DIAGNÓSTICO
ORIENTAÇÃO : DR. JOSÉ M
M
Diana Isabel Heitor Delgado
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
MONOGRAFIA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DO VÍRUS DE EPSTEIN BARR
M IGUEL AZEVEDO PEREIRA
MESTRADO EM ANÁLISES CLÍNICAS
Diana Isabel Heitor Delgado
LISBOA 2011
BARR
FACULDADE DE FARMÁCIA
Mestrado em Análises Clínica Diana Delgado 109
ÍNDICE
Resumo .................................................................................................................... 112
Abstract .................................................................................................................... 112
Introdução ................................................................................................................. 113
Enquadramento Teórico ........................................................................................... 114
Família Herpesviridae ............................................................................................... 116
Estrutura ............................................................................................................... 117
Replicação ............................................................................................................ 118
Vírus de Epstein-Barr ................................................................................................ 120
Replicação Viral .................................................................................................... 120
Epidemiologia ........................................................................................................ 122
Manifestações Clínicas ......................................................................................... 123
Mononucleose InfeCciosa .................................................................................. 123
Poder Oncogénico ............................................................................................. 124
Métodos diagnósticos do EBV .................................................................................. 126
Testes não Específicos ......................................................................................... 126
Aminotransferases ............................................................................................. 126
Hemograma ....................................................................................................... 126
Pesquisa de Anticorpos Heterófilos ................................................................... 127
Paul-Bunnel ................................................................................................... 128
Paul-Bunnel-Davidsohn .................................................................................. 128
Monoteste ...................................................................................................... 128
Testes específicos................................................................................................. 129
Anticorpos Específicos do EBV .......................................................................... 129
Técnicas Laboratoriais ................................................................................... 130
Imunofluorescência Indireta ........................................................................ 131
Ensaios Imunoenzimáticos (ELISA/EIA) ..................................................... 131
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Teste de avidez .......................................................................................... 132
Resultados serológicos e sua interpretação ................................................... 133
Carga Viral do EBV ............................................................................................ 134
Conclusão ................................................................................................................. 135
Bibliografia ................................................................................................................ 136
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ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Herpes Vírus16 .......................................................................................... 117
Figura 2 - Ciclo de replicação do Herpes vírus10 ....................................................... 119
Figura 3 - Ciclo de Replicação do EBV ..................................................................... 120
Figura 4 - Linfócitos Reativos17 ................................................................................. 127
Figura 5 - Cassetes de reação .................................................................................. 129
Figura 6 - Abreviaturas e descrições dos antigénios virais9 ...................................... 130
Figura 7 - Imunofluorescência Indireta ...................................................................... 131
Figura 8 - ELISA indireto ........................................................................................... 132
Figura 9 - Resultados serológicos e sua interpretação9 ............................................ 134
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RESUMO
O Epstein Barr é um vírus pertencente à família Herpesviridae, que apresenta tropismo
para os linfócitos B. A primoinfeção pode ser assintomática, mas pode também
manifestar-se através da mononucleose infecciosa e em casos muito específicos pode
conduzir a síndromas linfoproliferativos do tipo linfoma.
É um vírus ubiquitário e com distribuição mundial e a infeção por este vírus
transmite-se pela saliva e objetos contaminados.
A sua deteção é feita através da realização de várias técnicas laboratoriais, técnicas
essas que estão englobadas em dois tipos de técnicas, as não especificas
(aminotransferases, hemograma e pesquisa de anticorpos heterófilos) e as especificas
(doseamento de anticorpos especificos do EBV e deteção de carga viral).
Este trabalho permitiu aprofundar os conhecimentos sobre este vírus, assim como as
respetivas técnicas de diagnóstico laboratorial, sendo a existência destes métodos de
diagnóstico e a sua complementaridade determinantes para um diagnóstico correto da
infeção por EBV.
ABSTRACT
The Epstein Barr virus is a virus belonging to the Herpesviridae family, which has
tropism for B lymphocytes. The primary infection may be asymptomatic, but can also
manifest as infectious mononucleosis and in very specific cases can lead to lymph
proliferative syndromes as lymphoma. It is a ubiquitous virus, with worldwide
distribution. Infection with this virus is transmitted by saliva and contaminated objects.
Its detection is done by performing various laboratory techniques, which are mainly of
two types: not specific (aminotransferase, CBC and heterophil antibodies) and specific
(assay of EBV-specific antibodies and detection viral load).
This work allows further knowledge about this virus, as well as the respective
laboratory diagnostic techniques, and the existence of these diagnostic methods and
their complementary determining factors for a correct diagnosis of EBV infection.
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INTRODUÇÃO
No âmbito do Mestrado em Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia, foi solicitada
a elaboração de uma monografia. O tema escolhido foi o diagnóstico laboratorial do
Vírus de Epstein Barr, que versa os seguintes conteúdos:
- Conceitos introdutórios;
- Especificações do Vírus de Epstein Barr;
- Métodos de Diagnóstico.
A presente monografia tem como objetivo produzir um documento que sistematize a
informação existente sobre o diagnóstico deste vírus, e com isso demonstrar os
conhecimentos que me permitam completar com êxito o Mestrado em Análises
Clínicas.
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ENQUADRAMENTO TEÓRICO
A Virologia é o estudo dos vírus e das suas propriedades, sendo que os vírus são as
menores partículas infecciosas, cujo diâmetro varia de 18 nm a quase 300 nm
(partículas com menos de 200 nm não podem ser observadas ao microscópio ótico).
Muitos destes microrganismos estão associados a patologias humanas. Os vírus
consistem numa molécula de ADN ou ARN e proteínas associadas, necessárias para
a replicação e desenvolvimento da doença (patogenia). Esses componentes estão
circundados por uma camada proteica, com ou sem invólucro lipídico. Os vírus são
verdadeiros parasitas, necessitando de células hospedeiras para a sua replicação, por
este motivo o desenvolvimento de uma infeção viral numa população implica a
existência de:
- Um vírus (agente patogénico transmissível);
- Um modo de transmissão, que varia de vírus para vírus (via fecal-oral, via aérea, via
sexual, via salivar, via iatrogénica, transmissão por animais e entre pessoas-animais e
vetores);
- Indivíduos, membros de uma coletividade, aptos a receber o agente infecioso10.
