UNIVERSIDADE POTIGUAR PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

CURSO DE MESTRADO EM ODONTOLOGIA

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DOS EXTRATOS BRUTOS ETANÓLICOS DE: CUCURBITA PEPO, REMIREA

MARITIMA, CAYAPONIA TAYUYA, EUCALIPTUS CITRIODORA, CUMINUM CYMINUM E ÓLEO RESINA DE COPAÍBA SOBRE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA.

RAFAEL SOBREIRA VALVERDE

NATAL 2007

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RAFAEL SOBREIRA VALVERDE

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DOS EXTRATOS BRUTOS ETANÓLICOS DE: CUCURBITA PEPO, REMIREA MARITIMA, CAYAPONIA TAYUYA, EUCALIPTUS CITRIODORA, CUMINUM CYMINUM E ÓLEO RESINA DE COPAÍBA SOBRE LEVEDURAS DO GÊNERO CANDIDA.

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado em Odontologia, da Universidade Potiguar, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Odontologia, com Área de concentração em Clínica Odontológica. Orientadora: Profª. Drª. Patrícia Teixeira de Oliveira

NATAL

2007

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Ficha Catalográfica

Valverde, Rafael Sobreira Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos etanólicos de: Cucurbita pepo, Remirea maritima, Cayaponia tayuya, Eucaliptus citriodora, Cuminum cyminum, e Óleo Resina de Copaíba sobre leveduras do gênero Candida. / Valverde, Rafael Sobreira Valverde – Natal, RN: 130 páginas, 2007.

Orientadora: Profª. Drª. Patrícia Teixeira de Oliveira

Dissertação(Mestrado em Odontologia) - Universidade Potiguar – Faculdade de Odontologia

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UNIVERSIDADE POTIGUAR

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

MESTRADO EM ODONTOLOGIA

Avaliação da atividade antifúngica dos extratos brutos etanólicos de: Cucurbita pepo, Remirea maritima, Cayaponia tayuya, Eucaliptus citriodora, Cuminum cyminum e Óleo Resina de Copaíba sobre leveduras do gênero Candida. Dissertação apresentada pelo aluno RAFAEL SOBREIRA VALVERDE à Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação da Universidade Potiguar, em 23/07/2007 a qual obteve a nota abaixo, conforme avaliação da banca examinadora constituída pelos professores:

Banca Examinadora:

Profª. Drª. Patrícia Teixeira de Oliveira (Orientadora)

____________________________________________________________ Profª. Drª. Cícero Romão Gadê Neto (Co-orientador)

____________________________________________________________

Profª Drª Maria das Dores Melo (Professora convidada)

Avaliação final: ____________

NATAL 2007

5

Dedicatória

6

Ao Criador, meu Deus dedico... entre tudo: minha existência.

Dedico, outrora dito e hoje escrito, a ...

... você meu amor Fabiana, que tão generosamente com um dom abençoado

por Deus, mostrou-me com seus atos sua grandiosidade e amor de mãe, sua dedicação

e amor de esposa, sua integridade e amor de companheira, sua presteza, incentivo e

amor de colega profissional, sua confiança e amor de amiga... enfim, sua fortaleza, sua

beleza, que excede limites físicos, e que fizeram parte de minha vida nestes últimos

dois anos de forma mais viva e mais presente do que nunca antes sentido, que bom ter

você ao meu lado, te amo.

... vocês meus amados filhos, Rafael Filho e Fara Janine, que mesmo sem

entenderem, suportaram minha ausência, amparados no amor maternal que ao mesmo

tempo se transformava, nos períodos de ausência, em amor fraternal, vocês são fruto

do mais precioso sentimento dos homens, o amor, materializado em vida por Deus,

amo vocês.

... minha mãe Jalda e meu pai Francisco, pelo amor incondicional expresso em

incentivo, preocupação, e todo apoio nestes últimos anos, principalmente durante este

mestrado, pelo exemplo de integridade, dedicação, e família, pois hoje também como

pai, sei o que é participar da realização de um filho, amo vocês.

... meus irmãos Ricardo e Jalfran, pela torcida e apoio, amo vocês.

7

Agradecimentos

8

A minha orientadora Profª Drª Patrícia Teixeira de Oliveira, pela confiança e

apoio sempre depositados, bem como pela presença amiga, e acima de tudo por

desempenhar com precisão o papel de orientadora, sempre agradecido.

Ao Profº Drº Cícero Romão Gadê Neto, como co-orientador, pelo exemplo de

profissionalismo e retidão pessoal, sempre notável, muito obrigado.

Aos que fazem parte da Direção da Universidade Potiguar: Chanceler Profº

Paulo de Vasconcelos de Paula, ao Reitor Profº Manoel Pereira dos Santos, ao

Vice-Reitor Profº Mizael Araújo Barreto, à Pró-Reitora de Pesquisa e Pós-graduação

Profª Lecy de Maria Araújo Gadelha Fernandes bem como ao Diretor do Curso de

Graduação em Odontologia Profº Tasso Gadelha Fernandes, meus agradecimentos.

À coordenadora do programa de mestrado da UnP, Profª. Drª. Rejane Andrade

de Carvalho, bem como toda equipe de professores Profº Dr. Alex, Profº Dr.

Alexandre, Profº Dr. Carlos, Profº Dr. Cícero, Profª Drª. Cláudia, Profª Drª. Edja,

Profº Dr. Flávio Seabra, Profª Drª. Goretti, Profª Drª Lecy, Profª Drª. Patrícia e Profª

Drª Samira, pelo empenho e dedicação envolvidos neste programa, serei sempre grato.

Ao Profº Dr. Alex,meus agradecimentos pelo apoio na elaboração da estatística,

e acima de tudo, pelo empenho e dedicação no exercício da docência, servindo como

exemplo para todos, bem como ao Profº Dr. Flávio Seabra pela colaboração na

estatística.

Agradeço também ao Profº Dr. Carlos Frederico, pelo auxílio na tradução.

Aos funcionários da UnP, Gracinha, Vanízia, Bruno, Raíssa, Bete, Neto, a

equipe dos laboratórios de farmácia, bioquímica e microbiologia, e da esterilização, do

apoio da clínica, bem como a todos aqueles que dentro destes dois anos nos ajudaram,

muito abrigado a todos.

Á Profª Drª Josélia pelo apoio e confiança ao abrir as portas do laboratório para

que pudéssemos obter os extratos de plantas necessários em nossa pesquisa, bem

9

com à Prof ª Drª Maria das Dores Melo (Dorinha), no auxílio na catalogação e

classificação das amostras vegetais, meu eterno obrigado a vocês.

A Profª Drª Edeltrudes (UFPB), por ter contribuído com o material biológico

utilizado nesta pesquisa, bem como a sua orientada Giliara pela força e colaboração

dispensada, sou-lhes muito grato.

Ao Profº Drº Antônio Euzébio da Universidade Federal de Alagoas (UFAL), no

departamento de pós-graduação em química e biomateriais, por gentilmente ceder o

laboratório para obtenção dos extratos, e ao funcionário do departamento de química o

Sr. Aldi, por ter me acompanhado por longos dias e noites neste processo de

evaporação dos extratos, meus agradecimentos.

Ao Profº Drº Kênio, professor da Universidade Federal do Rio Grande do Norte,

pela colaboração.

Ao Profº Drº Mauro Guilherme, Coordenador do Centro de Ciências da Saúde

da Faculdade CESMAC- Maceió-Al, pelo sempre pronto apoio e disposição em

colaborar, muito obrigado.

Aos meus colegas do mestrado Ana Luíza, Rachel, Rômulo, Vilmar, Roseane,

Evamires, Lílian, Luciana, Lucy, Daniela, Patrícia, João, Lacet, Vânio e Eliziane,

por terem proporcionado momentos de aprendizado os quais levarei sempre comigo,

eternamente grato.

10

Agradecimentos especiais

11

Existem na vida situações que pedem dedicação, decisão, posição, participação,

e outras pedem apenas que se faça parte, que sintamos e vivamos emoções.

Compartilhar emoções com pessoas que amamos, faz com que nossa dedicação seja

insuperável, nossas decisões acertadas, nossas posições verdadeiras e nossa

participação seja sempre fundamental e necessária.

Agradeço aqui de forma especial a pessoas que fazem parte de nossa vida, e

que mesmo por algum motivo estejam longe, vão estar sempre presentes em nossos

corações...

Agradeço a Fabiana, minha esposa, meus filhos Rafinha e Fara, por serem fonte

de inspiração, dedicação e participação em minha vida.

Aos meus pais Jalda e Francisco, meus irmãos Ricardo e Jal por fazerem parte

da minha vida.

Aos meus sobrinhos Caio, Carol, Hermínia, Fábia, Pedro, João e Gabriel, as

minhas cunhadas Dani, Katiana e Rosimar.

As amigas do mestrado Ana Luíza, Raquel e Vilmar, pela oportunidade de

partilhar momentos e exemplos que estarão eternamente comigo.

Aos meus companheiros de viagem, Rômulo que foi um irmão o qual escolhi, e

Aninha nossa amiga em comum para todas as horas, e quantas horas...

“Agradeço a todos vocês pela participação na concretização deste sonho, hoje

realidade, vivida, glorificada e festejada por todos, minha eterna gratidão.”

12

Resumo

13

RESUMO

A candidíase oral é a infecção fúngica mais comum na boca. É causada por um grupo de fungos do gênero Candida, um microrganismo que faz parte da microbiota oral. O objetivo desta pesquisa foi avaliar a ação de extratos brutos etanólicos da Cucurbita pepo (polpa e semente), Remiera maritima, Cayaponia tayuya, Eucalyptus citrioidora, Cuminum cyminum e Óleo Resina de Copaífera sobre 06 cepas de Candida. A nistatina 100.000 UI/ml suspensão oral foi utilizada como controle. Foram realizados teste de difusão em meio sólido de Agar sabouraud dextrose 2% onde avaliou-se os halos de inibição apresentado pelas substâncias testadas nos tempos de 24 e 48 horas. Os dados coletados foram submetidos à análise estatística através dos testes ANOVA a Dois critérios, ANOVA a Um critério, Bonferroni, Tuckey e t Pareado. Dentre as substâncias avaliadas apenas o Eucalyptus citrioidora e a nistatina apresentaram ação contra as cepas de Candida. Os resultados mostraram que houve diferença estatisticamente significante entre a ação destas duas substâncias, com os maiores diâmetros de halo exibidos pela substância controle. Foi observada, também, uma diferença significante na comparação da ação destas substâncias nos dois tempos avaliados, com resultados mais efetivo para a leitura de 24 horas. Conclui-se que apesar da resposta efetiva do Eucalyptus citrioidora sobre as cepas de Candida testadas, outros estudos se fazem necessários para que se possa entender a ação desta substância sobre os fungos utilizados e a partir daí desenvolver novas formas terapêuticas para a candidíase oral. Palavras chaves: extratos brutos etanólicos, atividade antifúngica, candidíase, leveduras.

14

Abstract

15

ABSTRACT

The most common fungal infection in the oral cavity is the Candidose. It is caused by a group of Candida fungi, which is part of a group that belongs to the normal oral microflora. The aim of this study was to evaluate the action of the Copaífera resin oil and the crude ethanolic extracts of Cucurbita pepo, Remirea marine, Cayaponia tayuya, Eucaliptus citriodora and Cuminum cyminum, on 6 stumps of Candida. The nistatine 100.000 UI/ml oral suspended was used as a positive control. Diffusion technique in solid of Agar sabouraud dextrose 2% and medium technique were used in order to evaluate the inhibition haloes presented by the substances tested in period between 24 and 48 hours. The responses were submitted to statistic tests such as ANOVA two Ways, ANOVA one Way, Bonferroni, Tuckey and the t test. Among the substances evaluated only Eucalyptus citrioidora and nistanine were able to inhibit the growth of stumps of Candida. The results show that there were meaningful statistic differences between both and the positive control was responsible for the biggest halo diameter. It was also observed a meaningful difference comparing the action of both substances related to the evaluation time, which 24 – hour – period showed more effective result. Although Eucalyptus citrioidora has showed an effective response on evaluated stumps of Candida, we conclude that it must have other studies in order to understand the action of those substances on the tested fungi and further, to develop new therapeutic ways to treat oral candidose. Key words: crude ethanolic, antifungal activity, candidoses, yeasts.

16

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Cucurbita pepo ..................................................................................... 63 Figura 02 Cucurbita pepo polpa após processo de trituração .............................. 63 Figura 03 Cucurbita pepo polpa com o solvente .................................................. 63

Figura 04 Cucurbita pepo polpa durante a filtração ............................................. 64

Figura 05 Cucurbita pepo polpa após a filtração .................................................. 64

Figura 06 Cucurbita pepo polpa no rotaevaporador ............................................. 64

Figura 07 Cucurbita pepo polpa após evaporação ............................................... 64

Figura 08 Cucurbita pepo semente ..................................................................... 65

Figura 09 Cucurbita pepo semente triturada ....................................................... 65

Figura 10 Cucurbita pepo semente no percolador .............................................. 65

Figura 11 Cucurbita pepo semente após filtragem .............................................. 65

Figura12 Cucurbita pepo semente após evaporada ........................................... 65

Figura 13 Cayaponia tayuya.................................................................................. 66

Figura 14 Cayaponia tayuya após triturada .......................................................... 66

Figura 15 Cayaponia tayuya após filtrada ............................................................ 66

Figura 16 Cayaponia tayuya evaporada ............................................................... 66

Figura 17 Remirea marítima ................................................................................. 67

Figura 18 Remirea marítima: triturada .................................................................. 67

Figura 19 Remirea marítima: filtrada..................................................................... 67

17

Figura 20 Remirea marítima evaporada ............................................................... 67

Figura 21 Eucalipto citriodora árvore .................................................................... 68

Figura 22 Eucalipto citriodora no solvente ........................................................... 68

Figura 23 Eucalipto citriodora evaporado e filtrado .............................................. 68

Figura 24 Cuminum cyminum ............................................................................... 69

Figura 25 Cuminum cyminum evaporado ............................................................. 69

Figura 26 Óleo Resina de copaíba ....................................................................... 69

Figura 27 Cepas utilizadas no experimento ......................................................... 70

Figura 28 Discos de papel ................................................................................... 71

Figura 29 Numeração dos octantes e espaços centrais na placa de petri ........... 72

Figura 30 Marcação dos grupos e faces superior e inferior nas placas ............... 73

Figura 31 Diagrama para posicionamento dos discos .......................................... 73

Figura 32 Agar sabouraud fundido nos tubos de ensaio ...................................... 74

Figura 33 Agar sabouraud colocado nas placas de petri ..................................... 74

Figura 34 Placas com agar na estufa por 24 horas .............................................. 74

Figura 35 Preparo do repique microbiológico ....................................................... 75

Figura 36 Coleta de cepas do tubo de ensaio para formação do repique ............ 75

Figura 37 Semeadura do repique no tubo de ensaio ........................................... 75

Figura 38 Repique na estufa bacteriológica por 24 horas .................................... 75

Figura 39 Captura do repique com alça flambada e resfriada .............................. 76

18

Figura 40 Preparo do inóculo ............................................................................... 76

Figura 41 Escala 0,5 de McFarland ...................................................................... 76

Figura 42 Captura do inóculo com swab esteril .................................................... 76

Figura 43 Semeadura do inóculo na placa de petri .............................................. 76

Figura 44 Semeadura do inóculo na placa de petri .............................................. 76

Figura 45 Laminas de vidro para pesagem dos extratos ...................................... 78

Figura 46 Pesagem dos extratos ...................................................................... 78

Figura 47 Extratos pesados ................................................................................ 78

Figura 48 Balança analítica .................................................................................. 78

Figura 49 Sequência de pesagem das gotas nas placas de vidro ....................... 78

Figura 50 Discos de papel apreendidos sendo impregnados com os extratos .... 79

Figura 51 Inpregnação dos discos nos extratos ................................................... 79

Figura 52 Deposição dos discos de papel impregnados na placa ....................... 80

Figura 53 Posição dos discos nas placas ............................................................ 80

Figura 54 Placas incubadas em estufa bacteriológica por 24 e 48 horas ............ 80

Figura 55 Apresentação dos halos de inibição nas placas ............................. 80

Figura 56 Apresentação dos halos de inibição nas placas ............................. 80

Figura 57 Apresentação dos halos de inibição nas placas ............................. 80

Figura 58 Apresentação dos halos de inibição nas placas ............................. 81

Figura 59 Aferição do maior diâmetro do halo de inibição ............................. 81

19

Figura 60 Aferição do menor diâmetro do halo de inibição ............................ 81

Figura 61 Aferição do menor diâmetro do halo de inibição ........................... 81

Figura 62 Aferição do maior diâmetro do halo de inibição ............................. 81

20

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Ordem numérica das substâncias em teste.......................................... 60

Tabela 2 Relação da ordem alfabética das cepas de Candida............................ 71

Tabela 3 Media dos halos de inibição na leitura de 24 h...................................... 83

Tabela 4 Media dos halos de inibição na leitura de 48 h...................................... 84

Tabela 5 Quadro da Análise de Variância para 24 horas..................................... 85

Tabela 6 Quadro da Análise de Variância para 48 horas..................................... 85

Tabela 7 Média dos halos de inibição em mm no intervalo de 24 horas, e respectivas diferenças estatísticas em função das substâncias em teste........................................................................................................

85

Tabela 8 Média dos halos de inibição em mm no intervalo de 48 horas, e respectivas diferenças estatísticas em função das substâncias em teste............................................................................................................................

86

Tabela 9 Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para o extrato bruto do Eucalyptus citriodora em 24 horas...........................................

87

Tabela 10 Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para o extrato bruto do Eucalyptus citriodora em 48 horas...........................................

87

Tabela 11 Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para a Nistatina em 24 horas...........................................................................................

