UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO DISCIPLINA DE PARASITOLOGIA

VLAUDIA M. A. COSTA JOO INCIO IRMO

RECIFE 2008

PARASITOLOGIA CLNICA

EXAMES PARASITOLGICOS A maioria dos parasitos intestinais pode ser diagnosticada pelo exame das fezes, embora outros materiais como urina, escarro, secrees, tecidos e contedo duodenal, podem ser utilizados para identificao de algumas espcies de parasitas. No diagnstico parasitolgico podemos identificar mais frequentemente ovos e larvas de helmintos e os cistos, oocistos e trofozotos de protozorios. A identificao correta dos parasitos vai depender principalmente das condies das amostras. Portanto, fundamental a colheita adequada do material. No material fecal normalmente encontramos elementos como resduos alimentares, clulas vegetais, gro de plen, leuccitos e outros artefatos que podem facilmente ser confundidos com parasitos. Adultos de Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, proglotes de Taenia spp e de Dipylidium caninum podem ser encontrados no bolo fecal, sem que a presena de ovos seja identificada. Desta forma importante a realizao do exame macroscpico. A deteco e a identificao dos parasitos intestinais depende, portanto, da qualidade da amostra entregue ao laboratrio. Na colheita deve-se observar o tipo de recipiente, volume, tempo da amostra, utilizao de algumas drogas pelo pacientes, compostos qumicos. Estes fatores podem interferir na realizao do exame. O recipiente deve estar seco e limpo. Amostras secas nas bordas e na superfcie devem ser rejeitadas. O pote deve estar livre de anti-spticos, agentes germicidas, gotas de leo e de urina para evitar a destruio de formas vegetativas. Fezes excretadas no solo no devem ser utilizadas para evitar a contaminao com larvas de vida livre. O material no pode ser obtido de privadas, pois a gua e a urina poderiam destruir trofozotos. Os medicamentos como antibitico, antidiarricos, anticidos, derivados de bismuto e do brio, vaselina e leos minerais podem interferir nos resultados levando a resultado falso negativo. A utilizao de antibiticos pode afetar a flora intestinal normal causando diminuio ou ausncia temporria dos organismos, visto que muitos parasitos se alimentam de bactrias intestinais. De um modo geral as amostra devem ser colhidas em dias separados, uma srie de trs amostras em no mais de 10 dias. Este procedimento propicia uma maior positividade, uma vez que a eliminao de ovos e cistos nem sempre ocorre continuamente. O tempo de colheita do material tambm influencia no resultado. Os trofozotos de protozorios no se multiplicam nem encistam fora do organismo humano, e geralmente se degeneram aps a

excreo. Desta forma recomenda-se a leitura 30 minutos aps a colheita de fezes lquidas, as fezes pastosas devem ser processadas at uma hora aps evacuao. Pelo curto tempo nestes casos, este material deve ser colhido com substncias conservantes como formalina, MIF, SAF, etc. Quando se trata de fezes slidas este material pode ser observado at 24 horas ou preservados.

SOLUES CONSERVADORAS DE MATERIAL FECAL

Formalina a 10% MIF (mertiolato iodo formaldedo) SAF: TAF: utilizada na conservao de helmintos (larvas e vermes adultos).

EXAME MACROSCPICO As amostras fecais no preservadas devem ser examinadas macroscopicamente para determinar consistncia, odor, cor, presena ou ausncia de sangue, muco, proglotes e vermes adultos.

NORMAS TCNCAS DE SEGURANA LABORATORIAL

Utilizar uniforme adequado nos trabalhos de laboratrio.

Manusear o material biolgico devidamente protegido

Evitar aspirar ou inalar produtos qumicos ou biolgicos.

Identificar os produtos ou solues antes de usar.

formadas

Semi-formadas

Pastosas

Lquidas

Cistos

trofozoito

Encaminhar ao lixo a vidraria danificada.

Desprezar todas solues sem identificaes.

Manter em solues conservadoras o material diagnosticado para demonstrao futura.

O transporte de substncias volteis, cidos ou bases fortes, dever ser realizado com cuidados especiais de segurana.

Manter em local de fcil acesso extintor de incndio.

Deixar no laboratrio apenas os reativos, solues e corantes de uso dirio.

Colocar em local de fcil acesso antdotos.

CONTROLE DE QUALIDADE

No utilizar solues, reagentes e corantes com a data vencida.

Observar a adequada calibrao de equipamentos (ala de platina)

Manter o equipamento ptico (microscpio, lupa) em bom estado de conservao.

Controle dirio da temperatura de banho-maria e estufa.

No submeter vidraria e equipamentos calibrados alta temperatura.

Conservar adequadamente amostras padres de parasitos e material de ensino.

Estabelecer controle de qualidade externo mantendo intercmbio com outros profissionais (instituies de referncia).

COPROLOGIA

RESDUOS ALIMENTARES E ELEMENTOS ANORMAIS

Introduo: Devido a uma grande variedade de elementos que o exame microscpio pode revelar nas fezes, nem mesmo os coprologistas mais experimentados so capazes de identificar tudo que visto nas preparaes de lminas fecais.

A coprologia tem como objetivo estudar as mais diversas funes digestivas, que direta ou indiretamente, estejam ligadas a formao de massa fecalgica final. A presena de estruturas como polimorfonucleares, eritrcitos, picitos, gro de amido, fios e plos vegetais, cristais de Charcot Leyden, macrfagos, Blastocystis, etc., muitas vezes confundem os tcnicos em microscopia com estruturas outras, tais como: trofozotos, cistos, larvas e ovos.