Os vírus causam doença após romperem as barreiras protetoras normais do corpo,
escaparem ao controlo imunológico e matarem células de um tecido importante (por
exemplo do cérebro) ou desencadearem resposta imunológica e inflamatória
destrutiva. O resultado da infeção viral é determinado pela natureza do vírus, pela
interação entre o vírus e o hospedeiro e pela resposta do hospedeiro à infeção.
A resposta imunológica constitui o melhor tratamento, mas frequentemente contribui
para a patogenia da infeção viral. O tecido alvo do vírus determina a natureza da
doença e dos seus sintomas. Fatores virais e do hospedeiro determinam a gravidade
da doença. Esses fatores incluem a carga viral, o tamanho do inóculo e o estado geral
de saúde da pessoa infetada. A capacidade com que a resposta imunológica do
indivíduo infetado controla a infeção determina a gravidade e a duração da doença.
Uma determinada doença pode ser causada por vários vírus que possuem tropismo
tecidular comum (por exemplo, hepatite, fígado; encefalite, sistema nervoso central).
Por outro lado, um determinado vírus pode causar diferentes doenças ou nenhum
sintoma. Por exemplo o vírus do herpes simples tipo 1 pode causar gengivoestomatite,
faringite, herpes labial, herpes genital, encefalite ou ceratoconjuntivite, dependendo do
tecido afetado, ou pode não causar nenhuma doença. Embora geralmente benigno,
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esse vírus pode tornar-se potencialmente fatal num recém-nascido ou num
imunodeprimido.
Numerosos vírus codificam fatores de virulência que promovem a eficiência da
replicação e transmissão virais, o acesso e ligação do vírus à célula, ou o facto do
vírus fugir às defesas do hospedeiro. Esses fatores podem não ser essenciais para o
crescimento do vírus em células in vitro, mas são necessários para a patogenicidade
ou para a sobrevivência do vírus no hospedeiro. A perda desses fatores de virulência
resulta na atenuação do vírus.
No organismo, a doença viral progride através de etapas definidas, de forma
semelhante à replicação viral na célula. As etapas são as seguintes:
- Aquisição (entrada no organismo);
- Início da infeção no local de entrada;
- Período de incubação, quando o vírus se replica e pode disseminar-se para um local
secundário.
O período de incubação pode ocorrer sem sintomas (assintomático) ou pode produzir
sintomas iniciais pouco específicos. Os sintomas da doença são provenientes da lesão
tecidular e dos efeitos sistémicos e são causados pelo vírus e pelo sistema
imunológico. Esses sintomas podem continuar através da fase de convalescença,
quando o organismo recupera da infeção. Em geral, o indivíduo desenvolve uma
memória imunológica para futura proteção contra um contacto semelhante com o
mesmo vírus.
O vírus consegue penetrar no organismo através de soluções de continuidade da pele
ou através das membranas mucoepiteliais que revestem os orifícios do corpo (olhos,
vias aéreas, boca, órgãos genitais e trato gastrointestinal). Por outro lado, a pele é
uma excelente barreira à infeção, e os orifícios são protegidos pelas lágrimas, pelo
muco, pelo epitélio ciliado, ácido gástrico, bílis e imunoglobulina A. Após penetrar no
organismo, o vírus replica-se nas células que expressam recetores virais e que
possuem maquinaria biossintética apropriada. Numerosos vírus iniciam a infeção na
mucosa oral e nas vias aéreas superiores. Os sintomas podem acompanhar a
replicação viral no local de entrada. O vírus pode replicar-se e permanecer no local de
entrada ou pode disseminar-se para outros tecidos através da corrente sanguínea,
através dos fagócitos mononucleares e sistema linfático ou através das células
cerebrais, sendo a corrente sanguínea e o sistema linfático os principais meios de
transferência viral no organismo.
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A infeção pode resultar numa rápida replicação dos microrganismos e destruição das
células infetadas, ou numa prolongada relação latente com a célula hospedeira, com
uma possível integração da informação genética viral no genoma do hospedeiro. Os
fatores que determinam quais desses dois rumos será seguido são apenas
parcialmente compreendidos, mas são as células que os vírus infetam, a capacidade
intrínseca dos vírus e o resultado da infeção que ditam a natureza da manifestação
clínica.
FAMÍLIA HERPESVIRIDAE
A família Herpesviridae engloba mais de cem vírus, que infetam muitos tipos de
vertebrados. Estes vírus são ubíquos, induzem uma grande variedade de doenças e,
após primoinfeção, permanecem no organismo sob forma latente. As infeções,
geralmente benignas, podem contudo causar, em indivíduos imunodeprimidos,
morbilidade e mortalidade significativas.
Os herpesvírus humanos são classificados em três subfamílias com base em
diferentes características virais (estrutura do genoma, tropismo celular, efeito
citopatológico e local de infeção latente), bem como na patogenia da doença e suas
manifestações. Estas subfamílias são: Alphaherpesvirinae (α-herpesvirinae),
Betaherpesvirinae (β-herpesvirinae) e Gammaherpesvirinae ( γ-herpesvirinae).
Foram caracterizados até ao momento oito herpesvírus patogénicos para o homem: o
Herpesvirus simples ou simplex tipos 1 e 2 (HSV – 1 e HSV – 2), o Vírus da varicela e
da zona ou Vírus varicela-zóster (VZV), o Citomegalovirus (CMV) ou o Vírus das
inclusões citomegálicas, o Vírus de Epstein-Barr (EBV), o Herpesvirus humano tipo 6
(HHV – 6), o Herpesvirus humano tipo 7 (HHV – 7) e o Herpesvirus humano tipo 8
(HHV – 8), estando este último associado ao sarcoma de Kaposi.
Os herpesvírus são um importante grupo de grandes vírus de ADN com as seguintes
características em comum: morfologia do virião, forma básica de replicação e
capacidade de estabelecer infeções latentes e recorrentes. A imunidade mediada por
células é também importante no controlo da infeção por esses vírus e na produção de
sintomas. Os herpesvírus codificam para proteínas e enzimas que facilitam a
replicação e interação do vírus com o hospedeiro. Estes vírus podem causar infeções
líticas, persistentes, latentes/recorrentes e, no caso do EBV, as células infetadas
podem ser transformadas por este vírus, de modo a que por exemplo se multipliquem
indefinidamente, podendo por isso levar ao desenvolvimento de tumores.
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As infeções por herpesvírus são comuns, e os vírus são ubíquos, mas felizmente estes
vírus codificam para proteínas/enzimas que se podem constituir em alvos de
moléculas antivirais.