87

Tabela 12 Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para a Nistatina em 48 horas...........................................................................................

87

21

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1 Média dos diâmetros dos halos de inibição do Eucaliptus citriodora nos intervalos de 24 e 48 horas ............................................................

89

Gráfico 2 Média dos diâmetros dos halos de inibição da Nistatina suspenão oral

nos intervalos de 24 e 48 horas ............................................................

90

22

Sumário

23

4.9 Remirea marítima ............................................................................................... 67

4.10 Eucalípto citriodora .......................................................................................... 68

4.11 Cuminum cyminum .......................................................................................... 69

1 INTRODUÇÃO....................................................................................... 25

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................... 28 2.1 Fitoterápicos ....................................................................................................... 29

2.2 Espécies vegetais: Cucurbitáceas, Cayaponia tayuya, Cuminum cyminum, Copaífera, Eucaliptus e Remirea maritima .................................................................

38

2.2.1 Cucurbitáceae .............................................................................................. 38

2.2.2 Cayaponia tayuya ......................................................................................... 39

2.2.3 Cuminum cyminum ....................................................................................... 39

2.2.4 Copaífera ...................................................................................................... 40

2.2.5 Eucaliptus ..................................................................................................... 40

2.2.6 Remirea marítima ........................................................................................ 41

2.3 Fungos: estrutura e classificação ....................................................................... 42

2.3.1 Candida: características biológicas ............................................................. 42

2.3.2 Fatores associados à virulência da Candida ................................................ 44

2.3.4 Classificação das infecções fúngicas por Candida na cavidade bucal ....... 47

2.4 Classificação dos agentes antifúngicos e mecanismo de ação ......................... 52

3 PROPOSIÇÃO ..................................................................................................... 57

4 MATERIAL E MÉTODO .................................................................................... 59

4.1 Caracterização do estudo .................................................................................. 60

4.2 Material físico .................................................................................................... 60

4.3 Material químico-farmacológico .......................................................................... 60

4.4 Material vegetal .................................................................................................. 60

4.5 Método ................................................................................................................ 61

4.5.1 Obtenção dos extratos hidralcoólicos dos vegetais...................................... 61

4.5.2 Identificação do material vegetal................................................................... 62

4.6 Cucurbita pepo (polpa) ....................................................................................... 63

4.7 Cucurbita pepo (semente) ................................................................................. 65

4.8 Cayaponia tayuya .............................................................................................. 66

SUMÁRIO

24

4.12 Óleo Resina de copaíba .................................................................................. 69

4.13 Material biológico ............................................................................................. 70

4.13.1 Espécies de Cândidas ATCC’s ................................................................. 70

4.13.2 Espécies de Cândidas isoladas de cavidade bucal .................................. 70

4.14 Confecção dos discos de papel feltro .............................................................. 71

4.15 Confecção do diagrama de posicionamento dos discos .................................. 72

4.16 Marcação da posição dos grupos e face superior e inferior nas placas .......... 73

4.17 Preparo das placas e meio de cultivo .............................................................. 73

4.17.1 Número de placas de vidro ..................................................................... 73

4.17.2 Meio de cultivo ........................................................................................ 73

4.18 Preparo das suspensões microbianas e inóculo .............................................. 74

4.19 Semeadura das placas ..................................................................................... 76

4.19.1 Número de repetições das placas ............................................................. 76

4.19.2 Deposição do inóculo nas placas .............................................................. 76

4.20 Deposição das substâncias em teste nas placas semeadas ........................... 77

4.20.1 Preparo das substâncias ........................................................................... 77

4.2.8 Aferição dos resultados ............................................................................... 80

5 Resultados ........................................................................................... 82

6 Discussão ............................................................................................ 91

7 Conclusão ............................................................................................ 100

Referências .......................................................................................... 102

Anexo ................................................................................................... 119

25

Introdução

26

1 Introdução

O uso de plantas medicinais é uma prática comum em todas as culturas

mundiais, não sendo diferente no Brasil principalmente em função do fato de

possuirmos uma flora extremamente diversificada e vasta. Todo este arsenal contribui

sobremaneira para o estudo e desenvolvimento da terapêutica de várias patologias que

afligem a humanidade (GRÉGIO et al, 2006). Observa-se, entretanto, que grande parte

das espécies botânicas existentes nos países em desenvolvimento ainda não foi

identificada botanicamente, possuindo propriedades químicas, farmacológicas e

toxológicas desconhecidas (DONATINI, 2003). No Brasil esta realidade não é diferente,

onde apenas 8% das espécies vegetais apresentam seus compostos bioativos

estudados ou em estudo (NODARI; GUERRA, 2000; ORLANDO, 2005).

Baseando-se no conhecimento empírico sobre as propriedades terapêuticas das

plantas medicinais é que são desenvolvidos alguns dos mais valiosos medicamentos no

tratamento de diversas patologias (SARTORI, 2005). Na medicina popular o uso de

plantas medicinais é bastante difundido em virtude da fácil disponibilidade destes

recursos para a maioria da população (AMORIN et al., 2003).

Dentre as doenças que acometem a cavidade oral a candidíase está entre as

mais prevalentes, representando a infecção fúngica mais comum nesta localização.

Esta patologia é causada por fungos do gênero Candida, um microorganismo comensal

que faz parte da microbiota normal da maioria da população, mas que, na presença de

fatores predisponentes, pode causar infecção. Desta forma a candidíase oral é bastante

comum em indivíduos imunodeprimidos, como pacientes com AIDS, portadores de

neoplasias malignas, entre outras patologias. Entretanto, observa-se também uma a

elevada incidência da candidíase oral em pacientes imunocompetentes, como é o caso

dos usuários de próteses totais ou parciais (SANTOS et al., 2002; CROCCO et al.,

2004).

27

O tratamento da candidíase oral normalmente é feito com drogas antifúngicas

alopatas como os compostos polienos e azólicos. A maioria destas drogas antifúngicas

possue um elevado potencial hepato e nefrotóxico, ou podem causar distúrbios

gastrointestinais como náuseas, vômitos, diarréia e surgimento de gosto desagradável

na boca. Além disso, existem relatos que o uso indiscriminado pode levar a resistência

do fungo frente esses agentes (CAMPAGNOLI et al., 2004).

Em função dos efeitos indesejados apresentados pelos medicamentos alopatas,

associado ao seu elevado custo financeiro, que dificulta sua utilização pelas classes

economicamente menos favorecidas e o fato de produzir poucos efeitos colaterais, o

emprego de plantas medicinais tem crescido em todo mundo (RODRIGUES, 2005;

CALIXTO, 2000). Todo este crescimento tem impulsionado a comunidade científica a

desenvolver novas pesquisas relacionadas ao uso de plantas no tratamento das

diversas patologias que acomete o homem, como pode ser observado pelo número

crescente de publicações nesta área. Numerosas pesquisas também têm sido

desenvolvidas na odontologia relacionando o uso de plantas no tratamento das

patologias que afetam a cavidade oral.

Com propósito de buscar novas formas terapêuticas, que apresentem baixo

custo e menor toxicidade no tratamento da infecção fúngica mais comum na cavidade

oral, foi objetivo deste trabalho avaliar a ação dos extratos etanólicos de Cucurbita

pepo, Remirea marítima, Cayaponia tayuya, Eucaliptus citriodora, Cuminum cyminum e

o óleo resina da Copaífera sobre espécies do gênero Candida.

28

Revisão da Literatura

29

2 Revisão da literatura

2.1 Fitoterápicos

Para muitas civilizações antigas, o uso de plantas medicinais está relacionado ao

poder divino. A mitologia grega relata que Apolo, padecendo de um sofrimento que as

doenças traziam aos homens, deu as ervas o poder da cura e transferiu o

conhecimento destas a Asclépio, o Deus da medicina, chamado de Esculápio pelos

romanos (SARTORI, 2005). O conhecimento do poder curativo das plantas era

dominado no passado por várias civilizações, como os egípcios, incas, caldeus, árabes,

chineses e muitos outros povos. Já na Idade Média e Era Moderna, as escolas de

medicina só diplomavam aqueles que detinham vasto conhecimento sobre as plantas

medicinais (YUNES et al., 2001; NOVAIS et al., 2003).

A medicina moderna possui um grande número de medicamentos provenientes

de substâncias produzidas pelo metabolismo vegetal, os quais vêm sendo utilizados

pela humanidade como remédio desde o início de nossa civilização (MCCURDY;

SCULLY, 2005).

Os estudos de plantas, utilizadas popularmente durante séculos de forma

empírica para atividade medicinal, proporcionaram uma série de avanços terapêuticos.

No fim do século XIX e início do século XX por exemplo, foram isolados os primeiros

compostos de produtos vegetais, incluindo alcalóides como morfina, estricnina e quinina

(PHILLIPSON, 2001).

A atual legislação do Brasil conceitua fitoterápico como: “ [...] aquele

medicamento obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas vegetais. É

caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela

reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança são

validadas pelos levantamentos etnofarmacológicos de utilização, documentações

técnico-científicas em publicações ou em ensaios clínicos de fase 3” (Brasil, 2004 a). Os

30

fitoterápicos que já possuem estudos científicos reconhecidos, fazem parte da Lista de

Registro Simplificado de Fitoterápicos, reconhecida pela ANVISA (Brasil, 2004 b).

Os estudos em fitoterapia vêm sendo executados por instituições

governamentais, não-governamentais (BARBOSA; PINTO, 2003), de ensino, pesquisa

e assistência médica (CAETANO; FONTE; BORSATO, 2003), e as empresas de

fomento de pesquisa têm incentivado a produção de conhecimento científico na área de

plantas medicinais em termos de descoberta, validação e aplicação (RIBEIRO; LEITE;

DANTAS-BARROS, 2005).

No Brasil, as pesquisas envolvendo substâncias antimicrobianas de origem

vegetal teve seu início com Cardoso e Santos (1948), que avaliaram os extratos de cem

diferentes plantas indicadas na terapêutica cicatrizante e antiinflamatória, onde

constataram que apenas cinco extratos apresentaram atividade inibitória contra

Staphilococcus aureus, Escherichia colli e Proteus X-19 (SARTORI, 2005).

A farmacopéia brasileira vêm sendo alvo de reavaliações, principalmente em

função da descoberta de novos agentes, e os resultados destes estudos demonstram

uma intensa substituição das plantas nativas do Brasil por medicamentos

industrializados e outros produtos vegetais estrangeiros, confirmando assim a

necessidade de investimentos em pesquisa de validação das nossas plantas medicinais

(BRANDÃO et al., 2006).

É baseado nas propriedades terapêuticas dos fitoterápicos que o mercado

mundial envolvendo vegetais e substâncias extraídas dos mesmos, que são utilizadas

diretamente como fármacos ou que servem de base para o desenvolvimento de novos

medicamentos, movimenta vários bilhões de dólares, sendo uma atividade muito

lucrativa para as indústrias, principalmente as farmacêuticas (BRISKIN, 2000;

CALIXTO, 2000; van WIJK, 2000).

31

É estimado que existam entre 250.000 e 500.000 espécies vegetais em nosso

planeta (BORRIS, 1996), e a diversidade molecular quase ilimitada que existe no reino

vegetal, aliada com o conhecimento e sabedoria popular tem fornecido subsídios nos

estudos de plantas com provável potencial terapêutico, (BOLDI, 2004; CLARDY;

WALSH, 2004; KOEHN; CARTER, 2005).

A obtenção e identificação dos princípios ativos das plantas, aumentam o

número de opções terapêuticas, sendo uma alternativa contra os microrganismos que

desenvolvem resistência a medicamentos já utilizados (NASCIMENTO et al., 2000),

tornando o uso de plantas medicinais um processo em continua e franca ascensão

tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento (KOROLKOVAS, 1996).

Medicamentos fitoterápicos são preparações farmacológicas, obtidas de uma ou

mais plantas, os quais são utilizados no tratamento de inúmeras doenças. Os efeitos

terapêuticos, baixo custo e a grande disponibilidade, principalmente para indivíduos de

renda mais baixa, acabam favorecendo o uso deste produto por uma parcela

considerável da população (CALIXTO, 2000).

É considerado que as substâncias derivadas de plantas constituam

aproximadamente 25% da prescrição dos receituários médicos em países

industrializados (CUNICO et al., 2004), e que 50% dos medicamentos utilizados têm

origem sintética e os demais 25%, referem-se às outras fontes de produtos naturais,

como minerais, microbianos, entre outros (CRAGG & NEWMAN, 1999; CARVALHO,

2001; RATES, 2001).

Com relação ao consumo de uma forma geral, tem-se avaliado que, apenas 26%

da população detenha um consumo de 60% de todas as formas de medicamentos

(MARQUES, 2000). Ainda nos dias de hoje, o uso de plantas medicinais como veículo

para tratamento de patologias é bastante utilizado, principalmente em comunidades e

grupos étnicos com condições sócio-econômicas menos favoráveis (CAETANO et al.,

2002; MACIEL et al., 2002).

32

Na atual farmacologia, os produtos naturais vem se prestando a fornecer

medicamentos úteis e eficientes, com menores respostas tóxicas, servindo ainda como

protótipos para a formulação de medicamentos sintéticos, preservando suas

características originais (OLIVEIRA, 2005).

Muitos compostos originados de produtos naturais são usados como matéria

prima para o desenvolvimento de novas drogas pela indústria farmacêutica (CALIXTO

et al., 2003), em áreas como na terapêutica do câncer e doenças infecciosas por

exemplo, 60% de sua formulação corresponde aos produtos naturais (NEWMAN;

CRAGG; SNADER, 2003).

As funções metabólicas das plantas são essenciais para o seu desenvolvimento

e função celular, são provenientes do metabolismo primário, originando moléculas como

carboidratos, lipídeos e proteínas (SCHRICK et al., 2004; ZANGERL; BERENBAUM,

2004; KOCH, 2004) denominadas de alcalóides, flavanóides, isoflavanóides, taninos,

cumarinas, glicosídeos, terpenos e poliacetilenos entre outras, que são específicos para

famílias, gêneros ou espécies, cujas funções até pouco tempo eram desconhecidas

(CLARKE et al., 2001).

Outras funções do metabolismo das plantas tem sido relacionada com o ciclo de

vida da mesma e fazem parte do metabolismo secundário destas, agindo como

mediadores da interação entre esta com o meio ambiente, insetos, microrganismos e

vertebrados (HARBORNE, 2001; DIXON, 2001).

A produção de metabólitos secundários integra o sistema de defesa das plantas,

protegendo-as contra predadores (herbívoros), microrganismo patogênicos e outras

plantas, inibindo ainda o crescimento de sementes (DIXON, 2001). Os metabólitos

secundários têm também a função de atrair polinizadores, atuando no processo de

reprodução das plantas e podem ter atuação importante na qualidade dos alimentos

consumidos pela humanidade (cor, cheiro, sabor) e além disto podem ser usados na

33

produção de medicamentos, corantes, inseticidas e fragrâncias (BALANDRIN et al.,

1985; HARBORNE, 1989; HAMBURGER; HOSTETTMANN, 1991; VERPOORTE;

MEMELINK, 2002).

Os metabólitos secundários com ação protetora, produzidos como resposta

imediata a agressões por fungos, bactérias, vírus ou nematóides ou em função de

determinados estímulos como radiações, agentes físicos entre outros, são

denominados de fitoalexinas. Um destes compostos vegetais obtidos pelo metabolismo

secundário são os derivados fenólicos, que entre outras funções têm propriedades

antifúngicas (YUNES et al., 2001).

As substâncias das plantas utilizados na obtenção dos fitoterápicos, são

compostos sintetizados por estas durante o seu crescimento, gerando princípios ativos

ou substâncias inertes. Estes princípios ativos são encontrados nas folhas, flores,

frutos, raízes ou casca, não apresentando concentrações iguais para estes princípios

ativos, variando durante o seu ciclo de vida, habitat, colheita e modo de preparação

(REIS, 2006).

A busca de substâncias de origem vegetal sob a forma de extratos ou óleos

essenciais que desempenhem ação antimicrobiana tem tido uma busca cada vez maior,

principalmente em função do aumento da resistência dos microrganismos aos

medicamentos utilizados como rotina na prática médica conhecida. Atribui-se esta ação

antimicrobiana aos vegetais em função destes serem ricos em taninos, flavanóides e

polifenóis (REIS, 2006). Entretanto, o crescente processo de destruição das florestas

tropicais, pode determinar a impossibilidade de se estudar espécies vegetais sob risco

de extinção, inviabilizando desta forma a determinação de suas ações e constituintes

fitoquímicos (BALADRIN et al., 1985).

Inúmeras são as espécies vegetais estudadas com o propósito de

desenvolvimento de substâncias com ação antimicrobiana, entre outros, o uso do

Syzygiun jambos (DJIPA et al., 2000), Psidium guajava L (CARVALHO et al., 2002),

Bryophyllum pinnatum (SCHMITT et al., 2003), famílias Leguminoseaes e Rutaceae

34

(NOVAES et al., 2003), própolis (VARGAS et al., 2004), ervas Ocimum gratissimum l,

Cybopogum citratus (DC) Stapf e Salvia officinalis (PEREIRA et al., 2004), Sizyzium

cumini (LOGUERCIO et al., 2005), Acácia podalyriiflolia A. Cunn (ANDRADE et al.,

2005), Stryphnodendron adstringens Martius Coville (ORLANDO, 2005), Plathymenia

reticulata, Hymenaea courbaril L e Guazuma ulmifolia Lam (FERNANDES; SANTOS e

PIMENTA, 2005), Persea gratissima Gaertn (Reis, 2006), Miconia rubiginosa e Pfaffia

glomerata (MOURA, 2006), Zingiber oficinalle (GRÉGIO et al., 2006).

