela 4),

alguns dos extratos metanólicos (BRM, BFLM) apresentaram valores de 0,125 mg.ml-1

e 0,5 mg.ml-1. O extrato da casca do caule apresentou valores de CMI semelhante, da

ordem de 0,5 mg.ml-1.

Os valores das CMI para os cinco Clones Pediátricos (Tabela 5 e Tabela 6)

foram de 0,125 mg.ml-1 à 0,25 mg.ml-1 para o extrato da flor extração em metanol

(BFLM) quanto que no extrato por extração em acetato de etila indicaram uma menor

atividade.


Nas Tabelas 7 e 8 onde figuram as CMI para os quatro Clones Esporádicos, o

extrato da flor da Braúna extração em metanol (BFLM) apresentou boa atividade com

concentrações de 0,25 e 0,5 mg.ml-1.

Os valores das CMI dos antibióticos Oxacilina e Tetraciclina confirmaram para

o primeiro o caráter MRSA ou MSSA das cepas de Staphylococcus aureus e no caso da

tetraciclina o fenótipo de resistência.

Referente aos diluentes DMSO à 50% e Tween 80 à 4% não apresentam

nenhuma inibição, crescendo as 22 cepas semeadas, confirmando dados indicados já

para o DMSO por Sakagami (2005).

A pesquisa fitoquímica permitiu evidenciar a presença de substâncias como:

flavonóides (agliconas de flavonóides), ácido gálico, ácido elágico, β-sitosterol e

derivados cinâmicos para todos os extratos.

Outros componentes ainda identificados foram catequina e leucoantocianidinas

no endocarpo do fruto, β-amirina presente na folha, quercetina no exocarpo do fruto,

canferol detectado na casca da raiz e finalmente proantocianidinas condensadas e

taninos catéquicos encontradas na casca do caule, casca da raiz e endocarpo do fruto e

ainda flavanona na casca do caule e da raiz e flor, confirmando assim com os dados da

literatura (Cardoso 2001).

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Tabela 1. Cepas de Staphylococcus aureus utilizadas nos ensaios de atividade antimicrobianas, isolados clínicos e padrões.S. aureus Perfil Clone Origem

AM 594 MRSA* F Ponta de Cateter AM 599 MRSA B3 Secreção de Úlcera AM 642 MRSA B5 Secreção AM 723 MRSA A1 Ponta de Cateter AM 771 MRSA B2 Secreção de Cateter AM 791 MRSA A8 Secreção de Saída Tenckoff AM 793 MRSA A1 Secreção Traqueal AM 799 MRSA A5 Ponta Sonda Vesical AM 837 MRSA A7 Ponta de Cateter AM 858 MRSA A13 Ponta de Cateter AM 872 MRSA G Urina AM 875 MRSA D Hemocultura AM 876 MRSA I Hemocultura AM 895 MRSA A6 Hemocultura AM 902 MRSA A2 Secreção de Orifício AM 922 MRSA B6 Ferida Perna Esq. AM 942 MRSA B4 Hemocultura AM 948 MRSA A9 Ponta de Cateter AM 632 MSSA** - Ferida Operatória AM 672 MSSA - Secreção de Cateter Cepas Padrão Uso

AM 103 ATCC 6538 Teste em conservantes de colírio AM 106 ATCC 6538P Dosagem de Penicilina AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE ATCC: American Type Culture Collection. Clone A: Clone Epidêmico Brasileiro (CEB); Clone I, D, G, F: Clone Esporádico; Clone B: Clone Pediátrico. * MRSA : Staphylococcus aureus Meticilina Resistente. ** MSSA : Staphylococcus aureus Meticilina Sensível.


TABELA 2. Sistemas cromatográficos utilizados para screening fitoquímico de Schinopsis brasiliensis Engl.

Metabólitos Sistema de Eluição Revelador Referência

Alcalóides A Dragendorff WAGNER, 1984

Triterpenóides e Esteróides

B Liebermann Burchard HARBONE, 1998

Iridóides A Vanilina Sulfúrica WAGNER, 1984

Saponinas A Anisaldeído WAGNER, 1996

Açúcares C Trifeniltetrazólio WALLENFELS, 1950

Cumarinas D U.V WAGNER, 1996

Derivados Cinâmicos A NEU WAGNER, 1996

Flavonoides A NEU WAGNER, 1984

MARKHAM, 1982 Fenilpropanoglicosídeos A NEU WAGNER, 1996

Proantocianidinas Condensadas e

Leucoantocianidinas A Vanilina Clorídrica ROBERTSON, 1956

A-EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 11 : 11 : 26 v/v) B- EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v/v) C- n-BuOH-Me2CO-Buffer Phosphate pH = 5,0 (40 : 50 : 10 v/v) D- Et2O-toluene-AcOH 10 % (50 : 50 : 50 v/v) NEU – 2- Aninoetildifenil borinato


Halos (mm)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

BFM BCM BRM BFLM BCVM BPVM BSM TT DMSO50%

Baraúna extrato metanólico - Concentração 10 mg / p oço

AM 594 - Clone Esporádico

AM 723 - Clone Epidêmico Brasileiro

AM 922 - Clone Pediátrico


AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 1. Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus Técnica de poço/difusão em agar M: Metanol; F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; FL: Flor; EX: Exocarpo do fruto; EN: Endocarpo do fruto; S: Semente AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Halos (mm)

0

24

68

10

1214

1618

20

2224

2628

30

BFA BCA BRA BFLA TT Tw een80 4%Baraúna ext. acetato de etila - Conc. 10 mg / poço





AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 2. Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus Técnica de poço/difusão em agar A: Acetato de etila; F: Folha; C: Casca do caule; R: Casca da Raiz; FL: Flor. AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Halos (mm)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

BFM BCM BRM BFLM BCVM BPVM BSM TT DMSO50%

Baraúna extrato metanólico - Concentração 5 mg / po ço





AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 3. Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus Técnica de poço/difusão em agar M: Metanol; F: Folha; C: Casca do caule; R: Casca da Raiz; FL: Flor; EX: Exocarpo do fruto; EN: Endocarpo do fruto; S: Semente AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Halos (mm)

02468

1012141618202224262830

BFA BCA BRA BFLA TT Tween80 4%Baraúna ext. acetato de etila - Conc. 5 mg / poço





AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 4. Atividade antimicrobiana de Schinopsis brasiliensis frente a S. aureus Técnica de poço/difusão em agar A: Acetato de etila; F: Folha; C: Casca do caule; R: Casca da Raiz; FL: Flor. AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 3: Atividade antimicrobiana (dos extratos extraídos em metanol) de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (CEB)

Extratos de extração em MeOH*** Antibióticos**** CEPAS (BEC) BFM BCM BRM BFLM BENM BEXM BSM Tet Oxa Sensível Resistente