ESTRUTURA
Os herpesvírus são vírus grandes, com invólucro, contendo cadeia dupla de ADN. O
virião possui um diâmetro aproximado de 150 nm e apresenta a morfologia
característica apresentada na figura 1. O ADN é circundado por uma cápside
icosaédrica que contém 162 capsómeros (12 pentões ou pentâmeros e 150 hexões ou
hexâmeros). Esta cápside é circundada por um invólucro que contém glicoproteínas.
Os herpesvírus codificam várias glicoproteínas que são determinantes na fixação do
vírus, fusão e escape do controlo imunológico. O espaço entre o invólucro e a cápside,
denominado tegumento, contém proteínas e enzimas virais que ajudam a iniciar a
replicação. Como vírus com invólucro, os herpesvírus são sensíveis aos ácidos,
solventes, detergentes e ao calor. Os genomas dos herpesvírus são constituídos por
ADN linear de cadeia dupla, mas diferem no tamanho e na orientação genica.
Sequências repetidas diretas ou invertidas constituem regiões únicas do genoma
(região única longa [UL], região única curta [US]), permitindo a circulação e a
recombinação no interior do genoma. A recombinação entre repetições invertidas no
HSV, CMV e VZV permite que grandes porções do genoma modifiquem a orientação
dos seus segmentos génicos UL e US um em relação ao outro11.
Figura 1 - Herpes Vírus 16
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REPLICAÇÃO
A replicação dos herpesvírus é iniciada pela interação das glicoproteínas virais com
recetores presentes na membrana celular. O tropismo de alguns herpesvírus (por
exemplo o EBV) é restrito, como resultado da expressão célula-específica dos seus
recetores. A nucleocápside é a seguir libertada no citoplasma através da fusão do
invólucro com a membrana plasmática. As enzimas e os fatores de transcrição são
transportados para o interior da célula no tegumento. A nucleocápside fixa-se à
membrana nuclear e liberta o genoma no núcleo, onde é transcrito e replicado.
A transcrição do ADN genómico pela ARN polimerase e a síntese de proteínas virais
ocorrem de forma coordenada e regulada em três fases (imediata, precoce e tardia):
- Proteínas precoces imediatas (α), que consistem em proteínas de ligação do ADN,
importantes para a regulação da transcrição genética, que atuam na transcrição e na
modulação da resposta do hospedeiro à infeção;
- Proteínas precoces (β), que consistem em vários fatores de transcrição e enzimas,
incluindo a ADN polimerase, permitindo a síntese de novas moléculas de ADN;
- Proteínas tardias (γ), há produção de ARN mensageiro necessário à síntese de
proteínas estruturais, são geradas após o início da replicação do genoma viral.
Segue-se a fase de síntese e reunião das proteínas estruturais e a encapsidação do
genoma viral. À aquisição do invólucro, por passagem através da membrana nuclear,
segue-se a saída do vírus por gemulação.
A replicação do ADN começa no núcleo da célula cerca de 4 horas após a entrada do
vírus na célula. A síntese do ADN viral decorre no núcleo da célula infetada,
necessitando, contudo, de enzimas virais, especialmente a timidina-cinase, para o
caso do HSV e VZV e, ainda, de uma ADN-polimerase. Estas enzimas constituem,
portanto, um bom alvo para a quimioterapia seletiva, estritamente antiviral e pouco
tóxica.
A encapsidação do ADN faz-se no núcleo, onde se acumula material viral que é
responsável pelas inclusões nucleares nas células infetadas. As nucleocápsides saem
do núcleo, adquirindo o invólucro ao atravessarem as membranas nucleares ou
intracitoplasmáticas do aparelho de Golgi. Os viriões são libertados da célula por
exocitose ou por lise celular.
A transcrição do genoma viral realizada pela ARN polimerase é regulada por fatores
nucleares e celulares codificados pelos vírus. A inter-relação desses fatores determina
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se a infeção será lítica, persistente ou latente. As células que promovem infeção
latente transcrevem apenas os genes específicos sem a replicação do genoma. A
progressão para a expressão de genes precoces e tardios resulta em morte celular e
infeção lítica.
A replicação do genoma viral é realizada pela ADN polimerase codificada pelo v
também as enzimas que fornecem substratos de desoxiribonucleotidos para a
polimerase são codificadas por este e atuam como alvos para agentes antivirais.
Essas e outras enzimas virais facilitam a replicação do vírus em células em fase de
não crescimento e que necessitam de desoxiribonucleótidos e enzimas suficientes
para a síntese de ADN viral (por exemplo, os neurónios).
A transcrição, a síntese de proteínas, o processamento das glicoproteínas e a
libertação da célula por exocitose são processos rea
Figura 2 - Ciclo de replicação do Herpes vírus
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se a infeção será lítica, persistente ou latente. As células que promovem infeção
latente transcrevem apenas os genes específicos sem a replicação do genoma. A
progressão para a expressão de genes precoces e tardios resulta em morte celular e
A replicação do genoma viral é realizada pela ADN polimerase codificada pelo v
também as enzimas que fornecem substratos de desoxiribonucleotidos para a
polimerase são codificadas por este e atuam como alvos para agentes antivirais.
Essas e outras enzimas virais facilitam a replicação do vírus em células em fase de
ento e que necessitam de desoxiribonucleótidos e enzimas suficientes
para a síntese de ADN viral (por exemplo, os neurónios).
A transcrição, a síntese de proteínas, o processamento das glicoproteínas e a
libertação da célula por exocitose são processos realizados pela maquinaria celular
Ciclo de replicação do Herpes vírus 10
119
se a infeção será lítica, persistente ou latente. As células que promovem infeção
latente transcrevem apenas os genes específicos sem a replicação do genoma. A
progressão para a expressão de genes precoces e tardios resulta em morte celular e
A replicação do genoma viral é realizada pela ADN polimerase codificada pelo vírus e
também as enzimas que fornecem substratos de desoxiribonucleotidos para a
polimerase são codificadas por este e atuam como alvos para agentes antivirais.
Essas e outras enzimas virais facilitam a replicação do vírus em células em fase de
ento e que necessitam de desoxiribonucleótidos e enzimas suficientes
A transcrição, a síntese de proteínas, o processamento das glicoproteínas e a
lizados pela maquinaria celular11.
