ARTIGO ORIGINAL ISSN 2238-1589 A IndUçãO dO RECEPtOR B1 …

RESBCAL, São Paulo, v.1 n.2, p. 145-154, abr./maio/jun. 2012 145

ISSN 2238-1589

RESU

MO

ARTIGO ORIGINAL

1 IntROdUçãO

Organismos aeróbicos são continuamente afetados por espécies reativas de oxigênio (ROS)

derivadas de redução monoeletrônica do oxigê-nio, tal como peróxido de hidrogênio, superóxido e radicais hidroxila1,2,3. ROS também são gerados por enzimas redutoras como NAPDH oxidase que produz superóxido em várias células, incluindo

1 CEDEME, Universidade Federal de São Paulo;

2 Departamento de Parasitologia, Universidade de São Paulo;

3 Departamento de Biofísica, Universidade Federal de São Paulo;

4 Departamento de Nefrologia, Universidade Federal de São Paulo.

Autor para correspondência: Clélia Rejane Antônio BertonciniE-mail: [email protected];

[email protected]

Recebido para publicação: 11/11/2011Aceito para publicação: 16/04/2012

A IndUçãO dO RECEPtOR B1 dE BRAdICInInA é SInALIzAdA POR EStRESSE OxIdAtIvO PROdUzIdO POR PERóxIdO dE hIdROgênIO

EM CéLULAS EndOtELIAIS IMORtALIzAdAS dE CAMUndOngO

Subtítulo: Indução do receptor B1 de bradicinina por h2O2

Aline de Cássia Azevedo1, Michele Longoni Calió1, Tiago Vasques Gualberto1, Daniel Varoni Schneider1, Gui Mi Ko1, Margarete de Lara Capurro2, Edson Lucas dos Santos3, João Bosco Pesquero3,

Oscar Fernando Pavão Santos4, Clélia Rejane Antônio Bertoncini1,*

O receptor B1 de cininas é uma proteína induzível, que mede a vasodilatação em diversos

expressão tem sido apontada como um indicador da gravidade de doenças, por mecanismos que envolvem espécies oxidativos e nitrosativos, perguntamos se a indução do receptor B1

mm de H O

H Océlulas tratadas com 1 mM H O foi similar àquela induzida por LPS, conforme determinado

-

O não causou mudança nos níveis

O

O

Palavras-chave: 1

146 RESBCAL, São Paulo, v.1 n.2, p. 145-154, abr./maio/jun. 2012

A IndUçãO dO RECEPtOR B1 dE BRAdICInInA é SInALIzAdA POR EStRESSE OxIdAtIvO PROdUzIdO POR PERóxIdO dE hIdROgênIO EM CéLULAS EndOtELIAIS IMORtALIzAdAS dE CAMUndOngO

as células endoteliais e células de músculo liso vascular4. O superóxido é particularmente im-portante na homeostase vascular uma vez que a NAPDH oxidase pode ser ativada pela angio-tensina II5, uma molécula bioativa gerada em cascata pelo sistema renina-angiotensina (RAS). Superóxido potencializa os efeitos vasopressores de RAS porque também estimula fatores vaso-constritores4 e inativa o óxido nítrico (NO), um potente vasodilatador. Deste modo, muitos estu-dos demonstraram que tanto a superprodução de ROS ou a baixa biodisponibilidade de NO podem contribuir para disfunção endotelial em modelos animais de hipertensão6,7. Esta disfunção en-dotelial pode ser atribuída, ao menos em parte, pela indução da expressão gênica de moléculas

liso5, adesão celular8 e apoptose9. No entanto, enquanto tem sido claramente demonstrado que a superprodução de superóxido ou seu derivado peróxido de hidrogênio induz a expressão gênica relacionada a danos endoteliais e vasoconstrição, muito pouco se sabe sobre os caminhos supostos para a superação deste desequilíbrio desfavorável entre espécies oxidativas e nitrosativas e suas consequências.

Em células endoteliais, a produção de NO é estimulada pela bradicinina e peptídeos rela-cionados com cininas10,11. Cininas, os efetores principais do sistema calicreína-cinina (KKS), ligam e ativam dois tipos de receptores acoplados a proteína G, cinina B1 e B2, provocando uma ampla gama de efeitos biológicos, muitos deles relacionados com a homeostase cardiovascular12. A maioria dos efeitos das cininas são mediados por bradicinina, via ubiquitinação do receptor B2, mas ambos receptores induzem a liberação de NO, via ativação de cálcio, mediada por iso-enzimas NO sintetase (NOS). Diferentes células produzem NO a partir de arginina e oxigênio por três distintas NOS (neuronal nNOS ou NOS I, induzíveis iNOS ou NOS II e endotelial eNOS ou NOS III). Estudos anteriores usando mode-los de camundongos knockout mostraram que a eNOS é a mais importante na manutenção da função endotelial da pressão arterial normal13. No

entanto, também foi sugerido que a produção de NO por diferentes NOS pode ser determinada por certos co-fatores, tal como heat shock protein 90 (hsp90)14. Em células sob condições de baixos níveis de hsp90, ou pouca interação entre hsp90 e eNOS, estas NOS desacopladas podem produzir superóxido15,16.