AM# 723 1* 1 1 0,25 1 NT NT 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 791 0,5 0,5 0,5 0,25 >2 2 1 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 793 0,5 0,5 0,5 2 >2 2 >2 >0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 799 0,5 0,5 0,125 0,5 >2 2 >2 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 837 1 1 0,5 2 >2 >2 >2 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8AM 858 0,5 0,25 NT** 0,25 1 2 2 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 895 0,5 0,5 0,125 0,125 0,5 >2 >2 0,064 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 902 1 1 2 >2 >2 >2 >2 >0,064 0,032 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 948 0,5 0,5 0,5 NT NT 1 >2 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

* CMI em mg.ml-1. ** NT – Não testado *** BFM (Baraúna Folha Metanol); BFLM (Baraúna Flor Metanol); BCM (Baraúna Casca do caule Metanol); BRM (Baraúna Casca da Raiz Metanol); BEXM (Baraúna Exocarpo do fruto Metanol); BENM (BaraúnaEndocarpo do fruto Metanol), BSM (Baraúna Semente Metanol). **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 4: Atividade antimicrobiana (dos extratos extraídos em acetato de etila) de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC)

Extratos de Extração*** em Acetato de Etila Antibióticos**** CEPAS

BFA BCA BRA BFLA Tet Oxa Sensível Resistente AM# 723 >2* NT >2 2 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 791 1 0,5 >2 2 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 793 2 0,5 >2 2 >0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 799 2 0,5 1 2 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 837 NT** 0,5 NT NT 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 858 NT 0,5 NT NT 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 895 2 0,25 >2 2 0,064 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 902 NT 0,5 NT NT >0,064 0,032 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 948 2 0,5 >2 >2 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

* CMI em mg.ml-1. ** NT – Não testado *** BFA (Baraúna Folha em Acetato de etila) BCA (Baraúna Casca do caule em Acetato de etila); BRA (Baraúna casca da Raiz em Acetato de etila); BFLA (Baraúna Flor Acetato de etila); **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 5: Atividade antimicrobiana (dos extratos extraídos em metanol) de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico

Extratos de extração em MeOH*** Antibióticos**** CEPAS BFM BCM BRM BFLM BENM BEXM BSM Tet Oxa Sensível Resistente

AM# 599 1* 0,5 1 0,25 >2 >2 >2 0,001 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 642 1 1 1 0,5 >2 NT** NT 0,0005 0,032 1, 7, 5, 4 3, 2, 6, 8 AM 771 0,5 0,5 0,5 0,25 2 >2 0,5 0,0005 0,032 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 922 1 1 1 2 >2 >2 2 0,002 0,064 1, 2, 3, 4, 7 6, 8, 5 AM 942 0,5 1 0,5 0,125 0,5 NT NT 0,032 0,016 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8

* CMI em mg.ml-1. ** NT – Não testado *** BFM (Baraúna Folha Metanol); BFLM (Baraúna Flor Metanol); BCM (Baraúna Casca do caule Metanol); BRM (Baraúna Casca da Raiz Metanol); BEXM (Baraúna Exocarpo do fruto Metanol); BENM (BaraúnaEndocarpo do fruto Metanol), BSM (Baraúna Semente Metanol). **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 6: Atividade antimicrobiana (dos extratos extraídos em acetato de etila) de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Pediátrico

Extratos de Extração*** em Acetato de Etila Antibióticos****

CEPAS BFA BCA BRA BFLA TT OXA Sensível Resistente AM# 599 2* 0,5 >2 >2 0,001 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 642 >2 NT** >2 >2 0,0005 0,032 1, 7, 5, 4 3, 2, 6, 8 AM 771 2 0,5 >2 2 0,0005 0,032 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 922 2 1 >2 >2 0,002 0,064 1, 2, 3, 4, 7 6, 8, 5 AM 942 >2 NT >2 >2 0,032 0,016 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8

* CMI em mg.ml-1. ** NT – Não testado *** BFA (Baraúna Folha Acetato de etila) BCA (Baraúna Casca do caule em Acetato de etila); BRA (Baraúna casca da Raiz em Acetato de etila); BFLA (Baraúna Flor Acetato de etila); **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5)- Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 7: Atividade antimicrobiana (dos extratos extraídos em metanol) de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC

Extratos de Extração em MeOH*** Antibióticos**** CEPAS BFM BCM BRM BFLM BENM BEXM BSM TT OXA Sensível Resistente

AM# 594 1* 0,5 1 0,5 >2 >2 >2 0,032 0,256 1 3, 4, 6, 2, 7, 5, 8 AM 872 1 1 1 0,25 >2 >2 >2 0,016 0,128 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8 AM 875 1 1 0,5 2 >2 2 >2 0,0005 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 876 1 0,5 0,5 0,5 1 >2 >2 0,002 0,032 1, 2, 3, 4, 7, 5 6, 8 AM 632 1 1 1 0,5 2 >2 >2 0,001 0,000125 1, 4, 6, 2, 7, 5 8, 3 AM 672 NT** NT NT 0,5 2 >2 >2 0,001 0,000125 1, 2, 3, 4, 6, 7 5, 8 AM 103 0,5 1 0,5 0,5 2 1 >2 0,00025 0,000062 Padrão ATCC 6538 AM 106 0,125 1 0,5 0,25 2 NT >2 0,00025 0,000125 Padrão ATCC 6538P

* CMI em mg.ml-1. ** NT – Não testado *** BFM (Baraúna Folha Metanol); BFLM (Baraúna Flor Metanol); BCM (Baraúna Casca do caule Metanol); BRM (Baraúna Casca da Raiz Metanol); BEXM (Baraúna Exocarpo do fruto Metanol); BENM (Baraúna Endocarpo do fruto Metanol), BSM (Baraúna Semente Metanol). **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 8: Atividade antimicrobiana (dos extratos extraídos em acetato de etila) de Schinopsis brasiliensis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC

Extratos de Extração ** em Acetato de Etila Antibióticos***

CEPAS BFA BCA BRA BFLA TT OXA Sensível Resistente

AM# 594 2* 0,25 >2 >2 0,032 0,256 1 3, 4, 6, 2, 7, 5, 8 AM 872 >2 1 >2 2 0,016 0,128 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8 AM 875 2 1 >2 >2 0,0005 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 876 2 0,5 >2 2 0,002 0,032 1, 2, 3, 4, 7, 5 6, 8 AM 632 >2 0,5 >2 >2 0,001 0,000125 1, 4, 6, 2, 7, 5 8, 3 AM 672 2 0,5 >2 2 0,001 0,000125 1, 3, 4, 6, 2, 7 5, 8 AM 103 2 0,25 >2 >2 0,00025 0,000062 Padrão ATCC 6538 AM 106 2 0,5 >2 >2 0,00025 0,000125 Padrão ATCC 6538P

CMI em mg.ml-1

** BFA (Baraúna Folha Acetato de etila) BCA (Baraúna Casca do caule em Acetato de etila); BRA(Baraúna casca da Raiz em Acetato de etila); BFLA (Baraúna Flor Acetato de etila); **** (1) - Vancomicina,(2) - Ciprofloxacina, (3): Eritromicina, (4): Tetraciclina, (5): Gentamicina, (6): Oxacilina, (7): Sulfametoxazol/Trimetroprima, (8): Penicilina.


