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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
TESE DE DOUTORADO
Contribuição para a Tecnologia de Produção de Corpos de Oclusão do
Baculovírus Spodoptera: Análise das Proteínas Virais e
Caracterização Matemática
Graciana Clécia Dantas
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Regina da S. Pedrini
Co-orientadoras: Profa. Dra. Andréa Farias de Almeida
Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo
Natal/RN
Maio/2015
ii
Graciana Clécia Dantas
CONTRIBUIÇÃO PARA A TECNOLOGIA DE PRODUÇÃO DE CORPOS
DE OCLUSÃO DO BACULOVÍRUS SPODOPTERA: ANÁLISE DAS
PROTEÍNAS VIRAIS E CARACTERIZAÇÃO MATEMÁTICA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Engenharia Química – PPGEQ, da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutora em
Engenharia Química, sob a orientação da Profa. Dra.
Márcia Regina da Silva Pedrini e a coorientação das
Profas. Dras. Andréa Farias de Almeida e Gorete
Ribeiro de Macedo.
Natal/RN
MAIO/2015
Catalogação da Publicação na Fonte.
UFRN / CT / DEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.
Dantas, Graciana Clécia.
Contribuição para a tecnologia de produção de corpos de oclusão do baculovírus
spodoptera: análises das proteínas virais e caracterização matemática / Graciana Clécia
Dantas. - Natal, 2015.
93 f.: il.
Orientador: Márcia Regina da Silva Pedrini.
Coorientadores: Andréa Farias de Almeida.
Gorete Ribeiro de Macedo.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de
Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação em
Engenharia Química.
1. Baculoviridae - Tese. 2. Produtos químicos - Pragas agrícolas - Controle - Tese.
I. Pedrini, Márcia Regina da Silva. II. Almeida, Andréa Farias de. III. Macedo, Gorete
Ribeiro de. IV. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. V. Título.
RN/UF/BSEQ CDU 578.841(043.2)
DANTAS, Graciana Clécia – Contribuição para a Tecnologia de Produção de Corpos de
Oclusão do Baculovírus Spodoptera: Análise das Proteínas Virais e Caracterização
Matemática. Tese de Doutorado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia
Química. Área de concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Engenharia de
Processos, Natal/RN, Brasil.
Orientação: Profa. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini
Co-orientação: Profa. Dra. Andréa Farias de Almeida
Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo
___________________________________________________________________________
RESUMO:
O uso de agrotóxicos em cultivo agrícola é cada vez maior. Os inseticidas químicos usados na
agroindústria causam grandes preocupações como a contaminação ambiental e a falta de
seletividade aos organismos não-praga. Uma alternativa para esse problema é a utilização de
bioinseticidas, os quais são mais seguros que os agrotóxicos comuns e apresentam vantagens
como menor toxicidade e alta especificidade. Ademais, podem ser utilizados em menor
quantidade, decompõem-se mais rápido e sua utilização associada com os inseticidas
sintéticos faz com que o uso de agrotóxicos seja menor, causando baixo impacto ambiental.
Em particular, bioinseticidas do tipo baculovírus têm sido apontados como uma opção de
substituição aos inseticidas químicos na agricultura. Neste trabalho, foi realizada a produção
in vitro do baculovírus Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus e o estudo do seu perfil
eletroforético com base nas proteínas virais presentes nos vírus extracelulares deste
baculovírus. As partículas de vírus extracelulares obtidas durante a passagem seriada do
baculovírus foram analisadas por eletroforese em gel desnaturante e, como esperado, a
poliedrina, proteína responsável pela formação do corpo de oclusão, com aproximadamente
30 kDa foi destaque em todas as passagens analisadas. Proteínas na região entre 14,4 e 97
kDa também foram detectadas. A análise do efeito da adição do hormônio β-ecdisona extraído
do Ginseng brasileiro e do hormônio ecdisona sintético na produção do baculovírus
Spodoptera foi realizada na terceira e quarta passagens em células Sf21, momento em que a
formação dos corpos de oclusão foi reduzida. Os resultados mostraram que o hormônio
ecdisona não influenciou na produção dos corpos de oclusão na terceira passagem. Porém, na
quarta passagem ao se adicionar o hormônio ecdisona, tanto o sintético como o extraído do
Ginseng brasileiro, houve um aumento aproximado de duas vezes na formação dos corpos de
oclusão quando comparados à produção sem adição de ecdisona. Utilizando este processo de
infecção, foi realizada uma caracterização matemática que representasse o mecanismo de
produção do bioinseticida.
Palavras-chave: SfMNPV, Bioinseticida, Baculovírus, Ecdisona, Ginseng brasileiro, SDS-
PAGE, Caracterização matemática.
ABSTRACT
The use of pesticides in agricultural crops is increasing. Chemical pesticides used in
agribusiness cause major concerns such as environmental contamination and the lack of
selectivity to the target pests. An alternative to this problem is the use of biopesticides. The
bioinsecticides are safer than ordinary pesticides and present others benefits, such as lower
toxicity and high specificity. Furthermore, they can be used in smaller quantities, decompose
faster and when use associated with synthetic insecticides decreases the use of pesticides,
causing low environmental impact. In particular, baculovirus insecticides have been suggested
as an option to these chemical insecticides. In this work, in vitro production of baculovirus
Spodoptera frugiperda nucleopolyhedrovirus was performed and the study of its
electrophoretic profile based on viral proteins present in the extracellular virus. The particles
of extracellular virus obtained during serial passage baculovirus were analyzed by
electrophoresis on denaturing gel and, as expected, the polyhedrin - protein responsible for the
occluded bodies’ formation - with approximately 30kDa was prominent in all analyzed
passages. Proteins in the region between 14.4 and 97 kDa were also detected. The effect of the
addition of the extracted β-ecdysone hormone from Brazilian ginseng and synthetic hormone
ecdysone on the production of baculoviruses Spodoptera was carried out in the third and
fourth passages using Sf21 cells, when the formation of occlusion bodies was reduced. The
results showed that the hormone ecdysone did not influence the production of occlusion
bodies in the third passage. However, in the fourth passage by adding the hormone ecdysone,
both synthetic as well extracted from Brazilian ginseng, there was an approximate two-fold
increase in the formation of occlusion bodies as compared to the results without addition of
ecdysone. Using this process of infection, caracterization mathematical to represent the
biopesticide production mechanism was carried out.
Key words: SfMNPV, Biopesticide, Baculovirus, Ecdisone, Brazilian Ginseng, SDS-PAGE,
Mathematical caracterization.
A meu pai João Justino (in memorian) e a minha mãe Graça
por todo amor e confiança em mim depositada e por serem
responsáveis pelo meu crescimento profissional e pessoal.
A toda a minha família, pelo carinho e incentivo
em todos os momentos desta jornada.
DEDICO.
AGRADECIMENTOS
À Deus por me apontar sempre o caminho correto a seguir e me dar forças para
continuar quando tudo parecia estar difícil demais.
À minha mãe pelo exemplo, dedicação e amor incondicional dispensados a mim em
todos os momentos da minha vida.
Aos meus irmãos Júnior, João Hélio, Getúlio e George pelo grande apoio, carinho e
paciência.
Às minhas orientadoras, professoras doutoras Márcia Pedrini, Andréa Almeida e
Gorete Ribeiro pela dedicada orientação, oportunidade, disponibilidade, confiança, carinho,
apoio, valiosos ensinamentos e ajuda de sempre.
Aos Professores Jackson Araújo e Paulo Marinho pela presença na banca de
qualificação, contribuindo grandemente com o trabalho.
Ao doutor Diego Tresinari da UNICAMP pela doação do extrato do hormônio
ecdisona.
À professora Adriana Uchôa por toda dedicação na análise do gel de eletroforese.
Aos queridos Iuri, Milena e Ricardo pela ajuda nos experimentos.
Ao Carlos Eduardo pelo total empenho na execução da caracterização matemática
desse trabalho. A você, toda a minha gratidão!
Aos colegas do Laboratório de Engenharia de Alimentos pelas grandes alegrias no
convívio diário de trabalho.
Aos funcionários do PPGEQ, Mazinha e Medeiros, que sempre me ajudaram de forma
amigável e prestativa nas mais diversas questões surgidas ao longo deste curso.
A todos os meus amigos pela torcida e pelos momentos de descontração, carinho,
demonstração de verdadeira amizade, e por estarem sempre presentes.
Aos anjinhos da minha vida João Neto, Jodoval Neto, Rainan e Ludmila pelo amor
verdadeiro e por me fazerem sorrir nos momentos de estresse.
A Capes, pela bolsa concedida.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho, os meus sinceros agradecimentos e reconhecimento.
SUMÁRIO
Lista de figuras .............................................................................................................................
Lista de tabelas .............................................................................................................................
Nomenclatura................................................................................................................................
Lista de variáveis ..........................................................................................................................
Capítulo 1.Introdução Geral ..................................................................................................... 17
Capítulo 2.Análise das proteínas virais presentes na passagem seriada do baculovírus fMNPV
em células Sf21 ......................................................................................................................... 23
2.1. Revisão bibliográfica ................................................................................ 23
2.1.1. Produção de baculovírus em sistema in vitro ......................................................... 23
2.1.1.1. Passagem Seriada ................................................................................................ 26
2.1.2. Características das proteínas virais ......................................................................... 28
2.1.3. Análise das proteínas virais .................................................................................... 33
2.2. Metodologia Experimental ....................................................................... 33
2.2.1. Linhagem de células e vírus ................................................................................... 33
2.2.2. Passagem seriada .................................................................................................... 35
2.2.3. Preparo das amostras para as análises de eletroforese em gel ................................ 36
2.2.4. Dosagem de proteínas ............................................................................................. 36
2.2.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) ............................................. 37
2.3. Resultados e Discussão ............................................................................. 38
2.3.1. Dosagem de proteínas através do método de Bradford .......................................... 38
2.3.2. Análise das proteínas do vírus extracelular (BVs) através de eletroforese em gel de
poliacrilamida - SDS ........................................................................................................ 39
2.4. Conclusões ................................................................................................ 41
Capítulo 3.Adição de ecdisona na produção em batelada do baculovírus SfMNPV ............... 43
3.1. Revisão bibliográfica ................................................................................ 43
3.1.2. Otimização da produção in vitro de baculovírus .................................................... 43
3.1.2.1. Hormônio 20 – Hidroxiecdisona ......................................................................... 44
3.2. Metodologia Experimental ....................................................................... 49
3.2.1. Determinação da concentração celular e quantificação dos corpos de oclusão (OB)
.......................................................................................................................................... 49
3.2.2. Adição de ecdisona extraído do Ginseng brasileiro e de ecdisona comercial ....... 50
3.3. Resultados e Discussão ............................................................................. 50
3.3.1. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 3ª passagem . 50
3.3.2. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 4ª passagem . 53
3.4. Conclusões ................................................................................................ 57
Capítulo 4.Modelagem matemática e simulação da produção de baculovírus SfMNPV ......... 59
4.1. Revisão bibliográfica ................................................................................ 59
4.2. Definição das equações matemáticas ........................................................................ 62
4.2.1. Concentração de células viáveis não infectadas ..................................................... 62
4.2.2. Concentração de células viáveis infectadas ............................................................ 63
4.2.3. Concentração de células não viáveis ...................................................................... 64
4.2.4. Concentração viral .................................................................................................. 64
4.2.5. Estimação de parâmetros do modelo ...................................................................... 65
4.2.6. Algoritmo de otimização por enxame de partículas ............................................... 66
4.3. Metodologia Experimental ....................................................................... 67
4.3.1. Formulação do Modelo ........................................................................................... 67
4.3.1.1. Considerações do modelo .................................................................................... 67
4.4. Resultados e Discussões ........................................................................... 73
4.4.1. Parâmetros estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton ................................. 73
4.4.2. Análise da sensibilidade paramétrica ..................................................................... 78
4.4.3. Comportamento das respostas do modelo matemático .......................................... 81
4.5. Conclusões ................................................................................................ 85
Capítulo 5.Considerações finais ............................................................................................... 88
Referências Bibliográficas ........................................................................................................ 91
Lista de figuras
Figura 1.1. Esquema representativo dos capítulos abordados..................................................21
Figura 2.1. Estrutura e composição das partículas infectivas dos baculovírus: Vírus
extracelular (BV); vírus derivado de oclusão (ODV). .............................................................. 24
Figura 2.2. Produção de corpos de oclusão durante passagem seriada do baculovirus
Spodoptera em células de inseto Sf21. ..................................................................................... 27
Figura 2.3. Reconstrução filogenética das sequências proteicas VP1054 dos baculovírus.. .... 32
Figura 2.4. Aparato para gel de poliacrilamida (SDS-PAGE.. ................................................. 37
Figura 2.5. Dosagem de proteína total da passagem seriada de SfMNPV. .............................. 38
Figura 2.6. Análise de proteínas estruturais de Spodoptera frugiperda MNPV. Eletroforese em
gel de poliacrilamida – SDS 12%. ............................................................................................ 39
Figura 3.1. Estrutura química da beta-ecdisona. ...................................................................... 46
Figura 3.2. Aspecto geral de um espécime de Pfaffia glomerata. .............................. ..............47
Figura 3.3. Aspecto das raízes de Pfaffia glomerata................................................................48
