antimicrobianos

7/16/2019 antimicrobianos

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Antimicrobianos

Teste de Susceptibilidade

Dra. Viviane Nakano

Curso de Ps-Graduao em Microbiologia

BMM 5753 Bacteriologia de Anaerbios

*Histrico

1495 uso de mercrio para tratamento da sfilis

1905 Paul Ehrlich (Alemanha) bala mgica quimioterapia 1928 Alexander Fleming substncia com ao inibitria

contra Staphylococcus aureus,produzida pelo fungo:

Penicillium notatum

Penicilina

*Conceitos

Produzidas por microrganismos ou sintetizado em laboratrio,

capazes de matar ou inibir microrganismos (antibiticos e

quimioterpicos).

ANTIMICROBIANOS

*Conceitos

TOXICIDADE SELETIVA Capacidade de lesar o

microrganismo, sem ser txica para o hospedeiro.

SINERGISMO Quando a combinao de duas drogas

aumenta a atividade de ambas.

ANTAGONISMO Quando um antimicrobiano diminui a

ao de outro.

*Conceitos

CONCENTRAO INIBITRIA MNIMA (CIM) menor

concentrao da droga capaz de inibir o crescimento bacteriano.

CONCENTRAO BACTERICIDA MNIMA (CBM) -

menor concentrao da droga que inibe pelo menos 99,9% do

inculo bacteriano.

*Conceitos

PONTO CRTICO OU BREAKPOINT a concentrao de

uma droga que alcana no soro, urina ou lquido

cefaloraquidiano, aps a administrao do agente, com fins

teraputicos.


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Propriedades ideais dos antibiticos

1. Toxicidade seletiva;

2. Amplo espectro de ao;

3. No agir contra microbiota residente;

4. Solubilidade em lquidos corporais;

5. Alcanar altas concentraes nos tecidos e sangue;

6. No ser afetado pela acidez estomacal ou protenas do sangue;

7. No produzir efeitos colaterais;

8. Disponibilidade e baixo custo.

Relao Microbiota-Hospedeiro-Antibitico

Hospedeiro MicrobiotaAntimicrobiano

Desequilbrio

Microbiotaexgena

Processo infeccioso

Sistema imunecomprometido

Cepas resistentes Terapia: insucesso

Morte

Mecanismos de ao dos antimicrobianos

7 Inibio da sntese de parede celular;

7 Inibio da sntese de protenas;

7 Alterao da membrana citoplasmtica;

7 Inibidores da sntese dos cidos nuclicos (DNA/RNA);

7 Alterao do metabolismo do cido flico (PABA).

Madigan et al., 2010.

Mecanismos de ao dos antimicrobianos

Inibidores da Sntese de Parede Celular

Mecanismo de ao

Ligam-se as protenas de ligao de penicilina (PBPs) e

enzimas responsveis pela sntese de peptideoglicano.


Composio do peptidoglicano

Madiganet al., 2010.


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Transpeptidases/Carboxipeptidases/Endopeptidases

Protenas de ligao penicilina (PBPs)

PBPs + antibitico

Inibem a montagem das cadeias depeptideoglicano

Ativao das autolisinas

Lise e morte celularMadigan et al., 2010.


Penicilinas

Cefalosporinas

Carbapenmicos

Monobactmicos

Cefamicinas

Inibidores de beta-lactamases

Beta-lactmicos

Principais Antimicrobianos:

Glicopeptdeos

Vancomicina

Teicoplanina

Outros

Fosfomicina

Bacitracina

Cicloserina

Penicilinas (Beta-lactmico)

Penicilinas Naturais

Penicilina G, Penicilina V.

Penicilinas Semi-Sintticas

Oxacilina, Ampicilina, Amoxicilina, Piperacilina.

