uso de agrobacterium

Perspectivas das Plantas Transgnicas na Agricultura. UENESP-Jaboticabal, pp. 34-44, 1999.

USO DE Agrobacterium rhizogenes COMO VETOR PARA OBTENO DE PLANTAS TRANSGNICASPatrcia G. Morgante, Lzaro E. P. Peres & Marie-Anne Van Sluys. Simpsio - Perspectivas das Plantas Transgnicas na Agricultura. UENESP-Jaboticabal, pp. 34-44, 1999.

IntroduoA obteno de plantas transgnicas capazes de expressar um gene de interesse depende da eficincia dos processos de transferncia de DNA, que podem ser fsicos, qumicos ou biolgicos. Os sistemas biolgicos baseiam-se na interao Agrobacterium-planta, que se constitui no nico exemplo conhecido de transformao gentica natural entre organismos de reinos diferentes. Bactria de solo, pertencente famlia Rhizobiaceae, o gnero Agrobacterium caracterizase por ser um patgeno vegetal, uma vez que A. tumefaciens e A. rhizogenes so responsveis pelo desenvolvimento das doenas galha de coroa (crown gall) e sndrome das razes em cabeleira (hairy root), respectivamente. A virulncia dessas espcies reside em seus grandes plasmdeos de 200 kpb, sendo pTi (relativo induo de tumor) a designao dada ao plasmdeo de A. tumefaciens e pRi (relativo induo de rizognese), ao de A. rhizogenes (Chilton et al., 1982). O processo infeccioso ocorre com a transferncia e integrao de um segmento de DNA do plasmdeo bacteriano ao genoma da clula do hospedeiro (revisado por Hooykaas, 1989 e por Zambryski et al., 1989). O estudo desse processo de transformao gentica natural permitiu o desenvolvimento de tcnicas de produo de plant as transgnicas, utilizando-se Agrobacterium como vetor para a introduo de genes de interesse em diversas espcies vegetais. A utilizao de A. rhizogenes oferece vantagens sob vrios aspectos: Protocolos de transformao simples e rpidos podem ser facilmente estabelecidos; Nos vegetais, a competncia para formao de razes adventcias normalmente maior que aquela observada para a formao de gemas a partir de tecidos no meristemticos; As razes transgnicas (hairy roots) so clones celulares (Chilton et al., 1982), reduzindo a possibilidade de ocorrncia de plantas quimricas; O cultivo das razes isoladas feito em meio de cultura sem a adio de reguladores de crescimento, permitindo uma seleo prvia dos clones transformados e tornando o processo menos oneroso (Morgante, 1997; Hashimoto et al., 1999); As culturas de razes isoladas podem ser mantidas por muitos meses, permanecendo o crescimento vigoroso caracterstico; Tomando as razes por objeto de estudo, podem ser criados sistemas extremamente funcionais para a produo de metablitos (Wysokinska & Chmiel, 1997), obteno de plantas adequadas para uso como porta-enxerto (Lambert & Tepfer, 1992) e para a investigao de mecanismos de resistncia a patgenos de solo e metais, como o alumnio.

Interao Agrobacterium-planta: Mecanismo de Transferncia GnicaA figura 1 ilustra o processo de transformao gentica natural mediado por Agrobacterium. Para que a interao tenha incio, a planta necessita estar lesada e a bactria deve ligar-se superfcie da clula injuriada. Diversos estudos tm mostrado que protenas codificadas pelos loci cromossomais bacterianos chvA, chvB, pscA e att devem interagir com protenas vegetais, promovendo a ligao (revisado por Sheng & Citovsky, 1996).