Figura 3.4. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 3.....51
Figura 3.5. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 3ª passagem .................. 52
Figura 3.6. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 4..... 54
Figura 3.7. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 4ª passagem:a) produção
volumétrica; b) produção específica. ........................................................................................ 55
Figura 4.1 Classificação de modelos.........................................................................................60
Figura 4.2. Fases na trajetória de vírus e a produção de proteína de uma suspensão de células
infectadas com baculovírus recombinante. A fase latente, a fase de produção, e a fase de
decaimento................................................................................................................................68
Figura 4.3. Dados experimentais utilizados para a simulação. Concentração de células não
viáveis (Nnv), (A); concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB,
(C).............................................................................................................................................69
Figura 4.4. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio das células
controle. Dados experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto
paramétrico re-estimado (). A) Células viáveis; B) Células não-
viáveis.......................................................................................................................................74
Figura 4.5. Análise de sensibilidade paramétrica do modelo matemático proposto para os
ensaios de infecção de SfMNPV em células de inseto Sf21 sem adição de hormônio ecdisona
(A), com adição de hormônio ecdisona sintético (B) e com hormônio ecdisona extraído do
Ginseng brasileiro(C)...............................................................................................................80
Figura 4.6. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio sem hormônio
ecdisona. Dados experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com o
conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv), (A);
concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB, (C)..........................................82
Figura 4.7. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio
ecdisona sintético. Dados experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com
o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv), (A);
concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB, (C)...........................................83
Figura 4.8. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio
ecdisona extraído do Ginseng brasileiro. Dados experimentais (); Dados simulados pelo
modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células
não viáveis (Nnv), (A); concentração de células viáveis (Nv), (B) e produção de OB,
(C).............................................................................................................................................84
Lista de tabelas
Tabela 2.1. Principais proteínas codificadas por ORFs localizadas nas extremidades dos
clones de SfMNPV-19..............................................................................................................30
Tabela 4.1. Condições iniciais dos ensaios de infecção do baculovírus SfMNPV em células de
inseto Sf21.. .............................................................................................................................. 70
Tabela 4.2. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton no ensaio
de infecção sem adição do hormônio ecdisona. ....................................................................... 75
Tabela 4.3. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton no ensaio
de infecção com adição do hormônio ecdisona sintético ......................................................... 76
Tabela 4.4. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton no ensaio
de infecção com adição de hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro ...................... 77
Nomenclatura
20-HE 20-Hidroxiecdisona
AcMNPV Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus
AgMNPV Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus
AgMNPV-2D Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus clone 2D
Bac-HÁ Baculovírus recombinante do vírus da gripe do subtipo H6
BmNPV Bombix mori nucleopolyhedrovirus
BV-RVG/RVG Baculovírus recombinante do vírus da raiva
BVs Budded virus – vírus extracelular
CNPMS Centro Nacional de Pesquisa de Milho e Sorgo
d.p.i Dia pós infecção
DIPs Partículas interferentes defectivas
FP mutantes poucos poliedros
GP64 Glicoproteína 64
h.p.i Hora pós infecção
HaSNPV Helicoverpa armigera single nucleopolyhedrovirus
IEF Isoeletrofocalização
IGRs reguladores do crescimento de insetos
IPLB-Sf21 Linhagem de célula Sf21 de Spodoptera frugiperda
MIP Programa Integrado de Manejo de Pragas
MOI Multiplicidade de infecção
MP muitos poliedros
NS1 proteína não estrutural do vírus da dengue
OBs Corpos de oclusão
ODV vírus derivado do OB
ORFs fase de leitura aberta
PBM modelos de balanço populacional
PIBs Poliedros
PSO Otimização por enxame de partículas
rpm Rotação por minuto
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
Sf21 Linhagem de célula da Spodoptera frugiperda clone 21
Sf9 Linhagem de célula da Spodoptera frugiperda clone 9
SFM meio sem soro
SfMNPV Spodoptera frugiperda multiple nucleopolyhedrovirus
T.ni Células Trichoplusia ni
TEMED Tetrametiletilenodiamina
vAgEGT∆-LacZ Baculovírus recombinante de Anticarsia gemmatalis multiple
nucleopolyhedrovirus
VHSV Vírus da septicemia hemorrágica viral
Lista de variáveis
µmax Velocidade específica de crescimento
C Concentração de células
c1 Parâmetro cognitivo
c2 Parâmetro social
COB Concentração de OB
D Fator de diluição
D Dimensão de busca
FO Função objetivo
I Índice de observações de uma saída do modelo
K Número da iteração
K Índice do vetor de parâmetros do modelo
ka Coeficiente de ataque viral às células viáveis não infectadas
kd1 Taxa de morte celular específica em células viáveis não infectadas
kd2 Taxa de morte celular específica em células viáveis infectadas
kdv Velocidade de decomposição
KDa Quilodalton
M Marcador de peso molecular
MOB Média da contagem de OB
N Total de observações de uma resposta do modelo
Ncélulas Número de células contadas
Ni Balanço material da população de células viáveis infectadas
Nnv Variação da população de células não viáveis
Nu Balanço material de células viáveis não infectadas
P Partícula
P1 Passagem seriada 1
P3 Passagem seriada 3
P5 Passagem seriada 5
r1 e r2 Números randômicos da distribuição uniforme
snd,ik Informação adimensional da sensibilidade paramétrica individual
V Velocidade da partícula
Vt Concentração viral (OB/mL)
W Parâmetro peso inicial
X Posição atual da partícula
xglob
Melhor posição obtida pelo enxame
xind
Melhor posição da partícula
Α Taxa de produção viral específica
α Velocidade específica de formação de OB
τearly Tempo que delimita a etapa inicial
τexp Tempo que delimita a fase exponencial de crescimento celular
τest Tempo que delimita a fase estacionária
τvlate Tempo que delimita a fase muito tardia
Capítulo 1. Introdução Geral 17
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Capítulo 1.
Introdução Geral
O Brasil, por ser um país com atividade agrícola bastante expressiva, tem enorme
interesse quando se trata do combate de pragas agrícolas. Tendo em vista a alta produção
nacional e o custo com agrotóxicos, é relevante investir no controle de pragas.
Dentre as pragas que causam danos à atividade agrícola brasileira, destaca-se a lagarta-
do-cartucho do milho, Spodoptera frugiperda J.E. Smith (Lepidoptera: Noctuidae), também
conhecida por lagarta do milharal ou lagarta militar, considerada como a principal praga da
cultura do milho no Brasil. A preferência de S. frugiperda pelo cartucho do milho, não exclui
o ataque às folhas e aos grãos das espigas, o que explica o tamanho do prejuízo causado às
plantações (Cruz & Monteiro, 2004).
O controle de pragas principalmente em sistemas de produção agrícola tem sido
realizado mediante aplicações frequentes de inseticidas químicos, como método predominante
para redução de danos econômicos em lavouras. Embora o controle químico seja importante
para este fim, o uso de produtos de alta toxicidade pode resultar em efeitos adversos ao
homem e ao meio ambiente (Moscardi & Souza, 2002). Além disso, pode causar resistência às
populações de pragas (Carpio et al., 2013) e destruir predadores naturais que ajudam no
biocontrole de pragas (Kalha et al., 2014).
O controle de pragas por métodos biológicos aplicados é um avanço na agricultura
mundial. Organismos que normalmente têm preferências específicas a determinadas pragas,
inócuos a outros animais benéficos e a pessoas, são preferenciais para o controle de pragas.
Em particular, os vírus do tipo baculovírus, são considerados importantes agentes de controle
biológico devido à especificidade oferecida aos seus organismos-alvo (hospedeiros) e a sua
forma de disseminação (Federici, 2002).
A propagação de baculovírus é feita através dos próprios hospedeiros (cultivo in vivo)
ou utilizando as células embrionárias ou epiteliais isoladas destes hospedeiros (cultivo in
Capítulo 1. Introdução Geral 18
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
vitro). Atualmente, a produção de baculovírus ainda é realizada em sistema de cultivo in vivo,
onde sua propagação é na própria lavoura. Esse processo torna-se ineficiente, pois necessita
da presença da lagarta durante o cultivo, entretanto, o plantio de milho não é constante
durante o ano, o que impossibilita uma produção regular deste vírus na lavoura (Moscardi,
1999).
Uma importante vantagem dos bioinseticidas sobre os inseticidas químicos é o fato de
apresentarem menor custo e, além disso, sua utilização continuada não provoca resistência da
praga. Os bioinseticidas, ainda, são mais específicos e menos poluentes. Porém, como
desvantagens, requerem estudos mais elucidados no isolamento de novos patógenos, nos
testes de seleção, produção e formulação (Nohatto et al., 2010).
O Brasil tem-se destacado na produção de baculovírus desde a década de 80, no
controle à lagarta da soja Anticarsia gemmatalis (Hubner, 1818) (Lepidóptera: Noctuidae),
um inseto de importância econômica e que demanda cerca de 60% das aplicações de
inseticidas realizadas na produção de soja no país (Moscardi & Souza, 2002), representando
assim, o maior programa da utilização deste vírus para o controle de pragas. Além da
utilização do baculovírus Anticarsia, de maneira experimental, também foi utilizado o
baculovírus Spodoptera para o controle da lagarta do milho, S. frugiperda (Valicente 1989,
Valicente & Cruz 1991).
O sistema in vitro é uma alternativa para melhoria da tecnologia de produção de
baculovírus, no entanto, ainda é realizado em cultura de células em monocamadas
dificultando assim a obtenção de baculovírus em escala industrial. Já a cultura de células em
suspensão facilitaria a produção de baculovírus in vitro em grande escala, devido à adaptação
destas células em cultivo submerso (Weiss et al., 1994; Chakraborty et al., 1999).
A produção in vitro de baculovírus apesar de ser desejável tem encontrado dificuldades
principalmente na ampliação de escala (scale up) devido à instabilidade genética do vírus.
Diversos estudos vêm sendo realizados com a finalidade de melhorar esta produção. Dentre
estes estudos, surge a adição de β-ecdisona, hormônio encontrado em diversas variedades de
samambaias, presente nas gimnospermas e angiospermas, também encontrado em insetos, e
que possui aplicações na agricultura como inseticida e na medicina como agentes antitumorais
(Dinan, 2001; Vigo, 2004).
Capítulo 1. Introdução Geral 19
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
A utilização de estratégias bem estabelecidas em engenharia de bioprocessos é uma
forma de enfrentar os desafios tecnológicos e econômicos para a produção in vitro de
baculovírus. Deste modo, adaptar sistemas de produção que são utilizados há muito tempo
com sucesso em processos com células microbianas (bactérias, fungos ou leveduras) para
sistema de cultivo com células de inseto é uma estratégia interessante, principalmente quando
se deseja o aumento e a otimização da produção de baculovírus. O conhecimento das
equações cinéticas através da modelagem matemática descritas por esses sistemas de
produção in vitro de bioinseticidas virais e vetores de expressão de proteínas também tem sua
importância na ampliação da produção viral (Almeida, 2010).
Os baculovírus produzem dois tipos de fenótipos: o vírus extracelular “budded virus”
(BVs) e os vírus derivados de oclusão “occluded virus” (OBs ou PIBs). Os BVs são
responsáveis pela infecção célula a célula, sendo esta forma viral essencial para o processo de
infecção in vitro, pois alta concentração destas partículas virais indica a possibilidade do
sincronismo do processo de infecção, garantindo que todas as células sejam infectadas no
mesmo momento. Já os OBs difundem o vírus de inseto para inseto, apresentando-se oclusos
em uma matriz protéica, cuja principal constituinte é a poliedrina com aproximadamente 30
KDa (Rohrmann, 1986). A poliedrina proporciona a preservação do vírus no ambiente por um
tempo mais prolongado (Castro et al., 2004), portanto, essa oclusão permite que os OBs sejam
utilizados como os próprios bioinseticidas.
Além do conhecimento do sistema de produção dos baculovirus, deve-se ter ideia de
como é o modo de atuação desses vírus em seus hospedeiros. Nos últimos anos, a análise
proteômica tem sido usada para o entendimento do modo de ação das proteínas como forma
de aumentar o controle biológico de insetos-praga (Murad et al., 2008;. Yao et al., 2009;
Zhang et al., 2011). Em se tratando dos bioinseticidas virais, também é essencial o
conhecimento das proteínas virais que estão envolvidas direta ou indiretamente no processo
de infecção. Deste modo, a análise das proteínas virais é importante para o desenvolvimento
de estratégias na produção in vitro dos bioinseticidas virais, do ponto de vista de processo e
também biológico.
Sendo assim, o presente trabalho apresenta dados relativos à otimização da produção de
bioinseticida viral obtido a partir de infecções com Spodoptera frugiperda multiple
nucleopolyhedrovirus (SfMNPV) em células de S. frugiperda, linhagem Sf21, adaptadas ao
Capítulo 1. Introdução Geral 20
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
cultivo em suspensão. Análises do efeito do hormônio β-ecdisona, extraído do Ginseng
brasileiro, e do hormônio ecdisona sintético, produzido comercialmente, foram realizadas,
bem como a avaliação cinética da produção deste bioinseticida viral e sua caracterização
matemática no processo de infecção. Realizou-se, também, por meio de eletroforese em gel de
poliacrilamida, o estudo dos perfis das proteínas virais obtidas na produção in vitro do
baculovírus selvagem SfMNPV.
Em resumo, a presente tese está dividida em cinco capítulos. O primeiro capítulo exibe
uma introdução geral sobre os temas estudados. Os demais capítulos estão subdivididos em
revisão bibliográfica, relativa aos assuntos abordados na pesquisa, e no desenvolvimento
prático do trabalho (métodos utilizados, discussão dos resultados obtidos e conclusão parcial).
O segundo capítulo trata da análise das proteínas virais do vírus extracelular (BV) do
baculovírus SfMNPV onde a quantificação de proteínas foi realizada pelo método de
Bradford e a análise do vírus extracelular (BVs) em SDS-PAGE. O Capítulo 3 apresenta o
estudo da adição de ecdisona na produção em batelada do baculovírus SfMNPV, como
também, os dados experimentais das infecções na terceira e na quarta passagem do
baculovírus sem adição do hormônio ecdisona e com adição do hormônio β-ecdisona extraído
do Ginseng brasileiro e do hormônio ecdisona sintético produzido comercialmente. O
Capítulo 4 aborda as cinéticas de crescimento celular e de produção de corpos de oclusão,
obtidas das infecções dos três sistemas experimentais estudados no capítulo anterior, bem
como, a modelagem matemática e a simulação dos processos de produção já citados. Por fim,
o Capítulo 5 encerra a tese, apresentando as considerações finais, obtidas pela análise
minuciosa dos dados experimentais. O esquema representativo geral mostrando os capítulos
referentes a cada etapa deste trabalho é apresentado na Figura 1.1.