O referido tema possu grande relevncia no que diz respeito, principalmente aos chamados diagnsticos diferenciais dos esfregaos fecais, dando condies tcnicas ao laboratrio, para fornecer resultados que induzam ao medico o diagnstico, facilitando a formulao das requisies direcionadas para cada caso especfico. Ex.: requisio direcional para coprocultura ou para exame parasitolgico.

FINALIDADES GERAIS DA COPROLOGIA:

Estudo das funes digestivas.

Pesquisa do sangue oculto.

Pesquisa bacteriolgica

Pesquisa parasitolgica

Na avaliao coprolgica deve-se proceder de forma cientfica desde a avaliao com orientao mdica ao paciente, at o tipo de dieta, coleta e manuseio at chegar aos resultados coprolgicos finais.

Normalmente o paciente orientado, de acordo com o tipo de exame que se pretende fazer. Ex. na pesquisa de sangue oculto fecal, no podemos permitir que o doente ingira carnes ou medicamentos ferrosos, que certamente iriam mascarar os resultados. Para o exame parasitolgico de rotina, no se deve prescrever qualquer tipo de regime alimentar especial. Para os exames coprolgicos especiais como dosagem de gordura fecal e/ou das funes digestivas, recomenda-se o Regime misto ou seja, o paciente conserva os seus hbitos alimentares, acrescentando as substncias alimentares especficas em qualidade e quantidade estipuladas pelo mdico requisitante. DIETA DE GAUTIER para estudo dos elementos residuais das fezes:

Carne de bovino-------------------------------------------------- 60 g Leite ---------------------------------------------------------------300 mL

Manteiga --------------------------------------------------------- 30 g

Po -----------------------------------------------------------------100 g

Batata --------------------------------------------------------------100 g

OBS.: nestas quantidades prescritas, basta 1 nica refeio de prova, no havendo necessidade de dieta por perodo de 3 dias, como manda as dietas em geral. Ingerir uma cpsula de Carmim 0,3 g ao iniciar a dieta, a fim de facilitar o reconhecimento das fezes.

Deve-se coletar todo o material da evacuao normal ( a mais prxima da prova) em frasco de boca larga limpo e seco remetendo imediatamente para o laboratrio, ou colocar em geladeira 4 oC para exame posterior.

A maioria dos autores critica a utilizao de purgantes para acelerar as evacuaes.

PESQUISA DE SANGUE OCULTO NAS FEZES

PROCEDIMENTO:

Espalhar pequena quantidade de fezes sobre o papel de filtro limpo e colocar duas gotas de gua oxigenada sobre o esfregao. Adicionar duas gotas de soluo de benzidina. Observar imediatamente a cor. Leitura:

A reao de benzidina sensvel, mas as gorduras podem torn-la positiva. Nenhuma mudana de cor: Negativo Cor esverdeada: Traos Cor verde claro: + Cor vede escuro: ++ Cor verde azulado: +++ Azul intenso: ++++

ASPECTOS GERAIS DA MATRIA FECAL:

Aspectos do material fecal como, consistncia, forma, cor, odor, viscosidade e pH, so fatores de grande relevncia para o diagnstico coprolgico, como um todo, sendo considerados desde uma simples induo diagnstica, at mesmo a alteraes de caracteres patolgicos de malignidade. Ex.:

Fezes em formato tpico de fita pode ser indcio de algum estreitamento do reto sigmide. Fezes com odor tpico de cola de carpinteiro, fala a favor de infeco por ameba. Fezes com presena de sangue podem induzir a simples diagnsticos de processos hemorroidrios ou cncer.

EXAME MICROSCPICO

Resduos alimentares de origem animal

Tecido conjuntivo, fibras musculares, gorduras e sabes.

RESDUOS ALIMENTARES DE ORIGEM VEGETAL Amido intracelular, amido extracelular (amido amorfo), amido cru, celuloses, fibras e plos vegetais, vasos espiralados e clulas vegetais.

ELEMENTOS DE ORIGEM INTESTINAL DE NATUREZA NO PARASITRIA: Muco, eritrcitos, leuccitos, picitos, clulas epiteliais, cristais.

ELEMENTOS DE ORIGEM INTESTINAL DE NATUREZA PARASITRIA E/OU PUROS COMENSAIS Protozorios, helmintos, artrpodes, Blastocystis, Meloidogyne e leveduras.

CONCLUSO DE ESTUDO COPROLGICO COM DIAGNSTICO DIFERENCIAL DAS LMINAS

L1: leuccitos + eritrcitos + picitos (raros/ausentes) + cristal de Charcot Leyden = diagnstico sugestivo de Amebase (Disenteria amebiana).

L2: leuccitos + eritrcitos + picitos (inmeros) + ausncia de cristal de Charcot Leyden = diagnstico sugestivo de um processo bacilar (disenteria bacilar). Nestes casos em particular, o cristal e os picitos foram elementos diferenciadores do diagnstico laboratorial em lmina. O diagnstico diferencial em lmina fecal muito importante quando o mdico necessita intervir com urgncia, seja com relao ao tipo especfico de exame que deva se requisitar ou mesmo com relao teraputica, principalmente quando se trata de paciente de baixa idade ou idosos.