Figura 1: Representao esquemtica da interao Agrobacterium-planta (sem escala). 1) liberao de compostos fenlicos pela clula vegetal injuriada; 2) ligao de Agrobacterium superfcie da clula, mediada por protenas bacterianas e vegetais; 3) interao de composto fenlico com a protena VirA; 4) fosforilao da protena VirG; 5) ativao da transcrio dos genes de virulncia (genes vir); 6) formao da fita-T, ligada protena VirD2; 7) produo da protena VirE2; 8) organizao do complexo-T (fita-T, VirD2 e VirE2); 9) transferncia do complexo-T para a clula vegetal; 10) entrada do complexo-T no ncleo celular; 11) integrao do T-DNA ao genoma celular. (modificado de Sheng & Citovsky,1996).Tecidos vegetais lesados secretam uma seiva de pH cido (entre 5,0 e 5,8), que contm compostos fenlicos, como a acetoseringona e a a-hidroxiacetoseringona. Tais substncias entram em contato com a protena bacteriana VirA, que nesse momento se autofosforila para, em seguida, transferir o grupamento fosfato para VirG. Uma vez fosforilada, VirG ativa a transcrio dos demais genes de virulncia (genes vir) da agrobactria. As protenas VirA e VirG so expressas constitutivamente pelo plasmdeo Ti/Ri de Agrobacterium, sendo especificamente responsveis pela regulao da expresso dos genes da regio de virulncia (regio vir), durante o processo infeccioso. A regio vir encontra-se no plasmdeo Ti/Ri (figura 2), ocupando cerca de 35 kpb e possuindo sete loci principais, virA, virB, virC, virD, virE, virG e virH. Os produtos gnicos


desses loci so essenciais para a transferncia do segmento de DNA da bactria para a clula da planta hospedeira (revisado por Sheng & Citovsky, 1996). As protenas VirD1 e VirD2 formam juntas uma endonuclease capaz de reconhecer e processar o fragmento de DNA (fita-T) que ser transmitido. Este fragmento de DNA simples fita gerado a partir da regio-T do plasmdeo Ti/Ri. A regio-T est delimitada por duas seqncias diretamente repetidas, de 24 a 25 pb, denominadas bordas direita e esquerda (figura 2). A integridade das bordas fundamental para o reconhecimento da regio-T, sendo a borda direita intrinsecamente mais ativa na promoo da transferncia do fragmento que a esquerda (Jen & Chilton, 1986). Aps a produo da fita-T, VirD2 mantem-se ligada extremidade 5 da molcula (correspondente borda direita) e protenas VirE2 envolvem totalmente a fita-T formando-se um complexo nucleoprotico, designado complexo-T (revisado por Sheng & Citovsky, 1996). Ao alcanar e adentrar o ncleo, o fragmento de DNA dever ser incorporado ao genoma. Ainda no foi elucidado se a fita-T integrada ao DNA vegetal, havendo a sntese de uma fita complementar em seguida, ou se ela convertida em DNA dupla fita antes da integrao. Acredita-se, em ambos os casos, que a integrao seja iniciada pela borda esquerda e termine na borda direita, quando VirD2 se desligaria da extremidade 5da fita de DNA (revisado por Sheng & Citovsky, 1996). Uma vez incorporada ao material gentico, a fita-T passa a ser chamada de TDNA.

Figura 2: Representao esquemtica de um plasmdeo Ti/Ri e da estratgia usada para a transferncia de genes no sistema de transformao via Agrobacterium com vetor binrio (sem escala). pTi, plasmdeo indutor de tumor de A. tumefaciens; pRi, plasmdeo indutor de rizognese de A. rhizogenes; Regio vir, regio de virulncia; Regio-T, regio (DNA) transferida; BD, borda direita da regio-T; BE, borda esquerda da regio-T.

Interao Agrobacterium-planta: Expresso dos genes transferidosA expresso do T-DNA nas clulas da planta leva formao do tumor caracterstico da galha de coroa (promovido por A. tumefaciens) ou rizognese da sndrome das razes em cabeleira (promovida por A. rhizogenes), alm de produzir compostos conhecidos pelo nome de opinas. Ao contrrio das clulas normais, as transformadas proliferam-se in vitro sem a adio de fitormnios (revisado por Van Sluys et al., 1992). O desenvolvimento da galha de coroa encontra-se bastante elucidado. O T-DNA do pTi possui genes que codificam reguladores de crescimento vegetal, havendo dois genes responsveis pela produo de auxina (iaaM e iaaH) e um pela de citocinina (ipt). O balano hormonal determinado por essas substncias culmina na proliferao celular e estabelecimento do tecido tumoral (revisado por Hooykaas & Schilperoort, 1992). O conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na proliferao de razes em plantas transformadas por A. rhizogenes e no crescimento autnomo de razes excisadas em meio de cultura permanece pouco esclarecido. Determinadas cepas de A. rhizogenes, bem como de