Capítulo 1. Introdução Geral 21
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Capítulo 1:
Introdução Geral
Capítulo 2: Análise das Proteínas
Virais Presentes na Passagem
Seriada de SfMNPV em Células
Sf21
Quantificação
de proteínas
SDS - PAGE
Capítulo 3: Adição de Ecdisona na
Produção do Baculovírus SfMNPV
Capítulo 4: Modelagem
Matemática e Simulação da
Produção de Baculovírus
SfMNPV
Capítulo 5:
Considerações finais
Curvas de
crescimento celular Produção dos corpos
de oclusão
Sem ecdisona
Com ecdisona
comercial
Com extrato de
ecdisona
Aplicação aos modelos
matemáticos:
Power (1993)
Roldão et al. (2007)
Figura 1.1. Esquema representativo dos capítulos abordados.
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada do SfMNPV em Células Sf21 23
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Capítulo 2.
Análise das proteínas virais presentes na passagem
seriada do baculovírus SfMNPV em células Sf21
Neste capítulo, serão apresentados uma breve revisão sobre a produção de baculovírus,
enfatizando estudos relacionados à análise das proteínas virais, mais especificamente a análise
das proteínas relacionadas com a produção em passagem seriada do vírus extracelular de
SfMNPV. A quantificação das proteínas identificadas e a análise do vírus extracelular (BVs)
em SDS-PAGE. A passagem seriada do vírus SfMNPV em linhagem de células de inseto
Sf21, cultivadas em meio SF900II, realizada por Dantas (2010), foi utilizada como base para
análise das proteínas virais deste sistema.
2.1. Revisão bibliográfica
2.1.1. Produção de baculovírus em sistema in vitro
A produção de baculovírus utilizados como bioinseticidas pode ser realizada por dois
diferentes sistemas. Tradicionalmente, a produção de baculovírus dá-se de forma in vivo, onde
os corpos de oclusão multiplicam-se na própria lagarta, mantida por dieta artificial, infectada
com o baculovírus de interesse. Enquanto que no sistema in vitro o vírus é preparado de tal
maneira que permita sua replicação em células adaptadas ao cultivo e susceptíveis à ação
viral.
Apesar do processo de produção in vivo ser considerado a maior fonte dos baculovírus
disponíveis no mercado, problemas na sua produção, no controle de qualidade e na ampliação
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 24
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de escala torna-o ainda um processo inviável, além de resultar num custo final elevado
(Moscardi & Souza, 2002).
A produção in vitro de baculovírus em cultivo de células é relativamente mais fácil,
quando comparada à produção in vivo, por estabelecer cultivos contínuos de células. Este
processo de produção pode ser realizado através de duas formas virais: o vírus extracelular
(BV) e o vírus derivado de oclusão (ODV) (Figura 2.1). No entanto, é normalmente realizado
com o vírus extracelular (BV) da hemolinfa de insetos infectados ou do sobrenadante das
células previamente infectadas, ou ainda, através da liberação das partículas virais dos OB
produzidos (King & Possee, 1992).
Figura 2.1. Estrutura e composição das partículas infectivas dos baculovírus: Vírus
extracelular (BV); vírus derivado de oclusão (ODV). (Fonte: Adaptada de:
http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/baculo.html).
Segundo Kikhno et al (2002), estas formas virais (BV e ODV) possuem funções
diferentes, estrutura de seus nucleocapsídeos similares, genótipos idênticos, atingem
diferentes células-alvo apresentando proteínas específicas e diferindo na composição de seus
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 25
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envelopes. Essas funções distintas conferem diferentes atribuições funcionais às partículas
ODV e BV (Blissard, 1996).
Os BVs são caracterizados por um nucleocapsídeo simples, cuja principal proteína é a
VP39, envelopado por uma derivação da membrana plasmática que contém em sua superfície
estruturas chamadas peplômeros (Volkman, 1986). Os peplômeros são compostos por
proteínas, principalmente pela glicoproteína GP64 ou por outras proteínas dependendo da
classe de baculovírus (Almeida, 2008). Os ODVs são constituídos por um ou múltiplos
nucleocapsídeos envolvidos por um envelope originado do núcleo da célula composto por
diversas outras proteínas virais diferentes dos BVs (Braunagel et al., 2003). A proteína P74 é
uma das proteínas presentes no ODV, a qual, durante o processo de infecção, concentra-se
dentro de “microvesículas” no interior do anel intranuclear, região onde se origina o ODV
(Faulkner et al., 1997; Slack et al., 2001).
As pesquisas com baculovírus têm avançado muito nos últimos anos, como por
exemplo, análises com regulação gênica, preparação de vetores virais, estudo de terapia
gênica, construção de vetores de vacina, entre outros (Hu, 2005). Xu et al. (2011) construíram
o baculovírus recombinante BacSC-E, o qual é considerado uma interessante vacina contra o
vírus da encefalite japonesa. Encinas et al. (2011), estudaram a expressão da glicoproteína G
na criação de anticorpos para o vírus da septicemia hemorrágica viral (VHSV). Wu et al.
(2014), desenvolveram nova estratégia para gerar uma vacina contra o vírus da raiva com o
baculovírus recombinante BV-RVG/RVG. Liao et al. (2014), estudaram a eficácia de uma
vacina contra o vírus da gripe do subtipo H6 a partir do baculovírus recombinante Bac-HA.
Iwanaga et al. (2014) avaliaram a expressão de proteínas recombinantes em células de BmVF
usando o nucleopolyhedrovirus B. mori (BmNPV) e os resultados mostraram a
susceptibilidade das células BmVF a BmNPV.
Observando-se esse histórico de pesquisas, torna-se claro a importância do
conhecimento das proteínas atuantes no processo de infecção por baculovírus, sejam elas
essenciais ou não à replicação viral.
Vários fatores contribuem para a replicação in vitro de baculovírus em cultivo de
células, tais como cinética de infecção do vírus, tempo de infecção, consumo de nutrientes, o
tipo de sistema célula-vírus estudado e o efeito de passagem. Apesar do processo de infecção
in vitro necessitar de uma linhagem de célula de inseto altamente produtiva, de um meio de
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 26
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cultura de baixo custo e de uma estabilidade genética do vírus estoque (Black et al., 1997;
Jem et al., 1997), esse processo de infecção é um dos desenvolvimentos mais interessantes
com relação à produção de bioinseticida em larga escala.
A possibilidade de aumento da produção viral pode ser alcançada, porém, o maior
desafio é manter a estabilidade genética dos vírus produzidos no decorrer de diversas
passagens celulares devido ao “efeito passagem” que pode ocorrer durante o processo de
infecção (O'Reilly et al., 1994). Para tanto, a identificação das proteínas virais sintetizadas e
envolvidas no processo de infecção é essencial para a elucidação do efeito passagem.
2.1.1.1. Passagem Seriada
A passagem seriada baseia-se numa sequência de infecções virais em células
hospedeiras onde para cada infecção anterior é utilizada como inóculo para infecção seguinte.
Nesse processo, pode-se utilizar como inóculo os BVs ou ODVs produzidos por baculovírus
(Almeida, 2010). No entanto, sucessivas passagens destas partículas virais podem causar
alterações genéticas ou perdas de partículas virais no baculovírus, o conhecido “efeito
passagem”.
Na Figura 2.2, tem-se a passagem seriada obtida através das infecções com o
baculovírus SfMNPV realizada por Dantas (2010). No sistema estudado, apresentou-se uma
redução na produção dos corpos de oclusão (OBs) a partir da terceira passagem, durante a
passagem seriada do baculovírus Spodoptera em células de inseto Sf21, o que indica a
ocorrência do efeito passagem. Portanto, tal efeito constitui um fator limitante para a
ampliação de escala devido à instabilidade genética do vírus.
O efeito passagem é caracterizado pela formação de FP (few polyhedra) no decorrer de
sucessivas passagens dos vírus em células. A formação de FP causa redução da produção de
corpos de oclusão (Figura 2.2) e aumento da produção de vírus extracelulares, obtendo uma
vantagem seletiva durante o processo in vitro (Pedrini et al., 2004; Pedrini et al., 2005;
Pedrini et al., 2006a). Porém, o efeito passagem é considerado um dos bloqueios da produção
em larga escala de baculovírus em sistema in vitro, devido ao acúmulo de alterações em seu
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 27
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genoma, através de ciclos de replicação em culturas de células ou em biorreatores (Krell,
1996).
1 2 3 4 5
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
OB
/ C
élu
la
Número de Passagens
Produção específica de poliedros
Figura 2.2. Produção de corpos de oclusão durante passagem seriada do baculovírus Spodoptera em
células de inseto Sf21 (Fonte: Dantas, 2010).
A baixa quantidade de OB no núcleo da célula infectada é considerado um atributo da
formação dos mutantes FP (poucos poliedros) (Chakraborty & Reid, 1999; Pedrini et al.,
2004). Além da redução de OB, o que também é considerado características destes mutantes
tipo FP são as oclusões que não contêm virions ou com virions de morfologia modificada,
envelopamento intranuclear dos ODV (occlusion derived viruses) também anormal ou
reduzido, aumento da liberação de vírus extracelulares (BV) e diminuição da porcentagem de
células que produzem OB (Harrison & Summers, 1995).
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 28
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Outra alteração genética associada ao efeito passagem é a produção de partículas
interferentes defectivas (DIPs). Estas partículas apresentam apenas parte do genoma viral com
replicação mais rápida que o vírus padrão. A maioria das partículas defectivas está presente
em altas passagens seriadas do vírus (Souza et al., 2003).
Na produção in vitro de baculovírus SfMNPV, Pedrini et al. (2004), observaram a
rápida geração de fenótipo FP após somente duas passagens do isolado SfMNPV em cultura
de células Sf9. Almeida (2005), utilizando também um isolado de SfMNPV cultivado em
células Sf9, obteve uma maior estabilidade deste isolado, visto que a formação de mutantes do
tipo FP foi identificada após a quarta passagem em células. Dantas et al. (2013), fazendo uso
de um isolado de SfMNPV em cultivo de células Sf21 identificou uma redução na produção
de OB também após a quarta passagem. Também foi identificado por Pedrini (2003) a
diminuição de OB de HaSNPV-Ac53 a partir da segunda passagem em células HzUQ.
Todas as alterações observadas nesses vírus foram baseadas pelas mudanças
morfológicas provocadas pelo efeito passagem, portanto, a análise das proteínas virais durante
a passagem seriada é uma informação importante para que se possa elucidar a ocorrência do
efeito de passagem observado em diversos isolados de baculovírus.
2.1.2. Características das proteínas virais
Vírus é um fragmento, sobretudo protéico que pode infectar organismos vivos. As
formas virais, ODV e BV, apresentam proteínas específicas e diferentes. As primeiras
proteínas expressas no sistema baculovírus foram a β-interferon (Smith et al., 1983) e a
interleucina 2 (Smith et al., 1985), ambas produzidas em AcMNPV.
A maior parte das proteínas é codificada pelo próprio vírus. A especificidade das
proteínas de cada fenótipo viral vem sendo confirmada por meio de técnicas bioquímicas
(Volkman, 1983). É importante destacar, que as proteínas podem estar envolvidas
individualmente ou em cooperação no processo de entrada do vírion na célula do intestino
médio do inseto (Slack et al., 2001; Rashidan et al., 2003), pois já se sabe que fatores
presentes no envelope ODV são essenciais para a infectividade per os dos baculovírus.
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 29
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Dentre as proteínas virais presentes nas formas virais dos baculovírus, pode-se citar a
proteína de 74 kDa, localizada no envelope ODV, codificada pelo gene de virulência p74. A
p74 é umas das proteínas presentes no processo de replicação dos baculovírus. É do tipo very
late, ou seja, o fenótipo ODV é formado em estágio mais avançado da infecção (Kuzio et al.,
1989). A proteína 25KFP considerada essencial para a montagem correta dos dois fenótipos
virais, ODV e BV (Beniya et al., 1998; Acosta et al., 2001). A poliedrina exibe papel
fundamental na formação dos corpos de oclusão (Maruniak, 1986). A glicoproteína
GP64/PROTEÍNA F tem sua importância na infectividade do vírus de célula para célula
(Monsma et al., 1996).
As proteínas virais estão classificadas em proteínas não estruturais e proteínas
estruturais. As proteínas não estruturais são essenciais no metabolismo de nucleotídeos, na
replicação do DNA viral, na regulação da expressão gênica, nos inibidores de apoptose e nos
genes auxiliares (Ijkel et al., 1999). As proteínas estruturais têm como funções a ligação do
vírion na superfície celular, penetração, descapsidação e aquisição do envelope viral (Ijkel et
al., 1999; Rohrmann, 1986). Na Tabela 2.1, são apresentadas algumas das proteínas não
estruturais e estruturais do baculovírus SfMNPV-19 e suas funções.
Cerca de nove proteínas, codificadas como estruturais, foram identificadas no genoma
do SfMNPV-19 (Tabela 2.1). Os genes da poliedrina, glicoproteína 41kD, ODV-E66 e P74,
codificam proteínas exclusivas dos vírus oclusos. O gene ODV-E66 codifica uma proteína
envolvida na formação do envelope dos vírus oclusos (OBs). A proteína P74, que se liga a um
receptor específico da célula hospedeira, tem como função unir o envelope viral com a
membrana plasmática. As proteínas P87capsid, VP39 e VP1054 exercem função na formação
do nucleocapsídeo e estão presentes tanto nos vírus oclusos quanto nos vírus extracelulares
(Oliveira, 2006).
O baculovírus mais estudado é o AcMNPV e dentre as proteínas já identificadas neste
baculovírus, destaca-se: ODV-E25, uma proteína do envelope com 25 kDa (Russell &
Rohrmann, 1993); a proteína O-glicosilada, identificada como a principal glicoproteína de
ODV, GP41 ou P40 (Whitford & Faulkner, 1992; Ma et al., 1993); além das proteínas ODV-
E66 (Hong et al., 1994), ODV-E56 (Braunagel et al., 1996a), ODV-E18, ODV-E35 e ODV-
EC27 (Braunagel et al., 1996b); GP64, VP39, e P69 (Wang et al., 2010); ac93 e ODV-e25
(Yuan et al., 2011).
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 30
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Em estudos mais recentes com o baculovírus AcMNPV, Marek et al.(2013) detectaram
a proteína FLAG-VP1054 com uma banda de 43kDa na fração do nucleocapsideo e a proteína
VP39 que é considerada o componente mais abundante dos nucleocapsideos.
