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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Desenvolvimento biotecnológico de uma emulsão de uso tópico a base de óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) LUCAS AMARAL MACHADO Natal-RN
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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
PRO-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Desenvolvimento biotecnológico de uma emulsão de uso tópico a base de
óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)
LUCAS AMARAL MACHADO
Natal-RN
LUCAS AMARAL MACHADO
Desenvolvimento biotecnológico de uma emulsão de uso tópico a base de
óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade Federal
do Rio Grande do Norte como requisito
para obtenção do título de mestre.
Orientador: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa de Egito
Co-orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio da Silva Júnior
Natal-RN
2015
“Há homens que lutam um dia e são bons.
Há outros que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam toda a vida.
Esses são os imprescindíveis”
(Bertolt Brecht)
Dedico este trabalho:
Ao meu pai e ao meu irmão que em vida sonharam o meu
sonho ao meu lado, mas que hoje o realizam junto
comigo, na minha memória e em meu coração, dando-me
força, abençoando meus passos e sorrindo com as
vitórias que não são só minhas, mas nossas.
AGRADECIMENTOS
Em mais esta etapa de vida, várias pessoas foram essenciais para que eu
chegasse até esta fase do meu mestrado, e a elas eu presto meus
agradecimentos.
Agradeço à minha mãe, Ereni, pelo apoio e fé sempre depositados em mim
e nos meus sonhos.
À minha irmã, Paola, pelo importante papel que tem na minha vida.
À minha sobrinha Gabriela pela felicidade que me trouxe e por se tornar a
razão da minha vida.
Aos amigos Giovani Kolling, Roberta Timm, Alice Lüdtke, Rodolpho Brito
pelos momentos de conversas, conselhos e alegrias.
Aos que fazem parte do Laboratório de Sistemas Dispersos, especialmente
a Cybelle, Sarah, Rosilene e Christian Assunção e demais que compartilham
alegrias e conhecimentos no dia-a-dia.
Aos amigos e companheiros de equipe, Éverton, Andreza, Renata, Teresa,
Christian e Júnior Xavier pelo apoio em todos os momentos enfrentados no
desenvolver deste trabalho.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates pelos conhecimentos,
correções e suporte financeiro em aquisição de materiais necessários.
Ao Prof. Dr. Arnóbio Antônio, meu co-orientador, pelo apoio, disponibilidade
e correções.
Não menos importante, agradeço a CAPES pela bolsa concedida e CNPq
pelo financiamento de alguns matérias do projeto.
RESUMO
A pele é um dos maiores órgãos do corpo humano e representa cerca de
16% do peso corporal. A proteção do corpo frente a microrganismos do meio
externo é uma das suas mais importantes funções, devendo, a pele, manter-se
íntegra para que esta função seja exercida, de modo que, quando há uma lesão
na mesma, o processo de reestruturação necessita ser iniciado, podendo, ainda,
ser comprometido devido a algumas patologias, justificando ainda mais a
necessidade do desenvolvimento de produtos de uso tópico que favoreçam ou
mesmo acelerem a cicatrização da pele. Assim, o objetivo deste estudo foi extrair
e desenvolver uma emulsão adequada para uso tópico a base de óleo de rã-
touro. Duas amostras de óleo fora obtidas por diferentes métodos. As amostras
foram fisioquimicamente caracterizadas e seus compostos identificados através
de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG/EM). O
equilíbrio hidrifílico-lipofílico requerido (EHLr) do óleo de rã-touro foi determinado
e em seguida um diagrama de fases construído. A estabilidade da emulsão de
uso tópico foi determinada. A análise de citotoxicidade do óleo de rã-touro in
natura e na emulsão de uso tópico foi realizada através do ensaio de MTT,
utilizando linhagem de fibroblastos normais (3T3) e de melanoma (B16F10). O
rendimento da extração a quente foi de 60,6%. Os principais compostos
insaturados foram o ácido eicosapentaenóico (17,6%) e ácido araquidônico
(8,4%). O estudo de EHLr demonstrou a presença de sistemas estáveis com EHL
entre 12 e 13,5 e o diagrama de fases revelou a predominância de sistemas
caracterizados como emulsão (62%). A emulsão tópica apresentou tamanho de
gotícula igual a 390 nm, polidispersão de 0,05, potencial zeta -25 mV e manteve-
se estável durante os 90 dias avaliados. O óleo de rã-touro e a emulsão tópica
não apresentaram citotoxicidade frente à linhagem de células 3T3. No entanto,
inviabilizaram (p > 0,05) o crescimento das células B16F10. Em conclusão, o óleo
de rã-touro apresenta características químicas desejáveis para o desenvolvimento
de sistemas terapêuticos de uso farmacêutico e/ou cosmético.
Palavras chaves: Óleo de rã-touro, Rana catesbeiana Shaw. Emulsão, EHL,
diagrama de fases, citotoxicidade.
ABSTRACT
The skin is one of the largest organs of the human body and accounts for about
16% of body weight. The body protection against the external environment
microorganisms is one of its most important functions, however is necessary that
the skin remain intact for this function be exercised, so that when there is an injury
on the skin, the process of restructuring needs to be starts, however this
restructuration may also be compromised due to some diseases, justifying even
more the need for the development of topical products that promote or accelerate
the skin healing. Thus the aim of this study was to extract bullfrog oil and to
develop a suitable topical emulsion. Two different oil samples were extracted by
hot or organic solvent process. Titration techniques and gas chromatography-
mass spectrometry were used to characterize the bullfrog oil. The required
hydrophile-lipophile balance (HLBr) of bullfrog oil was determined and a pseudo-
ternary phase diagram was constructed. The stability of the topical emulsion was
evaluated. Then, cellular viability was determined by MTT assay using normal
fibroblasts (3T3) and melanoma (B16F10) cells lines. The hot extraction yield was
60.6%. The major polyunsaturated compounds found were Eicosapentaenoic acid
(17.6%) and Arachidonic acid (8.4%). HLBr study demonstrated the presence of
stable systems with HLB ranging from 12.1 to 13.5 and the pseudo-ternary phase
diagram showed mainly emulsion systems (62%). Topical emulsion showed 390
nm, polydispersity 0.05, zeta potential -25 mV and remained stable for ninety
days. The bullfrog oil and topical emulsion did not showed citotoxicity in normal
fibroblasts cells. However, these systems showed significantly inhibition of
melanoma cells growth. In conclusion, the bullfrog oil presented desirable
chemical characteristics required to be used for the development of a
pharmaceutical and cosmetic products.
Keywords: Bullfrog oil; Rana catesbeiana Shaw; Emulsion; HLB, pseudo-ternary
phase diagram, Citotoxicity.
LISTA DE SÍMBOLOS, ABREVIATURAS E SIGLAS
EPA Ácido eicosapentaenoico
DHA Ácido docosapentaenóico
AA Ácido araquidônico
A/O Água em óleo
O/A Óleo em água
A/O/A Água em óleo em água
O/A/O Óleo em água em óleo
EHL Equilíbrio hidrofílico-lipofílico
EHLr Equilíbrio hidrofílico-lipofílico requerido
® Registrado
DMSO Dimetilsufoxido
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
SFB Soro fetal bovino
ATCC American Type Culture Collection
BOH Amostra de óleo de rã-touro obtida por extração a quente
BOHx Amostra de óleo de rã-touro obtida por extração com solvente
orgânico
USP Untited States Pharmacopeia
IA Índice de acidez
IS Índice de saponificação
II Índice de iodo
IP Índice de peróxido
CG-EM Cromatografia gasosa acoplada a detector de espectrometria de
massa
°C Graus célsius
°C.min-1 Graus célsius por minuto
eV Electron-volts
mL.min-1 Mililitro por minuto
BSTFA N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
µL Microlitro
r.p.m Rotações por minute
% Por cento
DLS Dynamic light scattering
PdI Polidispersão
NaCl Cloreto de sódio
mM Milimolar
µg/mL Micrograma por mililitro
mg/mL Miligrama por mililitro
Nm Nanometro
ANOVA Análise de variança
Mg Miligrama
KOH/g Hidróxido de potássio por grama
mEq Miliequivalente
DP Desvio padrão
S/cm Siemens por centímetro
SF Separação de fases
mV
v/v
Milivolts
Volume/volume
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- a. Corte histológico da pele apresentando as três camadas
e estruturas anexas. b. a epiderme, os monócitos basais e
os vasos sanguíneos na derme.
18
Figura 2- Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw). 19
Figura 3- Esquema dos diferentes tipos de emulsão, O/A (A), A/O
(B), A/O/A (C) e O/A/O (D).
23
Figura 4- Parâmetros físico-químicos resultantes das análises do
óleo de rã-touro. Índice de acidez (mg de KOH/g de óleo);
Índice de saponificação (mg KOH/g de óleo); Índice de iodo
(mEq de oxigênio ativo/ 1000 g de óleo).
38
Figura 5- Diagrama de fases pseudoternário do oleo de rã-touro
produzido com EHLr 12,1. Preto (separação de fases),
cinza escuro (microemulsão), cinza médio (gel), cinza claro
(nanoemulsão), branco (emulsão).
44
Figura 6- Tamanho de gotícula e pH da emulsão básica e da
emulsão tópica durante 90 dias de análise. A: tamanho de
gotícula; B: análise de pH.
46
Figura 7- Viabilidade celular da emulsão tópica e do óleo de rã-touro
em três concentrações destas amostras. A: viabilidade
celular da linhagem 3T3; B: viabilidade celular da linhagem
B16F10.