Outras PenicilinasMeticilina, Pirazocilina, Propicilina, Azidocilina, Cloxacilina


1. Gerao

CefazolinaCefalotina

Cefalexina

2. Gerao

CefamandolCefonicida

CefuroximaCefaclor

3. Gerao

CefoperazonaCefotaximaCeftazidimaCeftriaxona

Cefoperazona

4. Gerao

Cefpiroma

CefiximaCefepima

Cefalosporinas (Beta-lactmico)


Carbapenmicos

Imipenem, MeropenemErtapenem, Panipenem

Biapenem

Monobactmico

AztreonamTigemonam


Beta-lactmicos

Cefamicinas

Cefotetan, Cefoxitina


Inibidores de Beta-lactamases

Inibidores beta-lactamase

Ampicilina+SulbactamPiperacilina+Tazobactam

Ticarcilina+c. clavulnicoAmoxicilina + c. clavulnico


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Glicopeptdeos

VancomicinaTeicoplanina

Bacitracina

Fosfomicina

CicloserinaTortora et al., 2012.

Composio do Ribossomo Bacteriano

Tortora et al., 2012.

16S RNA 5S RNA 23S RNA

Funo: Sntese de Protenas


Inibio da Sntese de Protenas

Mecanismo de ao

Alvos so as subunidades 50S e 30S do ribossomo

Inibio da Sntese de Protenas

Inibidores da subunidade 50S

9 Macroldeos

Eritromicina, Claritromicina, Roxitromicina, Diritromicina,

Azitromicina, Telitromicina.

9 Cloranfenicol (ativo contra anaerbios)

Cloranfenicol, Tianfenicol.

9 Lincosamidas (ativo contra anaerbios)

Lincomicina, Clindamicina.

Inibidores da subunidade 30S

6Aminoglicosdeos (dependente de O2)

Estreptomicina, Gentamicina, Amicacina, Neomicina, Canamicina.

6 Tetraciclina (inibe colagenase, quimiotaxia e aderncia bacteriana)

Tetraciclina, Minociclina, Doxiciclina, Clorotetraciclina, Oxitetraciclina.

6 Nitrofurano

Nitrofurazona, Furazolidona, Nitrofurantona, Nifurtimox.

6 Glicilciclinas (nova opo contra anaerbios)

Tigeciclina

Inibio da Sntese de Protenas Membrana citoplasmtica



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Permeabilidade Seletiva

Alterao

Inibidores da Sntese de DNA/RNA

Mecanismo de ao

Interferem na replicao do

DNA (DNA girase e DNA

polimerase) e na transcrio

(RNA polimerase - sntese

de RNA).



D Rifamicina

DNitroimidazol

DQuinolonas

Principais Antimicrobianos:


Rifamicina (Inibe a sntese de RNA)

Rifamicina, Rifampicina

Nitroimidazol (Anaerobiose Hidroxialamina dano ao DNA)

Metronidazol, Tinidazol

1. Gerao

cido nalidxicocido pipemdico

Rosoxacino

2. Gerao

NorfloxacinaCiprofloxacina

OfloxacinaDifloxacinaPefloxacina

Levofloxacina

3. Gerao

MoxifloxacinaGatifloxacinaGemifloxacinaClinafloxacina

Trovafloxacina

Quinolonas (Atuam na replicao do DNA)


Fluoroquinolonas

Alterao do Metabolismo do cido Flico

Mecanismo de ao

Inibidor competitivo

que atua na sntese de

metablitos essenciais

(cido flico).


Principal Antimicrobiano

Sulfonamidas

Sulfametoxazol + Trimetoprim


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cidoparaminobenzico

cido didroflico

cido tetraidroflico (cido flico)


Resistncia aosAntimicrobianos

Definio

9Capacidade de um microrganismo para resistir aos

efeitos de uma droga a que normalmente, sensvel.

Origem

1950 Primeiras observaes de Staphylococcussp.

resistente a penicilina.

Por que?

Uso abusivo e indiscriminado de antibiticos, o que

seleciona bactria geneticamente resistente.

*Produo industrial e consumo mundial de

antimicrobianos


Tipos de resistncia

Natural ou intrnseca

Decorrente de caractersticas inerentes clula

bacteriana e que j existe antes da exposio a um

determinado antibitico.

Exemplos:

Anaerbios aminoglicosdeos; Aerbios metronidazol;

gram positivos polimixina; gram negativos antimicrobianos

hidrofbicos (rifampicina e cido fusdico).