Tabela 2.1 - Principais proteínas codificadas por ORFs localizadas nas extremidades
dos clones de SfMNPV-19.
Função Proteína
Proteínas
Estruturais
Ligação do virion na
superfície celular, penetração,
aquisição do envelope viral
Polh, envelope protein, ODV-E66,
p87, glycoprotein 41 kD, vp1054,
vp39, p74, orf1629
Proteínas não
estruturais
Metabolismo de nucleotídeos
Replicação
Expressão viral
Auxiliares
Ribonucleotide reductase large
subunit-1
Dnapol, alcaline exonuclease,
helicase
lef-4, lef-8, p47, lef-6, 39k e ie-0
Catepsina e EGT
(Fonte: Oliveira, 2006).
A proteína VP1054 pode ser encontrada nos dois fenótipos, BV e ODV e é essencial
para a montagem do nucleocapsídeo (Marek et al., 2013). Neste estudo, os autores também
demonstraram que todos os homólogos de VP1054 foram reconhecidos em vírus da família
Baculoviridae e todos os baculovírus sequenciados possuem um gene vp1054. Na Figura 2.3,
estão mostradas todas as principais linhagens de baculovírus, indicando que um gene vp1054
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 31
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estava presente em um antepassado dos baculovírus atuais como também exibe a subdivisão
dos NPVs específicos de lepidópteras de acordo com os estudos filogenéticos de baculovírus
utilizando o gene da poliedrina e posteriormente outros genes conservados (Zanotto et al.,
1993). Desta forma, cada grupo apresenta proteína de envelope responsável pela fusão do
vírus com a célula hospedeira específica: no grupo I, a glicoproteína GP64 e no grupo II, a
proteína F (Herniou et al., 2003; Monsma et al., 1996; Pearson et al., 2000).
Gerk et al.(1997) através de eletroforese em géis de poliacrilamida-SDS com partículas
virais de AgMNPV e SfMNPV detectaram uma banda majoritária presente nas partículas de
AgMNPV com peso molecular de 33 KDa e uma banda mais fraca, um pouco inferior, com
31 KDa. Análogo ao AgMNPV, os poliedros de SfMNPV, revelou-se uma nítida banda de 32
KDa.
A poliedrina de diversos baculovírus varia entre 28 KDa e 33 KDa (Summers & Smith
1978), portanto, a proteína de 33 KDa, do AgMNPV, e a proteína de 32KDa, do SfMNPV são
poliedrinas, por se encontrarem em maiores concentrações e possuírem peso molecular
característico desse grupo de proteínas (Gerk et al., 1997). Ainda mostraram-se presentes
neste estudo, proteínas na região de 15,5 KDa a 24 KDa em poliedros de AgMNPV e
proteínas de peso molecular variando entre 14,5 KDa e 28 KDa para poliedros de SfMNPV.
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 32
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Figura 2.3. Reconstrução filogenética das sequências proteicas VP1054 dos baculovírus.
Todas as sequências homólogas de VP1054 reconhecível foram alinhadas. Números entre
parênteses são os números de acesso do GenBank. Quadrados de cor em cada uma das
estirpes de baculovírus indicam a classificação dos baculovirus. (Fonte: Marek et al., 2013).
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 33
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2.1.3. Análise das proteínas virais
O avanço tecnológico nos estudos de proteínas no decorrer dos anos de 1980 a 1990
permitiu elevada ampliação das técnicas de estudo das proteínas (Chung, 2007). Como por
exemplo, no âmbito vegetal, estudos de análise de proteínas têm trazido relevantes
contribuições, principalmente no que diz respeito a plantas de interesse econômico como o
milho, trigo, batata e arroz (Rossignol et al., 2006).
Quando se trata de processo de infecção viral, os estudos são caracterizados por diversas
proteínas virais a depender do tipo de baculovírus utilizado, as partículas virais, ODV e BV,
envolvidas no processo de infecção e apresentam fenótipos distintos (Wang et al., 2010),
possuindo, então, conjuntos protéicos diferentes. Embora BVs e ODVs tenham a estrutura dos
nucleocapsídeos comum e transportarem informações genéticas idênticas, eles diferem na
composição protéica de seus envelopes (Yuan et al., 2011).
Na análise bioquímica, proteínas estruturais do vírus são usualmente determinadas e
identificadas por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) que separa
as proteínas em um campo elétrico, de acordo com o tamanho das moléculas (Laemmli,
1970).
2.2. Metodologia Experimental
2.2.1. Linhagem de células e vírus
As células utilizadas neste trabalho foram da linhagem de células de inseto IPLB-SF21
(American Type Culture Collection, MD) cedidas pela Embrapa – Recursos Genéticos e
Biotecnologia (Cenargen), adaptadas ao meio de cultura em suspensão SF900II® SFM
(Serum Free Medium) (GIBCO). As células foram cultivadas em frascos Erlenmeyers de 125
mL (Schott), com volume de suspensão de 50 mL em cada frasco, em incubadora rotativa
refrigerada (Tecnal – TE421), com agitação controlada de 120 rpm e 28ºC e sua manutenção
realizada a cada três ou quatro dias de cultivo. A concentração celular foi estimada utilizando
um microscópio fase-contraste (Olympus, Japão) e um hemocitômetro, modelo Neubauer
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(Bright-Line Hemacytometer Sigma), dada conforme a Equação (1) em cada amostra. A
contagem foi realizada em triplicata, com erro em torno de 15% e média de 200 células
contadas em ambos os lados do hemocitômetro (Nielsen et al., 1991).
(1)
Onde:
C – concentração de células
célulasN – número de células contadas
D – fator de diluição
18x10-4
– Volume de dois lados do hemocitômetro.
Através da técnica de exclusão pela coloração com azul de tripan (Sigma-Aldrich), a
uma concentração final de 0,1% (v/v), foram determinadas a concentração de células viáveis e
viabilidade celular. As células que se tornaram azuladas devido à entrada do corante foram
consideradas não viáveis, enquanto que as células transparentes foram consideradas viáveis. A
concentração celular é expressa em células por mL (células/mL).
O baculovírus SfMNPV isolado-18, foi cedido pela Embrapa Milho e Sorgo (CNPMS),
Sete Lagoas, MG. O inóculo viral de SfMNPV, na forma de ODV (occluded derived virus),
foi obtido segundo o método de Lynn (1994). O ODV foi utilizado como inóculo para infectar
20 mL de suspensão de células Sf21 com viabilidade média de 95% e concentração de
5,3x105
células viáveis/mL. Para os demais experimentos de infecção da passagem seriada,
foram utilizados como inóculo o vírus extracelular (BV) obtido a partir da centrifugação a
1000 rpm/10 minutos de metade do volume de suspensão coletado após ter sido atingido o
estabelecimento da infecção.
As infecções foram realizadas em incubadora rotativa refrigerada (120 rpm e 28°C)
utilizando frascos Erlenmeyers de 125 mL (Schott). As concentrações de células não
infectadas e infectadas foram acompanhadas diariamente até atingir viabilidade em torno de
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 35
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50%, e a concentração dos corpos de oclusão acompanhada até o final do processo de
infecção.
A contagem de OBs produzidos pelas células infectadas foi determinada utilizando
hemocitômetro e um microscópio ótico (Olympus CX40) com aumento de 400 vezes. As
células infectadas com o vírus SfMNPV foram lisadas com uma solução de 1% (p/v) de
dodecil sulfato de sódio (SDS) por 2 horas para total dissolução da membrana celular e
liberação dos corpos de oclusão. A suspensão contendo os OBs foi diluída com água
purificada (18,3 MΩ-cm) com a finalidade de permitir a contagem de 100 a 150 OBs no
quadrante central de cada lado do hemocitômetro. A contagem dos OBs também foi feita em
triplicata e a sua concentração pela Equação (2):
(2)
Onde:
COB – Concentração de OB, OB/mL.
D – Fator de diluição
MOB – Média da contagem de OB
1x10-4
– Volume de um quadrante do hemocitômetro.
O rendimento específico de OBs (OB/célula) foi calculado dividindo a concentração de
OB pela maior concentração de células totais da cultura infectada.
2.2.2. Passagem seriada
A passagem seriada do vírus SfMNPV em linhagem de células Sf21 cultivadas em meio
SF900II foi realizada por Dantas (2010). Um total de cinco passagens foram feitas em
Erlenmeyer de 125 mL (schott) com volume de suspensão 50 mL operados em incubadora
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 36
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rotativa refrigerada (Tecnal – TE421) a 120 rpm e temperatura controlada a 28 ºC, seguindo
os métodos utilizados por Dantas (2010).
Na passagem 1, as células Sf21 foram inoculadas com 10% (v/v) do BV do SfMNPV
obtido da infecção com o ODV. Após o estabelecimento da infecção, metade da suspensão
infectada foi coletada, centrifugada a 1000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante (vírus
extracelular) foi usado para inocular a passagem 2. As demais passagens seguiram o mesmo
procedimento e cada sobrenadante serviu de inóculo para a passagem subsequente.
2.2.3. Preparo das amostras para as análises de eletroforese em gel
Partindo do resultado da passagem seriada do baculovírus SfMNPV descrita no item
anterior, três passagens foram selecionadas para análise de eletroforese em gel: as passagens
P1, P3 e P5. Para cada uma delas, 30 mL de acetona gelada foram adicionadas a 10 mL da
suspensão viral e sedimentada em freezer (-20 ºC) por 2 horas. Em seguida foram
centrifugadas a 16.000 g / 4 ºC em centrífuga (BECKMAN COULTER AVANTI-JE), rotor
JLA 16.250, por 1 hora. Após centrifugação o sobrenadante foi recolhido e o pellet mantido
em capela por aproximadamente 4 horas para total evaporação da acetona. Extraído toda a
acetona, o pellet foi diluído em água milliQ e armazenado em freezer (-20 ºC).
As amostras P1, P3 e P5 foram normalizadas para proteínas (30µg) e para volume
(50µL).
2.2.4. Dosagem de proteínas
As amostras P1, P3 e P5 foram diluídas nas proporções: 1:5, 1:10 e 1:20. A dosagem
colorimétrica foi realizada em placa de 96 poços. Como proteína padrão foi utilizada a
albumina e sua curva variou de 0,05 mg/mL a 0,5 mg/mL. Uma alíquota de 200 µL do
reagente Bradford foi adicionado em cada poço.
A leitura foi feita em espectrofotômetro com comprimento de onda λ= 595 nm,
utilizando a água como o branco.
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 37
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
2.2.5. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
O gel de poliacrilamida é formado por duas partes: o gel de empilhamento e o gel de
separação. O gel de empilhamento, com menor concentração de poliacrilamida e poros
grandes que permitem a migração igualitária das proteínas, independente das massas
moleculares, levando-as a empilharem-se em uma faixa estreita. Após o empilhamento, as
proteínas entram no gel de separação, cujos poros são menores, e a velocidade de migração
passa a ser dependente das massas moleculares.
Inicialmente foi realizado o gel de separação a 12% contendo: solução de acrilamida
30%, solução Tris-HCl 1,5 M e pH 8.8, TEMED, persulfato de amônio e água. O gel de
separação foi adicionado entre as placas do aparato e, para retirar bolhas, 100 μL de água
destilada foram adicionados sobre o gel. Após a polimerização, a água foi retirada e a
superfície do gel de separação foi seca.
O gel de empilhamento com menor concentração de poliacrilamida, o qual diferenciou
do gel de separação apenas o pH da solução Tris-HCl que foi 6.8, foi adicionado sobre o gel
de polimerização e, em seguida, o pente para criar os poços de aplicação foi colocado. Após a
polimerização, o pente foi retirado e o aparato contendo o gel foi submergido em tampão para
corrida dentro de uma cuba para eletroforese de proteínas (cuba SE 260 ligada ao
Electroforesis Power Supply EPS 601) (Figura 2.4).
Figura 2.4. Aparato para gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 38
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
2.3. Resultados e Discussão
2.3.1. Dosagem de proteínas através do método de Bradford
A Figura 2.5 mostra que em neste estudo de quantificação de proteínas realizada pelo
método de Bradford houve redução nas proteínas após as passagens (P1, P3 e P5) de
SfMNPV. Foi possível observar uma alteração no padrão quantitativo com redução gradual da
proteína total.
P1 P3 P5
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
mg
/ m
L
Passagem seriada
Figura 2.5. Dosagem de proteína total da passagem seriada de SfMNPV.
Observando a dosagem de proteínas através do método de Bradford, foi verificado que
houve redução de proteína viral no decorrer da passagem seriada do baculovírus SfMNPV. As
passagens P3 e P5 tiveram perda proteica de 18% e 51%, respectivamente, em relação à
passagem inicial P1.
0,82
0,68
0,40
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 39
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
2.3.2. Análise das proteínas do vírus extracelular (BVs) através de
eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS
O perfil eletroforético das proteínas do vírus extracelular (BV) do baculovírus SfMNPV
é apresentado na Figura 2.6.
Figura 2.6. Análise de proteínas estruturais de SfMNPV. Eletroforese em gel de
poliacrilamida – SDS 12%; M – marcador de peso molecular; P1 – Passagem seriada 1; P3 –
Passagem seriada 3; P5 – Passagem seriada 5: (normalizada para 30µg de proteína); P1’ –
Passagem seriada 1; P3’ – Passagem seriada 3; P5’ – Passagem seriada 5 (normalizado para
volume de 50µL).
A coloração com azul de “Coomassie” revelou um padrão diferencial de expressão
protéica entre as três passagens, sendo a P3 a que apresentou maior diferença quanto ao perfil
protéico. Pode-se observar uma banda majoritária com massa molecular aproximadamente a
60 KDa na passagem 3, sendo a mesma também detectada nas demais passagens, embora se
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 40
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
mostrasse pouco nítida. Esta proteína apresenta característica molecular semelhante à
glicoproteína GP64 (64 KDa), essencial na infectividade do vírus de célula para célula
(Monsma et al., 1996) nos baculovírus do grupo I, como por exemplo, o AcMNPV e o
AgMNPV. Porém, já se sabe que o baculovírus SfMNPV pertence aos NPVs do grupo II , os
quais não possuem GP64. No entanto, há um análogo funcional para as proteínas do envelope
que estão envolvidas no processo de ligação e ativação dos baculovírus do grupo I. O
conjunto destas proteínas foi denominado de proteínas F (Lung et al., 2002; Westenberg et
al., 2004).