49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Ácidos graxos presentes no óleo extraído do tecido adiposo
da rã-touro
21
Tabela 2- Composição da emulsão tópica
32
Tabela 3- Caracterização química por GC-EM do óleo de rã-touro
obtido pelo processo de extração a quente (BOH)
39
Tabela 4- Caracterização do primeiro lote dos sistemas emulsionados
a base de óleo de rã-touro para determinação do EHLr após
60 dias de análise a 25 °C
41
Tabela 5- Caracterização do segundo lote dos sistemas emulsionados
a base de óleo de rã-touro para determinação do EHLr após
60 dias de análise a 25 °C
43
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 14
2. REVISÃO DA LITERATURA 17
2.1. A PELE 17
2.2. RÃ-TOURO (Rana catesbeiana Shaw) 18
2.2.1. O uso terapêutico do óleo de rã-touro 20
2.3. SISTEMAS EMULSIONADOS A BASE DE ÓLEOS NATURAIS 23
3. OBJETIVOS 27
3.1. OBJETIVO GERAL 27
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27
4. MATERIAIS E MÉTODOS 29
4.1. MATERIAIS 29
4.1.1. Substâncias químicas e Material biológico 29
4.2. MÉTODOS 29
4.2.1. Extração do óleo de rã-touro 29
4.2.2. Análise da composição físico-química dos óleos 30
4.2.3. Caracterização química do óleo de rã-touro 30
4.2.4. Estudo do equilíbrio hidrofílico-lipofílico requerido (EHLr) 31
4.2.5. Construção do diagrama de fases pseudoternário 31
4.2.6. Desenvolvimento da emulsão tópica a base de óleo de rã-touro 32
4.2.7. Caracterização dos sistemas 33
4.2.7.1. Aspectos macroscópicos 33
4.2.7.2. Avaliação de pH e condutividade elétrica 33
4.2.7.3. Análise de distribuição de tamanho de gotícula e potencial zeta 33
4.2.8. Estudo de estabilidade das emulsões 34
4.2.8.1. Técnica de microemultócrito (estabilidade a curto prazo) 34
4.2.8.2. Ciclos gelo/degelo 34
4.2.8.3. Resistência centrífuga 34
4.2.9. Estudo de citotoxicidade 34
4.2.10. Análises estatísticas 35
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 37
5.1. EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO ÓLEO DE RÃ-
TOURO 37
5.2. DETERMINAÇÃO DO EHLR DO ÓLEO DE RÃ-TOURO 40
5.3. CONSTRUÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES PSEUDOTERNÁRIO 44
5.4. DESENVOLVIMENTO DA EMULSÃO TÓPICA DE ÓLEO DE RÃ-TOURO
45
5.5. ENSAIO DE CITOTOXICIDADE 47
6. CONCLUSÕES 51
7. PERSPECTIVAS 53
8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA 55
9. REFERÊNCIAS 58
13
1. INTRODUÇÃO
14
1. INTRODUÇÃO
A pele é o maior órgão do corpo humano e corresponde a
aproximadamente 16% do peso corporal. Este órgão é composto por três
camadas, a epiderme, derme e hipoderme, organizadas, respectivamente, da
camada mais externa para a mais interna, e possui funções sensoriais,
metabólicas, termorreguladora e protetora (Albuquerque, 2005; Candi, Schmidt et
al., 2005; Abbas, Lichtman et al., 2008; Cevc e Vierl, 2010).
As lesões sobre a pele são frequentes devidas a exposição deste órgão ao
meio externo (Santos, Vieira et al., 2009). Adicionalmente, estas lesões
promovem uma maior suscetibilidade do organismo de contrair infecções
causadas por microrganismos (Abbas, Lichtman et al., 2008), o que justifica a
necessidade de desenvolvimento de produtos que sejam biocompatíveis, atóxicos
e que possuam componentes que ajudem a manter a integridade física da
mesma, preferencialmente através da utilização de tecnologias que não agridam o
meio ambiente, o que projeta a utilização de recursos naturais como principal
fonte para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos em função da sua
biocompatibilidade.
Neste contexto o uso de materiais de fontes naturais na medicina faz parte
da história da civilização, havendo grande destaque de seu uso na cultura de
diversos países (Gomes, Rezende et al., 2007). Assim, baseado nos
conhecimentos da medicina popular, o interesse por parte das indústrias e
pesquisadores, tendo como fonte de estudo os ativos naturais, no
desenvolvimento de novos produtos terapêuticos, tem se tornado uma prática
bastante comum, visto que a partir do isolamento de novas substâncias
terapêuticas e a comprovação da sua ação biológica, é possível a realização do
incremento do arsenal farmacoterapêutico de diversas patologias (Paiva, Rao et
al., 1998; Paiva, Gurgel et al., 2004; Viegas Jr, Bolzanii et al., 2006; Mendonça e
Onofre, 2009).
Os óleos de origem vegetal e animal são amplamente utilizados na
medicina popular em terapias de distúrbios de caráter imunológico e inflamatório,
atividades estas sugeridas através de estudos que atribuem estas funções à
15
presença de metabólitos secundários e ácidos graxos (Yaqoob, 1998; Roland,
Piel et al., 2003).
Os óleos naturais apresentam vantagens tais como: baixa toxicidade, alta
biodegradabilidade, presença de substâncias com propriedades farmacológicas e
capacidade de apresentarem-se como uma fonte renovável (Roland, Piel et al.,
2003) e o seu emprego na terapêutica representa uma nova alternativa no
tratamento de diversas doenças (Manhezi, Bachion et al., 2008). Dentre estes
óleos, é possível destacar o óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) que tem
seu uso relatado, conforme estudos preliminares, para o tratamento de asma,
doenças infecciosas, na cicatrização de feridas e como antibiofilme (Lopes, 2003;
Lopes, T.N.C. et al., 2012; Alencar, Xavier et al., 2015).
O óleo de rã-touro é extraído do tecido adiposo deste anfíbio, o qual é
obtido de indústrias alimentícias que realizam o beneficiamento apenas de sua
carne em virtude da benéfica composição nutricional, descartando este tecido
graxo da mesma. Este óleo é empregado em algumas terapias de caráter
imunológico e anti-inflamatório devido à presença de ácidos graxos essenciais,
especificadamente os ômegas, ácidos graxos responsáveis por suas atividades
farmacológicas (Lopes, 2003; Gonçalves e Otta, 2008).
Com o objetivo de minimizar ou mesmo mascarar características
organolépticas desagradáveis, assim como promover uma melhora das
características físico-químicas e biofarmacêuticas do óleo de rã-touro, surgem as
emulsões, as quais são sistemas dispersos coloidais formados por fases
imiscíveis, em que uma fase está dispersa no interior da outra na forma de
gotículas estabilizadas por tensoativos (Bibette, Calderon et al., 1999).
As características deste sistema, relacionadas ao óleo de rã-touro,
sugerem que, através da utilização deste como fase interna da emulsão, é
possível minimizar seu odor, motivo da pouca adesão ao tratamento para diversos
medicamentos. Ainda, através da utilização de adjuvantes pode ser
potencializado seu efeito terapêutico permitindo um aumento da permeabilidade
cutânea e hidratação da pele, promovendo uma melhora das características
biofarmacêuticas deste óleo, já que a pouca espalhabilidade e baixa permeação
cutânea do mesmo na forma in natura são suas principais desvantagens (Bibette,
Calderon et al., 1999; Lopes, T.N.C. et al., 2010).
16
2. REVISÃO DA LITERATURA
17
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. A PELE
A pele é formada por três camadas, a epiderme, derma e a hipoderme
(Figura 1), de modo que a integridade destas promove ao ser humano uma
proteção contra agentes infecciosos existentes no meio externo (Candi, Schmidt
et al., 2005). A epiderme, camada mais externa da pele, é formada principalmente
por queratinócitos, melanócitos e células do sistema imune, e pode ser
subdividida em camadas de acordo com o grau de maturação dos queratinócitos
(Candi, Schmidt et al., 2005; Cevc e Vierl, 2010). A segunda camada da pele é a
derme, esta camada possui em sua composição o colágeno, fibroblastos, células
dendríticas e histócitos, bem como vasos sanguíneos, vasos linfáticos e
terminações sensoriais. Por último, tem-se a hipoderme, nesta camada fica
armazenada a reserva de tecido adiposo, de tal forma que a sua constituição
principal são os adipócitos (Lai-Cheong e Mcgrath, 2009).
Os tipos de doenças e lesões que este órgão pode sofrer são diversos, de
modo que a utilização de produtos de uso tópico para seu tratamento é
mundialmente difundida. Além disso novos produtos capazes de penetrar pela
pele estão sendo desenvolvidos (Viegas Jr, Bolzanii et al., 2006).
Adicionalmente, a medicina popular sugere a utilização de diversos
compostos naturais com prováveis atividades terapêuticas, sendo a via tópica
citada como a principal via de administração para vários destes produtos (Lopes,
2003; Xavier, Silva et al., 2012; Alencar, Xavier et al., 2015). Dessa maneira o
conhecimento sobre a toxicidade que estes compostos podem causar é essencial,
visto que alguns autores relatam efeitos tóxicos sobre células renais, sanguíneas,
hepáticas e nervosas de diversos compostos naturais utilizados na medicina
popular (Paiva, Rao et al., 1998; Paiva, Gurgel et al., 2004; Alencar, Xavier et al.,
2015).
18
Figura 1- a. Corte histológico da pele apresentando as três camadas e estruturas
anexas. b. a epiderme, os melanócitos basais e os vasos sanguíneos
na derme. (Fonte: LAI-CHEONG; MCGRATH, 2009).
2.2. RÃ-TOURO (Rana catesbeiana Shaw)
A rã-touro (Rana catesbeiana Shaw) (Figura 2) é um anfíbio nativo da
América do Norte e foi introduzido no Brasil na década de 30 através da
ranicultura. Este animal ectotérmico adaptou-se ao clima tropical, fator este que
influenciou o processo de reprodução com maior rapidez, assim como no ganho
de peso, gerando animais com massa superior às espécies nativas.
