Post on 17-Jan-2016
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BioinformáticaGenômica, Transcritômica e Metagenômica
Gabriel da Rocha FernandesUniversidade Católica de Brasília
gabrielf@ucb.br - fernandes.gabriel@gmail.com
+Estratégia de sequenciamento
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+Estratégia de sequenciamento
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+Sequenciadores
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+Arquivos de sequências
nAB1 e ESD - Sanger
nFastq - Illumina
nSFF - 454
nEsses arquivos tem que ser processados e a sequencia FASTA gerada.
nAlguns programas disponibilizam também o arquivo de qualidade das sequencias.
nPossível montagem sem a conversão em FASTA.
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+FastQ
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+Qualidade
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+Montagem
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+Análise de sequências?
nTransformar os dados do sequenciador em conhecimento biológico.
nBase calling.
nMontagem.
nPredição de genes.
nIdentificação de promotores e marcadores.
nGenômica comparativa.
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+Montagem do genoma
nAlinhamento das sequencias para geração de um consenso.
nIdentificação e eliminação dos gaps.
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+Predição de genes
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+Análise Funcional
nAssocia uma função aos genes preditos.
nBaseada na homologia entre sequências.
nUtiliza bases de dados de sequências conhecidas e programas de alinhamento.
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+Transcritoma
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nConjunto de todas as moléculas de RNA encontradas em uma população celular:n mRNAn tRNAn rRNAn miRNA
nTotal de transcritos encontrados em um organismo, tipo celular, condição...
nReflete os genes que estão sendo expressos em um determinado momento.
nSnapshot da função celular.
+Métodos de estudo
nExpressed Sequence Tags.
nSequenciado por método de Sanger.
nClonagem dos fragmentos usando vetores.
nNão funciona em procariotos.
nLow throughput.
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+Métodos de estudo
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nMicroarray.
nArranjos com os genes em locais determinados.
nComparação de amostras par a par.
nHibridização.
+Next Generation Sequencing
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+Custo do sequenciamento
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+RNA-seq
nUltra larga escala.
nNão necessita de clonagem.
nBaixo custo.
nValores absolutos.
nAnálise multi amostras.
nGrande cobertura.
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+Protocolo
nProtocolo para montagem da biblioteca pode variar de acordo com a tecnologia e com o objetivo:
nRemoção de rRNA.
nAmplificação por PCR.
nConversão a cDNA.
nSingle read ou pair end.
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+Genoma referência vs. Montagem de novo
nMapeamento dos reads a um genoma referência.n Quantificação da expressão.n Identificação de variantes de splicing.
nMontagem de novo do transcritoma.n Caracterização dos genes expressos.n Identificação de isoformas.n Ausência de genoma referência.
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+O que sai do sequenciador?
nFormato padrão para análises é o FastQ.
n @SEQ_IDGATTTGGGGTTCAAAGCAGTATCGATCAAATAGTAAATCCATTTGTTCAACTCAC+!”*((((***+))%%%++)(%%%%).1***-+*”))**55CCF»»»CCCCCCC65
nPrimeira linha: identificador da sequência.n Nome da sequência.n Informação sobre filtros.
nTerceira linha: qualidade da chamada da base (em código).
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+Montagem
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+Mapeamento e quantificação
nAs sequências produzidas são mapeadas a um genôma referência.
nAlinhou em apenas uma região = ótimo.
nAlinhou em mais que uma região = dilema.
nO uso de replicatas é FUNDAMENTAL!
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Repl. 1 Repl. 2 Repl. 3
Gene A 5 3 12
Gene B 16 25 35
Gene C 10 15 3
Gene D 750 500 500
Gene E 1504 1005 1030
+Interpretando a contagem dos genes
nNo exemplo da tabela, o Gene E tem duas vezes mais reads que o Gene D:n Gene E é expresso duas vezes mais que o Gene D.n Ambos os genes se expressam na mesma intensidade, mas o Gene E é
duas vezes maior que o Gene D.n Ambos os genes tem o mesmo tamanho e se expressam na mesma
intensidade, mas o Gene D tem um parálogo no genoma ao qual metade dos seus reads foram mapeados.
nA causa é os três ao mesmo tempo.
nMas quando analisamos o mesmo gene em 2 condições diferentes, os efeitos 2 e 3 são desconsiderados.
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+Identificando genes diferencialmente expressos.
nComparar diferentes condições: controle com testes.n Célula normal com célula tumoral.n Planta sem e com estresse hídrico.n Animal sem e com parasita...
nGenes em duas condições diferentes VÃO apresentar quantidades de reads diferentes.
nEssa variação pode ser diferença biológica entre as duas condições, ou ruído experimental.
nAplicação de testes estatísticos.
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+Identificando genes diferencialmente expressos.
nPara identificar uma diferença estatisticamente significantes, é necessário que a diferença de expressão entre as duas condições seja maior que a imprecisão do nível de expressão sob uma determinada condição.