A poliedrina com aproximadamente 30 KDa foi destacada em todas as passagens
analisadas. Fato esperado devido à produção de poliedrina ser imprescindível na formação do
corpo de oclusão, característica do baculovírus estudado. A mesma corresponde cerca de 95%
do conteúdo protéico do poliedro (Maruniak, 1986).
Bandas com pesos moleculares de 14,4 KDa ainda foram detectadas nas três passagens
com melhor nitidez nas passagens P1 e P5 e outra com aproximadamente 97 KDa visualizada
na passagem P5. Ainda na passagem P5 foi visto uma banda com peso molecular próximo a
45 kDa similar a proteína identificada como Flag-VP1054 com 43 KDa, importante no
processo de infecção, detectada por Marek et al. (2013) no nucleocapsídeo do baculovírus
AcMNPV.
Em comparação com a literatura, observa-se que diversos autores identificaram
proteínas em sistemas células / vírus. Chung (2007) identificou na infecção das células vero
com o vírus da dengue sorotipo 2, as proteínas diferenciais, GP96 e enolase, proteínas
exclusivas da infecção. Wang et al (2010) observou através da espectrometria de massa e
cromatografia líquida três proteínas mais abundantes do BV de AcMNPV: GP64, VP39, e
P69. Porém, um total de 34 proteínas virais foi identificado pelos métodos associados.
Também, Yuan et al (2011) identificaram em suas pesquisas com AcMNPV as proteínas ac93
e ODV-e25 e demonstraram que a proteína ac93 afeta a produção de BV. Braconi (2014),
estudando a proteômica do baculovírus AgMNPV-2D, identificou 33 proteínas estruturais em
seu BV. Destas, sete novas proteínas foram associadas a este fenótipo, previamente
desconhecidas nos dois proteomas disponíveis da família Baculoviridae.
Capítulo 2. Análise das Proteínas Virais Presentes na Passagem Seriada de SfMNPV em Células Sf21 41
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
2.4 Conclusões
Através da eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS foram detectadas algumas
proteínas presentes no vírus extracelular (BVs). A poliedrina foi destaque em todas as
passagens analisadas. Fato já esperado, uma vez que esta proteína é essencial na formação do
corpo de oclusão do baculovírus em estudo. Proteínas F e outras proteínas na região entre 14,4
e 97 KDa também foram encontradas neste estudo.
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 43
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Capítulo 3.
Adição de ecdisona na produção em batelada do
baculovírus SfMNPV
Este capítulo descreve a influência da adição do hormônio ecdisona na produção de
corpos de oclusão (OB) do baculovírus SfMNPV isolado-18, como processo alternativo para
o aumento da produtividade do bioinseticida viral, em escala industrial. A produção in vitro
do baculovírus SfMNPV foi avaliada após a adição ao meio de cultura, separadamente, de
dois tipos de hormônios ecdisona: um extraído do Ginseng brasileiro denominado de
ecdisona natural e o outro o ecdisona comercial 20-Hidroxiecdisona.
3.1. Revisão bibliográfica
3.1.2. Otimização da produção in vitro de baculovírus
Diferentes tipos de sistemas podem ser utilizados para a produção de baculovírus em
células de inseto, desde cultivo em monocamadas (estático) como cultivos em suspensão
utilizando frascos Erlenmeyers, spinners ou biorreatores. Isso se deve aos avanços na área de
cultivo celular. A temperatura de 28 ºC é ótima tanto para o crescimento celular quanto para a
infecção das células Sf9 e Sf21, embora, a maioria das células de inseto poder ser cultivada
numa faixa de 25 a 30 ºC (King & Possee, 1992).
A escolha do processo de produção, bem como, o modo de operação dos sistemas de
produção é de grande importância para obtenção de altos rendimentos com custo efetivo e
visando uma possível ampliação de escala (Almeida et al., 2010).
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 44
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
O desenvolvimento de um processo de produção, seja de proteínas recombinantes ou de
baculovírus, utilizando células animais, exige conhecimento detalhado das suas necessidades
nutricionais e de seu comportamento metabólico, bem como a seleção de uma estratégia de
cultivo específico: como batelada, batelada-alimentada ou de perfusão (Gioria et al., 2006).
Alguns autores têm estudado diferentes estratégias para aumentar a produção in vitro de
baculovírus. Almeida (2010) estudou a produção in vitro de baculovírus através do cultivo em
suspensão de corpos de oclusão de Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus e de
seu recombinante denominado vAgEGT∆-LacZ, analisando o aumento da produção em dois
sistemas de cultivo: batelada e batelada-alimentada. Como resultado, a autora verificou
aumento de produção de quatro vezes nos sistemas em batelada-alimentada com adição de
nutrientes, quando comparados ao sistema de produção em batelada simples.
Ainda considerando o aumento da produtividade, Dantas (2010) atingiu uma produção
de 1,9 x 108 OB/mL utilizando o sistema em suspensão do Spodoptera frugiperda MNPV, em
células Sf21 com adição de adjuvantes. Em ambos os estudos, a utilização de diferentes
estratégias de cultivo, seja pela adição de nutrientes e/ou substâncias ou o modo de operação
do sistema, resulta em aumento de produção, demonstrando ser uma alternativa interessante
para a otimização da produção de cultivos em suspensão de bioinseticidas virais.
3.1.2.1. Hormônio 20 – Hidroxiecdisona
Alternativas vêm sendo propostas com a intenção de minimizar as barreiras que ainda
deixam a produção in vitro de baculovírus não competitiva em relação à sua produção em
escala industrial. A perda de virulência ao longo das passagens sucessivas em cultivos
celulares configura o principal impedimento para a produção de baculovírus em larga escala.
A inserção de algumas substâncias que favoreçam o cultivo e o modo de conduzir o processo
in vitro é importante para o sucesso na produção. O hormônio 20-HE é uma destas
substâncias que vem sendo estudadas com a finalidade de se obter sucesso na produção de
baculovírus (Dantas, 2010).
A ecdisona está relacionada ao crescimento, ao desenvolvimento e à apólise (separação
da cutícula antiga da epiderme subjacente). Este hormônio ocorre em todos os grupos de
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 45
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
insetos estudados, crustáceos e aracnídeos, e provavelmente é o hormônio de muda de todos
os artrópodes. Também desempenha um papel na diferenciação dos ovaríolos e das glândulas
reprodutoras acessórias nas fêmeas e em várias etapas do processo de produção de ovos
(oogênese). A ecdisona também é produzida nos ovários dos insetos em um par de glândulas
do protórax (Triplehorn & Johnson, 2013).
O hormônio ecdisona é chamado de reguladores do crescimento de insetos (IGRs) e
compromete apenas o desenvolvimento e o crescimento dos insetos, sem causar danos a
organismos vertebrados (Graf, 1993; Mulla, 1995). A adição deste hormônio bloqueia o
processo de muda, ou seja, o inseto continua no estágio larval. As formas sintéticas da
ecdisona apresentam eficiência como agentes de controle de algumas populações de insetos,
induzindo a inibição da alimentação e mortalidade larvar (Dhadialla et al., 1998). Estes
compostos se mostraram eficazes contra lepidópteras (Hu et al., 2001).
O processo de muda dos insetos é regulado pela variação das concentrações de 20-HE
(Dhadialla et al., 1998). O crescimento e o desenvolvimento adequado dos insetos dependem
da concentração de 20-HE em vários estágios de diferenciação (Chapman, 1998). A adição
deste hormônio permite aumento considerável da produção de proteínas recombinantes e de
corpos de oclusão utilizando o processo em batelada (Chan et al., 2002; Dantas, 2010).
O 20-HE é a forma fisiologicamente ativa da ecdisona na maioria das espécies (Hubber
& Hoppe, 1965). Além de ser considerado o principal agente indutor da metamorfose nos
insetos (Dinan, 2001), é também o ecdisteroide encontrado em maior concentração, tanto em
plantas como em insetos (Savchenko et al., 1998; Dinan, 2001). Este
hormônio ativo resulta da ecdisona (Figura 3.1) que é um pró-hormônio polihidroxilado
(Chapman, 1998), inicialmente isolado a partir da pupa da mariposa. É considerado agente da
regulação dos processos de modulação da expressão dos genes relacionados ao ciclo da muda
(Shecther et al., 2007).
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 46
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Figura 3.1. Estrutura química da beta-ecdisona (Fonte: Debien et al., 2014).
Nas plantas, o hormônio 20-HE pode ser isolado a partir de raízes glomerata. A Pfaffia
glomerata (Figura 3.2) é uma planta medicinal conhecida no Brasil como Ginseng brasileiro
(Debien et al., 2014), assim chamada devido ao formato de suas raízes serem parecidas com
as do Ginseng Coreano (Panax ginseng C.A. Meyer) (Calgaroto, 2009).
A Pfaffia glomerata pertence ao gênero Pfaffia sendo a espécie de maior destaque
medicinal e comercial deste gênero (Vigo et al., 2003; Figueiredo et al., 2004; Zimmer et al.,
2006). A atuação adaptógena da Pfaffia associa-se, sobretudo, à presença do ecdisteróide β-
ecdisona (Vigo et al., 2003).
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 47
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Figura 3.2. Aspecto geral de Pfaffia glomerata (Marques, 1998).
Há vários anos o Ginseng brasileiro é utilizado em países asiáticos como medicamento
de cura e tônico. São em suas raízes tuberosas (Figura 3.3) que se encontram as saponinas, as
quais exercem inúmeros efeitos sobre o sistema imunológico e estresse (Leal et al., 2010). A
principal saponina presente nestas raízes de P. glomerata é a β-ecdisona (CAS n° 8047-15-2)
(Shiobara et al., 1993). Freitas et al. (2004) também confirmaram a presença significativa de
β-ecdisona nas raízes de P. glomerata.
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 48
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Figura 3.3. Aspecto das raízes de Pfaffia glomerata (Fonte: http://www.nativas.com.br).
Estudos farmacológicos e medicinais têm demonstrado que as raízes de Ginseng
brasileiro apresentam propriedades analgésicas, anti-inflamatórias e antireumáticas (Neto et
al., 2005), anti-glicêmico ( Sanches et al., 2001), anti-microbianas (Neto et al., 2004), dentre
outros. Portanto, considerando os atributos de promoção a saúde humana, este hormônio β-
ecdisona extraído da raiz do Ginseng brasileiro, tem um grande potencial como aditivo
alimentar na produção de alimentos nutracêuticos (Debien et al., 2014). Porém, um aspecto
negativo destas saponinas é que a ingestão em grandes quantidades demonstrou, por vezes,
causar perturbações gástricas, incluindo náuseas e dores de estômago (Shyobara et al., 1993).
Quando se trata do composto 20-HE encontrado nos insetos, o mesmo não é produzido
por linhagens de células de inseto desenvolvidas a partir do tecido ovariano, como por
exemplo, as linhagens Sf21, Sf9 e T.ni (Lynn et al., 1987).
Sarvari et al. (1990) demonstraram a eficácia da adição de 20-HE no aumento da
produção de proteínas recombinantes utilizando baculovírus como vetor. A adição de 2g de
20-HE/mL de meio de cultivo obteve um aumento na concentração da proteína, enquanto que
a adição de 10g de 20-HE/mL foi inibitória. Isto quer dizer que a concentração do hormônio
é um fator importante na otimização do processo.
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 49
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Chan et al. (1998), otimizaram o processo para produção da proteína recombinante β-
galactosidase através da adição de nutrientes (aminoácidos, lipídios, glicose e extratos de
levedura) em culturas de células Sf9 em meio de cultivo SF900II (Invitrogen, USA).
Posteriormente, Chan et al. (2002) testando o processo de batelada alimentada para produzir a
glicoproteína recombinante do vírus da dengue NS1 também conseguiram otimizar o processo
obtendo um aumento de 5 vezes quando adicionado 4 µg/mL de 20HE ao meio de cultivo.
Dantas (2010), estudando o efeito da adição de ecdisona na produção in vitro do
baculovírus Spodoptera, no sistema em batelada, obteve aumento de duas vezes na produção
volumétrica de OB em relação ao processo de infecção sem adição de hormônio.
Diante disto, propõe-se adicionar o hormônio ecdisona ao processo de infecção como
estratégia para melhorar a produção dos corpos de oclusão do baculovírus SfMNPV em
cultura de células Sf21.
3.2. Metodologia Experimental
3.2.1. Determinação da concentração celular e quantificação dos corpos de
oclusão (OB)
Assim como no capítulo anterior, a linhagem de células de inseto IPLB-SF21 (American
Type Culture Collection, MD) cedidas pela Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia
(Cenargen), adaptadas ao meio de cultura em suspensão SF900II® SFM (Serum Free
Medium) (GIBCO) foi utilizada nestes experimentos como também o baculovírus SfMNPV
isolado-18, foi cedido pela Embrapa Milho e Sorgo (CNPMS), Sete Lagoas, MG.
Todos os experimentos foram realizados em triplicata e apresentaram um erro médio de
5% na contagem das células e 18% na quantificação dos corpos de oclusão (OBs). A
concentração celular e a quantificação dos corpos de oclusão (OB) foram estimadas conforme
descritos no item 2.2.1 da referida tese.
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 50
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
3.2.2. Adição de ecdisona extraído do Ginseng brasileiro e de ecdisona
comercial
O hormônio ecdisona foi adicionado na passagem 3 e passagem 4 do processo de
produção de baculovírus SfMNPV. A adição ocorreu 24 h.p.i (horas pós infecção).
O extrato de ecdisona obtido a partir do Ginseng brasileiro foi cedido pelo Dr. Diego
Tresinari dos Santos (UNICAMP).
A concentração de ecdisona extraído do Ginseng brasileiro e do hormônio 20-HE
adquirido comercialmente adicionada aos experimentos foi de 6 µg/mL tendo como base os
estudos de Chan et al. (2002) e Dantas (2010).