Taxonomicamente, este animal pertence ao Reino Metazoa, Filo Chordata,
Subfilo Craniata, Superclasse Gnathostomata, Classe Amphibia, Superordem
Ranidae, Ordem Anura, Subordem Neobatrachia, Superfamília Ranonidea,
Família Ranidae, Subfamília Raninae, Gênero Rana, Subgênero Aquarana
(Boelter e Cechin, 2007; Ficetola, Coic et al., 2007; National Center for
Biotechnology Information, 2014).
19
Figura 2- Rã-Touro (Rana catesbeiana Shaw). (Fonte: GONÇALVES;
OTTA, 2008).
Morfologicamente, ambos os sexos da rã-touro são caracterizados pela
presença de corcovas sacrais proeminentes, dorso de cor verde, marrom ou cor
de oliva e machas largas, cabeça verde-clara, ventre branco ou acinzentado com
manchas, pernas com marchas esparsas ou contínuas, caixas acústicas
proeminentes e corpo sem dobras dorso-laterais. O que diferencia os sexos desta
espécie é a presença de garganta amarelada, caixas acústicas mais largas que
os olhos e polegares alargados nos machos (Coutinho, 2002).
A utilização da rã-touro vem aumentando nos ramos industriais, seja no
ramo alimentício, pela utilização de sua carne rica em conteúdo proteico, ou na
indústria do couro, pela utilização de sua pele para a produção de bolsas,
calçados e acessórios (Lopes, 2003). De toda forma, a medicina popular relata
ainda a aplicabilidade do óleo de rã-touro no tratamento de doenças inflamatórias,
assim como no tratamento de feridas para diminuição de quelóide, embora ainda
não haja efetivamente estudos que comprovem tais atividades (Lopes, 2003).
O tecido adiposo é a principal fonte para a obtenção do óleo de rã-touro, o
qual é normalmente rejeitado nos ranários. Este tecido ocupa cerca de 2% do
peso corporal da rã-touro, salvo variações sazonais e de habitat, e é composto
principalmente por triacilgliceróis, contudo, também são encontrados ácidos
graxos livres, carotenóides e colesterol (Brown, 1964). Estes lipídios são
resultantes das reservas nutricionais que estes animais produzem durante o verão
e que são utilizados no inverno em virtude do período de pré-hibernação, o qual
20
ocorre com o intuito da rã resistir ao frio e fugir do congelamento (Fitzpatrick,
1976; Mendez, Sanhueza et al., 1998; Coutinho, 2002; Lopes, 2003).
Durante o outono é onde são encontrados os estoques máximos de
lipídios, enquanto que o mínimo é encontrado no início do verão. Isto acontece
devido os machos desta espécie reduzirem sua alimentação ou mesmo
suspender sua alimentação no outono, devido a baixa demanda de gasto de
energia do período, podendo assim aumentar a reserva existente, a qual será
utilizada para suas funções reprodutivas (Storer e Stebbins, 1998).
O tecido adiposo deste animal tem grande importância para o mesmo para
o seu desenvolvimento gonadal, de modo que a ausência deste tecido provoca
degeneração dos órgãos genitais, assim como a ausência de tecido adiposo em
fêmeas fecundadas aumenta o risco de que a mesma utilize seus ovos cheios de
vitelo para seu próprio sustento (Storer e Stebbins, 1998).
2.2.1. O uso terapêutico do óleo de rã-touro
O aproveitamento biotecnológico do tecido adiposo da rã-touro, com
finalidade científica, vem sendo amplamente estudado através dos efeitos que o
óleo extraído deste tecido possui (Lopes, T.N.C. et al., 2010; Alencar, Xavier et
al., 2015). Vários são os parâmetros utilizados para a obtenção deste óleo, dos
quais podem ser citados a utilização de solventes orgânicos e o uso de
aquecimento, havendo destaque para este último, principalmente sob
temperaturas medianas (aproximadamente 80 ºC), visto que o rendimento e as
características físico-químicas nestas temperaturas são melhores do que quando
utilizadas temperaturas elevadas (200ºC) ou baixas (35ºC) (Mendez, Sanhueza et
al., 1998; Lopes, T.N.C. et al., 2010).
Atualmente, a população do estado do Rio Grande do Norte no Brasil, tem
utilizado o óleo de rã-touro no tratamento de processos asmáticos, alérgicos e em
processos de regeneração cutânea (Lopes, T.N.C. et al., 2010).
Adicionalmente, alguns pesquisadores sugeriram que a atividade
cicatrizante poderia ser potencializada pelo uso da pele da rã-touro como um
curativo oclusivo e que esse uso estaria associado à presença de colágeno e
queratina neste tecido, assim como o aumento da proteção da região lesada, já
21
que o mesmo tem sua aplicação favorecida em virtude de ser um componente
orgânico e de promover uma oclusão na região lesada (Lima, Cruz et al., 1999;
Velly, 2001). Contudo, estas pesquisas não demonstraram tanta eficácia do tecido
epitelial deste anfíbio na regeneração de tecidos humanos (Lopes, 2003)
Assim, seguindo os conhecimentos da medicina popular, outros estudos
buscaram determinar os componentes químicos presentes no óleo de rã-touro,
impulsionando as pesquisas a acreditar que a atividade regenerativa epitelial e a
atividade contra processos inflamatórios crônicos estão mais associadas ao uso
do óleo e não ao tecido epitelial do mesmo (Mendez, Sanhueza et al., 1998;
Lopes, 2003; Silva, Miyasaka et al., 2004; Lopes, T.N.C. et al., 2012). Na Tabela 1
é possível observar uma série de ácidos graxos que foram identificados em óleos
extraídos de rã.
Tabela 1: Ácidos graxos presentes no óleo extraído do tecido adiposo da
rã-touro.
Ácido graxo (%) (Mendez,
Sanhueza et
al., 1998)
(Silva,
Miyasaka et
al., 2004)
(Lopes, T.N.C.
et al., 2010)
Mirístico (14:0) 2,7 2,77 1,8
Palmítico (16:0) 18,1 11,91 18,5
Esteárico (18:0) 4,1 2,34 3,2
Oléico (18:1 n-9) 31,7 37,6 36,3
Linoléico (18:2 n-6) 12,9 23,78 25,0
Linolênico (18:3 n-3) 1,4 1,97 2,1
Palmitoleico (16:1 n-7) 8,0 17,0 9,4
Eicosapentaenóico-EPA (20:5 n-3) 1,5 0,46 -
Docosaexaenóico-DHA (22:6 n-3) 4,7 0,91 0,1
Araquidônico AA (20:4 n-6) - 0,74 0,6
Estes estudos verificaram a presença de ácido linoléico (ômega-6), de
ácido araquidônico (AA), ácido linolênico (ômega-3), bem como os ácidos graxos
de cadeias longas e insaturadas ativas da série ômega-3, ácido
eicosapentaenoico (EPA) e o ácido docosaexaenoico (DHA). Estes ácidos graxos,
especialmente o ácido linoléico e o ácido linolênico possuem grande importância
22
na manutenção e higidez da pele devido as suas interações com o estrato córneo
através das ceramidas, reduzindo desidratação transepidérmica e mantendo a
integridade e elasticidade da pele (Belda e Pourchet-Campos, 1991).
Neste contexto, tem-se ainda o AA, DHA e EPA, os quais auxiliam na
atividade das enzimas, integridade e fluidez das membranas e estimulam a
síntese de prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanos, modificando reações de
caráter inflamatório e imunológico, alterando funções leucocitárias e acelerando o
processo de degranulação tecidual, atuando de forma similar a fármacos de
caráter anti-inflamatório (Kelley, 2001; Moreira, Curi et al., 2002; Jorge e Dantas,
2003).
Apesar do óleo de rã-touro apresentar-se como uma fonte promissora no
desenvolvimento de fármacos com capacidade regenerativa tecidual, a ausência
do conhecimento sobre a toxicidade deste composto para uso tópico, além de
suas características físicas e organolépticas apresentarem-se como
desvantagens para sua administração e aceitação pelos pacientes, são fatores
que impulsionam novos estudos com este óleo. Exemplos destas características
são a baixa espalhabilidade, o que torna dificultosa sua aplicação de forma
homogênea; a baixa absorção que por sua vez impede que o mesmo venha a agir
em determinadas regiões da pele tais como derme e hipoderme; bem como o
odor e a viscosidade, os quais promovem receio à administração, diminuindo a
adesão ao tratamento (Lopes, 2003).
Assim, o desenvolvimento de um sistema farmacêutico torna-se necessário
com a finalidade de ultrapassar estas desvantagens, o que, partindo-se do
pressuposto que o uso de um sistema emulsionado é capaz de aumentar a
estabilidade química do produto, mascarar o sabor e odor desagradável, otimizar
a biodisponibilidade da substância ativa e possui biocompatibilidade com a pele,
tornam o mesmo uma excelente alternativa na veiculação do óleo de rã-touro,
possibilitando a obtenção de um produto estável, adequado para uso tópico e de
fácil acesso à população.
23
2.3. SISTEMAS EMULSIONADOS A BASE DE ÓLEOS NATURAIS
Emulsões são sistemas heterogêneos formados por uma fase aquosa e
outra oleosa, dispersas entre si na forma gotículas estabilizadas por tensoativos,
cujo tamanho pode variar de nanômetros à micrômetros (Roland, Piel et al., 2003;
Macedo, Fernandes et al., 2006). Estas gotículas são formadas por uma das
fases, a qual pode ou não possuir fármacos internalizados, e que se mantém
dispersa na outra fase. Os sistemas emulsionados apresentam-se geralmente
como óleo em água (O/A), água em óleo (A/O), podendo ainda, apresentar-se na
forma de emulsões múltiplas (O/A/O ou A/O/A) (Figura 3) (Bibette, Calderon et al.,
1999; Ferrari, Maruno et al., 2008).