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VÍRUS DE EPSTEIN-BARR
O vírus Epstein-Barr (EBV, designado também por Human Herpes Vírus 4 (HHV4)), foi
identificado em 1964 por Epstein (M.A.Epstein) e Barr (B.G.Achong) a partir da
observação de viriões típicos de herpesvírus humanos em linhas celulares de Linfoma
de Burkitt. Este vírus pertence à família Herpesviridae, tem um tropismo para os
linfócitos B, onde estabelecem vários processos de latência. A primoinfeção pode ser
assintomática, mas pode manifestar-se através da mononucleose infecciosa. A
reativação do vírus na população imunocompetente é normalmente assintomática, em
contrapartida em indivíduos imunodeprimidos pode conduzir a síndromas
linfoproliferativos do tipo linfoma.
REPLICAÇÃO VIRAL
A transmissão deste vírus faz-se principalmente através da saliva, o vírus entra no
organismo pela cavidade oral, infetando as células epiteliais da orofaringe e as
glândulas salivares9. Com efeito, a replicação do EBV tem lugar ao nível do epitélio
orofaríngeo, onde posteriormente, por exemplo numa reativação as partículas virais
completas são libertas na saliva a partir dos linfócitos B infetados3. Então entram na
corrente sanguínea onde infetam os linfócitos B e se multiplicam. Nos linfócitos B o
EBV replica-se liticamente. Entra posteriormente numa fase latente, possuindo a
capacidade de transformar as células infetadas9.
Figura 3 - Ciclo de Replicação do EBV
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O processo de replicação ocorre da seguinte forma:
1- O invólucro viral (glicoproteína gp350/220) funde-se com a membrana
citoplasmática dos linfócitos B, através do recetor CD21;
2- A cápside, contendo o genoma viral, penetra no citoplasma;
3- Utilizando o citoesqueleto da célula, a cápside migra em direção ao núcleo;
4- O ADN viral penetra no núcleo através dos poros da membrana nuclear e
adquire forma circular;
5- Dá-se o processo de transcrição, em que ocorre a síntese de ARN mensageiro
a partir da sequência de bases dos nocleótidos do ADN. Quando uma secção
da molécula de ADN se desenrola e as suas cadeias se separam, uma das
cadeias de ADN serve de molde para a formação do ARN mensageiro1;
6- O ARN mensageiro (ARNm) migra para o citoplasma onde se processa a
síntese das primeiras proteínas virais que se deslocam para o núcleo,
continuando o processo de transcrição do ADN viral e posterior tradução em
proteínas virais;
7- O ADN viral replica-se dando origem a novas moléculas que permanecem no
núcleo;
8- Inicia-se então uma nova fase de transcrição do ADN viral, formando-se os
ARNm responsáveis pelas proteínas estruturais do vírus;
9- Após a sua síntese, as proteínas estruturais migram para o núcleo e envolvem
o genoma viral;
10- Estas estruturas (pró-cápsides) penetram na membrana nuclear após fusão
com a sua parede interna, ganhando assim um “invólucro temporário” que as
rodeia durante a sua curta estadia no espaço perinuclear. Este invólucro
funde-se com a parede exterior da membrana nuclear. libertando as
pró-cápsides no citoplasma;
11- No citoplasma as cápsides virais utilizam o retículo endoplasmático para
sintetizar glicoproteínas virais que, através das vesículas do aparelho de Golgi,
migram até à membrana citoplasmática, modificando-a;
12- No citoplasma, determinadas proteínas virais ligam-se às cápsides virais,
formando o tegumento;
13- As novas partículas virais fundem-se com vesículas citoplasmáticas,
adquirindo um invólucro maduro, sendo transportadas até à membrana
citoplasmática;
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14- O virião sai então da célula por exocitose, utilizando zonas modificadas da
membrana citoplasmática9.
O EBV replica-se produzindo inúmeras partículas virais assumindo depois a forma
latente. Este vírus estabelece infeção latente permanecendo sob a forma de ADN
extracromossómico (epissoma).
Dependendo de determinados cofatores o genoma viral integra-se no ADN da célula
hospedeira, expressa seis genes virais (EBNA 1 a 6) que transformam os linfócitos B
de forma a permanecerem continuamente em divisão.
EPIDEMIOLOGIA
O EBV é um vírus ubiquitário e com distribuição mundial. A infeção por este vírus
transmite-se pela saliva e objetos contaminados, (escovas de dentes, louça, etc.) ou
por transfusões sanguíneas. A partilha de saliva entre adolescentes e adultos jovens
contribui para a propagação do vírus sendo, por isso, a mononucleose infecciosa
também designada por “doença do beijo”.
Em países com condições socioeconómicas muito precárias e deficientes hábitos de
higiene, a infeção pelo EBV ocorre muito precocemente, ou seja, logo que os
anticorpos maternos desaparecem. As infeções primárias na criança são, geralmente,
subclínicas ou com fraca sintomatologia. Na maioria dos casos, após a primoinfeção, o
vírus permanece latente no organismo sem se manifestar.
Estudos realizados em alguns países tropicais revelaram uma seropositividade de
90% para as crianças com cerca de seis anos de idade, enquanto que, nos países
mais desenvolvidos, a infeção pelo EBV ocorre mais tarde, preferencialmente nos
adolescentes e adultos jovens. Nestes países, a seropositividade é de 30 a 40% nas
crianças de 6 anos e de 70% para os adultos com cerca de 30 anos.
Um número elevado de adultos, seropositivos para o EBV, elimina partículas virais de
forma intermitente nas secreções orofaríngeas, ao longo de toda a vida, apesar de
permanecerem assintomáticos. Há numerosas variantes genómicas do EBV, apesar
de se conhecer um só serotipo10.
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MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
O período de incubação para o EBV varia entre 2 semanas e 2 meses, sendo que, nos
adolescentes e nos jovens adultos, o EBV pode causar uma Mononucleose Infecciosa
(MNI) também designada por doença de Pteiffer (febre glandular) ou doença do beijo.
Nas crianças mais novas, as infeções por EBV são frequentemente assintomáticas3.
A mononucleose infecciosa corresponde à primoinfeção pelo EBV. Este tem também
sido associado, não só ao Linfoma de Burkitt, mas ainda ao carcinoma da nasofaringe
e ao carcinoma das glândulas salivares. Este vírus tem sido também relacionado com
a Leucoplasia Oral Pilosa que ocorre em indivíduos imunodeprimidos.