EXAME PARASITOLGICO DAS FEZES

O exame parasitolgico de fezes constitui na prtica mdica providncia de fundamental importncia para o diagnstico das parasitoses intestinais. Sua execuo envolve a utilizao de vrios mtodos que objetivaram a pesquisa de protozorios intestinais nas suas formas csticas e vegetativas, como tambm de ovos, larvas e por vezes vermes adultos de helmintos. Alm da possvel presena de formas infectantes ou infestantes, de enteroparasitos, h tambm a possibilidade de que o material em exame contenha bactrias e vrus patognicos. Portanto, deve ser observada uma srie de cuidados no s na manipulao, como tambm na limpeza da vidraria e na destinao da amostra examinada. O emprego de substncias desinfetantes se faz necessrio.

COLETA DE MATERIAL:

Geralmente a colheita do material feita em casa, portanto necessrio algumas recomendaes, uma vez que sua coleta adequada de fundamental importncia. As amostras no devem ser colhidas durante uma semana depois que o paciente tenha tomado substncias que deixam resduos cristalinos, tais como compostos antidiarricos, anticidos, bismuto e brio. Alm disso, laxativos oleosos tais como leo mineral pode interferir no exame. Antibiticos e meios de contraste reduzem os nmeros de organismos, particularmente protozorios, nas fezes durante 2 a 3 semanas. As amostras devem ser isentas de urina e no devem estar contaminadas por gua do vaso sanitrio ou pelo solo, pois estes podem conter

protozorios e helmintos livres ou podem destruir trofozotos. gua armazenada no laboratrio tambm podem tornar-se contaminadas com estes organismos. Como os nmeros de formas diagnosticados de alguns parasitos podem variar, aconselhvel examinar os espcimes obtidos em dias alternados ou de 3 em 3 dias, com um total de trs espcimes sendo o mnimo para assegurar ausncia de infeco. As fezes para exame coprolgico devem ser colhidas em recipientes de boca larga cuidadosamente limpos, sem necessidade de esterilizao. Colher o material correspondente parte intermediria da evacuao, que em geral de maior uniformidade. Quando o exame seriado obtido normalmente examinado e no identifica parasito, podem ser conseguidos espcimes purgados, particularmente quando se suspeitam de infeces por protozorios. Deve-se usar purgativos salinos, como sulfato ou fosfasoda tamponada em vez de compostos de leo mineral ou de magnsia, que podem interferir com o exame por causa dos glbulos de leo ou detritos cristalinos.

ASPECTO MACROSCPICO DO MATERIAL FECAL

Deve-se fazer um exame macroscpico das fezes, porque permite observar: a) Consistncia: moldada, pastosa, diarrica. b) Presena de sangue e muco c) cor d) Helmintos adultos ou partes dos mesmos

Quando se tratar de material moldado, ou mesmo pastoso, so indicados os mtodos de concentrao, ao passo que em se tratando de material diarrico, liquefeito ou com muco ou sangue, impe-se os exames diretos a fresco ou aps fixao pela hematoxilina frrica. Esta conduta explicada pelo fato de que, geralmente, nas enteroprotozooses, as formas vegetativas so encontradas no material diarrico, enquanto cistos esto presentes em fezes pastosas e moldadas. Evidentemente, as formas vegetativas muito frgeis no resistem aos trmites dos mtodos de concentrao. Todavia, tambm estes devem ser aplicados ao material liquefeito, portanto nas helmintoses intestinais podem sobrevir, muitas vezes, crises diarricas.

PROTOZORIOS DE VIDA LIVRE TIPOS DE MOVIMENTO Movimento Amebide: Processa-se por meio da emisso de prolongamentos do protoplasma, que so os pseudpodes. o movimento das amebas, pode ser lento ou rpido. (amebdeos de vida livre) Movimento Flagelar: Processa-se as custas de flagelos, so filamentos longos, delgados e flexveis. O nmero de flagelos nos animais varia de 01 a 08. um movimento tipo saltitante, helicoidal, chicoteando o meio lquido (Euglena). Movimento Ciliar: Processa-se por meio de clios, que so filamentos curtos e numerosos, envolvendo todo corpo do animal. um movimento ondulante, oscilatrio (Paramecium, Opalina, etc.) Algumas formas que so de vida livre ou saprozicas no interior de animais: Rhizopoda

Amoeba proteus Mastigophora

Trichomonas, Chilomastix, Euglena Ciliophora - Paramecium, Opalina, Zeleriella, Nyctotherus

OBSERVAO DO MATERIAL Exame Direto 1. colocar uma gota do material a ser examinado numa lmina, cobrindo com uma lamnula. 2. Usando a objetiva de 45X, observar a presena de formas mveis dos protozorios (trofozotos) 3. Procurar focalizar o protozorio, que facilmente reconhecido pelo seu movimento tpico

OBSERVAO DE FLAGELADOS E CILIADOS

1. Preparar a lmina com o material a observar 2. Levar ao microscpio, usando a objetiva de 45X e observar os movimentos da forma pesquisada.

3. Retirar com papel de filtro, parte da gua existente entre a lmina e lamnula, com cuidado, at conseguir uma diminuio do movimento do flagelado ou ciliado e verificar as caractersticas morfolgicas

MTODOS LABORATORIAIS APLICADOS NA IDENTIFICAO DE PARASITOS DO APARELHO DIGESTIVO

QUALITATIVOS Preparao fresco:

Este mtodo indicado para o material fecal emitido recentemente (menos de 20 minutos), de consistncia lquida ou pastosa e que se admite que contenham trofozotos de protozorios.