3.3. Resultados e Discussão
3.3.1. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 3ª
passagem
Na Figura 3.4 são apresentados todos os perfis de crescimento das células infectadas e
não infectadas na passagem 3 dos sistemas estudados neste capítulo. O primeiro perfil mostra
o crescimento das células não infectadas a qual exerceu função de controle para as células
infectadas. No segundo perfil observou-se o crescimento das células infectadas com o
baculovírus SfMNPV na 3ª passagem; o terceiro refere-se a curva de crescimento das células
infectadas com o baculovírus SfMNPV na 3ª passagem, quando adicionado 6µg/mL de
ecdisona adquirido comercialmente e, por fim, o perfil das células infectadas com adição de
ecdisona extraída do Ginseng brasileiro na mesma concentração do hormônio adquirido
comercialmente.
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 51
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
0 1 2 3 4
0
1
2
3
4
5
6
7
Cé
lula
s vi
áve
is x
106
/ m
L
Tempo (dia)
Células não infectadas
Células infectadas
Células infectadas e com ecdisona comercial
Células infectadas e com extrato de ecdisona
Figura 3.4. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 3.
Como pode observar na Figura 3.4, é notória a diferenciação quanto ao crescimento das
células não infectadas em relação às células infectadas no momento em que a infecção é
estabelecida. As células infectadas e as infectadas mais a adição de ecdisona comercial
tiveram o mesmo comportamento e o estabelecimento da infecção é visível já no primeiro dia.
No processo de infecção das células mais adição de ecdisona, extraída do Ginseng brasileiro,
a estabilidade infectiva é observada no segundo dia. A adição de ecdisona foi dada 24 hpi e, a
partir de então, já houve declínio na concentração das células viáveis na infecção com o
hormônio comercial. No entanto, na infecção com o extrato de ecdisona este declínio só foi
observado no dia seguinte. As células não infectadas cresceram até 6,2 x 106± 0,3 células
viáveis / mL. Em todos os sistemas de infecção estudados as células infectadas cresceram na
ordem de 105 células viáveis / mL.
As Figuras 3.5 (A) e 3.5 (B) mostram a produção de OBs produzidos na infecção com
SfMNPV na 3ª passagem nos três sistemas estudados nos últimos três dias de infecção.
Ecdisona
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 52
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
INFECTADA INFECTADA+ECDISONA COMERCIAL INFECTADA+EXTRATO DE ECDISONA
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
OB
x 1
08 /
mL
Experimentos
INFECTADA INFECTADA+ECDISONA COMERCIAL INFECTADA+EXTRATO DE ECDISONA
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
OB
/ c
élu
la
Experimentos
Figura 3.5. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 3ª passagem:
A) Produção volumétrica; B) Produção específica.
(B)
(A)
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 53
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Observou-se que a produção média (volumétrica e específica) de OB não teve diferença
significativa nos três processos. Ao final de 10 d.p.i. (dia pós infecção) a produção de OB sem
nenhum adjuvante foi 1,34 x 10 8± 0,24 OB / mL e 122,17 ± 22 OB / célula. Enquanto que
com relação à infecção com adição do hormônio ecdisona adquirido comercialmente produziu
em torno de 1,61 x 10 8± 0,28 OB / mL e 135,42 ± 24 OB / célula. Já o hormônio extraído do
Ginseng brasileiro obteve produção de 1,41 x 10 8 ± 0,25 OB / mL e 150,56 ± 27 OB / célula.
A partir destes resultados pode-se afirmar que a 3ª passagem da infecção com
baculovírus SfMNPV atinge produção máxima e, portanto, a adição do hormônio ecdisona
não favoreceu a infecção. Esta afirmação é confirmada com o estudo da passagem serial do
baculovírus S. frugiperda MNPV em cultivo de células de inseto realizado por Dantas (2010),
que demonstrou um declínio na produção de OB apenas a partir da quarta passagem. Diante
disto, objetivando reduzir o efeito passagem e promover o aumento da produção do
bioinseticida viral nos cultivos em suspensão, foi estudado a adição do hormônio ecdisona na
4ª passagem.
3.3.2. Curvas de crescimento celular e produção de corpos de oclusão na 4ª
passagem
A Figura 3.6 mostra as curvas de crescimento das células não infectadas, infectadas e
com adição do hormônio ecdisona nas duas formas estudadas.
Observa-se agora o mesmo comportamento das células infectadas em todos os sistemas
aqui estudados. Pode-se perceber que a infecção foi estabelecida no primeiro dia e a
concentração de células viáveis foi praticamente a mesma em ambos os processos de
infecção, em torno de 6,0 x 105 ± 0,30 células viáveis / mL. Contudo, o comportamento
identificado em todos os processos infectivos deste trabalho, tanto na passagem 3 como na
passagem 4, foi na diferenciação das células não infectadas e infectadas independentes da
adição de ecdisona. Portanto, tal ação evidencia a capacidade infectiva do SfMNPV – isolado
18 na linhagem de células Sf21 (Barreto et al., 2005).
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 54
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
0 1 2 3 4
0
1
2
3
4
Cé
lula
s vi
áve
is x
106 /
mL
Tempo (dia)
Células não infectadas
Células infectadas
Células infectadas + ecdisona sintético
células infectadas + extrato de ecdisona
Figura 3.6. Curvas de crescimento das células infectadas e não infectadas na passagem 4.
A influência do hormônio ecdisona somente foi observada na produção de Obs (Figura
3,7). Porém, não houve diferença significativa entre o hormônio adquirido comercialmente e o
hormônio extraído do ginseng brasileiro. A produção de OB foi acompanhada diariamente até
10 d.p.i.
Pelas Figuras 3.7 (A) e (B) percebe-se que, exceto no sexto dia de infecção, a adição do
hormônio favoreceu a produção de OB.
Tal fato significa que o hormônio ecdisona tem influência positiva na produção de
corpos de oclusão (OB) já que sua adição a uma concentração de 6µg/mL aumentou em
aproximadamente duas vezes a produção volumétrica e específica de OB em relação ao
processo de infecção sem adição de hormônio, a qual passou de 7,01 x 107
OB/mL e 86,28
OB/célula para 1,33 x 10 8 e 168,65 OB/célula; e para 1,28 x 10
8 OB/mL e 171,29 OB/célula
(hormônio comercial e hormônio extraído do Ginseng brasileiro, respectivamente).
Ecdisona
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 55
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
OB
x 1
08 / m
L
Tempo (dia)
INFECTADA
INFECTADA + ECDISONA COMERCIAL
INFECTADA + EXTRATO DE ECDISONA
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
OB
/ c
élu
la
Tempo (dia)
INFECTADA
INFECTADA + ECDISONA COMERCIAL
INFECTADA + EXTRATO DE ECDISONA
Figura 3.7. Perfil da produção de OB da infecção com SfMNPV na 4ª passagem:
A) produção volumétrica; B) produção específica.
(A)
(B)
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 56
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Estes resultados confirmam os valores encontrados por Dantas (2010) mostrando que
com esse sistema estudado é possível diminuir o efeito do acúmulo de mutantes FP que tem
como principal característica o rápido declínio na produção de corpos de oclusão (OB).
Efeitos sobre o aumento na produtividade viral ou de proteínas recombinantes, usando o
baculovírus como vetor de expressão observado quando se adicionou adjuvantes ao meio de
cultivo há anos vêm sendo estudados.
Belloncik et al. (1997), constataram que o colesterol, quando adicionado ao meio de
cultivo, melhorou a morfologia da membrana dos corpos de oclusão de Galleria mellonella
(GmNPV). Chernomordik et al. (1995), investigando a infecção de células Sf21 com o
baculovírus AcNPV observaram que houve replicação deste baculovírus quando o meio de
cultivo foi suplementado com lipídios. Meghrous et al. (2010) afirma que soluções lipídicas
são importantes no aumento de produtividade de proteínas recombinantes utilizando
baculovírus como vetor (BEVS).
Ainda em relação ao aumento na produção de proteínas recombinantes utilizando
baculovirus como vetor de expressão, Sarvari et al. (1990) também obtiveram aumento da
produção quando adicionaram o hormônio 20-HE ao meio de cultivo. Chan et al. (2002) e
Chan et al. (1998) otimizaram o processo de batelada alimentada para produção da
glicoproteína recombinante do vírus da dengue NS1 e da proteína recombinante β-
galactosidase, respectivamente, através da adição de nutrientes. Do mesmo modo, Almeida
(2010), visando o aumento da produção de OBs do baculovírus recombinante vAgEGT∆-
LacZ também obteve sucesso quando adicionou nutrientes ao meio de cultivo no processo de
produção em batelada alimentada.
Desta forma, é possível afirmar que a presença de adjuvantes no processo de infecção
viral é apresentada como fator importante no que se refere ao aumento de produção como
também no estímulo ao crescimento celular (Goodwin, 1990; Wilkie et al., 1980) e na
formação dos poliedros.
Capítulo 3. Adição de Ecdisona na Produção do Baculovírus SfMNPV 57
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
3.4 Conclusões
O hormônio ecdisona não influenciou a produção do baculovírus SfMNPV na terceira
passagem por não provocar efeito na quantidade de partículas virais devido a formação de MP
(muitos poliedros). Tal fato mostra que é na passagem 3 onde ocorre a maior produção de
OBs sendo assim, inviável a adição de adjuvantes para aumento da produção viral de
baculovírus.
A adição, na quarta passagem, do hormônio ecdisona comercial como também o
hormônio extraído do Ginseng brasileiro elevou cerca de 2 vezes a produção dos corpos de
oclusão com relação a produção do baculovírus SfMNPV durante a passagem seriada sem
adição de adjuvantes.
Este resultado mostra a influência positiva do hormônio ecdisona na produção de MP,
reduzindo o efeito do acúmulo de mutantes FP. Esta influência pode estar relacionada à
suscetibilidade das células Sf21 a retenção do composto 20-HE permanecendo mais robustas
e viáveis por um tempo mais prolongado que as células infectadas isentas do hormônio. Fato
observado na morfologia das células durante o processo de infecção.
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 59
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Capítulo 4.
Modelagem matemática e simulação da produção de
baculovírus SfMNPV
Neste capítulo, serão apresentados e discutidos os resultados da modelagem matemática
e simulação da produção de baculovírus SfMNPV em células de inseto Sf21 sob os efeitos de
ecdisona comercial e do extrato de ecdisona.
4.1. Revisão bibliográfica
A cinética de um processo biotecnológico é representada pelo comportamento de
parâmetros que são relevantes para o cultivo, tais como crescimento celular, formação de
produtos, sejam primários ou secundários, consumo de substratos e suplementação de
nutrientes que associados descrevem um modelo característico.
Ao se adotar um modelo cinético para descrever o crescimento celular e a formação de
produtos, algumas simplificações estão embutidas. As estruturas celulares podem ser
consideradas como não estruturadas ou estruturadas. Caso as variáveis intrínsecas das células
sejam consideradas inalteradas ou em estado pseudo-estacionário, a própria célula pode ser
considerada como não estruturada e pode ser representada por uma única variável como
massa celular ou número de células. Sendo este modelo, pela dificuldade em obter parâmetros
cinéticos intrínsecos, o mais comumente utilizado na modelagem de processos fermentativos.
No entanto, quando as estruturas internas das células são descritas em detalhes, então os
modelos cinéticos são denominados modelos estruturados (Power et al., 1994).
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 60
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Os modelos podem ainda ser denominados de segregados ou não segregados (Figura
4.1) que resume os principais tipos de modelos aplicados na descrição do metabolismo
celular, segundo a classificação proposta por Tsuchiya et al.(1966).
Figura 4.1 Classificação de modelos (Fonte: Augusto et al., 2008 baseado em
Tsuuchiya et al., 1966 e Bailey & Ollis, 1986)
No processo de modelagem matemática a etapa crucial é a formulação do modelo, visto
que a modelagem matemática busca desempenhar ampla rede de reações bioquímicas
múltiplas controladas por regimes complexos de regulação, que geram adaptações das células
às variações nas condições de cultivo. A complexidade desse metabolismo celular foi
abordada levando em consideração as limitações de recursos e as necessidades de
informações para a representação dos processos.
Desta forma, os modelos são ditos segregados e não estruturados quando consideram o
cultivo celular como uma população heterogênea, com as células individuais caracterizadas
por idade, massa ou tamanho. Essa variação de propriedades segue modelos estatísticos de
distribuição. Devido a isto, os modelos de balanço populacional (PBM – population balance
heterogêneas
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 61
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
models) é o meio mais pragmático de tratar a heterogeneidade da população. PBM são os
modelos que causam maior complexidade matemática, pois as equações que descrevem a
população precisam considerar que as propriedades variam na população e ao longo do tempo
de cultivo. Nesse caso, a descrição matemática utiliza equações diferenciais parciais.
Enquanto os modelos não segregados e estruturados são aqueles que consideram a população
celular como homogênea no que se refere à idade, tamanho e massa, porém, as estruturas
intracelulares são discriminadas, de forma que cada célula representa uma estrutura
heterogênea (Augusto et al., 2008).
Nos modelos segregados e estruturados são consideradas as populações de células
heterogêneas e células como estruturas heterogêneas, representando, assim, a diversidade de
estados fisiológicos e as várias estruturas e as vias metabólicas a elas relacionadas. A
complexidade envolvida na formulação matemática e na determinação de parâmetros faz com
que esses modelos sejam pouco utilizados, apesar de possibilitarem uma representação bem
realista dos cultivos. Já os modelos não segregados e não estruturados diferenciam dos
modelos segregados e estruturados por permitirem uma visão macro do comportamento
celular. A população celular é considerada homogênea, isto é, todas as células da cultura se
comportam da mesma forma (Augusto et al., 2008).
A formulação de um modelo matemático deve possuir um comprometimento entre grau
de complexidade razoável e solução (esforço computacional) economicamente desejável. Por
sua vez, a simulação do processo corresponde a sua análise (por exemplo, sua otimização)
através da utilização do modelo matemático proposto (Bonomi & Schmidell, 2001).
Levando em consideração as informações acima referenciadas foi formulado um
modelo para o referido estudo da modelagem e simulação da estratégia de otimização para
produção in vitro de baculovírus SfMNPV proposto neste trabalho.
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 62
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
= velocidade específica de morte celular intrínseca, kd1
= crescimento da população por replicação.