Os testes de sensibilidade antimicrobiana, podem ser realizados com qualquer

microrganismo, quando se deseja aferir a susceptibilidade in vitro de microrganismos

patógenos frente a agentes antimicrobianos, sendo mais utilizado o método de difusão

em meio sólido. Para fungos, que possuem um crescimento rápido, o método de

difusão em agar é o mais utilizado (TRUJILLO, 2002; NCCLS, 2002).

Muito embora os testes de sensibilidade in vitro, para fungos, não têm sido

empregados corriqueiramente, eles são de grande valia para avaliação da resistência

destes microrganismos, sendo úteis no controle da terapêutica antimicótica e para

pesquisa de novas substâncias alternativas para o tratamento, como por exemplo, a

utilização de extratos vegetais (OLIVEIRA et al., 2006).

A ação de substâncias vegetais utilizadas em testes de sensibilidade

microbiológica, estão associadas com uma intricada relação de sinergismo entre as

diversas substâncias que integram os extratos brutos, conferindo a estas uma ação

biológica efetiva (VASCONSELOS et al., 2002).

Entretanto, têm-se demonstrado que, os compostos presentes em menor

proporção muitas vezes são os que apresentam melhores resultados (MOURA, 2006),

mas contudo, pelo fato de o potencial antimicrobiano dos extratos brutos de origem

vegetal não se dever a uma única substância, mas a um conjunto destas existentes no

extrato, não justificaria assim o processo de isolamento da substância ativa em todos os

casos, mesmo este sendo de extrema importância fitoquímica, o que reduziria etapas

35

químicas de isolamento e por conseguinte os custos, viabilizando ainda mais a

indicação e uso dos fitoterápicos (CUNHA, 2006).

A utilização da fitoterapia na Odontologia ainda é uma prática recente (BUFFON,

et al., 2001; PAIXÃO, et al., 2002; COUTINHO, et al., 2004; BRITO; LIMA; ARAÚJO;

2006; FERNANDES JÚNIOR, et al., 2006). Foi a partir da década de 90 que estudos

associando fitoterápicos e patógenos bucais passou a ter uma maior atenção, como a

utilização da resina da Acacia arabica (CLARK et al., 1993), e do extrato metanólico

Syzygium aromaticum (CAI; WU, 1996), frente a microrganismos

periodontopatogênicos, bem como a avaliação da atividade antibacteriana do extrato

etanólico da própolis contra microrganismos causadores da cárie dental (PARK et al.,

1998).

Levantamentos de ordem farmacológica têm despertado grande interesse por

produtos de origem natural, em função de sua vasta aplicabilidade clínica nos diferentes

campos da prática médico-odontológica. Estudos e ensaios físico-químicos e

microbiológicos devem ser levados a termo, cada vez que se detecta uma fonte

terapêutica de um fitofármaco (GRÉGIO et al., 2006)

A avaliação da atividade antimicrobiana da Água Rabelo, Malvatricin, Mel

Rosado, Apis Flora, Fitogargarejo, e Óleo de Copaíba frente a microrganismos

cariogênicos, semeadas em meio de cultura Ágar Müeller Hintön, com emprego da

técnica de Concentração Inibitória Mínima (CIM), concluiu que os produtos tiveram

desempenhos variados, tendo o Malvatricin® obtido a melhor CIM frente a todas as

linhagens, bem como os maiores espectros de inibição e Água Rabelo não apresentou

atividade antibacteriana (DRUMOND et al., 2004).

No controle do biofilme dental, também foram realizados trabalhos in vitro como

in vivo, com soluções de própolis, onde a mesma apresentou resultados semelhantes a

ação das soluções de clorexidina (ALMEIDA et al., 2006).

36

Estudos etnobotânicos são de grande valia na catalogação de espécies vegetais,

associando-as com seu uso medicinal pela população. Já foram catalogadas 409

espécies vegetais utilizadas no tratamento de infecções fúngicas. Estas estão

distribuídas em 98 famílias. Este levantamento etnobotânico, associou as dez espécies

mais citadas como úteis frente a fungos, fazendo uma busca na base de dados

MEDLINE-PubMed, encontrando estudos apenas com as espécies Phytolacca

americana , Rosmarinus officinalis , Mirabilis jalapa , Schinus molle. Entre as dez

espécies mais utilizadas, seis correspondem a espécies nativas: Anacardium

occidentale , Cecropia peltata , Schinus molle , Schinus terebinthinfolius Raddi,

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville e Tabebuia heptaphylla, onde as mais

utilizadas provavelmente estejam relacionadas com a possibilidade de acesso fácil, e

não a uma real ação do vegetal (FENNER et al., 2006).

Em algumas situações, o fato de não existir relatos na literatura científica de

estudos sobre determinadas espécies vegetais com uma atividade antimicrobiana

diretamente relacionada aos microrganismos da cavidade oral, pode-se ter dificuldade

em realizar uma avaliação comparativa com outros trabalhos (MOURA, 2006), sem

contar que a necessidade de regulamentação também vem incentivando as pesquisas

de plantas medicinais utilizadas no Brasil (RIBEIRO; LEITE; DANTAS-BARROS, 2005).

Os estudos envolvendo testes de sensibilidade antimicrobiana de vegetais,

utilizam diversas partes destas (folhas, frutos, sementes, casca, caule, seivas, resinas e

raízes), e várias formas de produção das substâncias derivadas das mesmas, como os

extratos aquosos, hidroalcóolicos, óleos essenciais (SCHUCK et al., 2001; LEITE et al.,

2006; LIMA et al., 2006; NASCIMENTO et al., 2007) e também tinturas (COELHO et al.,

2003; SILVA et al., 2006). Os princípios gerais para a obtenção de produtos vegetais

biologicamente ativos, via de regra seguem um protocolo bem semelhante (FILHO;

YUNES, 1998).

Devido ao crescente aumento na resistência microbiana aos tratamentos

medicamentosos de rotina, se faz de extrema importância a busca de novos agentes

37

antimicrobianos, que sejam efetivos e com um grau de toxicidade baixo ou inexistente

(ORLANDO, 2005).

Avaliações iniciais dos testes de sensibilidade (screenings) possibilita a

descoberta da efetividade das ações de fitoterápicos frente a diversos microrganismos,

independente da técnica de extração utilizada. Os métodos de teste para os diversos

microrganismos são similares, onde os mais utilizados são os testes de microdiluição

em meio líquido e os testes de difusão em meio sólido com discos ou poços (COWAN,

1999), o que em função da potencialidade do extrato, o mesmo pode apresentar

resultados tanto positivos como negativos (GONÇALVES, et al.,2005).

A partir dos anos 50, os primeiros compostos de origem fitoterápica foram

isolados, os quais detinham atividade contra Staphylococcus aureus resistentes à

meticilina. As pesquisas envolvendo atividades antifúngicas buscam fármacos com

alvos específicos, visando sobretudo a diminuição de efeitos colaterais, e atuando na

inibição da biosíntese do ergosterol, das topoisomerases ou ainda na parede celular

fúngica (ZACCHINO et al., 1998).

É imprescindível que sejam incrementadas as pesquisas que visem a obtenção

de novas substâncias com atividade antimicrobiana, principalmente com atividade

dirigida contra patógenos fúngicos, uma vez que a disponibilidade de antifúngicos é

inferior a de agentes antibacterianos, e sobretudo o fato do desenvolvimento de

resistência, possibilidade de recorrência e da toxicidade sistêmica (SMÂNIA, 2003).

O uso não racional de medicamentos, faz com que os microrganismos acabem

desenvolvendo resistência aos fármacos, dificultando o tratamento. Os estudos

voltados para a descoberta de fármacos naturais, que apresentem características de

segurança no emprego, estabilidade, padronização na formulação e eficácia na

resolutividade da terapêutica servem também de modelo para a obtenção de moléculas

sintéticas para a produção de antimicrobianos mais efetivos e específicos contra os

microrganismos. Tal especificidade é de grande valia na minimização de efeitos

38

colaterais indesejáveis ao paciente, que em muitas vezes limita ou até impede o uso de

determinados medicamentos (SARTORI, 2005; ORLANDO, 2005).

Os fitoterápicos constituem uma alternativa terapêutica mais econômica se

comparados aos medicamentos alopáticos industrializados (CARVALHO et al., 2002),

pois sua diversidade molecular tornam os vegetais uma excelente fonte de novas

drogas (NOVAES et al., 2003). Foi verificado que o uso de fitoterápicos é maior nas

classes de condição econômica mais baixas, onde 72% dos que fazem uso desta

modalidade, afirmaram que a busca por tratamentos mais baratos foi decisivo na

modalidade terapêutica escolhida (ARNOUS; SANTOS; BEINNER; 2005).

2.2 Espécies vegetais: Cucurbita pepo, Cayaponia tayuya, Cuminum cyminum,

Copaífera, Eucaliptus citriodora e Remirea maritima .

2.2.1 Cucurbita pepo:

Nome popular: abóbora, abóbora-amarela, abóbora-comprida, abóbora-de-carne-

branca, abóbora-de-carneiro, abóbora-de-guiné, abóbora-de-porco, abóbora-grande,

abóbora-menina, abóbora-moganga, abóbora-moranga, abóbora-porqueira, abóbora-

quaresma, aboboreira, aboboreira-grande, abobrinha-italiana, cabaceira, cucurbita-

major-rotunda, cucurbita-potiro, girimum, jeremum, jerimum, jerimu, jurumum, moganga,

zapalito-de-tronco, zapalo (LORENZI et al., 2002).

Este vegetal é uma herbácea rasteira, vigorosa, anual, de ramos carnosos,

nativa da América Central. Possui folhas peltadas, revestidas por pêlos ásperos, com

23 a 25 cm de diâmetro, e flores solitárias, amarelo-alaranjada. Existem várias espécies

em cultivo no Brasil, sendo utilizadas todas as partes da planta na medicina popular

(LORENZI et al., 2002).

Dentro da literatura, as espécies vegetais aqui estudadas, possuem um uso

popular diversificado, como a Cucurbita pepo (abóbora, jerimum), onde se utilizam suas

sementes secas e maceradas misturadas ao leite para o combate a verminoses (AGRA

39

et al., 2007). Na medicina popular brasileira, existe também relato do uso da Cucurbita

pepo em banho de asseio para o tratamento de corrimento vaginal (FENNER et al.,

2006).

Estudos fitoquímicos revelaram a presença de óleo fixo, proteína (aleurona) e

resina, aminoácidos não proteinogênicos – cucurbitina (LORENZI et al., 2002).

2.2.2 Cayaponia tayuya:

Também conhecida como: taiuiá, tajujá, abobrinha-do-mato, cabeça-de-nego,

guardião, anapinta, tomba, azougue-do-brasil, raiz-de-bugre (LORENZI et al., 2002).

A Cayaponia tayuya é uma planta herbácea, trepadeira ou rastejante, vigorosa,

nativa em todo o Brasil, possuindo longas raízes e tuberosas, com ramos sulcados

longos e carnosos. Folhas tri ou penta-lobadas com 12 a 18 cm de comprimento, com

frutos e sementes numerosos (JOLY, 1998).

É utilizada tradicionalmente como tônico e purificador do sangue, suas raízes sob

a forma de decocto, são utilizadas como purgativo, emético, analgésico, anti-sifilítica e

depurativa, empregadas em reumatismo, nevralgias. Foi também observado a inibição

do vírus Epstein-Bar e efeito antitumoral em pele de ratos (LORENZI et al., 2002).

Dentro da medicina popular do Brasil, é encontrado citações do uso da raiz, folha

e fruto da Cayaponia tayuya para o tratamento de dermatoses, bem como de

Cayaponia bonariensis, que é da mesma família, para o tratamento de leucorragias

crônicas (FENNER et al., 2002).

Dentre outras indicações, a Cayaponia tayuya tem sido utilizada como

antiulcerogênico, sobretudo para suas folhas (COELHO, 2004).

40

2.2.3 Cuminum cyminum:

Também conhecido como falso-anis, falso-aneto e kümel. Originário da Europa e

norte da Índia. Possui flores pequenas, brancas ou levemente rosadas, que dão origem

a frutos contendo sementes, as quais apresentam aroma característico. São utilizadas

as folhas e raízes na culinária e medicina, para má digestão (MORGAN, 1994).

Possui como principais constituintes, óleo essencial, constituído por uma mistura

de aldeído cumínico, cimol, pineno, paracimeno, felandreno, álcool cumínico, tanino,

aleurona, matérias resinosas, desempenhando propriedades de estimulante estomacal,

usado como digestivo nas gastraldias, dores intetinais, flatulências, excitante da

secreção láctea (HERBARIUN, 2007).

2.2.4 Copaífera sp:

As árvores das diversas espécies de Copaifera são conhecidas como copaíba,

copaibeira, pau-de-óleo, copaúba, copaúva, copiúva, copai, óleo de copaíba ou

bálsamo. No Brasil ocorrem quase trinta espécies, podendo ser arbustos ou árvores

frondosas, que têm as mesmas utilizações terapêuticas (PIO CORRÊA, 1984).

As pesquisas científicas relacionando o uso de determinadas plantas no

tratamento das doenças bucais, vem fazendo com que a odontologia se beneficie, e a

população ao utilizar a fitoterapia, usufrua destes benefícios. O óleo de copaíba vem

sendo indicado, há mais de quatro séculos, para diversos fins farmacológicos. Este óleo

é exudato do tronco da copaibeira e os estudos de atividade antibacteriana mostraram

atividade bactericida e bacteriostática do óleo frente ao Streptococcus mutans (VEIGA

JÚNIOR; PINTO, 2002).

O óleo-resina é obtido pela incisão no tronco de árvores do gênero Copaífera,

família Leguminosae, sub-família Caesalpinioideae. É utilizada na medicina popular

brasileira, com a denominação de óleo de copaíba, principalmente como cicatrizante,

41

anti-séptico e antiinflamatório (PIO CORREA, 1984). Atividades bactericida, anti-

helmíntica, analgésica, antiinflamatória, gastroprotetora, antitumoral, cicatrizante e

tripanossomicida foram confirmadas em ensaios em microrganismos ou animais

(COSTA et al., 1996).

A Copaífera utilizada sob a forma de óleo vegetal, vem tendo resultados

animadores na terapêutica antineoplásica e antiinflamatória (AGRA et al., 2007).

Apresentou também atividade antibacteriana frente ao Streptococcus mutans, quando

submetido à técnica de difusão em meio sólido e determinação da CIM (BANDEIRA et

al., 1999).

Quanto as infecções fúngicas, estudos também tem englobado testes de

sensibilidade, obtendo resultados variados entre positivos e negativos. Avaliações feitas

com o óleo de copaíba, por exemplo, que contém óleo de corafileno com potencial

ação germicida, deveria apresentar a formação de halos de inibição em teste in vitro,

entretanto isto não tem sido observado (PACKER; da LUZ, 2007).

2.2.5 Eucaliptus citriodora:

O gênero Eucaliptus vem sendo cultivado e utilizado em diversas partes do

mundo há muito tempo. No Brasil, pode ser encontrado em todas as regiões, possuindo

cerda de 400 espécies reconhecidas. São utilizados deste vegetal o caule para

indústrias de papel e carvão, as folhas para obtenção de óleos e extratos, utilizados em

perfumarias, medicamentos, conservantes entre outras. Observando que sob análise

química da composição, verificou que o mesmo é composto por um predomínio de

monoterpenos, com um alto teor de citroneleal, em torno de 83% (ESTANISLAU et al.,

2001).

Diversas espécies apresentam algumas atividades terapêuticas como:

adstringente, anti-séptica, antifúngica, antiinflamatória, antibacteriana, cicatrizante e

desinfetante (SILVA et al., 1998). O Eucaliptus vem sendo utilizado no tratamento de

afecções do trato respiratório, aromatizantes de ambientes (NAKASHIMA; BOLLER,

42

2005), bem como também são utilizados em infecções intestinais (TORRES et al.,

2005).

2.2.6 Remirea maritima Abul:

É uma herbácea, a qual possui nome vulgar de pinheiro da praia. Desenvolve-se

em solos arenosos na costa brasileira. Rizomatosa de folhas agudo-triangulares.

Inflorescência terminal, densa, de coloração esbranquiçada (CRONQUIST, A. 1988;

MARTINS et al., 2000).

Dentro da sua utilização na medicina popular, tem-se observado a sua utilizado

para o tratamento de diarréia (Siani et al., 2001)

2.3 Fungos:

Os fungos, pertencem ao Reino Fungi, e a divisão Eumycota. A maioria das

espécies são classificadas na subdivisão Deuteromycotina e outras na Ascomycotina

(RIBEIRO et al., 2004). De forma didática, os fungos patogênicos podem ser divididos

tendo como base a forma de crescimento em filamentosos ou leveduriformes, e pelo

tipo de infecção que produzem em causadores de micoses superficiais ou profundas

(PRETTO, 2005).

2.3.1 Candida: características biológicas

O gênero Candida compreende mais de 200 espécies de leveduras, as quais

reproduzem-se de forma assexuada por brotamento. Algumas dessas espécies também

apresentam a forma telomórfica (sexual), na maioria das vezes ascosporogeneas. Estes

fungos apresentam capacidades assimilatórias, oxidativas e fermentativas, tornando-se

aptas a utilizarem uma boa variedade de substâncias orgânicas. Somando-se a forma

unicelular blastosporica (levedura), uma grande parte das espécies deste fungo podem

apresentar um estágio micelial com produção de micélio verdadeiro ou pseudomicélio.

43

Em algumas condições in vitro algumas espécies, como C. albicans e C. stellatoidea

podem produzir clamidósporos (MIMS et al., 1999).

Em meio líquido, induz a presença de sedimento em caldo Sabouraud dextrose e

provas de assimilação de fonte carbono (maltose, glicose, rafinose, celobiose, lactose,

galactose e sacarose) e de fermentação de açúcares (dextrose, maltose, sacarose e

lactose) permitem a identificação de espécies de Candida (SOUZA, 1990).