A. tumefaciens, possuem duas regies-T independentes conhecidas como regio-T direita (TRDNA) e regio-T esquerda (TL-DNA). No caso de A. rhizogenes, a regio TR-DNA apresenta genes que codificam duas enzimas de uma rota biossinttica de auxina, genes aux1 e aux2. Na regio TL-DNA est outro grupo de genes, genes rolA, rolB e rolC, cujos produtos no encerram nenhuma funo relacionada sntese de reguladores de crescimento. Em plantas infectadas por cepas possuidoras das duas regies-T, a proliferao de razes poderia ser justificada pela atuao dos genes aux. Porm, constatou-se que a TR-DNA dessas cepas no essencial para desencadear a rizognese em muitas espcies de plantas. Em adio, cepas que contm apenas a TL-DNA so igualmente hbeis na promoo do fentipo caracterstico das plantas infectadas (revisado por Zambryski et al., 1989). A funo molecular do gene rolA continua desconhecida. O aspecto tpico de uma planta que expressa esse gene a ocorrncia de folhas enrugadas com colorao verde-escuro, a diminuio no comprimento da regio do entren e o atraso na florao. Alguns estudos sugerem que o produto do gene rolA interfira no metabolismo de giberelinas (Dehio et al., 1993) e que o fentipo ano esteja relacionado com uma atuao primria da protena nos tecidos vasculares (Guivarch et al., 1996). Quanto ao gene rolB, Estruch e colaboradores (1991b) constataram que sua protena tem atividade de -glicosidase in vitro. A enzima capaz de hidrolisar, especificamente, indol- -glicosdeos, o que possibilita a liberao de molculas de auxina ativas a partir de conjugados inativos. O aumento nos nveis de auxina livre em plantas transformadas explicaria, em parte, o aparecimento das razes. A atividade de -glicosidase da protena RolB in vivo no foi demonstrada at o momento, uma vez que diferentes estudos tm revelado que a concentrao de auxina em rgos e clulas vegetais no transformados semelhante dos que expressam rolB (Schaerer & Pilet, 1993; Delbarre et al., 1994). O produto do gene rolC tambm foi caracterizado in vitro como sendo uma -glicosidase. No caso da protena RolC, os ensaios enzimticos detectaram a hidrlise de conjugados N-glicosdicos de citocininas (Estruch et al., 1991a). A liberao de molculas ativas de citocininas a partir de tais conjugados, conciliada liberao de molculas ativas de auxina, promovida pela ao de RolB, levaria a um balano hormonal adequado rizognese. Porm, Faiss e colaboradores (1996) demonstraram que a glicosidase RolC no interfere diretamente no metabolismo de citocininas de plantas de fumo transformadas. Os autores propuseram que essa enzima possa causar modificaes em substncias de baixo peso molecular que produzem efeitos similares aos atribudos aos hormnios, como as oligossacarinas. A habilidade de Agrobacterium em transferir um segmento de DNA para o genoma vegetal levou elaborao de tcnicas que viabilizaram a transformao de vrias espcies de plantas. H duas estratgias para a transferncia de genes via Agrobacterium: o sistema de vetor cointegrado e o sistema de vetor binrio, que o mais utilizado atualmente. Neste ltimo sistema, a agrobactria deve possuir um pTi/Ri com regio vir intacta e um segundo plasmdeo, denominado vetor binrio, que contm o gene de interesse e o marcador clonados entre seqncias idnticas s das bordas da regio-T (figura 2). A transmisso do segmento de DNA darse- atravs da atuao em trans dos produtos de expresso dos genes vir sobre as bordas da regio-T simulada no vetor binrio. Como os genes de biossntese de auxina e citocininas interferem negativamente na regenerao das clulas transformadas, comum a utilizao de cepas desarmadas de A. tumefaciens para a produo de plantas transgnicas. Cepas desarmadas carregam delees parciais ou totais na regio-T do plasmdeo Ti, ou seja, no possuem os genes de biossntese hormonal (revisado por Jouanin et al., 1993). Uma abordagem alternativa ao uso de cepas desarmadas de A. tumefaciens a utilizao de cepas selvagens de A. rhizogenes. Nesse caso, tira-se vantagem da ao dos genes rol para a induo de razes transformadas, as quais regeneraro plantas transgnicas. A seguir iremos descrever essa abordagem, tomando-se o tomateiro (Lycopersicon esculentum) como modelo. Utilizao de A. rhizogenes para Obteno de Tomateiros Transgnicos Atualmente, muitos estudos genticos utilizam o tomateiro como modelo vegetal. A riqueza de germoplasma e as facilidades de cultivo e propagao sexuada ou assexuada so algumas propriedades que justificam essa popularidade (revisado por Rick & Yoder, 1988). Outros fatores importantes so o pequeno tamanho do genoma (9,5 x 108 pb) e a existncia de mapas cromossmicos bem estruturados com marcadores clssicos e em RFLP. Mapas de alta densidade molecular, com um espaamento de 1,2 cM (centiMorgan) entre os marcadores, j foram construdos (Tanksley et al., 1992). Os protocolos atuais de transformao de tomateiro so adaptaes do protocolo original de co-cultivo de discos foliares de tabaco com cepa desarmada de A. tumefaciens (Horsch et al.,