Tabela 9. Metabólitos secundários de Schinopsis brasiliensis de reconhecida atividade antimicrobiana Schinopsis brasiliensis (MeOH)

Metabólitos secundários Folha

Casca do Caule

Casca da Raiz

Endocarpo do Fruto

Exocarpo do fruto Semente Flor

Referência

β-Amirina + (-) (-) (-) (-) (-) + Morales, 2003

β-Sitosterol + + + + + + + Virtuoso, 2005 Derivados Cinâmicos

+ + + + + + + Almeida, 2002

Flavanona (-) + + (-) (-) (-) + Bylka, 2004

Agliconas de Flavonóides

+ + + + + + + Bylka, 2004

Quercetina (-) (-) (-) (-) + (-) (-) Bylka, 2004

Canferol (-) (-) + (-) (-) (-) (-) Bylka, 2004

Proantocianidinas Condensadas

(-) + + + (-) (-) (-) Hatano, 2005

Catequina (-) (-) (-) + (-) (-) (-) Cowan, 1999

Ácido Gálico + + + + + + + Akiyama,2001

Ácido Elágico + + + + + + + Vattem, 2005

Taninos Catequicos (-) + + + (-) (-) (-) Cowan, 1999 + : Metabólito Presente; (-):Metabólito Ausente


Tabela 10. Valores dos Rfs, referente às zonas de inibição dos extratos de Schinopsis brasiliensis obtidos nas bioautografias em CCD, frentes a S. aureus ATCC 6538.

Sistema Extrato Rf

BFM 0,34* 0,58 0,84 BCM 0,18 0,27 0,44 0,62BFLM 0,12 0,27 0,44

AcOEt/HCOOH/AcOH/H2O (100:11:11:27)

BCA 0,27 0,44 0,62 0,78 0,90 BFLA 0,58 0,8 0,90 AcOEt/HCOOH/AcOH/H2O

(100:2:2:2 e 100:3:3:3) BFA 0,76 0,86 0,96 * Leituras de Rf .


Figura 1. Bioautografia dos extratos de Schinopsis brasiliensis (BFM, BCM, BFLM e BCA). BFM: Baraúna folha extraído metanol; BFLM: Baraúna flor extraído metanol; BCM: Baraúna casca do caule extraído metanol;; BCA: Baraúna casca do caule extraído em acetato de etila;


Figura 2. Bioautografia de Schinopsis brasiliensis extratos BFA e BFLA.BFA: Baraúna Folha extraído em acetato de etila; BFLA: Baraúna flor extraído em acetato de etila

7.4. Apêndice - Artigo IV Artigo a ser submetido à Brazilian J. Microbiology


Determinação da atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis Tull.

(Fabaceae) frente a cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistentes

Saraiva, A. M., Saraiva, C. L., Gonçalves, A. M., Soares, R. R., Sena Filho, J. G.,

Mendes, F. O., Cordeiro, R. P., Xavier, H. S., Caetano, N.

1Laboratório de Análises Microbiológicas, Departamento de Ciências Farmacêuticas,

Universidade Federal de Pernambuco, 50740-52,1 Recife, PE, Brazil

2Laboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade

Federal de Pernambuco, 50740-521, Recife, PE, Brazil,

Resumo

A determinação da atividade antimicrobiana dos extratos metanólicos e em acetato de etila da

folha, casca do caule, casca da raiz, flor, fruto e semente de Caesalpinia pyramidalis Tull.

(Catingueira), foi realizada frente às cepas de Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes

(9 isolados pertencentes ao Clone Epidêmico Brasileiro, 5 isolados correspondentes ao Clone

Pediátrico, 4 isolados de Clone Esporádico), dois isolados S. aureus MSSA e duas cepas

padrões, pelas técnicas de poço / difusão em agar e determinação das CMI pelo método de

diluição em agar / multiinoculador de Stears. O extrato metanólico de casca da raiz indicou

uma boa atividade, com CMI inferior a 0,5 mg.mL-1. Os extratos secos por extração em

acetato de etila apresentaram menor atividade que poderia explicar-se por problemas de

solubilidade e menor difusão no meio de cultura em agar. Resultados das bioautografias

confirmaram zonas de inibição correspondente às substâncias ativas presente na folha, como

também na flor da C. pyramidalis. No estudo fitoquímico dos extratos, evidenciou a presença


de vários constituintes com reconhecida atividade antimicrobiana, são eles: ácido ursólico,

quercetina, catequina, ácido elágico, β-sitosterol, vários flavonóides, proantocianidinas e

ácido gálico. Entre todos os metabólitos citados, somente o ultimo, não está presente na casca

da raiz de C. pyramidalis.

Palavras Chaves: Caesalpinia pyramidalis, Atividade Antimicrobiana, Staphylococcus aureus

MRSA Multirresistente, Clone Epidêmico Brasileiro, Clone Pediátrico, Clone esporádico,

Bioautografia.

Abstract

The determination of the antimicrobial activity of dry methanolic and ethyl acetate extracts of

the leaf, bark of the stem, peel of the root, flower, fruit and seed of Caesalpinia pyramidalis

Tull. (Catingueira), was realized against Staphylococcus aureus MRSA multirresistentes

strains (9 isolates belonging to the Brazilian Epidemic Clone strain, 5 isolates corresponding

to the Pediatric Clone strain, 4 isolates of Sporadic Clone strain), two S. aureus MSSA

isolates and two standard international strains, by the agar diffusion well technique and CMI

determination by the agar dilution method using Stears’s multiinoculator. The dry methanolic

extract of root indicated a good antimicrobial activity with CMI less than 0,5 mg.mL-1. The

dry ethyl acetate extracts presented smaller antimicrobial activity that could be explained by

solubility problems and smaller diffusion in the agar medium. Results of the bioautographies

confirmed inhibition zones that correspond to the active substances present in the leaf, as well

as in the flower of C. pyramidalis. In the phytochemical study of the extracts, the presence of

several constituent with recognized antimicrobial activity was evidenced, they are: ursolic

acid, quercetin, catechin, ellagic acid, β-sitosterol, some flavonoids, proanthocianidines and


gallic acid. Among all of them, only the last one is not present in the peel of the root of C.

pyramidalis.