Exame Pelo Mtodo Direto Este mtodo foi utilizado pela primeira vez por Leeuwenhoek quando identificou a Giardia lamblia no sculo XVII. Tem sido empregado quando h carncia de recursos ou a infestao parasitria reconhecidamente intensa. Pode ser empregado em fezes de consistncia variada, recentemente emitidas ou no.

MTODO DE SEDIMENTAO ESPONTNEA (HOFFMAN, PONS & JANER)

FUNDAMENTO: Precipitao de partculas, inclusive de cistos, ovos e larvas de parasitos ao fundo do clice de sedimentao, devido a fora de gravidade.

INDICAO: Utilizado na pesquisa de ovos de S. mansoni, atualmente usado na rotina diria dos laboratrios, na deteco de cistos de protozorios, de ovos e larvas de helmintos. Adolf Lutz, eminente pesquisador brasileiro, empregou o modelo pela primeira vez, no entanto, foi a partir dos trabalhos de Hoffman, Pons e Janer, que a tcnica passou a ser conhecida mundialmente. A vantagem deste mtodo a economia dispensando o uso de reagentes e centrfugas. A desvantagem a grande quantidade de detritos fecais, dificultando, com freqncia a preparao e o exame da lmina.

PROCEDIMENTO: 1. Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de vrias partes do bolo fecal, em copo graduado

ou Becker de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml de gua corrente e misturar vigorosamente.

2. Preparar a suspenso juntando 100 ml de gua corrente. 3. Filtrar essa suspenso atravs de gaze dobrado 4 vezes, recolhendo-a em copo de

sedimentao de capacidade de 125 ml. 4. Se necessrio, adicionar gua corrente, at completar aproximadamente do volume do

copo cnico. Deixar a suspenso em repouso durante 1 a 2 horas. 5. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena

poro do sedimento na camada inferior, depositando sobre uma lmina. Se a preparao estiver muito espessa, diluir com uma gota de soluo salina a 0,85% ou gua corrente. Colher amostra adicional do centro e do fundo do sedimento.

6. Examinar ao microscpio, a presena de ovos, larvas e cistos.

CENTRFUGO-FLUTUAO PELO SULFATO DE ZINCO (FAUST & Cols.)

FUNDAMENTO: Flutuao de cistos de protozorios e ovos leves de helmintos em soluo de sulfato de zinco.

INDICAO: Indicado na pesquisa de protozorios e de ovol leves de helmintos (Ancilostomdeos, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura). Esta tcnica imprpria para espcimes que contenham grande quantidade de gorduras. A tcnica pode ser utilizada com fezes preservadas em formaldedo, SAF e outros fixadores, no entanto a densidade especfica dever se ajustada em 1.2 g/mL. O aumento de densidade poder resultar em uma distoro dos organismos. Obs.: 1. ovos de trematdeos e de cestides podem estar presentes, portanto um exame completo deve-se examinar tambm o sedimento.

2. uma permanncia prolongada da suspenso em sulfato de zinco, pode resultar em distoro dos cistos e ovos de nematdeos. A preparao deve ser examinada at 20 minutos. Deve-se utilizar tubos com fundo

PROCEDIMENTO: 1. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de vrias partes do bolo fecal em frasco contendo 10 ml

de gua. Filtrar a suspenso atravs de gazes dobradas em quatro vezes , e receber o filtrado em um tubo cnico de centrfuga de 15 ml.

2. Adicionar gua corrente at completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar ( 650x g ( 2500rpm) por 1 minuto ).

3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de gua corrente ao sedimento , antes de ressuspend-lo. Completar com gua 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar.

4. Repetir a etapa 3, at que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. 5. Depois que o ltimo sobrenadante decantado, adicionar 1 a 2 ml do reagente , e

ressuspender o sedimento: completar com sulfato de zinco 33% at 0,5 cm da borda do tubo e

centrifugar (650 x g( 2500rpm) por 1 min ). 6. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e,

sem agitao Coloca-lo em uma estante em posio

vertical.

7. Com uma ala de arame (dimetro de 5 a 7 mm) tocar no centro da membrana formada na superfcie, transferido vrias aladas para uma lmina de microscopia. Examinar ovos larvas e cistos.

8. Depois de concluda a etapa 4, com auxlio de pipeta, encher o tubo at a borda com soluo de sulfato de zinco. Colocar uma lamnula (22 x 22 mm) na superfcie do tubo. Deixando-a em contato com o lquido durante 8 a 10 minutos. Remover a lamnula, invertendo a sua posio, e colocar a face com a gota sobre uma lmina. Examinar para larvas e cistos.

MTODO DE WILLIS

FUNDAMENTO: Baseia-se na capacidade da soluo saturada de cloreto de sdio em fazer flutuar ovos de helmintos considerados leves.

