UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE VIVIANE CORREIA CAMPOS ALMEIDA · FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA

VIVIANE CORREIA CAMPOS ALMEIDA

FREQUÊNCIA DE DOENÇAS INFECCIOSAS E AVALIAÇÃO DA RESPOSTA

IMUNE HUMORAL E CELULAR EM ADULTOS NÃO TRATADOS COM

DEFICIÊNCIA CONGÊNITA E ISOLADA DE GH

ARACAJU

2016





Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira

Co-orientador: Prof. Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus

ARACAJU

2016

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA BISAU UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

A447f

Almeida, Viviane Correia Campos Frequência de doenças infecciosas e avaliação da resposta imune humoral e celular em adultos não tratados com deficiência congênita e isolada de GH / Viviane Correia Campos Almeida; orientador Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira ; co-orientadora Amélia Maria Ribeiro de Jesus. – Aracaju, 2016.

123 f.: il. color.

Tese (doutorado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, 2016.

1. Imunidade. 2. Hormônio do Crescimento Humano.

3. Doenças Transmissíveis. 4. Testes Cutâneos. 5. Vacinas. I. Oliveira, Manuel Hermínio de Aguiar, orient. II. Jesus, Amélia Maria Ribeiro de, co-orient. III. Título.

CDU 612.017





Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.

Aprovada em: _____/_____/_____

_________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Manuel Hermínio de Aguiar Oliveira

_________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dra. Ângela Maria da Silva

_________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dra. Carla Raquel Oliveira Simões

_________________________________________ 3º Examinador: Prof. Dr. Cesar Luiz Boguszewski

_________________________________________ 4º Examinador: Prof. Dr. Roque Pacheco de Almeida

Dedico este trabalho a meus amores eternos Sofia e

Clarice.

AGRADECIMENTOS

Foi tão difícil chegar até aqui, que a sensação é que o tempo parou um pouco nesses quatro

anos. Ai meu Deus! Quantas vezes repeti este chamado e o Senhor que sabe tudo o que passa

em meu coração sempre me segurou, foi arrumando o caminho, mesmo eu não sabendo,

muitas vezes, compreender. Muito obrigada!!!

Minhas pequenas Sofia e Clarice, tantas vezes mamãe ausentou-se mesmo presente em casa.

Vocês são tesouros maravilhosos, fontes de inspiração com suas brincadeiras e dizeres sábios,

que enchem de alegria a vida da gente. A Silvio, pela compreensão, paciência e ajuda diária,

principalmente com as nossas filhas, enquanto eu estava desligada por muitas horas de estudo

e trabalho. Vocês são meus amores!

Aos meus pais, Pinheiro e Valda, que foram os responsáveis pela formação do meu caráter,

pelo exemplo de dedicação a família, de importância ao trabalho e de procurar sempre fazer o

melhor. Cada vitória minha é a vitória de vocês! Amo-os muito!! A meus irmãos, Elaine,

grande companheira e amiga, a Pinheirinho, Daniela e especialmente a minha cunhada

Vanessa, que esteve sempre presente ajudando-me em cada formatação do trabalho e a meus

lindos sobrinhos que trazem alegria a nossa família, Vitória e João.

Digo sempre a mim mesma, Deus é tão bom comigo, que me colocou ao lado de dois anjos,

muito parecidos na simplicidade, na alegria com que desempenham o seu trabalho e na

competência e presteza de idéias e soluções. Obrigada professores Dr. Hermínio e Dra.

Amélia.

Ao Professor Hermínio por ter me aceitado novamente como orientanda, agora no Doutorado,

obrigada pelos ensinamentos, pela compreensão e pelas palavras de incentivos nos diversos

momentos. A sua competência profissional, aliada a sua simplicidade, calma e sabedoria de

vida são inspiradores e passam uma tranquilidade e certeza de que tudo dará certo. Muito

obrigada!

À Professora Amélia, que me recebeu com todo carinho no laboratório de Biologia Molecular,

obrigada pela compreensão, pelo incentivo e pela grande ajuda diante de tantas informações

novas que recebi nesses anos. A imunologia com suas tantas siglas assusta muito no início!

Rsss

À grande companheira de pesquisa Mônica, pela ajuda diária, pelo carinho, é muito bom

trabalhar com você!

Aos professores, Dr. Roque Pacheco e Dra. Tatiana Moura pela atenção e carinho sempre

dispensados.

A Dr. Roberto Salvatori pela parceria e grande colaboração, muito obrigada!

Agradeço a todos os alunos, pós-graduandos, professores e funcionários que fazem parte do

laboratório de Biologia Molecular, e aos que passaram por ele. É muito prazeroso estar na

companhia de vocês! Em especial quero agradecer a Rodrigo, Aline, Priscila, Fabrícia,

Márcio, Ricardo, Lucas, Lays, Nalu, Luana, Michele, Murilo, Roseane, Nanci, Meirielly,

Mirella, Sueli, Juciene, as professoras Shirley, Patrícia e Cris, Cecília, Daniela, Pedro, entre

outros, não só pela ajuda constante, mas pela alegria, carinho, palavras animadas. O trabalho

por mais árduo que seja, fica muito mais fácil com um ambiente prazeroso e vocês

possibilitam isso.

Ao grupo da Endocrinologia e pós-graduandos que trabalham direta e indiretamente junto à

comunidade de Itabaianinha, sob a orientação do Professor Dr. Hermínio, em especial a Carla

Raquel, Rossana Pereira, Ívina, Raquel Diniz, Alécia Oliveira, Virgínia Gurgel, Elenilde

Barretto, Eugênia Oliveira, Francisco Pereira, Miburge Góis, Franciele Temer, Marta Regina

Alcântara, Paula Alcântara, Valéria Barreto, Menilson Menezes, Carlos Pereira, Roberto

Ramalho, Diana Matos, Adriana Prata, Ana Denise Costa, Naira Horta, Catarine Farias,

Ângela Leal, Karine e, em especial, a querida professora Dra. Karla Freire, que me orientou

em minha primeira pesquisa científica.

A Secretaria de Saúde do Município de Itabaianinha, em especial, a Ana Célia e sua equipe do

Posto de Saúde, pela grande ajuda com os experimentos.

A Daniela Félix e a Toinho, que sempre estavam lá em Itabaianinha, esperando-me, ajudando

a contactar com as pessoas. Muito obrigada! Tenho um carinho especial por vocês!

Às pessoas que fazem parte do laboratório do Hospital Universitário, muito obrigada por

tudo!

Aos queridos amigos que alegram e deixam a minha vida mais suave, em especial a minha

amiga Martha Lícia, que mesmo distante, sempre está presente!

Ao Programa de Núcleos de Excelência (PRONEX) e à Fundação de Apoio à Pesquisa e à

Inovação Tecnológica do Estado de Sergipe (FAPITEC) pelo apoio financeiro.

E aos personagens principais, os anões de Itabaianinha, que são grandes em disponibilidade,

simpatia e disposição!

Enfim, a todos que direta e indiretamente, ajudaram-me e torceram por mim! Fica a

lembrança de que o trabalho, por mais árduo que seja, deve sempre ser desempenhado com

alegria! Alegria de viver!!

“Antes que você possa alcançar o topo de uma

árvore e entender os brotos e as flores, você terá de

ir fundo nas raízes, porque o segredo está lá. E,

quanto mais fundo vão as raízes, mais alto vai a

árvore.”(Nietzsche)

RESUMO

Frequência de doenças infecciosas e avaliação da resposta imune celular e humoral em adultos não tratados com deficiência congênita e isolada de GH. Viviane Correia Campos Almeida. Aracaju-SE. 2016.

O hormônio do crescimento (GH) é importante para o desenvolvimento e função do

sistema imunológico, mas há controvérsias se a deficiência do GH (DGH) é associada a distúrbios imunes. Um modelo de deficiência isolada do GH (DIGH), sem outros déficits ou reposições hormonais, excluiria efeitos confundidores na análise das ações do GH na imunidade, podendo esclarecer se a ausência do GH é associada a uma maior susceptibilidade a infecções ou a uma alteração na resposta imunológica. Nosso objetivo foi estudar a frequência de doenças infecciosas e a resposta imune celular e humoral em adultos com DIGH congênita e não tratada. O estudo foi realizado em duas partes: na primeira, estudo transversal com 35 adultos DIGH devido à mutação homozigótica (C.57 + 1G > A) no gene do receptor do hormônio liberador do GH (GHRH) e 31 controles, que foram submetidos a um questionário clínico para avaliar a história prévia e atual de doenças infecciosas, exame físico e foram dosadas as sorologias para doença de Chagas, leishmaniose, HIV, tétano, hepatites B e C. O único critério de exclusão para esta primeira etapa foi ter menos de 20 anos de idade. Na segunda parte, foi feito um estudo de casos com grupo controle para comparação da resposta imunológica celular e humoral entre os grupos. Os critérios de exclusão foram ter menos do que 20 e mais do que 65 anos de idade, diagnóstico de HIV, infecções agudas, malignidades, doenças autoimunes como artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, uso de medicações antialérgicas e glicocorticóides ou condições como gravidez. A resposta imune foi avaliada em um subgrupo destes indivíduos através das dosagens das imunoglobulinas séricas: IgG total, IgA, IgE e IgM, de testes cutâneos (Derivado Proteico Purificado (PPD), estreptoquinase e candidina), e da resposta à vacinação para hepatite B e tétano (nos indivíduos com sorologia negativa) e ao bacilo Calmette-Guérin (BCG), nos indivíduos que tivessem PPD negativo. Não houve diferença entre os grupos na história de doenças infecciosas e dados sorológicos basais. Indivíduos com DIGH apresentaram menores níveis de IgG total, mas dentro da variação normal e menor diâmetro da induração no teste cutâneo com estreptoquinase, embora sem diferença na positividade a este teste (DIGH 2 em 21; controles 5 em 20). Também não houve diferença na positividade ao PPD (DIGH 4 em 24; controles 10 em 28) e à candidina (DIGH 3 em 21; controles 1 em 19) nem na resposta às vacinações entre os grupos. Os controles tiveram uma maior frequência de um teste cutâneo positivo. Em conclusão, adultos com DIGH não tratada não apresentaram uma maior frequência de infecções ou alterações significantes nos testes imunológicos, mas apresentaram menores níveis de IgG total e menor positividade a pelo menos um teste cutâneo, embora sem impacto clínico.

Descritores: imunidade; deficiência isolada do hormônio de crescimento; vacinas; testes cutâneos; doenças infecciosas.

ABSTRACT

Frequency of infectious diseases and evaluation of cellular and humoral responses in adult subjects with lifetime congenital growth hormone deficiency. ALMEIDA, V. C. C. Sergipe: UFS, 2016.

GH is important for the development and function of the immune system, but there is controversy on whether GH deficiency (GHD) is associated to immune disorders. A model of isolated GHD (IGHD), without others deficits or hormones replacement, may exclude if the lack of GH is associated with increased susceptibility to infections or with an altered responsiveness of the immune response. Our objective was to study the frequency of infectious diseases and the cellular and humoral immune response in adults with congenital, untreated IGHD. The study was performed in two steps: in the first, a cross-sectional study, 35 adults IGHD due to a homozygous mutation in the GHRH receptor gene and 31 controls were submitted to a clinical questionnaire to evaluate past and current history of infectious diseases, physical examination, and serology for tripanosomiasis, leishmaniasis, HIV, tetanus, hepatitis B and C. The only exclusion criterion for this first step was age less than 20 years old. In the second step, a study of cases with a control group for comparison of immune cellular and humoral response between the groups. The exclusion criteria were age less than 20 and more than 65 years old; diagnosis of HIV, infection or acute diseases; history of malignancies; autoimmune diseases; glucocorticoid and anti-allergic medications use; or current pregnancy. The immune response was evaluated in a subset of these subjects by serum total IgG, IgM, IgE and IgA measurement, skin tests (Protein Purified Derived (PPD), streptokinase and candidin), and response to vaccination for hepatitis B and tetanus (in individuals with negative serology), and to bacillus Calmette-Guérin (BCG) in subjects non-reactive to PPD. There was no difference between the groups in history of infectious diseases and baseline serologic data. IGHD subjects had lower total IgG, but within normal range, and a smaller induration diameter in streptokinase skin test, but no difference in the frequency of positivity to streptokinase (IGHD 2 in 21; controls 5 in 20). There was no difference in the positivity to PPD (IGHD 4 in 24; controls 10 in 28) and to candidin (IGHD 3 in 21; controls 1 in 19), or in the response to any of the vaccinations between the groups. The controls had a higher frequency of one positive skin test. In conclusion, adult untreated IGHD did not present an increased frequency of infections or significant alterations in the immunological tests, but we found lower total IgG levels and lower positivity to at least one skin test, without detectable clinical impact. Key Words: immunity; isolated GH deficiency; vaccines; skin tests; infectious diseases.

LISTA DE ABREVIATURAS

ALS = subunidade do ácido lábil

APCs = células apresentadoras de antígenos

CCR4 = receptor de quimiocinas com o domínio C-C tipo 4




CD = cluster de diferenciação

CD4 = cluster de diferenciação (grupo de diferenciação) 4

CD8 = cluster de diferenciação (grupo de diferenciação) 8

CXCL8 = quimiocinas ligante 8

CXCR3 = receptor de quimiocinas tipo 3

CXCR3A = receptor de quimiocinas tipo 3 A

DGH = deficiência do hormônio do crescimento

DIGH = deficiência isolada do hormônio do crescimento

DTP = difteria-tétano-pertussis

Fab = fragmento de ligação do antígeno

GATA-3 = proteína 3 ligada ao fator de transcrição GATA

GH = hormônio do crescimento

GHR = receptor do hormônio do crescimento

GHRH = hormônio liberador do hormônio do crescimento

GHRHR = receptor do hormônio liberador do hormônio do crescimento

GM-CSF = fator estimulador de colônias granulócitos-macrófagos

IFN-γ = interferon-gama

IgA = imunoglobulina A

IgD = imunoglobulina D

IgE= imunoglobulina E

IGFBP = proteína ligadora do fator de crescimento insulina-símile

IGF-I = fator de crescimento insulina-símile tipo I

IGF-II = fator de crescimento insulina-símile tipo II

IgG = imunoglobulina G

IgM = imunoglobulina M

IL = interleucina

ILC1 = células linfóides inatas tipo 1

ILC2 = células linfóides inatas tipo 2

iNOS = óxido nítrico sintase induzida

JAK-2 = Janus kinase 2

MEF = fator de transcrição da família ETS (E26 transformador

específico)

MHC = complexo principal de histocompatibilidade

NK = natural killer

RMN = Ressonância Magnética Nuclear

RNAm = ácido ribonucleico mensageiro

SI = Sistema imunológico

SL = Síndrome de Laron

SOCS = supressores de sinalização de citocina

STAT = transdutor de sinal e ativador da transcrição

STAT1 = transdutor de sinal e ativador da transcrição 1



STAT5B = transdutor de sinal e ativador do gene transcripcional 5B

Tc1 = T citotóxicas tipo 1



Tfh = T auxiliares foliculares

TGF-β = fator de crescimento transformante beta

Th1 = T auxiliadores (helper) 1



TNF = fator de necrose tumoral

Treg = T reguladora

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 12

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................ 14

2.1 Sistema imunológico ................................................................................................... 14

2.1.1 Vacinas ....................................................................................................................... 22

2.1.2 Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia ................................................................ 23

2.2 Sistema GH/IGFs ........................................................................................................ 24

2.3 DGH ........................................................................................................................... 27

2.4 DIGH em Itabaianinha ................................................................................................ 32

2.5 Sistemas endócrino e imunológico .............................................................................. 33

3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 40

4 METODOLOGIA ........................................................................................................... 41

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .............................................................................................. 49

6 RESULTADOS ............................................................................................................... 51

7 DISCUSSÃO .................................................................................................................. 65

8 CONCLUSÕES .............................................................................................................. 71

9 CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................... 72

10 PERSPECTIVAS ............................................................................................................ 73

REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 74 ANEXO ............................................................................................................................... 92

12

1 INTRODUÇÃO

O hormônio de crescimento (GH) e seu principal mediador o fator de crescimento

insulina-símile tipo I (IGF-I) têm efeitos sinérgicos no crescimento somático e efeitos

complexos em várias funções do corpo, inclusive na resposta imune, que é essencial para a

sobrevivência, defendendo o homem contra patógenos perigosos e células atípicas (1).

Há uma complexa interação entre a resposta imune inata e a adaptativa e entre as

respostas humoral e a mediada por células, relacionadas respectivamente a função das células

B e T. A resposta imune inata atua rapidamente contra patógenos ou agentes agressores ao

organismo, e através das células apresentadoras de antígenos (APCs) ativam e induzem a

proliferação e migração das células B e T para o sítio da inflamação. As células B produzem

anticorpos que têm como alvos principais patógenos extracelulares e vírus. A população de

células T incluem células T citotóxicas CD8+ que lisam células infectadas por agentes

intracelulares e células tumorais, e as células T auxiliadoras CD4+ que secretam uma ampla

variedade de citocinas e regulam positiva ou negativamente outros componentes da resposta

imune (2). O conhecimento da interação entre a glândula pituitária e o sistema imune datam

de quase 90 anos atrás, quando foi visto que ratos hipofisectomizados tinham atrofia do timo

(3) .

GH, IGF-I, ghrelina e seus receptores foram demonstrados em várias células imunes

de roedores e humanos (4-10), sugerindo produção autócrina e parácrina destes e de outros

peptídeos como as proteínas ligadoras do IGF (IGFBP), o fator de crescimento insulina-

símile tipo II (IGF-II) e o receptor do IGF-II (11, 12). É possível que pequenas concentrações

locais destes peptídeos já sejam suficientes para a manutenção das funções imunes,

superando a atividade do GH pituitário e do IGF-I circulante (5-7, 9). De fato, a função do

sistema imunológico é mais relevante para a sobrevivência do que o tamanho do corpo, que

reflete a resposta óssea ao GH pituitário e ao IGF-I circulante.

Várias evidências indiretas ligam o eixo GH/IGF-I ao sistema imunológico. A geração

de IGF-I requer a ligação do GH ao receptor do hormônio de crescimento (GHR), um

receptor de citocina tipo 1 que engatilha a fosforilação da Janus Kinase 2 (JAK-2), e a

ativação do transdutor de sinal e ativador do gene-5b transcripcional (STAT5B) (13-16). A

prolactina, o interferon-gama (IFN-γ) e várias interleucinas (IL) também se ligam a

receptores das citocinas e ativam a família STAT (16). A ligação da IL-2 a seu receptor e a

ativação do STAT5B leva a ativação dos linfócitos T e a inibição de sua apoptose

(protegendo contra infecções), e ao desenvolvimento e proliferação de células T regulatórias

13

(que controlam a resposta imune e protegem contra a autoimunidade) (14). Distúrbios

imunológicos são bem descritos em alguns defeitos do eixo GH/IGF-I, como nas mutações

em homozigose no STAT5B (13-16) e na hipogamaglobulinemia associada a deficiência

isolada de GH ligada ao X (17, 18). Curiosamente, ratos com deleções no gene do hormônio

liberador do GH (GHRH) são menos propensos a desenvolver encefalite experimental

autoimune. Este efeito é devido primariamente a deficiência de GH (DGH), sugerindo um

papel essencial do GH na regulação do sistema imunológico (19).

A DGH é frequentemente adquirida, acompanhando neurocirurgia e radioterapia,

estando associada a outros déficits hormonais (hormônios tireoidianos e sexuais, cortisol,

prolactina), o que requer terapias de reposição. Tanto os déficits de outros hormônios

pituitários como as terapias de reposição destes hormônios podem confundir a análise das

consequências da DGH na resposta imune. Assim, idealmente, um grupo homogêneo com

DGH isolada (DIGH) permite esclarecer se a DGH causa uma alteração na resposta do

sistema imunológico e aumenta a susceptibilidade a infecções. Na cidade de Itabaianinha, no

nordeste do Brasil, há um grupo de indivíduos com DIGH severa causada por mutação

homozigota nula (C.57 + 1G > A) no gene do receptor do GHRH (GHRHR) (20). Apesar de

um aparente aumento nas mortes na infância, não há diferença significante na expectativa de

vida destes sujeitos com DIGH em relação aos seus parentes com estatura normal ou com a

população geral quando eles alcançam a idade de 20 anos (21). Diante da longevidade

normal, a hipótese é que sua imunidade não seja alterada significativamente na vida adulta.

Sendo assim, a existência de um grupo populacional adulto com DIGH vitalícia e não tratada

justifica a avaliação da frequência de infecções neste grupo, e se há alguma alteração na

resposta imune humoral e celular desses indivíduos, a fim de esclarecer o impacto da DIGH

na função imunológica, sem as interferências das deficiências e reposições de outros

hormônios hipofisários.

14

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Sistema imunológico

O sistema imunológico (SI) tem papel fundamental na defesa contra agentes

infecciosos e contra fatores endógenos alterados como células cancerosas. Dois tipos de

resposta são evidentes: a resposta imune inata e a adaptativa (2). A resposta imune inata é

essencial na defesa contra infecções, pois é a primeira linha de defesa e está presente em

todos os organismos multicelulares. Esta linha de defesa é formada pelas barreiras protetoras

(pele, mucosas, epitélios respiratório, gastrointestinal e urinário), pelas secreções do corpo

como a saliva com suas funções antimicróbicas e pelas suas células efetoras: monócitos,

macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e natural killer (NK), que reconhecem os

patógenos por meio de receptores de reconhecimento padrão, que identificam padrões

moleculares ligados aos patógenos (22). Os macrófagos são as principais células atuantes na

ligação entre as respostas imune inata e adaptativa (2), e funcionam como APCs para os

linfócitos T auxiliadores (Th). Os linfócitos Th ao serem ativados, a depender de sinais

ocorridos no momento de sua ativação, podem se diferenciar para subtipos de linfócitos Th

com funções efetoras diferentes. O direcionamento da diferenciação é influenciado pelas

APCs (23).

As APCs são as células que capturam os antígenos e apresentam-nos aos linfócitos.

As células dendríticas dão início às respostas das células T; os macrófagos, à fase efetora da

resposta celular e as células dendríticas foliculares apresentam os antígenos aos linfócitos B,

mas estes linfócitos também podem reconhecer o antígeno diretamente (24).

Os macrófagos teciduais, em contato com antígenos próprios ou de patógenos,

produzem sinais co-estimulatórios e citocinas, que atuam na resposta imune adaptativa,

estimulando-a (resposta pró-inflamatória, relacionada a morte de patógenos) ou inibindo-a

(resposta anti-inflamatória, relacionada ao reparo tecidual). Assim, macrófagos que foram

estimulados por auto antígenos são anti-inflamatórios, pois produzem IL-10, citocina que

suprime a resposta imune (macrófagos chamados M2 ou alternativamente ativados), já os

macrófagos, que respondem aos antígenos dos patógenos, produzem citocinas pró-

inflamatórias IFN-γ, fator de necrose tumoral (TNF), óxido nítrico sintase induzida (iNOS),

sendo chamados M1 ou classicamente ativados. Desta forma, inicia-se a inflamação para a

defesa do organismo, com secreção de citocinas e quimiocinas e ativação e recrutamento de

outras células imunológicas de acordo com o tipo de resposta principal (M1 ou M2),

15

orquestrando-se o caminho da diferenciação das células Th, que gera uma resposta duradoura

de memória: a resposta imune adaptativa (25, 26).