Key Words: Caesalpinia pyramidalis, Antimicrobial activity, Multiresistant MRSA

Staphylococcus aureus, Brazilian Epidemic Clone, Pediatric Clone, Sporadic Clone,

Bioautography

INTRODUÇÃO

A importância das infecções nosocomiais produzidas por Staphylococcus aureus,

principalmente S. aureus Meticilina Resistente (MRSA), é bem reconhecida pela sua

freqüência, morbidade, mortalidade e principalmente pela dificuldade de tratamento

(NASCIMENTO, 2000). Virtualmente as cepas de MRSA estão resistentes a todos os β-

lactâmico, macrolídeos, tetraciclina, aminoglicosídeos, sendo os dois glicopeptídeos

(vancomicina e teicoplamina), a única alternativa de tratamento clinico destas infecções por S.

aureus MRSA multirresistentes (SHIBATA, 2005). Recentemente, porém, S. aureus com

susceptibilidade intermediária à vancomicina (VISA) ou S. aureus glicopeptídeos

intermediários (GISA) têm sido isolados em diversos países. Posteriormente, cepas de S.

aureus resistentes a vancomicina (VRSA), tem também emergido com um mecanismo de

resistência claramente distinto daqueles das cepas VISA (NISHI, 2004).

No Brasil, os S. aureus são os microorganismos mais freqüentemente isolados e sua

prevalência de em maior proporção a nível hospitalar (TAVARES, 2000). Os resultados

obtidos de isolados oriundos das infecções hospitalares, a prevalência de cepas MRSA variam

de 40 a 80% nos hospitais brasileiros. Estes isolados são geralmente resistentes a múltiplos


antibióticos (aminoglicosídeos, cloranfenicol, tetraciclina, lincosamidas, macrolídeos,

quinolonas, sulfametoxazol/trimetoprima), com susceptibilidade a rifampicina.

Assim estudos realizados no Brasil descreveram um clone de Staphylococcus aureus

meticilina resistente (Clone Epidêmico Brasileiro – BEC) em hospitais do Sul, Sudeste, Norte

e Nordeste (TEIXEIRA, 1996; FIGUEIREDO, 1991), sendo que este clone se expandiu para

outros países da América Latina (Argentina, Chile, Uruguai) e também na Europa (Portugal,

Itália e República Tcheca) (OLIVEIRA, 2001; SOLA, 2002).

O crescimento da resistência bacteriana aos antibióticos é uma ameaça a população

mundial, aumentando as recorrências por doenças infecciosas, devido ao surgimento de

bactérias multirresistentes que dificulta o tratamento quimioterápico (AQIL, 2005). Por tudo

isso, é importante o estudo, realizado em vários países, dos mecanismos de resistência dos S.

aureus multirresistentes, tanto aos antibióticos, usados na clínica, quanto aos germicidas,

empregados na limpeza e descontaminação do ambiente hospitalar, visando ao entendimento

do processo, pelo qual, o S. aureus penetra e sobrevive neste, a fim de poder implementar

ações de controle das infecções. Sendo por isso, importante o estudo do genoma, dos fatores

de virulência das cepas de S. aureus MRSA multirresistente de origem hospitalar e

comunitária (LINDSAY, 2004), como também a descoberta de novos agentes antibacterianos

com mecanismo de ação diferente dos compostos existentes (BREITHANPT, 1999).

Dentre as fontes de novas moléculas de maior importância temos o Reino Vegetal por

sua diversidade e amplitude indivíduos ainda pouco estudados como por ser uma fonte

inesgotável de novos constituintes (DORMAN, 2000).

Quanto aos componentes com potenciais ações antibióticas, destacam-se os resultados

obtidos com: óleos essenciais ricos em mono e sesquiterpenos, alcalóides, ácidos fenólicos,

flavonóides, taninos, cumarinas, triterpenos, esteróides, entre outros que apresentam atividade

sobre o crescimento de bactérias Gram-positivas, bactérias Gram-negativas, Mycobacterium,


leveduras e fungos filamentosos (NEPOMUCENO, 2003 e CECHINEL FILHO, 1998). Os

compostos citados são encontrados em diversas plantas, mas a pesquisa de outros

constituintes é também essencial para a descoberta e desenvolvimento de novos fármacos

(BONJAR, 2004 e SIMÕES, 2002).

A Caesalpinia pyramidalis Tull. faz parte da família Leguminosae (Fabaceae), classe

Dicotiledoneae. Estas árvores são endêmicas do sertão Nordestino e conhecidas popularmente

por “Catingueira”, “Pau-de-Porco”, “Catinga de Porco”, “Pau-de-Rato” e “Mussitaiba”. Na

medicina popular as flores, folhas e cascas da catingueira são usadas no tratamento de

infecções catarrais, diarréias e disenterias (BRAGA, 1960), ainda relatam ação antipirética e

diurética (MENDES, 2000).

Alguns dos seus metabólitos tem sido isolados, como: fenilpropanoides, lupeol, β-

sitosterol, biflavonoides (agastiflavona, caesalflavona, podocarpusflavona), chalcona,

canferol, apigenina, lignana, galato de metila e estigamasterol (MENDES, 2000 e BAHIA,

2002). NOVAIS (2003) testando extratos oriundos de extração em acetato de etila a partir das

folhas e caule de C. pyramidalis Tull. frente a cepas de S. aureus e Escherichia coli pelo o

método de disco / difusão em agar, observando-se halos de inibição da ordem de 10 mm só

para a cepa de S. aureus. De outra parte, no Instituto de Antibiótico – UFPE, num screening

de plantas superiores, dentre estas, a C. pyramidalis, que foi estudada frente a sete cepas: S.

aureus, Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis, E. coli, Enterococcus faecalis, Candida

albicans e Neurospora crassa, verificando atividade somente sobre as três primeiras

(CHIAPPETA, 1984/5).

MATERIAIS E MÉTODOS

Coleta e identificação


A planta coletada na cidade de Carnaubeira da Penha, Sertão de Pernambuco, latitude:

08º19’09”, longitude: 38º44’41” e altitude: 446 metros, entre os meses de março e junho de

2004, foi identificada pela curadora do Herbário IPA, Dra. Rita de Cássia Pereira e depositada

neste, sob registro de n° 70.008.

Preparação dos extratos

Na determinação da atividade antimicrobiana da Caesalpinia pyramidalis Tull.,

Catingueira (C), foram realizados testes com diferentes partes da planta. Assim, para o estudo

material a fresco, da folha (CF), casca do caule (CC), casca da raiz (CR), flor (CFL), fruto

(CFR) e semente (CS) foram triturados, pesados e submetidos a três extrações sucessivas pelo

processo de infusão, em intervalos, em média de 72 horas, para cada solvente. A ordem dos

solventes foi n-hexano (H), seguido de acetato de etila (A) e por ultimo metanol (M). Os

extratos, assim obtidos, foram filtrados e levados à secura no rota-vapor, subseqüentemente

pesados e calculados os rendimentos.

Os extratos secos obtidos da extração metanólica foram ressuspendidos em

água/DMSO (1:1 v/v; DMSO à 50%) (SAKAGAMI, 2005) na concentração de 100 mg.mL-1

(Solução mãe). Os extratos secos obtidos por extração em acetato de etila e n-hexano foram,

por sua vez, ressuspendidos em água-Tween 80 (4,8: 0,2 v/v; Tween 80 à 4%) na

concentração de 100mg.mL-1.