Figura 3- Esquema dos diferentes tipos de emulsão, O/A (A), A/O (B), A/O/A (C)
e O/A/O (D). (Fonte: autoria própria).
Os tensoativos são substâncias anfifílicas que interagem com as fases
interna e externa diminuindo a tensão interfacial entre os líquidos, melhorando a
estabilização do sistema. Desta forma, emulsões possuem melhor estabilidade
quando a mistura de tensoativos atinge o equilíbrio hidrofílico-lipofílico (EHL)
requerido pela fase oleosa da emulsão usada no sistema (Griffin, 1949; Aulton,
2005; Ansel, Popovich et al., 2007; De Oliveira Ferreira, 2008; Sinko, 2008;
Ferreira, Santiago et al., 2010).
Dentre as vantagens atribuídas a estes sistemas é possível citar a
capacidade de mascaramento de características organolépticas, tais como odor e
gosto desagradável, possibilidade de incorporação de princípios ativos de caráter
tanto hidrofílico, quanto lipofílico, possibilitando, ainda, uma melhora na absorção
destes últimos quando administrado por via oral e alterações de características
24
biofarmacêuticas e farmacocinéticas (Bibette, Calderon et al., 1999; Aulton, 2005;
Ansel, Popovich et al., 2007; De Oliveira Ferreira, 2008; Sinko, 2008; Verissimo,
Lima et al., 2010).
Apesar de serem sistemas heterogêneos e possuírem tendência à
instabilidade, vários parâmetros são considerados no momento do
desenvolvimento de uma emulsão, os quais possuem a finalidade de controlar
estes fenômenos de instabilidade, dentre estes parâmetros, é possível citar o
tamanho de gotícula, polidispersividade, EHL e potencial zeta (Bibette, Calderon
et al., 1999; Roland, Piel et al., 2003; Ansel, Popovich et al., 2007; Sinko, 2008).
No fenômeno de floculação, ocorre uma aproximação das gotículas, sem
que haja rompimento da interface entre a fase dispersa e dispersante, não
havendo, portanto um aumento de tamanho de gotícula, e sim, a formação de
agregados. A coalescência é o fenômeno que sucede a floculação. Neste há
fusão entre as gotículas, promovendo a formação de um sistema com alta
polidispersividade (Roland, Piel et al., 2003).
A cremagem e a separação de fases são os dois últimos estágios da
instabilidade de um sistema emulsionado. Neste primeiro há uma sedimentação
ou flutuação dos constituintes da emulsão devido a diferença que existe entre as
densidades dos mesmos, enquanto que na separação de fases o conteúdo
lipofílico e hidrofílico do sistema separam-se, sem que haja possibilidade de
reverter o quadro de instabilidade do sistema. A instabilidade ocasionada por
pontes de Ostwald costuma preceder a separação de fases e é caracterizada pela
formação de agregados de gotículas, isto ocorre devido à capacidade que alguns
materiais solúveis na fase externa do sistema possuem de se solubilizar com as
gotículas, promovendo um aumento no diâmetro das mesmas (Roland, Piel et al.,
2003; Aulton, 2005; Ansel, Popovich et al., 2007).
Desta forma, tendo as emulsões como um sistema vantajoso no
desenvolvimento de produtos contendo veículos oleosos e, baseado na
composição química do óleo de rã-touro, que por sua vez sugere que o mesmo
possui atividades terapêuticas por via tópica, a avaliação da citotoxicidade deste
óleo e o desenvolvimento de uma formulação farmacêutica a base de óleo de rã-
touro tornam-se uma boa alternativa para contribuir com a saúde pública. A
possibilidade de controlar a instabilidade destes sistemas, bem como as
25
características organolépticas desagradáveis que este óleo possui, fazem destes
uma opção vantajosa no desenvolvimento de um produto para uso tópico, visto
que através da incorporação de produtos de origem natural tais como o óleo de
rã-touro em sistemas dispersos, é possível promover a superação das
desvantagens apresentadas por este óleo, potencializando algum provável efeito
terapêutico e atribuindo características que aumentem a aceitabilidade do mesmo
pela população (Xavier, Silva et al., 2012).
26
3. OBJETIVOS
27
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Desenvolver e realizar a caracterização físico-química de um sistema
farmacêutico emulsionado a base de óleo de rã-touro (Rana catesbeiana Shaw)
para uso tópico.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Extrair o óleo de rã-touro a partir de tecido adiposo descartado em ranário.
• Realizar o controle de qualidade de amostras de óleo de rã-touro que serão
utilizados como matéria-prima no desenvolvimento das formulações.
• Determinar o melhor valor do Equilíbrio Hidrofílico Lipofílico requerido
(EHLr) do óleo de rã-touro
• Construir um diagrama de fases pseudoternário com o EHLr do óleo de rã-
touro.
• Desenvolver um sistema emulsionado para uso tópico a base de óleo de
rã-touro.
• Realizar a caracterização físico-química da emulsão do óleo de rã-touro.
• Avaliar a estabilidade físico-química destes sistemas.
• Avaliar a citotoxicidade do sistema desenvolvido através da técnica de
MTT.
28
4. MATERIAIS E MÉTODOS
29
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. MATERIAIS
4.1.1. Substâncias químicas e Material biológico
Tecido adiposo de rã-touro foi fornecido por Asmarana Produtos Naturais
(Natal, RN, Brasil). Span® 80 (monooleato de sorbitano 80), penicilina-
estreptomicina e reagente MTT (brometo de (3- (4, 5-dimetiltiazolil-2) -2,5-
difeniltetrazólio)) foram obtidos a partir de Sigma Aldrich Inc. (St. Louis, MO,
EUA). Etanol, dimetilsulfóxido (DMSO), hexano, propilenoglicol e Tween® 20
(polisorbato 20) foram adquiridos da VETEC (RJ, RJ, Brasil). Álcool Cetostearílico
etoxilado e palmitato de isopropila foram adquiridos da ViaFarma (São Paulo, SP,
Brasil). Goma xantana e Germall® foram adquiridos da Mapric (São Paulo, SP.
Brasil). Butilhidroxitolueno foi adquirida da Galena (Campinas, SP, Brasil) e
Fragrância floral verde foi obtida a partir de Bio Inter (São Paulo, SP, Brasil).
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) e soro fetal bovino (SFB)
foram obtidos a partir de CULTILAB (Campinas, São Paulo, Brasil). Linhagens
celulares de fibroblastos (3T3) e melanoma (B16F10) da American Type Culture
Collection (ATCC), utilizados neste estudo, foram fornecidos pelo Laboratório de
biotecnologia de polímeros naturais, da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (Natal, RN, Brasil).
4.2. MÉTODOS
4.2.1. Extração do óleo de rã-touro
Duas amostras de óleo de rã-touro foram extraídas a partir do tecido
adiposo deste anfíbio por diferentes métodos. A primeira amostra extraída (BOH)
foi obtida através de uma adaptação do método proposto por Lopes et al. (2010)
(Lopes, T.N.C. et al., 2010), no qual o tecido adiposo foi aquecido à 80 °C sob
agitação magnética (IKA®, RH basic model KT/C, Staufen, Alemanha) por 40
30
minutos.. A segunda amostra (BOHx) foi obtida através pelo método de extração
com solvente orgânico, no qual foi adicionado hexano ao tecido adiposo de rã-
touro seguido de agitação em Ultra-turrax® T-18 sob agitação de 5,000 r.p.m
(IKA®, Staufen, Alemanha). Logo o solvente foi evaporado em evaporador
rotatório (Quimis Diadema, SP, Brazil) por 30 minutos sob temperatura de 40 °C.
Após o processo de extração, ambas as amostras foram filtradas em membrana
de 0,45 µm (Merck Millipore, Hessen, Alemanha) e acondicionadas em frascos de
vidro âmbar em temperatura ambiente.
4.2.2. Análise da composição físico-química dos óleos
Os ensaios físico-químicos das amostras de óleo de rã-touro (BOH e
BOHx) foram realizadas de acordo com a farmacopéia norte-americana (USP 35)
(Convention e Usp, 2011) e com a American Oil Chemists Society (Aocs, 1989).
O índice de saponificação (IS) foi titulado com ácido clorídrico 0,5 N,
utilizando fenolftaleína alcoólica como indicador. A análise de índice de acidez
(IA) foi realizada utilizando-se hidróxido de sódio 0,1 N como substância titulante.
Referente à determinação do índice de iodo (II), utilizou-se iodeto de potássio e
amido como substâncias indicadoras e tiossulfato de sódio 0,1 N como substância
titulante. Para a verificação do índice de peróxido (IP) utilizou-se solução saturada
de iodeto de potássio e amido como indicadores e tiossulfato de sódio 0,01 N
como titulante das amostras.
4.2.3. Caracterização química do óleo de rã-touro
A identificação dos componentes do óleo de rã-touro foi realizada através
de cromatografia gasosa acoplada a um detector seletivo de massas ITQ Tune
(Thermo Scientific, Waltham, USA). Foi utilizada uma coluna capilar de sílica
fundida (25m x 0,32 mm, 0,5 µm) revestida com uma película de polimetil fenil
siloxano (5%) (SGE Analytical Science PTY Ltd, Victoria, Australia). A
temperatura do injetor do CG-EM foi de 250 °C enquanto que a coluna foi
regulada a uma temperatura de 90 °C com uma taxa de aquecimento de 2 °C.min-
1 até 150 °C, logo a taxa de aquecimento foi aumentada para 20 °C.min-1 até 300
31
°C. A razão de separação foi de 1:25 e o sistema de ionização foi fixado em 70
eV. Utilizou-se hélio como gás de arraste a 1 mL.min-1. As amostras foram
derivatizadas por sililação utilzando-se N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide
(BSTFA) como reagente e o volume de injeção foi de 1 µL. Os componentes do
óleo de rã-touro foram identificados pela comparação entre seu espectro de
massa e os dados das bibliotecas eletrônicas (MAINLIB, WILEY 6, TOX.HP,
Acides.hp, SAMM, arp_cnrs.HP, RTLPEST3.HP e pmw.tox2).