INDICAO: 1. Recomendado para a pesquisa de ovos de helmintos de baixo peso especfico como ancilostomdeos e Trichuris trichiura ou ainda de ovos frteis de Ascaris lumbricoides. No recomendado para protozorios, ovos infrteis de A. lumbricoides e ovos de tremadeos ou E. vermicularis.. Este mtodo bastante eficiente na identificao de ovos de ancilostomdeos, sobretudo nos casos em que h baixa infestao. Pode-se usar aucar ao invs do sal no preparo da soluo (Sheather). PROCEDIMENTO

1. Colocar uma quantidade de fezes de aproximadamente 1 a 2 g. coletada de vrias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3 cm de dimetro com capacidade aproximada de 20 ml. Completar da capacidade do recipiente com soluo saturada de cloreto de sdio.

2. Suspender as fezes na soluo saturada salina at haver uma total homogeneizao. 3. A lamnula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos; no

dever haver formao de bolhas de ar entra a lamnula e a superfcie do lquido. A gota contendo os ovos se adere face inferior da lamnula .

4. Remover a lamnula e inverter rapidamente a sua posio sobre uma lmina. 5. Examinar ao microscpio com objetiva de pequeno aumento.

CENTRFUGO-SEDIMENTAO POR FORMOL ACETATO DE ETILA

FUNDAMENTO: Fornece o diagnstico para ovos, larvas e cistos de todas as espcies de parasitos intestinais detectveis, alm de separar dos detritos, deixando o sedimento limpo.

INDICAO: Destina-se pesquisa de protozorios e helmintos nas fezes

PROCEDIMENTO: 1. Diluir aproximadamente 2 g de fezes em 5 mL de soluo de formalina a 10% e filtrar

por meio de gaze dobrada. 2. colocar em tubo de centrifuga e acrescente 1 ou 2 gotas de detergente comercial. 3. acrescentar 3 mL de acetato de etila comercial; 4. tampe o tubo e agite por 10 segundos 5. destampar e centrifugar por 2 minutos a

2000rpm

Observar a formao de quatro camadas distintas

1a camada - sedimento no fundo do tubo

2a camada formalina

3a camada detritos

4a camada acetato de etila 6. despreze a camadas sobrenadantes com um

movimento rpido 7. ressuspender o sobrenadante com 7 ml de gua. Tampe o tubo e agite 8. centrifugar 2000 rpm por 2 minutos. Desprezar o sobrenadante 9. deixar o tubo emborcado sobre gaze por 2 minutos 10. ressuspender o sedimento com lugol. Colocar uma gota do sedimento sobre lmina e

proceder a leitura.

FUNO DO FORMOL: fixar e manter ntegras as estruturas de ovos, larvas e cistos por perodos prolongados. Tem funo tambm de diluente. FUNO DO ACETATO DE ETILA: o acetato de etila remove as substncias graxas e possibilita a flutuao dos detritos. um eficiente solvente para objetos de plstico (tubo, pipetas, estantes, empreg-los sempre com objetos de vidro) FUNO DO DETERGENTE: o detergente se destina a aumentar a positividade para ovos de A. lumbricoides. Os ovos infrteis de ascaris tm a superfcie acentuadamente mamilonada, permitindo que muitas gotculas de acetato de etila se alonguem na sua face voltada para o fundo do tubo. Em consequncia alguns desses ovos seriam retidos junto ao sobrenadante. Em presena de detergente, que tem a propriedade de baixar a tenso superficial, as gotculas de acetato confluem umas em relao as outras com maior facilidade, reduzindo a possibilidade delas alongarem debaixo de estruturas como os ovos infrteis de Ascaris.

CENTRFUGO-SEDIMENTAO POR FORMOL TER (MTODO DE RITCHIE)

FUNDAMENTO: Fornece o diagnstico para ovos, larvas e cistos de todas as espcies de parasitos intestinais detectveis, alm de separar dos detritos e gorduras fecais.

INDICAO: Destina-se pesquisa de protozorios e helmintos nas fezes

FUNO DO TER: O ter tem a mesma funo do acetato de etila, isto , ele dissolve as substncias graxas e faz flutuar os detritos, porm ele mais voltil, explosivo e inflamvel.

PROCEDIMENTO:

1. Colocar 1 ou 2g de fezes coletadas de vrias partes do bolo fecal em frasco contendo 10ml de gua corrente ou soluo salina a 0,85%;

2. Filtrar a suspenso atravs de gaze dobrada duas ou quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cnico de centrfuga de 15 ml.

3. Centrifugar 2000 rpm por minuto); 4. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de gua corrente ou soluo salina a

0,85% ao sedimento antes de ressuspend-lo. Completar com gua corrente (ou soluo salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar 2000rpm por 1 min).

5. Repita a etapa 4, at que o sobrenadante se apresente relativamente claro. 6. Depois que o ltimo sobrenadante decantado, ressuspender o sedimento com 1 a 2

ml de formalina a 10% (dar preferncia soluo tamponada de formalina a 10% , pH. Neutro). Completar o volume da suspenso em 10 ml com formalina a 10%. Deixar em repouso em repouso durante 5 minutos.

7. Adicionar 3ml de ter ou acetado de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posio invertida, por 30 minutos. Remover a tampa com cuidado.

8. Centrifugar 2000rpm 1 min. Quatro camadas se formaro: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitas, (2) camada de formalina, (3) tampo de detritos fecais, e (4) camada de ter na superfcie.

9. Afrouxar e separar o tampo de detritos das paredes do tubo com um estilete fino,e com cuidado decantar as trs camadas superiores. Limpar com swab de algodo as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes.