1985). A reduzida capacidade organogentica do tomateiro faz com que o co-cultivo de seus explantes foliares rendam poucas gemas caulinares, sendo, alm disso, a grande maioria delas descartada na triagem por plantas transformadas. Desse modo, somente 5 a 10% dos discos foliares inoculados do origem a plantas transgnicas (Hamza & Chupeau, 1993; Frary & Earle, 1996).

Figura 3: Representao esquemtica de um procedimento de inoculao de plantas de tomate e do isolamento de razes originadas a partir da transformao gentica (hairy roots).Contrastando com a escassa formao de gemas nos protocolos de co-cultivo com cepa desarmada de A. tumefaciens, a inoculao de segmentos caulinares de tomateiro com A. rhizogenes forma numerosas razes transgnicas, ou hairy roots (Morgante, 1997; Hashimoto et al.,


1999). A alta eficincia na induo de hairy roots se deve provavelmente elevada competncia do tomateiro em formar razes, a qual pode ser observada inclusive no enraizamento de estacas em casa de vegetao. A obteno de hairy roots de tomateiro segue um protocolo consideravelmente simples (figura 3), quando comparado com os protocolos de co-cultivo de explantes foliares (McCormick et al., 1986; Fillati et al., 1987). Segmentos caulinares so levemente tocados em culturas frescas de A. rhizogenes multiplicadas em meio slido, dispensando portanto a obteno de culturas lquidas e a determinao da densidade ptica adequada. Os segmentos radiculares so inoculados na poro basal, onde mais tarde ir se acumular auxina, devido ao transporte baspeto desse hormnio. A acumulao de auxina facilita a formao de razes e hairy roots. Cepas de A. rhizogenes que transferem genes para produo de auxina (genes aux presentes no TR-DNA de pRi) para o tecido infectado costumam ser mais efetivas na induo de hairy roots. Contudo, hairy roots contendo genes aux podem apresentar dificuldade de regenerao devido alterao que esses genes causam na razo auxina/citocinina endgena. Decorridas 2 semanas aps a inoculao, as razes formadas so isoladas e cultivadas em meio sem hormnios e suprido com 100 mg/ml de cefotaxime, para inibir o crescimento de Agrobacterium. Razes transgnicas so selecionadas por seu crescimento vigoroso em meio sem hormnio, indicando a presena dos genes rol contidos no TL-DNA de pRi. A presena do T-DNA do vetor binrio contendo o gene de interesse verificada pelo cultivo das razes em meio seletivo e/ou por anlises moleculares tais como PCR e Southern blot. A natureza clonal das hairy roots permite que todos os processos de seleo sejam feitos nas razes antes mesmo de se obter as plantas transgnicas. Sendo assim, uma vez identificadas as razes transgnicas, as plantas regeneradas de qualquer poro radicular tambm contero o gene de interesse pois cada hairy root originalmente formada a partir de uma nica clula. A seleo de hairy roots antes da regenerao prefervel devido maior velocidade e acurcia da resposta das razes em meio seletivo (canamicina, por exemplo), quando comparada com os caules. Alm disso, a extrao de DNA em razes facilitada pela ausncia de clorofila e baixa concentrao de compostos fenlicos. Uma vez selecionadas, as razes so divididas em vrios fragmentos e incubadas em meio de regenerao. A