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+Sou pobre, não vou usar replicata.
nLição de vida:n Um Gene H, em uma célula normal extraída do Zé Moreno, tem 5 reads.n O mesmo Gene H, em célula tumoral extraída do mesmo Zé Moreno,
tem 10 reads.n Uoua! O Gene H é duas vezes mais expresso na célula tumoral!
n Ganhei uns trocados e fiz transcritoma da célula normal de mais 2 pacientes. De brinde, ganhei o sequenciamento do Zé moreno de novo.
n O Gene H teve 12 reads na célula do Zé Moreno, 17 reads na Maria Tolé, e 22 reads na célula do Tião Torresmo.
nMoral da história: quanto mais medições fizer, mais vai ter certeza dos níveis de expressão dos genes.
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+Replicata técnica vs. Replicata biológica
nTécnica: explica a variação encontrada que pode ter sido causada por critérios técnicos: preparação da biblioteca, qualidade do sequênciamento, cobertura do gene...
nBiológica: explica a variação encontrada que pode ter sido causada pela variabilidade de expressão que não está associada à mudança nas condições do experimento.
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+Fontes de variaçãoVariância de Poisson
nÉ a incerteza existente em qualquer medição em que algo é amostrado e contado.
nComo é baseado no valor da contagem em si, não é específico do experimento.
nEssa variância está relacionada a quantidade total de reads.
nPor exemplo, a diferença na expressão de um gene medido com 1 read versus 2 reads é inerentemente menos seguro do que as diferenças na expressão de um gene medido com 100 reads versus 200 reads, apesar de ambas as diferenças serem, nominalmente, uma mudança 2X.
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+Fontes de variaçãoVariância de Poisson
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+Fontes de variaçãoVariação Técnica Não-Poisson
nAssociado à incapacidade da técnica não conseguir medir a expressão perfeitamente.
nVisto em replicatas técnicas.
nCausas:n Seleção de miRNA.n Depleção de rRNA.n Amplificação por PCR.n Armazenamento.n RNA-later.
nMoral da história: Manipule sua amostra o mínimo possível.
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+Fontes de variaçãoVariação Biológica
nOcorre naturalmente nas amostras.
nA expressão naturalmente flutua em células sob a mesma condição.
nCausas da variações biológicas podem ser diferenças genéticas, de maquinaria celular, ou de resposta a variação do ambiente.
nVariação biológica também sofre a influência das outras duas variações vistas.
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+Filosofando...
nMais replicatas vs. Mais reads.
nComo lidar com batch-effects?
nPreciso validar com RT-PCR?
nEu considero como diferencialmente expresso genes com p-value < 0.01.
nCalcular FDR (False discovery rate)
nLeia artigos que tenham usado benchmarks.
nConverse com o bioinformata que vai fazer as análises.
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+Metagenômica
nMetagenoma: material genético recuperado diretamente de amostras ambientais.
nFornece informações sobre os organismos em seu habitat natural.
+Metagenômica
nCerca de 99% das bactérias não são cultiváveis.
nPermite o estudo de organismos que não são facilmente cultivados em laboratório.
nIdentificação de funções em espécies ainda não identificadas.
+Análise do gene do rRNA 16s
nGene altamente conservado em bactérias e archaea.
nRegião hiper variável confere sequências com assinatura específica.
nFornece um perfil da diversidade na amostra.
+Whole Genome Shotgun e nova geração de sequenciadores
nPermite uma visão mais global da comunidade.
nAnálise dos níveis da diversidade filogenética e polimorfismos intraespecíficos.
nEstudo de genes completos e de vias metabólicas da comunidade.
nReconstrução dos genomas.
nDemanda intensa análise bioinformática.
+Etapas da análise metagenômica
nFatores influentes.
nInterdependências ocultas.
+Métodos de estudo - Funcional
nIsolamento do DNA da amostra.
nClonagem do DNA em um hospedeiro.
nExpressão do gene e análise funcional.
nAnálise das sequências.
+Métodos de estudo - Genômico
nDNA isolado pode ser submetido a um sequenciamento aleatório ou direcionado.
nPermite montagem de todo metaboloma.
nAnálise filogenética.
nMetagenômica comparativa.
+Análise filogenética e funcional
+Pipeline de análise
+Assinatura filogenética
nCada read é associado a um organismo (espécie, gênero, família…)
nUtiliza bases de dados de genômas referência ou base de dados NT do NCBI.
nFerramenta de alinhamento.
nValores de identidade para definir o nível cladístico assinado.
88% 98% 99%
Bacteroides fragilis
Escherichia coli
70%
+Assinatura filogenética
nComposição geral da amostra
nPrograma: MEGAN
nAgrupa multiplos alinhamentos em um nível cladístico.
+Análise filogenética
nQual clado prevalece na amostra?
nExiste um perfil filogenético?
nIdentificação de marcadores filogenéticos.
nAssociação da presença de um clado a uma determinada característica.
+Anotação funcional
nAvaliar o potencial genético da amostra.
nMontagem dos contigs.
nPredição dos genes.
nAlinhamento dos genes preditos a uma base de dados.
+Análise funcional
nQual função está mais presente?
nExiste alguma função do seu interesse?
nMontagem do mapa metabólico do ambiente.
nRastrear a função e identificar o organismo que executa.
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+Visualização