4.2. Definição das equações matemáticas
4.2.1. Concentração de células viáveis não infectadas
O balanço material de células viáveis não infectadas, Nu (células/mL), é o resultado de
três contribuições (Equação 3). A primeira delas representa a velocidade de adsorção dos
vírus nas células de inseto em suspensão, ou seja, compreende a conversão das células não
infectadas em células infectadas (Roldão et al., 2007). O segundo termo trata-se da velocidade
específica de morte celular intrínseca, kd1, e o terceiro termo está ligado ao crescimento da
população por replicação.
1
1ua u t d u u
dNk N V k N N
dt MOI
(3)
Onde os termos:
Nu = balanço material de células viáveis não infectadas (células/mL)
ka = coeficiente de ataque viral
Vt= concentração viral
kd1 = velocidade específica de morte celular intrínseca
MOI = multiplicidade de infecção
µ = velocidade específica de crescimento
A velocidade específica de crescimento da população viável não infectada, μ (hpi-1
),
leva em conta, ainda que de maneira simplificada, a idade da célula e a concentração de
nutrientes. Desta forma, foram definidos valores diferentes de μ em dadas situações do
= velocidade de adsorção dos vírus nas células de inseto em suspensão
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 63
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
cultivo, sendo necessários dois parâmetros (τexp e τest) que se referem às etapas de crescimento
exponencial, estacionário e morte celular (Equação 4).
max exp
1 exp est
est
, para
, para
0, para
d
t
k t
t
(4)
4.2.2. Concentração de células viáveis infectadas
O balanço material da população de células viáveis infectadas, Ni (célula/mL), possui
dois termos. O acréscimo de células infectadas é dado pela velocidade de adsorção dos vírus
nas células viáveis não infectadas e o segundo termo trata-se da velocidade de morte celular
(Equação 5).
As células Sf21 infectadas, no que diz respeito à morte celular, podem exibir dois perfis
distintos. Em um primeiro instante a concentração de células decai por meio de eventuais
lesões na membrana plasmática, expresso pela velocidade de morte celular intrínseca. No
estágio de infecção tardia as células infectadas são rompidas para liberação dos OBs, sendo
caracterizado pelo aumento da velocidade de morte celular, dado pelo acréscimo da constante
kd2 (hpi-1
). Na fase muito tardia, quando a liberação de OBs foi cessada, a velocidade de morte
celular específica é associada apenas a constante kd1 (hpi-1
) (Equação 6).
1ia u t d i
dNk N V k N
dt MOI
(5)
1 early
1 2 early late
1 late
, para
, para
, para
d
d d d
d
k t
k k k t
k t
(6)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 64
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
= acréscimo de células infectadas
Onde os termos:
Ni = balanço material da população de células viáveis infectadas (célula/mL)
4.2.3. Concentração de células não viáveis
A variação da população de células não viáveis, Nnv (célula/mL), está ligada às
contribuições de morte celular das células viáveis não infectadas e das células viáveis
infectadas (Equação 7).
1nv
d u d i
dNk N k N
dt (7)
Onde os termos:
Nnv= variação da população de células não viáveis(célula/mL)
4.2.4. Concentração viral
A concentração viral, V (OB/mL), durante o cultivo é o resultado de sua formação na
fase tardia e sua não formação na fase muito tardia. A produção de OBs foi considerada como
uma velocidade dependente da concentração de células viáveis infectadas (Power et al.,
1994). O termo α pode ser definido como a velocidade específica de formação de OB, cujo
= morte celular das células viáveis não infectadas
= células viáveis infectadas.
= velocidade de morte celular
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 65
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
valor varia de acordo com os estágios de infecção. No estágio tardio α tem valor fixo e
positivo, já nos dois outros estágios o termo assume valor nulo. A não formação dos OBs
também foi considerada no processo de infecção, mais especificamente no estágio muito
tardio, e é governada pela velocidade de decomposição de primeira ordem, kdV (hpi-1
).
i dV
dVN k
dt (8)
early
early late
late
0, para
', para
0, para
t
t
t
(9)
late
late
0, para
', para dV
dv
tk
k t
(10)
Onde os termos:
V = concentração viral (OB/mL)
4.2.5. Estimação de parâmetros do modelo
Os modelos matemáticos são compostos de conjunto de equações algébricas e/ou
diferenciais que estabelecem relações entre as variáveis independentes e as variáveis
dependentes. Algumas destas variáveis não podem ser medidas e elas são chamadas de
parâmetros do modelo. Em problemas não lineares, como é o caso dos modelos bioquímicos,
= formação de OB na fase tardia
= não formação de OB na fase muito tardia.
V
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 66
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
a estimação dos parâmetros pode ser realizada pela soma ponderada dos quadrados dos
desvios entre os valores experimentais e os valores preditos (Schwaab et al., 2008; Zhao et
al., 2013).
A estimação de parâmetros de um modelo pode ser realizada por duas abordagens:
determinística ou heurística. Os algoritmos de estimação determinística como Gauss-Newton,
Levenberg-Marquardt, e outros, se baseiam no cálculo de derivadas ou aproximações destas
para guiar a resposta para o mínimo. Apesar da rápida convergência, estes métodos sofrem
com problemas multimodais (problemas com mais de um ponto de máximo ou de mínimo).
Por outro lado, nos métodos metaheurísticos a estimação é feita de maneira “aleatória
orientada” com várias avaliações simultaneamente, o que aumenta o esforço computacional.
Eles exploram de modo multidimensional o espaço fornecido e não se prendem a máximos ou
mínimos locais, aproximando-se da otimalidade dentro de suas limitações (Schwaab et al.,
2008; Colaço et al., 2006).
4.2.6. Algoritmo de otimização por enxame de partículas
A otimização por enxame de partículas (PSO) é um algoritmo iterativo de busca
inspirado na movimentação agrupada de organismos. Nele, a busca no espaço
multidimensional é realizada pelo ajuste da trajetória de vetores individuais chamados
partículas que, assim como os seres vivos, trocam experiências entre si visando obter
vantagem evolutiva (Giordano et al., 2013; Dhanarajan et al., 2014). A atualização da posição
e da velocidade da partícula p na direção de busca d é feita conforme as Equações 11 e 12:
,
1, 1 1 , , 2 2 ,p d
globk k ind k kp d p d p d p ddv w v c r x x c r x x
(11)
1 1, , ,
k k kp d p d p dx x v (12)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 67
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Onde:
p representa uma partícula,
d =a dimensão de busca,
k = o número da iteração,
v = a velocidade da partícula,
x = a posição atual da partícula,
xind
= a melhor posição da partícula,
xglob
= a melhor posição obtida pelo enxame.
w, c1 e c2 são os parâmetros peso inicial, cognitivo e social, respectivamente.
Os termos r1e r2 tratam-se de dois números randômicos da distribuição uniforme na faixa de 0
a 1.
4.3. Metodologia Experimental
4.3.1. Formulação do Modelo
4.3.1.1. Considerações do modelo
Excesso de nutrientes: o meio de cultivo dispõe de nutrientes suficientes para
crescimento celular e produção viral;
Modelo segregado e não estruturado: a população das células de inseto foi dividida
em viável e não-viável e em infectada e não-infectada. Apesar disto, detalhes
metabólicos das células foram suprimidos;
Infecção sincronizada: valores intermediários da multiplicidade de infecção
possibilitam que algumas células de inseto não sejam infectadas e permaneçam com
seu metabolismo original;
Divisão de estágios de infecção: No modelo, a infecção foi retratada pela sequência de
etapas inicial, muito tardia e degradativa. Elas correspondem biologicamente à
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 68
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
adsorção de vírus em células e na reprogramação das células para replicação viral,
produção de OBs e decaimento viral (Figura 4.2).
Figura 4.2. Fases na trajetória de vírus e a produção de proteína de uma suspensão de células
infectadas com baculovírus recombinante. A fase latente, a fase de produção, e a fase de
decaimento (Fonte: Power, 1993).
Onde:
P1 = produção final (vírus ou proteína)
P0 = produção inicial (vírus ou proteína)
τINF = tempo inicial do processo de produção
τPC = tempo no qual ocorre a primeira detecção do produto no cultivo (virus ou proteína)
τPE = tempo da máxima produção detectada no cultivo (virus ou proteína)
τEND = tempo final do processo de produção
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 69
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Para as simulações foram utilizados os experimentos de infecção das células de inseto Sf21 com o baculovirus SfMNPV sobre o efeito da
adição de ecdisona mostrados na Figura 4.3.
0 24 48 72 96
0
1
2
3
Cé
lula
s n
ão
viá
ve
is x
105
/ m
L
Tempo (hora)
Infectada sem ecdisona
Infectada + ecdisona sintético
Infectada + extrato de ecdisona
0 24 48 72 96
2
3
4
5
6
7
Cé
lula
s v
iáve
is x
105
/ m
L
Tempo (dia)
Infectada sem ecdisona
Infectada + ecdisona sintético
Infectada + extrato de ecdisona
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
OB
x 1
08/
mL
Tempo (dia)
Infectada sem ecdisona
Infectada + ecdisona sintético
Infectada + extrato de ecdisona
Figura 4.3. Dados experimentais utilizados para a simulação. Concentração de células não viáveis (Nnv), (A); concentração de células viáveis (Nv), (B) e
produção de OB, (C).
(B) (A) (C)
Tempo (hora) Tempo (hora) Tempo (dia)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 70
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
A Tabela 4.1 mostra as condições iniciais para os três ensaios de infecção do
baculovírus SfMNPV nas células de inseto Sf21.
Tabela 4.1. Condições iniciais dos ensaios de infecção do baculovírus SfMNPV em células de
inseto Sf21.
Variáveis Sem ecdisona Ecdisona
comercial
Extrato de
ecdisona
Nu 4,13 x 105
3,50 x 105
2,99 x 105
Nnv 8,00 x 103
1,20 x 104 1,30 x 10
4
MOI (unidade
PFU/cell)
10,00 10,00 10,00
Vt 1,88 x 109
1,88 x 109
1,88 x 109
Onde:
Nu = células viáveis não infectadas (célula/mL)
Nnv = células não viáveis (célula/mL)
MOI = multiplicidade de infecção
Vt = concentração viral (OB/mL).
Para assegurar um conjunto de parâmetros ótimos foi usada uma abordagem híbrida
para estimação dos parâmetros do modelo. Esta abordagem consiste no uso da saída de uma
técnica de estimação randômica, no caso o algoritmo PSO, como chute inicial para um
método de estimação determinística, como o algoritmo Gauss-Newton. Desta forma, partiu-se
do algoritmo PSO para ajuste das respostas nos ensaios de infecção sem hormônio ecdisona,
com hormônio ecdisona sintético e hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro.
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 71
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
As simulações do modelo proposto foram realizadas usando a linguagem de
programação Fortran, no software Microsoft Visual Studio. A integração numérica das
Equações 3, 5, 7 e 8 foi executada pela rotina DASSL IMSL. No algoritmo PSO foram usadas
50 partículas e 50 iterações; o peso inercial e os termos cognitivo e social foram fixados em
0,7, 1,0 e 1,0, respectivamente. A função objetivo (FO) minimizada foi do tipo mínimos
quadrados ponderados (Equação 13), que estabelece a diferença entre os valores experimental
(expiy ) e calculado (
calciy ) associada a um peso ( iw ). Os intervalos de busca do PSO para os
parâmetros do modelo foram baseados em trabalhos com sistemas de infecção semelhantes,
sendo:
ka[10-9
; 10-7
] mL.cél-1
.h-1
, kd1[10-4
; 5x10-3
] h-1
e kd2[5x10-3
; 5x10-2
] h-1
(Roldão et al.,
2007);
α[0,1; 3,5] OB.cél-1
.h-1
e kdV[10-4
; 10-2
] h-1
(Power, 1993).
Os demais: μmax[7,5x10-2
; 2,5x10-1
] h-1
,τearly[24,0; 48,0] h, τvlate[48,0; 240,0] h,
τexp[24,0; 60,0] h, τest[75,0; 150,0] h foram delimitados com base nos dados
experimentais.
2
exp calc
21
N ii
i i
y yFO
(13)
Após a calibração dos parâmetros do modelo foi realizada uma investigação acerca dos
parâmetros que mais influenciaram as respostas de concentração de células viáveis, não
viáveis e viral. Desta forma foi usada a análise da sensibilidade paramétrica conforme a
metodologia mostrada em Brun et al. (2001) e Prunescu & Sin (2013), que o cálculo da
medida δmsqr
descrita na Equação (14):
,1
1 Nmsqr
nd iki
sN
(14)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 72
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Onde:
k é o índice do vetor de parâmetros do modelo k ,
i é o índice de observações de uma saída do modelo,
N é o total de observações de uma resposta do modelo e
snd,ik é a informação adimensional da sensibilidade paramétrica individual definida por:
,i k
nd ikk i
ys
SC
(15)
Aqui ; ;nv v iy N N N V é o vetor de respostas do modelo, i
k
y
representa a
variação da resposta do modelo pela perturbação no parâmetro k , e iSC é o fator de escala
com a mesma unidade da resposta observada. Este método foi executado para os conjuntos de
parâmetros estimados pelo algoritmo PSO nos ensaios sem hormônio ecdisona, com
hormônio ecdisona sintético e com hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro,
mantendo as mesmas condições iniciais usadas na estimação. Os valores de iSC foram
retirados dos erros de medição associada a cada resposta.
Com o conjunto de parâmetros já calibrado pelo algoritmo PSO e finalizada a
sensibilidade paramétrica, os cinco parâmetros mais relevantes foram re-estimados pelo
algoritmo Gauss-Newton. O pacote computacional Estima desenvolvido na COPPE-UFRJ foi
usado para esta finalidade, buscando minimizar a função objetivo (FO) descrita igualmente
pela Equação (13). Através dele também foi possível extrair a matriz de covariância, e por
conseqüência, os desvios padrões associados a cada parâmetro.