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Tipos de resistncia

Resistncia adquirida

Surge quando cepas resistentes emergem de

populaes bacterianas originalmente sensveis em

geral, aps exposio.

Resulta de uma alterao gentica que se expressa

bioquimicamente em resposta a ao dos antibiticos.

Tipos de resistncia

Resistncia adquirida

Cromossmica Plasmidial

Aquisio de genes

Mutao

Modifica a permeabilidadeda membrana

Plasmdios de resistncia(Plasmdio R)

Produo de enzimas (beta-lactamases,

fosfotransferase)

Mecanismos de aquisio da resistncia

Resistnciapor

mutao

Resistnciatransfervel

Transformao

Transduo

Conjugao

Mecanismos de resistncia

Inativao enzimticada droga

Alterao do stio alvo

Impedir o acesso doantibitico ao stio alvo


Inativao enzimtica da droga

9 Produo de beta-lactamases

(penicilinas, cefalosporinas e

carbapenmicos);

9 Genes (cromossomo, plasmidial e

transposons).


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Alterao do stio alvo

9Alterao das PBP (protenas

ligadoras de penicilina);

9Alterao da DNA girase e

topoisomerase.


Impedir o acesso do antibitico ao stio alvo

9Mutaes que causam alterao

na permeabilidade da membrana;

9 Efluxo da droga pelo sistema de

bombas.

Mecanismos de resistncia Transmissibilidade da resistncia aosantimicrobianos

Reservatrios comensais (humanos e animais);

Reservatrio ambiental (solo, gua, entre outros);

Disseminao por pessoas da rea de sade:

* Lavagem das mos de forma inadequada;

* Uso inadequado de equipamento de proteo.

Efeito da presso seletiva em bactrias

Para refletir...

7 Uso racional de antibiticos;

7Auto medicao;

7 Boas prticas de controle de infeces (diagnstico e

tratamento efetivo);

7Novos antimicrobianos???


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Testes de Susceptibilidade de

Bactrias Anaerbias Estritas

Quais as indicaes para o teste desusceptibilidade?

Infeces especficas (endocardites, osteomielites,

infeces que no respondem ao tratamento emprico,

infeces do sistema nervoso central);

Avaliao de novas drogas;

Determinar o padro de susceptibilidade de

determinada rea geogrfica.

1. Mtodo de diluio em caldo: macrodiluio e

microdiluio;

2. Mtodo de diluio em gar;

3. SGE (Spiral Gradient Endpoint).

Preconizado pela CLSI

(Clinical and Laboratory Standards Institute)

Outras tcnicas

Mtodo Kirby-Bauer Mtodo Epsilomtrico E-Test

Eluio de disco emcaldo

Sistemas miniaturizados:

MicroScan

Micro Media Systems

Sceptor Anaerobe MIC

Inculo Bacteriano

0,5 McFarland

(1,5 x 108 cl./mL)

Escala McFarland

Inculo Bacteriano

Incubao

0,5 McFarland

(1,5 x 108 cl./mL)

35-37C por46-48 horas.

Meios de cultura utilizados

Em Caldo: BHI (Brain

Heart Infusion);

Em gar: gar Wilkins &

Chalgren, gar Sangue, gar

Brucella.


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Agentes a serem testados

Metronidazol,imipenem, cloranfenicol,beta-lactmico/inibidor

de beta-lactamase.

Variavelmente ativo

Cefalosporinas,penicilinas eclindamicina.

Pouca atividade

Norfloxacina, ofloxacina,ciprofloxacina, e novas

fluoroquinolonas(levofloxacina,gatifloxacina,

moxifloxacina).

Ativos

Para todos os mtodos

Preparao da soluo estoque (droga) (10 mg/mL);

Diluio da droga (0,25 a 512 g/mL); Controles de viabilidade: Inicial, Final e Aerobiose;

Controle do teste: ATCC.