A maioria das espécies de Candida apresentam-se com uma grande variedade

de nichos ecológicos, com características saprofíticas. De uma forma geral, estas

leveduras são diplóides com forma teleomórfica desconhecida, com sua morfologia

sendo caracterizada por esta natureza dimórfica, incluindo a forma micelial e de

levedura. Esta mudança morfológica pode ocorrer tanto in vivo como in vitro, o que vai

determinar uma característica significante com implicações na patogênese e

propriamente no diagnóstico das infecções promovidas por este tipo de fungo. In vitro, o

blastosporo (levedura) pode ser obtido a partir de seu crescimento em meios de cultura

sólido ou líquido, e a obtenção da forma micelial ou pseudomicélio, e também da forma

de clamidósporo, pode ser influenciada por vários fatores ambientais, como as

alterações na composição de meios de cultivo, adição de soro, crescimento sob semi-

anaerobiose ou baixa tensão de CO2, pH baixo entre outros. O clamidosporo é uma

estrutura de resistência formada por uma parede celular grossa e citoplasma

condensado. Normalmente é produzido quando a levedura está em condições de

crescimento desfavorável, sendo a formação de clamidósporo e tubo germinativo

utilizados em testes de identificação de C.albicans por exemplo (MIMS et al., 1999;

SCHAECHTER et al., 2002).

É verificado que ambas as estruturas morfológicas, micélio e levedura, são

encontradas in vivo, onde normalmente as leveduras predominam como comensais em

hospedeiros clinicamente saudáveis, entretanto, sua associação com o progresso de

estados patológicos dá ênfase ao aparecimento das formas miceliais, as quais estas

últimas são mais resistentes aos mecanismos de defesa do hospedeiro, enquanto que

44

os blastosporos (leveduras) são mais sujeitos a ação dos fagócitos do sistema celular

de defesa. Aceita-se de uma forma geral que as leveduras são responsáveis pelo início

dos processos infecciosos, com as formas miceliais filamentosas respondendo por

episódios de patologias invasivas. Os fatores ambientais podem afetar o poder

fisiológico da levedura comensal, alterando por exemplo um determinado passo da

atividade enzimática que produz modificações quantitativas na composição da parede

celular, induzindo assim alterações morfogenéticas as quais vão resultar na formação

de micélio (MIMS et al., 1999; SCHAECHTER et al., 2002).

Apesar do grande número de espécies, apenas algumas destas estão implicadas

na etiologia de processos patológicos em humanos, as quais estão incluídas a C.

albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. stellatoidea, C. guilliermondii, C. glabrata, C.

krusei, C. lusitaniae, C. dubliniensis, C. kefyr, C. rugosa, C. famata, C. utilis, C.

lipolytica, C. norvegensis, C. inconspícua (COLOMBO; GUIMARÃES, 2003).

Para que a Candida possa promover um processo patológico, o mecanismo de

aderência destes fungos é considerado como primeiro estágio da colonização, para

então ocorrer o processo de disseminação a partir de um desequilíbrio nas defesas do

hospedeiro. A aderência envolve um processo de união entre superfícies

macromoleculares que vão interagir ou serem absorvidas pelo substrato fúngico, onde

existe a produção de proteínas (manoproteína= adesina), quitinas e lipídeos que estão

envolvidos neste processo. Os receptores teciduais envolvidos no processo de

aderência ainda não foram bem caracterizados, entretanto é sugerido que participem

deste mecanismo as fibronectinas, fosfolipídeos, manose, N-acetil-glicosamina, mucina,

laminina e colágeno (PIRES et al., 2001).

Quaisquer alterações orgânicas independente de qual natureza, que possam

causar uma ruptura no processo de equilíbrio entre as leveduras e a microbiota a qual

faz parte, comumente favorecem a manifestação infecciosa da Candida, também

chamada de candidíase, principalmente quando as condições tópicas, aspectos físico-

químico e biológico da pele e mucosas envolvidas, propiciam a sua proliferação

exacerbada, aguçando assim seus fatores de virulência, o que pode ser ainda

45

associado com irregularidades funcionais do sistema imunológico, em função do

aprimoramento ou deficiência deste (RIBEIRO et al., 2004).

2.3.2 Fatores associados à virulência da Candida

A presença da Candida em indivíduos está relacionada a uma condição de

comensalismo (RODRIGUES et al., 2004), e apresentam em função da espécie

diferentes habilidades de patogenicidade e virulência, podendo ser isoladas a partir de

várias formas clínicas e diferentes idades, desde lactentes (SCHERMA et al., 2004),

crianças em idade escolar de ambos o sexos (BORIOLLO, 2004) a pacientes geriátricos

dentados ou não (CARVALHO, 2000).

A incidência das infecções por cândida, bem como outros fungos, está ligada a

fatores pertinentes ao hospedeiro ou até fatores externos, entretanto a maior parte

desta infecção se dá por via endógena, ou seja, são causadas por microrganismos que

fazem parte da microbiota normal do ser humano. Já a forma exógena ocorre nos casos

onde os pacientes se encontram debilitados por tratamentos como por exemplo drogas

imunossupressoras, antibioticoterapia prolongada e até no decurso de doenças

crônicas (SCHAECHTER et al., 2002).

Dentre os fatores associados com a virulência da Candida, podemos citar o

oportunismo, onde pacientes submetidos ao tratamento antineoplásico, principalmente

acometidos por neoplasias malignas sistêmicas, sobretudo crianças, apresentam um

alto índice para o desenvolvimento de infecções orais oportunistas principalmente por

Candida , e que condições precárias de higiene oral podem atuar como coadjuvantes

na instalação deste processo (GORDON-NÚÑEZ; PINTO, 2003), fato este também

observado em adultos (AL-ABEID et al., 2004).

Em pacientes com diagnóstico de câncer bucal, o índice de culturas positivas

para Candida tem apresentado-se em torno de 42,4% (KIGNEL; BIRMAN, 2000). Nos

casos de pacientes em estágio crítico de neutropenia é a infecção fúngica mais

46

freqüente, chegando a 80% de presença (CUÉTARA et al., 2006). Os quadros de

leucemias tem mostrado que as infecções por Candida , independente da forma de

apresentação clínica, correspondem a 7,8% das alterações a nível da cavidade bucal

(RIBAS; ARAÚJO, 2004).�

As manifestações patológicas da Candida podem ser vistas com uma freqüência

alta em pacientes imunocomprometidos, sobretudo naqueles que apresentam

diagnóstico de AIDS, onde a incidência de lesões bucais corresponde a 74,48% dos

casos, com a candidíase apresentando índices de 29,69% em pacientes que estão sob

tratamento (CAVASSINI et al., 2002), podendo atingir níveis de até 80% quando

consideramos apenas a presença da levedura nestes pacientes (MENEZES et al.,

2006).

Nos casos de pacientes que apresentam alterações endócrinas como diabetes,

caracterizadas pelos quadros de hiperglicemias ou mesmos nos estágios iniciais da

doença, pode ser considerada como um fator de aumento na suscetibilidade ao

desenvolvimento à candidíase (TANGA et al., 2003). Em pacientes hemofílicos, a

colonização e presença de Candida na cavidade bucal é encontrada em maior número

(64%), do que em pacientes saudáveis (44%), independentemente dos parâmetros

clínicos analisados, como infecção viral, próteses dentárias, transfusões de

hemoderivados e fluxo salivar (PEREIRA et al., 2004).

Tem-se demonstrado que a Candida também é capaz de se aderir a superfícies

lisas, como o metacrilato de próteses (GASPARETTO et al., 2005; PENHA et al., 2000).

O uso de próteses dentre a população brasileira, apresentam índices altos,

principalmente com o avanço da idade da população, variando de 1,88% entre

indivíduos com faixa etária de 15 a 19 anos, atingindo a proporção de 42,57% entre os

que se encontram na faixa etária de 65 a 74 anos colocar tabela do SB-Brasil

(PROJETO SB-BRASIL, 2003). Este uso é considerado como um outro fator que

favorece os quadros de infecções pela Candida, onde a confecção da prótese de forma

inadequada, ou mantidos na cavidade oral com graus insuficientes de uso e higiene,

47

vem sendo relacionado com o aparecimento de uma grande variedade de lesões,

incluindo hiperplasias, estomatites, úlceras traumáticas, lesões periodontais e a

candidíase, com esta última considerada a alteração mais freqüente nestes pacientes e

com uma variação clínica bem diversificada e bastante característica (GOIATO et al.,

2005).

Para que estas diferentes condições possam gerar o processo patológico da

infecção pela levedura, se faz necessário que os fatores de virulência do fungo estejam

presentes, como a capacidade de aderência, dimorfismo (formação de micélio),

variabilidade fenotípica (switching), produção de toxinas e enzimas extracelulares. O

processo de aderência se deve a características químicas e estruturais da parede

celular. O componente químico que permite a união é uma manoproteína, enquanto que

a estrutura é uma capa fibrilar que recobre a parede. Tem-se descrito também outras

moléculas de aderência, como as adesinas (lectinas e glicoproteínas de superfície) do

agente infectante, e receptores protéicos (laminina, fibronectina e fibrina) presentes na

superfície celular das mucosas. O processo de interação também pode ser influenciado

pela temperatura, pH, nutrientes, IgA secretória e hidrofobicidade superficial celular

(GREENFIELD, 1992).

O desenvolvimento de micélio pelas espécies de Candida também favorece as

infecções fúngicas em decorrência da variabilidade antigênica da superfície e do

formato micelial que propicia maior aderência, dificultando a ação fagocitária pelo

sistema imune. As alterações morfológicas das colônias fúngicas e das propriedades de

superfície celular, podem ser conduzidos pelo mecanismo de switching de alta

freqüência e reversibilidade, além de favorecer também mudanças na sensibilidade,

como à drogas antifúngicas. A Candida pode emitir também filamentos largos, que são

capazes de invadir em direção a profundidade tecidos, cujo processo é chamado de

tigmotropismo (RIBEIRO, 2004).

É comum detectar também a produção de algumas substâncias, sejam elas

toxigênicas (toxicoglicoproteínas e canditoxina), ou exoenzimas leveduriformes (aspartil

48

proteinases e fosfolipases) as quais tem relação direta com os mecanismos de

virulência e patogenicidade (RIBEIRO, 2002).

O mecanismo de imunidade inata e adquirida atuam no combate as infecções

fúngicas, e a ruptura das barreiras teciduais humanas por lesões de pele ou mucosas

constituem um princípio básico para o estabelecimento do processo de infecção pela

Candida. Os fatores hormonais por sua vez, proporcionam tanto o estabelecimento

quanto a progressão da candidíase, fato este observado em períodos de gestação, e

diabetes em função da descompensação insulínica (CARVALHO et al., 2003)

2.3.3 Classificação da infecções fúngicas por Candida na cavidade bucal

As infecções por Candida foram inicialmente descritas por Hipócrates (600 a. C)

com a denominação de aphathae ou albae. Já em 1838, Langenbeck relacionou os

fungos como etiologia de um caso de tifo, e em 1846, Berg descreveu de forma mais

objetiva a presença de candida em lesões na boca. Posteriormente, Berkhout em 1923,

definiu o termo Monília para infecções promovidas por este microrganismo. Tal

derivação na nomenclatura reporta a associação com o termo Monilia albicans, que se

referia às vestes, toga ou no robe branco, que os candidatos ao Senado Romano

utilizavam. Atualmente este termo caio em desuso, sendo denominado de candidíase

ou candidose (BIRMAN, 2002).

A candidíase é uma infecção fúngica causada pela presença de leveduras do

gênero Candida, a qual faz parte da família Cryptococaceae, onde hoje se conhece

mais de 200 espécies do gênero (CAVASSANI, 2002).

No passado a infecção por Candida era relacionada a um processo oportunista,

a qual estava associada a indivíduos que já se apresentavam imunologicamente

comprometidos (ASSAD, 2004). A nível de cavidade oral, as patologias promovidas

pela Candida, são consideradas as infecções micóticas mais freqüentes, onde a

49

espécie mais prevalente é a C. albicans, sendo esta também a que mais produz

manifestações estomatológicas (URIZAR, 2002).

Hoje, atribui-se as leveduras do gênero Candida a responsabilidade pelos

processos de colonização e patogênicidade das infecções fúngicas superficiais em

indivíduos imunocompetentes e por envolvimento sistêmico em indivíduos

imunocomprometidos (CROCCO et al., 2004).

Em cavidade bucal de humanos, a distribuição das leveduras do gênero Candida

é ampla, integrando a microbiota bucal de forma permanente na grande maioria dos

indivíduos, sendo considerada o único gênero de fungos que é residente habitual da

microbiota bucal humana (SCHERMA et al., 2004). Esta ocorrência na boca, tem sido

bem observada, sendo estes fungos considerados como habitantes comensais que

fazem parte da microbiota oral normal de indivíduos saudáveis, interagindo com outros

microrganismos já existentes, havendo uma coexistência desses microrganismos e o

hospedeiro, cuja condição saprofítica estabelece um estado denominado de “anfibiose”

(MOREIRA et al., 2001). Foi verificado que este fungo tem a capacidade de colonizar a

cavidade oral de indivíduos, mesmo que eles não apresentem condições

predisponentes para tal, podendo ainda estas leveduras serem detectadas em exames

de saliva, (JORGE et al., 1997).

A transformação do fungo de comensal em patógeno depende da combinação de

três grupos de fatores: do hospedeiro, do fungo e de fatores que modifiquem a

microbiota da cavidade bucal, com a ocorrência destes microrganismos variando de

20% a 70% (URIZAR, 2002).

Dentre as espécies mais prevalentes, a Candida albicans tem apresentado o

maior índice, atingindo de 60% a 70% , porém outras espécies também podem ser

relacionadas em menor freqüência, como a C. tropicalis, C. krusei e C.parapsilosis

(MOREIRA et al., 2001). Inclui-se além destas variantes, a C. gullierrmondi presente

50

na cavidade oral, porém em freqüência baixa se comparada com a C. albicans

(CROCCO et al., 2004).

A classificação aqui apresentada é a preconizada por Neville (2004), onde as

formas clínicas da candidíase bucal são: Pseudomembranosa, eritematosa, glossite

romboidal mediana, multifocal crônica, queilite angular, atrófica crônica, hiperplásica,

mucocutânea e síndrome da candidíase endócrina.

a) Pseudomembranosa:

É caracterizada pelo aparecimento de placas brancas, cremosas e

aderentes na mucosa bucal, as quais podem ser removidas por uma simples raspagem

com abaixador de língua ou gaze seca. Pode ter seu início pelo uso prolongado de

antibióticos de amplo espectro, com a conseqüente redução de microrganismos

competidores ou redução da imunidade, como nos casos de leucemia ou em pacientes

infectados pelo vírus da imunodeficiência humana. É mais observada na mucosa jugal,

língua e palato.

b) Eritematosa:

Apresenta uma característica clínica avermelhada, desencadeando uma

sensação de queimação ou ardência. Tem uma ocorrência maior a nível de palato duro,

mucosa jugal e dorso da língua.

c) Glossite romboidal mediana (atrofia papilar central):

Pode também ser ainda incluída na categoria de C. eritematosa.

Apresenta-se como uma zona eritematosa, bem demarcada localizada na linha média

da superfície dorsal e mais posterior da língua, de forma plana ou lobulada.

51

d) Multifocal crônica:

Em pacientes que apresentem glossite romboidal mediana, e também

sinais de infecção por Candida em outros locais da mucosa bucal, como palato, dorso

da língua, recebem a denominação de multifocal crônica.

e) Queilite angular:

É caracterizada pelo envolvimento da comissura labial, com formação de

eritema, fissuras e descamação desta área, com queixa de dor. Pode ser observada em

pacientes com dimensão vertical diminuída e sulcos acentuados na comissura labial,

favorecendo o acúmulo de saliva nestas áreas.

f) Atrófica crônica (estomatite por dentadura):

Pode também ser classificada como uma das formas da C. eritematosa,

por apresentar vários graus de eritema, petéquias hemorrágicas, localizadas sob a base

de dentaduras de forma assintomática, a nível de palato.

g) Hiperplásica:

Também conhecida como leucoplasia por candida, apresentando placas

brancas que não são removidas pela raspagem, sendo mais comumente observada na

região anterior da mucosa jugal.

h) Mucocutânea:

52

Normalmente está associada a distúrbios imunológicos, apresentando-se

como placas brancas que não se destacam à raspagem, com maior incidência na

língua, mucosa jugal e palato.

i) Síndrome da candidíase endócrina:

Está associada a distúrbios endócrinos e nutricionais como anemias. É

também caracterizada pela presença de placas brancas, cuja maioria não são

destacáveis, localizadas a nível de língua, mucosa jugal e palato.

A forma de apresentação clínica apresentada após se converter de comensal a

patógeno, pode incluir a candidíase pseudomembranosa, candidíase eritematosa,

candidíase hiperplásica, assim como lesões associadas ao uso de próteses removíveis,

queilite angular, glossite rombóide mediana, queilite exfoliativa, candidíase

mucocutânea crônica, e pode também estar associada ao eritema gengival linear e a

periodontite necrótica em pacientes infectados pelo HIV, estando estes indivíduos

saudáveis ou não (MOSCA et al., 2005).

Em pacientes imunocomprometidos a candidíase bucal foi a infecção mais

comumente diagnosticada, atingindo 92 % dos casos, e com as manifestações desta

infecção possuindo caráter mais ativos e de controle extremamente difícil (FUENTES,

2005). A infecção oportunista mais freqüente em pacientes com AIDS é a Candida

sendo a espécie mais prevalente a Candida albicans, e a forma de apresentação clínica

mais comum é a pseudomembranosa, localizando-se geralmente na língua, palato duro

e mole e a mucosa jugal (LOPEZ; MARIN, 2001).