segmentao das razes aumenta consideravelmente o nmero de explantes que podero vir a formar gemas. Embora os cultivares de tomateiro (L. esculentum) no possuam capacidade de formar gemas caulinares a partir de razes ou hairy roots, as espcies selvagens L. peruvianum, L. chilense e algumas introdues de L. hirsutum possuem tal capacidade (Peres et al., 1999a). A competncia para formar gemas em razes em L. peruvianum de herana monognica (Koornneef et al., 1993) e pode ser transferida para o tomateiro atravs de hibridao controlada. Em um trabalho recente, Peres et al. (1999b) propuseram a utilizao de L. esculentum cv Micro-Tom para experimentos envolvendo a obteno de plantas transgnicas. Essa variedade pode ser cultivada em vasos de apenas 100 mL e produz frutos maduros em 70-90 dias aps a semeadura (figura 4A). A introgresso da capacidade de formar gemas a partir de razes em Micro-Tom facilitar a obteno e manuteno de grande nmero de plantas, necessrio aos estudos de transgnese. Plantas regeneradas de hairy roots podem apresentar fentipo bastante alterado com folhas encarquilhadas, entrens curtos e intensa pigmentao (figura 4B). Apesar dessas plantas sofrerem reduo da fertilidade, elas formam sementes frteis, podendo ser utilizadas para a segregao dos T-DNAs provenientes do pRi e do vetor binrio. Uma das alteraes apresentadas pelas plantas regeneradas de hairy root a formao de um vigoroso sistema radicular e, nesse caso, as mesmas podem ser utilizadas como porta enxerto para o cultivo de tomateiro em estufa.


Figura 4: A) Planta adulta de L. esculentum cv Micro-Tom com 90 dias de idade, crescida em um vaso contendo somente 100 ml de substrato. B) Plantas de L. peruvianum CNPH 942 regeneradas a partir de razes (esquerda) e hairy roots (direita). Note que a planta transgnica derivada de hairy root exibe entrens curtos e folhas encarquilhadas, sendo esses sintomas causados pelos genes rol.

A utilizao do cultivar miniatura de tomateiro com capacidade de formar gemas em hairy roots, alm de possibilitar a manuteno de grande nmero de plantas em espao reduzido, facilitar a segregao dos T-DNAs do pRi e do vetor binrio, j que essa cultivar possui ciclo rpido. Como o Micro-Tom s difere das cultivares tradicionais em poucos genes recessivos (Meissner et al., 1997), os melhores transgnicos podem ser facilmente utilizados para produo de hbridos comerciais. Contudo, o maior interesse da utilizao desse sistema talvez seja a possibilidade de sua aplicao em experimentos de T-DNA tagging. A baixa eficincia dos protocolos usuais de transformao de tomateiro fez com que essa poderosa ferramenta de clonagem no tenha sido utilizada para essa espcie vegetal. Nossos resultados preliminares utilizando A. rhizogenes sinalizam uma eficincia de transformao adequada para a utilizao em T-DNA tagging. Tal estratgia faz-se relevante quando se considera que existem mais de 250 mutantes monognicos bem caracterizados de tomateiro (Stevens & Rick, 1986), entre os quais poucos genes foram clonados pelas trabalhosas ferramentas de Chromossome walking e Transposon tagging (Jones et al., 1994; Bishop et al., 1996; Pnueli et al., 1998).

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