10. Uma pequena quantidade de lquido que permanece nas paredes do tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o lquido e o sedimento, preparando as lminas para a pesquisa de ovos, lavas e cistos.

MTODO DE BAERMANN-MORAES

FUNDAMENTO: Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas e na tendncia destas de sedimentar, espontaneamente, quando se encontram na gua.

INDICAO: Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra tambm a presena de larvas de ancilostomdeos e por vezes at adultos de nematdeos pequenos como E. vermiculares. Ao serem examinadas fezes que permaneceram, antes do exame, em temperatura ambiente por perodo superior a 24 horas, ou ainda de indivduos que sofrem de constipao intestinal, ocorre a possibilidade de que as larvas encontradas sejam rabditides ou filariides de ancilostomdeos e no de Strongyloides stercoralis PROCEDIMENTO: 1. Encher o funil com gua corrente, aquecida a 40-45C. 2. Abrir a pina de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de gua para evitar a

formao de bolhas de ar na haste e no tubo de ltex. 3. Colocar 8 a 10 g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada quatro vezes e, se

necessrio, juntar mais gua, at que as fezes fiquem submersas. 4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 5. Abrir a pina e coletar parte do lquido em vidro de regio; examinar ao microscpio

estereoscpio (aumentos 20 a 30 x). Deixar em repouso durante alguns minutos, pois desta forma as larvas migraro para o centro do vidro de relgio, ou proceder de acordo com o item 6.

6. Coletar em tubo cnico de centrfuga. Centrifugar (500 x g por 1 min), e examinar o sedimento entre lmina e lamnula. Corar a preparao com soluo de Lugol, para a identificao das caractersticas morfolgicas das larvas, e examinar ao microscpio com aumento de 20x.

MTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA

FUNDAMENTO: Baseia-se no hidro e termotropismo das larvas de S. stercoralis contidas no material fecal. INDICAO: Indicado na pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis. Demonstra tambm a presena de larvas de Ancilostomdeos, notadamente em pacientes portadores de constipao intestinal.

A observao microscpica deve ser cuidadosa e toda larva visualizada dever ser identificada segundo a chave de classificao proposta por AMATO NETO & cols.

PROCEDIMENTO: 1. Estender, sobre a abertura de um recipiente

contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trs;

2. Encher, com aproximadamente 70 a 100 ml de gua corrente aquecida a 40-45C, um copo cnico de sedimentao (capacidade de 125ml);

3. Transferir o recipiente com as fezes para o interior

do copo cnico de sedimentao, de modo que o lquido alcance toda a extenso da abertura do recipiente, cuidando para no formar bolhas de ar;

4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 5. Colher o sedimento, no fundo do copo cnico, com pipeta capilar longa. Alguns autores

recomendam retirar o recipiente do copo Cnico antes da colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente, para evitar o revolvimento do lquido;

6. Examinar o sedimento entre lmina e lamnula. Corar a preparao com soluo de lugol.

MTODO DE HARADA-MORI

FUNDAMENTO O mtodo visa o cultivo de larvas em papel de filtro.

INDICAO Empregado no cultivo de larvas de ancilostomdeos e Strongyloides stercoralis presentes no material fecal.

PROCEDIMENTO: 1. Distribuir 0,5 g de fezes em tira de papel de filtro (3

x 15 cm), deixando as extremidades livres. 2. colocar a tira em um tubo de ensaio (18 cm), com

gua destilada, de modo q1ue a extremidade inferior toque na gua;

3. tampar o tubo de ensaio, deixar 7 a 14 dias na temperatura ambiente

4. examinar com lupa o fundo do tubo 5. adicionar formalina 10% de piperazina a 5% e colocar o tubo de ensaio em banho-maria a

50oC por 15 minutos a fim de matar as larvas; 6. retirar as larvas e coloca-las entre lmina e lamnula para identificao.

MTODO DE TAMISAO (pesquisa e identificao de proglotes)

FUNDAMENTO: Este mtodo fundamenta-se na tamisao do material fecal, como meio de captura de anis (proglotes) de tendeos.

INDICAO: indicado para a retirada de anis de esclex de tendeos das fezes para fins de diagnstico para controle de cura; como tambm so encontrados vermes adultos de A. lumbricoides, E. vermicularis, T. trichiura, Ancilostomdeos e H. nana. Estes parasitas so encontrados no bolo fecal durante o incio do tratamento.

recomenda-se realizar o mtodo com o material fecal excretado durante o dia. Para melhor conservao, as fezes devem ser colocadas em formalina 10%

PROCEDIMENTO: Emulsionar as fezes com gua. Coar a emulso atravs de peneira metlica. Este procedimento deve ser realizado em uma pia, servindo-se de um jato de gua corrente. Vermes adultos como o Ascaris lumbricoides e Enterobius vermicularis so encontrados freqentemente misturados ou na superfcie das fezes, como tambm as proglotes de tenias. Outros helmintos como o Trichuris trichiura, ancilostomdeos e Hymenolepis nana so depositados no bolo fecal aps o incio do tratamento. Freqentemente podero ser encontrados helmintos adultos nas amostras fecais e ausncia dos ovos. Esses processos macroscpicos so vantajosos para a demonstrao e coleta de pequenos helmintos, de proglotes e de esclex. Identificao de Proglotes de Taenia Dois mtodos so indicados para a identificao de proglotes de Taenia: o cido actico e o de CAMPOS (AMATO NETO & CORREA, 1980). Mtodo do cido Actico Glacial:

1. Colocar em uma placa de Petri, contendo cido actico glacial, a proglote a ser identificada, durante 15 a 20 minutos.

2. Aps o perodo, comprimi-la entre lminas. 3. Examinar sob iluminao intensa.

Mtodo de CAMPOS: 1. Dissolver trs comprimidos de metoquina em 5 ml de gua destilada-deionizada. 2. Mergulhar nesta soluo, durante 15 minutos, a proglote a ser identificada. 3. Aps este perodo, comprimi-la entre lminas. 4. Examinar sob iluminao intensa.

