PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS

BIOTECNOLÓGICOS

PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS

BIOTECNOLÓGICOS

Diversidade de produtos biotecnológicos não há processos de purificação e aplicação geral

Escolha das operações unitárias uso da molécula alvo e suas características físico-químicas

ETAPAS PRINCIPAIS

Clarificação = separação de células e seus fragmentos do meio de cultivo

Concentração e/ou purificação de baixa resolução = separação da molécula alvo

Purificação de alta resolução = separação de classes de moléculas com algumas características físico-químicas semelhantes

Operações para acondicionamento final do produto

Para produtos associados às células rompimento celular

A redução do número de etapas é de fundamental importância na viabilidade do processo

Exemplo, se a cada operação unitária o rendimento em produto for de 90%, a aplicação de 9 operações levará a um rendimento final de cerca de apenas 40%

PURIFICAÇÃO DE PRODUTOS

BIOTECNOLÓGICOS

OPERAÇÕES UNITÁRIAS

CLARIFICAÇÃO:

Filtração convencional

Centrifugação

Filtração tangencial

Floculação

OPERAÇÕES UNITÁRIAS

ROMPIMENTO DE CÉLULAS:

Homogeneização

Moagem em moinho de bolas

Rompimento químico ou enzimático

OPERAÇÕES UNITÁRIAS

PURIFICAÇÃO DE BAIXA RESOLUÇÃO:

Precipitação

Ultrafiltração

Extração em sistemas de duas fases líquidas

OPERAÇÕES UNITÁRIAS

PURIFICAÇÃO DE ALTA RESOLUÇÃO:

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia de afinidade (biológica ou química)

Cromatografia de fase reversa

Cromatografia de exclusão molecular

OPERAÇÕES UNITÁRIAS

TRATAMENTOS FINAIS:

Cristalização

Liofilização

Secagem

CLARIFICAÇÃO

É a separação de células suspensas de um meio de cultivo

É a primeira operação unitária do processo de purificação

O meio resultante (isento de células) é denominado clarificado ou filtrado

Depende da dimensão da partícula a ser removida

Filtros convencionais Centrifugação

Microfiltração

0,1 m 1 m 10 m 100 m

Bactérias Leveduras

Bolores

CLARIFICAÇÃO

FILTRAÇÃO CONVENCIONAL

Aplica-se à clarificação de grandes volumes de suspensões diluídas de células (da ordem de milhares de litros), produtos extracelulares e situações nas quais a assepsia não é necessária

A contínua deposição das células sobre o meio filtrante resulta a formação de uma “torta” de filtração

FILTRAÇÃO CONVENCIONAL

Filtro Rotativo à Vácuo

CENTRIFUGAÇÃO

Processo que acelera o processo de sedimentação pela ação de um campo gravitacional centrífugo

Resulta em suspensões mais concentradas em relação à original

Centrífugas Tubulares

CENTRIFUGAÇÃO

Centrífugas de Discos

CENTRIFUGAÇÃO

MICROFILTRAÇÃO

Filtração tangencial fluido de alimentação escoa tangencialmente à superfície do meio filtrante a tensão de cisalhamento do fluido minimiza o acúmulo de células e seus fragmentos na superfície da membrana

MICROFILTRAÇÃO

Filtro Tubular com Fibra Oca

MICROFILTRAÇÃO

Filtro Tipo Quadro e Placa

MICROFILTRAÇÃO

MICROFILTRAÇÃO

Pode ser conduzida em um ou mais filtros

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS Produtos associados às células

requerem o rompimento ou a permeabilização destas através de operações conduzidas sobre o adensado obtido após a clarificação

Para recuperação de produtos termolábeis ou sujeitos a ação de proteases processo deve ser rápido e conduzido em baixas temperaturas

PAREDE CELULAR

Bactérias Gram (+)

Bactérias Gram (-)D

Leveduras

Fungos Filamentosos

MÉTODOS MECÂNICOS:

Homogeneizador de alta pressão equipamento constituído de pistões projetados para aplicar altas pressões à suspensão celular, forçando sua passagem através de um orifício estreito seguida de colisão contra uma superfície em uma câmara de baixa pressão. A queda instantânea de pressão associada ao impacto, provoca o efetivo rompimento celular sem danificar proteínas

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

MÉTODOS MECÂNICOS:

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

MÉTODOS MECÂNICOS:

Moinho de bolas

Ultrassom

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

MÉTODOS NÃO MECÂNICOS:

Choque osmótico

Congelamento e descongelamento

Secagem

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

MÉTODOS QUÍMICOS:

Álcalis

Solventes

Detergentes

Ácidos

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

MÉTODOS ENZIMÁTICOS:

Adequados para a recuperação de biomoléculas sensíveis à tensão de cisalhamento ou pressão de trabalho geradas pelos métodos mecânicos

Quando uma certa quantidade de parede é removida, a pressão osmótica interna rompe a membrana citoplasmática, permitindo que o conteúdo intracelular seja liberado para o meio externo

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

MÉTODOS ENZIMÁTICOS:

Sistemas líticos são específicos para cada grupo de microrganismo

Para leveduras como glucanases, proteases e mananases

Para bactérias enzimas como glicosidases, acetilmuramilalanina amidases, endopeptidases e proteases

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

MÉTODOS ENZIMÁTICOS:

Vantagens facilidade no controle do pH e temperatura, baixo investimento de capital e alta especificidade para degradação da parede celular

Desvantagens alto custo das enzimas e variação da eficiência da lise enzimática com o estado fisiológico do microrganismo

ROMPIMENTO DE CÉLULAS

MICROBIANAS

PRECIPITAÇÃO

Método utilizado para separar os produtos microbianos em meio aquoso

Método tradicional de concentração e purificação de proteínas

A solubilização de proteínas precipitadas pode ser dimensionada de modo a promover a redução do volume inicial e, portanto, levar ao aumento da concentração pode proceder processos de elevada resolução, como cromatografia

PRECIPITAÇÃO

Proteínas precipitadas têm sua estrutura tridimensional modificada sua aplicação só é viável quando a conformação da proteína é recuperada após a precipitação

“Salting-out” = precipitação de proteínas em altas concentrações salinas. Mais usados: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio

PRECIPITAÇÃO

“Salting-out” = precipitação de proteínas em altas concentrações salinas. Mais usados: citrato de sódio, sulfato de sódio e sulfato de amônio

Precipitação por solventes = devido à redução da constante dielétrica do meio

ULTRAFILTRAÇÃO

Utilizada para concentrar macromoléculas como proteínas ou polissacarídeos

Transporte de soluções através de membranas com poros de diâmetros de 0,001 a 0,1m, sob pressão de transmembrana de 100 a 500kPa e fluxo de filtrado de 10 a 200 L/hm2

ULTRAFILTRAÇÃO

VANTAGENS:

Separação de bioprodutos de caldos fermentados diluídos

Promover a concentração de compostos a baixa temperatura e pressão

Possibilitar a retirada de sais e outras moléculas pequenas

Manter constante o pH do meio

EXTRAÇÃO EM SISTEMAS DE

DUAS FASES AQUOSAS

As moléculas alvo e as impurezas são

separadas como resultado de suas diferentes solubilidades nas fases líquidas imiscíveis (fase aquosa e solvente)

Sistemas de suas fases aquosas: Polietilenoglicol (PEG)/ dextrana (Dx) Polipropilenoglicol (PPG)/ Dx Sulfato dextrana de sódio/PPG PEG/ fosfato de potássio PEG/ sulfato de magnésio PEG/ citrato de sódio

CROMATOGRAFIA

Processo os solutos de um meio líquido (proteínas, peptídeos, anticorpos) são adsorvidos ou retidos em um leito de material poroso

A posterior remoção gradual dos solutos por ação de uma fase líquida móvel (eluente), resulta na separação das diferentes moléculas

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA

CROMATOGRAFIA

Processos cromatográficos industrialmente mais utilizados:

Gel filtração baseado na separação de moléculas em função do volume efetivo em solução

Troca iônica baseado na adsorção das moléculas sobre o leito cromatográfico

TRATAMENTOS FINAIS

Liofilização

Cristalização

Secagem

LIOFILIZAÇÃO

Processo de remoção de um solvente (tipicamente a água) de uma solução por sublimação

Nesse processo o material é congelado e em seguida submetido a baixa pressão para sublimação da água livre

CRISTALIZAÇÃO

Processo de agregação de cristais de moléculas presentes em soluções homogêneas supersaturadas

Operação Unitária Características determinantes

Centrifugação Densidade e tamanho das células

Viscosidade do meio

Filtração convencional Compressibilidade e tamanho das células

Microfiltração Tamanho das células ou partículas

Homogeneização Resistência física da parede celular ao

gradiente de pressão

Moinho de bolas Resistência física da parede celular à

tensão de cisalhamento

Extração em SDFA

Precipitação Solubilidade de proteínas

Cromatografia de troca

iônica Mobilidade eletroforética de proteínas

Ultrafiltração

Gel filtração Massa molecular

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