Os linfócitos são as células que possuem receptores específicos para antígenos, sendo

os principais mediadores da imunidade adquirida. Eles são diferenciados pelas proteínas que

estão na sua superfície, denominada numericamente CD (cluster de diferenciação). Os

linfócitos B expressam o CD19 e o receptor de célula B = BCR, anticorpos de superfície que

reconhecem antígenos solúveis e antígenos na superfície de patógenos, e são os mediadores

da imunidade humoral; os linfócitos T são os mediadores da imunidade celular e expressam o

CD3 e o receptor de células T = TCR, que reconhecem fragmentos peptídicos de antígenos,

que estão nas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II,

presente na superfície das APCs (24); e as células NK expressam CD56 e receptores que

reconhecem moléculas do MHC de classe I. Estas células são importantes para a imunidade

inata e defesa contra infecções virais e células tumorais. As células NK distinguem as células

infectadas e tumorais das células normais pelo reconhecimento de alterações nos níveis ou na

estrutura da molécula do MHC de classe I (27).

Quando as células do SI são ativadas, tornam-se responsáveis pela destruição do

patógeno diretamente ou através da modulação de outras células do SI: linfócitos, macrófagos

e monócitos e granulócitos (neutrófilos, eosinófilos). Os linfócitos B ativados diferenciam-se

em plasmócitos, que produzem anticorpos. Além disso, linfócitos B ativados de memória

podem produzir anticorpos nos órgãos linfóides periféricos e até na medula, sobrevivendo por

muito tempo na ausência do antígeno. As células de memória não apresentam função efetora,

a não ser que sejam estimuladas novamente pelo antígeno (24).

Os anticorpos são produzidos nos órgãos linfóides periféricos após estímulo dos

linfócitos B pelos antígenos e podem alcançar qualquer local periférico onde ocorra a

infecção. Eles podem agir tanto como receptores de membrana dos linfócitos B como podem

desempenhar funções efetoras.

As moléculas dos anticorpos são compostas por quatro cadeias polipeptídicas, duas

leves e duas pesadas. Cada molécula da imunoglobulina apresenta duas regiões idênticas: os

fragmentos de ligação do antígeno (Fab), onde se liga o antígeno e uma região central (Fc),

que é a responsável pelas funções efetoras e pela maioria de suas ações biológicas. Os

anticorpos são classificados de acordo com as cadeias pesadas que apresentam. Os principais

isotipos de anticorpos são: IgG, IgA, IgE, IgM e IgD (24).

A IgG tem como funções: opsonizar antígenos para fagocitose por macrófagos e

neutrófilos, neutralizar microorganismos e toxinas, ativar o complemento, participar na

16

citotoxidade celular dependente de anticorpos mediada por células NK, na imunidade

neonatal (transferência de anticorpos maternos), além de inibir as células B por feedback

(24).

A IgA desempenha função de imunidade a nível de mucosa, neutralizando

microorganismos e toxinas no trato gastrointestinal e respiratório e também participando da

imunidade passiva neonatal. A IgE ativa mastócitos (reações de hipersensibilidade mediada)

e participa da citotoxidade celular dependente de anticorpos mediada por eosinófilos,

importante mecanismo de proteção contra agentes multicelulares, a exemplo dos helmintos.

A IgD e a IgM têm função de receptor de antígenos em células B virgens, além disso, a IgM é

produzida nos primeiros momentos de uma infecção e participa da ativação da via clássica do

complemento, promovendo lise do patógeno (24).

Todos os linfócitos originam-se de células-tronco na medula óssea, os linfócitos B

amadurecem na medula e os linfócitos T, no timo. Após seu desenvolvimento no timo, os

linfócitos T apresentam duas classes principais: uma que expressa a proteína de superfície

celular CD8 e outra, que expressa a proteína de superfície CD4 (28). As células efetoras T

CD4 produzem citocinas, que ativam as células B e os macrófagos, exercendo função auxiliar

(T helper (Th)) e as células T CD8, chamadas células T citotóxicas, destroem as células

infectadas. As células T CD8 diferenciam-se no timo, após serem ativadas por antígenos

apresentados pela molécula do MHC classe I, mas a ativação destas células requer o auxílio

da célula T CD4, na maioria das infecções virais (23). As células T CD4 virgens podem se

diferenciar em 4 tipos de células efetoras, a partir da ativação inicial pelo antígeno: células

Th1, Th2, Th17 e células T auxiliares foliculares ou células Tfh, estas últimas localizam-se

nos folículos linfóides e fornecem sinais aos linfócitos B, auxiliando-os na produção de

anticorpos (23).

A diferenciação das células T CD4 virgens para células efetoras será determinada

pelas citocinas produzidas pelas células do sistema imune inato em resposta ao patógeno. O

primeiro sinal (sinal 1) para ativação das células T virgens advém da interação de um

complexo peptídico específico/MHC com o TCR. Em paralelo, moléculas co-estimuladoras

presentes na superfície das APCs fornecem o segundo sinal (sinal 2) que estimula a

proliferação das células T virgens. A molécula co-estimuladora presente na superfície de

células dendríticas é a B7 e seu receptor na célula T é o CD28. Essas células T ativadas têm

sua proliferação dirigida pela IL-2 e a posterior diferenciação para células efetoras (Th1, Th2,

Th17, Treg ou Tfh) vai depender do tipo de citocinas produzidas ou proteínas expressas pelas

APCs (sinal 3). A produção da IL-2 pelas células T depende da presença dos sinais co-

17

estimuladores, mas uma vez que a célula T tenha se diferenciado em uma célula T efetora,

um encontro posterior com um antígeno específico resulta em um ataque imune sem a

necessidade de co-estimulação (23).

Quando maduros, os linfócitos circulam no sangue ou na linfa e podem migrar para os

órgãos linfóides periféricos: baço, linfonodos, tecidos linfóides cutâneos e da mucosa (24). O

controle efetivo de infecções pelo SI é assegurado pela estrutura bem organizada dos órgãos

linfóides periféricos, que permitem capturar, processar e apresentar antígenos, levando a

eliminação dos patógenos e indução da imunidade adaptativa (29).

Os linfonodos são agregados nodulares de tecido linfóide e se localizam ao longo dos

canais linfáticos em todo o corpo. As APCs podem reconhecer antígenos que estejam na linfa

e que drenam para os linfonodos assim como células dendríticas podem capturar antígenos de

microorganismos do epitélio, levando-os para os linfonodos da região. Os tecidos linfóides

cutâneos e da mucosa são os locais onde acontecem as respostas imunológicas aos antígenos

reconhecidos no epitélio (24).

O baço é o principal órgão que elimina patógenos que chegam pelo sangue. Ele possui

uma população heterogênea de macrófagos que atuam para eliminar os agentes infecciosos

circulantes e induzir respostas imunes efetivas. Os macrófagos da zona marginal e os

metalocíticos marginais têm grande habilidade para internalizar patógenos (bactérias e vírus)

e localizam-se adjacentes a áreas esplênicas ricas em células T e B, favorecendo o rápido

contato com as células da imunidade adaptativa. Os macrófagos metalocíticos marginais

podem ativar células T CD8. Já os macrófagos da polpa vermelha fagocitam bactérias do

sangue, eritrócitos envelhecidos e os infectados, células apoptóticas, LDL oxidado, sendo

também importantes no metabolismo do ferro (29).

É possível se distinguir quatro maiores tipos de resposta imune efetora mediada pelas

células T: a tipo 1 (Th1), a tipo 2 (Th2), a Th17 e a tipo T reguladora (Treg) (30, 31). A

imunidade efetora mediada por células tipo 1 provê uma resposta efetiva contra

microorganismos intracelulares (bactérias intracelulares, vírus e protozoários) e compreende

células helper produtoras de IFN-γ (células CD4 Th1 e células linfóides inatas tipo 1 (ILC1)),

assim como linfócitos citotóxicos: células CD8 T1 citotóxicas (Tc1) e células NK (30). A

imunidade tipo 2 é principalmente dedicada para proteção contra helmintos e venenos

animais e é composta de células CD4 Th2, células CD8 T2 citotóxicas (Tc2) e células

linfóides inatas tipo 2 (ILC2), que produzem IL-4, IL-5 e IL-13. A imunidade Th17 é dirigida

para proteção contra bactérias extracelulares e fungos e as citocinas principais são a IL-17 e a

IL- 22, que são produzidas pelas células CD4 Th17, células CD8 T17 citotóxicas (Tc17) e

18

células linfóides inatas tipo 3 (ILC) (30). Já a imunidade Treg, através da produção de

citocinas como a IL-10 e o TGF-β, modula tanto a apresentação de antígenos, inibindo as

APCs, bem como as respostas tipo 1 e tipo 2. Não foi avaliada a sua inibição sobre a resposta

Th17. Um resumo da resposta imunológica primária mediada por células e os quatro tipos de

respostas efetoras são ilustradas na figura 1, e cada um dos quatros tipos de resposta efetora

será melhor definido nos próximos tópicos.

Figura 1: Resposta imunológica primária mediada por células.

Células dendríticas (APCs especializadas) apresentam receptores que reconhecem padrões moleculares associados aos patógenos (PAMP). A célula T virgem reconhece o antígeno na forma de um complexo peptídico: MHC na superfície da célula dendrítica. A ativação específica pelo antígeno do receptor de células T (TCR) libera o sinal 1. A interação com moléculas co-estimuladoras das APCs libera o sinal 2, e as citocinas que controlam a diferenciação em diferentes tipos de células efetoras emitem o sinal 3. A depender de sinais ocorridos no momento da ativação das células T e das citocinas produzidas em resposta ao patógeno, essas células poderão se diferenciar em subtipos de linfócitos com funções efetoras diferentes. Se houver um predomínio na produção das citocinas IL-12 e IFN-γ, essas células vão desencadear uma resposta Th1, com diferenciação e proliferação para linfócitos do tipo Th1, que atuam na proteção a vírus, fungos e patógenos intracelulares. Se há um predomínio na produção de IL-4, vai haver uma diferenciação e proliferação de linfócitos que desempenham uma resposta do tipo Th2, importante na defesa contra helmintos e bactérias extracelulares; a produção de IL-10 é responsável pela resposta T reguladora, que regula negativamente tanto a resposta do tipo Th1 como a Th2, sendo importante para evitar uma resposta inflamatória excessiva, protegendo o organismo. Mais recentemente foi descrito a resposta Th17 que está relacionada a proteção contra bactérias extracelulares (Desenhado por Amélia Maria Ribeiro de Jesus, baseado em (23, 32)).

19

Resposta efetora Th1

As bactérias intracelulares têm a capacidade de sobreviver e replicar dentro de

fagócitos mononucleares e algumas vezes dentro de outras células hospedeiras, pois são

dotadas de mecanismos evasores potentes que as capacitam sobreviver em um ambiente

hostil. Por sua vez, os fagócitos mononucleares são células efetoras potentes capazes de

fagocitar e matar várias células estranhas. Essas proteínas bacterianas, que sobrevivem nos

fagócitos, são processadas e apresentadas, levando a ativação das células T. Células Th1,

células Tc1 e ILC1 secretam IFN-γ e TNF, ativando fagócitos mononucleares e convertendo-

os para potentes células efetoras.

Microorganismos intracelulares interagem com receptores de reconhecimento de

patógenos nas células dendríticas, na presença de IL-12 e IL-18 derivadas destas células e de

IFN-γ derivado de células NK e ILC1, e induzem o desenvolvimento de células Th1 e células

Tc1, a partir de células T precursoras. Citocinas derivadas das células Th1, Tc1 e ILC1

ativam fagócitos mononucleares para produzirem matriz metalopeptidase, óxido nítrico e

citocinas que permitem a morte dos microorganismos invasores (30).

A ativação do transdutor de sinal e ativador da transcrição tipo 1 (STAT1) pelo IFN-γ

e da STAT4 pela IL-12 é o marco da transcrição para célula Th1. Os principais receptores de

quimiocinas das células Th1 são CXCR3A e CCR5 (33). As células Th1 são capazes de

auxiliar os linfócitos B na produção de anticorpos IgM, IgG e IgA em humanos.


Os helmintos induzem liberação pelas células epiteliais da IL-25, IL-33 e

linfopoietina estromal tímica, que podem diretamente ativar eosinófilos, basófilos e células

linfóides inatas tipo 2 a produzirem IL-5, IL-13 e pequenas quantidades de IL-4. Células

dendríticas ativadas na presença da IL-4 induzem o desenvolvimento das células Th2 e

células Tc2, a partir de células T precursoras. Estas células Th2 e Tc2 produzem IL-4, IL-5 e

IL-13. As células CD4 Th2 diferem fundamentalmente das células Th1 porque elas são

incapazes de secretar IFN-γ e linfotoxina-alfa (30).

Tanto a IL-4 quanto a IL-13 são essenciais para a produção de IgE e todas as outras

classes de imunoglobulinas pelas células B. Já a IL-5 tem um papel importante na

diferenciação, ativação e sobrevida dos eosinófilos (30).

20

A interação entre a IL-4 e seu receptor resulta na ativação do STAT6, que promove a

expressão do fator de transcrição GATA-3. A GATA-3 induz transativação do promotor da

IL-4 e também diretamente regula a expressão gênica da IL-5 e IL-13 (34). Células Th2

humanas expressam receptores quimiocinas diferentes daqueles expressados pelas células

Th1, tal como CCR3, CCR4 e CCR8 (33).

As células Th2 humanas também expressam a cadeia beta 2 do receptor da IL-12, que

é a razão porque mesmo as células Th2 alérgeno-específicas podem ser revertidas para a

produção de IFN-γ na presença da IL-12 (35), então sugerindo a possibilidade da plasticidade

dos subconjuntos de células Th (30).

A imunidade tipo 2 é associada a proteção contra nematódeos intestinais, que é

dependente da via da IL-13 fornecida pelas células Th2 e ILC2. Os mecanismos protetivos da

imunidade tipo 2 são diferentes e podem incluir o realce da contratilidade da musculatura lisa

intestinal, mudanças na função da célula epitelial e aumento da secreção de muco intestinal

tão bem quanto indução de mastocitose intestinal, que favorecem a expulsão do parasita (36).

O marco patológico humano das desordens relacionadas a imunidade tipo 2 são a alergia e

asma (37).


As subpopulações de células Th17 parecem ser induzidas precocemente na resposta

imune adaptativa e sua principal função parece ser a de auxiliar na proteção contra bactérias

extracelulares e fungos, por meio da estimulação da resposta de neutrófilos (23).

Estas células surgem quando as citocinas IL-6 e o TGF-β estão presentes, mas a IL-4

e a IL-12 estão ausentes. O desenvolvimento das células Th17 envolve a produção inicial da

citocina IL-21 pelas células T, que atua de forma autócrina, para ativar o STAT3, que é um

fator de transcrição necessário para o desenvolvimento destas células (23). O fator de

transcrição RORγT (receptor γT órfão relacionado) também é primordial, promovendo a

diferenciação de células T virgens em células Th17, provavelmente por regular

negativamente a IL-2 (38) e coordenar a expressão das citocinas características das células

Th17 (23). As células Th17 expressam o receptor para a citocina IL-23 no lugar do receptor

para IL-2, que é típico das células Th1, sendo que a IL-23 é necessária para a expansão e

desenvolvimento da atividade efetora das células Th17 (23).

As células Th17 são distinguidas pela capacidade de produzir citocinas da família IL-

17 (IL-17A, IL-17F). Estas citocinas atuam como receptores em células do epitélio ou

21

estromais e respondem produzindo quimiocinas como a IL-8, que recruta células efetoras

inativas, principalmente os neutrófilos. Estas células também produzem IL-22, que atua em

receptores expressos no intestino, na pele e nos pulmões, promovendo as defesas inatas

contra os patógenos (23).

As células Th17 humanas produzem também TNF e fator estimulador de colônias de

granulócitos-monócitos (GM-CSF), que contribuem para a ativação, sobrevida e

recrutamento de neutrófilos (39).

Uma das particularidades das células Th17 quando comparadas com as Th1 e Th2 é a

sua raridade nos sítios de inflamação. Uma razão para esta raridade no local da inflamação é

a sua alta plasticidade, que permite que estas células produzam IFN-γ e então rapidamente

desviem para o fenótipo Th1 (30).

Assim, o principal papel protetor da imunidade Th17 é contra as bactérias

extracelulares e fungos por causa da habilidade da IL-17 para promover o recrutamento de

neutrófilos e de fagócitos mononucleares nos tecidos (28) e para induzir a produção de

peptídeos antimicróbicos por células epiteliais.

Resposta efetora T reguladora

A resposta T reguladora tem o papel de modular a resposta imune e impedir que haja

uma lesão tecidual muito intensa, mesmo em resposta a patógenos, evitando situações de

hipersensibilidade, além de proteger o organismo contra a autoimunidade. As células Treg

apresentam o fator de transcrição FOXp3 (23), sem o qual não há geração dessas células e

sua deficiência está associada à doença autoimune do sistema IPEX (Imunodesregulação,

Poliendocrinopatia e Enteropatia ligada ao X), síndrome que apresenta doença inflamatória

intestinal e diversas doenças autoimunes em glândulas endócrinas (40).

Existem células Treg que são formadas no timo – T reguladora natural, sendo

produtoras de IL-10 e TGF-β, citocinas principais em controlar a autoimunidade e células

Treg identificadas na periferia (chamadas T reguladoras induzidas ou adaptativas), que

podem ou não expressar FOXp3 e produzem também IL-10, modulando a resposta imune,

através do equilíbrio entre a destruição dos patógenos por células efetoras e a modulação por

células Treg, mesmo havendo persistência de alguns patógenos (23).

A IL-10 e o TGF-β inibem a proliferação de células T. A IL-10 inibi a secreção de IL-

12 e afeta a diferenciação das células dendríticas, prejudicando a capacidade dessas células de

ativar as células T e de promover a diferenciação de células Th1. Além disso, a IL-10 inibe a

22

produção na célula T de IL-2, TNF-α e IL-5 e a secreção de IL-12, inibe também as APCs,

reduzindo a expressão das moléculas co-estimuladoras e do MHC. Já o TGF- β bloqueia a

produção de citocina pelas células T, a divisão celular e a capacidade dessas células

destruírem os agentes estranhos. Nem todos os efeitos da IL-10 e do TGF-β são

imunossupressores, a IL-10 pode aumentar a sobrevivência de células B, a sua maturação em

plasmócitos e a atividade das células T CD8, apesar disso, os efeitos imunossupressores são

os que prevalecem in vivo (23).

2.1.1 Vacinas

A vacinação tem o objetivo de induzir uma primeira ativação do SI que resultará em

uma memória específica, protegendo o indivíduo de infecções secundárias pelo patógeno cujo

antígeno estava presente na vacina (41).

A vacinação clássica é baseada na resposta adaptativa. Inicialmente, as células

efetoras do sistema imune inato reconhecem padrões moleculares do patógeno através dos

seus receptores de reconhecimento padrão, ativando rapidamente a produção de citocinas e

quimiocinas, a fagocitose e a produção de espécies reativas de oxigênio e outros

antimicróbicos, além de apresentar os antígenos às células do sistema adaptativo: os

linfócitos B e T (42), que reconhecem especificamente o antígeno, induzindo células de

memória (após dias a semanas) para que em uma infecção futura por aquele patógeno, haja

uma resposta rápida e realçada à infecção (41).

Além da indução de células de memória protegendo o hospedeiro contra um segundo

contato com um microorganismo específico, as vacinas têm efeitos benéficos não específicos,

estabelecidos em dias, que são conferidos pela imunidade inata e que aumentam a resposta a

outras infecções não relacionadas a vacina: a imunidade treinada (43). Os efeitos da

imunidade treinada têm duração menor do que a memória imune adaptativa, mas são

importantes protegendo contra patógenos não relacionados ao agente específico da vacina

(44), reduzindo mortalidade (45), embora haja publicações que associam o aumento de

mortalidade em crianças em período próximo ao uso da vacina difteria-tétano-pertussis

(DTP) em países de alta mortalidade (46).

23

2.1.2 Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia

Testes de hipersensibilidade tardia são uma forma para avaliar in vivo a imunidade

mediada por células, que inclui o processamento do antígeno inoculado pelos macrófagos, a

ativação de linfócitos T de memória e a liberação de fatores que levam a induração. Para uma

resposta positiva, os macrófagos e a função das células T precisam estar intactos. Estas

reações ocorrem no período de 24 a 72 h, dependendo do tempo necessário para a ativação de

um número suficiente de células T e macrófagos ativados, no local de deposição do antígeno,

capazes de produzir a induração (47).

Estes testes são mais frequentemente utilizados para a triagem de anergia, onde se

avalia a competência do SI mediado por células (48), mas podem ser também úteis para testar

alérgenos responsáveis por hipersensibilidade de contato e para o diagnóstico de infecções.

Há variabilidade na resposta aos diferentes antígenos utilizados nos testes de acordo

com a exposição prévia ao antígeno, a vacinações prévias e a idade. Estudo utilizando

sistemas Multitest®, dispositivo de punção descartável onde se aplicou simultaneamente sete

antígenos de memória padronizados, mostrou que indivíduos com mais de 65 anos tinham

menor positividade aos antígenos dos testes (49). É importante que os antígenos utilizados

sejam comuns à maioria da população e que variações na exposição e situação vacinal de um

determinado antígeno sejam superadas, utilizando-se um maior número de antígenos no teste

(49).

Problemas relacionados ao teste podem ser consequentes à inapropriada aplicação e

leitura, à potência dos antígenos e à natureza do diluente. Há estudos que mostram uma

correlação positiva entre anergia ou diminuída resposta aos testes cutâneos e sepse pós-

operatória (50), enquanto outros, não mostraram relação (51). A formação de uma induração

entre 1 a 4 mm correlaciona-se com uma resposta proliferativa de linfócitos presente e

achados histológicos podem ser encontrados em reações com menos de 5 mm de induração

(52, 53).

24

2.2 Sistema GH/IGFs

O GH humano é uma cadeia polipeptídica única de 191 aminoácidos com 2 pontes

dissulfídicas entre os aminoácidos 53-165 e 182-189 (54), codificado pelo gene do GH (GH-

N), localizado no braço longo do cromossomo 17 e sintetizado e secretado pelos

somatotrofos. Há duas isoformas principais, ambas são expressas na pituitária anterior, uma

com 22 kDa e outra com 20 kDa, que perde os aminoácidos de 32 a 46 e que corresponde a 5-

10% do GH circulante. A prolactina e o lactogênio placentário apresentam estrutura similar

ao GH (54).