MTODO DA FITA GOMADA (GRAHAM) FUNDAMENTO Baseia-se na utilizao da fita gomada na apreenso de estgios evolutivos de parasitos, localizados na regio perianal.

INDICAO Este mtodo indicado para a pesquisa de todos os parasitos que prioritria ou ocasionalmente se deslocam at a regio perianal. Assim sendo, poderemos detectar o Enterobius vermicularis, Taenia sp, e eventualmente ovos de Ascaris lumbricoides, Ancilostomdeos e Trichuris trichiura. PROCEDIMENTO 1. Coleta do material dever ser realizada pela manh

antes que o paciente realize sua higiene. Recomendar que o paciente no utilize pomada ou outro qualquer medicamento de uso tpico na regio anal ou perianal na noite anterior ao exame.

2. Tomar um pedao de fita gomada com aproximadamente 10 cm, colar nas extremidades dois retngulos de papel "oficio", a fim de servirem para identificao dos pacientes e manuseio do tcnico, sem risco de contaminao.

3. Montar em tubo de ensaio. (l5xI50) de modo que a parte adesiva permanea livre, na parte externa do fundo do tubo.

4. Recomendar que o paciente fique em decbito ventral, e aplicar a fita gomada montada sobre a regio perianal, tendo o cuidado de afastar os glteos.

5. Aps a coleta, aplicar a fita gomada sobre a lmina pressionando levemente do centro para a periferia a fim de evitar a apreenso de bolhas de ar.

6. Preparar no mnimo duas lminas. Em seguida levar a microscopia. 7. As lminas assim preparadas podero ser encaminhadas at dois meses aps, devido a

capacidade de conservao da tcnica

TCNICA DE KINYOUN

FUNDAMENTO

Os coccdios coram-se pela fucsina bsica , adquirindo colorao vermelha ou rosa brilhante intensa; e so lcool cido resistente, destacando-se de outros resduos, leveduras e bactrias.

INDICAO Este mtodo indicado para pesquisa dos coccdios intestinais, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis e Isospora belli

PROCEDIMENTO: 1. Preparar o esfregao com uma a duas gotas de fezes frescas ou preservadas. Deixar secar a temperatura ambiente. 2. Fixar submetendo direto ao calor rapidamente. 3. Cobrir com Fucsina 3 a 5 minutos 4. Lavar rapidamente 5. Diferenciar com lcool cido at no sair mais corante. 6. Lavar com gua 7. Contra corar com azul de metileno 30 segundos a 1 minuto. 8. Deixar secar e examinar ao microscpio

Obs.: a colorao de fundo da preparao depende do corante utilizado; azul de metileno concede a cor azul aos organismos que no se coram pela fucsina, enquanto o verde malaquita cora o fundo verde e o cido pcrico em amarelo

SOLUO DE FUCSINA CARBRICA Fucsina bsica 4,0 g Fenollquido 8,0 g lcool a 95 % 20 mL gua destilada 100 mL Dissolver a fucsina no lcool e no fenol.

Filtrar antes de usar. SOLUO DE COOL-CIDO CLORDRICO A 0,1% HCl P.A 0,1 mL

lcool 99 mL SOLUO ESTOQUE DE AZUL DE METILENO Azul de metileno 1,4 g lcool a 95% 100 mL

SOLUO DE USO AZUL DE METILENO Soluo estoque 10 mL

gua destilada 90 mL

MTODOS QUANTITATIVOS

Estes mtodos so empregados quando se deseja avaliar a intensidade da infestao parasitria, ou ainda quando se pretende comparar mtodos laboratoriais. Descreveremos dois destes mtodos; o de STOLL-HAUSHEER e o KATO-KATZ.

MTODO DE STOLL-HAUSHEER (contagem de ovos)

FUNDAMENTO Baseia-se na diluio de quantidade conhecida de fezes e a contagem do nmero de ovos de uma amostra da diluio, de maneira a deduzir a intensidade parasitria.

INDICAO Indicado na avaliao da carga parasitria e suas repercusses patognicas. Ex. Ancilostomdeos.

PROCEDIMENTO 1. Preencher com NaOH (N/1 O), o frasco de Stoll at a marca que corresponde a 56 mL. 2. Adicionar fezes at que o lquido (NaOH) alcance a marca de 60 mL. 3. Introduzir no frasco prolas de vidro (+ 12) e em seguida, obtur-lo com rolha de borracha. 4. Agitar bem at a perfeita homogeneizao logo aps, retirar com pipeta aspiratria 0,1 mL da suspenso. Pipeta aspiratria ou pipeta automtica.