4.2.4. Estudo do equilíbrio hidrofílico-lipofílico requerido (EHLr)
O equilíbrio hidrofílico-lipofílico requerido do óleo de rã-touro foi
determinado baseado no desenvolvimento de sistemas dispersos contendo 92%
de água destilada, 5% de óleo de rã-touro e 3% de uma mistura de tensoativos
(Tween® 20 e Span® 80) em diferentes proporções. Os sistemas do primeiro lote
foram produzidos com uma mistura de tensoativos onde o EHL variou de 4,5 até
15,5, com intervalos de 1,0, gerando treze sistemas. As amostras que
apresentaram menor variação em suas propriedades físico-químicas durante 60
dias de análise foram escolhidas para desenvolver o segundo lote, onde o
intervalo de EHL foi 0,1 e as propriedades físico-químicas avaliadas durante 60
dias. As emulsões de óleo de rã-touro foram desenvolvidas pelo método de
inversão de fases (Yu, Egito et al., 1993), onde a fase aquosa e oleosa foram
aquecidas separadamente a 70 °C. Posteriormente, a fase aquosa foi vertida
sobre a fase oleosa sob agitação constante de 11.000 r.p.m em Ultra-Turrax® T-
18 (IKA, Staufen, Alemanha) por 10 minutos. Finalmente, as amostras foram
acondicionadas em frascos e armazenadas a 25 °C para posteriores análises.
4.2.5. Construção do diagrama de fases pseudoternário
O diagrama de fases pseudoternário foi construído baseando-se no método
por titulação de água a temperatura ambiente, gerando diversos sistemas com
diferentes concentrações (Yan, Resau et al., 1994; Tai, Lee et al., 2001) de seus
componentes. Tween® 20 e Span® 80 foram misturados em uma razão de
6,29:3,71. Posteriormente, o óleo de rã-touro foi misturado com a mistura de
32
tensoativos em proporções de 1:9 até 9:1 e então titulados com água. Assim,
estas misturas geraram 90 diferentes formulações as quais foram produzidas
utilizando-se agitação em Ultra-Turrax T-18 a uma velocidade de 11.000 r.p.m por
10 minutos (Silva, Santiago et al., 2010). Os sistemas foram caracterizados
através de inspeção visual com o intuito de identificar sistemas emulsionados
opacos e leitoso (Xavier, Silva et al., 2012). Adicionalmente, amostras com
aparência transparente foram caracterizadas como microemulsões. Sistemas
leitosos com algum grau de transparência foram caracterizados como
nanoemulsão. Géis foram definidos como sistemas que apresentaram aparência
visual límpida e alta viscosidade. Separação de fases foi definida como sistemas
com gotículas macroscópicas de óleo dispersas.
4.2.6. Desenvolvimento da emulsão tópica a base de óleo de rã-
touro
A emulsão básica foi escolhida a partir do diagrama de fases e definida
como um sistema emulsionado do tipo óleo em água contendo alta concentração
de óleo e baixa concentração de tensoativos. Com o intuito de melhorar as
características organolépticas e a estabilidade do sistema contendo óleo de rã-
touro foi produzida uma emulsão de uso tópico contendo excipientes (Tabela 2), a
qual foi preparada, assim como emulsão básica, pelo método de inversão de
fases, conforme descrito no item 4.2.4.
Tabela 2: Composição da emulsão tópica
Excipientes % Função
Fase aquosa
Tween® 20 5,03 Tensoativo
Propilenoglicol 4,00 Umectante
Germall® 0,30 Conservante
Goma Xantana 1,00 Agente de estabilidade
Água destilada 62,55 Agente dispersante
Fase oleosa
Span® 80 2.97 Tensoativo
Butilhidroxitolueno 0,10 Antioxidante
Álcool cetoestearílico
etoxilado 8,00 Agente de viscosidade
33
Palmitato de
isopropila 4,00
Emoliente e permeador
cutâneo
Óleo de rã-touro 12,00 Óleo
Após
preparação Fragrância 0,05 Essência
4.2.7. Caracterização dos sistemas
Estudos de caracterização foram realizados para a emulsão tópica e para a
emulsão básica contendo óleo de rã-touro
4.2.7.1. Aspectos macroscópicos
As variações de cor e odor, assim como a presença de fenômenos de
instabilidade (cremagem ou separação de fases) foram determinadas através de
inspeção visual das amostras acondicionadas a 25 ± 2 °C.
4.2.7.2. Avaliação de pH e condutividade elétrica
O pH e a condutividade elétrica das emulsões foram avaliadas utilizando-se
um pH-metro (Tecnal, TEC-2, Piracicaba, SP, Brasil) e um condutivímetro
(Digimed, DM-32, São Paulo, SP, Brasil) pré-calibrados à 25 ± 2 °C,
respectivamente.
4.2.7.3. Análise de distribuição de tamanho de gotícula e
potencial zeta
O diâmetro hidrodinâmico e a distribuição de tamanho das emulsões foram
determinados através da dispersão dinâmica de luz (DLS) utilizando-se um
ZetaPlus (Brookhaven instruments, Hotsville, NY, USA) à 25 °C com ângulo de
leitura de 90°. As amostras foram previamente diluídas em água destilada na
proporção de 1:100. Os resultados foram expressos como a média do diâmetro
hidrodinâmico, desvio padrão da distribuição de tamanho e polidispersão (PdI). O
potencial zeta das emulsões foi avaliado com o uso de um ZetaPlus (Brokhaven
instruments, Hotsville, NY. USA). Com a finalidade de manter a força da constante
34
iônica, as amostras foram diluídas em solução salina (NaCl) a 1 mM e os
resultados correspondem à media de três determinações.
4.2.8. Estudo de estabilidade das emulsões
O estudo de estabilidade das emulsões tópica e básica contendo óleo de
rã-touro foi realizado durante 90 dias.
4.2.8.1. Técnica de microemultócrito (estabilidade a curto prazo)
A técnica do microemultócrito foi empregada para determinar a taxa de
cremagem presente nas emulsões em micro-centrífuga (Microspin, modelo SPIN
100, Equipar, Curitiba, Brasil) a 11.500 r.p.m por 10 minutos. A cremagem foi
avaliada após a centrifugação (Macedo, Fernandes et al., 2006).
4.2.8.2. Ciclos gelo/degelo
Os ciclos gelo-degelo foram realizados em tubos hermeticamente
fechados, preenchidos com as emulsões e estocados por 24 horas em freezer a -
5 °C, seguidos de mais 24 horas em estufa a 45 °C ± 2 °C (Brasil, 2005). As
mudanças visuais nas emulsões foram caracterizadas macroscopicamente
conforme descrito no item 4.2.7.1. Foram realizadas seis repetições de cada ciclo.
4.2.8.3. Resistência centrífuga
Tubos preenchidos com 10 mL de emulsões foram submetidos à
centrifugação logo após seu prepare em centrífuga a 3000 giros em temperatura
ambiente. Os sistemas foram inspecionados visualmente a fim de verificar a
presença e separação de fases.
4.2.9. Estudo de citotoxicidade
Duas linhagens representativas do tecido cutâneo, linhagem de fibroblastos
(3T3) e melanoma (B16F10), foram utilizadas para a avaliação da citotoxicidade
do óleo e da emulsão tópica. O ensaio foi realizado em 4 replicatas para cada
linhagem celular e três diferentes concentrações de óleo de rã-touro e de emulsão
tópica (1 µg/mL, 10 µg/mL and 100 µg/mL). O óleo de rã-touro foi diluído em
DMSO. Em seguida, as células foram adicionadas, juntamente com 100 µL de
35
meio de cultura DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino em placas
de 96 poços (densidade celular de 5 x 104 células/poço) e incubadas por a 37 °C
e 5% de CO2 durante um período de 24, 48 e 72 horas. Posteriormente, 100 µL
de reagente de MTT na concentração de 1 mg/mL foi adicionado em cada poço
para então determinar a viabilidade celular. Após 4 horas de incubação, os cristais
de formazan foram dissolvidos em 100 µL de etanol e sua absorbância foi medida
em um leitor de ELISA Multiskan Ascent Microplate Reader (Thermo Labsystems,
Franklin, MA) em comprimento de onda de 570 nm. A citotoxicidade foi avaliada
através do valor relativo da absorbância entre o controle, óleo de rã-touro e a
emulsão tópica.
4.2.10. Análises estatísticas
Todos os resultados foram realizados em triplicatas e expressos como
media ± desvio padrão. A significância estatística entre três ou mais grupos foi
determinada por análise de variância (ANOVA) seguida de teste de Tukey por
meio de comparação múltipla. Análises entre dois grupos foram realizadas
através do teste-t de Student com grau de significância estatística de p < 0,05.
36
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
37
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DO ÓLEO DE RÃ-
TOURO
A extração do óleo de rã-touro foi realizada seguindo dois diferentes
métodos a fim de produzir as amostras BOH e BOHx. O rendimento da extração
foi de 60,6% e 74,8% para os métodos de extração a quente e com solvente
orgânico, respectivamente. Alguns autores citam que as diferenças entre os
rendimentos na extração de óleos naturais são diretamente influenciadas pelo
método de extração e seus parâmetros (Bimakr, Rahman et al., 2011). Lopes et.
al. (2010) avaliou o rendimento na extração de óleo de rã-touro utilizando o
método e extração a quente em diferentes temperaturas e observou que o
rendimento é diretamente proporcional à temperatura de extração, de tal forma
que nossos resultados corroboram com o encontrado neste estudo.