A regulação da secreção do GH é feita pelo hipotálamo e por fatores periféricos que

agem nos somatotrofos (55). Esta secreção é pulsátil e é estimulada pelo hormônio liberador

do GH (GHRH), que aumenta a transcrição do GH e promove a secreção do GH estocado

(56) e, em menor intensidade, pela ghrelina e esteróides sexuais (57), e é inibida pela

somatostatina (58), IGF-I e glicocorticoides em excesso (59, 60). Tanto o GHRH como a

somatostatina agem através de receptores acoplados a proteína G. O receptor do GHRH

(GHRHR) é localizado no braço curto do cromossomo 7 (7p14) e consiste de 13 éxons. O

fator de transcrição Pit-1 parece ser o principal responsável pelo desenvolvimento tecidual

dos somatotrofos e expressão do GH (61) e do GHRHR nos somatotrofos (62). A

representação esquemática do eixo GH/IGF-I é mostrada na figura 2.

25

Figura 2: Regulação hipotálamo-pituitária do eixo GH/IGF-I

Adaptado de Aguiar-Oliveira & Salvatori, 2012 (63).

A secreção do GH alcança seu pico dentro de uma hora do início do sono profundo e é

também influenciada por fatores nutricionais, sendo aumentada na desnutrição e no jejum

(59), na atividade física, no trauma e na sepse (62) e acompanhando refeições com alto

conteúdo proteico e aminoácidos intravenosos (64), e sendo inibida pela hiperglicemia e

leptina (65).

Na circulação, 40 a 60% do GH se liga a proteína ligadora do GH (GHBP), que é

gerada pela clivagem do domínio extracelular do receptor do GH (GHR) (66). A GHBP age

prolongando a meia-vida do GH de 11 para 80 minutos, mantendo a concentração circulante

de GH nos vasos e controlando a disponibilidade do GH para a ligação aos GHRs periféricos.

A isoforma com 22 kDa tem maior afinidade à GHBP do que a de 20 kDa (67).

O GH liga-se ao GHR, que é membro da família dos receptores de citocinas e

apresenta um domínio extracelular, uma porção transmembrânica e um domínio

citoplasmático. O receptor existe como um dímero in vivo inativo, mantidos juntos por suas

hélices transmembrana, sendo que duas moléculas associadas da proteína JAK-2 interagem

de um modo inibidor (68). A ligação do GH provoca uma mudança estrutural no receptor,

com movimento dos domínios intracelulares do receptor, reduzindo a inibição das moléculas

26

de JAK-2 e lhes permitindo a ativação, iniciando assim a resposta celular ao hormônio (68).

A ativação do GHR induz a sinalização intracelular via JAK/STAT (69). As proteínas STATs

são proteínas citoplasmáticas fosforiladas pela JAK-2 e uma vez fosforiladas, são

translocadas para o núcleo onde se ligam ao DNA, promovendo a ação biológica do GH,

entre elas o estímulo para a síntese hepática e secreção do IGF-I (69). O GH também se liga

ao receptor da prolactina (70).

Há dois fatores de crescimento insulina-símile (IGFs): o IGF-I e o IGF-II. O GH

exerce seus efeitos direta ou indiretamente mediados pela síntese do IGF-I. O IGF-I é gerado

em vários tecidos, principalmente no fígado (71). Estudo anterior em camundongo, observou

que a deleção específica do IGF-I do fígado não resultou em comprometimento do

crescimento apesar da redução em 75% nas concentrações séricas do IGF-I, concluindo que o

IGF-I autócrino/parácrino foi mais importante para o crescimento do que o endócrino (72).

Dois anos mais tarde, foi demonstrado que camundongos com deleção dupla no gene do IGF-

I e da subunidade do ácido lábil (ALS) e que tinham uma maior redução do IGF-I,

apresentaram redução do crescimento corpóreo significante. O uso do IGF-I por 4 semanas

restaurou a altura total da placa proximal da cartilagem de crescimento da tíbia destes

camundongos, mostrando que para um crescimento normal é necessário um limite mínimo de

IGF-I, confirmando a participação do IGF-I endócrino (circulante) e local

(autócrino/parácrino) no crescimento longitudinal (73).

Os níveis de IGF-I variam com a idade, sendo baixos no nascimento e aumentando

lenta e progressivamente, atingindo pico na puberdade (74). Com o avançar da idade há

redução nos níveis de IGF-I coincidente com a redução na secreção de GH (75).

O IGF-I é transportado na corrente sanguínea ligado a uma das 6 proteínas ligadoras

do fator de crescimento insulina-símile (IGFBPs), principalmente a IGFBP-3. Noventa e

nove por cento do IGF-I está na forma ligada. A IGFBP-3 é a mais abundante das IGFBPs e

75% do IGF-I está ligado à mesma. A IGFBP-3 e o IGF-I ligados à ALS constituem o

complexo ternário, que é mais estável no plasma e aumenta a meia-vida do IGF-I para 16

horas (76).

O receptor do IGF-I apresenta homologia ao receptor de insulina e tanto o IGF-I

quanto o IGF-II ligam-se ao receptor do IGF tipo 1 (IGF-R1), que é constituído por duas

cadeias α e duas cadeias β, às isoformas A e B do receptor de insulina (RI-A e RI-B) e a

híbridos deles. A ligação do IGF-I ao seu receptor ativa a tirosina-quinase, fosforilando a

tirosina e levando a ativação de várias proteínas sinalizadoras, incluindo o substrato receptor

de insulina 1 e 2 (IRS1 e IRS2). A ativação deste receptor leva ao estímulo da síntese de

27

proteínas, proliferação e diferenciação celular, estímulo para angiogênese e, inibição da

apoptose (74).

Já o IGF-II tem 67% de homologia com o IGF-I. O fígado também é o principal

produtor do IGF-II no adulto, mas várias outras células sintetizam-no. O IGF-II regula o

desenvolvimento e a diferenciação fetal, mas seu papel no adulto é bem menos compreendido

(76).

A concentração do IGF-II é estável na idade adulta e declina na velhice. No adulto,

sua concentração é mais abundante que a do IGF-I, sendo a proporção molar IGF-II/IGF-I de

3:1. O IGF-II liga-se ao IGF-R1 e a RI-A, exercendo seus efeitos biológicos, além de se ligar

ao IGF-R tipo 2, que tem função importante na sua depuração. A afinidade de ligação do

IGF-II ao RI-A é maior do que a do IGF-I e ele tem principalmente efeitos mitogênicos

quando se liga a este receptor (77). A ligação do IGF-II às IGFBPs controla sua concentração

livre, que parece independer da idade (74). Na DIGH por mutação no GHRHR, o IGF-II livre

e total são diminuídos, porém com níveis superiores em relação às concentrações de IGF-I.

Este dado sugere que a influência do GH na secreção de IGF-II é pequena (78).

No sistema imune, o IGF-II promove aumento da expansão de colônias granulócitos-

macrófago (79) e formação dos precursores mielóides e eritróides (80). O IGF-II promove

também proliferação e sobrevida das células beta pancreáticas em camundongos (81) e tem

efeito anabólico no osso (82). No fígado e nos tecidos, o IGF-II tem ação insulina-símile, mas

é menos potente do que a insulina e o IGF-I. Nos adipócitos humanos, é secretado em maior

concentração do que o IGF-I (83). Nas células granulosas, estimula a proliferação e síntese de

estrógeno e progesterona (84), e nas células da teca, aumenta a produção de andrógenos (85).

O excesso de IGF-II tem sido implicado no diabetes, câncer e síndrome dos ovários

policísticos (85-87).

2.3 DGH

O GH possui efeitos diretos ou indiretos mediados pela síntese hepática de IGF-I. As

ações do sistema GH/IGF-I vão muito além do crescimento corpóreo, atuando no

metabolismo de proteínas (síntese proteica), carboidratos (GH age como um antagonista da

insulina) e lípides (lipólise e oxidação lipídica) (88, 89), na composição corpórea (90),

retenção de sódio, água e fosfato, na aquisição de massa óssea (91), no sistema

cardiovascular, na proliferação celular e na redução da apoptose.

28

A DGH é rara, sendo geralmente adquirida, mas uma porcentagem significante destes

casos está associada a distúrbios genéticos. Essas alterações genéticas podem ocorrer por

redução na síntese do GH, por função alterada nas moléculas do GH (GH bioinativo) ou por

diminuição na responsividade ao GH (Insensibilidade ao GH) (62). As causas genéticas ainda

podem ocorrer devido a mutações nos fatores de transcrição da pituitária anterior e outros

fatores envolvidos no sistema nervoso central, levando ao desenvolvimento pituitário

anormal e a deficiência hormonais múltiplas.

Até 26% dos casos de DIGH apresentam anormalidades na Ressonância Magnética

Nuclear (RMN), particularmente hipoplasia pituitária anterior e hipófise posterior ectópica

(92) e um crescente número de causas genéticas têm sido identificadas. As causas genéticas

mais frequentes levando a DIGH são a tipo IA e a tipo IB. A tipo II e III são mais raras.

A DIGH tipo IA é herdada de forma autossômica recessiva e ocorre devido a deleções

em homozigose e mutações nonsense no gene GH1 levando a ausência absoluta da proteína

GH no sangue. Apesar de responder bem a terapia inicial com GH, muitos pacientes

desenvolvem anticorpos anti-GH, que levam a perda da eficácia do GH e a opção de

tratamento é o uso de IGF-I (93).

A DIGH tipo IB é autossômica recessiva e causada por mutações no GH1 ou por

mutações no GHRHR, como a encontrada em Itabaianinha. O fenótipo da DIGH tipo IB é

mais suave do que a DIGH tipo IA com a presença de baixos níveis de GH nos testes de

estímulos, mas detectáveis, e a resposta ao tratamento com GH é boa, sem desenvolver

anticorpos anti-GH.

A DIGH tipo II é mais comumente causada por mutações tipo splicing no GH1,

particularmente splicing do éxon 3 (94). A exclusão do éxon 3 leva a produção de uma

isoforma do GH de 17.5 kDa. Esta variante do GH reduz a estabilidade da isoforma 22kDa do

GH (95). Pode haver perda de outros hormônios pituitários, causadas pelo fluxo hormonal

interrompido e por inflamação e destruição pituitária. Atualmente, não há tratamento

específico para melhorar os efeitos desta isoforma defeituosa.

A DIGH tipo III tem herança recessiva ligada ao X e os homens descritos foram

deficientes em GH e imunoglobulina (hipo ou agamaglobulinemia). Os primeiros quatro

pacientes da mesma família descritos com hipogamaglobulinemia ligada ao X e DGH tinham

um quadro clínico com infecções recorrentes (pneumonias, sinusite, otite média, entre outras)

típicas de pacientes com nenhuma ou pouca células B e baixíssimos níveis de

imunoglobulinas, e tinham função normal das células T (17). No entanto, não foram

identificadas mutações no gene da proteína tirosina-quinase de Bruton (BTK), presentes na

29

agamaglobulinemia ligada ao X (96). Mais tarde, foi descrito um paciente com mutação no

BTK com agamaglobulinemia e DGH (97).

Foi identificado também, em todos os homens de uma família com

hipogamaglobulinemia ligada ao X e DGH, uma mutação no gene MEF (fator de transcrição

da família ETS (E26 transformador específico)) (18). A mutação no MEF pode causar uma

inibição acentuada no desenvolvimento das células B na medula óssea e nos somatotrofos

produtores de GH na pituitária (18). Isto pode ocorrer porque o GH-N é imediatamente

adjacente ao gene para o receptor do antígeno da célula B (98).

Há várias outras causas genéticas envolvendo mutações nos fatores de transcrição da

pituitária anterior, que embora raras, levam a DGH associado ao desenvolvimento pituitário

anormal e a deficiência de vários outros hormônios pituitários associada a alterações típicas

na RMN (99). Um dos fatores de transcrição específicos mais precoces, que desempenha um

papel crítico no desenvolvimento da hipófise, encéfalo e linha média é o HESX1 (gene

homeobox da bolsa de Rathke). O HESX1 e o PROP1 desempenham papéis distintos no

desenvolvimento pituitário, sendo o HESX1 um repressor da transcrição, e o PROP1, um

ativador. A atenuação da expressão do HESX1 coincide com o aumento da expressão do

PROP1 e a progressão da diferenciação celular pituitária (100). O PROP1 é requerido para a

formação de quatro linhagens celulares: as dependentes do Pit-1 (somatotrofos, lactotrofos e

tireotrofos) e os gonadotrofos (101). Mutações no HESX1 são associadas com displasia do

septo-óptico e pan-hipopituitarismo, podendo ser herdadas de forma autossômica recessiva

ou dominante. Na RMN, além da hipoplasia pituitária anterior, pode haver também hipófise

posterior ectópica e agenesia do septo pelúcido (102).

Mutações no fator de transcrição PROP-1 são a causa genética mais comum de

deficiências hormonais pituitárias múltiplas, sendo responsável por cerca de 50% dos casos

familiais (103). Mutações no PROP-1 são associadas a deficiência de GH, Prolactina, TSH,

LH/FSH e raros casos de deficiência de ACTH. A primeira causa genética de deficiência

hormonal pituitária múltipla identificada foi relacionada a mutações no Pit-1 (104). Estas

mutações levam a deficiência de GH, TSH e Prolactina. Vários outros genes estão envolvidos

no controle genético do desenvolvimento da pituitária e podem apresentar mutações levando

a DGH (99).

A baixa estatura pode também estar associada a presença de moléculas de GH

bioinativas com níveis normais ou altos de GH e baixas concentrações de IGF-I. Mutações na

molécula do GH resultam em diminuição da ligação do GH mutante ao GHR (105). Nem

sempre há boa resposta a reposição do GH nesta situação (106, 107).

30

Não só mutações na molécula de GH poderiam afetar a sua ligação aos sítios do GHR.

A presença em excesso de isoformas não 22-kDa foi identificada em crianças com baixa

estatura idiopática, pequena para idade gestacional (PIG) e na Síndrome de Turner (108)

através de ensaio inicial imunomagnético, na qual se extraiu as formas monoméricas e

diméricas do GH 22kDa do soro, quantificando-se em seguida as formas de GH não 22kDa

através de ensaio com anticorpo policlonal para o GH (109). A proporção aumentada de

isoformas não 22-kDa, inativa ou parcialmente ativa, pode modular a atividade do GH in vivo

agindo como agonistas parciais, agonistas completos ou antagonistas (110).

Em 1966, foi descrito a clássica Síndrome da insensibilidade ao GH, conhecida como

Síndrome de Laron (SL), causada por mutações no GHR levando a perda de função deste

receptor (111). A maioria é herdada de forma autossômica recessiva, mas é descrita herança

autossômica dominante em menor número de casos (112). Esses indivíduos têm baixa

estatura severa, com tamanho normal ao nascimento, fronte olímpica, hipoplasia de face,

micropênis, hipoglicemia ao nascimento, obesidade centrípeta e bioquimicamente apresentam

baixos níveis de IGF-I, IGFBP-3 e ALS, mas o GH basal é normal ou inapropriadamente

elevado e há aumento do pico de GH quando estimulado. Como o defeito no GHR pode ser

também no domínio transmembrana ou intracelular do GHR, níveis de GHBP marcadamente

baixos indicam ausência do componente extracelular do GHR, mas níveis normais, não

excluem o diagnóstico da SL. Para o diagnóstico, além dos achados clínicos e bioquímicos, o

padrão é um teste de geração de IGF-I (113), seguindo a seleção de indivíduos para o estudo

genético.

Outras alterações que levam à insensibilidade ao GH com baixa estatura são as

mutações em homozigose no STAT5B. Em 2003, foi descrito o primeiro caso com mutação

na proteína STAT5B e insensibilidade ao GH associada à deficiência imune (13). Esse

distúrbio é herdado de forma autossômica recessiva e várias mutações já foram descritas (13,

114, 115). O crescimento é comparável ao das crianças com SL, a idade óssea e puberdade

são atrasadas, refletindo também o estado de doença crônica. Os achados bioquímicos são

semelhantes à SL, mas os níveis de GHBP são normais e divergem também pelo quadro de

imunodeficiências, com infecções de repetição e doenças autoimunes como a pneumonite

intersticial linfocítica, doença pulmonar crônica grave e de início precoce. Estes indivíduos

também apresentam hiperprolactinemia. A disfunção imunológica ocorre pelo defeito na ação

da IL-2, cuja sinalização intracelular também é dependente da STAT5B, e que é envolvida na

proteção da apoptose e ativação dos linfócitos T, e no desenvolvimento dos linfócitos T

31

reguladores (14). A figura 3 representa a ativação do receptor do GH e da IL-2 via ativação

da JAK2 e fosforilação da STAT5B e consequentes ações biológicas do GH e IL2

Figura 3: Ativação do receptor do GH e da IL2 via ativação da Janus Kinase 2 (JAK2) e fosforilação do transdutor de sinal e ativador do gene transcripcional 5B (STAT5B) e consequentes ações biológicas do GH e IL2.

Adaptado de Scalco, Pugliese-Pires, Jorge, 2013 (15) e Brooks e col., 2014 (68).

Outras causas de doenças relacionadas ao GH/IGF-I são: a deficiência da ALS (116),

onde há baixa estatura moderada e baixas concentrações de IGF-I, IGFBP-3 e ALS e altos

níveis de GH; as mutações no gene do IGF-I, que são extremamente raras e além da

diminuição no crescimento, parte dos casos apresentam microcefalia, perda auditiva

sensorioneural e atraso no desenvolvimento, com baixos a indetectáveis níveis de IGF-I, GH

alto e, IGFBP-3 e ALS normais; e as alterações no receptor do IGF-I, cujo fenótipo é um

pouco mais suave ou semelhante ao fenótipo dos indivíduos com mutações no gene do IGF-

I, mas estes pacientes têm IGF-I acima da variação para a idade (117).

As deficiências adquiridas de GH são mais frequentes, principalmente nos adultos, e

podem acontecer por tumores da região hipotálamo/pituitária, por traumas externos e por

doenças inflamatórias como a histiocitose e a hipofisite. Nesses casos, geralmente a DGH

vem acompanhada de outros déficits hormonais, o que confunde a análise sobre o impacto

isolado da DGH sobre os diferentes sistemas do organismo (cardiovascular, imunológico...),

principalmente considerando que esses casos de DGH adquirido muitas vezes requerem uso

32

de esteróides sexuais, hormônios tireoidianos e glicocorticoides, e que essas reposições não

necessariamente mimetizam as produções endógenas.

2.4 DIGH em Itabaianinha

Em Sergipe, no município de Itabaianinha, foi identificada em 8 gerações de uma

mesma família, um grupo de 105 indivíduos com acentuada baixa estatura por DIGH devido

a mutação homozigótica C.57 + 1G > A. Esta mutação impede a formação do RNA

mensageiro do GHRHR, abolindo completamente sua expressão e consequentemente a

proliferação celular e secreção do GH (118). Este grupo mostra níveis muito baixos de GH e

IGF-I. O maior valor de GH com os testes da hipoglicemia e clonidina foi 1 μg/l,

caracterizando deficiência grave de GH (119).

Estes indivíduos apresentam massa muscular diminuída, aumento da porcentagem de

massa gorda, da relação cintura/quadril, dos níveis de colesterol total e LDL colesterol, de

proteína C reativa de alta afinidade e menor índice de massa ventricular esquerda, apesar de

aumento na pressão sanguínea sistólica. Embora tenham fatores de riscos cardiovasculares

associados, não foi evidenciado aterosclerose prematura pelo ecocardiograma de estresse e

pela medida da espessura da íntima média da carótida (120-123).

Oliveira e colaboradores (2010), buscando entender a dissociação entre a não

ocorrência de aterosclerose prematura apesar de fatores de risco associados, encontraram

maiores níveis de adiponectina e níveis normais de leptina e de excreção urinária de albumina

em indivíduos adultos com DIGH. Este perfil de adipocinas favorável contribuiria para a

maior sensibilidade à insulina, protegendo estes indivíduos da aterosclerose prematura

mesmo na presença de fatores de riscos cardiovasculares adversos (124, 125).

A maior sensibilidade à insulina é um marco da longevidade em indivíduos

centenários saudáveis associada a uma relação molar IGFI/IGFBP3 elevada (126). Os

indivíduos com DIGH de Itabaianinha têm níveis muito baixos do IGF-I no soro, com uma

redução na proporção IGF-I/IGFBP-3 e um nível proporcionalmente maior do IGF-II,

levando a um aumento na relação molar IGF-II/IGFBP-3, tal que a razão molar do IGF total

(IGF-I + IGF-II)/IGFBP-3 é elevada, de alguma maneira similar ao que ocorre com

indivíduos centenários saudáveis (78). Embora os anões de Itabaianinha tenham maior

sensibilidade insulínica, eles não são protegidos do diabetes devido a uma menor função das

células beta (125, 127).

33

Vale ressaltar que a DIGH não afeta a qualidade de vida deste grupo que apresentou

índice total do questionário de satisfação da vida semelhante ao dos controles da mesma

região (128). A puberdade é frequentemente atrasada (129), mas a fertilidade é normal e as

mulheres são capazes de amamentar. Nem micropênis nem hipoglicemia neonatal têm sido

encontrados, possivelmente devido a secreção residual de GH (118).

Três achados em estudos nesta população sugeriram que a deficiência severa de GH

poderia estar influenciando a função imunológica nestes indivíduos: o menor volume do

baço, mesmo quando corrigido pela superfície corporal (130), a ocorrência de mais

sangramentos e inflamação gengival (131) e o achado de maior freqüência de morte em

mulheres com DIGH com idade entre 4 e 20 anos, por provável causas infecciosas, apesar de

longevidade normal (21). Estes trabalhos levaram ao interesse em avaliar se a DIGH e o

consequente baixíssimo nível de IGF-I estão associados a uma menor capacidade de resposta

do sistema imune e maior predisposição às infecções, considerando a peculiaridade desta

população apresentar um grupo de adultos com DIGH, que não foram tratados com GH e que

não possuem outros déficits hormonais e as interferências dos tratamentos de reposição.

2.5 Sistemas endócrino e imunológico

Desde a descrição em 1930, que ratos hipofisectomizados apresentavam atrofia do

timo, vários trabalhos também começaram a mostrar as relações dos hormônios pituitários

com o sistema imune (3).

Ratos hipofisectomizados, com deficiência de todos os hormônios pituitários, tinham

diferentes compartimentos do sistema imune comprometidos e houve restauração da resposta

imune celular e humoral com a administração de GH ou prolactina (132). Camundongos com

mutação no fator de transcrição pituitário Pit-1 tiveram o número de células e a resposta

imune humoral e celular restituídas de forma variada com a reposição de um dos hormônios

deficientes (132-136). Em camundongos, o tratamento com GH foi capaz de reverter a

celularidade tímica (137).