A ocorrência destes microrganismos em pessoas saudáveis pode variar de 33%

a 60% (JORGE et al., 1997). Em pacientes que fazem uso de prótese removível, a

ocorrência de alterações na mucosa oral pode chegar a 70% (PILOTO; URRUTIA;

2000), com as lesões mais freqüentemente relacionadas ao uso de prótese são a

candidíase eritematosa (64,1%), a hiperplasia fibrosa (19,2%) e queilite angular

53

(12,1%) (FREITAS, 2004), e que dentre as formas de apresentação clínica mais

comums, a candidíase atrófica crônica é a mais prevalente, sendo esta associada ao

uso de próteses removíveis e quase em sua totalidade acompanhada de queilite

angular (FALCÃO, 2004).

2.4 Classificação dos agentes antifúngicos e mecanismo de ação

Os gentes antimicrobianos possuem uma série de classificação, que variam de

acordo com critérios de estrutura química, mecanismo de ação, espectro de ação entre

outros (SCHAECHTER et al., 2002).

De acordo com o mecanismo de ação, os grupos de agentes antimicrobianos

podem ter sua classificação descrita forma que segue abaixo:

A) Inibidores da síntese da parede celular bacteriana:

Esta ação é tida como seletiva, pois as células dos mamíferos não são

dotadas da parede celular como revestimento (MIMS et al , 1999).

B) Inibidores da Membrana Citoplasmática:

a) Fármacos que desorganizam a membrana citoplasmática- Tirociclinas,

Polimixinas.

b) Fármacos que produzem poros na membrana – Gramicidinas.

c) Fármacos que alteram a estrutura do fungo – Polienos.

d) Fármacos derivados de Imidazol, Cetoconazol, Fluconazol (NEU;

GOOTZ, 2004).

54

C) Inibidores da Síntese de Ácidos Nucléicos:

a) Inibidores do metabolismo de nucleotídeos – Adenosina arabinose e

Aciclovir (vírus), Flucitosina (fungos).

b) Antimicrobianos que prejudicam a função do DNA – Cloroquina

(parasitas).

c) Antimicrobianos que inibem a replicação do DNA – Quinolonas,

Nitroimidazóis.

d) Antimicrobianos que inibem o RNA polimeraze – Rifampicina (NEU;

GOOTZ, 2004).

D) Inibidores da função dos ribossomas:

a) Inibidores da Unidade 30S- Estreptomicina, Canamicina, Gentamicina,

Amicacina, Espectinomicina, Tetraciclinas.

b) Inibidores da Unidade 50S- Cloranfenicol, Clindamicina, Eritromicina,

Ácido fusídico (NEU; GOOTZ, 2004).

E) Inibidores do metabolismo dos folatos:

a) Inibidores da síntese do ácido pteróico – Sulfonamidas.

b) Inibidores da dihidrofolato redutase – Trimetropin (NEU; GOOTZ, 2004).

Os agentes antifúngicos disponíveis para uso atualmente apresentam na sua

grande maioria uma ação fugistática e não fungicida (azóis) como ideal, fato este que

proporciona o surgimento de cepas resistentes, sem contar que são dotados de outras

55

limitações terapêuticas, sobretudo no que se refere a possibilidade do desenvolvimento

de efeitos colaterais como nefrotoxicidade e hepatotoxicidade (FARIAS et al., 2003).

Outro fator refere-se ao ressurgimento de cepas mais resistentes ou mais

adaptadas aos antifúngicos existentes, fazendo com que estabeleça-se uma

necessidade mundial no desenvolvimento de novas pesquisas destinadas a

investigação de agentes antimicrobianos antifúngicos que atuem de forma mais seletiva

contra a célula fúngica, sem contudo interferir em nenhum sistema bioquímico da célula

do hospedeiro (SARTORI, 2005).

As células fúngicas são dotadas de uma revestimento chamado parede celular,

sendo esta essencial para a manutenção da integridade destas células, o que vem com

isso tornar as células fúngicas diferentes das células de mamíferos e servem ainda para

proporcionar um alvo específico para uma possível ação seletiva dos fármacos, que

podem passar a atuar nos sistemas enzimáticos responsáveis pela síntese e montagem

desta parede celular (SELITRENNIKOF, 2001).

Entretanto, existem mais semelhanças do que distinção entre as células fúngicas

e humanas, onde ambas compartilham as mesmas vias do metabolismo intermediário,

fazendo uso de enzimas muito similares, o que torna difícil a obtenção de alvos que

possam oferecer seletividade na ação, de forma a tornar o uso do agente antifúngico

seguro (URBINA et al., 2000).

O princípio do uso da parede celular como alvo para o desenvolvimento de

agentes antifúngicos específicos e não-tóxicos para o hospedeiro é uma prática

recente. A parede celular é um envoltório celular que carrega consigo uma função,

sobretudo de proteção, evitando ruptura osmótica da célula, além do que é essencial

para dar a morfologia, crescimento e viabilidade bioquímica a mesma. O fato de alguns

agentes antifúngicos que atuam na inibição da biosíntese do ergosterol demonstrar boa

seletividade, não os faz menos tóxicos que outros, pois estes podem interferir também

56

em vias comuns de biosíntese de esteróides humanos, tornando-se com isso um

agente de potencial tóxico (URBINA et al., 2000).

Um outro provável caminho para o uso de novos medicamentos, seria então a

utilização de substâncias que interfiram no processo catalítico entre a topoisomerase I e

o DNA, impedindo desta feita o relaxamento do DNA, onde esta estabilização vai

determinar a o surgimento de um processo ainda desconhecido de morte celular

(SARTORI, 2005).

De uma forma mais objetiva, os agentes antifúngicos podem ser classificados em

duas categorias: os que agem diretamente sobre a membrana celular, e os que atuam

intracelularmente, afetando os processos celulares vitais, como síntese de DNA, RNA

ou de proteínas (SCHAECHTER et al., 2002).

Os principais grupos de agentes antifúngicos utilizados são os derivados dos

polienos, dos azólicos e dos alilaminas/tiocarbamatos, onde a inibição do ergosterol é

uma ação similar a todos estes tipos de medicamentos (GEORGOPAPADOKOU;

WALSH, 1994).

Os compostos azólicos (Cetoconazol, itraconazol, fluconazol, clotrimazol) são

compostos sintéticos que atuam no processo da biossíntese do ergosterol no passo de

dimetilação C-14, a qual é uma reação dependente do citocromo P-450.

Já as alilaminas (Terbinafina, naftifina) e os tiocarbamatos (Tolnaftato), atuam

inibindo a enzima esqualeno epoxidade, que em conjunto com oxidoesqualeno ciclase

processam o esqualeno em lanosterol (GROLL; WALSH, 2002).

A 5-flucitosina age atuando no metabolismo das pirimidinas, interferindo no

processo de síntese do DNA/RNA, com sua utilização vinculada a uma associação com

a Anfotericina B (GEORGOPAPADAKOU; WALSH, 1996).

57

58

3 Proposição

O presente trabalho teve como objetivo realizar uma avaliação microbiológica in

vitro dos extratos brutos etanólicos de: Cucurbita pepo, Ramirea marítima, Cayaponia

tayuya, Eucaliptus citriodora, Cuminum cyminum e Copaífera sobre leveduras do

gênero Candida.

Proposição

59

Material e Método

60

4 Material e Método

4.1 Caracterização do estudo:

Estudo in vitro do tipo experimental.

4.2 Material físico:

(anexo 1).

4.3 Material químico-farmacológico:

Álcool etanólico 98%- Solvente (20 litros, USGA- anexo 2).

Nistatina suspensão oral.

Óleo resina de Copaífera (cápsulas 2 unidades- Instituto de Estudo e Pesquisa

do Amapá –IEPA).

Agar Sabouraud Dextrose – meio de cultivo microbiológico (DifcoTM ).

4.4 Material vegetal:

Foram obtidos extratos brutos etanólicos de: Cucurbita pepo (polpa e semente),

Cayaponia tayuya, Remirea marítima, Eucalyptus citriodora, Cuminum cyminum.

As amostras vegetais Cucurbita pepo, Remirea marítima e a Cayaponia tayuya

de foram obtidas entre novembro e dezembro de 2006, as quais foram manipuladas

para obtenção dos extratos em janeiro de 2007. O Eucalyptus citriodora e o Cuminum

cyminum foram obtidos em março de 2007. O óleo resina de Copaífera, foi adquirido

junto ao Instituto de Estudo e Pesquisa do Amapá – IEPA, sob a forma de cápsulas.

Utilizamos por conveniência, para identificar as substâncias em teste, uma

seqüência numérica, a qual correspondeu ao respectivo número no diagrama de

posicionamento dos discos (Tabela 1).

61

Tabela 1: Ordem numérica das substâncias em teste

Numeração Substância em teste

1 Cucurbita pepo – polpa

2 Cucurbita pepo – sementes

3 Cayaponia tayuya

4 Remirea marítima

5 Eucalyptus citrohidora

6 Cuminun cyminum

7 Óleo de copaífera sp

8 Nistatina (controle)

4.5 Método

4.5.1 Obtenção dos extratos etanólicos dos vegetais:

Para todas as amostras vegetais, adotou-se a mesma metodologia na obtenção

dos extratos brutos etanólicos, exceto para o óleo resina de copaíba o qual foi adquirido

em cápsula. A amostra do material vegetal, foi composta de: Cucurbita pepo - Polpa

(Figura 1); Cucurbita pepo - semente seca (Figura 8); Cayaponia tayuya- raiz (Figura

13); Remirea marítima- toda planta (Figura 17); Eucalyptus- folhas (Figura 21);

Cuminum cyminum (Figura 24) e Óleo resina de copaíba (Figura 26);

Para todo material foi utilizado o mesmo solvente, o álcool etanólico (ETHO –

98%). Após a coleta do material vegetal, foi realizada uma desidratação ao sol

(ambiente) exceto a polpa da Cucurbita pepo que foi utilizada in natura. Para o óleo

resina de Copaífera, que foi adquirido em cápsulas, também não foi necessária a

realização desta etapa. Em seguida o material foi triturado em uma forrageira para

fragmentá-los em pedaços pequenos de forma a permitir um maior contato do solvente

com o mesmo (Figuras 3, 10 e 22). Após a trituração o material vegetal foi colocado em

62

um percolador (Figura 10), onde em seguida o solvente foi depositado até cobrir todo o

material, permanecendo por um intervalo de sete dias. Decorrido este período, o

material foi filtrado com papel feltro e um funil o qual ficou apoiado na entrada do

erlenmeyer para a captação do material diluído no solvente (Figura 4).

Apenas para a polpa da Cucurbita não utilizamos o percolador, mais sim dois

erlenmeyers para receber o material triturado e serem recobertos com o solvente, para

posterior filtração (Figura 3).

A eliminação do solvente foi realizada em um rotaevaporador BUCHI 461 Water

Bath (Figura 6) para todas as amostras, seguindo sempre o mesmo protocolo: o

material filtrado foi depositado em um balão de vidro, sempre com um volume

aproximado de 500 mL por vez (Figuras 5, 11, 15 e 19) e aquecido a uma temperatura

de 76º C em banho-maria com movimentação de rotação e contínua, onde ocorreu a

evaporação do álcool, o qual sob vácuo foi jogado para uma serpentina de

resfriamento. Ao resfriar o vapor, o solvente foi armazenado em um outro balão de vidro

localizado abaixo da serpentina (Figura 6).

Após a eliminação do solvente, os extratos brutos eram acumulados no balão

que recebeu a solução filtrada inicialmente e foram depositados em recipientes de vidro

sem a tampa para armazenamento dos respectivos extratos (Figuras 7, 12, 16, 20 e

23). Foram logo em seguida posicionados sobre uma estufa de secagem de vidraria

aquecida a uma temperatura de 62°C para evaporação final do álcool e água residual

por um período contínuo de 3 dias.

4.5.2 Identificação do material vegetal:

As excicatas encontram-se armazenadas no herbárium da Universidade

Potiguar- RN, onde todo material vegetal foi devidamente identificado pela Botânica

desta instituição.

63

4.6 Curcubita pepo (polpa):

Após a trituração, que rendeu 7 kg (Figura 2), o material foi depositado em um

erlenmeyer e recoberto com solvente até que cobrisse sua superfície (Figura 3),

permanecendo por 8 dias. Após este período realizou-se o processo de filtragem

(Figuras 4 e 5) e evaporação do solvente até se obter o extrato bruto (Figuras 6 e 7).

Figura 1. Cucurbita pepo.

Figura 2. Cucurbita pepo após triturada. Figura 3 Cucurbita pepo com solvente.

64

Figura 4. Cucurbita pepo: filtração. Figura 5. Cucurbita pepo: após filtração.

Figura 6. Cucurbita pepo: no evaporador. Figura 7. Cucurbita pepo: após

evaporação.

65

4.7 Cucurbita pepo (semente):

As sementes foram secadas ao sol por um período de 3 dias (Figura 8), e

passadas na forrageira para trituração. A massa triturada (Figura 9), permaneceu por

um período de 6 dias em contato com o solvente (Figura 10), para ser realizada a

filtragem com papel feltro, do material filtrado (Figura 11) foi evaporado o solvente no

rotaevaporador e obtenção do extrato bruto (Figura 12).

Figura 8. C. pepo (semente). Figura 9. C. pepo (semente): triturada.

Figura 10. C. pepo (semente) Figura 11. C.pepo (semente): Figura 12. C. pepo (semente):

no percolador. após filtragem. após evaporada.

66

4.8 Cayaponia tayuya ( raiz):

A raiz após seca por 7 dias ao sol (Figura 13), foi triturada (Figura 14) e o

material foi posteriormente depositado no percolador com solvente permanecendo por

um período de 6 dias para ser realizada então a filtragem em papel feltro, obtendo-se

um líquido marrom âmbar (Figura 15) e eliminação do solvente no rotaevaporador

obtendo um líquido esverdeado escuro (Figura 16).

Figura 13. Cayaponia tayuya. Figura 14. Cayaponia tayuya: triturada.

Figura 15. Cayaponia tayuya: filtrada. Figura 16. Cayaponia tayuya: evaporada.

67

4.9 Remirea marítima:

A Remirea marítima (Figura 17), após a realização de toda a seqüência de

trituração (Figura 18), colocação do solvente, filtragem (Figura 19) e evaporação do

solvente, obtivemos um produto escuro de consistência firme (Figura 20).

Figura 17. Remirea marítima. Figura 18. Remirea marítima: triturada.

Figura 19. Remirea marítima: filtrada. Figura 20. Remirea marítima: evaporada

68

4.10 Eucalyptus:

Foram utilizadas as folhas (Figura 21), as quais após coletadas, foram colocadas

para secar ao sol por 5 dias, e após este período, foram trituradas e depositadas em um

recipiente (Figura 22), o qual recebeu o solvente, permanecendo por 5 dias. Foi filtrado

em seguida e realizada a evaporação do solvente (Figura 23). Obteve-se uma pasta

espessa, de consistência firme, esverdeada e com odor bem característico.

Figura 21. Eucalyptus: reserva florestal.

Figura 22. Eucalyptus: solvente. Figura 23. Eucalyptus: evaporado.

69

4.11 Cuminum cyminum:

O cominho foi obtido de forma não triturada (Figura 24). Em triturador para

temperos, triturou-se o mesmo, o qual ficou em um recipiente lacrado de vidro com o

solvente por 5 dias, quando realizamos o processo de evaporação do solvente (Figura

25). Após a obtenção do extrato, observou-se que o mesmo tinha uma consistência

pastosa e odor bem forte e característico.

Figura 24. Cuminum cyminum Figura 25. Cuminum cyminum- evaporado.

4.12 Óleo Resina de Copaífera:

O Óleo resina de Copaíba foi adquirido no Instituto de Estudo e Pesquisa do Amapá –IEPA, em apresentação comercial de cápsulas (Figura 26).

Figura 26. Óleo de Copaífera: em cápsulas.

70

4.13 Material biológico:

Utilizou-se na presente pesquisa, 06 cepas de microrganismos do gênero

Candida, destas 04 ATCC (American Type Culture Collection), e 03 isoladas da

cavidade bucal, as quais estão descritas abaixo (Figura 27).

4.13.1 Espécies ATCC’s: C.albicans ATCC 76615; C.albicans ATCC 90028;

C.albicans ATCC 13803; C.krusei ATCC 6258.

4.13.2 Espécies de Candida isoladas de cavidade bucal: C. guilermondi LM

02, C.krusei LM 11; C. tropicalis LM 13.

Figura 27. Cepas utilizadas.

Utilizou-se por conveniência uma seqüência alfabética para cada cepa utilizada,

iniciando pela letra “A” até a “G” (Tabela 2), a qual foi marcada no fundo de cada

respectiva placa, onde trabalhou-se em triplicata para cada microrganismo.

A B C D E F G

71

A cepas de Candida foram disponibilizadas e cedidas pelo laboratório de

micologia da Universidade Federal da Paraíba (UFPb), as cepas isoladas de cavidade

oral, foram identificadas neste mesmo laboratório, e mantidas no laboratório de

microbiologia da Universidade Potiguar (UNP-Rn) após a doação, totalizando um

número de sete espécies (Anexo 3).

Tabela 2: Relação da ordem alfabética das cepas de Candida

ORDEM ALFABÉTICA ESPÉCIE DE CANDIDA

A C. albicans ATCC 76615

B C. albicans ATCC 90028*

C C. albicans ATCC 13803

D C. krusei ATCC 6258

E C. guilermondi LM02**

F C. krusei LM11**

G C. tropicalis LM13**

* Espécie que não se desenvolveu, foi excluída da pesquisa. * * Espécies isoladas de cavidade bucal.