A qualidade dos óleos extraídos foi avaliada conforme a caracterização
físico-química. Estes parâmetros são importantes, visto que a partir dos mesmos
é possível avaliar a qualidade do óleo extraído (Aocs, 1989), apesar de ainda não
existirem padrões para óleo de rã-touro. O índice de acidez foi avaliado com a
finalidade de determinar a presença de degradação hidrolítica do óleo de rã-touro,
uma vez que valores elevados de índice de acidez sugerem a presença de água
na amostra (Moretto, 1998). As amostras BOH e BOHx apresentaram o mesmo
resultado para índice de acidez (2,9 mg KOH/g de óleo) (Figura 4), demonstrando
uma boa preservação das amostras após o processo de extração. O índice de
iodo foi realizado para avaliar o grau de instauração dos ácidos graxos presentes
no óleo de rã-touro, permitindo avaliar seu grau de pureza (Knothe, 2002). Ambas
as amostras apresentaram algo grau de ácidos graxos insaturados, entretanto, a
BOH apresentou uma concentração maior de iodo, comparada a BOHx (Figura 4).
Este resultado sugere que a utilização do solvente orgânico e o aumento da
superfície de contato entre o solvente e o tecido adiposo pode promover uma
maior extração de ácidos graxos saturados, visto que este método baseia-se na
polaridade dos compostos e o equipamento utilizado promove a redução do
38
tamanho das partículas do tecido adiposo (Shirsath, Sonawane et al., 2012),
enquanto que o método de extração a quente baseia-se na temperatura de fusão
dos compostos. Isto também explica a diferença no rendimento dos óleos, uma
vez que o método escolhido afeta o desempenho do processo. O índice de
saponificação foi avaliado com a finalidade de determinar a quantidade relativa de
ácidos graxos saturados, visto que os ácidos graxos de cadeia longa possuem
baixos índices de saponificação. O BOHx demonstrou um IS superior ao BOH,
corroborando com os resultados obtidos na determinação do II. O índice de
peróxido demonstrou que o BOHx possui seu processo de degradação iniciado
antes do BOH, visto que este índice serve como parâmetro de análise para
degradação oxidativa, devido aos peróxidos serem os primeiros compostos
formados no processo de oxidação (Moretto, 1998; Choe e Min, 2006). Assim,
estes resultados sugerem que o método de extração a quente permite a obtenção
de um óleo mais puro, com uma maior quantidade de ácidos graxos insaturados e
isento de traços de solvente orgânico, e com menores índices de peróxidos,
tornando-se, portanto, o melhor método de extração para o óleo de rã-touro.
Figure 4: Parâmetros físico-químicos resultantes das análises do óleo de rã-
touro. Índice de acidez (mg de KOH/g de óleo); Índice de saponificação (mg
KOH/g de óleo); Índice de iodo (mEq de oxigênio ativo/ 1000 g de óleo).
A tabela 3 mostra a composição química dos principais compostos
identificados na amostra BOH utilizando-se de um GC-EM. Os componentes
insaturados majoritários identificados foram o ácido eicosapentaenóico (EPA)
(17,6%) e o ácido araquidônico (8,4%), enquanto que o composto saturado
39
majoritário foi o ácido oléico (29,9%). Outros estudos que buscaram identificar a
composição química do óleo de rã-touro demonstraram que os ácidos graxos
insaturados encontram-se em menores concentrações quanto aos ácidos graxos
saturados (Mendez, Sanhueza et al., 1998; Silva, Miyasaka et al., 2004; Lopes,
T.N.C. et al., 2010; Alencar, Xavier et al., 2015), dados que corroboram com os
resultados encontrados neste estudo, no qual foi encontrado uma quantidade de
26,8% de ácidos graxos insaturados e 53,6% de ácidos graxos saturados.
Embora tenhamos encontrado proporções semelhantes entre ácidos graxos
saturados e insaturados, é possível observar uma diferença nas concentrações
individuais dos mesmos, visto que em nosso estudo foi detectado 8,4% de ácido
araquidônico, enquanto que no estudo de Silva et al. (2004) e Lopes et al. (2010)
este mesmo composto foi encontrado nas concentrações de 0,74% e 0,6%
respectivamente. Foram também encontradas diferenças significativas nas
concentrações de EPA (17,6%) e ácido docosahexaenóico (DHA) (0,8) em
comparação com os estudos de Silva et. al. (2004) (0,46% e 0,91%) e Lopes et.
al. (2010) (0% e 0,1%).
Tabela 3: Caracterização química por GC-EM do óleo de rã-touro obtido pelo
processo de extração a quente (BOH)
Substância Tempo de
retenção (min)
Concentração
(%)
Ácido mirístico 10,3 1,4
Ácido araquidônico 12,0 8,4
Ácido palmítico 12,2 10,3
Ácido eicosapentaenóico (EPA) 13,7 17,6
Ácido oleico 13,7 29,9
Ácido esteárico 14 2,5
Ácido docosahexaenóico (DHA) 16,5 0,8
Colesterol 20,6 9,5
Ethyl iso-allocholate 27,7 3,5
Total 83,9
Não identificado 16,1
40
Os resultados obtidos são relevantes, considerando-se que o ácido
araquidônico atua como um agente pró-inflamatório, estimulando a síntese de
leucotrienos e prostaglandinas, promovendo a migração dos leucócitos,
possibilitando uma regeneração tecidual em casos onde haja lesões (Chavali,
Zhong et al., 1998; Lopes, Laurindo et al., 1999; Ziboh, Miller et al., 2000; O'shea,
Bassaganya-Riera et al., 2004), enquanto que o EPA e o DHA, por sua vez,
reduzem a desidratação da pele, mantendo sua integridade e elasticidade (Belda
e Pourchet-Campos, 1991). O composto ethyl iso-allocholate foi identificado nas
amostras de BOH, entretanto, nenhum outro estudo havia identificado tal
composto. Este composto é citada na literatura como um bioativo com atividade
antioxidante, antibacteriana, anticancerígena, diurética, anti-inflamatória e
antiasmática (Sarada, Jothibai Margret et al., 2011; Saravanan, Chandramohan et
al., 2014). Além disso, todos os compostos identificados no óleo de rã-touro, o
tornam próprio para utilização por via tópica, visto que há uma interação destes
compostos com a ceramidas, mantendo a pele hidratada (Mendez, Sanhueza et
al., 1998; Kelley, 2001; Silva, Miyasaka et al., 2004). Assim, baseado nesta
composição química, é possível sugerir que o óleo de rã-touro, pode apresentar
várias aplicações terapêuticas, considerando, além disso, seu baixo custo, visto
que é um produto obtido por processos biotecnológicos de reaproveitamento.
5.2. DETERMINAÇÃO DO EHLr DO ÓLEO DE RÃ-TOURO
O EHL é um importante parâmetro para o desenvolvimento de sistemas
emulsionados estáveis, já que geralmente o EHL da mistura de tensoativos, em
sistemas estáveis, é o mesmo EHL requerido pela fase oleosa (Kantaria, Rees et
al., 2003). A tabela 4 apresenta a caracterização dos diferentes sistemas
produzidos no primeiro lote (EHLr 4,5 - 15,5) após 60 dias à 25 °C. No primeiro
lote, foi possível observar que o tamanho das gotículas das emulsões com EHL
entre 12,5 e 13,5 apresentaram as menores variações e os valores obtidos nos
sistemas desenvolvidos nesta faixa de EHL não apresentaram diferença
estatística significativa. Isto foi possível em virtude do diâmetro das gotículas
obtidas (259,9 nm até 275,6 nm) além de um menor Pdi (0,190 até 0,218), em
41
comparação com os demais sistemas produzidos. Desta forma este intervalo foi
considerado o mais adequado para a produção de sistemas emulsionados
estáveis. O índice de cremagem deste intervalo de EHL também foi o menor (2,8
a 3,0%). O pH ácido foi observado em todos os sistemas e acredita-se que este
resultado possa ter sido influenciado pelo grande número de ácidos graxos de
cadeias longas presentes na composição química do óleo de rã-touro.
Tabela 4: Caracterização do primeiro lote dos sistemas emulsionados a base de
óleo de rã-touro para determinação do EHLr após 60 dias de análise a 25 °C
EHL Tamanho de
gotícula (nm) ± DP
Polidispersão Microemultócrito
(%) ± DP
pH ±
DP
Condutividade
elétrica (S/cm)
4,5 SF SF SF SF SF
5,5 SF SF SF SF SF
6,5 SF SF SF SF SF
7,5 SF SF SF SF SF
8,5 266,7 ± 14,2 0,235 4,1 ± 1,3 4,2 ± 0,6 94,4
9,5 257,7 ± 13,7 0,261 3,6 ± 1,2 3,9 ± 0,5 121,2
10,5 295,9 ± 24,8 0,268 4,3 ± 1,5 4,9 ± 1,0 107,7
11,5 SF SF SF SF SF
12,5 259,8 ± 8,7 0,218 3,0 ± 0,6 4,2 ± 0,6 100,3
13,5 275,6 ± 11,9 0,190 2,8 ± 0,7 3,8 ± 0,6 175,7
14,5 324,3 ± 26,0 0,230 3,6 ± 0,8 4,0 ± 0,4 101,4
15,5 SF SF SF SF SF
DP (desvio padrão), SF (separação de fases)
O segundo lote foi produzido através da redução da variação do EHL para
0,1 na faixa de confiança de EHL definido pelo primeiro lote. A tabela 5 apresenta
42
os resultados obtidos para a caracterização dos sistemas emulsionados para o
segundo lote (EHLr 12,0 a 14,0) após 60 dias a 25°C. Os sistemas foram
agrupados em pares e o resultado com a menor variação em cada par foi
apresentado nesta tabela. Os resultados obtidos na determinação do índice de
cremagem nas emulsões a base de óleo de rã-touro demonstraram que o maior
valor foi 3,2% (± 0.8), resultado este que pode ser justificado pelo fato destes
sistemas serem pré-formulações. Desta forma, acredita-se que após a adição de
agentes estabilizantes este índice de cremagem seja reduzido na emulsão tópica.