Células secretoras de GH na pituitária mostram expressão abundante de receptores

tipo I e II da IL-1 em murinos (138). O GH, a prolactina e várias interleucinas têm receptores

que pertencem à mesma família de receptores citocina classe I e que ativam a mesma via

JAK/STATs. Mutações em homozigose na proteína STAT5B são causas de DGH em

humanos, devido à resistência ao GH, associada a deficiências imunológicas, com aumento

34

no número de infecções e doenças autoimunes (13-16, 114). Estas observações reforçam a

relação já descrita entre os hormônios e o sistema imunológico (139).

Os receptores de GH e prolactina mostram forte homologia. O GH em altas

concentrações liga-se ao receptor da prolactina e altas concentrações de prolactina também

podem deslocar o GH de sítios de ligação de alta afinidade nas células imunes (139).

Trabalho prévio verificou que as ações de GH nos neutrófilos humanos ocorriam não pela

ligação ao GHR, mas preferivelmente ao receptor da prolactina (140).

A prolactina é sintetizada e secretada por células do sistema imunológico (133). Além

disso, foi mostrado que a expressão do gene da prolactina em células linfóides era regulada

independentemente do fator de transcrição pituitário Pit-1, o que sugeria que a prolactina em

células imunes humanas poderia ser regulada por citocinas (141) e outros agonistas imunes.

A expressão de receptores de prolactina de alta afinidade em monócitos, células T e B

e células NK possibilita que esse hormônio tenha efeitos diretos no sistema imune (142, 143).

O agonista da dopamina, bromocriptina, tem ação imunossupressora e foi visto que em ratos

reduzia a produção de IFNγ e a resposta de células T a macrófagos (132). A administração de

prolactina (132) e mesmo a do GH reverteu estas alterações, sendo mais uma evidência de

que estes hormônios têm ações redundantes no sistema imunológico (144).

Camundongos com knockout na prolactina (145) e no seu receptor (146) não

apresentaram anormalidades no desenvolvimento do sistema imunológico. A semelhança no

receptor e nas propriedades imunorregulatórias do GH e prolactina e de citocinas específicas

poderiam ser responsáveis pela ausência de alterações imunes nestes camundongos, assim

como poderiam justificar a ausência de significantes imunodeficiências na DGH (139).

Em humanos, a prolactina também tem sido relacionada com doenças autoimunes

como artrite reumatóide (147) e lúpus (148), onde cerca de 20% dos pacientes apresentam

hiperprolactinemia (139).

O hormônio tireoidiano e o cortisol também têm ações bem definidas no sistema

imunológico. Camundongos com hipotiroidismo e com nanismo por mutação no fator de

transcrição Pit-1 (Snell-Bagg) apresentavam depleção de células pré-B. O tratamento com T4

restaurou os níveis destas células nos camundongos Snell-Bagg, associando um papel do eixo

pituitário-tireoidiano no desenvolvimento das células B em murinos (149).

O corticóide tem efeitos anti-inflamatórios, podendo desviar a resposta imune

adaptativa do tipo Th1 para Th2, através da inibição da produção da IL-12 pelas células

dendríticas e macrófagos, que é a citocina que induz a uma resposta predominante do tipo

Th1 (150). Doses mais elevadas de corticóide em linfócitos humanos inibiram a proliferação

35

de linfócitos T e induziram apoptose de linfócitos T CD4+ periféricos. O GH diminuiu a

apoptose dos linfócitos T CD4+ induzida pela dexametasona e os efeitos da inibição na

proliferação dos linfócitos T provocado pelo corticóide. O GH melhorou parcialmente a

inibição provocada pelo excesso de corticóide na síntese de DNA em linfócitos T periféricos

humanos (151). Esses efeitos dos glicocorticóides são importantes nos casos de

hipopituitarismo com necessidade de reposição, pois tanto o excesso leva a imunossupressão

como a falta pode levar a uma resposta inflamatória exacerbada, com excesso de citocinas

pró-inflamatórias (152), impactando na morbidade e mortalidade dos pacientes. Os efeitos

imunossupressores dos glicocorticóides são antagonizados pelas ações do GH e também da

prolactina, possibilitando a homeostasia imune durante os períodos de doença (153).

As células imunes (154, 155) possuem receptores intracelulares para o estradiol. O

estrógeno tem ações anti e pró-inflamatórias. Nas mulheres, a prevalência das ações pró-

inflamatórias é vantajosa nas situações de infecções mas faz com que tenham maior risco de

doenças autoimunes (156). Ratos orquiectomizados tinham mais tireoidite autoimune e a

administração de testosterona reduziu o desenvolvimento de doenças autoimunes (157). Em

humanos, os níveis de estrógenos podem influenciar a resposta imune no hipopituitarismo,

aumentando os supressores de sinalização de citocina tipo 2 (SOCS-2), que atuam

negativamente na via JAK/ STAT, envolvida na sinalização do GH e da prolactina, e assim

regulando negativamente estes hormônios pró-inflamatórios (158). A IL-1 beta parece

também suprimir o hormônio liberador das gonadotrofinas (159).

O GHR (160), o RNAm de ambos GH (8) e GHRH (161), o GHRHR (162), o

receptor da somatostatina (163), a ghrelina e o receptor do secretagogo do GH (GHR-S) (8)

são expressos em células mononucleares do sangue periférico humano (4, 8). GH (164),

GHR, GHR-S e ghrelina são expressos também em neutrófilos humanos (8, 10). Um estudo

encontrou GHR em mais de 90% de linfócitos B e monócitos humano e em menor quantidade

nos linfócitos T. Neste estudo, a expressão do GHR nos linfócitos B de 9 crianças com DGH,

diagnosticadas pela baixa velocidade de crescimento e pela não resposta do GH em 2 testes

de estímulo, foi semelhante a controles normais (160). A expressão do GHR e do RNAm do

GH foram mais encontrados nos linfócitos B (8) e a forma expressa foi a GH-N (expressa

também na pituitária anterior) e com peso molecular de 22kDa, 20 kDa e outras variantes

(165). A presença destes hormônios e seus receptores nas células do sistema imunológico

mostra que eles agem nestas células e que as interações entre o sistema endócrino e imune

podem ocorrer também através de mecanismos autócrino e parácrino.

36

Receptores de IGF-I são encontrados em células mononucleares do sangue periférico

humano, mas há variações nos estudos em relação a concentração da expressão nas diferentes

células. Um estudo encontrou expressão em 97% dos monócitos e 88% em linfócitos B e só

2% em linfócitos T (166); ao contrário, Kooijman e colaboradores (167) encontraram

receptores de IGF-I em cada subpopulação de linfócitos, com relativo alto número de

receptores nos monócitos, nas células NK, nas células T helper CD4+, intermediário número

nas células T citotóxicas/supressoras CD8+ e um menor número nos linfócitos B.

Estudo in vitro, em linfonodo não tumoral humano, localizou o gene e a proteína do

IGF-I em células dendríticas foliculares e, principalmente, em macrófagos. Nas células

dendríticas foliculares, a expressão do RNAm do IGF-I foi mais forte do que a expressão da

proteína, sugerindo que à medida que o IGF-I é produzido, ele é liberado para o ambiente ao

redor, exercendo efeitos parácrinos nos linfócitos B, onde não foi encontrado IGF-I

imunorreativo. Muitos poucos linfócitos T exibiram imunoreatividade para o IGF-I neste

estudo (7).

É sugerido que o sistema IGF tenha um papel na regulação da apoptose via gene

supressor tumoral p53, que faz estímulo para a produção de IGFBP-3, que por sua vez

diminui a biodisponibilidade de IGF-I, levando ao aumento da apoptose (168). Por outro

lado, a produção autócrina de IGF-I em células como macrófagos (7, 169), que atuam na

imunidade inata e lidam com numerosos desafios contra os diversos patógenos, indica um

papel particular do IGF-I na modulação imune, inclusive como fator anti-apoptótico para

estas células (7).

Curiosamente, Hattori e colaboradores (170, 171), em estudos in vitro, encontraram

que linfócitos T e B humanos, não estimulados, sintetizaram e secretaram espontaneamente

GH, similar no peso e imunogenicidade ao GH pituitário. Concentrações fisiológicas de

GHRH e somatostatina não tinham efeito na secreção espontânea de GH desses linfócitos,

mas houve aumento da secreção de GH quando os linfócitos foram estimulados por

mitógenos e por GH exógeno adicionado aos linfócitos com fitohemaglutinina. O GH

exógeno não aumentou o número de células (171).

Estudo in vitro, comparando células mononucleares do sangue periférico de humanos

adultos normais e de indivíduos com DGH de início na idade adulta, após cirurgia por um

adenoma pituitário, demonstrou que havia secreção de IGF-I e IGFBPs nestas células. A

secreção do IGF-I foi estimulada pelo GH exógeno, mas a das IGFBPs não, e o padrão de

secreção das células dos normais foi semelhante ao das células dos adultos com DGH (9).

37

Malarkey e colaboradores (172) demonstraram in vitro que cândida e IL-12 realçaram

a expressão do RNAm do GH em células mononucleares do sangue periférico humano,

sugerindo que o GH produzido em linfócitos têm um papel na via Th1 da resposta imune

celular. Já concentrações de cortisol e norepinefrina, semelhantes às presentes em situações

de estresse, suprimiram a expressão do RNAm do GH nestas células.

Estes resultados sugeriram que a regulação da secreção do GH e das IGFBPs no

sistema imunológico pode ser diferente daquela do sistema endócrino (9, 10, 170-172) e que

há produção autócrino/parácrina do GH, do IGF-I e das IGFBPs (9, 170, 171). Há duas

diferenças importantes entre as células imunes e as células da pituitária: células imunes não

podem estocar os seus produtos em grânulos e elas se movem livremente no corpo (10). É

possível que citocinas e o próprio GH possam ter um efeito feedback positivo nas células

imunes, aumentando a secreção de GH dessas células, que são constantemente mobilizadas

para os sítios de inflamação, o que possibilita manter localmente o nível deste hormônio até

que a inflamação se resolva (10, 171).

Muitos investigadores têm mostrado ação endócrina e autócrino/parácrina do GH e/ou

IGF-I em estimular a linfopoiese e a granulopoiese (173-175). A adição de GH recombinante

humano a células da medula óssea humana incubadas com GM-CSF dobrou o número de

células precursoras que se diferenciaram em granulócitos. O IGF-I quando foi adicionado a

esta cultura também causou o mesmo efeito e o uso de anticorpo específico para o receptor do

IGF-I bloqueou o aumento nos granulócitos. Células da medula óssea podem secretar IGF-I

após estímulo com GH e este IGF-I derivado destas células foi o responsável pela

diferenciação dos granulócitos (173). GH estimulou a proliferação de linfócitos T de

humanos normais, mas não fez isso nos linfócitos de pessoas com Síndrome de Laron (175).

Estudos em animais, mostram que o GH e o IGF-I levam a aumento absoluto e

relativo do baço e do timo e têm efeitos linfoproliferativos nas células imunocompetentes

destes órgãos (176, 177). No timo, aumentou o número de células T progenitoras CD4 e CD8

(177). Esses efeitos foram bloqueados por anticorpo anti-receptor de IGF-I e anticorpo anti-

IGF-I, o que sugere que o GH tem efeitos diretos e indiretos via IGF-I, provavelmente por

secreção autócrino-parácrina de IGF-I (178, 179).

Os efeitos linfoproliferativos do GH em órgãos como o timo sugeriam que o GH

poderia ter alguma função como agente terapêutico em situações de imunodeficiências de

células T, como no tratamento da AIDS (180), de pacientes transplantados e no

envelhecimento (139).

38

O GH é um fator ativador de macrófagos em humanos (181). O GH e o IGF-I agem in

vitro e in vivo nos neutrófilos para aumentar a produção de radicais livres de oxigênio (181,

182). Essa capacidade do GH de ativar macrófagos para produzir radicais livres de oxigênio

capazes de matar bactérias intracelulares, levou a proteção de ratos normais e

hipofisectomizados contra a mortalidade induzida pela bactéria Salmonella typhimurium

(183, 184). Este efeito do GH em ativar macrófagos só poderia ser engatilhado se houvesse

um estímulo para a produção de radicais livres como a presença de uma proteína relacionada

à bactéria.

Há evidências de que o IGF-I é também um importante fator patogênico. Em

camundongos, o IGF-I favoreceu a infecção e aumentou as lesões na leishmaniose cutânea

(185, 186). As formas promastigotas da leishmania têm um receptor antigenicamente similar

a cadeia alfa do receptor do IGF-I do homem e com habilidade para se ligar especificamente

ao mesmo (187). Na leishmaniose, o IGF-I induz o crescimento das formas parasitárias in

vitro por promover a sobrevida e proliferação nos macrófagos do hospedeiro (185, 186)

através da ativação da arginase diretamente no parasita e nos macrófagos infectados,

suprindo–o com poliaminas, que é um nutriente essencial ao parasita, e reduzindo os níveis

de óxido nítrico, que tem efeito leishmanicida (188, 189).

Os experimentos com camundongos lit/lit (com mutação no GHRHR) e com deleção

do IGF-I mostraram que a linfopoiese primária dessas estirpes é normal (149). Além disso, as

respostas imune celular, humoral e inata nos camundongos lit/lit foram similares às respostas

da ninhada controle normal (190). Assim, Dorshkind e Horseman (153) defendem que GH e

IGF-I não são essenciais para o desenvolvimento ou função do sistema imunológico, já que

ratos deficientes em GH e IGF-I e crianças com deficiência de GH têm imunidade normal.

Para eles, o GH e o IGF-I são promotores do crescimento geral, com ações em vários órgãos,

sendo hormônios anabólicos e moduladores do estresse em muitas células, incluindo as

imunes.

Há evidências in vitro e em animais das ações dos hormônios pituitários no sistema

imunológico, mas há poucos e divergentes dados sobre essa interação nos seres humanos.

Estudos em crianças DGH não acharam diferenças no número de linfócitos B, de linfócitos T

helper e supressores/citotóxicos em relação a controles, na condição basal (191-194), mas o

número e a atividade das células NK foi diminuída (191, 192) ou semelhante (193) nas

crianças DGH comparadas aos controles. Adultos com DGH severo por pan-hipopituitarismo

apresentaram menor concentração, proporção e menor atividade de células NK, aumento no

número total e proporcional de células T helper CD4+ e similar concentração de células

39

CD8+, quando comparados aos controles normais, sendo levantado a possibilidade da menor

atividade das células NK ser compensada pela maior concentração de células T CD4 + (195).

Mukherjee e colaboradores (196) encontraram deficiência na resposta imune humoral

em adultos com hipopituitarismo, mesmo com reposição estável de GH e dos demais

hormônios, evidentes principalmente naqueles com menores níveis de IGF-I prévios ao

tratamento com GH e menores níveis de prolactina.

A mortalidade geral é aumentada no hipopituitarismo, estando as infecções entre as

principais causas de morte, no entanto, em levantamento realizado em 2013, mais da metade

destas mortes aconteceram por inadequado tratamento do hipocortisolismo durante um

quadro infeccioso (197). Um outro estudo encontrou também uma maior frequência de

doenças respiratórias como causa de mortalidade em pacientes com hipopituitarismo, mas

não foi encontrado uma associação destas mortes com a DGH (198). A morbidade por

infecções também foi aumentada na DGH (199), mas não há dados em pacientes adultos com

DIGH e que não tenham feito reposição de GH. Além disso, houve maior morbidade por

câncer, doenças endócrinas, circulatórias, pulmonar, urogenital, traumas, parecendo haver

relação com a doença pituitária geral (199), com seus vários déficits, particularidades das

reposições e tratamentos relacionados à doença de base como irradiação. No contexto clínico

geral, crianças com DGH têm imunidade normal e não há dados demonstrando maior taxa de

infecções na DIGH.

Em suma, há uma grande rede de comunicação entre o sistema imunológico e o

endócrino. Hormônios e citocinas compartilham mesmo sítio de ativação de receptores,

hormônios são secretados por células do sistema imunológico e estas apresentam os

respectivos receptores hormonais, e receptores de citocinas são encontrados na pituitária.

Alguns hormônios como o GH e a prolactina têm ações similares entre si e antagônicas a

outros, como o glicocorticóide. Esse sinergismo de ações pode fazer com que a deficiência

isolada de um hormônio seja compensada por esta rede imune-neuroendócrina, não levando a

alterações imunes relevantes, apesar do papel comprovado do sistema GH/IGFs no sistema

imunológico (152, 153). É possível que as pequenas concentrações locais destes peptídeos

sejam predominantes para manutenção das funções imunes, superando a atividade do GH

pituitário e do IGF-I circulante.

40

3 OBJETIVOS

Geral

Avaliar a frequência de infecções prévias e a resposta imune humoral e celular em

indivíduos adultos com DIGH.

Específicos

Comparar os indivíduos DIGH e controles genotipados sem esta mutação em relação

a:

a) Frequência das doenças: tuberculose, hepatite B, hepatite C, leishmaniose,

amigdalite de repetição, hanseníase, doença de Chagas, doenças diarreicas agudas,

pneumonias e de sorologias positivas para doença de Chagas, leishmaniose,

hepatite B, hepatite C, tétano, HIV;

b) Reatividade aos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia: PPD, candidina e

estreptoquinase;

c) Concentração sérica de imunoglobulinas: IgG total, IgA, IgM e IgE;

d) Resposta à vacinação para hepatite B, tétano toxóide e BCG.

41

4 METODOLOGIA

Indivíduos com DIGH não tratados e controles pareados por idade e sexo, residentes

na cidade de Itabaianinha, foram chamados para participar do estudo através de convites

durante reuniões na associação local dos anões de Itabaianinha ou por meio de ligações

telefônicas para os indivíduos que já haviam sido genotipados em estudos prévios. Toda a

parte experimental do estudo foi desenvolvida entre o ano de 2012 até meados de 2015. O

estudo foi realizado em duas etapas: na primeira, um estudo transversal, onde participaram

todas as pessoas convidadas, sendo o critério de inclusão para o grupo DIGH ter um genótipo

homozigoto para a mutação C.57 + 1G > A no GHRHR, enquanto os controles foram

indivíduos com estatura normal e genótipo normal para a mutação C.57 + 1G > A no

GHRHR. Não houve critério de exclusão nesta fase inicial do estudo e só compareceram

indivíduos adultos, com vinte anos de idade ou mais. A segunda etapa, um estudo de casos

com grupo controle, incluiu testes cutâneos de hipersensibilidade tardia (Derivado Proteico

Purificado (PPD), estreptoquinase e candidina), avaliação da resposta imunológica através da

quantificação dos níveis de imunoglobulinas (IgG total, IgA, IgM e IgE) e avaliação da

resposta às vacinações para a hepatite B, tétano toxóide e para o bacilo Calmette-Guérin

(BCG). Para esta parte, os critérios de inclusão foram idade entre 20 anos e 65 anos, e de

exclusão: infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), doenças clinicamente

evidentes como infecções agudas, malignidades, doenças autoimunes como artrite

reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico, uso de medicações antialérgicas e glicocorticóides

ou condições como gravidez, que afetem a resposta imunológica. Foi obtido consentimento

por escrito de todos os indivíduos. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética da

Universidade Federal de Sergipe (CAAE: 01741012600000058).

Trinta e cinco indivíduos com DIGH e 31 controles foram avaliados na primeira parte

do protocolo. Esta etapa (objetivo a) consistiu da aplicação de um questionário clínico

(apêndice B) com a história pregressa e atual de doenças infecciosas (tuberculose, hanseníase,

amigdalite de repetição (mais de 5 episódios em 1 ano), diarréia com febre e vômitos antes

dos 5 anos, pneumonias, calazar, hepatite B, hepatite C, estreptococcia com febre reumática),

de vacinações para hepatite B, tétano toxóide, BCG e rotavírus, além de exame físico,

dosagem de exames hormonais (IGF-I e prolactina) e de sorologias para tétano, doença de

Chagas, HIV, leishmaniose, hepatite B e hepatite C. Dois controles não responderam ao

questionário, mas foram submetidos ao exame físico e a coleta sanguínea para dosagem das

sorologias e hormônios. O sangue para dosagem das sorologias e exames hormonais foi

42

coletado na cidade de Itabaianinha, pela manhã, após jejum noturno, seguindo-se a

centrifugação e transporte sob refrigeração ao laboratório do Hospital Universitário, e

estocagem em freezer a – 30 graus. A distância entre Itabaianinha e o laboratório é de

aproximadamente 121 quilômetros. Os exames foram realizados na semana seguinte à coleta.

As seguintes metodologias foram utilizadas:

a) Prolactina por Fluoroimunoensaio (Perkin Elmer Life and Analytical Science, Wallac Oy

Turku, Finland) com sensibilidade de 1,44 ng/ml.

b) IGF-I por ensaio imunométrico marcado com enzima quimioluminescente em fase sólida,

IMMULITE 2000 (Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd, Malvern, PA, USA),

com sensibilidade de 25 ng/ml.

c) Sorologia para Doença de Chagas anticorpos IgG por quimioluminescência por

micropartículas (CMIA): Chagas Architect Systems-Abbott (ARCHITECT-ABBOTT) e

confirmado quando positivo por imunofluorescência indireta: Imuno-COM CHAGAS

WAMA Diagnóstica, sendo considerado reagente valores ≥ 1/40.

d) Sorologia para Leishmania anticorpos IgG por imunofluorescência indireta (IFA)

(Leishmania IFA Vircell® fornecido pela Medivax), sendo considerado reagente valores ≥

1/40.

e) Sorologia para Hepatite C: Anti-HCV (vírus da Hepatite C) por

Eletroquimioluminescência (ECLIA), ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics), sendo

considerado reagente a presença de anticorpos.

f) Sorologia para hepatite B: Anti-HBc (anticorpos contra antígenos do nucleocapsídeo

(core) do vírus da hepatite B), Anti-HBcTotal, Anti-HBcIgM e HBsAg (antígeno de

superfície do vírus da hepatite B) por ECLIA, ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics),

sendo reagente a presença de anticorpos, e Anti-HBs (anticorpos para hepatite B) também

pela mesma metodologia, com limite de detecção de 2 mUI/ml, sendo não reagente

dosagens até 10 mUI/ml.

g) Anticorpos HIV 1 e 2 por quimioluminescência (Abbott Laboratórios Diagnóstico), sendo

reagente a presença de anticorpos.

h) Sorologia para tétano por Radioimunoensaio ou ELISA (RIDASCREEN® Tetanus IgG

R-Biopharm), ambas as técnicas com limite de detecção de 0,1 UI/ml. Foi considerada

imunidade títulos maiores que 1 UI/ml para o Radioimunoensaio e maiores que 0,6 UI /ml

para o ELISA.