O receptor de cinina B1 distingue-se do recep-tor B2 por ser altamente indutível. Geralmente inexiste sob condições normais, mas pode ser induzido ou ativado em condições patológicas,

e estresse10,11. Em muitos trabalhos, a indução de receptores B1 é apontada como um indicador de gravidade da doença, podendo ser considerado um biomarcador de vasodilatação, a qual é muitas vezes irreversível. Por exemplo, a hiperalgesia e a profunda vasodilatação, observadas em modelos experimentais de choque séptico, podem ser pelo menos em parte elucidadas devido à interacção do receptor B1 com o seu agonista Des-Arg9--Bradicinina (DBK) na vasculatura17,18. Foi su-gerido que o receptor B1 desempenha um papel essencial na resposta de defesa do hospedeiro à lesão isquêmica, estimulando a sobrevivência e proliferação da célula endotelial, contribuindo assim para a neovascularização e a cicatrização tecidual10.

O presente estudo testa a hipótese de que o re-ceptor B1 pode ser induzido por H2O2 em células endoteliais de camundongo, usando a técnica RT--PCR e ensaios de Cytosensor microphysiometry, o qual é capaz de medir a taxa na qual as células

ligante-receptor19,20,21. Ao medir a resposta de aci-

interacção do receptor B1 em células tratadas com H2O2. A indução do receptor de cinina B1 parece ser criticamente dependente do fator de trans-crição NF- B22, bem conhecido como ativador da expressão gênica em resposta ao aumento de estresse oxidativo23. Embora o superóxido parece ser a espécie mais importante de ROS na disfun-ção endotelial, é espontaneamente catalisado ou rapidamente convertido em H2O2 por dismutases superóxido dismutase.


Aline de Cássia Azevedo, Michele Longoni Calió, tiago vasques gualberto, daniel varoni Schneider, gui Mi Ko, Margarete de Lara Capurro, Edson Lucas dos Santos, João Bosco Pesquero, Oscar Fernando Pavão Santos, Clélia Rejane Antônio Bertoncini

2 MAtERIAL E MétOdOS

2.1 Células

Culturas de células endoteliais imortalizadas SV40 de linfonodos de camundongos, SVEC4--10E2 de ATTC24 foram cultivadas em meio F12 (Sigma) suplementado com 5% de soro fetal bo-vino (v/v), 472 U de penicilina/mL e 94 µg/mL de estreptomicina. As células foram incubadas em

foram realizados com aproximadamente 5 x 105

células expostas por 30 minutos em 0,1 – 1,5 mM de peróxido de hidrogênio em PBSA1 ou na presença de 10 µg/mL de lipopolysacharide (LPS) por 3h em meio F1222. As células controle e as LPS tratadas foram mantidas em meio sem soro durante os experimentos, baseados em resultados que mostram que o soro no meio induz a expres-são do receptor B122. O tratamento com LPS foi considerado o controle positivo para a indução de B1, como previamente mostrado17,22

tratamentos, as células foram lavadas com PBSA e mantidas ou não por mais 3h em meio de cultura

os efeitos máximos ao tratamento antioxidante8. Os ensaios preliminares avaliando os efeitos do tratamento com H2O2 em células musculares de camundongos não produziram nenhuma mudança

-to as células SVEC4-10E2 mostraram-se muito sensíveis. Portanto, esta última linhagem celular foi selecionada para prosseguir com os experimen-tos descritos no presente estudo.

2.2 Análise por Rt-PCR

As imagens da expressão de mRNA do recep-

avaliadas por transcrição reversa semi-quantitativa da reação em cadeia de polimerase (RT-PCR). O RNA total das células de camundongos foi extra-ído usando o reagente Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de RNA foi determi-

nada por medidas de densidade ópticas a 260 nm usando um biofotômetro (Eppendorff, Hamburg, Germany) e sua pureza foi avaliada por A260/A280

das bandas de 18S e 28S após eletroforese de 1 µg de RNA em gel de agarose corado com brometo de etídio. A análise de RT-PCR foi feita com um volume de 20 µL total contendo 800 ng de RNA total, 400 nmol de primers reverse and forward, e outros reagentes necessários fornecidos no kit Master RT plus PCR (Eppendorf). Foi usado o seguinte protocolo de ciclos para reação: 4 min

45 s

(PTC-200 Thermocycler, MJ Research, Waterto-wn, MA, USA). Os primers foram sintetizados pela Invitrogen e desenhados de acordo com a sequência de DNA do receptor de cinina B119 e com a sequência p-22phox NADPH oxidase25,26,27. A Tabela 1 mostra em detalhes as sequências de primers e o tamanho esperado dos produtos de PCR. Os produtos resultantes do PCR foram corridos em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio, e as bandas foram capturadas sob iluminação UV pelo Video Documentation System (Pharmacia).

O PCR quantitativo foi feito usando Syber Green e termociclador 7500 Fast Real-Time PCR System with DellTM Tower (Applied Biosystems). Os dados coletados foram analisados baseados em estudos previamente descritos28.