5. Colocar em lmina, cobrir com lamnula e examinar em pequeno aumento. 6. Contar o nmero total de ovos na lmina. 7. Calcular o nmero de ovos por grama de fezes, multiplicando o valor encontrado por 150 8. Examinar sempre mais de uma lmina e trabalhar com a mdia aritmtica. O resultado encontrado indicado por alguns autores como ovos/rnL OBS. O resultado dever ser corrigido segundo a consistncia das fezes. Fezes formadas, multiplicar o resultado por 1; fezes pastosas por 1,5; e fezes diarricas por 3. Os resultados

conseguidos em material fecal lquido no so confiveis. A agitao recomendada no tem 4 nunca dever ser com movimentos circulares e sim de alto para baixo.

MTODO DE KATO-KATZ

FUNDAMENTO Fundamenta-se na contagem de ovos de helmintos em lmina qps o peneiramento e contato com substncia conservadora.

INDICAO Indicado para avaliao da carga parasitria no diagnstico e controle de cura aps o tratamento. Ex. Schistosoma mansoni. Contar os ovos encontrados em toda a lmina e multiplicar por 23, a fim de ter o nmero de ovo por grama de fezes. OBS.:Apesar de ser recomendado para a pesquisa de helmintos, este mtodo tem sido empregado com mais frequncia na esquistossomose, devido s modificaes que podem ocorrer na morfologia dos ovos de outros parasitas. A funo da glicerina a clarificao da matria fecal, tornando-a transparente e permitindo melhor visualizao dos ovos a presentes. Os ovos de Ascaris e de Trichuris conservam-se bem por semanas ou meses, enquanto os ovos de Ancilostomdeos tm sua visualizao comprometida por este mtodo.

PROCEDIMENTO: 1. Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente. 2. Comprimir a tela metlica ou de nilon sobre as fezes, fazendo com que parte passe

atravs das malhas. 3. Remover as fezes que passam atravs das malhas e transferi-las para o orifcio do carto,

colocado sobre a lmina. 4. Depois de encher o orifcio central, remover com cuidado o carto, deixando as fezes com

a lamnula.

5. Cobrir as fezes com a lamnula de celofane, invertendo e pressionando a lmina sobre o papel absorvente.

6. Deixar a preparao em repouso (clarificao) durante 30 minutos a 34-40C ou temperatura ambiente por 1-2 horas.

7. Examinar a preparao ao microscpio

MTODOS PARA EXAME DOS PARASITOS DO SANGUE O exame microscpico do sangue constitui valioso recurso para o diagnstico das doenas parasitrias cujos agentes apresentam formas evolutivas sanguneas. A preparao de bons esfregaos sanguneos importante na diferenciao de parasitos, principalmente de protozorios.

COLHEITA DE SANGUE O sangue pode ser colhido por puno do lbulo da orelha, da superfcie palmar da ponta de um dedo da mo, no caso de lactentes da superfcie plantar do grande artelho ou no calcanhar. No caso da orelha, a margem livre do lbulo e no a face lateral que deve ser puncionada. A picada deve ser feita com deliberao e lentamente, para no provocar dor. A picada deve ter profundidade de 3mm. No se deve utilizar um local edemaciado ou congestionado. Em animais de laboratrio a colheita de sangue feita segundo o seu porte.

EXAME A FRESCO Uma pequena gota de sangue, examinada entre lmina e lamnula em mdio aumento. Esta nos permite demonstrar de forma rpida microfilrias e Trypanosoma.

EXAME SECO (PREPARAO CORADA) Pode ser realizado em gota espessa e/ou camada delgada ou esfregao.

GOTA ESPESSA Colher 3 a 4 gotas de sangue na lmina e com a ponta de um estilete, desfibrin-la. Deixar secar ao abrigo de corrente de ar quente que podem causar esporos de fungos contaminantes, ou deixar secar em estufa a 37 C. o desfibramento impede a coagulao e consequentemente fendilhamento da preparao, garantindo a necessria aderncia do sangue ao vidro durante a colorao. Realizar desemoglobinizao antes da colorao.

CAMADA DELGADA OU ESTIRAMENTO Colhida a gota de sangue na lmina, imedatamente coloca-se a lmina distensora na posio. Por capilaridade, o sangue espalha prontamente na zona de contato das lminas. Num movimento rpido e contnuo, a lmina distensora deslocada para frente, obtendo-se assim a camada delgada.

COLORAO DA CAMADA DELGADA MTODO DE GIEMSA FUNDAMENTOS Fixao do estiramento pelo metanol e colorao pela soluo de Giemsa.

MTODO DE LEISHMAN

FUNDAMENTOS Fixao e colorao do estiramento pela soluo de azul de metileno e eosina

BIBLIOGRAFIA

NEVES, D. P & Cols. Parasitologia humana. Ed. Atheneu, 11a ed, 2005. REY, L. Bases da Parasitologia Mdica. Ed. Guanabara Koogan, 3a ed, 2010. REY, L. Parasitologia. Ed. Guanabara Koogan, 4a ed, 2008. CIMERMAN, B.; FRANCO, M.A. Atlas de parasitologia. So Paulo: Atheneu, 1999. COURA, J. R. Dinmica das Doenas Infecciosas e Parasitrias. Volumes I e II. Editora Guanabara Koogan. 2005 DE CARLI , G.A.- Parasitologia Clnica. Seleo de Mtodos e tcnicas de Laboratrio para o Diagnstico das Parasitoses Humanas SP. Ed.Atheneu,810pp, 2001

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