O fluxograma 1 delineia esta parte do experimento.

43

Fluxograma 1: Primeira etapa experimental para seleção dos indivíduos para comparação da frequência de doenças infecciosas e de sorologias positivas para doença de Chagas, leishmaniose, hepatite B, hepatite C, tétano e HIV, entre indivíduos DIGH e controles.

Na segunda etapa (objetivos b), um grupo de 25 DIGH e 25 controles foi convidado

para a avaliação da resposta imune celular in vivo através de testes cutâneos de

hipersensibilidade tardia. Dos 25 indivíduos com DIGH selecionados, 22 compareceram, mas

um deles não quis participar do exame após explicação de como seriam as aplicações e data

de retorno para leitura do teste. Já nos controles, 20 indivíduos compareceram para realização

66 indivíduos selecionados e explicado pesquisa para consentimento

DIGH = 35 indivíduos

Homozigotos para a

mutação C.57 + 1G > A

Controle = 31 indivíduos

Homozigotos normais para a

mutação C.57 + 1G > A,

pareados para idade e sexo

SELEÇÃO Convite em reuniões na associação

dos anões de Itabaianinha ou contato telefônico em banco de dados de

indivíduos previamente genotipados

Amostra selecionada por conveniência, Critério de inclusão: genótipo homozigoto para mutação C.57 + 1G > A ou homozigoto normal. Não houve critérios de exclusão

Questionário clínico sobre as condições gerais de vida, antecedentes de vacinações para o tétano, hepatite B, BCG, pneumonia, rotavírus (conferências dos cartões de vacinas, se possível) e sobre a história de doenças infecciosas e tratamentos prévios já realizados, e exame físico.

Dosagem de prolactina e IGF-I e sorologia para HIV, doença de Chagas, leishmania, hepatite B, hepatite C e tétano

44

dos testes cutâneos. Um indivíduo controle foi excluído da análise do teste com a candidina

por problemas técnicos no momento da aplicação deste antígeno. Posteriormente, os três

indivíduos DIGH, que não compareceram inicialmente para realização dos testes cutâneos,

realizaram o teste cutâneo com o PPD, além de oito indivíduos controles genotipados, que

não participaram da primeira parte do protocolo. O tempo entre a realização do teste com o

PPD entre o primeiro e o segundo grupo foi de cerca de 30 dias. Assim, 24 DIGH e 28

controles foram submetidos ao teste cutâneo de hipersensibilidade tardia com o PPD; 21

DIGH e 20 controles, com o antígeno estreptoquinase e 21 DIGH e 19 controles, com a

candidina.

O PPD utilizado foi procedente do Statens Serum Institut na Dinamarca: Tuberculina

PPD RT 23 SSI 2 U.T./ 0,1 ml, lote número 1624B, validade até 05-2016. Já os testes

intradérmicos com estreptococos e Cândida albicans foram adquiridos com a Immunotech,

Rio de Janeiro, Brasil, sendo manipulados em 14.04.14 e tendo validade até 14.10.15:

Streptococcus sp 100.000.000 BCT/ml (referência 14018/603) e Cândida albicans 1:100

(referência 14018/604).

Os testes foram realizados na cidade de Itabaianinha pela mesma técnica (ACSN). A

aplicação foi precedida de orientações sobre o teste, possíveis efeitos colaterais, cuidados

após a aplicação como não friccionar o local e marcado horário de retorno para a leitura

(200). Foi inoculado 0,1 ml dos antígenos tuberculina purificada (PPD) RT 23, do filtrado de

cultura Streptococcus sp e Cândida albicans, por via intradérmica, com 4 cm de distância um

do outro na face flexora do antebraço esquerdo, cerca de 4 cm abaixo da curvatura do

cotovelo, em local com pouco pêlos, sem cicatrizes ou lesões e distante de veias calibrosas. O

local em volta de cada aplicação foi circulado com caneta estereográfica para melhor

identificação e orientado reforçar o círculo, caso preciso. A leitura dos testes foi feita 48 h

após inoculação dos antígenos. O teste foi considerado positivo quando o diâmetro da

induração foi maior ou igual a 5 mm. Para leitura foi utilizada uma régua milimetrada

transparente de 10 cm.

O esquema representando o número final de participantes, que realizaram os testes

cutâneos de hipersensibilidade tardia em cada grupo, está apresentado no fluxograma 2.

45

Fluxograma 2: Número de indivíduos submetidos aos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia em cada grupo.

Leitura 48 horas após aplicação

Positivo induração ≥ 5 mm

Ainda nesta segunda etapa (objetivo c e d), convocamos quinze indivíduos DIGH e

quinze controles, cujo critério de inclusão foi, além da idade entre 20 e 65 anos, apresentar

sorologias negativas para tétano e/ou hepatite B. Foi procedida a coleta de sangue para a

dosagem das imunoglobulinas séricas IgG total, IgA, IgM e IgE, e a vacinação para tétano

e/ou hepatite B. Treze indivíduos DIGH e quinze controles compareceram no local para

coleta de imunoglobulinas e posterior vacinação. Dois indivíduos com DIGH não quiseram

fazer a coleta sanguínea, mas foram vacinados e um controle foi excluído da análise após

diagnóstico de um carcinoma do colo uterino, não finalizando a vacinação. Dois DIGH e um

outro controle também não completaram a vacinação: dois DIGH por efeitos colaterais no

local da vacina e o controle abandonou a vacinação. Assim, a análise da dosagem sérica das

imunoglobulinas foi feita em onze indivíduos DIGH e quatorze controles e a resposta à

vacinação foi analisada em onze indivíduos com DIGH e treze controles.

As imunoglobulinas séricas IgG total, IgM e IgA foram dosadas por imunoturbimetria

intensificada por polietileno glicol (PEG) – Siemens (Advia 2400), sendo os valores de

referência 700 a 1600 mg/dl (limite de detecção 140 mg/dl); 50 a 300 mg/dl (limite de

detecção 21 mg/dl) e 40 a 350 mg/dl (limite de detecção 33 mg/dl), respectivamente. A IgE

PPD 24 DIGH e 28 controles

0,1 ml de tuberculina purificada

Estreptoquinase 21 DIGH e 20 controles

0,1 ml de filtrado de Streptococcus sp

Candidina 21 DIGH e 19 controles

0,1 ml de filtrado de Cândida albicans

Aplicação: intradérmica, na face flexora do antebraço esquerdo cerca de 4 cm abaixo da curvatura do cotovelo, em local com pouco pêlos, sem cicatrizes ou lesões e

distante de veias calibrosas. Cada antígeno foi inoculado com cerca de 4 cm de distância um do outro.

46

foi dosada pelo método imunológico não competitivo, com valor de referência inferior a 160

UI/ml.

As vacinas foram aplicadas na sala de vacinação, no posto de Saúde da cidade de

Itabaianinha, por enfermeira responsável pelo Programa de Vacinação, Ana Célia Simões do

Nascimento (ACSN), habilitada pelo Ministério da Saúde em Atualização de Administração

de PPD e Capacitação de Sala de Vacina. A conservação das vacinas e os procedimentos para

aplicação das mesmas estavam de acordo com as orientações do Manual de Normas e

Procedimentos para a Vacinação do Ministério da Saúde (201). A positividade sorológica foi

avaliada após 30 dias da última dose da vacina para hepatite B, e 150 dias da última dose do

tétano. A vacina adsorvida da hepatite B foi aplicada em 3 doses de 1 ml via intramuscular no

músculo deltoide, com 30 e 180 dias após a dose inicial, sendo produzida pelo Instituto

Butantan em São Paulo, Brasil e cada 1,0 ml contém 25 mcg da proteína de superfície do

vírus da hepatite B (recombinante). Já a vacina adsorvida difteria e tétano adulta,

TETADIF®, foi aplicada em 3 doses intramuscular de 0,5 ml (contendo pelo menos 40 UI/ml

do toxóide tetânico) após 30 e 60 dias da dose inicial (201) e foi produzida pela BB-NCIPD

na Sofia, Bulgária e distribuída pela InterVax, Toronto, Canadá.

O esquema da seleção dos indivíduos para coleta das imunoglobulinas séricas e

vacinação para hepatite B e tétano está apresentado no fluxograma 3.

47

Fluxograma 3: Seleção dos indivíduos para coleta das imunoglobulinas séricas e vacinação para hepatite B e tétano.

SELEÇÃO

15 indivíduos DIGH e 15 controles com sorologia negativa para hepatite B e/ou tétano e idade ≥ 20 e ≤ 65 anos

Coleta de sangue para dosagem de imunoglobulinas séricas (11 DIGH e 14 controles)

13 DIGH e 15 controles compareceram

Hepatite B 12 DIGH e 14 controles

Tétano 13 DIGH e 12 controles

- Anticorpos foram dosados: - 30 dias após última dose do esquema 0, 30 e 180 dias da vacina adsorvida da

hepatite B, 1 ml cada aplicação - 120 dias após última dose do esquema 0, 30 e 60 dias da vacina adsorvida difteria

e tétano adulto (dT), 0,5 ml cada aplicação

Anti-HBs ≥ 10 mIU/ml (positividade sorológica)

Níveis de IgG para tétano > 0.6 IU / ml (positividade sorológica)

2 DIGH não coletaram sangue para dosar as imunoglobulinas

2 DIGH e 1 controle não finalizaram a vacinação

Hepatite B 10 DIGH e 13 controles

Tétano 11 DIGH e 11 controles

1 controle excluído por malignidade; 1 DIGH Anti-HBs + e 2 controles anticorpos + para tétano não se vacinaram respectivamente para hepatite B e tétano

Vacinação

48

Quinze indivíduos DIGH e dez controles, que não foram reatores (induração menor

que 5 mm) ao teste com PPD, foram convocados para vacinação com BCG, lote 4021,

validade 31.10.16, fornecida pelo Ministério da Saúde, sendo aplicada via intradérmica, 0,1

ml da solução homogeneizada após diluição com cloreto de sódio, em braço direito, na altura

da inserção inferior do músculo deltóide. A aplicação foi feita pela mesma pessoa que

realizou o teste cutâneo. Após 60 dias da vacinação, um novo teste cutâneo com PPD foi feito

nestes indivíduos, seguindo o mesmo protocolo descrito acima.

O fluxograma 4 representa a vacinação com o BCG em não reatores ao PPD e a

leitura 48 h após aplicação de um novo teste com PPD.

Fluxograma 4: Número de indivíduos vacinados com o BCG e submetidos a novo PPD.

Leitura 48 horas após aplicação do PPD

Positivo induração ≥ 5 mm

15 DIGH e 10 controles não reatores ao PPD

Aplicação intradérmica: 0,1 ml da vacina BCG, em braço direito, na altura da inserção inferior do músculo deltóide, e feito novo PPD após 60 dias da vacinação

49

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os valores para variáveis contínuas foram expressos como média (desvio padrão). As

variáveis com distribuição não normal (IGF-I, prolactina, diâmetro da pápula da

estreptoquinase e PPD e IgA) foram expressas como mediana (distância interquartil). A

distância interquartil foi calculada entre os quartis 25 e 75. As porcentagens foram

comparadas com o teste exato de Fisher. Os dados com distribuição normal foram

comparados usando o teste t de Student e aqueles com distribuição não gaussiana foram

comparados com o teste U de Mann-Whitney. Análise univariada de variância foi utilizada

para avaliar a dimensão do efeito e o poder observado das variáveis com diferença

significante entre os 2 grupos. A análise estatística foi realizada usando o programa estatístico

da IBM® SPSS® Versão 20. Os valores de probabilidade < 0,05 foram considerados

estatisticamente significantes. Cada objetivo foi avaliado conforme descrito abaixo:

a) Objetivo a: Comparar a frequência de doenças infecciosas e dos resultados

sorológicos entre indivíduos DIGH e controles → Teste exato de Fisher

→ IGF-I e prolactina expressos em mediana (distância interquartil) e comparados

pelo teste U de Mann-Whitney.

Objetivo b: Comparar a reatividade aos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia:

PPD, candidina e estreptoquinase, entre os indivíduos DIGH e controles.

→ diâmetro da induração expresso em média (desvio padrão) e comparados pelo teste

t de Student, exceto o da estreptoquinase e PPD, que foram expressos em mediana

(distância interquartil) e comparados pelo teste U de Mann-Whitney.

→ frequência de positivos após os testes cutâneos: comparados pelo teste exato de

Fisher.

b) Objetivo c: Comparar os níveis de imunoglobulinas, IgG total, IgA, IgM e IgE, entre

os indivíduos DIGH e controles → Variáveis expressas média (desvio padrão) e

comparadas pelo teste t de Student, exceto IgA expressa em mediana (distância

interquartil) e comparada pelo teste U de Mann-Whitney.

c) Objetivo d: Comparar a resposta à vacinação para hepatite B, tétano toxóide e BCG

entre os indivíduos DIGH e controles

50

→ níveis de anticorpos expressos em média (desvio padrão) e comparados pelo teste t

de Student, exceto Anti-HBs pré vacinação expresso em mediana (distância

interquartil) e comparado pelo teste U de Mann-Whitney.

→ frequência de positivos após vacinação: comparados pelo teste exato de Fisher.

51

6 RESULTADOS

Comparação da frequência de doenças infecciosas e de sorologias positivas para doença

de Chagas, leishmaniose, hepatite B, hepatite C, tétano, HIV, entre indivíduos DIGH e

controles (Objetivo a).

Foram avaliados 66 indivíduos residentes no município de Itabaianinha há pelo menos

20 anos, genotipados previamente em outros estudos com este grupo populacional, já

havendo registros em arquivos do banco de dados do grupo de pesquisa iniciada em 1994. A

avaliação foi feita através de questionário clínico, exame físico, dosagens hormonais (IGF-I e

prolactina) e realização de exames sorológicos para doença de Chagas, leishmaniose, hepatite

B, hepatite C, tétano e HIV. Os 66 indivíduos avaliados foram divididos em 2 grupos: DIGH

35 indivíduos (53%), com genótipo apresentando a mutação C.57 + 1G > A nos 2 alelos no

gene do receptor do GHRH e controle, 31 (47%), homozigoto normal para ambos os alelos.

Dois indivíduos controles (3%) não responderam ao questionário clínico, por abandonar o

local antes de responder ao questionário, mas foram submetidos a coleta sanguínea e ao

exame físico.

A comparação dos dados antropométricos e resultados hormonais dos dois grupos são

apresentados na tabela 1.

52

Tabela 1: Comparação dos dados antropométricos (idade, sexo, EDP (escore de desvio padrão) para peso, peso, EDP para altura, altura, EDP para índice de massa corpórea (IMC), IMC e superfície corpórea (SC)) e hormonais (IGF-I e prolactina) entre os indivíduos com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.

DIGH Controles N 35 31 P

Idade (anos)

Variação

45,8 (18)

23 a 89

47,6 (16,9)

25 a 83

0,686

Sexo 18 H (51,4%) 17 H (54,8%) 0,809

IGF-I (ng/ml) 25 (0) 128 (125) < 0,0001

Range 25 to 37,2 43,3 to 270

Prolactin (ng/ml) 6,4 (4,1) 10,9 (19) 0,34

Range 2,1 to 33,9 3,42 to 33,9

Peso (kg)

Variação

38,6 (8,2)

23,9 a 58,2

66,2 (11,1)

46,3 a 88,2

< 0,0001

EDP Peso

Variação

-5,2 (3,0)

- 11,2 a – 0,01

-0,1 (1,3)

- 4,1 a 1,8

< 0,0001

Altura (cm)

Variação

126,3 (10,3)

103 a 143

161,7 (9,9)

145 a 179,5

<0,0001

EDP Altura

Variação

-6,96 (1,6)

- 10,1 a – 3,5

-1,5 (1,1)

- 3,5 a 0,5

<0,0001

IMC (kg/m²)

Variação

24,7 (7)

15 a 47,3

25,3 (3,9)

18,8 a 33,2

0,63

EDP IMC

Variação

0,02 (2,2)

- 5,1 a 4,1

-0,6 (1,2)

- 2,1 a 2,6

0,206

SC (m²)

Variação

1,1 (0,1)

0,8 a 1,4

1,7 (0,2)

1,4 a 2,0

<0,0001

N = número de indivíduos em cada grupo; H = homem; kg (quilograma); cm (centímetros); as variáveis são apresentadas como média (desvio padrão) e comparadas pelo teste t de Student, exceto IGF-I e prolactina, expressos em mediana (distância interquartil) e comparados pelo teste U de Mann-Whitney; a variável sexo foi comparada pelo teste exato de Fisher; p < 0,05

Como esperado, a altura, o peso, a superfície corpórea e os níveis de IGF-I foram

menores no grupo DIGH.

A comparação das características gerais de habitação, do estado civil, da renda mensal

e do nível educacional de cada grupo está na tabela 2.

53

Tabela 2: Comparação das condições gerais de habitação, do estado civil, da renda mensal e do nível educacional entre os grupos com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.

DIGH Controle P

N 35 29

Sexo 18 H (51,4%) 17 H (58,6%) 0,62

Idade (anos) 45,8 (18) 47,7 (17,1) 0,67

Variação (anos) 23 a 89 25 a 83

Solteiro 24 (68,6%) 5 (17,2%) < 0,0001

Casado 10 (28,6%) 21 (72,4%) 0,0009

Divorciado 1 (2,9%) 3 (10,3%) 0,32

Luz elétrica 35 (100%) 29 (100%) 1,0

Água encanada 31 (88,6%) 24 (82,8%) 0,72

Esgoto sanitário 25 (71,4%) 17 (58,6%) 0,30

Fossa 8 (22,9%) 11 (37,9%) 0,27

Esgoto a céu aberto 2 (5,7%) 1 (3,4%) 1,0

Casa de taipa 2 (5,7%) 0 0,50

Casa rebocada com pintura 4 (11,4%) 1 (3,4%) 0,12

Casa rebocada sem pintura 29 (82,9%) 28 (96,6%) 0,37

< 1 SM 11(31,4%) 1 (3,4%) 0,008

1 a 3 SM 23 (65,7%) 26 (89,7%) 0,04

4 a 7 SM 1 (2,9%) 2 (6,9%) 0,59

Analfabeto 6 (17,1%) 5 (17,2%) 1,0

Fundamental completo 1 (2,9%) 3 (10,3%) 0,32

Fundamental incompleto 16 (45,7%) 15 (51,7%) 0,80

Médio completo 5 (14,3%) 2 (6,9%) 0,44

Médio incompleto 1 (2,9%) 2 (6,9%) 0,59

Superior completo 3 (8,6%) 2 (6,9%) 1,0

Superior incompleto 3 (8,6%) 0 0,25

N = número de indivíduos em cada grupo; H = homem; SM = salário mínimo; a variável idade é expressa em média (desvio padrão) e foi comparada pelo teste t de Student; as variáveis qualitativas são apresentadas como número de indivíduos que responderam sim à pergunta (porcentagem); sendo comparadas pelo teste exato de Fisher; p < 0,05.

54

Os dados sócio-econômicos são semelhantes entre os dois grupos, com a ressalva do

maior número de solteiros e a menor renda familiar na DIGH.

Sessenta e quatro indivíduos foram questionados sobre os antecedentes de vacinações

para tuberculose (BCG), tétano, hepatite B, rotavírus e pneumococo. A tabela 3 mostra a

comparação do número de indivíduos entre os grupos DIGH e controles, que informaram já

ter recebido essas vacinas. Quando possível, foi feita a confirmação através dos dados do

cartão de vacinação.

Tabela 3: Comparação do relato de vacinações já recebidas entre os grupos com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.

Vacinações prévias DIGH (35) Controle (29) P

BCG Sim 19 (54,3%) 17 (58,6%) 0,80

BCG Não 5 (14,3%) 6 (20,7%) 0,53

BCG NS 11(31,4%) 6 (20,7%) 0,40

Tétano Sim 25 (71,4%) 21(72,4%) 1,0

Tétano Não 0 3 (10,3%) 0,09

Tétano NS 10 (28,6%) 5 (17,2%) 0,12

Hepatite B Sim 6 (17,1%) 4 (13,8%) 1,0

Hepatite B Não 20 (57,1%) 16 (55,2%) 1,0

Hepatite B NS 9 (25,7%) 9 (31%) 0,78

Rotavírus Não 35 (100%) 29 (100%) 1,0

Pneumo Sim 0 1 (3,4%) 0,45

Pneumo Não 27 (77,1%) 21 (72,4%) 0,77

Pneumo NS 8 (22,9%) 7 (24,1%) 1,0

N = número de indivíduos em cada grupo; H = homem; NS = não sabe informar; as variáveis qualitativas são apresentadas como número de indivíduos que responderam à pergunta (porcentagem); sendo comparadas pelo teste exato de Fisher; p < 0,05.

Esses dois grupos foram também comparados em relação a história de patologias

prévias apresentadas. Essa comparação é mostrada na tabela 4.

55

Tabela 4: Comparação do número de indivíduos com doenças infecciosas prévias entre os grupos com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.

DIGH (35) Controles (29) P Doença de Chagas 0 1 0,453

Leishmaniose visceral 0 0 1,0

Hanseníase 2 1 1,0

Amigdalite de repetição

Gastroenterite na infância

3

1

1

2

0,619

0,586

Pneumonia 2 2 1,0

Hepatite B 0 0 1,0

Hepatite C 0 0 1,0

Tuberculose 0 0 1,0

Febre reumática 0 0 1,0

Amigdalite de repetição: mais de 4 infecções em 1 ano; as variáveis qualitativas foram comparadas pelo teste exato de Fisher; a idade é representada como média (desvio padrão) e foi comparada pelo teste t de Student.

Os resultados dos exames sorológicos de cada grupo estão apresentados na tabela 5.

Tabela 5: Comparação do número de indivíduos com resultados sorológicos positivos entre os grupos com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e controles.

DIGH Controles P N 35 31

Positividade para Chagas 1 2 0,597

Positividade para Leishmania 2 3 0,659

Positividade para Hepatite B 0 0 1,0

Positividade para Hepatite C 0 0 1,0

Positividade para HIV 0 0 1,0

Positividade para tétano 6 7 0,758

N = número de indivíduos em cada grupo; as variáveis qualitativas foram comparadas pelo teste exato de Fisher. .

Não houve diferença na história de doenças infecciosas, nos resultados sorológicos

para doença de Chagas, leishmaniose, HIV, hepatite B, hepatite C e tétano entre os grupos.

Dois DIGH e 3 controles tiveram sorologia positiva para leishmaniose e foram avaliados para

o diagnóstico de leishmaniose visceral através de Hemograma, dosagem de transaminases

56

(alanina transaminase e aspartato aminotransferase), proteínas totais e frações, coagulograma,

rK 39 (Kalazar Detect® Teste Rápido, fornecido pela Bios Internacional Inc., Seattle, WA) e

o teste cutâneo de Montenegro (teste utilizando antígenos da Leishmania amazonensis

produzido pela FIOCRUZ, Rio de Janeiro). Nenhum dos sujeitos apresentou esplenomegalia

nem alterações aos exames, não sendo diagnosticada leishmaniose visceral em nenhum deles.