Diluio em gar

1. Preparao das placas com as concentraes da droga;

2. Secagem das placas;

3. Preparao do inculo (0,5 McFarland);

4. Aplicao do inculo no replicador de Steers;

5. Carimbar nas placas;

6. Esperar secar. Incubao em anaerobiose.

Diluio em gar

Replicador deSteers

(32 poos)

Diluio em gar

gar Brucella gar Wilkins & Chalgren

Diluio em gar

Vantagens

Vrias cepas podem ser

testadas ao mesmo tempo;

Vivel para todos os

anaerbios, mesmo os mais

exigentes.

Desvantagens

No conveniente para apenas

um isolado;

CBM no pode ser

determinado;

Teste dispendioso e incmodo.


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Macrodiluio em caldo

1. Preparao dos tubos com as concentraes da droga;


3. Aplicao do inculo nos tubos;

4. Incubao em anaerobiose.


Caldo BHI (Brain Heart Infusion)


Vantagens

Custo mais efetivo;

Fcil de ser executado;

So teis para isolados nico.

Pode ser determinada a CBM.

Utilizado para microrganismos

como Clostridiumspp. (swarming).

Desvantagens

Dificuldade na determinao

da CIM em microrganismo que

no apresentam turbidez aps

crescimento (Dialister).

No vivel para muitos

isolados.

Microdiluio

1. Preparao da placa com as concentraes da droga;


3. Aplicao do inculo com carimbador;

4. Incubao em anaerobiose.

Microdiluio

Caldo BHI (Brain Heart Infusion)

Microdiluio


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Microdiluio

Vantagens

Placas podem ser preparadas

antecipadamente e congeladas

ou serem compradas prontas;

Vivel para um nico isolado

ou vrios.

Desvantagens

No favorvel para

crescimento de muitos anaerbios

(Fusobacterium, Porphyromonas,

Prevotella);

Dificuldade na determinao

da CIM.

SGE (Spiral Gradient Endpoint)





Lavagem do dispositivoAplicao de droga

H2OH2O

Hipoclorito


Aplicao da droga em espiral

Mais concentrado

Menos concentrado


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2. Secagem das placas;


4. Aplicao do inculo no replicador radial;

5. Carimbar nas placas;

6. Esperar secar. Incubao em anaerobiose.


Replicador radial: 15 cepas

BactriasPlaca

Como interpretar os resultados do SGE?


Crescimento bacteriano


Diagrama para clculo da CIM

Distncia em mm



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Vantagens

Crescimento de microrganismos

exigentes;

Sistema rpido e prtico;

Diminuio no nmero de

placas.

Desvantagens

Equipamento requerido tem

custo elevado.

Qual mtodo utilizar?

9Variao dos testes permitir confuso no padro

de resistncia;

9A CIM de algumas drogas para anaerbios somtodo dependentes;

9As tcnicas de macro e microdiluio apresentama CIM uma concentrao menor do que a diluioem gar.

200 cepas testadas e comparadas SGE e SAD (Standard Agar Dilution)

8 drogas testadas (clindamicina, metronidazol, imipenem, cefoxitina, ampicilina,ampicilina/sulbactam, mezlocilina, penicilina)

SGE apresentou CIM menor em comparao com SAD.

2 cepas ATCC testadas e comparadas SGE e SAD (Standard AgarDilution) em 5 laboratrios diferentes;

Resultados discrepantes, mas devido a tcnica.

Controle de Qualidade dos Testes de

Susceptibilidade aos Antimicrobianos

9Validade das drogas e preparao das solues estoques;9 Filtrao das drogas e evitar a inativao pela luz;9 Escolha do meio de cultura (suplementos, pH, espessura);9 Tamanho do inculo (104-106 cls./mL);9 Pureza do inculo (gram, teste respiratrio);9Viabilidade do organismo-teste (incio e f im);9 Controle de esterilidade de aerobiose do teste;9 Cepas de referncia (ATCC, NCTC).

Teste de Beta-lactamase

Nitrocefin

Cefinase


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Teste de Beta-lactamase

Mtodo Biolgico

Resistente

Sensvel

Resistncia aos antimicrobianos emanaerbios

Resistncia aos antimicrobianos emanaerbios

Resistncia aumentando = rea geogrfica, conduta

teraputica e auto-medicao

Resistncia intrnseca e adquirida (plasmdios e

transposons)

Produo de enzimas beta-lactamases- estrutura

primria (classe A a D); caractersticas funcionais e

bioqumicas (grupo I a IV).