Bactérias

No estudo foram utilizadas vinte e duas cepas de Staphylococcus aureus, das quais

vinte isolados clínicos e duas cepas padrões, apresentadas na Tabela 1.


Os S. aureus MRSA multirresistentes e S. aureus MSSA foram cepas da coleção do

Laboratório de Análise Microbiológica proveniente de um estudo do perfil de

susceptibilidade/resistência de S. aureus, no Recife-PE (CORDEIRO, 2004). Na determinação

de fenótipos de resistência foram escolhidos oito antibióticos: ciprofloxacino, penicilina,

vancomicina, gentamicina, oxacilina, sulfatrim, tetraciclina e eritromicina, conforme

indicação sugerida para informes com fins epidemiológico.

O caráter de MRSA ou MSSA foi confirmado pelas técnicas de antibiograma,

determinação das concentrações mínimas inibitórias (CMI) pelo método de multiinoculador

de Stears, E-test assim como a técnica de screening de oxacilina.

O caráter de MRSA e MSSA foi confirmado também pela amplificação do gene mecA

por PCR e da proteína PBP2a pelo teste de aglutinação em látex.

Num estudo conjunto com o grupo de Biologia Molecular da Profª. Dra. Agnes

Figueiredo da Universidade Federal do Rio de Janeiro foi realizado a análise de clonacidade

das cepas entre outras pela técnica de eletroforese em campo elétrica alternado (PFGE).

Os nove isolados de S. aureus MRSA multirresistentes pertencentes ao Clone

Epidêmico Brasileiro (BEC) foram só sensíveis ao glicopeptídeo vancomicina. (Tabela 3 e

Tabela 4).

Os cinco isolados correspondentes ao Clone Epidêmico Pediátrico apresentam uma

maior susceptibilidade aos antibióticos testados, alguns deles são principalmente resistentes

aos antibióticos oxacilina, penicilina, gentamicina e ocasionalmente eritromicina (Tabela 5 e

Tabela 6).

Os quatro isolados restantes correspondem a clones esporádicos, assim denominados

pela sua relativa pouca freqüência. As duas cepas MSSA foram só resistentes à Penicilina e

aos antibióticos eritromicina ou gentamicina (Tabela 7 e Tabela 8).


Tabela 1

Preparação dos inóculos

Os inóculos foram preparados a partir das colônias de culturas de 24h de

Staphylococcus aureus em ágar Muller-Hinton (MH), e suspendidos em soro fisiológico

estéril, comparando as turvações com o tubo 0,5 da escala MacFarland (108 UFC/ml)

(NCCLS, 2003).

Técnica Poços / Difusão em agar

O semeio das bactérias foi realizado com swab de algodão estéril em placas de Petri

contendo 20 ml de agar Muller-Hinton, procedendo subseqüentemente à perfuração dos poços

(perfurador de 6 mm de diâmetro), e aplicado os extratos com pipeta automática (100 µl por

poço), nas concentrações de 100 mg.mL-1 e 50 mg.mL-1 para os extratos brutos e para a

tetraciclina padrão na concentração de 300 µg.mL-1. Após incubação à 36 °C ±1 por 24 horas,

os resultados dos produtos testados foram avaliados conforme o diâmetro dos halos, pelo

seguinte parâmetro: halos < 9 mm, inativo; 9-12 mm, pouco ativo; 13-18 mm, ativo; > 18

mm, muito ativo (ALVES, 2000).

Determinação da Concentração Mínima Inibitória

Na determinação da concentração mínima inibitória para os extratos secos da extração

metanólica, a partir de uma solução mãe de 20 mg.mL-1 foram feitas diluições em água nas

concentrações de 312,5 µg.mL-1 à 20.103 µg.mL-1 e incorporadas no Agar Muller Hinton (1:9)

ficando assim concentrações finais de 31,5 µg.mL-1 a 2000 µg.mL-1 dos extratos. Neste teste


os antibióticos padrões usados foram tetraciclina e oxacilina (Sigma), nas concentrações

indicadas pelas normas NCCLS (2003) em agar Muller Hinton e agar Muller Hinton agregado

com 2% cloreto de sódio para oxacilina.

Com uma pipeta automática de 100 µl foram distribuídos assepticamente os 22

inóculos no Multiinoculador de Stears, e as placas de Petri inoculadas então na superfície do

meio, incubando-se a 36ºC ± 1 por 24h.

Foram feitos controles em duplicata no início e no final do processo, em meio ágar

Muller-Hinton (controle de cepas) e controle dos diluentes (Tween 80 à 4% e DMSO à

50%).

Os resultados são lidos comparativamente aos controles de cepas e determinados pela

primeira placa, cuja concentração iniba o crescimento.

Cromatografia em Camada Delgada (CCD) / Estudo Fitoquímico

As placas cromatográficas de Sílica-Gel usadas foram GF254 (Merck), 20 x 20 cm com

1 mm de espessura. Os extratos metanólicos ou aqueles em acetato de etila da folha e da flor

de Caesalpinia pyramidalis foram aplicados na concentração de 20 mg.mL-1 usando um

capilar analítico (15µl). A fase móvel para os extratos metanólicos foi o sistema

cromatográfico (1): AcOEt/MeOH/H2O (81:11:08) e para os correspondentes em acetato de

etila usou-se o sistema (2): AcOEt/HCOOH/AcOH/H2O (100:2:2:2 e 100:3:3:3). As placas

cromatográficas foram eluídas em duplicata, sendo uma usada como referência

cromatográfica e a segunda para bioautografia.

No estudo fitoquímico foram utilizados como padrões: ácido gálico; ácido elágico;

quercetina; canferol, catequina; ácido ursólico; β-sitosterol, β-amirina, pilocarpina, Iridóides,

glicose.


Na placa cromatográfica as bandas foram visualizados sob luz UV (254 e 366 nm),

então reveladas conforme a Tabela 2.

Tabela 2

Bioautografia

As placas desenvolvidas pelo sistema (1) foram secas em corrente de ar por 5 minutos,

e aquelas desenvolvidas no sistema (2) ficaram sob corrente de ar por 6h, numa capela de

fluxo laminar. As placas cromatográficas foram instaladas, cada uma, numa placa de Petri (12

cm de diâmetro) e recobertas com 20 ml meio fundido de agar Muller Hinton (45 ºC)

inoculado com uma suspensão salina de S. aureus ATCC 6538 (18 ml de meio agar Muller

Hinton + 2 ml da suspensão bacteriana à 108 UFC/ml), distribuído homogeneamente por toda

a placa. Após solidificação houve um tempo de pré-difusão de 30 minutos à temperatura

ambiente (25º C) para à difusão dos compostos ativos, levando então a placa a incubar por 24

horas a 36±1ºC. Após este período a bioautografia foi revelada com uma solução de 2,3,5-

trifeniltetrazólio (TTC) à 2,5mg.mL-1 e novamente incubada por 4 horas.