MONONUCLEOSE INFECCIOSA
A Mononucleose Infecciosa é uma doença linfoproliferativa sistémica, de curta
evolução e geralmente benigna. Caracteriza-se por um aumento do volume dos
gânglios linfáticos, hepatoesplenomegália acompanhada de amigdalite, cefaleias,
náuseas, mal-estar, prostração e febre prolongada, mas moderada, com picos
noturnos10.
No plano biológico, existe uma síndroma mononucleósica com uma hiperlinfocitose
sanguínea e linfócitos atípicos hiperbasófilos que correspondem a linfócitos T CD8+
ativos, que proliferam em resposta à proliferação dos linfócitos B induzidos pelo EBV.
A hiperleucocitose moderada (15.000/mm3) apresenta células mononucleares com
citoplasma azulado de 15 a 20 µm, com relação núcleo-citoplasma baixa, e gânglios
inflamatórios com hiperplasia dos folículos linfoides.
A estimulação dos linfócitos B está na origem das manifestações de autoimunidade,
como a anemia hemolítica autoimune com teste de coombs direto positivo,
crioaglutininas e púrpura trombocitopénica idiopática.
Os sinais de citólise hepática com aumento das transaminases são quase constantes.
A evolução é favorável em algumas semanas persistindo apenas a astenia. As
complicações são raras: púrpura trombocitopénica, encefalite, meningite, síndroma de
Guillain-Barré, paralisia facial, rotura do baço, pericardite, miocardite, artrite e nefrite.
No indivíduo imunodeprimido foi descrita uma forma grave de infeção primária por
EBV, o síndroma de Purtilo ou doença de Duncan que atinge rapazes com um défice
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imunitário ligado ao cromossoma X. A proliferação massiva infiltra-se no fígado e nos
órgãos linfoides e a mortalidade é de dois em cada três casos7.
É importante realizar um diagnóstico diferencial para toxoplasmose, CMV e HIV7.
PODER ONCOGÉNICO
Aquando da primoinfeção, muitos linfócitos B entram num ciclo lítico, ou seja, dão
origem a novas partículas virais. A maior parte dos linfócitos B, ao serem infetados,
recebem estímulos que conduzem à divisão celular e à produção de anticorpos. Os
linfócitos infetados adquirem a capacidade de se multiplicarem continuamente in vitro,
característica comum às células neoplásicas, que se denomina por “imortalização” ou
“transformação”. A doença linfoproliferativa que resultaria deste processo é
interrompida pela ação da imunidade celular (linfócitos T CD8+ “atípicos”), o que reduz
a um pequeno número os linfócitos B infetados. Nos estados de imunodeficiência
característicos dos pacientes transplantados é relativamente comum o aparecimento
de doenças linfoproliferativas pós-transplante, que podem ser designadas por
neoplasias oportunistas, desencadeadas pela replicação não controlada do vírus de
Epstein-Barr. Também na SIDA ocorrem linfomas extranodulares agressivos,
especialmente do sistema nervoso central, devido à proliferação monoclonal ou
policlonal de linfócitos B, nos quais está presente o genoma viral. Este vírus é
provavelmente um fator importante na formação de tumores de distribuição geográfica
restrita, como o linfoma de Burkitt (África) e o carcinoma anaplásico da orofaringe
(China). Há evidências crescentes da sua importância na doença de Hodgkin15.
Como já foi referido existem várias manifestações malignas associadas ao EBV, tais
como:
- Linfoma de Burkitt: Este linfoma é o tumor mais frequente em crianças da África
Central e Oriental, é endémico na África Equatorial e pode ocorrer de forma
esporádica ou associada a casos de SIDA, em diferentes regiões do globo. Os tecidos
tumorais contêm sequências de ADN do EBV, exprimem o antigénio viral EBNA e, por
vezes, permitem a deteção de partículas virais por microscopia eletrónica. Nesta
patologia ocorre uma proliferação monoclonal de linfócitos B, ligada a uma
translocação no cromossoma 8 (Q24) e um dos cromossomas 2,14 ou 22. O perfil
molecular deste linfoma é típico pois é sempre monoclonal7. Estas translocações
conduzem a uma desregulação do proto-oncogene c-myc, possivelmente ao nível do
controlo transcricional.
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Estudos seroepidemiológicos revelaram a presença de anticorpos anti-VCA e anti-EA
em títulos elevados, precedendo, em cerca de cinco anos, a deteção clínica deste
tumor10.
- Carcinoma da nasofaringe: atinge mais frequentemente o homem entre os 20 e os 50
anos, é endémico no Sul da China, pouco frequente em África e raro na Europa,
estando ligado ao vírus em 100% dos casos7. As células alvo são as células epiteliais,
embora os tumores apresentem infiltrações de numerosos linfócitos.
A associação do EBV com este carcinoma foi descoberta através de estudos
serológicos e, mais tarde, confirmada pela presença do genoma viral em produtos
obtidos por biopsia. A demonstração da presença de ADN viral nas células epiteliais
tumorais, mas não nos linfócitos presentes no tumor, pode ser feita por hibridação in
situ e, ainda, por transplantação do tumor para cobaias que desenvolvem neoplasia.
Os pacientes com carcinoma da nasofaringe possuem teores elevados de anticorpos
anti-VCA e anti-EA, especialmente da classe IgA.
Na génese deste tumor parecem intervir, não só o EBV, como certos fatores genéticos
e geográficos10.
As adenopatias cervicais são reveladoras e demonstram a difusão metástica precoce.
Associam-se a manifestações otorrinolaringológicas e neurológicas7.
- Adicionalmente, outras doenças estão associadas ao EBV: o genoma do EBV
encontra-se em células tumorais da doença de Hodgkin (células de Sternberg). Certos
linfomas das células T estão associados ao EBV (linfomas nasais, gastrointestinais,
pulmonares ou ganglionares).
- No decorrer da infeção por HIV encontram-se certas patologias associadas ao EBV:
A leucoplasia da língua (produção de EBV pelas células epiteliais da língua) é
frequente, esta leucoplasia apresenta-se como uma lesão esbranquiçada nas margens
da língua, podendo encontrar-se na mucosa bucal. A observação destas lesões pode
alertar para uma possível infeção pelo HIV, visto que, virtualmente, todos os pacientes
com esta leucoplasia são seropositivos para o HIV10.