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 73
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4.4. Resultados e Discussões
4.4.1. Parâmetros estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton
Para reduzir o esforço do algoritmo PSO na estimação dos parâmetros do modelo e
evitar a correlação dos parâmetros ka, µmax e kd1, a estimação dos dois últimos foi realizada
separadamente com base nos dados do ensaio das células controle. Como se trata de um
ensaio controle não há adição de inóculo viral, de modo que os primeiros termos das
Equações 3 e 7 são nulos, o que transforma o modelo de infecção a um simples caso de
crescimento celular. Nesta estimação foi usada uma rotina baseada no método de Levenberg-
Marquardt tendo como chute inicial os valores de µmax e kd1 obtidos em Roldão et al., (2007).
As Figuras 4.4 (A) e 4.4 (B) mostram a concentração das células Sf21 viáveis e não-
viáveis ao longo do cultivo, respectivamente. A curva simulada de células viáveis se ajusta
bem aos dados experimentais seguindo o seu comportamento exponencial; no entanto, com
relação ao comportamento de células não-viáveis, foi observado um certo afastamento entre o
simulado e o experimental.
(A)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 74
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Figura 4.4. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio das células
controle. Dados experimentais(); Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto
paramétrico re-estimado (). A) Células viáveis; B) Células não-viáveis.
Após a estimação dos parâmetros do modelo com base no ensaio controle, as respostas
nos ensaios de infecção foram ajustadas através do algoritmo PSO. As respostas observadas
foram concentração de células viáveis, não viáveis e concentração viral. Nas primeiras
colunas das Tabelas 4.2, 4.3 e 4.4 estão dispostos os conjuntos paramétricos estimados pelo
algoritmo PSO para os ensaios sem ecdisona, com ecdisona sintético e com extrato de
ecdisona, respectivamente.
(B)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 75
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Tabela 4.2. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton no ensaio
de infecção sem adição do hormônio ecdisona.
Parâmetros
Valores estimados
Algoritmo PSO Algoritmo Gauss-Newton
1 1mL cél hak 4,57 x 10-9
4,61 x 10-9
± 6,09 x 10-8
11 hdk 0,001 0,001
12 hdk 0,014 0,013 x 10
-2 ± 0,032 x 10
-2
1max h 0,036 0,036
1 1OB cél h 1,695 1,734 ± 6,95 x 10-1
1hdVk 0,000 2,03 x 10-8
hearly 44,0 46 ± 5,61
hvlate 218,08 218,08
exp h 58,8 58,8
est h 94,3 94,3
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 76
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Tabela 4.3. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton no ensaio
de infecção com adição do hormônio ecdisona sintético.
Parâmetros
Valores estimados
Algoritmo PSO Algoritmo Gauss-Newton
1 1mL cél hak 3,69 x 10-9
5,47 x 10-9
± 2,22 x 10-8
11 hdk 0,001 0,001
12 hdk 0,009 0,0098
1max h 0,036 0,036
1 1OB cél h 3,077 3,16 ± 8,64
1hdVk 0,004 0,004
hearly 55,6 35 ± 0,035
hvlate 199,69 194 ± 48,8
exp h 69,5 69,5
est h 79,1 79,1
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 77
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Tabela 4.4. Parâmetros do modelo estimados pelo algoritmo PSO e Gauss-Newton no ensaio
de infecção com adição de hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro.
Parâmetros
Valores estimados
Algoritmo PSO Algoritmo Gauss-Newton
1 1mL cél hak 3,64 x 10-9
3,67 x 10-9
± 4,095 x 10-8
11 hdk 0,001 0,001
12 hdk 0,02 0,016
± 0,018
1max h 0,036 0,036
1 1OB cél h 4,907 4,66 ± 3,969
1hdVk 0,002 0,002
hearly 63,0 67,3 ± 0,011,
hvlate 170,4 170,4
exp h 73,3 73,3
est h 92,4 92,4
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 78
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
A velocidade específica de crescimentos (µmax) foi de 0,036h-1
, ou seja, 0,864d
-1 para os
três sistemas estudados. Tal valor é equivalente aos comparados com a literatura. Almeida et
al. (2010) obteve velocidade específica de crescimento 0, 775d-1
de células Sf9 cultivadas em
meio HyClone suplementado com soro fetal bovino, valor próximo ao encontrado por Power
et al. (1994), que também utilizando as células Sf9, obtiveram µmax= 0,672 d-1
.
Analisando a velocidade de morte celular (Kd), observou-se que as células não
infectadas (Kd1) foram iguais nos três sistemas em estudo. Em relação à velocidade de morte
celular (Kd2), percebeu-se que os valores foram aproximados em todos os casos. No entanto, a
velocidade de morte celular intrínseca das células Sf21 em todos os sistemas, kd1 = 0,001 h-1
está de acordo com estudos anteriores em células Sf9 (Dalal & Bentley, 1999; Hu & Bentley,
2000).
Após a infecção viral, a velocidade de morte celular, aqui caracterizada pelo parâmetro
Kd2, exibe algumas variabilidades em função da carga viral. Apesar de se ter semelhantes
velocidades de morte celular (kd2) nos três sistemas estudados, as infecções onde houve
adição do hormônio ecdisona tiveram maior tempo de vida e, consequentemente, maior
produção viral devido à proteção das células dada pela presença do hormônio. Tal fato foi
observado através da morfologia das células infectadas. Roldão et al. (2007), sugeriram que o
aumento na velocidade de morte celular, kd2, superior em seus estudos com a co-infecção em
relação a infecção única se deu em consequência da MOI mais elevada, o que para Licari &
Bailey (1991), uma elevada MOI provoca um decréscimo mais rápido na viabilidade celular.
4.4.2. Análise da sensibilidade paramétrica
Finalizada a primeira calibração do conjunto de parâmetros do modelo, foi realizada
uma análise de sensibilidade paramétrica (Figura 4.5), tendo como medida o valor de δmsqr
. Os
resultados de sensibilidade paramétrica indicaram que o coeficiente de ataque viral às células
viáveis não infectadas (ka) foi quem mais afetou significativamente as saídas do modelo,
possuindo elevados valores de δmsqr
nas três condições de infecção. Outros parâmetros que
obtiveram valores moderados de δmsqr
foram a taxa de morte celular específica em células
viáveis infectadas (kd2) mais visível na infecção sem hormônio, a taxa de produção viral
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 79
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específica (α) e o tempo que delimita a etapa inicial (τearly). Este último, por sinal, apresenta
este comportamento nos ensaios sem ecdisona e com ecdisona extraído do Ginseng brasileiro,
mas no ensaio com ecdisona sintético seu efeito foi pouco pronunciável. Os demais
parâmetros que incluem o tempo que delimita a etapa muito tardia (τvlate), o tempo da fase
exponencial de crescimento celular (τexp) e o tempo da fase estacionária (τest) pouco afetaram
as saídas do modelo e, consequentemente, obtiveram baixos valores de δmsqr
.
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 80
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
4.4.2. Análise da sensibilidade paramétrica
Finalizada a primeira calibração do conjunto de parâmetros do modelo, foi realizada uma análise de sensibilidade paramétrica, tendo como
medida o valor de msqr
.
Figura 4.5. Análise de sensibilidade paramétrica do modelo matemático proposto para os ensaios de infecção de SfMNPV em células de inseto Sf21 sem
adição de hormônio ecdisona (A), com adição de hormônio ecdisona sintético (B) e com hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro (C).
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 81
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
4.4.3. Comportamento das respostas do modelo matemático
De maneira a eliminar parâmetros não-identificáveis e reduzir o esforço computacional
na estimação pelo algoritmo Gauss-Newton, os quatro parâmetros com maiores valores de
sensibilidade (ka, kd2, τearly e α) foram levados à re-estimação nos sistemas de infecção sem
hormônio ecdisona e com ecdisona extraído do Ginseng brasileiro. Para o sistema de infecção
com adição do hormônio sintético foram re-estimados os parâmetros ka,. α, τearly e τvlate.
Enquanto isso, os parâmetros considerados não-relevantes foram fixados nesta etapa. Os
parâmetros re-estimados e seus respectivos desvios padrões são mostrados na segunda coluna
das Tabelas 4.2, 4.3 e 4.4.
Após a simulação dos dados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-
estimado, os mesmos foram analisados juntamente com os dados experimentais e seus
comportamentos estão mostrados nas Figuras 4.6, 4.7 e 4.8 para cada sistema de infecção
estudado.
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 82
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(A) (B)
Figura 4.6. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio sem hormônio ecdisona. Dados experimentais (); Dados
simulados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv) (A);
concentração de células viáveis (Nv) (B) e produção de OB (C).
(C)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 83
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
(B)
Figura 4.7. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio ecdisona sintético. Dados experimentais ();
Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis (Nnv) (A);
concentração de células viáveis (Nv) (B) e produção de OB (C).
(A) (C)
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 84
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
(A) (B) (C)
Figura 4.8. Comportamento das respostas do modelo matemático para o ensaio com hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro. Dados
experimentais (); Dados simulados pelo modelo matemático com o conjunto paramétrico re-estimado (). Concentração de células não viáveis
(Nnv) (A); concentração de células viáveis (Nv) (B) e produção de OB (C).
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 85
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ - UFRN
As Figuras 4.6 (A), 4.7 (A) e 4.8 (A) mostram a variação de células não viáveis
previstas e observadas das culturas de células Sf21 infectadas com o baculovírus Spodoptera
para a infecção ausente de hormônio ecdisona, a infecção com adição do hormônio ecdisona
sintético e para a infecção com adição de hormônio ecdisona extraído do Ginseng brasileiro,
respectivamente. Os modelos preditos corresponderam adequadamente com as respostas dos
dados experimentais. Este fato também é observado nas Figuras 4.6 (B), 4.7 (B) e 4.8 (B) que
representam a concentração de células viáveis dos processos de infecção examinados.
O comportamento das respostas do modelo para a produção volumétrica (OB/mL) dos
corpos de oclusão é mostrado nas Figuras 4.6 (C), 4.7 (C) e 4.8.(C). Observou-se no processo
de infecção sem a presença do hormônio ecdisona que a produção de OBs é menor do que nos
sistemas no qual houve a adição do hormônio. A adequação do modelo mantém uma relação
razoável com os dados experimentais. O modelo previu um aumento na produção de OBs para
as produções virais na presença do hormônio ecdisona, fato já esperado, uma vez que o
objetivo de se adicionar hormônio ao processo infectivo é diminuir o efeito passagem.
A concentração de OB tem um comportamento mais complexo no tempo e incorre
maiores desvios por conta de sua determinação, o que prejudica o ajuste das curvas simuladas.
Para uma futura ampliação de escala dos sistemas baculovírus faz-se necessário um
modelo capaz de permitir o acúmulo de informações sobre os fatores que afetam a morte
celular. Wu et al. ( 1993, 1994) desenvolveram um modelo matemático que descreve a morte
celular em um cultivo em monocamada baseado nas fases lag, a qual a viabilidade permanece
constante, e rápida, período no qual ocorre uma queda acentuada na viabilidade celular
(Revisado por Padilha et al., 2013).
4.5. Conclusões
Neste trabalho, foi proposto um modelo matemático do sistema vírus / células de
inseto Sf21 para a produção de bioinseticida. Para todos os casos analisados os modelos
preditos corresponderam satisfatoriamente bem aos dados experimentais.
Houve um acréscimo da produção de OB mediante presença do hormônio ecdisona. A
simulação do modelo está em boa concordância com os dados experimentais.
Capítulo 4. Modelagem matemática e simulação da produção do baculovírus SfMNPV 86
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
A concentração celular viável e não-viável prevista e observada em cada sistema
mostraram aceitação adequada entre o modelo e os dados.
Capítulo 5. Considerações finais 88
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
Capítulo 5.
Considerações finais
A expectativa da realização deste trabalho era essencialmente trazer informações
relevantes sobre a análise bioquímica dos vírus extracelulares dos baculovírus; o
melhoramento da produção dos corpos de oclusão a partir da adição do hormônio ecdisona,
como também, simular um modelo matemático para esta produção de OB.
As sucessivas passagens do baculovírus em cultivo de células de inseto usando o BV
como inóculo mostraram uma rápida diminuição de OB no decorrer do cultivo. Com isso,
observou-se ainda, por meio de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida – SDS,
uma redução da proteína total o que representa outro desafio para o aumento de escala da
produção deste bioinseticida viral.
A análise bioquímica destas partículas de BVs trouxe informações referentes às
proteínas presentes nesta forma viral analisada, revelando um padrão diferencial de expressão
proteica entre as três passagens. Foi detectada a presença da poliedrina com 30 kDa em ambas
as passagens, além de uma banda majoritária com massa molecular de aproximadamente 60
kDa observada com maior intensidade na passagem 3. Outras observações foram feitas com
bandas na faixa entre 14,4 kDa e 97 kDa.
Por ser altamente específico o baculovírus é um excelente agente de controle a ser
empregado no manejo integrado de pragas, priorizando a presença dos inimigos naturais não
alvos e a preservação do meio ambiente. Por isso o interesse em ampliar a produção do
baculovírus a ser utilizado como bioinseticida viral. Diante disto, a adição de hormônio
ecdisona proposto para ampliação da escala de produção apresentou resultados satisfatórios
quando adicionados na quarta passagem, a qual obteve aumento de 2 vezes. Porém, na
produção final do baculovírus na terceira passagem, o hormônio ecdisona não causou efeito
positivo na produção dos corpos de oclusão. Os dados obtidos neste trabalho sugerem que o
Capítulo 5. Considerações finais 89
Graciana Clécia Dantas – Tese de Doutorado – PPGEQ – UFRN
hormônio ecdisona, utilizado no sistema células/vírus aqui estudado estimule um mecanismo
de proteção celular, permitindo uma otimização da produção viral.
A formulação do modelo matemático e a simulação, fazendo uso da linguagem de
programação Fortran, para a produção de baculovírus SfMNPV foi considerada satisfatória
uma vez que os dados experimentais de todos os sistemas de infecção analisados tiveram
concordância com modelos preditos. O modelo formulado foi considerado útil para melhorar
a produção dos corpos de oclusão do baculovírus Spodoptera.
Essa ferramenta de modelagem pode permitir um ponto de partida para otimizar os
parâmetros de infecção, tais como a produção de OBs em processo em batelada. O modelo
proposto representa um bom ajuste entre complexidade e precisão. Um número relativamente
pequeno de parâmetros cinéticos está envolvido, os quais foram estimados com alta confiança
estatística.
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