A presença de zona de inibição indica a existência de composto ativo (PESSINI,

2003).

RESULTADOS

Atividade Antimicrobiana

Os resultados dos extratos metanólicos da Caesalpinia pyramidalis frente aos quatro

isolados clínicos e uma cepa padrão (ATCC 6538) de Staphylococcus aureus são


apresentados no gráfico 1 (concentração de 10 mg/100 µl) e Gráfico 3 (concentração de 5

mg/100 µl). Os correspondentes dados para os extratos de extração em acetato de etila são

apresentados nos Gráficos 2 e 4. Os extratos hexânicos não apresentaram atividade.Os

diâmetros dos halos expressos em milímetros são representados na forma de colunas para

cada extrato e bactéria.

Os resultados das concentrações mínimas inibitórias são expressas em mg.mL-1 e

apresentadas nas Tabelas 3, 5 e 7 para os extratos metanólicos e Tabelas 4, 6 e 8 para os

extratos em acetato de etila.

As leituras dos CMI foram apresentados em bloco separados pelos tipos de clones de

Staphylococcus aureus MRSA multirresistente desta forma nas Tabelas 3 e 4 figuram os

resultados para os clones Epidêmicos Brasileiros nas Tabelas 5 e 6 os correspondentes para os

clones Pediátricos e finalmente nas Tabelas 7 e 8, os valores dos CMI para quatro clones

multirresistentes esporádicos, as duas cepas de Staphylococcus aureus MSSA e as cepas

padrões.

Gráfico 1

Gráfico 2

Gráfico 3

Gráfico 4

Tabela 3

Tabela 4

Tabela 5

Tabela 6

Tabela 7

Tabela 8


Bioautografia e Estudo Fitoquímico

Nas bioautografias em CCD realizados para os extratos de Catingueira folha, flor

extração em metanol e acetato de etila, observaram-se zonas de inibição em todos os extratos

testados (Figura 1 e 2).

Tabela 9

Figuras 1 Figura 2

Estudo fitoquímico

Os metabólitos secundários, com reconhecida atividade antimicrobiana, são

apresentados na tabela 10.

Tabela 10

DISCUSSÃO

Das duas metodologias utilizadas para determinação da atividade antimicrobiana, a

técnica de poços/difusão em agar apesar de empregar volumes maiores (100 µl) (CAETANO,

2001), em relação aos empregados nos discos (10µl) (VORAVUTHIKUNCHAI, 2005), tem a

vantagem de possibilitar o emprego de adjuvantes de dissolução e permitir uma difusão tanto

radial como da superfície, condições estas que resultam em melhores zonas de inibição.

Quanto às cinco cepas de Staphylococcus aureus escolhidas no estudo representam,

quatro delas, os três tipos de clones MRSA multirresistente junto com a cepa padrão.

Pelo Gráfico 1, o extrato seco da flor extração em metanol (CFLM) mostrou os

maiores halos de inibição frente as cinco cepas testadas, dando valores da ordem de 22 mm,

na maior concentração ( 10mg/poço) que corresponderia à classificação de muito ativo,


enquanto que para as concentrações de 5mg, aparecem halos da ordem de 16 mm, tendo

também boa atividade os extratos da folha, casca da raiz, fruto e semente.

De igual forma os extratos oriundos de extração em acetato de etila, em geral,

obtiveram halos menores em comparação com aqueles extraídos com metanol. Este fato pode

ser devido às características de polaridade de seus constituintes, que resulta uma menor

difusão em meio aquoso, produzindo por tanto menores zonas de inibição, mesmo tendo

substâncias com atividade antimicrobiana.

Assim observando o Gráfico 2, dos correspondentes extratos, (folha, casca do caule,

casca da raiz, fruto e semente) em acetato de etila, em quanto que o extrato de raiz produz

halos da ordem de 20 mm, o extrato da folha não evidenciou atividade exceto sobre cepa

padrão (ATCC 6538). Experimentalmente, essa diferença pode explicar-se porque o extrato

seco da raiz apresentou-se como um pó enquanto que aquele da folha tinha uma consistência

pastosa que dificultou sua solubilidade.

Os halos produzidos pelo antibiótico padrão, tetraciclina, confirmam o fenótipo de

resistência dos clones testados, ou seja, Staphylococcus aureus MRSA AM 594, S. aureus

AM 723 e S. aureus AM 942 resistentes a tetraciclina tiveram halos da ordem de 13 mm ou

inferior e as cepas S. aureus MRSA AM 922 e S. aureus ATCC 6538 sensíveis à tetraciclina

apresentaram halos da ordem de 26 mm.

Finalmente em todos os gráficos observou-se que os dois diluentes DMSO à 50% e

Tween 80 à 4% não apresentaram inibição.

Os dados apresentados foram médias de duas determinações.

De outra parte, a presença de substâncias ativas tanto na folha como na flor para

ambos tipos de extratos ficou evidenciado nos resultados das bioautografias (Tabela 9 e

Figura 1 e 2).


A técnica de bioautografia (Do Amaral, 2003) permite detectar as zonas de inibição no

cromatograma assim em nosso estudo o bioautograma revelou a presença de substâncias

ativas frente à cepa de S. aureus ATCC 6538 entre os Rf: 0,48 para o extrato metanólico da

flor de Catingueira os Rf: 0,55 para extrato metanólico da folha de Catingueira (Figura 1). Da

mesma forma, para os extratos em acetato de etila, evidenciou-se a presença de zonas de

inibição nos Rf:0,62, para o extrato da flor e Rf: 0,51, Rf: 0,62, Rf: 0,80, e Rf: 0,94 para a

folha de Catingueira (Figura 2).

O ensaio fitoquímico permitiu evidenciar a presença de substâncias como: flavonóides

(agliconas de flavonóides), β-sitosterol e derivados cinâmicos, para todos os extratos da

catingueira testados. No extrato da flor em metanol foi evidenciado também a presença de

ácido gálico, ácido elágico.

Outros compostos igualmente identificados foram polifenois (ácidos fenólicos) no

fruto, da casca do caule e da casca da raiz, ácido ursólico, quercetina e catequina (raiz e casca

do caule), confirmando assim dados da literatura (BAHIA, 2002; BAHIA, 2005).

Quanto às CMI, na análise dos resultados observa-se no caso dos S. aureus MRSA

Clone Epidêmico Brasileiro (Tabela 3 e Tabela 4), que alguns dos valores mostraram-se

inferiores à 0,5 mg.mL-1, tanto para os extratos de extração metanólica como por extração em

acetato de etila da casca da raiz.

Resultado semelhante houve para o extrato de extração metanólica da flor.

Os valores das CMI dos cinco Clones Pediátricos (Tabela 5 e Tabela 6) foram

novamente menores para os extratos de casca da raiz, tanto extração metanólica como do

acetato de etila na ordem de 0,25 mg.mL-1.