4.14 Confecção dos discos de papel feltro:

Os discos de papel foram confeccionados com auxílio de um perfurador de

papel, onde usou-se papel feltro, os quais possuíam um diâmetro de 6 milímetros e uma

espessura de 0,14 milímetros. Posteriormente a sua confecção, foram depositados em

placas de Petri pequenas, perfazendo um total de 220 discos, que foram levados para

autoclave já devidamente embalados (Figura 28).

Figura 28. Discos de papel (20 unidades).

72

4.15 Confecção do diagrama de posicionamento dos discos:

Organizou-se as placas em octantes e duas áreas centrais, passando no fundo

da placa duas linhas com uma caneta de retroprojetor azul, uma vertical e outra

horizontal coincidindo com o centro geométrico da placa formando quatro quadrantes.

Traçamos então uma bissetriz, dividindo cada quadrante ao meio, obtendo 8 espaços,

os quais foram utilizadas cada uma para uma solução distinta e duas áreas centrais

eqüidistantes entre si, como áreas reservas, para que na impossibilidade de utilizar as

áreas de 1 a 8, por contaminação ou mau posicionamento dos discos e extratos,

pudéssemos utilizar as áreas 9 ou 10 (Figura 29).

Transferiu-se o desenho com uma caneta de retroprojetor, do fundo da placa

para uma superfície plástica, flexível e transparente, funcionando como um “molde de

posicionamento” (diagrama), e cada placa após inoculada, foi posicionada sobre este

molde, que definiu a posição para as soluções testadas. O diagrama foi fixado na

bancada de trabalho, e cada placa ao ser manipulada foi posicionada sobre o mesmo,

em uma posição pré-determinada, o que possibilitou durante a leitura dos resultados,

reposicionar as placas da mesma forma que foi colocada para o posicionamento dos

discos, facilitando a identificação da posição dos discos, e por conseguinte, o processo

da leitura visual dos resultados.

Figura 29. Numeração dos octantes e espaços centrais na placa de petri.

1

2

3

4 5

6

7

8

99 910

73

4.16 Marcação da posição dos grupos e faces superior e inferior nas placas:

Com um lápis dermatográfico marcou-se no fundo das placas, antes de se

depositar as soluções, a localização da face superior e inferior de forma aleatória,

sempre uma oposta e eqüidistante a outra, com as respectivas letras “S” e “I”, e

ligeiramente acima da letra “S”, foi feita uma marcação com um risco vertical, de modo

a predeterminar estas posições para deposição das soluções e leitura dos resultados

(Figura 30).

Figura 31. Diagrama de posicionamento

dos discos.

O primeiro espaço à direita e superior do octante superior, recebeu a numeração

01, e seguindo o sentido horário, para os demais subseqüentes 02, 03, 04, 05, 06, 07,e

08, e a numeração 09 para o espaço central à esquerda e 10 para o espaço central à

direita, onde estes dois últimos foram considerados espaços de reserva,. Para todas as

placas e grupos, utilizou-se a mesma numeração (Figura 32).

4.17 Preparo das Placas e meio de cultivo:

4.17.1 Número de placas: 21 placas de 13 cm (03 para cada cepa).

4.17.2 Meio de cultivo: Agar saboraud dextrose 2% (DificoTM).

Figura 30. Marcação do grupo, e posição superior e inferior.

74

O meio foi preparado seguindo as orientações do fabricante, 65 g do mesmo,

pesado em balança de precisão, em 1000 mL de água destilada. Deste volume total,

utilizamos para cada placa 40 mL de água destilada e 2,60g do meio de cultura,

separados individualmente este volume em tubos de ensaio, para que se mantivesse

assim uma espessura uniforme e controlada para todas as placas (Figura 32).

As placas já com os meios de cultivo foram então levadas a uma estufa

bacteriológica por um período de 24 horas a uma temperatura de 37°C (Figuras 33 e

34). Decorrido este período, foi confirmado o teste de esterilidade das mesmas, e em

seguida passou-se para o processo de formação do inóculo.

Figura 32. Ágar fundido. Figura 33. Ágar colocado nas placas. Figura 34. Ágar na estufa por 24 horas.

4.18 Preparo das suspensões Microbianas e inóculo:

As seis cepas de leveduras (Candida) estavam cultivadas em tubos de ensaio

distintos, com meios de cultura agar Sabouraud dextrose 2% DifcoTM. A partir delas

realizou-se então uma nova proliferação das leveduras usando para isso um novo tubo

de ensaio com meio de cultura inclinado, previamente preparado e com o teste de

esterilidade já realizado (Figura 35). Com uma alça aquecida ao rubro sob a chama do

bico de busen, e resfriada em temperatura ambiente, foram coletadas e semeadas as

leveduras do tubo inicial para um novo tubo de ensaio, realizando movimentos em “Z”,

do fundo do tubo para a borda (Figuras 36 e 37). Posteriormente foram lacrados e

levados para a estufa bacteriológica a 37° por 24 horas, de forma que houvesse a

75

proliferação de cada respectiva cepa (Figura 38). Decorrido esse período dentro da

estufa, e de posse das novas culturas (repiques), procedeu-se a formação do inóculo.

Figura 35. Preparo do repique. Figura 36. Remoção das cepas do tubo.

Figura 37. Semeando o repique no tubo com agar. Figura 38. Repique na estufa por 24 horas

Removemos dos repiques com auxílio de uma alça estéril (Figura 39), uma

pequena quantidade de microrganismos os quais foram depositados em tubos contendo

solução salina estéril, agitando-os até que correspondesse com o tubo de número 0,5

da escala de McFarland. Este protocolo foi realizado de forma repetida para cada

espécie de fungo utilizado, obtendo-se assim o inóculo respectivo de cada cepa

(Figuras 40 e 41).

76

Figura 39. Captura do repique. Figura 40. Preparo do inóculo. Figura 41. Escala 0,5 McFarland.

4.19 Semeadura das placas:

4.19.1 Número de repetições das placas:

03 para cada cepa.

4.19.2 Deposição do inóculo nas placas:

Com o auxílio de um swab estéril e base plástica (Prolab), por trás da chama, foi

coletado do tubo que continha o inóculo uma quantidade do mesmo, mergulhando o

swab estéril, saturando o mesmo e removendo o excesso nas paredes laterais internas

do tubo. Semeou-se o inóculo nas placas de Petri, distribuindo-o por toda a extensão da

mesma, com movimentos horizontal, vertical, oblíquo (em Z), como também nas bordas,

o que permitiu um crescimento dos fungos de forma confluente e uniforme por toda a

superfície das placas (Figuras 42, 43 e 44).

Figura 42. Inóculo. Figura 43. Semeadura da placa. Figura 44. Semeadura da placa.

77

4.20 Deposição da substância em teste nas placas semeadas:

4.20.1 Preparo das substâncias:

Para cada substância em teste, foi utilizada uma numeração por conveniência,

de 01 a 08, incluindo a Nistatina (substância controle), seguindo a ordem relacionada

na tabela 1. Os extratos vegetais foram depositados em ependorfs e deixados em

banho-maria por um intervalo de 2 h a uma temperatura de 40° C, cuja finalidade foi de

fluidificar os extratos mais espessos, de maneira que o mesmo obtivesse uma textura

mais favorável para a manipulação. Permanecendo imersos apenas até o terço final, os

ependorfs permaneceram todo o tempo lacrados e apoiado em uma estante específica

no interior do banho Maria durante o processo de pesagem das porções das

substâncias.

Essas serviram para umedecer os discos de papel feltro antes de serem levados

às placas, de forma que obteve-se uma padronização da quantidade individual de

substância para cada disco de papel. Este protocolo foi adotado, pois existia uma

diferença entre as substâncias, onde algumas possuíam uma maior viscosidade que

outras, fato que dificultou a quantificação volumétrica, optando-se assim pela

padronização do peso.

Foram selecionadas 2 lâminas de vidro utilizadas em microscopia ótica para

cada extrato, as quais serviram para deposição sobre estas das porções dos extratos,

que foram pesados em balança analítica, perfazendo o número de onze porções para

cada lâmina, totalizando 22 porções por cada grupo de extrato. O grupo 6, em função

de ser um extrato sem muita viscosidade, foi pesado na balança, mas o mesmo

espalhou-se mais na lâmina, sendo então distribuído em 5 lâminas com as porções

mais eqüidistantes que as demais, com finalidade de as porções não se encontrarem.

78

O grupo 7 e 8 foram pesadas apenas a primeira porção para que pudéssemos

obter o valor em gramas destas, e as demais porções só foram depositadas na lâmina

no momento da impregnação dos discos em função de se tratar de um material com

característica muito fluída (Figuras 45, 46 e 47), obtendo-se uma média por cada gota

depositada, de forma a não passar um intervalo de tempo grande fora dos seus

respectivos recipientes, mantendo-se assim suas características.

Figura 45. Lâminas de vidro. Figura 46. Pesagem dos extratos. Figura 47. Extratos pesados.

Cada lâmina foi posicionada na balança analítica com a extremidade áspera

sempre voltada para baixo e para o lado direito (Figura 48). Com a lâmina nesta

posição, a balança foi “tarada”, e iniciou-se o processo de pesagem das porções dos

extratos, depositando uma quantidade por vez, distribuídas sobre toda a sua extensão.

Sempre após a colocação de uma porção na lâmina e a subseqüente, a balança foi

“tarada” até completar a última porção, que para padronizar a seqüência, criou-se uma

posição específica na placa para cada porção (Figura 49). O peso em gramas das

porções teve uma variação entre 0,0300 e 0,0399.

79

Figura 48. Balança analítica. Figura 49. Seqüência de posição das gotas dos extratos.

Logo após a semeadura do inóculo nas placas, as mesmas permaneceram por

um período de pré-incubação médio de 2:55 h em estufa bacteriológica a 37°. Os

discos de papel feltro estéril, foram saturados com as substância em teste, sendo

depositados nas porções distintas das lâminas que já as continham com auxílio de uma

pinça. Durante este passo, foram separadas para cada tipo de substância um disco de

papel e uma pinça clínica individual.

Tomou-se o cuidado para que durante o uso, cada substância tivesse sempre a

mesma pinça para impregnar o disco de papel feltro de cada grupo, os quais foram

levados até a superfície do meio de cultivo (Figuras 50 e 51). Utilizou-se para esta

etapa, uma pinça anatômica de 14 cm da marca ABC Stainless L75-5, com um total de

8 unidades previamente esterilizadas, uma para cada tipo de substância em teste.

Figura 50. Discos de papel. Figura 51. Impregnação dos discos nos extratos.

1 3 5 7

2 4 6

10

8 9

11

80

As placas já com os discos impregnados, foram levadas para uma estufa

bacteriológica a uma temperatura de 37°C por 24 h (Figuras 52, 53 e 54), onde

respeitou-se as condições nutricionais e temperatura. Somente após um período de 24

realizou-se a primeira leitura, após 48 horas foi realizada a segunda leitura .

Figura 52. Deposição dos Figura 53. Posição dos discos Figura 54. Placas na estufa

discos impregnados na placa. nas placas. 24 horas.

4.21 Aferição dos resultados:

Os halos de inibição (Figuras 55, 56, 57 e 58) foram aferidos de forma visual,

com auxílio de um paquímetro digital (Figuras 59 a 61), sob fonte de iluminação

refletida. Para este procedimento, utilizamos duas medidas perpendiculares entre si,

uma da borda do disco até a borda mais distante do halo de inibição, e uma outra da

borda do disco até a borda mais próxima do halo, somando as duas medidas e

acrescentando o valor do diâmetro do disco de papel, obtendo-se assim, o tamanho

dos halos de inibição. Os valores encontrados foram posteriormente submetidos a

análise estatística .

81

Figura 55. Halos formados. Figura 56. Halos formados. Figura 57. Halos formados.

Figura 58. Halos formados. Figura 59. Aferição maior Figura 60. Aferição menor

diâmetro. diâmetro.

Figura 61. Aferição menor diâmetro. Figura 62. Aferição maior diâmetro.

82

83

4 Resultados

Foi avaliada nesta pesquisa a ação dos extratos brutos etanólicos de Cucurbita

pepo, Remirea marítima, Cayaponia tayuya, Eucalyptus citriodora, Cuminum cyminum e

o óleo resina da Copaífera, sobre as seguintes cepas do gênero Candida: C. albicans

ATCC 76615 (C.A), C. albicans ATCC 13803 (C.C), C. krusei ATCC 6258 (C.D) , C.

guilliermondii LM 02 (C.E), C. krusei LM 11 (C.F) e Candida tropicalis LM 13 (C.G).

Observamos que apenas o extrato bruto etanólico do Eucalipto citriodora e a

Nistatina suspensão oral, mostraram-se efetivos frente a todas as cepas de Candida

utilizadas. Portanto, os testes estatísticos foram empregados para avaliação destas

duas substâncias

Os resultados obtidos na aferição dos halos de inibição para a leitura de 24 e de

48 horas das substâncias testadas, incluindo o controle encontram-se descritos nas

tabelas 3 e 4 respectivamente.

Tabela 3: Media dos halos de inibição na leitura de 24 h. Candida A Candida C Candida D Candida E Candida F Candida G SUBSTÂNCIAS C.pepo- polpa SI SI SI SI SI SI

C.pepo semente SI SI SI SI SI SI Cayaponia tayuya SI SI SI SI SI SI Remirea marítima SI SI SI SI SI SI

84

Eucalyptus citriodora 10,32 13,41 7,93 9,73 9,90 10,52 Cuminum cyminum SI SI SI SI SI SI

Óleo de Copaíba SI SI SI SI SI SI Nistatina 19,07 16,81 15,43 20,99 16,17 18,83

SI= Sem formação de halo de inibição. Resultados expressos em milímetros.

Tabela 4: Media dos halos de inibição na leitura de 48 h. Candida A Candida C Candida D Candida E Candida F Candida G SUBSTÂNCIAS C.pepo- polpa SI SI SI SI SI SI

C.pepo semente SI SI SI SI SI SI Cayaponia tayuya SI SI SI SI SI SI Remirea marítima SI SI SI SI SI SI

Eucalyptus citriodora 8.89 11,69 6,86 8,32 7,83 8,80 Cuminum cyminum SI SI SI SI SI SI

Óleo de Copaíba SI SI SI SI SI SI Nistatina 18,31 12,95 14,51 19,45 14,13 18,09

SI= Sem formação de halo de inibição. Resultados expressos em milímetros.

Para análise dos resultados, foram utilizados o teste de análise de variância

ANOVA dois Critérios, e ANOVA um Critério. Utilizamos também o Teste t Pareado e

como pós-teste, foram utilizados os testes de Bonferroni e Tukey. Todas as análises

foram conduzidas com o nível de significância de 5% com auxílio do Software

GraphPad Prism version 4.00 para Windons, (GraphPad Software, San Diego,

Califórnia, EUA www.graphpad.com).

85

Para avaliar se existe diferença entre o extrato bruto etanólico do Eucaliptus

citriodora e a Nistatina, as cepas de Candida utilizadas e a interação entre elas, foi

utilizada a análise de variância ANOVA dois Critérios.

Observou-se que, tanto para os resultados das aferições feitas em 24 horas

quanto para os de 48 horas, houve diferença estatisticamente significante entre as

variáveis avaliadas (Tabelas 5 e 6).

Tabela 5: Quadro da Análise de Variância dois Critérios para 24 horas. Fonte de variação

Grau de liberdade

Soma dos quadrados

Quadrado médio F

p

Interação 5 51,97 10,39 16,23 p<0,0001 Substância 1 517,5 517,5 808 p<0,0001 Tipo de Cândida 5 61,7 12,34 19,27 p<0,0001 Residual 24 15,37 0,6404

Tabela 6: Quadro da Análise de Variância dois Critérios para 48 horas. Fonte de variação

Grau de liberdade

Soma dos quadrados

Quadrado médio F

p

Interação 5 90,76 18,15 19,56 p<0,0001 Substância 1 503 503 542,1 p<0,0001 Cândida 5 55,87 11,17 12,04 p<0,0001 Residual 24 22,27 0,9278

Para identificação da diferença apontada no teste ANOVA Dois critérios foi

realizado o pós-teste de Bonferroni (Índice de Confiabilidade de 95%). Observou-se

que, para a leitura da medida dos halos em 24 horas, houve uma diferença

estatisticamente significante nas respostas das substâncias testadas para todas as

cepas de Candida avaliadas (p< 0,001), conforme mostra tabela 7.

86

Tabela 7: Média dos halos de inibição em mm no intervalo de 24 horas, e respectivas diferenças estatísticas em função das substâncias em teste. Eucalipto citriodora Nistatina

C. albicans ATCC 13803 13,41 A a 16,81 B b c

C. tropicalis LM 13 10,52 A b 18,83 B a b

C. albicans ATCC 76615 10,32 A b 19,07 B a

C. krusei LM 11 9,90 A b c 16,17 B c

C. guilliermondii LM 02 9,73 A b c 20,99 B a

C. krusei ATCC 6258 7,93 A c 15,43 B c

Letras maiúsculas na comparação entre colunas e minúsculas na comparação entre linhas. As médias seguidas por letras distintas diferem entre si a nível de 5% de significância.

Na avaliação de 48 horas observou-se que houve diferença estatisticamente

significante (p< 0,001) para as cepas C. albicans ATCC 76615, C. albicans ATCC

13803, C. guilliermondii LM 02, C. krusei LM 11 e C. tropicalis LM 13. Para a cepa C.

albicans ATCC 13803, observamos que houve uma diferença estatisticamente

significante (p> 0,05), conforme constam os dados da tabela 8.

Tabela 8: Média dos halos de inibição em mm no intervalo de 48 horas, e respectivas diferenças estatísticas em função das substâncias em teste. Eucalipto citriodora Nistatina

C. albicans ATCC 13803 11,69 B a 12,95 B a

C. albicans ATCC 76615 8,89 A b 18,31 B b

C. tropicalis LM 13 8,80 A b 18,09 B b

C. guilliermondii LM 02 8,32 A b 19,45 B b

C. krusei LM 11 7,83 A b 14,13 B c

C. krusei ATCC 6258 6,86 A b 14,51 B c

Letras maiúsculas na comparação entre colunas e minúsculas na comparação entre linhas. As médias seguidas por letras distintas diferem entre si a nível de 5% de significância.