Por vezes a infeção por EBV também está associada aos linfomas não Hodgkin com
localizações sobretudo extraganglionares (tubo digestivo, espinal medula e sistema
nervoso central)7.
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MÉTODOS DIAGNÓSTICOS DO EBV
O diagnóstico da Mononucleose Infecciosa (MNI) baseia-se principalmente em
sintomas clínicos (anginas, febre e linfoadenopatia). A serologia é utilizada para
confirmar o diagnostico da MNI e excluir outras patologias, tais como o linfoma e a
leucemia, que podem apresentar sintomas comparáveis aos da MNI. A síndroma de
mononucleose pode também ser causada por outros agentes patogénicos (o
citomegalovírus, o HHV6, o adenovírus, o vírus da rubéola, o vírus da papeira, o HIV,
o vírus da hepatite A, os vírus da influenza A e B e Toxoplasma gondii).
O diagnóstico serológico do EBV inclui testes específicos, bem como não específicos,
como a deteção dos anticorpos heterófilos.
TESTES NÃO ESPECÍFICOS
AMINOTRANSFERASES
As aminotransferases são enzimas que catalisam a transferência do grupo amina de
um aminoácido para um ácido alfa-cetónico. Passam para o soro em caso de hemólise
hepática ou muscular.
Avaliam-se normalmente a atividade da alanina-aminotransferase (ALT ou TGP)
essencialmente presente no fígado e da aspartato-aminotransferase (AST ou TGO)
presente no coração e em menor quantidade no fígado6.
Relativamente ao EBV, apesar de, aquando da infeção por este vírus ser infrequente a
icterícia, a elevação moderada das enzimas acima mencionadas ocorre em cerca de
90% dos casos, devido à lesão hepática, provocada pelo vírus15.
HEMOGRAMA
O hemograma compreende a contagem dos elementos figurados do sangue (glóbulos
vermelhos, brancos, plaquetas e eventualmente reticulócitos) e o cálculo dos índices
eritrocitários, como o volume globular sanguíneo médio (VGM) e a concentração
média de hemoglobina globular (CHGM) a partir do doseamento da hemoglobina e do
hematócrito, o cálculo do número e percentagem das diferentes categorias de glóbulos
brancos – Fórmula Leucocitária (neutrófilos, linfócitos, eosinófilos e basófilos)6.
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Na infeção pelo EBV é típica a presença de uma leucocitose com linfocitose.
Há em geral mais de 50% de linfócitos, entre os quais 10% ou mais são descritos
como "atípicos", ou "células de Downey". Estas células correspondem a linfócitos T
CD8+ supressores/citotóxicos ativados e surgem não só na mononucleose, como
também noutras infeções virais (rubéola, hepatite…) e noutras causas da síndroma
adenomegálica, como toxoplasmose aguda, citomegalovirose, primoinfeção pelo vírus
da imunodeficiência humana, doença de Chagas aguda e alergia a drogas. O que
sobressai na mononucleose pelo vírus de Epstein-Barr é o seu grande número. Apesar
disso, o hemograma pode apenas tornar-se característico uma semana após o início
da doença.
Figura 4 - Linfócitos Reativos 17
PESQUISA DE ANTICORPOS HETERÓFILOS
Na primoinfeção pelo vírus de Epstein-Barr, o estímulo inespecífico à produção de
anticorpos eleva em cerca de 50% a concentração sérica de anticorpos da classe IgG
e em cerca de 100% a de anticorpos da classe IgM, o que aumenta a quantidade de
muitos anticorpos normalmente indetetáveis ou presentes em baixas concentrações.
Estes anticorpos são denominados "heterófilos", pois os testes utilizados para o seu
doseamento utilizam antigénios que não estão relacionados com as causas
determinantes da formação dos anticorpos. Estes testes têm menor positividade na
infância, tornam-se reativos após duas semanas de doença e podem estar presentes
até um mês após o inicio da infeção15. Estes testes podem ser o Monoteste, o
Paul-Bunnel e o Paul-Bunnel-Davidsohn.
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PAUL-BUNNEL
Este teste deteta anticorpos que aglutinam hemácias de carneiro15. Estes anticorpos
podem apresentar títulos significativos em várias alterações clínicas que cursam com a
ativação policlonal dos linfócitos B, tais como na presença de imunocomplexos
circulantes, hepatite viral, leishmaniose visceral e HIV.
PAUL-BUNNEL-DAVIDSOHN
Tal como o anterior, também este teste deteta anticorpos que aglutinam hemácias de
carneiro, a diferença reside no facto de a reação ser repetida após o soro em estudo
ser exposto a antigénios de rim de cobaia. Como, dos vários anticorpos heterófilos, os
da mononucleose causada pelo vírus de Epstein-Barr são os únicos sem qualquer
afinidade com estes antigénios, apenas se se tratar desta infeção o soro conservará a
maior parte do seu poder aglutinante, sendo nas outras patologias intensamente
inativado pela fixação dos anticorpos aos antigénios de rim de cobaia7.
MONOTESTE
Este teste, tal como os anteriores é um teste qualitativo. A modalidade mais antiga
deste teste era um teste em lâmina que detetava anticorpos através do uso de
eritrócitos de cavalo formolizados. Os testes mais recentes detetam também
anticorpos heterófilos da Mononucleose Infecciosa em sangue total, soro ou plasma
mas através de um sistema imunocromatográfico de fluxo lateral. Neste teste o
antigénio é extraído de eritrócitos de bovino e é imobilizado na região da linha de teste
do dispositivo. Durante o teste, a amostra reage com partículas cobertas de antigénio
extraído de eritrócitos bovinos que foram aplicadas ao longo da membrana. Esta
mistura migra cromatograficamente ao longo do teste e interage com o antigénio
extraído dos eritrócitos bovinos.
Se a amostra apresentar anticorpos heterófilos da mononucleose infecciosa, uma linha
colorida aparecerá na região da linha de teste, indicando um resultado positivo. Se a
amostra não apresentar anticorpos heterófilos da mononucleose infecciosa, não
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aparecerá nesta região da linha de teste uma linha colorida, indicando um resultado
negativo.
Para verificação de procedimento, aparecerá sempre na região da linha de controlo
uma linha colorida, indicando que o volume da amostra foi suficiente e que absorção
da membrana ocorreu2.