Nas Tabelas 7 e 8 onde figuram as CMI para os quatro Clones Esporádicos

conjuntamente com as das cepas sensíveis Staphylococcus aureus MSSA e as cepas padrões,

os extratos de raiz em acetato de etila apresentam alguns valores tão baixos como 0,125


mg.mL-1 sendo ainda inferiores a aqueles para as cepas MSSA (0,5 mg.mL-1) e padrões (0,25

mg.mL-1).

Os valores das CMI obtidos para os antibióticos Oxacilina e Tetraciclina confirmaram

para o primeiro o caráter MRSA ou MSSA das cepas deStaphylococcus aureus e no caso da

tetraciclina o fenótipo de resistência determinado.

Referente aos diluentes DMSO à 50% e Tween 80 à 4% não apresentam nenhuma

inibição, crescendo as 22 cepas semeadas, confirmando dados já indicados para o DMSO por

SAKAGAMI (2005).

AGRADECIMENTOS

A Profª. Dra. Agnes M. S. Figueiredo - Laboratório de Biologia Molecular de

Bactérias, Instituto de Microbiologia - UFRJ, Rio de Janeiro - RJ , Brasil.

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Tabela 1. Cepas de Staphylococcus aureusS. aureus Perfil Clone Origem AM 594 MRSA* F Ponta de Cateter AM 599 MRSA B3 Secreção de Úlcera AM 642 MRSA B5 Secreção AM 723 MRSA A1 Ponta de Cateter AM 771 MRSA B2 Secreção de Cateter AM 791 MRSA A8 Secreção de Saída Tenckoff AM 793 MRSA A1 Secreção Traqueal AM 799 MRSA A5 Ponta Sonda Vesical AM 837 MRSA A7 Ponta de Cateter AM 858 MRSA A13 Ponta de Cateter AM 872 MRSA G Urina AM 875 MRSA D Hemocultura AM 876 MRSA I Hemocultura AM 895 MRSA A6 Hemocultura AM 902 MRSA A2 Secreção de Orifício AM 922 MRSA B6 Ferida Perna Esq. AM 942 MRSA B4 Hemocultura AM 948 MRSA A9 Ponta de Cateter AM 632 MSSA** - Ferida Operatória AM 672 MSSA - Secreção de Cateter Cepas Padrão Uso

AM 103 ATCC 6538 Teste em conservantes de colírio

AM 106 ATCC 6538P Dosagem de Penicilina

AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE ATCC: American Type Culture Collection. Clone A: Clone Epidêmico Brasileiro (CEB); Clone I, D, G, F: Clone Esporádico; Clone B: Clone Pediátrico. * MRSA : Staphylococcus aureus Meticilina Resistente. ** MSSA : Staphylococcus aureus Meticilina Sensível.


TABELA 2. Sistemas cromatográficos utilizados para screening fitoquímico de Caesalpinia pyramidalis Tull.

Metabólitos Sistema de Eluição Revelador Referência Alcalóides A Dragendorff WAGNER, 1984

Triterpenóides e Esteróides B Liebermann Burchard HARBONE, 1998 Iridóides A Vanilina Sulfúrica WAGNER, 1984

Saponinas A Anisaldeído WAGNER, 1996 Açúcares C Trifeniltetrazólio METZ, 1961

Cumarinas D U.V WAGNER, 1996

Derivados Cinâmicos A NEU WAGNER, 1996

Flavonóides A NEU WAGNER, 1984

MARKHAM, 1982 Fenilpropanoglicosídeos A NEU WAGNER, 1996

Proantocianidinas Condensadas e Leucoantocianidinas A Vanilina Clorídrica ROBERTSON, 1956

A-EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 11 : 11 : 26 v/v) B- EtOAc–HCOOH–AcOH–H2O (100 : 0,5 : 0,5 : 0,5 v/v) C- n-BuOH-Me2CO-Buffer Phosphate pH = 5,0 (40 : 50 : 10 v/v) D- Et2O-toluene-AcOH 10 % (50 : 50 : 50 v/v) NEU – 2- Aninoetildifenil borinato


Halos (mm)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

CFM CCM CRM CFLM CVM CSM TT DMSO50%

Catingueira extrato metanólico - Concentração 10 mg / poço





AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 1. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S. aureus M: Metanol; F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; FL: Flor; V: Fruto ; S: Semente Técnica de poço/difusão em agar AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Halos (mm)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

CFA CCA CRA CVA TT Tw een 804%

Catingueira extrato em acetato de etila - Concentra ção 10 mg / poço





AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 2. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S. aureus A: Acetato de etila. F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; V: Fruto. Técnica de poço/difusão em agar AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Halos (mm)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

CFM CCM CRM CFLM CVM CSM TT DMSO50%

Catingueira extrato metanólico - Concentração 5 mg / poço





AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 3. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S. aureus M: Metanol; F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; FL: Flor; V: Fruto ; S: SementeTécnica de poço/difusão em agar AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Halos (mm)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

CFA CCA CRA CVA TT Tw een 804%

Catingueira extrato em acetato de etila - Concentra ção 5 mg / poço





AM 103 - ATCC 6538

Gráfico 4. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis frente a S. aureus A: Acetato de etila. F: Folha; C: Casca do Caule; R: Casca da Raiz; V: Fruto. Técnica de poço/difusão em agar AM: Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 3. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC)

Extratos da Planta em MeOH *** Antibióticos ***** CEPAS (CEB) CFM CCM CRM CFLM CFRM CSM Tet Oxa Sensível Resistente

AM# 723 1* 1 1 2 >2 >2 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 791 0,062 0,125 0,5 0,5 1 1 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 793 1 1 0,5 0,5 1 1 >0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 799 1 1 0,5 0,5 2 1 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 837 2 2 1 1 NT NT 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 858 1 1 0,25 1 NT NT 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 895 1 1 0,5 1 2 1 0,064 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 902 >2 >2 1 2 NT NT >0,064 0,032 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 948 NT** NT 0,5 0,5 2 >2 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

* CMI em mg.mL-1. ** NT – Não testado *** C (Catingueira) M: (Metanol); F (Folha), FL (Flor); C (Casca do caule); R (Casca da Raiz); FR (Fruto); S(Semente). **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 4. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Epidêmico Brasileiro (BEC)

Extratos de Extração em Acetato de Etila *** Antibióticos****

CEPAS CRA CFRA CCA Tet Oxa Sensível Resistente

AM# 723 2* >2 2 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 791 0,5 1 NT 0,032 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 793 0,25 1 >2 >0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 799 0,25 0,5 >2 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 837 NT NT 2 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 858 NT NT >2 0,032 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 895 0,25 1 NT 0,064 0,064 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 902 NT** NT 2 >0,064 0,032 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 AM 948 1 0,5 2 0,064 0,256 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8