Um DIGH e 2 Controles tinham sorologia positiva para doença de Chagas e foram

submetidos a exames complementares de eletrocardiograma e radiografia de tórax. Em 1

controle foi confirmado doença de Chagas com cardiomiopatia dilatada.

Comparação da reatividade aos testes cutâneos (Objetivo b) entre os indivíduos DIGH e

controles.

Cinquenta e dois indivíduos foram submetidos a testes cutâneos de hipersensibilidade

tardia: candidina, estreptoquinase e/ou PPD.

Todos os 52 adultos foram submetidos ao teste cutâneo com PPD, sendo 24 DIGH e

28 controles. A idade dos indivíduos com DIGH foi 41,7 (12,7) anos (mínimo de 25 e

máximo de 64 anos) e nos controles, 40,1 (11,7) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,64).

Na DIGH, 11 (45,8%) eram homens e nos controles, 9 (32,1%), p = 0,39. Não houve

diferença na frequência de positividade do PPD (DIGH 4 (16,7%) e Controles 10 (35,7%), p

= 0,21) nem no diâmetro da pápula (DIGH, 1,0 (2,75) mm e Controles, 2,0 (6,0) mm, p =

0,178). O diâmetro da pápula formada após a inoculação do antígeno variou de 0 a 9 mm na

DIGH e de 0 a 20 mm, nos controles. A figura 4 mostra a comparação entre a resposta média

e individual dos 2 grupos no teste cutâneo com o PPD.

57

Figura 4: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com o PPD nos indivíduos DIGH e controles.

N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média do diâmetro da induração. P corresponde a diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da induração está expresso em mediana (distância interquartil) e foi comparado pelo teste U de Mann-Whitney. A frequência de positivos foi comparada pelo teste exato de Fisher (p = 0,21). Nos 41 indivíduos submetidos ao teste cutâneo com estreptoquinase, 21 eram DIGH e

20 controles. A idade dos indivíduos com DIGH foi 42,9 (13) anos, variando de 25 a 64 anos,

e nos controles, 44 (11,3) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,79). Na DIGH, 8 (38,1%)

eram homens e nos controles, 7 (35%), p = 1,0. Não houve diferença na frequência de

positividade: DIGH, 2 (9,5%) e controles, 5 (25%), p = 0,24. O diâmetro da pápula foi menor

na DIGH do que nos controles, 2,0 (2,5) mm e 3,5 (1,75) mm, respectivamente, p = 0,0151.

Na DIGH, a pápula formada variou de 0 a 11 mm e nos controles, 0 a 6 mm. Um dos

indivíduos não reativo do grupo DIGH apresentou tardiamente (10 dias após o teste) a

formação de uma pápula com pequena ulceração local. A figura 5 mostra a comparação entre

a resposta média e individual dos 2 grupos no teste cutâneo com a estreptoquinase.

58

Figura 5: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com a estreptoquinase nos indivíduos DIGH e controles.

N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média do diâmetro da induração. P corresponde a diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da induração está expresso em mediana (distância interquartil) e foi comparado pelo teste U de Mann-Whitney, p < 0,05. A frequência de positivos foi comparada pelo teste exato de Fisher (p = 0,24).

Quarenta adultos foram submetidos ao teste cutâneo com candidina, sendo 21 DIGH e

19 controles. Na DIGH, a idade dos indivíduos foi 42,9 (13) anos, variando de 25 a 64 anos, e

nos controles, 44,3 (11,5) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,73). Na DIGH, 8 (38,1%)

eram homens e nos controles, 6 (31,6%) homens, p = 0,75. Não houve diferença na

freqüência de positividade da candidina (DIGH, 3 (14,3%) e Controles, 1 (5,3%), p = 0,64)

nem no diâmetro da pápula (DIGH, 2,1 (2,0) mm e Controles, 1,9 (1,5) mm, p = 1,0). Na

DIGH, a pápula formada variou de 0 a 7 mm e nos controles, 0 a 5 mm. A figura 6 mostra a

comparação entre a resposta média e individual dos 2 grupos no teste com a candidina.

59

Figura 6: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com a candidina nos indivíduos DIGH e controles.

N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média do diâmetro da induração. P corresponde a diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da induração está expresso em média (desvio padrão) e foi comparado pelo teste t de Student. A frequência de positivos foi comparada pelo teste exato de Fisher (p = 0,64).

Dos adultos submetidos a todos os três testes cutâneos, 21 eram DIGH e dezenove,

controles. A idade na DIGH foi 42,9 (13) anos, variando de 25 a 64 anos, e nos controles,

44,3 (11,2) anos, variando de 20 a 61 anos (p = 0,73). Na DIGH, oito (38,1%) homens e nos

controles, seis (31,6%), p = 0,75. Dezesseis (76,2%) DIGH e 8 (42,1%) controles não foram

positivos em nenhum dos três testes cutâneos, p = 0,0515. Houve um maior número de

indivíduos positivos a pelo menos um teste cutâneo no grupo controle (DIGH, 3 (14,3%) e

Controles, 9 (47,4%), p = 0,038). A tabela 6 mostra individualmente o número de testes

cutâneos positivos e aqueles que apresentaram todos os três testes negativos.

60

Tabela 6: Resultados individuais do número de testes cutâneos positivos e dos que apresentaram todos os 3 testes negativos. DIGH 3

testes +

2 testes

+

1 teste

+

3 testes

-

Controle 3 testes

+

2 testes

+

1 teste

+

3 testes

- 1 X 1 X

2 X 2 X

3 X 3 X

4 X 4 X

5 X 5 X

6 X 6 X

7 X 7 X

8 X 8 X

9 X 9 X

10 X 10 X

11 X 11 X

12 X 12

13 X 13 X X

14 X 14 X

15 X 15 X

16 X 16 X

17 X 17 X

18 X 18 X

19 X 19 X

20 X

21 X

Total 2

9,5%

0 3

14,3%

16

72,2%

0 2

10,5%

9

47,4%

8

42,1%

A tabela 7 mostra a comparação entre os grupos do número de indivíduos que tiveram

os 3 testes negativos, um positivo, dois positivos, três positivos e o total de testes positivos de

cada grupo.

61

Tabela 7: Resultados do número de indivíduos com os 3 testes negativos, um positivo, dois positivos, três positivos e o total de testes positivos em cada grupo.

DIGH Controle P

N 21 19

Sexo (M) 8 (38,1%) 6 (31,6%) 0,7475

Idade (anos) 42,9 (13) 44,3 (11,5) 0,73

Variação (anos) 25 a 64 20 a 61

Negativo nos 3 testes 16 (76,2%) 8 (42,1%) 0,0515

Positivo nos 3 testes 2 (9,5%) 0 0,4885

Positivo em 2 testes 0 2 (10,5%) 0,2192

Positivo em 1 teste 3 (14,3%) 9 (47,4%) 0,0378

Total de testes positivos 9 /63 (14,3%) 13/57 (22,8%) 0,3471

N = número de indivíduos em cada grupo; M = masculino; a variável idade é expressa em média (desvio padrão) e foi comparada pelo teste t de Student; as variáveis qualitativas são apresentadas como número de indivíduos (porcentagem), exceto total de testes positivos que é o número de testes positivos/número total de testes; sendo comparadas pelo teste exato de Fisher; p < 0,05.

Dos nove testes positivos no grupo DIGH, quatro (44,4%) foram positivos ao PPD,

três (33,3%), à candidina e dois (22,2%), à estreptoquinase. Nos controles, sete (53,8%) dos

13 testes positivos foram ao PPD, cinco (38,5%), à estreptoquinase e um (7,7%), à candidina.

Comparação das concentrações séricas de imunoglobulinas entre os indivíduos DIGH e

controles (Objetivo c).

Onze indivíduos DIGH e quatorze controles tiveram amostras sanguíneas coletadas

para a dosagem de imunoglobulinas.

A tabela 8 mostra os níveis séricos de imunoglobulinas. Os indivíduos com DIGH

apresentaram níveis de IgG menores do que os controles, mas dentro da variação normal para

metodologia do exame.

62

Tabela 8: Comparação dos resultados dos níveis séricos de imunoglobulinas dos indivíduos DIGH e Controles.

DIGH Controles P

N 11 14

Sexo 7 H (63,6%) 6 H (42,9%) 0,43

Idade (anos)

Variação

41,1 (12,8)

25 a 58

45,6 (11,5)

28 a 61

0,37

IgA (mg/dl)

Variação

277,1 (53)

163,1 a 538,7

199,1(122,7)

95,3 a 517

0,11

IgG (mg/dl)

Variação

1049,9 (197,9)

695 a 1355

1346,3 (401,9)

471 a 1971,9

0,03

IgE (UI/ml)

Variação

743 (631,5)

31,7 a 2001

439.9 (680,5)

14 a 2001

0,26

IgM (mg/dl)

Variação

160,5 (61,3)

64,3 a 253,8

141,9 (40,8)

93,4 a 223

0,40

N = número de indivíduos; H = homens; IgA, IgG, IgE e IgM: imunoglobulinas A, G, E e M; as variáveis são apresentadas como média (desvio padrão) e comparadas pelo teste t de Student, exceto os valores de IgA que são expressos como mediana (distância interquartil) e comparados pelo teste U de Mann-Whitney; a variável sexo foi comparada pelo teste exato de Fisher; p < 0,05.

Comparação da resposta à vacinação para hepatite B, tétano toxóide e BCG entre os

indivíduos DIGH e controles (Objetivo d).

Dez DIGH e 13 controles completaram a vacinação para hepatite B e 11 DIGH e 11

controles, a vacinação para o tétano. Quatro indivíduos controles iniciaram a vacinação para

o tétano após confirmação pela história e cartão de vacinação de longo período sem reforço

desta vacina (mais de 20 anos).

A resposta a vacinação para hepatite B e tétano foi similar nos 2 grupos e está

representada na tabela 9.

63

Tabela 9: Comparação dos resultados da vacinação para hepatite B e tétano no grupo com deficiência isolada do hormônio de crescimento (DIGH) e nos Controles.

DIGH Controle

Hepatite B P

N 10 13

Sexo 7 H (70%) 6 H (46,2%) 0,4

Idade (anos)

Variação

42,3 (12,8)

25 a 58

47(10,8)

29 a 61

0,51

Anti-HBs pré (mUI/ml) 1,9 (0) 1,9 (0,81) 0,054

Variação 1,9 a 8,4 0,66 a 1,9

Anti-HBs pós (mUI/ml)

Variação

316,04(354,6)

1,9 to 1001

278,7(361,2)

1,9 to 1001

0,81

Diferença (mUI/ml) 313,49(355,2) 251,93(343,2) 0,71

Variação 0 a 999,1 0 a 1000

Imunes 70% (7) 76,9% (10) 1,0

Tétano

N 11 11

Sexo 7 H (63,6%) 5 H (45,5%) 0,67

Idade (anos)

Variação

41,1 (12,8)

25 a 58

49,4 (9,7)

32 a 61

0,10

Anticorpos pré (UI/ml) 0,15 (0,13) 0,15 (0,11) 1,0

Variação 0,09 a 0,42 0,01 a 0,34

Anticorpos pós (UI/ml)

Variação

2,33 (2,25)

0,09 a 5,1

1,75 (1,47)

0,46 a 4,97

0,48

Diferença (UI/ml) 2,12 (2,15) 1,76 (1,78) 0,70

Variação 0 a 5,01 0,21 a 4,87

Imunes 63,6% (7) 63,6% (7) 1,0

N = número de indivíduos; H = homens; Anticorpos pré = nível do anticorpo antes da vacina; Anticorpos pós = nível do anticorpo após a vacina; Diferença = diferença do nível de anticorpo pós-vacina menos o nível de anticorpo pré-vacina; imunes = número de indivíduos que alcançaram níveis de anticorpos protetivos; a idade, o nível de anticorpos e a diferença são expressos como média (desvio padrão) e comparados pelo teste t de Student; exceto o Anti-HBs pré que é expresso como mediana (distância interquartil) e comparados pelo teste U de Mann-Whitney; a porcentagem de imunes e a variável sexo foram comparadas pelo teste exato de Fisher; p < 0,05.

64

Quinze DIGH não reatores ao PPD, 42,1 (13,2) anos, variando de 28 a 64 anos e 10

controles, 39,9 (9,8) anos, variando de 30 a 61 anos, foram vacinados com BCG (p = 0,64).

Na DIGH, 9 (60%) eram homens e nos controles, 5 (50%), p = 0,70. Não houve diferença na

frequência de positividade do PPD após a vacinação com BCG (DIGH, 9 (60%) e Controles,

6 (60%), p = 1,0), nem no diâmetro da pápula (DIGH, 8,1 (7,1) mm e Controle, 7,9 (6,0) mm,

p = 0,93). Na DIGH, a pápula formada variou de 0 a 21 mm e nos controles, 0 a 16 mm. A

figura 7 representa a comparação dos dois grupos no gráfico de pontos dos valores da

induração, após 60 dias da vacinação com o BCG.

Figura 7: Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com o PPD, após 60 dias da vacina BCG, em indivíduos que não foram reativos ao PPD inicial.

N = número de indivíduos em cada grupo; pontos acima da linha tracejada indicam testes positivos (induração ≥ 5 mm). A barra horizontal representa a média. P corresponde a diferença entre o diâmetro da pápula dos 2 grupos. O diâmetro da induração está expresso em média (desvio padrão) e foi comparado pelo teste t de Student. A frequência de positivos foi comparada pelo teste exato de Fisher (p = 1,0).

65

7 DISCUSSÃO

O mais importante achado deste trabalho é que indivíduos adultos com a mutação

C.57 + 1 G > A em homozigose nos dois alelos do GHRHR têm similar frequência de

infecções, painel sorológico e de imunoglobulinas, e resposta imune a vacinações, quando

comparados com controles locais pareados para idade e sexo. No entanto, adultos com DIGH

apresentam menores níveis séricos de IgG (ainda que na variação normal), menor diâmetro da

pápula após teste cutâneo com estreptoquinase e uma tendência a menor positividade nos

testes cutâneos. A importância deste trabalho advém da inexistência de dados publicados

sobre os aspectos imunológicos na DIGH congênita em adultos não previamente tratados.

Embora estudos in vivo e in vitro tenham mostrado que GH e IGF-I são importantes

para o desenvolvimento e função do sistema imune (6, 202, 203), não é claro se DGH por si,

cause déficits imunes. Um trabalho mostrou reduzida resposta imune (196), enquanto outros

reportaram resposta imune normal em indivíduos com DGH (153, 194, 204). Entretanto, a

DGH é frequente no pan-hipopituitarismo e é difícil diferenciar os efeitos da DGH na

resposta imune, daqueles efeitos de outros déficits pituitários e da reposição destes

hormônios. Menores níveis de anticorpos protetivos após vacina pneumocócica foram

encontrados em adultos com pan-hipopituitarismo severo, que vinham em reposição

hormonal, inclusive de GH, com níveis de IGF-I na variação normal para a idade, e dose de

GH estável por 6 meses antes do estudo. No entanto, esses indivíduos já tinham menores

níveis de anticorpos pneumocócicos antes da vacinação, quando comparados ao grupo

controle. Baixos níveis de IGF-I pré-tratamento e menores níveis de prolactina, ambos

relacionados a severidade do hipopituitarismo, foram associados a não resposta a vacina

pneumocócica (196). É possível que a menor resposta à vacina pneumocócica esteja

relacionada à deficiência de outros hormônios pituitários. Esta hipótese é apoiada pela

associação entre maiores níveis de prolactina e maior número de células B (196). Vários

estudos têm correlacionado os níveis de prolactina com a função das células B e a imunidade

(142, 196, 205, 206), e estudos encontraram número de linfócitos B na variação normal na

DGH (194, 204). Nossos indivíduos adultos com DIGH têm indetectáveis ou muito baixos

níveis de IGF-I (78), associado a muito baixos níveis de GH, mas detectáveis (207), e níveis

de prolactina normais (208). Devido a alta homologia entre os receptores do GH e da

prolactina (139), um cruzamento entre os dois ligantes e receptores é possível, como já

descrito previamente em neutrófilos humanos (140). Consequentemente, os níveis normais de

66

prolactina podem exercer um efeito compensatório na função imune de nossos indivíduos

com DIGH.

Deficiência imunológica primária é associada a deficiência de IGF-I em raras

condições (11, 13-18, 209). Deficiência imunológica é encontrada em mutações STAT5B (12-

15), que causam um severo nanismo devido à insensibilidade ao GH. Estes indivíduos

apresentam disfunção de células T regulatórias, déficit no número de células T e doenças

pulmonares (16), que não estão presentes na Síndrome de Laron (SL), o modelo clássico de

insensibilidade ao GH devido a mutações no GHR (210). A ausência de relevantes disfunções

imunes, em ambos os modelos de resistência ao GH (SL) e ao GHRH (DIGH de

Itabaianinha), implicam que um nível circulante de IGF-I normal não é necessário para a

função imune padrão.

Apesar dos menores níveis de IgG total, o grupo DIGH alcançou níveis de anticorpos

específicos para os antígenos da hepatite B e tétano que foram similares ao grupo controle. A

taxa de conversão com a vacinação para hepatite B foi acima de 70%, semelhante a alguns

estudos (211, 212), e menores do que outros em indivíduos não DGH (213-215). A vacina

produzida pelo Instituto Butantan na dose de 25 mcg foi testada em adultos de 31 a 40 anos e

mostrou equivalência à vacina de referência, com proteção em torno de 98,6% (216). Apesar

disso, 2,5 a 5% dos indivíduos saudáveis podem não responder a vacina para hepatite B (217)

e há diminuição da resposta à vacina em indivíduos mais velhos (218). A taxa de conversão

com a vacinação para o tétano foi similar nos 2 grupos. Um estudo prévio encontrou menores

níveis de anticorpos para o tétano no hipopituitarismo, mas a administração do tétano toxóide

foi analisada por dados de história e não foi controlada (196). A resposta semelhante à

vacinação para o tétano e hepatite B, entre DIGH e controles, prova que a DGH não leva a

uma menor resposta humoral a estas vacinas.

Nossos dados imunológicos ajustam-se com os achados de longevidade normal que

foram publicados previamente nestes indivíduos com DIGH (21). Naquele estudo, cinco

mortes foram registradas entre 4 e 20 anos, uma devido a provável causa infecciosa e as

restantes foram atribuídas a doenças diarreicas por relatos verbais dos familiares (21). No

grupo equatoriano com SL, 22 crianças morreram em uma idade precoce, aparentemente de

infecções e/ou hipoglicemia (219). Entre as quatro conhecidas mortes do grupo de Israel com

SL, uma foi devido a encefalite (210). Os indivíduos com DIGH e com resistência ao GH

parecem vulneráveis a doenças infecciosas na infância (21, 219, 220). Nós não pudemos

investigar a função imunológica das crianças com DIGH neste estudo, porque muitas delas

estão no momento em reposição com GH. É possível que os menores níveis de IgG (ainda

67

que na variação normal para o adulto) possam ser insuficientes na infância, quando os níveis

de imunoglobulinas começam a se elevar progressivamente a partir dos 6 meses de vida,

alcançando níveis adultos apenas no fim da adolescência (221). Como nossos indivíduos

DIGH têm puberdade atrasada (222), pode ser que haja um atraso em alcançar um nível

adulto seguro de imunoglobulinas, e isso contribua para uma maior susceptibilidade a

infecções bacterianas ou virais antes da idade adulta.

O GH parece influenciar o tamanho do baço. Foi já previamente reportado que estes

indivíduos adultos com DIGH têm um menor volume do baço, mesmo quando corrigido pela

superfície corpórea (130). O baço tem funções imunes inatas e adaptativas: modula migração

e proliferação celular; ativa a resposta de células T citotóxicas macrófago-dependente;

remove células apoptóticas; aumenta o contato entre os linfócitos T antígeno-específico e as

APCs e contém células B específicas, que capturam antígenos na corrente sanguínea via

receptores de complemento (223). Pelo avaliado neste trabalho, o menor tamanho do baço

não parece afetar a produção de imunoglobulinas. No entanto, não é possível afastar que os

menores níveis de IgG e o menor volume do baço possam contribuir para um prognóstico

desfavorável durante infecções agudas e severas, já que a remoção do patógeno pode estar

prejudicada, tendo em vista que o ritmo de remoção do microorganismo pode estar reduzido

pelo possível menor fluxo sanguíneo no baço, que é proporcional ao tamanho do mesmo

(223).

Menores níveis de anticorpos IgM e células B de memória foram encontrados em

pacientes esplenectomizados por doença autoimune em uma idade mais avançada (média de

35,6 anos) do que em controles e esplenectomizados na infância (média de 5,4 anos), sendo

sugerido que a resposta normal à vacinação nos esplenectomizados na infância poderia ser

pelo fato de haver uma maior plasticidade do sistema imunológico mais jovem, que foi capaz

de compensar os menores níveis de anticorpos e células B de memória através da produção

destas células em outros sítios extra-esplênico (224). Os indivíduos com DIGH do presente

estudo têm apenas baço reduzido, mas é possível que a produção de células B de memória e

de anticorpos em outros sítios possam também estar compensando uma menor produção

destes componentes do sistema imunológico devido ao menor baço, como também, que a

nível celular possam ser necessárias menores concentrações de GH/IGF-I do que para o

crescimento longitudinal, e que outros fatores locais e/ou uma produção parácrina e autócrina

do GH (195) e IGF-I possam estar mantendo o equilíbrio da resposta celular e humoral (5).

A relação IGF total/IGFBP-3 é uma medida da biodisponibilidade dos IGFs e pode

também ter um papel positivo na função das células imunes. Os indivíduos com DIGH têm

68

níveis muito baixos do IGF-I e IGFBP-3 no soro, com uma redução na proporção IGF-

I/IGFBP-3 e um nível proporcionalmente maior do IGF-II, levando a um aumento na relação

molar IGF-II/IGFBP-3, tal que a razão molar do IGF total (IGF-I + IGF-II) /IGFBP-3 é

elevada (78). Esse aumento da razão molar do IGF total/IGFBP-3 pode ser um outro

mecanismo compensatório, além da produção autócrina e parácrina do GH e do IGF-I, que

pode atuar na manutenção do equilíbrio da imunidade celular e humoral, independentemente

dos níveis circulantes de GH e IGF-I necessários para o crescimento longitudinal (7-10).