87

Para fazer uma análise da ação do extrato bruto do Eucalyptus citriodora e da

ação da Nistatina entre as cepas estudadas, utilizou-se a análise de variância ANOVA

um Critério. Observou-se que, tanto para o extrato bruto etanólico do Eucalyptus

citriodora quanto a Nistatina houve diferença estatisticamente significante (p<0,001),

conforme mostra a tabela 9, 10, 11 e 12.

Tabela 9: Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para o extrato bruto do Eucalyptus citriodora em 24 horas.

Fonte da Variação Soma dos quadrados

Grau de liberdade

Quadrado Médio

p

Tratamento (entre colunas) 47,52 5 9,503 p<0,0001 Resíduo (entre colunas) 7,767 12 0,6472 Total 55,28 17

Tabela 10: Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para o extrato bruto do Eucalyptus citriodora em 48 horas.

Fonte da Variação Soma dos quadrados

Grau de liberdade

Quadrado Médio

p

Tratamento (entre colunas) 37,69 5 7,538 p<0,0016 Resíduo (entre colunas) 11,28 12 0,9399 Total 48,97 17

Tabela 11: Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para a Nistatina em 24 horas.

Fonte da Variação Soma dos quadrados

Grau de liberdade

Quadrado Médio

p

Tratamento (entre colunas) 66,15 5 13,23 p<0,0001 Resíduo (entre colunas) 7,604 12 0,6337 Total 73,75 17

Tabela 12: Quadro para análise de variância ANOVA um Critério para a Nistatina em 48 horas. Fonte da Variação Soma dos Grau de Quadrado p

88

quadrados liberdade Médio Tratamento (entre colunas) 108,9 5 21,79 p<0,0001 Resíduo (entre colunas) 10,99 12 0,9158 Total 119,9 17

Para identificação da diferença entre a ação das substâncias avaliadas sobre as

6 cepas de Candida, utilizou-se o pós-teste de Tukey.

Os resultados da análise realizada em 24 horas para o extrato bruto do

Eucalyptus citriodora na leitura de 24 horas, mostraram diferenças estatisticamente

significante em relação as cepas de C. albicans ATCC 76615 e C. albicans ATCC

13803, entre a C. albicans ATCC 76615 e C. krusei ATCC 6258, conforme mostra a

tabela 7.

Na leitura de 48 horas para esta mesma substância, observou-se que ocorreu

diferenças estatisticamente significante entre as cepas de C. albicans ATCC 13803 e

todas as outras. Entre as seguintes cepas: C. albicans ATCC 76615, C. krusei ATCC

6258, C. guilliermondii LM 02, C. krusei LM 11 e C. tropicalis LM 13, houve um

comportamento semelhante do extrato etanólico do Eucalyptus citriodora, não

apresentando diferença estatisticamente significante (Tabela 8).

Avaliando a ação da Nistatina no intervalo inicial de aferição dos halos em 24

horas sobre as cepas utilizadas, observou-se que houve diferença estatisticamente

significante entre as cepas de C. albicans ATCC 13803 e todas as demais utilizadas.

Mostrou também que entre a cepa de C. tropicalis LM 13 e as duas cepas de C. krusei

(LM 11 e ATCC 6258) esta diferença também foi observada. Entre as cepas de C.

tropicalis LM 13, C. albicans ATCC 76615 e C. guilliermondii LM 02, não houve

diferença estatisticamente significante frente a ação desta substância, conforme mostra

a tabela 7.

A ação da Nistatina no intervalo de 48 horas sobre as cepas de Candida, quando

analisado, mostrou que a C. albicans ATCC 13803 apresentou diferença

89

estatisticamente significante entre as demais cepas. Ficou evidenciado também que a

ação da Nistatina sobre as cepas de C. albicans ATCC 76615, C. tropicalis LM 13 e

C. guilliermondii LM 02 não apresentou diferença estatisticamente significante, bem

com entre as cepas de C. krusei LM 11 e a C. krusei ATCC 6258 (Tabela 8).

Foi realizada também uma comparação da ação de cada substância (extrato

bruto etanólico do Eucalyptus citriodora e Nistatina) separadamente para cada cepa de

Candida utilizada, relacionando os dois intervalos de aferição dos diâmetros dos halos

de inibição de 24 e 48 horas, empregando o Teste t Pareado.

Observou-se neste teste que, a ação do extrato bruto etanólico de Eucalipto

citriodora mostrou diferença estatisticamente significante, quando comparou-se a média

do diâmetro dos halos de inibição entre os intervalos de 24 e 48 horas para a C.

albicans ATCC 76615, C. krusei LM 11 e a C. tropicalis LM 13. Para as cepas de C.

albicans ATCC 13803, C. krusei ATCC 6258 e C. guilliermondii LM 02 não foram

observadas diferenças estatisticamente significante (Gráfico 1).

02468

101214

Val

ores

em

milí

met

ros

24 horas 48 horas

Gráfico 1 : Média dos diâmetros dos halos de inibição do Eucalipto citriodora em 24 e 48 horas.

Candida albicansATCC 76615Candida albicansATCC13803Candida krusei ATCC6258Candida guiliermondiiLM 02Candida kruesi LM 11

Candida tropicalisLM13

90

Para a Nistatina, foi observado que houve diferença estatisticamente significante

para as cepas C. albicans ATCC 13803, C. guilliermondii LM 02 e C. tropicalis LM 13

entre os intervalos de aferição dos diâmetros médio dos halos de inibição de 24 e 48

horas. Dentro deste mesmo intervalo de aferição dos halos, a ação da nistatina não

apresentou diferença estatisticamente significante para a C. albicans ATCC 76615, C.

krusei ATCC 6258 e para a C. krusei LM 11 (Grafico 2).

0

5

10

15

20

25

Val

ores

em

milí

met

ros

24 horas 48 horas

Gráfico 2 : Média dos diâmetros dos halos de inibição da Nistatina em 24 e 48 horas.

Candida albicans ATCC76615Candida albicans ATCC13803Candida krusei ATCC6258Candida guiliermondiiLM 02Candida krusei LM 11

Candida tropicalis LM13

91

92

6 Discussão

A candidíase representa a infecção fúngica mais comum na cavidade oral. Esta

patologia é causada por um grupo de fungos do gênero Candida, que está presente na

microbiota oral da maioria dos indivíduos (URIZAR, 2002). Em condições de

normalidade, a presença desses fungos na cavidade oral é caracterizada por uma

condição de comensalismo, entretanto, para que ocorra um processo patológico é

necessário que o equilíbrio mantido entre o fungo e o hospedeiro seja quebrado

(MOREIRA et al., 2001; SCHERMA et al., 2004).

A quebra deste equilíbrio pode ocorrer em decorrência de deficiências

imunológicas associadas a patologias como AIDS e tumores malignos, distúrbios

endócrinos como a diabetes e uso prolongado de drogas imunossupressoras como

corticóides e antibióticos (FUENTES, 2005). Mas um fator que chama atenção na

clínica odontológica é que observa-se uma elevada prevalência desta infecção em

indivíduos imunocompetentes que apresentam fatores locais que favoreçam o

crescimento da Candida, como é o caso de usuários de próteses removíveis. Ao

realizarmos um exame oral em usuários de próteses removíveis, totais ou parciais, não

é surpresa identificar sob as mesmas, áreas avermelhadas desenhando no palato ou

rebordo do paciente a impressão da prótese (PEREIRA et al., 2004).

O tratamento de rotina para a candidíase oral é realizado com antifúngicos, como

a Nistatina, Cetoconazol, Itraconazol, Fluconazol e Clotrimazol entre outros. Esses

Discussão

93

medicamentos têm ação fungistática já bem comprovada, podendo ser utilizados nas

formas tópica e sistêmica (GROLL; WALSH, 2002).

Observa-se que estes medicamentos apresentam efeitos adversos indesejados

como nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, náuseas, vômitos, diarréia, e sensação de

gosto amargos na boca. Um outro efeito indesejado já observado é a resistência

desenvolvida por algumas cepas da Candida a estes agentes terapêuticos. Este fato,

em muitos casos, dificultar o tratamento e leva o indivíduo a fazer a candidíase de

repetição (FARIAS et al., 2003).

A observação na clínica diária da odontologia da elevada prevalência da

candidíase oral, associada à leitura de trabalhos existentes na literatura no que se

refere às dificuldades observadas no tratamento de alguns casos desta infecção com a

utilização da terapêutica convencional (SMÂNIA, 2003; GRÉGIO et al., 2006), nos

direcionaram a buscar de novas formas terapêuticas para esta infecção.

Sabe-se que dentre as espécies de Candida, a albicans é a mais prevalente na

mucosa oral, estando, por conseguinte, mais relacionada com os quadros dessa

infecção na boca. Outras espécies, entretanto, também têm sido associadas a esta

infecção, onde destacam-se a Candida krusey, Candida tropicalis e Candida

guilliermondii (GRÉGIO et al., 2006), fato este que justifica as cepas escolhidas para

realização desta pesquisa.

Selecionamos, além das cepas certificadas (ATCCs), cepas isolados da cavidade

oral, afim de podermos avaliar, também, a possibilidade da existência de diferenças na

virulência das mesmas, ou mesmo diferentes respostas frente a ação de agentes

terapêuticos.

A metodologia utilizada nesta pesquisa foi a recomendada pelo National

Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2002), a qual foi baseada na

utilização de difusão com discos de papel em meio de cultura sólido a base de Agar

94

sabouraud, e na padronização do inóculo, assegurando assim os resultados,

diminuindo a possibilidade de falhas (TRUJILLO, 2002).

A utilização de fitoterápicos para o tratamento das diversas patologias que

afetam o homem tem crescido de forma crescente nos últimos anos. A busca de

substâncias naturais, de baixo custo financeiro e com menos efeitos adversos, tem

levado a um número crescente de pesquisas nesta área (CALIXTO, 2000;

RODRIGUES, 2005).

No Brasil especialmente, onde a biodiversidade é especialmente rica, existe um

amplo conhecimento popular sobre plantas medicinais, tem se observado várias

pesquisas utilizando estas substâncias na área médica e odontológica (MARQUES,

2002).

É a partir da percepção das propriedades terapêuticas dos vegetais que, o

estudo de seus constituintes, acabam propiciando o isolamento de seus componentes,

fornecendo subsídios para o entendimento geral da ação biológica dos vegetais

(VASCONÇELOS et al., 2002).

Os estudos associando a fitoterapia e sua utilização frente a microrganismos

patogênicos da cavidade bucal, tem sido fonte de recentes pesquisas, porém ainda de

forma muito discreta (BUFFON, et al., 2001; KOO, et al., 2002; PAIXÃO, et al., 2002;

COUTINHO, et al., 2004; BRITO; LIMA; ARAÚJO; 2006; FERNANDES JÚNIOR, et al.,

2006), muito embora o uso de fitoterápicos pelas civilizações como fonte de tratamento

contra patologias seja tão antigo quanto a humanidade, o qual foi evoluindo durante o

processo adaptativo do homem que se beneficiava desta utilização (NOVAIS et al.,

2003).

No presente estudo, testamos a ação in vitro de extratos etanólicos de Cucurbita

pepo, Remirea marítima, Cayaponia tayuya, Eucalyptus citriodora, Cuminum cyminum e

o óleo resina da Copaífera, sobre cepas do gênero Candida: C. albicans ATCC 76615,

95

C. albicans ATCC 13803, C. krusei ATCC 6258, C. guilliermondii LM 02, C. krusei LM

11 e Candida tropicalis LM 13.

A escolha destas substâncias foi baseada na medicina popular, como no caso da

Cucurbita pepo e o óleo resina da Copaífera por exemplo, utilizadas frente a

microrganismos. Utilizamos como controle, a Nistatina, que é um medicamento

amplamente utilizado no tratamento da candidíase.

Os extratos etanólicos foram preparados dentro de uma mesma metodologia,

onde após maceradas, as amostras vegetais permaneceram imersas e sob ação do

solvente (álcool etanólico 98%) por um período de 7 dias. Eliminou-se o solvente com

auxílio do rotaevaporador com pressão reduzida, que ao final do processo obtivemos os

extratos brutos etanólicos.

Esta pesquisa avaliou o diâmetro dos halos de inibição formados nas placas de

cultura com as cepas de Candida, frente a ação dos extratos nos intervalos de leitura

de 24 e 48 horas. Observamos que, para as substâncias obtidas da Cucurbita pepo,

Remirea marítima, Cayaponia tayuya, Cuminum cyminum e o óleo resina da Copaífera,

não houve inibição do crescimento fúngico para ambos os intervalos de tempo

avaliados.

Apesar de não ter sido observada ação antifúngica nestas substâncias, achamos

interessante ressaltar que o potencial antimicrobiano de vegetais, não estar em todos

os casos relacionada exclusivamente a uma única substância derivada deste, mas sim

a uma interação entre várias substâncias oriundas dos vegetais, desencadeando, em

conjunto, a ação antimicrobiana (CUNHA, 2006). Além disso, e também reconhecido

que os composto presentes em menor proporção na planta, são os que apresentam

geralmente os melhores efeitos biológicos (MOURA, 2006).

O fato de não termos observado inibição das cepas fúngicas pelos extratos

brutos etanólicos de Cucurbita pepo, Cuminum cyminum, Cayaponia tayuya e

96

Copaífera, não significa que os mesmos sejam ineficientes frente a cepas de Candida

testadas, porque os extratos podem apresentar diferentes propriedades de solubilidade

e difusibilidade. Sabe-se que os extratos que possuem maior solubilidade em água,

tende a apresentar uma maior eficiência no teste de difusão em Agar, sem contar que,

o peso molecular da substância pode dificultar a difusão no meio de cultura (REIS,

2006).

Foi o que observou-se, por exemplo, com a Copaíba que, apesar de ter

demonstrado ação frente o Streptococcus mutans (VEIGA JÚNIOR; PINTO, 2002) e de

conter dentre seus componentes o óleo de cariofileno, que tem efeito germicida, não

mostrou efetividade contra a Candida, como mostraram os resultados deste estudo.

Resultados semelhantes foram observados por PACKER; da LUZ (2007).

Em virtude de termos observado ação antifúngica apenas no extrato bruto

etanólico do Eucalyptus citriodora e a Nistatina, a discussão dos resultados estatísticos

serão fundamentados apenas nestas duas substâncias.

Ao analisarmos a ação da Nistatina e do extrato bruto etanólico do Eucalyptus

citriodora frente as cepas de Candida utilizadas, observamos que ocorreu uma

diferença estatisticamente significante entre a ação das substâncias, as cepas e a

interação entre elas (ANOVA dois Critérios). Após aplicação do pós-teste de Bonferroni,

identificou que esta diferença foi verificada para as seis cepas na avaliação feita em 24

horas. Este achado indica que a intensidade de ação do extrato bruto etanólico do

Eucaliptus citriodora é diferente da intensidade observada para a Nistatina, uma vez

que as medidas dos halos de inibição apontaram diferença estatística, com as maiores

medidas sempre presentes na Nistatina. Ou seja, apesar da substância controle e do

extrato bruto etanólico do Eucaliptus citriodora apresentar ação efetiva sobre as cepas,

os resultados mostraram uma ação mais efetiva da Nistatina.

Resultados semelhantes foram observados para as leituras de 48 horas,

ressaltando-se que a Candida albicans ATCC 13803 mostrou uma diferença

97

estatisticamente não significante para as duas substâncias. Este ocorrência pode ser

justificada provavelmente em função da cepa que se mostrou mais resistente na

avaliação de 48 horas. Outra explicação possível seria o fato desta Candida possuir um

mecanismo de adaptação à Nistatina desenvolvido, proporcionando uma menor

sensibilidade a este agente, com formação dos menores diâmetros dos halos de

inibição nesta leitura.

Para o extrato bruto etanólico do Eucalipto citriodora, entretanto, foi esta cepa de

C. albicans ATCC 13803 que se mostrou menos resistente, formando halos de inibição

com os maiores diâmetros quando comparados com as demais cepas. Este fato pode

sugerir que, mesmo substâncias alternativas como as de origem vegetal podem

apresentar características diferentes entre microrganismos semelhantes, o que vem

corroborar com o Ribeiro (2004), quando se refere as características de colônias e aos

antígenos de superfície interferindo no mecanismo de resposta às drogas utilizadas

como antifúngicos.

Na avaliação da ação do extrato bruto do Eucaliptus citriodora sobre as cepas de

fungo aqui testadas, no tempo de 24 horas foi identificada uma diferença estaticamente

significante quando comparamos a ação entre a C. albicans ATCC 76615 e C. albicans

ATCC 13803 e C. Krusei ATCC 6258; entre C. albicans ATCC 13803 e Candida Krusei

ATCC 6258; e entre Candida Krusei ATCC 6258 e C. tropicalis. Resultados

semelhantes foram observados para análise de 48 horas.

Esta observação mostra que houve diferença significante entre a ação de

algumas cepas de ATCC´s, mas não observou-se esta diferença entre os fungos

isolados de cavidade oral. Salienta-se, entretanto que os halos das espécies não-

albicans sempre foram menores quando comparados com os halos de inibição das

espécies de Candida albicans.

Na comparação da ação das substâncias em relação aos dois intervalos de

tempo estudados foi observado que a formação de halos de inibição nas aferições de

98

24 horas foi sempre maior do que nas aferições de 48 horas, independente do tipo de

Candida e do tipo de substância utilizada para o teste in vitro.