* CMI em mg.mL-1. ** NT – Não testado *** C: (Catingueira); A: (Acetato de etila) C (Casca do caule); R (Casca da Raiz); FR(Fruto); **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 5. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico

Extratos de extração em MeOH ** Antibióticos*** CEPAS

CFM CCM CRM CFLM CFRM CSM Tet Oxa Sensível Resistente AM# 599 2* >2 1 1 2 2 0,001 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 642 2 2 1 1 2 1 0,0005 0,032 1, 7, 5, 4 3, 2, 6, 8 AM 771 2 1 0,5 0,5 >2 1 0,0005 0,032 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8AM 922 >2 1 1 1 1 2 0,002 0,064 1, 2, 3, 4, 7 6, 8, 5 AM 942 1 0,5 1 1 1 >2 0,032 0,016 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8

* CMI em mg.mL-1. *** C (Catingueira) M: (Metanol); F (Folha), FL (Flor); C (Casca do caule); R (Casca da Raiz); FR (Fruto); S (Semente). **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 6. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Pediátrico

Extratos de Extração em Acetato de Etila*** Antibióticos****

CEPAS CCA CRA CFRA Tet Oxa Sensível Resistente

AM# 599 NT** 1 >2 0,001 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 642 >2* 2 >2 0,0005 0,032 1, 7, 5, 4 3, 2, 6, 8 AM 771 NT 0,5 2 0,0005 0,032 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 922 2 1 2 0,002 0,064 1, 2, 3, 4, 7 6, 8, 5 AM 942 NT 2 2 0,032 0,016 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8

* CMI em mg.mL-1. ** NT – Não testado *** C: (Catingueira); A: (Acetato de etila) C (Casca do caule); R (Casca da Raiz); FR(Fruto); **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 7. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureusMRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC.

Extratos de extração em MeOH*** Antibióticos**** CEPAS

CFM CCM CRM CFLM CFRM CSM Tet Oxa Sensível Resistente AM# 594 0,5* 1 1 1 2 2 0,032 0,256 1 3, 4, 6, 2, 7, 5, 8 AM 872 >2 1 1 2 >2 >2 0,016 0,128 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8 AM 875 2 2 0,5 1 2 2 0,0005 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 876 2 2 0,5 0,5 2 1 0,002 0,032 1, 2, 3, 4, 7, 5 6, 8 AM 632 2 2 1 1 2 1 0,001 0,00013 1, 2, 6, 2, 7, 5 8, 3 AM 672 2 2 NT** NT >2 1 0,001 0,00013 1, 2, 3, 4, 6, 7 5, 8 AM 103 2 2 0,5 0,5 2 1 0,00025 0,00006 Padrão ATCC 6538 AM 106 2 1 0,5 1 2 0,5 0,00025 0,00013 Padrão ATCC 6538P

* CMI em mg.mL-1. ** NT – Não testado *** C (Catingueira) M: (Metanol); F (Folha), FL (Flor); C (Casca do caule); R (Casca da Raiz); FR (Fruto); S (Semente). **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 8. Atividade antimicrobiana de Caesalpinia pyramidalis sobre cepas de Staphylococcus aureus MRSA Multirresistente - Clone Esporádico, MSSA e Padrões ATCC

Extratos de *** Extração em Acetato

de Etila Antibióticos****

CEPAS

CCA CRA CFRA TT OXA Sensível Resistente AM# 594 >2* 0,125 1 0,032 0,256 1 3, 4, 6, 2, 7, 5, 8 AM 872 NT** 0,125 >2 0,016 0,0128 1, 2, 3, 5, 7 4, 6, 8 AM 875 NT 0,5 2 0,0005 0,016 1, 2, 4, 7, 5 3, 6, 8 AM 876 >2 0,5 2 0,002 0,032 1, 2, 3, 4, 7, 5 6, 8 AM 632 2 1 >2 0,001 0,00013 1, 2, 6, 2, 7, 5 3, 8 AM 672 2 0,5 >2 0,001 0,00013 1, 2, 3, 4, 6, 7 5, 8 AM 103 2 0,25 2 0,0003 0,00006 Padrão ATCC 6538 AM 106 >2 0,25 2 0,0003 0,00013 Padrão ATCC 6538P

* CMI em mg.mL-1. ** NT – Não testado *** C: (Catingueira); A: (Acetato de etila) C (Casca do caule); R (Casca da Raiz); FR (Fruto); **** (1) – Vancomicina; (2) – Ciprofloxacina; (3) - Eritromicina; (4) - Tetraciclina; (5) - Gentamicina; (6) - Oxacilina; (7) - Sulfametoxazol/Trimetroprima; (8) - Penicilina. # AM - Código da coleção do Laboratório de Análises Microbiológicas – Depto. de Ciências Farmacêuticas – UFPE


Tabela 9. Valores dos Rfs, referente às zonas de inibição dos extratos de Caesalpinia pyramidalis obtidos nas bioautografias em CCD, frentes a S. aureus ATCC 6538

Sistemas Cromatográficos Extrato Rfs

CFM 0,55* 0,84 0,94 AcOEt/MeOH/H2O (81:11:08) CFLM 0,19 0,29 0,48

CFA 0,51 0,62 0,80 0,94AcOEt/HCOOH/AcOH/H2O (100:2:2:2 e 100:3:3:3) CFLA 0,62

* Leituras de Rf AcOEt: acetato de etila, MeOH: Metanol, HCOOH: Ác. Fórmico, AcOH: Ac. Acético.


Figura 1. Bioautografia dos extratos de Caesalpinia pyramidalis

extrato de CFM e CFLM frente a S. aureus ATCC 6538.

CFM: Catingueira Folha extraído Metanol, CFLM: Catingueira Flor extraído

Metanol.


Figura 2. Bioautografia dos extratos de Caesalpinia pyramidalis

extrato de CFA e CFLA, frente a S. aureus ATCC 6538.

CFA: Catingueira Folha extraído em acetato de etila, CFLA: Catingueira Flor

extraído em acetato de etila.


Tabela 10. Metabólitos secundários de Caesalpinia pyramidalis de reconhecida atividade antimicrobiana.

Caesalpinia pyramidalis (MeOH)Metabólitos secundários Folha

Casca do

Caule

Casca da

Raiz Fruto Flor

REFERÊNCIA

Ácido Ursólico (-) (-) + (-) (-) Amorim, 2003 β-Sitosterol + + + + + Virtuoso, 2005 Derivados Cinâmicos

+ + + + + Almeida, 2002

Agliconas de Flavonóide

+ + + + + Bylka, 2004

Quercetina (-) (-) + (-) (-) Bylka, 2004 Proantocianidinas

Condensadas (-) + + (-) (-) Hatano, 2005

Catequina (-) + + (-) (-) Cowan, 1999

Ácido Gálico (-) (-) (-) + + Akiyama, 2001

Ácido Elágico (-) (-) + + + Vattem, 2005 + : Presença do metabólito. (-): Ausência do metabólito.

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