A resposta imune celular destes indivíduos DIGH foi também similar a dos controles

quando avaliados através de testes cutâneos para estreptoquinase, candidina, PPD e na

imunização com BCG, mas os controles foram mais prováveis a responder positivamente a

pelo menos um teste cutâneo. O diâmetro da pápula no teste cutâneo em resposta ao antígeno

estreptoquinase foi menor na DIGH, mas a freqüência de testes cutâneos positivos não foi

diferente entre DIGH e controles, como previamente reportado em crianças com DGH

adquirida (194). Houve muitos indivíduos que não apresentaram induração positiva após a

administração dos 3 antígenos comuns à maioria da população. Os trabalhos que avaliam

anergia utilizam um perfil de pelo menos cinco antígenos (47, 49, 52) e o antígeno da

tuberculina é o regularmente padronizado por sua potência (225). Problemas referentes a

dificuldades técnicas na aplicação dos antígenos, na leitura e no condicionamento adequado

da vacina BCG e do PPD (52) foram minimizados através da aplicação dos antígenos por

pessoa experiente, e foram afastadas condições clínicas que pudessem levar a anergia, como

HIV, imunodeficiências, terapia imunossupressora, alcoolismo, entre outras (52).

Não encontramos estudos prévios com vacinação com BCG e avaliação da resposta ao

PPD em pacientes com hipopituitarismo ou DIGH, para comparar nossos dados. Cerca de

42% dos indivíduos de cada grupo não sabiam ou diziam que não tinham recebido

previamente BCG. Não houve um controle no estudo sobre a presença de cicatriz de BCG,

para tentar confirmar vacinação prévia. Apesar da sensibilidade positiva a tuberculina ser

usada como um indicador de sucesso da vacinação com o BCG, a reatividade tuberculínica

pós-vacinal declina ao longo dos anos (226, 227) e a proteção da BCG não está relacionada

com o tamanho da induração (228). O impacto da vacinação sobre o resultado do PPD é

fortemente afetado pela idade na vacinação. O efeito da vacina BCG recebida na infância no

PPD é mínimo após 10 anos ou mais da vacinação, e o BCG, quando dado em mais idade,

produz com mais frequência reações, que habitualmente são maiores e mais persistentes

(229). Não há evidência de benefício da revacinação (230), não sendo recomendada pela

Organização Mundial de Saúde. Possíveis interferentes na efetividade do BCG são

69

micobactérias ambientais não patogênicas, que podem agir como vacinas naturais, mas isto é

mais relevante em países com muito baixa incidência de tuberculose (229), além de

infestações crônicas por helmintos, que por induzir predominantemente uma resposta do tipo

Th2, podem alterar a resposta imune celular, reduzindo a eficácia da BCG, mas que pode ser

melhorada com o tratamento anti-helmíntico (231). No presente estudo, não foi feito exame

parasitológico, embora em geral não seja comum parasitoses na idade adulta.

Apesar do número de indivíduos que não apresentaram reação a nenhum dos

antígenos inoculados, após a vacinação com BCG e um novo PPD, houve um aumento na

positividade de ambos os grupos. Vale ressaltar que a resposta aos testes cutâneos foi

semelhante entre os grupos e não há relato de infecções causadas por patógenos intracelulares

no grupo com DIGH, a não ser dois casos de hanseníase que foram tratados e um familiar

controle, de um desses dois casos, que apresentou também a doença. A ausência de relato de

qualquer caso de tuberculose no grupo com DIGH, em mais de 20 anos de atividades clínica

e de pesquisa nesta comunidade, está de acordo com uma resposta celular normal nestes

indivíduos.

Os dados sócio-econômicos são semelhantes entre os dois grupos, com a ressalva do

maior número de solteiros e menor renda familiar na DIGH. Embora este último achado

pudesse ter um efeito favorecendo mais infecções no grupo DIGH (o que não ocorreu), a

significância biológica deste dado é questionável. Não há indivíduos com DIGH, em estado

de desnutrição ou escassez alimentar. Ao contrário, eles ingerem mais calorias e mais

proteínas do que os controles (232).

No último censo do IBGE em 2010, a população de Sergipe era de 2.068.017 pessoas

e a estimada em 2015 era de 2.219.574 de habitantes. Já Itabaianinha tinha 38.910 habitantes

e a população estimada em 2015 era de 41.404 habitantes (233). A freqüência de notificação

das doenças pesquisadas neste estudo foi pequena. Segundo dados do SINAN (Sistema

Nacional de Agravos de Notificação), em Itabaianinha, a incidência de tuberculose entre

2010 e 2015, considerando-se todas as formas da doença, ficou em uma média de 10,86

casos/100.000 habitantes/ano, e em 2015, foram notificados 4 casos novos de tuberculose,

com uma incidência de 9,66 casos/100.000 habitantes. Já em Sergipe, a média da incidência

de tuberculose, entre 2010 e 2015, foi em torno de 27 casos/100.000 habitantes/ano, e em

2015, foram notificados 636 casos novos de tuberculose, com uma incidência de 28,18

casos/100.000 habitantes. Com relação à frequência de notificação das outras doenças

pesquisadas, em Itabaianinha, entre 2010 e 2015, foi notificado apenas um caso de

leishmaniose visceral (em 2013) e nenhum caso de leishmaniose tegumentar entre 2010 e

70

2011; seis casos de hepatite por vírus B, sendo nenhum caso em 2015 e dois casos de hepatite

por vírus C, ambos em 2011. Já em Sergipe, a freqüência de notificação foi de 361 casos de

leishmaniose visceral; 975 casos de hepatite B, sendo 52 em 2015 e 412 casos de hepatite por

vírus C, sendo 33 em 2015. Em Sergipe, o coeficiente de detecção de casos novos de

hanseníase é considerado alto e, em 2014, foi de 18,74 por 100.000 habitantes (234). Em

2015, houve três notificações de casos novos de hanseníase em Itabaianinha e um total de 230

em Sergipe.

O grupo de indivíduos de Itabaianinha tem DIGH congênita e vitalícia. É possível que

tenham algum mecanismo compensatório não presente na DGH adquirida e de início na idade

adulta. Portanto, os resultados deste estudo podem não necessariamente ser aplicados aos

indivíduos nos quais a DGH foi adquirida e que possuam outras deficiências hormonais.

Uma possível limitação deste estudo é o relativo pequeno tamanho da amostra. Não

encontramos literatura semelhante em humanos sobre as consequências imunes da DIGH

para auxiliar em encontrar um poder de cálculo confiável. Acreditamos que o número inicial

de indivíduos adultos com DIGH e controles que responderam ao questionário clínico foi

adequado considerando a raridade da DIGH (1 em 3.480 a 1 em 10.000 nascidos vivos) (235)

e a dificuldade de identificar adultos não tratados. Este é de longe o maior grupo no mundo

de indivíduos adultos com DIGH congênita, não tratados. A vasta maioria dos casos com

DIGH não são tão severos como os nossos e são tratados com terapia de reposição com GH.

Devido a estes fatores, um estudo semelhante a este não pode ser facilmente realizado em

qualquer outro lugar, nem mesmo em Itabaianinha, por causa do tratamento atual com GH

nas crianças do nosso grupo. Infelizmente, mas compreensivelmente, o número de indivíduos

após a primeira etapa deste estudo foi reduzido em função dos critérios de idade e resultados

sorológicos, e isto pode ter diminuído nosso poder de detectar diferenças sutis entre os

grupos.

Assim, indivíduos adultos, não tratados, com DIGH vitalícia, não exibiram uma maior

frequência de infecções ou uma significante alteração na resposta imune humoral. No

entanto, indivíduos com DIGH apresentaram menores níveis de IgG total, menor diâmetro da

pápula após teste cutâneo com estreptoquinase, e uma tendência (embora não significante) a

uma menor resposta celular com maior frequência de todos os três testes cutâneos negativos,

já os controles apresentaram uma maior frequência de um teste cutâneo positivo. Estas

diferenças parecem não ter relevância clínica no cotidiano, mas podem contribuir para

resultados desfavoráveis em situações de infecções mais severas.

71

8 CONCLUSÕES

a) A frequência de história de doenças infecciosas e de sorologia positiva para doença de

Chagas, leishmaniose, hepatite B, hepatite C, HIV e tétano é semelhante àquela dos

controles normais da mesma região.

b) Os níveis de IgG foram menores no grupo DIGH do que nos controles, embora dentro

da variação normal do método. Os níveis das demais imunoglobulinas IgA, IgM e IgE

foram semelhantes nos DIGH e controles.

c) A freqüência de positividade aos testes cutâneos PPD, estreptoquinase e candidina foi

igual entre DIGH e controles, apesar do diâmetro da pápula 48 h após o teste cutâneo

com estreptoquinase ser menor no grupo DIGH e de os controles apresentarem uma

maior frequência de pelo menos um teste cutâneo positivo.

d) A imunização com as vacinas do vírus da hepatite B, com o tétano toxóide e com a

BCG induzem respostas semelhantes em pacientes com DIGH e controles.

72

9 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Como um todo, a avaliação da resposta imunológica dos indivíduos adultos com

DIGH vitalícia não revelou uma maior frequência de infecções ou uma significante alteração

na resposta imune humoral ou mediada por células, apesar dos menores níveis de IgG total e

da menor positividade a pelo menos um dos testes cutâneos na DIGH. Os níveis normais de

prolactina podem compensar os baixíssimos níveis de GH, já que estes dois hormônios têm

grande semelhança nos seus receptores, podendo compartilhar funções. Adicionalmente, a

maior razão molar IGF total (IGF-I + IGF-II)/IGFBP-3 pode levar a uma maior

biodisponibilidade dos IGFs e isto pode também ter um papel positivo na função das células

da resposta imune. Além disso, a secreção autócrina-parácrina do GH nas células do sistema

imunológico, independente da regulação pituitária, pode ser suficiente para modular a

resposta imune destes indivíduos com DIGH vitalícia, considerando a importância do sistema

imunológico para a sobrevivência do homem. No entanto, considerando os achados de

menores níveis de IgG e o menor volume do baço em adultos com DIGH vitalícia, e tendo em

vista a importância de ambos para neutralização de patógenos invasores, principalmente em

crianças, onde os níveis de imunoglobulinas ainda estão em ascensão, é possível que em

situações de infecções mais agudas e graves, estes indivíduos tenham uma maior dificuldade

de controlar as infecções, com consequente aumento da mortalidade.

73

10 PERSPECTIVAS

a) Avaliar a resposta imunológica a outros agentes (exemplo, pneumococo 23 e

rotavírus).

b) Avaliar a produção de citocinas pelas células estimuladas in vitro com antígenos e

tratadas com GH e IGF-I.

c) Acompanhar os níveis de imunoglobulinas nos recém-nascidos com DIGH, para

verificar seus níveis de IgG, IgM, IgA, IgE e suas respostas às vacinas do calendário

habitual.

d) Acompanhar a frequência de infecções nos recém-nascidos até a adolescência, faixa

etária onde ocorreu uma maior frequência de morte em estudo anterior do nosso

grupo.

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89

APÊNDICE A

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

PESQUISA: Avaliação da prevalência de infecções e da resposta imune em indivíduos com deficiência de GH/IFG-1

Concordo em participar da pesquisa acima, que tem como objetivo estudar a capacidade do organismo de pessoas com deficiência de hormônio de crescimento reagir à infecção e se esta reação é diferente de outros familiares ou conhecidos próximos que não tenham a deficiência. Para isto será realizado inicialmente um questionário onde perguntaremos sobre a ocorrência de infecções anteriores, quais vacinas já foram tomadas e alguns dados sobre condições de vida. Além disso, será realizada uma coleta sanguínea de cerca de 10 ml para verificar se há anticorpos de defesa no sangue contra algumas doenças infecciosas (Hepatite C, Calazar, HIV e Doença de Chagas) e contra antígenos de vacinas que são dadas nos Programas do Governo como Tuberculose, Tétano, Calazar e Hepatite B. Será feito também um teste na pele para verificar se as pessoas reagem bem à aplicação de algumas vacinas como a do microorganismo toxóide tetânico, BCG, estreptoquinase e candidina, produzindo mecanismos de defesa normal. Para isto aplicaremos uma quantidade mínima da vacina no subcutâneo (logo embaixo da pele, na camada de gordura) com uma agulha bem pequena e fina (mesma agulha para aplicar insulina) e 2 dias após esta aplicação verificaremos se o organismo reage. A reação normal ocorre quando é formado um edema na pele de mais de 0,5 cm, sendo assim esse edema poderá ocorrer, podendo ser maior ou menor em algumas pessoas, mas depois desaparecerá e faremos também uma nova coleta de sangue para dosar os anticorpos (células de defesa) que serão formados no sangue para proteção contra o microorganismo da vacina. Em seguida, um número menor de pessoas que não tenham resposta à vacinação da Hepatite B e Tétano, poderá ser novamente vacinado, desta vez com aplicação no músculo da vacina e faremos a coleta de sangue 3 meses após a aplicação da vacina para verificarmos se anticorpos no sangue foram produzidos para proteção contra esse microorganismo da vacina. Com esse sangue também faremos estudos nas células de defesa, verificando o comportamento das células à infecção como por exemplo à infecção do Calazar (Leishmania).

Estou ciente de que os dados do meu questionário e dos meus exames serão utilizados para a pesquisa. Ponho-me à disposição para fornecer outras informações, caso necessário, da minha história ou do meu exame. Estou também ciente de que posso abandonar a pesquisa em qualquer estágio sem comprometimento algum. Os dados da Pesquisa ficarão sob a responsabilidade da médica Viviane Correia Campos Almeida, devendo ser publicado em revista científica da área médica. O nome e endereço dos participantes serão mantidos em sigilo.

Aracaju, ______de ___________________de _________.

______________________________________________ Nome do responsável

_____________________________________________

Nome da Pesquisadora

90

APÊNDICE B

QUESTIONARIO

1. Número:_____(Nome:______________________________________) 2. Grupo: (1) DGH (Homozigoto) (2) Heterozigoto (3) Homozigoto normal 3. Idade:_________(Data de nascimento ____/____/___) 4.Sexo: (1) M (2) F 5. Estado civil: (1) S (2) C (3) D (4) V 6. Local de residência:__________________________________________________ 7. Naturalidade:__________________ 8. Dados sócio-econômico-cultural: 8.1. Endereço:__________________________________________________________ 8.2. Telefone:___________ 8.3 Água encanada: (1) Sim (2) Não (3) Sim, mas falta com freqüência 8.4: Luz elétrica: (1) Sim (2) Não 8.5. Renda familiar: (1) < 1 SM (2) 1 a 3 SM (3) 4 a 7 SM (4) > 7 SM 8.6. Esgotamento sanitário: (1) Esgoto (2) Fossa (3) esgoto a céu aberto 8.7. Tipo de casa: (1) Taipa (2) Reboco sem pintura (3) Reboco com pintura 8.8 . ( ) Número de pessoas na casa 8.9. ( ) Número de cômodos na casa 8.10. Escolaridade: (1) Analfabeto (2) Fundamental completo (8 série) (3) Fundamental incompleto (< 8 série) (4) Médio completo (3 anos) (5) Médio incompleto (6) Superior completo (7) Superior incompleto (8) Outro: ____________ 9. Antecedentes de Vacinação: (1 ) BCG (2) Tétano (3) Rotavírus (2006) (4) Hepatite B (5) Pneumo 23 10. Antececentes Patológicos: (1) Tuberculose (2) Chagas (3) Hepatites vírus B ou C (4) Calazar (5) Hanseníase (6) Pneumonia (7) Diarréia com febre e vômitos (antes dos 5 anos) (8) Infecções de orofaringe de repetição (9) Estreptococcia com febre reumática e lesão cardíaca 11. Antecedentes Tratamento: (1) Tuberculose (uso de rifampicina, etambutol, isoniazida e/oupirazinamida, por no mínimo 6 meses) (1) Sim (2) Não (3) NS (2) Hanseníase (tratamento longo, uso de rifampicina, dapsona ou clofazimina) (1) Sim (2) Não (3) NS (3) Uso de Interferon (1) Sim (2) Não (3) NS (4) Pneumonia (1) Sim (2) Não (3) NS (5) Fez profilaxia mensal com Benzetacil (1) Sim (2) Não (3) NS (6) Calazar (1) Sim (2) Não (3) NS 12. Antecedentes Familiares: ( ) Número de óbitos por diarréia, febre, vômitos e desidratação na infância (1) Sim (2) Não (3) NS ( ) Número de óbitos por outras causas (1) Sim (2) Não (3) NS (idade)_______________________________________ 13. Resultados Sorológicos positivos: (1) Chagas (2) Leishmaniose (3) Tétano (4) HIV (5) Hepatite B (6) Hepatite C (7) Pneumo 23 14. Resultados sorológicos positivos na reimunização: (1) Tétano (2) Hepatite B (3) Pneumococo

91

15.Exame físico: Peso: ________ Altura:_______ SC:____________ Inspeção (pele e fâneros):_________________________________________________ ACV: ________________________________________________________________ Ausculta respiratória:_____________________________________________________ Exame neurológico (sensibilidade, força):_____________________________________ 16. Exames laboratoriais adicionais (pacientes com Doença e quadro clínico específico): R-X tórax______________________________________________________________ ECG__________________________________________________________________ EED (R-X esôfago-estômago-duodeno com contraste)___________________________ ECO__________________________________________________________________ US Abdômen (medir baço e corrigir SC)______________________________________ ______________________________________________________________________ Enema_________________________________________________________________ Hemograma____________________________________________________________ Coagulograma __________________________________________________________ TGO________ TGP________ gamaGT _________ albumina________

92

ANEXO

93

Infectious diseases and immunological responses in adult subjects with

lifetime untreated, congenital GH deficiency

Viviane C. Campos¹, Mônica R. Barrios², Roberto Salvatori³, Roque Pacheco de Almeida²,

Enaldo V. de Melo¹, Ana C. S. Nascimento¹, Amélia Ribeiro de Jesus², and Manuel H.

Aguiar-Oliveira¹

1 - Federal University of Sergipe, Division of Endocrinology, 49060–100, Aracaju – SE,

Brazil.

2 - Federal University of Sergipe, Division of Immunology and Molecular Biology

Laboratory, 49060–100, Aracaju - SE, Brazil.

3- Division of Endocrinology, Diabetes and Metabolism, The Johns Hopkins University

School of Medicine Baltimore, Maryland 21287 USA.

Corresponding author:

Roberto Salvatori, MD, Division of Endocrinology, Johns Hopkins University School of Medicine, 1830 East Monument street suite #333, Baltimore, MD 21287 E-mail: [email protected] Tel (410) 955-3921; Fax (410) 367-2042

Abbreviated title: Infection and immunology in GH deficiency

94

Abstract

Purpose: GH is important for the development and function of the immune system, but there

is controversy on whether GH deficiency (GHD) is associated to immune disorders. A model

of isolated GHD (IGHD) may clarify if the lack of GH is associated with increased

susceptibility to infections, or with an altered responsiveness of the immune system.

Methods: We have studied the frequency of infectious diseases and the immune function in

adults with congenital, untreated IGHD. In a cross-sectional study, 35 adults with IGHD due

to a homozygous mutation in the GHRH receptor gene and 31 controls were submitted to a

clinical questionnaire, physical examination and serology for tripanosomiasis, leishmaniasis,

HIV, tetanus, hepatitis B and C, and serum total IgG, IgM, IgE and IgA measurement. The

immune response was evaluated in a subset of these subjects by skin tests and response to

vaccination for hepatitis B, tetanus, and bacillus Calmette-Guérin.

Results: There was no difference between the groups in history of infectious diseases and

baseline serology. IGHD subjects had lower total IgG, but within normal range. There was no

difference in the response to any of the vaccinations, or in the positivity to PPD, streptokinase

or candidin.

Conclusions: Adult untreated IGHD does not cause an increased frequency of infectious

diseases, and does not alter serologic tests, but is associated with lower total IgG levels,

without detectable clinical impact.

Key Words: cellular and humoral immune response; isolated GH deficiency; vaccines and

skin tests; infectious diseases.

95

Introduction

GH and its principal mediator IGF-I have synergistic effects on somatic growth and

complex effects on various body functions, including the immune response, which is essential

for survival by defending against dangerous pathogens and cancer cells [1]. There is a

complex interaction between the two types of immune response, the humoral and the cell-

mediated, related respectively to the function of B and T cells. Both cells interact with antigen

presenting cells and become activated, proliferate and migrate to the site of inflammation. B

cells produce antibodies that target extracellular pathogens. T cell populations include CD8+

cytotoxic T cells that lyse infected cells, and CD4+ T helper cells that secrete a wide range of

cytokines and activate other components of the immune response [2].

The knowledge of the interaction between the pituitary gland and the immune system

dates back almost 90 years, when hypophysectomized rats were found to have atrophy of the

thymus [3]. GH, IGF-I, ghrelin and their receptors were demonstrated in various immune cells

in rodents and humans[4-10], suggesting autocrine and paracrine production of these and

other peptides like IGF binding proteins, IGF-II and its receptor[11].It is possible that the

local effects of these peptides surpasses the activity of pituitary GH and circulating IGF-I on

the immune system [4-8]. Indeed, immune function is more relevant to survival capacity than

body size, which reflects the effect of pituitary GH and circulating IGF-I.

Several pieces of indirect evidence tie the GH-IGF-I axis to the immune system. The

generation of IGF-I requires the binding of GH to growth hormone receptor (GHR), a class I

cytokine receptor that triggers phosphorylation of Janus Kinase 2 (JAK2), and activation of

the signal transducer and activator of transcriptional gene-5b (STAT5b) [12-15]. Prolactin,

interferon gamma, and various interleukins (IL) also bind to cytokine receptors and activate

the STAT family [15]. The binding of IL-2 to its receptor and the activation of STAT5b lead

to activation of T lymphocytes and inhibition of their apoptosis (protecting against

96

infections), and to the development and proliferation of regulatory T cells (protecting against

autoimmunity) [13]. Immunological disorders are well described in some GH/IGF-I axis

defects, like homozygous mutations in STAT5b [12-15] and hypogammaglobinemia

associated to X-linked isolated GH deficiency (GHD) [16, 17]. Interestingly, GH releasing

hormone (GHRH) gene knock out GHD mice are less likely to develop experimental

autoimmune encephalitis, suggesting pivotal role of GH in regulation of immune system [18].

GHD is often acquired, in setting of hypopituitarism, and associated to other pituitary

deficits requiring replacement therapies. Both the other deficits and the replacement therapies

may confound the consequences of GHD on the immune response. Patients with isolated

GHD (IGHD) would allow clarifying whether lack of GH results into an altered

responsiveness of the immune system, and increased susceptibility to infections. We have

described (in Itabaianinha County, in Northeast Brazil) a group of individuals with severe

IGHD caused by a null homozygous mutation in the GHRH receptor gene (GHRHR) [19].

Despite an apparent increase in childhood deaths, there is no significant difference in life span

between these IGHD subjects and normal statured siblings or the general population when

subjects reach age 20 years [20]. Given the normal longevity, we hypothesized that their

immunity in adulthood is not relevantly impaired. The objective of this study was to compare

the frequencies of infectious diseases, and to perform a comprehensive immune assessment in

GH-naïve adult subjects from this IGHD cohort.