A avaliação do pH durante os 60 dias demonstraram uma leve acidez em todos os
sistemas, com resultados que variaram entre 5,0 (± 1,6) até 5,6 (± 1,4). O valor de
pH é um fator importante na estabilidade de emulsões, particularmente quando os
tensoativos são obtidos através de um processo de saponificação, uma vez que
os compostos ácidos podem promover a desestabilização do sistema
emulsionante, promovendo a separação das fases (Barel, Paye et al., 2014). A
acidez dos sistemas emulsionados desenvolvidos é um resultado positivo, visto
que o pH ácido podem acelerar o processo de cicatrização da pele além da
compatibilidade com o pH cutâneo (Menoita, Santos et al., 2011). Neste estudo,
foi verificado um decréscimo do pH ao longo do tempo das análises, sugerindo
que possa ter havido contaminação microbiológica dos sistemas ou mesmo
oxidação dos ácidos graxos de cadeia carbônica longa presente no óleo de rã-
touro, gerando hidroperóxidos (Mendez, Sanhueza et al., 1998; Driscoll,
Giampietro et al., 2001; Masmoudi, Le Dreu et al., 2005). Referente à
condutividade elétrica, a mesma apresentou-se elevada em todos os sistemas
desenvolvidos, demonstrando que o óleo de rã-touro encontrava-se disperso em
uma emulsão do tipo óleo em água (Latreille e Paquin, 1990).
43
Tabela 5: Caracterização do segundo lote dos sistemas emulsionados a base de
óleo de rã-touro para determinação do EHLr após 60 dias de análise a 25 °C
EHL Tamanho de
gotícula (nm) ± DP
Polidispersão Microemultócrito
(%) ± DP
pH ±
DP
Condutividade
elétrica (S/cm)
12,1 212,0 ± 13,6 0,213 2,4 ± 0,5 5,2 ± 1,4 91,2
12,2 202,7 ± 21,6 0,22 2,4 ± 0,5 5,1 ± 1,5 100,8
12,5 202,9 ± 29,8 0,215 2,2 ± 0,7 5,4 ± 1,2 87,3
12,7 199,6 ± 16,6 0,232 2,7 ± 0,4 5,1 ± 1,5 108,7
12,9 209,3 ± 18,4 0,234 2,1 ± 0,3 5,3 ± 1,4 97,4
13,0 196,4 ± 17,3 0,215 2,0 ± 0,0 5,2 ± 1,4 90,5
13,3 201,9 ± 15,0 0,215 2,5 ± 0,5 5,0 ± 1,5 100,1
13,5 208,1 ± 19,9 0,245 2,4 ± 0,5 5,1 ± 1,4 120,5
13,7 194,4 ± 11,7 0,225 2,4 ± 0,5 5,0 ± 1,5 72,5
13,9 193,7 ± 18,5 0,248 2,5 ± 0,5 5,0 ± 1,5 112,0
14,0 188,4 ± 22,2 0,261 2,7 ± 0,5 5,0 ± 1,5 120,4
DP (desvio padrão)
Os sistemas do segundo lote apresentaram tamanho de gotícula entre 190
e 220 nm, sendo a variação dos sistemas nesta análise o principal parâmetro
utilizado definir o melhor sistema, visto que quando os sistemas emulsionados
apresentam-se com gotículas de tamanho reduzido a desestabilização dos
sistemas é controlada pela maturação de Ostwald (Mondal, Samanta et al., 2008;
Anton e Vandamme, 2011), não sendo possível verificar por inspeção visual
qualquer outro fenômeno de instabilidades. Após os 60 dias de análise, não foram
observadas diferenças estatísticas significativas entre o tamanho de gotícula de
todas as emulsões produzidas na faixa de EHL entre 12 e 13,5. Desta forma, é
possível dizer que emulsões a base de óleo de rã-touro produzidas nesta faixa de
EHL, neste período de tempo avaliado, são estáveis. No entanto, o sistema que
44
apresentou a menor variação no tamanho de gotícula e menor PDI neste período
foi o sistema produzido com EHL 12,1. Assim, tendo o EHL requerido pelo óleo de
rã-touro definido como 12,1, foi construído um diagrama de fases, tendo este EHL
como variante fixa.
5.3. CONSTRUÇÃO DO DIAGRAMA DE FASES PSEUDOTERNÁRIO
O diagrama de fases pseudoternário foi construído baseado na emulsão
mais estável escolhida no estudo de EHL requerido para o óleo de rã-touro
(Figura 5). O diagrama de fases pseudoternário é uma ferramenta útil no
desenvolvimento de sistemas dispersos, uma vez que permite a obtenção das
concentrações ótimas dos componentes de uma emulsão para produção de um
sistema ideal (Formariz, Chiavacci et al., 2007; Moghimipour, Salimi et al., 2012;
Prajapati, Dalrymple et al., 2012; Espinosa e Scanlon, 2013; Nanjwade, Katare et
al., 2013; Patel, Barot et al., 2013).
Figura 5: Diagrama de fases pseudoternário do oleo de rã-touro produzido
com EHLr 12,1. Preto (separação de fases), cinza escuro (microemulsão), cinza
médio (gel), cinza claro (nanoemulsão), branco (emulsão)
45
Sistemas emulsionados foram obtidos predominantemente (62%), os quais
apresentaram concentrações de água que variaram entre 20% a 80% e
concentrações de óleo de rã-touro até 60%. Estes resultados corroboram com
estudos como os de Prajapati et al. (2012), o qual demonstrou a formação de uma
emulsão com concentrações de óleo entre 30% e 50% (Prajapati, Dalrymple et al.,
2012) e também o estudo de Espinosa et al (2013), que por sua vez obteve
sistemas emulsionados com concentrações de lipídios entre 5% e 70% (Espinosa
e Scanlon, 2013). Também foram observados em nosso estudo a presença de
sistemas opacos com um leve grau de transparência (nanoemulsões, 6%),
sistemas límpidos e com alta viscosidade (géis, 2%) e sistemas transparentes
com elevadas concentrações de tensoativos (microemulsões, 4%). Sistemas
semelhantes têm sido desenvolvidos e caracterizados em outros estudos que
também utilizaram o diagrama de fases pseudoternário como ferramenta para
determinar as melhores concentrações dos componentes de sistemas
emulsionados (Moghimipour, Salimi et al., 2012; Nanjwade, Katare et al., 2013;
Patel, Barot et al., 2013). Portanto, com base nos resultados obtidos e devido ao
objetivo do estudo ser o desenvolvimento de uma emulsão tópica com caráter
externo aquoso, foi escolhido uma emulsão contendo 12% de óleo de rã-touro,
8% da mistura de tensoativos (Tween® 20:Span® 80, 6.29:3.71) e 80% de água.
5.4. DESENVOLVIMENTO DA EMULSÃO TÓPICA DE ÓLEO DE RÃ-TOURO
Uma emulsão tópica foi desenvolvida a partir da emulsão básica
selecionada no diagrama de fases pseudoternário. Esta emulsão foi desenvolvida
com a adição de excipientes com o intuito de melhorar as características
organolépticas do óleo de rã-touro, mantendo fixas as concentrações de óleo de
rã-touro e a mistura de tensoativos, definidas na emulsão básica. As emulsões
tópica e básica foram caracterizadas e suas estabilidades avaliadas a fim de
compará-las e então determinar se a adição dos excipientes aumenta sua
estabilidade.
Dentre os aspectos macroscópicos dos sistemas produzidos foi possível
observar a coloração branca, ausência de odor característico do óleo de rã-touro
46
e sistema fluído (emulsão básica) e viscoso (emulsão tópica). Estas
características não sofreram alterações ao longo do estudo. No entanto, foi
observada que a emulsão tópica apresentou um índice de cremagem máximo de
2,4%, semelhante ao resultado obtido no estudo de EHLr (2,5%). Este mesmo
índice não pôde ser observado na emulsão tópica, uma vez que a alta
viscosidade reduz a motilidade das gotículas dispersas no sistema, melhorando
sua estabilidade (Allen, Popovich et al., 2011). O índice de cremagem é um
parâmetro importante para avaliar a estabilidade dos sistemas emulsionados,
visto que este fenômeno precede a coalescência e a separação de fases. Assim,
o conhecimento prévio sobre este índice, permite a reversão ou até mesmo a
prevenção da separação de fases do sistema através da adição de excipientes
que atuam como agentes de estabilidade (Lieberman, 1988).
A figura 6 apresenta os resultados obtidos nos ensaios de tamanho de
gotícula e pH das emulsões tópica e básica, analisadas por 90 dias. Foi
observado um aumento significativo do tamanho das gotículas na emulsão tópica
quando comparada com a emulsão básica. Este resultado pode ser explicado
pela adição de excipientes na fase interna da emulsão tópica. Ambas as amostras
não apresentaram variação significativa em seu tamanho durante os 90 dias
analisados, fato já esperado, uma vez que as instabilidades são influenciadas
principalmente pelo EHL requerido pelo óleo, o qual já havia sido previamente
estudado e definido. Assim, nossos resultados mostram-se em concordância com
a teoria descrita por Griffin, o qual diz que mantendo-se o EHLr é possível
desenvolver sistemas com a mesma estabilidade, provando que o EHL do óleo de
rã-touro é realmente 12,1 (Griffin, 1949).
Figura 6: Tamanho de gotícula e pH da emulsão básica e da emulsão tópica
durante 90 dias de análise. A: tamanho de gotícula; B: análise de pH.