Podemos considerar aqui a possibilidade de que, tanto o extrato bruto etanólico

do Eucalipto citriodora quanto a Nistatina, podem apresentar características físico-

químicas próprias que interfiram na manutenção da efetividade da ação antifúngica.

Este fato promoveria uma diminuição da sua potência, especificidade, interação com o

meio de cultivo microbiológico ou até mesmo, a solubilidade da substância e sua

propriedade de difusibilidade, possam promover esta diminuição da ação.

Em contrapartida, vale salientar que, em confronto com uma provável diminuição

na efetividade das substâncias, as colônias fúngicas durante os testes in vitro, estão em

processo de crescimento e desenvolvimento contínuo, utilizando um meio de cultivo

extremamente favorável sob o ponto de vista nutricional. Acreditamos que isto justifique

o fato de obtermos nas leituras de 48 horas, halos de inibição presentes, contudo com

valores menores do que os obtidos nas leituras de 24 horas.

Nossos resultados mostraram que o extrato bruto de Eucalyptus citriodora

apresentaram uma resposta efetiva no que se refere a inibição das cepas de C.

albicans ATCC 76615, C. albicans ATCC 13803, C. krusei ATCC 6258, C.

guilliermondii LM 02, C. krusei LM 11 e Candida tropicalis LM 13, aqui estudadas. Esses

achados corroboram com os observados por NAKASHIMA, BOLLER (2005), mesmo

tendo avaliado a ação de uma outra espécie de eucalipto, o Eucalyptus cinerea, e sob a

forma de óleo essencial.

Em um estudo realizado por Lima et al. (2006), o Eucalyptus citriodora, sob

forma de óleo essencial, não obteve o mesmo resultado do observado nesta pesquisa,

mostrando-se ineficaz frente a levedura do gênero Candida albicans ATCC 76615 e

Candida tropicalis, porém apresentou formação de halos de inibição frente a cepas de

Candida guilliermondii, krusei, parapsilosis e stelatoideia.

99

Por se tratar de formas diferentes de produtos, o extrato etanólico e o óleo

essencial, não seriam incomum obter resultados distintos de um mesmo vegetal,

alterando-se apenas a metodologia da obtenção dos produtos destes, na forma de

extratos aquoso e etanólico ou óleo essencial, frente a um mesmo microrganismo

(SCHUK et al., 2001). Esta não padronização entre os testes biológicos tende a

dificultar a elucidação das propriedades de bioatividade de compostos, sobretudo de

óleos essenciais, bem como a comparação entre eles (NASCIMENTO et al., 2007). Um

outro fator que pode interferir nos resultados é a época, local e período de coleta da

planta, fazendo com que exista uma variação na concentração dos seus constituintes

(COELHO et al., 2003).

Apesar de termos encontrado resultados positivos para o extrato bruto do

Eucalyptus citriodora, observamos que a média dos diâmetros dos halos de inibição, na

maioria dos casos, foi maior com a Nistatina. Entretanto, esta observação não

inviabiliza outras pesquisas, envolvendo este fitoterápico, utilizando-se de outras

metodologias ou até mesmos outras espécies da mesma família.

O presente estudo tem se apoiado na justificativa de que antes de se chegar a

um composto puro e isolado de determinado vegetal, é indispensável que sejam feitos

estudos in vitro com os extratos brutos destes para que os mesmos possam assegurar

ou não a atividade antimicrobiana, e só posteriormente a esta etapa pesquisas mais

aprofundadas sejam elaboradas, com o propósito se identificar substâncias isoladas e

possíveis mecanismos de ação destas, para que assim a maior efetividade do agente

seja explorada com um nível de efeito colateral ou toxicidade reduzido.

Além disso, pesquisas envolvendo novos fármacos de origem vegetal

possibilitam uma redução no custo do tratamento convencional, sobretudo para uma

população carente, e também, poderiam proporcionar junto as indústrias farmacêuticas,

o desenvolvimento de moléculas cujas ações seriam trabalhadas no sentido de

aumentar sua potencialidade sem aumentar o possível efeito tóxico ou colateral

indesejado a qualquer fármaco.

100

Conclusão

101

7 Conclusão Em função da análise dos resultados obtidos, concluímos que:

• Dos extratos aqui avaliados, apenas o extrato bruto etanólico do Eucalipto

citriodora, apresentou ação frente a todos as espécies de Candida utilizadas,

podendo ser uma boa alternativa no controle de infecções por este fungo.

• As demais substâncias em teste não obtiveram resultados positivos, exceto o

extrato de Cuminum cyminum, que apresentou-se efetivo frente apenas uma

espécie de Candida, o que sugere a necessidade de estudos mais

aprofundados, no intuito de se identificar quais ou qual substância isolada é a

responsável por esta ação, e se o composto isolado tem ação mais ou menos

eficiente do que sua forma em conjunto no extrato bruto.

• A nistatina mostrou-se eficaz frente a todas as cepas de Candida, servido como

um excelente parâmetro de comparação entre esta e os extratos utilizados.

102

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YUNES, R. A.; PEDROSA, R. C.; CECHINEL FILHO, V. Fármacos e fitoterápicos: A necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no Brasil. Quim. Nova. v. 24, n. 1, p.147-52, 2001. ZACCHINO, S. A.; SANTECCHIA, C.; LOPEZ, S.; GATTUSO, S.; MUNOZ, J.; CRUANES, A.; VIVOT, E.; CRUANES, M.; SALINAS, A.; RUIZ, R.; RUIZ, S. In vitro antifungal evaluation and studies on the mode of action of eight selected from the argentine flora. Phytomedicine, v. 5, p. 389-95, 1998.

ZANGERL, A. R.; BERENBAUM M. R. Genetic variation in primary metabolites of Pastinaca sativa; can herbivores act as selective agents?. J. Chem. Ecol., v. 30, p. 1985-2002, 2004.

119

Anexo 1

Material físico:

Autoclave (Dabi-Atlante)

Balança Analítica Digital (Marca: SHIMADZU AY 220)

Banho-maria (Delta MC 220)

Bastões de vidro 30x08 cm (5 unidades)

Estufa de secagem com renovação e circulação de ar (Marca e modelo)

Evaporador com pressão reduzida (BUCHI 461)

Paquímetro digital (Starret 727-6/150)

Caneta retroprojetor preta- Faber Castel.

Lápis dermatográfico (Marking Graph- Tombow 2285)

Lâminas de vidro para microscopia (25 unidades)

Laboratório de microbiologia da Universidade Potiguar

Perfurador de papel

Agar Sabouraud Dextrose – DifcoTM

Discos de papel feltro com 6 mm de diâmetro (168 unidades)

Placa de Petri 13 mm (21 unidades)

Funil plástico

Papel feltro (para confecção dos discos (Brigitta- Filtros de papel)

Pinça clínica ABC Stainless L75-5 (6 unidades)

Placa de petri de13 cm (21 unidades)

120

Anexo 2

Laudo Técnico do solvente:

121

Anexo 3 Termo de doação do material biológico.

122

Anexo 4

Table Analyzed Candida x Substância (24h)

Análise de Variância ANOVA Dois Critérios Source of Variation % of total variation P value Interaction 8,04 P<0.0001 Substância 80,04 P<0.0001 Tipo de Cândida 9,54 P<0.0001 Source of Variation P value summary Significant? Interaction *** Yes Substância *** Yes Tipo de Cândida *** Yes

Source of Variation Df Sum-of-squares Mean square F Interaction 5 51,97 10,39 16,23 Substância 1 517,5 517,5 808 Tipo de Cândida 5 61,7 12,34 19,27 Residual 24 15,37 0,6404

Number of missing values 0 Bonferroni posttests Substância 5 vs. Substânia 8 Tipo de Cândida Substância 5 Substânia 8 Difference 95% CI of diff. A 10,33 19,07 8,743 6.865 to 10.62 C 13,41 16,82 3,403 1.525 to 5.282 D 7,93 15,43 7,503 5.625 to 9.382 E 9,73 21 11,27 9.388 to 13.15 F 9,907 16,18 6,27 4.391 to 8.149 G 10,52 18,83 8,31 6.431 to 10.19

Tipo de Cândida Difference t P value Summary A 8,743 13,38 P<0.001 *** C 3,403 5,208 P<0.001 *** D 7,503 11,48 P<0.001 *** E 11,27 17,24 P<0.001 *** F 6,27 9,596 P<0.001 *** G 8,31 12,72 P<0.001 ***

123

Anexo 5

Number of missing values 0 Bonferroni posttests Substância 5 vs. Substância 8 Cândida Substância 5 Substância 8 Difference 95% CI of diff. A 8,89 18,32 9,427 7.165 to 11.69 C 11,69 12,95 1,257 -1.005 to 3.518 D 7,06 14,51 7,453 5.192 to 9.715 E 8,323 19,46 11,13 8.872 to 13.39 F 7,833 14,14 6,303 4.042 to 8.565 G 8,807 18,09 9,283 7.022 to 11.54 Cândida Difference t P value Summary A 9,427 11,99 P<0.001 *** C 1,257 1,598 P > 0.05 ns D 7,453 9,477 P<0.001 *** E 11,13 14,16 P<0.001 *** F 6,303 8,015 P<0.001 *** G 9,283 11,8 P<0.001 ***

Table Analyzed Candida x Substância (48h)

Análise de Variância ANOVA Dois Critérios Source of Variation % of total variation P value Interaction 13,51 P<0.0001 Substância 74,86 P<0.0001 Cândida 8,31 P<0.0001 Source of Variation P value summary Significant? Interaction *** Yes Substância *** Yes Cândida *** Yes

Source of Variation Df Sum-of-squares Mean square F Interaction 5 90,76 18,15 19,56 Substância 1 503 503 542,1 Cândida 5 55,87 11,17 12,04 Residual 24 22,27 0,9278

124

Anexo 6

Parameter Value Table Analyzed Subs 5 / 24h Análise de Variância ANOVA Um Critérios P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 6 F 14,68 R squared 0,8595

ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 47,52 5 9,503 Residual (within columns) 7,767 12 0,6472 Total 55,28 17

Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff A vs C -3,087 6,645 P < 0.01 -5.293 to -0.8799 A vs D 2,397 5,16 P < 0.05 0.1899 to 4.603 A vs E 0,5967 1,285 P > 0.05 -1.610 to 2.803 A vs F 0,42 0,9042 P > 0.05 -1.787 to 2.627 A vs G -0,1933 0,4162 P > 0.05 -2.400 to 2.013 C vs D 5,483 11,81 P < 0.001 3.277 to 7.690 C vs E 3,683 7,93 P < 0.01 1.477 to 5.890 C vs F 3,507 7,55 P < 0.01 1.300 to 5.713 C vs G 2,893 6,229 P < 0.01 0.6866 to 5.100 D vs E -1,8 3,875 P > 0.05 -4.007 to 0.4068 D vs F -1,977 4,256 P > 0.05 -4.183 to 0.2301 D vs G -2,59 5,576 P < 0.05 -4.797 to -0.3832 E vs F -0,1767 0,3804 P > 0.05 -2.383 to 2.030 E vs G -0,79 1,701 P > 0.05 -2.997 to 1.417 F vs G -0,6133 1,32 P > 0.05 -2.820 to 1.593

125

Anexo 7

Parameter Value Table Analyzed Subs 8 / 24h Análise de Variância ANOVA Um Critérios P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 6 F 20,88 R squared 0,8969

ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 66,15 5 13,23 Residual (within columns) 7,604 12 0,6337 Total 73,75 17

Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff A vs C 2,253 4,903 P < 0.05 0.06984 to 4.437 A vs D 3,637 7,913 P < 0.01 1.453 to 5.820 A vs E -1,927 4,192 P > 0.05 -4.110 to 0.2568 A vs F 2,893 6,296 P < 0.01 0.7098 to 5.077 A vs G 0,24 0,5222 P > 0.05 -1.943 to 2.423 C vs D 1,383 3,01 P > 0.05 -0.8002 to 3.567 C vs E -4,18 9,095 P < 0.001 -6.363 to -1.997 C vs F 0,64 1,393 P > 0.05 -1.543 to 2.823 C vs G -2,013 4,381 P > 0.05 -4.197 to 0.1702 D vs E -5,563 12,11 P < 0.001 -7.747 to -3.380 D vs F -0,7433 1,617 P > 0.05 -2.927 to 1.440 D vs G -3,397 7,391 P < 0.01 -5.580 to -1.213 E vs F 4,82 10,49 P < 0.001 2.637 to 7.003 E vs G 2,167 4,714 P > 0.05 -0.01682 to 4.350 F vs G -2,653 5,773 P < 0.05 -4.837 to -0.4698

126

Anexo 8

Parameter Value Table Analyzed Subs 5 / 48h Análise de Variância ANOVA Um Critérios P value 0,0016 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 6 F 8,019 R squared 0,7697

ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 37,69 5 7,538 Residual (within columns) 11,28 12 0,9399 Total 48,97 17

Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff A vs C -2,803 5,008 P < 0.05 -5.463 to -0.1440 A vs D 1,83 3,269 P > 0.05 -0.8293 to 4.489 A vs E 0,5667 1,012 P > 0.05 -2.093 to 3.226 A vs F 1,057 1,888 P > 0.05 -1.603 to 3.716 A vs G 0,08333 0,1489 P > 0.05 -2.576 to 2.743 C vs D 4,633 8,278 P < 0.001 1.974 to 7.293 C vs E 3,37 6,021 P < 0.05 0.7107 to 6.029 C vs F 3,86 6,896 P < 0.01 1.201 to 6.519 C vs G 2,887 5,157 P < 0.05 0.2274 to 5.546 D vs E -1,263 2,257 P > 0.05 -3.923 to 1.396 D vs F -0,7733 1,382 P > 0.05 -3.433 to 1.886 D vs G -1,747 3,121 P > 0.05 -4.406 to 0.9126 E vs F 0,49 0,8754 P > 0.05 -2.169 to 3.149 E vs G -0,4833 0,8635 P > 0.05 -3.143 to 2.176 F vs G -0,9733 1,739 P > 0.05 -3.633 to 1.686

127

Anexo 9

Parameter Value Table Analyzed Subs 8 / 48h Análise de Variância ANOVA Um Critérios P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 6 F 23,79 R squared 0,9084 ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 108,9 5 21,79 Residual (within columns) 10,99 12 0,9158 Total 119,9 17 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff A vs C 5,367 9,713 P < 0.001 2.742 to 7.992 A vs D 3,803 6,884 P < 0.01 1.178 to 6.428 A vs E -1,14 2,063 P > 0.05 -3.765 to 1.485 A vs F 4,18 7,566 P < 0.01 1.555 to 6.805 A vs G 0,2267 0,4102 P > 0.05 -2.398 to 2.852 C vs D -1,563 2,83 P > 0.05 -4.188 to 1.062 C vs E -6,507 11,78 P < 0.001 -9.132 to -3.882 C vs F -1,187 2,148 P > 0.05 -3.812 to 1.438 C vs G -5,14 9,303 P < 0.001 -7.765 to -2.515 D vs E -4,943 8,947 P < 0.001 -7.568 to -2.318 D vs F 0,3767 0,6817 P > 0.05 -2.248 to 3.002 D vs G -3,577 6,474 P < 0.01 -6.202 to -0.9517 E vs F 5,32 9,629 P < 0.001 2.695 to 7.945 E vs G 1,367 2,474 P > 0.05 -1.258 to 3.992 F vs G -3,953 7,155 P < 0.01 -6.578 to -1.328

128

Anexo 10

Teste t Pareado (24h x 48) Table Analyzed Subs 5 / 24 x 48 Column A A-24 H vs Vs Column B A-48 H Paired t test P value 0,0305 P value summary * Are means signif. different? (P < 0.05) Yes One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=5.597 df=2 Number of pairs 3 Table Analyzed Subs 5 / 24 x 48 Column E D-24 H vs vs Column F D-48 H Paired t test P value 0,1693 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=2.110 df=2 Number of pairs 3

Table Analyzed Subs 5 / 24 x 48 Column I F-24 H vs vs Column J F-48 H Paired t test P value 0,0063 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=12.56 df=2 Number of pairs 3

Table Analyzed Subs 5 / 24 x 48 Column C C-24 H vs vs Column D C-48 H Paired t test P value 0,3285 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=1.281 df=2 Number of pairs 3

Table Analyzed Subs 5 / 24 x 48 Column G E-24 H vs vs Column H E-48 H Paired t test P value 0,0631 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=3.791 df=2 Number of pairs 3

Table Analyzed Subs 5 / 24 x 48 Column K G-24 H vs vs Column L G-48 H Paired t test P value 0,0025 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=19.99 df=2 Number of pairs 3

129

Anexo 11

Table Analyzed Subs 8 24 x48 Column A A-24 H vs vs Column B A-48 H Paired t test P value 0,0573 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=3.996 df=2 Number of pairs 3 Table Analyzed Subs 8 24 x48 Column E D-24 H vs vs Column F D-48 H Paired t test P value 0,4052 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=1.046 df=2 Number of pairs 3 Table Analyzed Subs 8 24 x48 Column I F-24 H vs vs Column J F-48 H Paired t test P value 0,0957 P value summary ns Are means signif. different? (P < 0.05) No One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=2.995 df=2 Number of pairs 3

Table Analyzed Subs 8 24 x48 Column C C-24 H vs vs Column D C-48 H Paired t test P value 0,0018 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=23.44 df=2 Number of pairs 3

Table Analyzed Subs 8 24 x48 Column G E-24 H vs vs Column H E-48 H Paired t test P value 0,0145 P value summary * Are means signif. different? (P < 0.05) Yes One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=8.228 df=2 Number of pairs 3

Table Analyzed Subs 8 24 x48 Column K G-24 H vs vs Column L G-48 H Paired t test P value 0,0324 P value summary * Are means signif. different? (P < 0.05) Yes One- or two-tailed P value? Two-tailed t, df t=5.421 df=2 Number of pairs 3

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