Genes relacionados com resistncia aos antibiticos

Bacteroides fragilis ermF (IS4351)(Clindamicina)

(Macroldeos)

tetQ

(Tetraciclina)

nim

(IS1168, IS1169, IS1170)

(Metronidazol)

cfxA

(Cefoxitina)

cepA classe A (IS21)

(Cefalosporina)

(Penicilina)

cfiAclasse B(IS4351, IS942, IS1186)

(Carbapenmicos)

Metais pesados

Transferncia horizontal de genes com dois tipos de

elementos conjugativos

Plasmdeos Transposons

ermF

tetQ

ermF*

ermB**

ermG**

*genes ermF inicialmente descritos em gram-positivos e foramtransferidos para gram-negativos.

**genes ermB e ermG parecem ser transferidos s entre Bacteroidesspp.

Salyers et al. (2004)

Transferncia de genes entre organismos gram positivos enegativos no clon e outros ambientes intestinais

gram-positivos gram-negativosGenes

Staphylococcusspp.

Enterococcusspp.

Streptococcusspp.

Clostridiumspp.

Actinomycesspp.Bifidobacteriumspp.

tetM

Campylobacterspp.

Haemophilusspp.

Veillonellaspp.

Fusobacterium nucleatum

Neisseriaspp.

Eubacteriumspp. tetQermF

Bacteroidesspp.Prevotellaspp.Porphyromonasspp.

Salyers et al. (2004)


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Resistncia aos antimicrobianos

24 crianas sem diarria 50 cepas Bacteroides/Parabacteroidesspp.

15 crianas com diarria 64 cepas Bacteroides/Parabacteroidesspp.

Teste de susceptibilidade:

11 antibiticos

6 metais pesados

Porcentagens de resistncia para antimicrobianos de 114espcies dos gneros Bacteroidese Parabacteroides

Bactrias-Origem (n) Faixa de Resistncia (%)

Antibiticos:Amx, Amp, Cfx, Cli, Er, PenG, Tet

Pacientes (64) 13,7 100

Sadios (50) 22 100

ons Metlicos:Hg, Ag, Cu, Cd, Pb, Ni

Pacientes (64) 57 100

Sadios (50) 80 100

Nakano etal. (2004)

Cura: Resistncia paraPenicilina G, Ampicilina,

Clindamicina eAmoxicilina/cido

clavulnico

90 crianas sem diarria 35 cepas Clostridiumspp.91 crianas com diarria 56 cepas Clostridiumspp.


10 antibiticos

Ferreira etal. (2004)

30 paciente com implantes:

- Prevotella intermedia 19 cepas

- Porphyromonas gingivalis 7 cepas


8 metais pesados


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Pfau& Avila-Campos (2005)

Silvestroet al. (2006)

Alteraes morfolgicas produzidas por antibiticos em B. fragilis

Clindamicina

Cefoxitina

Silvestroet al. (2006)

Alteraes morfolgicas produzidas por antibiticos em B. fragilis

Clindamicina

Controle

Cefoxitina

54 bezerros sem diarria 92 cepas Bacteroides/Parabacteroidesspp.

54 bezerros com diarria 124 cepas Bacteroides/Parabacteroidesspp.Teste de susceptibilidade:

12 antibiticos

6 metais pesados

Almeida et al. (2007)


18/19

5225 cepas amostras clnicas Bacteroides/Parabacteroidesspp.

Snydman et al. (2007)

466 cepas amostras clnicas Bacteroides/Parabacteroidesspp.

Rohet al. (2009)

114 cepas Bacteroides/Parabacteroidesspp.


8 antibiticos

Genes de resistncia:

cfiA, cepA, tetQ, nim, ermF


19/19

Nakano etal. (2011)

Genes de resistncia:

cfiA: Carbapenmicos

cepA: Cefalosporinas/Penicilina

tetQ:Tetraciclina

nim:Nitroimidazol (metronidazol)

ermF:Clindamicina/MacroldeosNakano etal. (2011)

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