47
O potencial zeta da emulsão básica (-32.79 mV ± 2.90) e da emulsão
tópica (-25.02 mV ± 4.33) sugerem que estes sistemas são estáveis. Os valores
de potencial zeta superiores a 25 mV (valores absolutos) indicam que as forças
de repulsão são maiores que as forças de atração, mantendo, desta forma, as
gotículas dispersas (Netz e Ortega, 2002; Roland, Piel et al., 2003). A análise de
pH demonstrou que a emulsão tópica não apresenta variação significativa ao
longo dos 90 dias estudados, entretanto a emulsão básica se manteve estável
apenas até o 15° dia. A ausência de conservantes e de agentes antioxidantes
podem ter influenciado nestes resultados, uma vez que a degradação
microbiológica e/ou química podem promover a alteração de cor, odor e pH da
formulação (Aulton e Taylor, 2013).
A estabilidade das emulsões foi realizada e avaliada quanto suas
características organolépticas, resistência centrífuga e ciclos gelo/degelo. Ambas
as amostras mantiveram suas características organolépticas e apresentaram-se
resistentes ao ensaio de resistência centrífuga, demonstrando, desta forma, a
estabilidade física dos sistemas (Xavier, Silva et al., 2012). No estudo de ciclos
gelo/degelo, foi observada a separação de fases na emulsão básica a partir do
segundo ciclo, enquanto que a emulsão tópica permaneceu estável durante todos
os 6 ciclos realizados, indicando que a adição dos excipientes é responsável pela
melhora da estabilidade do sistema em elevadas variações de temperatura
(Cooper, 1981).
5.5. ENSAIO DE CITOTOXICIDADE
A viabilidade celular das linhagens 3T3 e B16F10, tratadas com óleo de rã-
touro e com a emulsão tópica em três diferentes concentrações foi avaliada
através do ensaio de MTT durante o período de 24, 48 e 72 horas.
O crescimento de células 3T3 não apresentou nenhuma diferença
estatística quando tratados com as amostras de emulsão tópica e óleo de rã-touro
quando comparados com o controle negativo (p < 0,05). Estes resultados foram
observados em todas as amostras ao longo das 72 horas avaliadas (Figura 7A).
48
Desta forma, é possível sugerir que nenhuma das amostras possui atividade
citotóxica nestas concentrações frente a linhagem de células 3T3, o que indica
que o óleo de rã-touro pode ser adequado para desenvolvimento de sistemas
terapêuticos. Este é um resultado importante, uma vez que o conhecimento sobre
a segurança de produtos naturais é essencial em indústrias alimentícias e
farmacêuticas (Paiva, Rao et al., 1998; Paiva, Gurgel et al., 2004; Alencar, Xavier
et al., 2015).
Os resultados obtidos na linhagem de melanoma (B16F10) demonstraram
que as concentrações inferiores da emulsão tópica e do óleo de rã-touro (0,1
µg/mL e 10 µg/mL) não interferem na viabilidade celular. No entanto, as
concentrações elevadas (100 µg/mL), promoveram a redução da viabilidade
destas células ao longo do tempo, não havendo diferença significativa desta
inibição entre o óleo in natura e a emulsão tópica após as 48 horas de análise. A
emulsão tópica e o óleo de rã-touro demonstraram que apresentam citotoxicidade
dependentes da concentração e do tempo de incubação para a linhagem de
melanoma e acredita-se que esta atividade pode estar relacionada com a
presença do composto ethyl iso-allocholate, já que algumas bibliografias citam
que o mesmo possui atividades antiasmática e antitumoral (Saravanan,
Chandramohan et al., 2014), identificado na caracterização química deste óleo.
49
Figura 7: Viabilidade celular da emulsão tópica e do óleo de rã-touro em
três concentrações destas amostras. A: viabilidade celular da linhagem 3T3; B:
viabilidade celular da linhagem B16F10.
Baseado nestes resultados é possível sugerir que o óleo de rã-touro é um
composto natural seguro e sua utilização sob a forma in natura ou adicionados em
um sistema emulsionado para uso tópico é adequado, uma vez que o óleo não
apresenta citotoxicidade. No entanto, quando incorporados em um sistema
emulsionado, há uma melhora nas características organolépticas do óleo de rã-
touro. Além disso, o óleo e a emulsão tópica mostraram atividade inibitória do
crescimento de células B16F10, sugerindo que este sistema poderia ser um
agente com potencial antitumoral.
50
6. CONCLUSÕES
51
6. CONCLUSÕES
Os resultados demonstram que:
O óleo de rã-touro obtido pela extração a quente a partir do tecido
adiposo da Rana catesbeiana Shaw apresentou uma rica
composição de ácidos graxos insaturados (ácido eicosapentaenóico
(17,6%) e ácido araquidônico (8,4%)).
O EHL capaz de produzir emulsões estáveis do tipo O/A contendo
óleo de rã-touro variou entre 12 e 13,5.
O diagrama de fases foi capaz de produzir sistemas dispersos, dos
quais 62% corresponderam a emulsões.
A emulsão básica deste desenvolvida neste estudo foi composta por
2.97% de Span® 80, 5.03% de Tween® 20, 12% de óleo de rã-touro
e 80% de água (v/v).
A emulsão tópica foi produzida na presença de excipientes e
apresentou-se mais estável em comparação com a emulsão básica,
preservando as características iniciais, obtidas no momento da
produção.
A emulsão tópica de óleo de rã-touro e o óleo in natura não
apresentaram citotoxicidade frente a linhagem de fibroblastos
normais, entretanto, promoveram a redução da viabilidade celular da
linhagem de melanoma.
Assim, é possível concluir que o óleo de rã-touro é um óleo apropriado
para o desenvolvimento de sistemas terapêuticos devido sua rica composição de
compostos bioativos que lhe confere potente atividade terapêutica. Possibilitando
o avanço dos estudos que visam não só comprovar sua atividade antitumoral,
mas também o desenvolvimento de novos sistemas que contribuam para o
avanço das pesquisas no combate ao câncer no mundo todo.
52
7. PERSPECTIVAS
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7. PERSPECTIVAS
Avaliar, através de citometria de fluxo em qual fase de crescimento
celular o óleo e a emulsão tópica possuem atividade;
Realizar a marcação das amostras com substância fluorescente
para verificar se a atividade ocorre em nível superficial de
membrana ou se ocorre no interior da célula;
Avaliar atividade antitumoral;
Avaliar a cinética de liberação do óleo de rã-touro;
Testar os sistemas in vivo.
54
8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
55
8. PRODUÇÃO CIENTÍFICA
Os trabalhos abaixo são produções relacionados aos resultados
apresentados neste documento.
Trabalhos apresentados em congressos
VERISSIMO, L. M. ; MACHADO, L.A. ; RUTCKEVISKI, R. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; DANTAS, T. R. F. ; OLIVEIRA, C. M. ; SILVA JUNIOR, A. A. ; EGITO, E.S.T. . Development of biotechnological emulsion based on bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil: A preliminary study. 2014.
MACHADO, L.A. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; SANTOS, N. D. Uso de ativos naturais no tratamento da asma: revisão da literatura. In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP, 2012.
SANTOS, N. D. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; MACHADO, L.A. Estudo das propriedades terapêuticas da rã-touro (Rana catesbeiana Shaw). In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP, 2012.
Resumos publicados em anais de congressos
XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; MACHADO, L.A. ; RUTCKEVISKI, R. ; DANTAS-SANTOS, N. ; EGITO, E.S.T. ; VAUTHIER, C. . Emulsions based on natural oils as antimicrobial agents. In: XIIIèmes Journées de I'École Doctorale - Innovaton Thérapeutique, 2013, Kremlin-Bicêtre. XIIIèmes Journées de I'École Doctorale - Innovaton Thérapeutique, 2103.
MORAIS, A. R. V. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MACHADO, L.A. ; DANTAS, T. R. F. ; OLIVEIRA, C. M. ; DANTAS-SANTOS, N. ; VERISSIMO, L. M. ; EGITO, E.S.T. . Analyses of the glass transition temperature of microemulsion containing glucose and lactose by differential scanning calorimetry. In: 3rd Conference on Innovation in Drug Delivery: Advances in local drug delivery, 2013, Pisa. 3rd Conference on Innovation in Drug Delivery: Advances in local drug delivery, 2013.
MACHADO, L.A. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; DANTAS-SANTOS, N. . Uso de ativos naturais no tratamento da asma: revisão da literatura. In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP,
56
2012, Natal. Uso de ativos naturais no tratamento da asma: revisão da literatura, 2012. DANTAS-SANTOS, N. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MORAIS, A. R. V. ; MACHADO, L.A. . Estudo das propriedades terapêuticas da rã-touro (Rana catesbeiana Shaw). In: XIV Congresso Científico e XIII Mostra de Extensão da UnP, 2012, Natal. Estudo das propriedades terapêuticas da rã-touro (Rana catesbeiana Shaw), 2012.
Resumos expandidos publicados em anais de congressos
SILVA-FILHO, M.A. ; RUTCKEVISKI, R. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; MORAIS, A. R. V. ; ALENCAR, E. N. ; MACHADO, L.A. ; OLIVEIRA, C. M. ; DANTAS, T. R. F. ; DANTAS-SANTOS, N. ; EGITO, E.S.T. . Quality control of bullfrog (Rana catesbeiana Shaw) oil: a contribution for the extraction and chemical identification. In: XXI International Conference on Bioencapsulation, 2013, Berlin. XXI International Conference on Bioencapsulation, 2013.
MORAIS, A. R. V. ; XAVIER JUNIOR, F. H. ; ALENCAR, E. N. ; MACHADO, L.A. ; OLIVEIRA, C. M. ; DANTAS, T. R. F. ; DANTAS-SANTOS, N. ; EGITO, E.S.T. . Optimization of lyophilization process of microemulsion containing lactose and glucose by experiment design. In: 3o Encontro Brasileiro de Inovação Terapêutica, 2013, Jaboatão dos Guararapes. 3o Encontro Brasileiro de Inovação Terapêutica, 2013.
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9. REFERÊNCIAS
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9. REFERÊNCIAS
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