Figura 5 - Cassetes de reação
Este teste tem boa correlação com a reação de Paul-Bunnell-Davidsohn, a qual
tendem a substituir, por serem mais sensíveis e de mais fácil execução.
TESTES ESPECÍFICOS
Estes testes baseiam-se na deteção dos anticorpos produzidos pelo hospedeiro em
resposta aos diferentes antigénios produzidos durante o ciclo viral.
ANTICORPOS ESPECÍFICOS DO EBV
A produção de anticorpos específicos do EBV está associada à presença de
antigénios virais, que são os seguintes:
Abreviaturas Nome Completo Descrição
EBNA Antigénio Nuclear Proteína não estrutural. IgG anti-EBNA são sintetizadas numa fase tardia da infeção primária.
VCA Antigénio da Cápside Viral
Proteína estrutural IgM anti-VCA são sintetizadas nas infeções assintomáticas e na Mononucleose Infecciosa. IgG anti-VCA são sintetizadas em todo o tipo de patologias associadas ao EBV.
EA Antigénio Precoce Proteína precoce, existe em duas formas, restrito (R) e difuso (D).
EA(D) Antigénio Precoce Difuso
Proteína difusa encontra-se presente no citoplasma e no núcleo. IgG anti-EA (D) são sintetizadas na Mononucleose Infecciosa mas raramente nas infeções assintomáticas.
EA(R) Antigénio Precoce Restrito Proteína restrita encontra-se presente no
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Abreviaturas Nome Completo Descrição
citoplasma. IgG anti-EA (R) são sintetizadas nas infeções assintomáticas.
MA Antigénio Membranar Proteínas virais presentes na membrana linfocitária.
EMA Antigénio Membranar Precoce Sintetizado no inicio da infeção viral, não produzem resposta humoral.
LMA Antigénio Membranar Tardio Sintetizado após a infeção viral, não produzem resposta humoral.
LYDMA Antigénio Membranar Tardio Detetado por reação linfocitária.
Figura 6 - Abreviaturas e descrições dos antigénios virais 9
A resposta imunitária humoral é, no início, dirigida aos antigénios da fase lítica. Depois
o vírus entra numa fase de latência associada à expressão de proteínas nucleares
(EBNA) e de membrana (LMP), este processo inicia uma resposta imunitária dirigida
contra as proteínas de latência. A seguir aparecem sucessivamente anticorpos
primeiro dirigidos contra os antigénios do invólucro viral (anti-MA), depois contra os
antigénios da cápside (anti-VCA) e posteriormente contra as proteínas precoces
(anti-EA). Por fim, anticorpos dirigidos contra proteínas da fase de latência
(anti-EBNA)7. Os anticorpos anti-EA vão diminuir até desaparecer, enquanto que os
anticorpos anti-VCA e anti-EBNA vão persistir. A resposta imunitária tem um papel
fundamental para limitar a infeção primária e para controlar a fase de latência.
No inicio da MNI, os anticorpos heterófilos aparecem em 60 a 80% dos casos, os
anticorpos anti-EA em 70 a 80% dos casos, os anticorpos anti-VCA IgM em 100% dos
casos e os anticorpos anti-VCA IgG em perto de 100%.
Durante a fase da convalescença os anticorpos anti-VCA IgG persistem e,
aproximadamente 95% das pessoas, apresentam anticorpos anti-EBNA IgG (1, 2, 3, 4
e 5). Se os 5 anticorpos forem medidos existem cerca de 32 possibilidades de
diferentes padrões serológicos3.
TÉCNICAS LABORATORIAIS
Para a pesquisa da presença destes anticorpos são normalmente utilizadas técnicas
de imunofluorescência indireta e ensaios imunoenzimáticos (ELISA/EIA), tendo estes
últimos uma sensibilidade superior às técnicas de imunofluorescência indireta.
Para se distinguir uma infeção recente de uma não recente pode também realizar-se o
teste de avidez.
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IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
A técnica da imunofluorescência utiliza moléculas de anticorpo marcadas com um
composto fluorescente para detetar os respetivos
antigénios.
Baseia-se no comportamento de certas moléculas que
fluorescem quando expostos a determinados comprimentos
de onda (frequentemente luz ultravioleta) no microscópio de
fluorescência.
Cada corante emite luz num comprimento de onda.
Exemplos de tais moléculas são a fluoresceína
(amarelo-esverdeada) e a rodamina (laranja-avermelhada).
Os anticorpos podem ser ligados a estas moléculas: são
então denominados anticorpos marcados ou fluorescentes.
Na imunofluorescência indireta um anticorpo não marcado é
inicialmente aplicado a um esfregaço de células infetadas
com o EBV. Na etapa seguinte, um segundo anticorpo
fluorescente contra a imunoglobulina da espécie animal utilizada para preparação do
anticorpo inicial, é adicionado e então esta mistura é incubada. Este procedimento liga
o anticorpo fluorescente ao anticorpo específico que reagiu com o antigénio presente
nas células. Após a lavagem da lâmina para retirar os anticorpos não ligados, o
esfregaço é observado ao microscópio de fluorescência. Se a amostra fluoresce, o
anticorpo que se associa ao segundo anticorpo marcado está presente.
ENSAIOS IMUNOENZIMÁTICOS (ELISA/EIA)
As técnicas EIA dividem-se em dois grandes grupos:
– EMIT “enzime-multiplied immunoassay techniques”
– ELISA “enzime-linked immunosorbent assays”
Nas técnicas EMIT a reação ocorre num meio líquido homogéneo e a separação entre
reagentes ligados e não ligados não é satisfeita.
Nas técnicas ELISA, parte das reações ocorrem em meio sólido que também serve
para separar os imunocomplexos dos reagentes não ligados. Esta técnica consiste na
deteção ou quantificação de um antigénio (Ag) ou anticorpo (Ac) usando um ligando
Figura 7 - Imunofluorescência Indireta
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(anti-Ag ou anti-Ac) conjugado com uma enzima cuja reação se traduz na alteração de
cor do substrato.
Tem por base a capacidade de um Ac reconhecer um dado epítopo (parte estrutural
de um Ag reativo). É um método sensível, reprodutível e não radioativo, mais usado no
estudo Ag-Ac.
Atendendo a que o pretendido é a deteção de anticorpos, o tipo de ELISA mais
apropriado será o ELISA indireto, cuja reação ocorre da seguinte forma:
Figura 8 - ELISA indireto
Existem também técnicas que associam o método imunoenzimático em duas etapas
com uma deteção final em fluorescência (ELFA)3.