97

Subjects and Methods

Subjects

In a cross-sectional study, adult GH-naïve IGHD and age- and sex-matched controls

were recruited by advertising in the local Dwarfs Association building and by word of mouth

among the inhabitants of Itabaianinha County. Inclusion criteria for IGHD was genotype-

proven homozygosity for the C.57 + 1G > A GHRHR mutation, whereas controls were normal

statured individuals proven to be homozygous for the wild-type GHRHR allele. A two-step

protocol was performed. The first step included a clinical questionnaire (supplemental file),

physical examination and serology. The only exclusion criterion for this first step was age <

20 years. The second step included the evaluation of immune response through

immunoglobulins measurements, skin tests reactivity, and response to vaccinations. For this

step, the exclusion criteria were age < 20 and > 65 years; diagnosis of Human

Immunodeficiency Virus (HIV) infection or acute diseases; history of malignancies;

autoimmune diseases; glucocorticoid and anti-allergic medications use; or current pregnancy.

Thirty-five IGHD subjects and 32 controls volunteered. One control was excluded due to

history of cervical cancer. Both groups live in the same area and have similar educational

level, monthly family income, and general living conditions.

The Institutional Review Board of Federal University of Sergipe approved the

protocol, and all subjects provided written informed consent.

Study protocol

Clinical questionnaire and physical examination

The same physician (V.C.C) administered a questionnaire to all subjects to evaluate

past and current history of infectious diseases and vaccination for hepatitis B, tetanus toxoid,

bacillus Calmette-Guérin (BCG) and rotavirus, and performed a complete physical

98

examination. All the clinical information were confirmed by the file records of the database of

research group started in 1994.

Hormone assays

Prolactin, was measured by fluoroimmunoassay (Perkin Elmer Life and Analytical

Science, Wallac Oy Turku, Finland) with sensitivity of 1.44 ng/ml. IGF-I was measured by a

solid-phase, enzyme labeled chemiluminescent immunometric assay IMMULITE 2000

(Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd, Malvern, PA, USA), with sensitivity of 25

ng/ml.

Serology

Serological screening for tripanosomiasis was performed by immunoassay

chemiluminescent microparticle (ARCHITECT-ABBOTT) and by indirect

immunofluorescence (WAMA Diagnostics). Serology for leishmaniasis was performed by

indirect immunofluorescence (Leishmania IFA Vircell® provided by MEDIVAX). Serology

for HIV by chemiluminescence (Abbott Diagnostic Laboratories, Santa Clara, California,

USA); hepatitis B and C by electrochemiluminescence (ELECSYS 2010, Roche Diagnostics);

tetanus by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA RIDASCREEN® Tetanus IgG R-

Biopharm). Subjects with positive leishmaniasis serology enrolled in a protocol to rule out

visceral leishmaniasis, including measurement of blood cell count, transaminases, total

protein and fractions, coagulation, rK39 (Kalazar Detect® Rapid Test: In Bios International

Inc., Seattle, WA) and Montenegro skin test (test uses antigens of Leishmania amazonensis

produced by FIOCRUZ, Rio de Janeiro). Subjects with positive results for tripanosomiasis

enrolled in a protocol to rule out tripanosomiasis disease including, electrocardiogram,

transthoracic echocardiogram and chest radiograph.

Evaluation of immunoglobulin panel

Serum total IgG (reference value 700 to 1600 mg/dl), IgM (reference value 50 to 300

99

mg/dl) and IgA (reference value 40 to 350 mg/dl) were measured by immunoturbidimetric

assay. IgE (reference value lower than 160 IU/ml) was measured by non-competitive

immunoassay method.

Evaluation of hypersensitivity skin test reactivity

Three skin tests of delayed hypersensitivity were performed: Protein Purified Derived

(PPD), Candidin, and Streptokinase. PPD was obtained from the Staten’s Serum Institute of

Denmark, PPD RT 23 SSI 2 UT / 0.1 mL, lot number 1624B; Candidin and Streptokinase

were obtained from the Immunotech, Rio de Janeiro, Brazil. Candidin was extracted from

Candida albicans 1:100 (reference 14018/604) and Streptokinase from Streptococcus sp

100.000.000 BCT/ml (reference 14018/603). The three antigens were administered

intradermallly in the amount of 0.1 ml on the flexor side of the left forearm, starting 4 cm

from of the elbow, according to standard techniques by the same nurse. The tests were

considered positive when the diameter of indurations was ≥ 5mm [21, 22]. We analyzed

positive or negative reaction and induration size, separately, as histological findings can be

found with indurations smaller than 5 mm [21, 23].

Evaluation of response to vaccines

Thirteen IGHD individuals and thirteen controls who had negative serology for tetanus

and/or hepatitis B vaccines volunteered for this study. Two IGHD subjects dropped out after

first dose of vaccination for tetanus toxoid and hepatitis B because of side effects at the

injection site. One IGHD was already Anti-HBs positive, and he was immunized only against

tetanus toxoid. Two controls had positive serology for tetanus and they were immunized only

against hepatitis B. Therefore, 10 IGHD and 13 control subjects completed hepatitis B, and 11

IGHD and 11 controls tetanus vaccination.

The schedule for hepatitis B vaccination consisted of three 1 ml intramuscular doses

(baseline,30, and 180 days later) of the adsorbed hepatitis B vaccine (recombinant) developed

100

at the Butantan Institute in São Paulo, Brazil. The schedule for tetanus vaccination

(TETADIF, vaccine adsorbed diphtheria and tetanus adult, BB-NCIPD Sofia, Bulgaria)

consisted of three 0.5 ml intramuscular doses (baseline, 30, and 60 days later). The respective

levels of antibodies were measured 30 days after the end of the schedule for hepatitis B and

150 days after the end of tetanus vaccination. Seroconversion were considered when Anti-

HBs titer ≥ 10 mIU/ml for hepatitis B and IgG levels for tetanus toxoid greater than 0.6 IU /

ml.

Fifteen IGHD and 10 controls, all non-reactive to PPD, were vaccinated with BCG

(0.1 ml) and a new PPD test was performed 60 days after vaccination. A diameter of

induration ≥ 5 mm was considered positive. For the entire experimental protocol, it was

needed 18 months for an individual has completed all the steps.

Statistical analysis

Values for continuous variables were expressed as mean (standard deviation).

Variables with non-normal distribution (IGF-I and prolactin levels, IgA and papule diameter

streptokinase and PPD) were expressed as median (interquartile range). Percentages were

compared with the Fisher's exact test. Data with normal distribution were compared using the

Student t test, and those with non-Gaussian distribution were compared by Mann-Whitney U

test. Univariate analysis of variance was used to assess the dimension of the effect and

observed power of the variables with significant difference between the two groups. Statistical

analysis was performed using the statistical software IBM®SPSS® Version 20. Probability

values < 0.05 were considered statistically significant.

101

Results

Table 1 shows the anthropometric data, previous pathologies, and results of hormonal

and serological tests of the two groups. As expected, height and weight were lower in the

IGHD group. IGF-I was below the limit of sensibility of the method in all but 4 of the IGHD

individuals. There was no difference in history of infectious diseases, or positive serology for

tripanosomiasis, leishmaniasis, HIV, hepatitis B and C, and tetanus between the groups. Two

IGHD and three controls had positive serology for leishmaniasis, but visceral leishmaniasis

was ruled out in all five subjects. One IGHD and two controls had positive serology for

tripanosomiasis, and one control was found to have tripanosomiasis with dilated

cardiomyopathy.

Table 2 shows the immunoglobulins levels. IGHD subjects had lower IgG levels, but

within the normal range.

Twenty-four IGHD, 41.7 (12.7) yrs. (range 25 to 64), 11 males, and 28 controls, 40.1

(11.7) yrs. (range 20 to 61), nine males, were submitted to PPD skin test. Twenty-one IGHD,

42.9 (13) yrs. (range 25 to 64), 8 males, and 20 controls, 44 (11.3) yrs. (range 20 to 61), seven

males, were submitted to streptokinase test. Twenty-one IGHD, 42.9 (13) yrs. (range 25 to

64), 8 males, and 19 controls, 44.3 (11.5) yrs. (range 20 to 61), six males, were submitted to

candidin test.

There was no difference in the frequency of positivity to PPD [IGHD 4 (16.7%) vs.

controls 10 (35.7%), p = 0.21], nor in the papule diameter [IGHD, 1.0 (2.75) mm vs. controls

2.0 (6.0) mm, p = 0.178].

There was no difference in the frequency of positivity to streptokinase [IGHD 2

(9.5%) vs. controls 5 (25%), p = 0.24], although the papule diameter was smaller in IGHD

than controls [2.0 (2.5) mm vs. 3.5 (1.75) mm, respectively, p = 0.0151].

There was no difference in the frequency of positivity to candidin [IGHD 3 (14.3%)

102

vs. controls 1 (5.3%), p = 0.61], nor in the papule diameter [IGHD 2.1 (2.0) mm vs. controls

1.9 (1.5) mm, p = 1.0]. Figure 1 shows the individual and mean response of the two groups to

the skin tests. Even excluding indurations < 5 mm, and analyzing the small number of

subjects with indurations ≥ 5 mm, there was no difference between groups (IGDH vs.

Control: PPD, p = 0.31; streptokinase, p= 0.13; and candidin p= 0.56).

Table 3 shows the comparison of the number of subjects who had all the three negative

tests, one positive, two positive, three positive tests and the total number of positive tests.

IGHD subjects showed a tendency to reduced cellular response with non-significant higher

frequency of all the three negative skin tests (p = 0.052), while the controls have a high

frequency of one positive skin test (p = 0.04).

Table 4 shows the response to hepatitis B and tetanus vaccination, which was similar

in both groups.

Fifteen IGHD individuals, 42.1 (13.2) yrs. (range 28 to 64), 9 males, and 10 controls,

39.9 (9.8) yrs. (range 30 to 61), five males, were vaccinated with BCG. There was no

difference in the frequency of positivity of PPD after BCG vaccination [IGHD vs. controls, 9

(60%) vs. 6 (60%), p = 1.0], nor in the papule diameter [IGHD vs controls, 8.1 (7.1) mm vs

7.9 (6) mm, p = 0.933]. Figure 2 shows a dot plot of the values of induration after 60 days of

vaccination.

103

Discussion

The most important finding of this work is that adult IGHD individuals with a null

homozygous (C.57 + 1G > A) GHRHR mutation have similar frequency of infections,

serological and immunoglobulins panel, and immune response to vaccinations, when

compared with age and gender matched local controls. Nevertheless, IGHD subjects have

lower serum IgG levels (still in normal range), smaller papule diameter after streptokinase test

and a tendency to lower positivity in skin tests.

Although studies in vivo and in vitro have shown that GH and IGF-I are important for

the development and function of the immune system [6, 24, 25], it is not clear if GHD per se

causes immune deficits. One paper showed reduced [26], while others reported normal

immune response in GHD subjects [25, 26]. However, GHD is often found in the setting of

pan-hypopituitarism, and it is difficult to separate the effects of GHD from the effects of other

pituitary deficits and replacements. For instance, lower levels of protective antibodies post-

pneumococcal vaccine were found in treated severely panhypopituitary adults. Low levels of

IGF-I and lower prolactin levels, both related to the severity of hypopituitarism, were

associated with non-response to pneumococcal vaccination [26]. It is possible that lower

response to pneumococcal vaccine was related to deficiency of other pituitary hormones. This

is supported by the association between higher levels of prolactin and greater number of B

cells [26]. Various studies have correlated the levels of prolactin and B cell function and

immunity [26, 29, 30], and studies found the number of B-lymphocytes to be in the normal

range in GHD [27, 31].Our adult IGHD subjects have undetectable or very low IGF-I levels

[32], associated to very low GH but detectable GH levels [33], and normal prolactin levels

[34]. Due to the high homology between GH and prolactin receptors [35], a cross talking

between the two ligands and receptors is possible, as previously shown in human neutrophils

104

[36]. Consequently, the normal prolactin levels may exert a compensatory effect on the

immune function of our IGHD subjects.

Primary immune deficiency is associated to IGF-I deficiency in some rare conditions

[11-17, 37]. Immune deficiency was reported in STAT5B mutations [12-15], which cause

severe dwarfism due to GH insensitivity. These individuals present dysfunction of T

regulatory cells, T cell number deficit, and pulmonary disease [15], which are not present in

the classical model of GH insensitivity due to mutations in the GH receptor, the Laron

syndrome (LS) [38]. The lack of relevant immune disorders in both GH (LS) and our GHRH

resistance models imply that a normal IGF-I circulating level is not required for adequate

immunity.

Despite lower total IgG levels, the IGHD group reached levels of specific antibodies to

the antigens of hepatitis B and tetanus that were similar to the control group. The conversion

rate of tetanus and hepatitis B vaccination was similar in the two groups. The % of conversion

of hepatitis B vaccination in IGHD subjects was above 70%, similar to some previous studies

[39, 40], and lower than others done in non-GH deficient individuals [41-43]. A previous

study had found lower levels of antibody to tetanus toxoid in hypopituitarism, but tetanus

toxoid administration was historical and not controlled [26]. The similar response to tetanus

and hepatitis B vaccination between IGHD and controls proves that GHD does not lead to a

lower humoral response to these vaccines.

Our immune data fit with the finding of normal longevity we reported previously in

these IGHD subjects [20]. In that study, five deaths were registered between 4 and 20 years,

one due to infectious cause and the remainders were attributed to diarrheic diseases by verbal

reports [20]. In the Ecuadorian LS cohort, 22 children died at an early age, apparently from

infections and/or hypoglycemia [44]. Among the four known deaths of the Israeli LS cohort,

one was due to encephalitis [38]. Therefore, both IGHD and GH resistant patients seem

105

vulnerable to infectious diseases in childhood [20, 44, 45]. We could not investigate the

immunological status of IGHD children in this study because most IGHD children are

presently on GH replacement. It is possible that the lower IgG levels (still in normal

adulthood range) could be insufficient in childhood, as the immunoglobulin levels raises

progressively after the first month of life, reaching the adult levels at the end of adolescence

[46]. As our IGHD individuals have delayed puberty [47], it is also possible that they may

have a delay in reaching a safe immunoglobulin adulthood profile, and be more susceptible to

bacterial infections or viral antigens before adulthood.

We had previously reported that these adult IGHD subjects have a small spleen

volume, even when corrected by body surface [48]. Accordingly, GH replacement in GH

deficient mice increases spleen size [49]. The spleen has innate and adaptive immune

functions: it modulates migration and proliferation of lymphoid cells and macrophage-

dependent activation of cytotoxic T cell responses; removes apoptotic cells; increases contact

between antigen specific T lymphocytes and antigen presenting cells and contains specific B

cells, which capture antigens carried in the blood via complement receptors [50]. While the

smaller spleen size does not seem to affect the day-to-day immunoglobulin production, we

cannot exclude that during acute and severe infections, the lower levels of IgG and the smaller

volume of the spleen could contribute to an unfavorable outcome, as pathogen clearance rate

can be improved by increasing the blood flow in the spleen, which is proportional to its size

[50].

The cellular immune response of the IGHD subjects is also similar to controls, when

assessed by skin tests for streptokinase, candidin and PPD, but controls subjects were more

likely to be positive to at least one test. The skin test papule diameter in response to

streptokinase antigen was smaller in IGHD, but the frequency of positive skin tests were not

different between IGHD and controls, as previously reported in children with acquired GHD

106

[31]. After BCG immunization, there was an increase in positivity of both groups. We could

not find any previous study on BCG vaccination and response to PPD in patients with GHD.

The normal response we found fits with the observation that there has been no report of any

cases of tuberculosis in the IGHD cohort in more than 20 years of clinical and research

activities in the community.

It is important to note that the Itabaianinha cohort subjects have lifetime, congenital

IGHD. They may therefore have some compensatory mechanism not found in acquired or

adulthood onset GHD. Furthermore, the vast majority of GHD cases are not as severe as ours.

Therefore, the results of this study may not necessarily apply to subjects in whom GHD is

acquired.

One possible limitation of the study is the relatively small sample size. There is no

good literature on immune consequences of IGHD to help a reliable power calculation. We

believe that the initial number of IGHD and control adult subjects enrolled in the clinical

questionnaire was respectable considering the rarity of IGHD (1 in 3,480 to 1 in 10,000 live

births) [51] and the rarity of identifying untreated adults. This is by far the largest cohort in

the world of adult individuals with lifetime untreated IGHD. Due to these factors, a study like

this could not be easily performed anywhere else, and due to GH treatment occurring now in

children from our cohort, never again even in Itabaianinha. Unfortunately, but

understandably, the number of individuals in the following steps was each time reduced in

function of the age criteria and immune status, and this may have reduced our ability of

detecting more subtle differences between the two groups.

In conclusion, adult subjects with lifetime, untreated IGHD do not exhibit increased

frequency of infections or a significant alteration in humoral immune response. However,

IGHD subjects present reduction of total IgG levels, smaller papule diameter after

streptokinase test, and a non-significant tendency to reduced cellular response with higher

107

frequency of all the three negative skin tests. Accordingly, the controls have a higher

frequency of one positive skin test. These differences seem without clinical relevance in daily

conditions, but may contribute to an unfavorable outcome in situations of more severe

infections.

108

Funding:

This work was supported by Foundation Research and Technological Innovation of Sergipe -

FAPITEC/SE/ FUNTEC/ CNPq Nº 12/ 2009 (to A.R.J).

Acknowledgments:

The authors thank the Associação do Crescimento Físico e Humano de Itabaianinha, for

assistance.

Conflict of interest:

R.S. serves in the advisory board of Novo Nordisk and Pfizer.

Ethical approval:

All procedures performed in studies involving human participants were in accordance with

the ethical standards of the institutional and national research committee and with the 1964

Helsinki declaration and its later amendments or comparable ethical standards.

109

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Figures legends

Figure 1: Response to intradermal skin test in isolated GH deficiency (IGHD) and controls:

A) Protein Purified Derived (PPD); B) streptokinase and C) candidin; n = number of

individuals in each group. The dotted line indicates the threshold of positivity (induration 5

mm or more). The horizontal bar represent the mean.

Figure 2: PPD response after 60 days of BCG vaccine in subjects who were non-reactive to

the initial PPD; n = number of individuals in each group; dots above the dashed line indicate

positives tests (induration ≥ 5 mm). p indicates the difference of the diameter of induration

between the groups

118

Table 1: Anthropometric, hormonal, serologic data and previous infectious diseases in isolated GH deficiency (IGHD) and controls.

IGHD (35) Controls (31) P Age (years)

Range

45.8 (18)

23 to 89

47.6 (16.9)

25 to 83

0.686

Men 18 (51.4%) 17 (54.8%) 0.81

Height meter

Range

126.3 (10.3)

103 to 143

161.7 (9.9)

145 to 179.5

< 0.0001

Weight Kg

Range

38.6 (8.2)

23.9 to 58.2

66.2 (11.1)

46.3 to 88.2

< 0.0001

BMI

Range

24.7 (7)

15 to 47.3

25.3 (3.9)

18.8 to 33.2

0.206

Body Surface (m²)

Range

1.1 (0.1)

0.8 to 1.4

1.7 (0.2)

1.4 to 2.0

< 0.0001

IGF-I ng/ml 25 (0) 128 (125) < 0.0001

Range 25 to 37.2 43.3 to 270

Prolactin ng/ml 6.4 (4.1) 10.9 (19) 0.34

Range 2.1 to 33.9 3.42 to 33.9

Positivity for Chagas 1 2 0.597

Chagas disease 0 1 0.469

Positivity for leishmania 2 3 0.659

Leishmaniasis disease 0 0 1.0

Hanseniasis 2 1 1.0

Recurrent tonsillitis

Child Gastroenteritis

3

1

1

2

0.619

0.586

Pneumonia 2 2 1.0

HIV positive 0 0 1.0

Hepatitis B and C 0 0 1.0

Tuberculosis 0 0 1.0

Rheumatic fever 0 0 1.0

Positivity for Tetanus 6 7 0.758

Data are in mean (standard deviation), except for IGF-I and prolactin in median (interquartile

range)

119

Table 2: Comparison of the results of the immunoglobulin levels in isolated GH deficiency

(IGHD) and controls

IGHD Controls P

N 11 14

Men 7 (63.6 %) 6 (42.9 %) 0.43

Age (years)

Range

41.1 (12.8)

25-58

45.6(11.5)

28-61

0.37

IgA (mg/dl)

Range

277.1 (53)

163.1-538.7

199.1 (122.7)

95.3-517

0.11

IgG (mg/dl)

Range

1049.9 (197.9)

695-1355

1346.3 (401.9)

471-1971.9

0.03

IgE (UI/ml)

Range

743 (631.5)

31.7-2001

439.9 (680.5)

14-2001

0.26

IgM (mg/dl)

Range

160.5 (61.3)

64.3-253.8

141.9 (40.8)

93.4-223

0.40

N = number of individuals; IgA, IgG, IgE and IgM: immunoglobulins A, G, E and M; data

presented as mean (standard deviation), except the IgA values that are expressed as median

(interquartile distance).

Table 3: Comparison of the number of subjects who had all the three negative skin tests, one

positive, two positive, three positive tests and the total of positive tests between the groups.

IGHD Controls p

Number of subjects 21 19

Men 8 (38.1%) 6 (31.6%) 0.75

Age (years) 42.9 (13) 44.3 (11.5) 0.73

Range (years) 25-64 20-61

Negative in 3 tests 16 (76.2%) 8 (42.1%) 0.052

Positive in 3 tests 2 (9.5%) 0 0.49

Positive in 2 tests 0 2 (10.5%) 0.22

Positive in 1 test 3 (14.3%) 9 (47.4%) 0.04

Overall positive tests 9 /63 (14.3%) 13/57 (22.8%) 0.35

120

Table 4: Comparison of the results of the vaccination for hepatitis B and tetanus in isolated

GH deficiency (IGHD) and controls:

IGHD Controls p

Hepatitis B

N 10 13

Men 7 (70 %) 6 (46.2 %) 0.4

Age (years)

Range

42.3 (12.8)

25-58

47 (10.8)

29-61

0.51

Antibodies

(mUI/ml)

Range

316.04 (354.6)

1.9-1001

278.7 (361.2)

1.9-1001

0.81

Immune 7 (70%) 10 (76.9%) 1.0

Tetanus

N 11 11

Men 7 (63.6 %) 5 (45.5%) 0.67

Age (years)

Range

41.1 (12.8)

25-58

49.4 (9.7)

32-61

0.10

Antibodies (UI/ml)

Range

2.33 (2.25)

0.09-5.1

1.75 (1.47)

0.46-4.97

0.48

Immune 7 (63.6%) 7 (63.6%) 1.0

N = number of individuals; immunes = number of individuals who have achieved levels of

protective antibodies; data expressed as mean (standard deviation).

121

FIGURE 1

122

FIGURE 2

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