TESTE DE AVIDEZ
O teste de avidez baseia-se no princípio de que a afinidade das moléculas de IgG para
o seu antigénio aumenta progressivamente com o tempo durante o estabelecimento
da resposta imunológica.
Nos anticorpos com alta afinidade com o seu antigénio, a ligação antigénio-anticorpo é
forte e estável, enquanto que nos anticorpos com baixa afinidade a ligação é mais
fraca e instável.
Através da determinação da avidez dos anticorpos do tipo IgG para um determinado
vírus é possível saber se a amostra de soro analisada foi colhida recentemente ou
remotamente, após a infeção primária, sendo que quando a avidez é baixa indica-nos
que a infeção é recente e quando a avidez é alta a infeção é antiga9.
anticorpo específico liga-se ao antigénio
antigénio absorvido no poço
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RESULTADOS SEROLÓGICOS E SUA INTERPRETAÇÃO
Utiliza-se o teste de pesquisa de anticorpos específicos anti-EBV em doentes com
suspeita de infeção aguda por EBV sem anticorpos heterófilos, bem como em
pacientes com infeções atípicas. Os testes serológicos são particularmente úteis em
crianças pequenas que muitas vezes não produzem anticorpos heterófilos. Os títulos
de anticorpos IgM e IgG contra o antigénio da cápside viral (VCA) mostram-se
elevados no início da doença. O anticorpo IgM dirigido contra o VCA é útil para o
diagnóstico da mononucleose infecciosa aguda, visto que só está presente em títulos
elevados nos primeiros dois meses da doença. Em contraste, o anticorpo IgG
anti-VCA é muitas vezes utilizado para avaliar uma exposição antiga ao EBV, devido à
sua persistência durante o resto da vida.
Detetam-se anticorpos dirigidos contra antigénios precoces (EA) num padrão difuso no
núcleo e no citoplasma de células infetadas (anticorpo EA-D) ou restrito ao citoplasma
(anticorpo EA-R). Esses anticorpos podem ser detetados três a quatro semanas após
o aparecimento dos sintomas em pacientes com mononucleose infecciosa. Cerca de
70% dos indivíduos com mononucleose infecciosa, sobretudo os que apresentam
doença relativamente grave, produzem anticorpos EA-D durante a evolução da
doença. Em geral, esses anticorpos só persistem durante três a seis meses. Os níveis
de anticorpos EA-D também são elevados em pacientes com carcinoma da
nasofaringe ou infeção ativa crónica por EBV. Os anticorpos EA-R são apenas
ocasionalmente detetados em pacientes com mononucleose infecciosa, todavia, são
muitas vezes encontrados em níveis elevados em pacientes com linfoma de Burkitt
africano ou com infeção ativa crónica por EBV.
Os anticorpos IgA contra antigénios do EBV são úteis na identificação de pacientes
com carcinoma nasofaríngeo e de indivíduos com alto risco de desenvolverem a
doença. A seroconversão para positividade dos EBNA também é útil no diagnóstico da
infeção por EBV aguda. Os anticorpos anti-EBNA são detetáveis num estádio
relativamente tardio (3 a 6 semanas após o início dos sintomas) em quase todos os
casos de infeção aguda por EBV e persistem durante toda a vida do paciente. Estes
anticorpos podem estar ausentes em pacientes imunodeficientes e naqueles que
apresentem uma infeção por EBV crónica ativa.
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Anticorp os anti -EBV
Infeção IgG anti-EBNA IgG anti-VCA IgM anti-VCA IgG anti-EA
Suscetibilidade - - - -
Recente -/+ +/++ + -/+
Antiga +/++ +/++ - -
Reativação +/++ ++/+++ - +/++
Linfoma de Burkitt ++ ++ - ++ (EA-D)
Carcinoma da Nasofaringe
++/+++ ++/+++ - ++/+++ (EA-R)
- negativo; + borderline; + positivo (1/10 -1/160); ++ positivo “forte” (1/320 – 1/640); +++ positivo “muito forte” (1/1280/>1/2560)
Figura 9 - Resultados serológicos e sua interpretaç ão9
CARGA VIRAL DO EBV
A deteção de ADN, de ARN ou de proteínas do EBV tem sido importante para
demonstrar a associação do vírus a diversas neoplasias. A reação de polimerase em
cadeia (PCR) tem sido utilizada para detetar o ADN do EBV no líquido
cefalorraquidiano de alguns pacientes com SIDA que apresentam linfomas, bem como
para monitorizar a quantidade de ADN do EBV no sangue de pacientes com doenças
linfoproliferativas. Este parâmetro pode ser utilizado para fazer um diagnóstico precoce
e para monitorizar a eficácia da terapia. Para além disso, a carga viral do EBV é
frequentemente elevada em pacientes com carcinoma da nasofaringe e o nível dessa
elevação corresponde ao estádio do tumor. Nos doentes com SIDA, a amplificação de
ADN do EBV no líquido cefalorraquidiano, tal como já foi referido, é indicativa de
linfoma cerebral e pode ser utilizada para monitorizar a eficácia do tratamento
posterior.
A quantificação da carga viral do EBV em soro, plasma e leucócitos de sangue
periférico é utilizada em pacientes de alto risco e para monitorizar a resposta à
terapêutica para EBV no grupo de pacientes acima descrito14.
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CONCLUSÃO
A realização deste trabalho foi importante para a aquisição de novos conhecimentos e
maturação de alguns já existentes relativamente à família Herpesviridae, mais
especificamente ao Vírus Epstein-Barr.
Este é um vírus ubiquitário e com distribuição mundial e os danos causados no
hospedeiro infetado variam conforme o estado imunológico do mesmo, logo os efeitos
causados podem ir de ligeiros a severos, sendo necessário um rápido e conclusivo
diagnóstico para que o clínico possa proceder ao tratamento mais correto e eficaz.
Nesta fase, ressalvo a importância das diversas técnicas existentes e da sua
complementaridade no diagnóstico laboratorial da infeção por EBV.
Concluo também este trabalho com a certeza da importância da evolução da Medicina
e da Genética no conhecimento deste vírus, o que possibilitou o desenvolvimento de
técnicas cada vez mais sensíveis e específicas para o diagnóstico laboratorial do EBV
e das diversas patologias associadas.
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BIBLIOGRAFIA
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