2.3 Medidas de acidificação extracelular

A metodologia utilizada para determinar o acoplamento funcional do receptor B1 de cini-na foi similar à previamente descrita19. Células SVEC4-10E2 foram removidas da placa de cultura com tripsina e plaqueadas em cápsulas estéreis na densidade de 3 x 105células por cápsula. As cápsu-las montadas foram transferidas para uma câmara contendo 1 mL de meio F12 (sem bicarbonato e soro, contendo 2 mM de glutamina e 44 nM de NaCl adicionais para ajustar a osmolaridade). Os sensores foram colocados no Cytosensor micro-physiometer (Molecular Devices) e equilibrados



por mais de 30 min antes dos experimentos co-meçarem, quando o patamar base era constante e mantido perto de zero. O meio foi introduzido atra-

as células foram inicialmente estimuladas com agonistas e antagonistas, em diferentes concen-trações, para cada receptor B1 e B2. A integridade das células foi avaliada adicionando o agonista bradicinina (BK) e o antagonista icatibant para o receptor B2. Os efeitos dos agonistas tanto de B1 como B2 foram bloqueados pelos antagonistas

icatibant respectivamente (dados não mostrados). Os dados apresentados foram obtidos em células estimuladas ao longo de um período de 40 se-gundos com 10-6 M Des-Arg9-BK (agonista do receptor para cininas B1).

2.4 Análise estatística

Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (SEM). A análise estatística foi realizada por ANOVA seguido por Newman-Keuls

para testes de comparações múltiplas. Um valor

3 RESULtAdOS

3.1 Indução do receptor B1 em células expostas ao tratamento com h2O2 e LPS

Para estabelecer as condições de indução de B1, inicialmente tratamos as culturas de células endoteliais imortalizadas SVEC4-10E2 com 1mM H2O2 durante 30 min e 10 g/mL de LPS duran-te 3 horas. A detecção das bandas de mRNA do

realizada por RT-PCR semiquantitativo. A imagem

células tratadas com H2O2 e LPS em contraste com as bandas pouco detectáveis das células controle. Interessantemente, o receptor B1 foi encontrado

com H2O2 (Figure 1, última linha).

Tabela 1. primers

Gene GenBank accession nos. Primer sequences

Size of PCR products

(bp)Bradykinin B1 receptor

*Estes primers



A funcionalidade dos receptores B1 nas cé-lulas endoteliais tratadas com 1mM de H2O2 foi

-tracelular induzida pelo acoplamento funcional do

--bradicinina foi observado (Figura 2). O nível da

-6

M de DBK determinada em células tratadas com 1 mM de H2O2 foi similar aquele observado em

foi observada nas células controle.

3.2 Resposta dose dependente de h2O2 e expressão do receptor de cinina B1

A indução de expressão do receptor B1 em culturas de células endoteliais SVEC4-10E2 foi

(Figura 3). O aumento na indução foi máximo de-pois de 0,5 mM de H2O2. A exposição das células

-mente a resposta. Esses resultados sugerem que a indução dos receptores B1 pode constituir um sensor para acúmulo de H2O2, permitindo uma

ROS gerados em condições patológicas.

3.3 Expressão de hsp90 e subunidade p22phox de nAdPh oxidase

Em uma tentativa de investigar com mais deta-

de condições elevadas de H2O2, avaliamos a ex-pressão de NADPH oxidase e hsp90, o que poderia

Figure 1. Detecção por RT-PCR do receptor B1

ou 1 mM de H O

de exposição a H O

Figure 2. por acoplamento funcional do receptor B1 com o agonista de bradicinina Des-Arg9-A (DBK).

O em



estar associado com a indução do receptor B1, quer por mediação por superóxido ou por produção de NO, respectivamente, nestas células endoteliais submetidas a estresse oxidativo. A Figura 4 mostra

mRNA da subunidade p22phox de NADPH oxidase foi encontrada entre as células não estimuladas ou tratados com 0,1-1,5 mM de H2O2. Inversamente, H2O2 conduz a uma inesperada diminuição de regulação de hsp90 (Figura 4, painéis B e C).

3 dISCUSSãO

Consideramos inicialmente a linhagem de células-10E2 SVEC4 apropriada para este estudo,

principalmente tendo em conta as suas proprieda-des para manter as características funcionais de células endoteliais normais24. Além disso, também consideramos sua sensibilidade à indução do re-ceptor B1 por H2O2, a facilidade de manipulação e capacidade para suportar condições adversas de tratamentos oxidantes. A expressão de dois outros genes envolvidos no estresse oxidativo e disfunção endotelial, NADPH oxidase e hsp90, também foi

Figure 3. Resposta da indução do receptor B1 em células tratadas com H2O2.

mM de H O

Figura 4. Efeito de H2O2 na subunidade p22phox de NADPH oxidase e expressão de mRNA hsp90 em células endoteliais.

O



avaliada em nosso estudo. Ambos são conheci-

oxidativas e nitrosativas na vasculatura. NADPH oxidase é uma fonte de radicais superóxido vaso-constritora4,6, e hsp90 é um co-factor crítico para a funcionalidade apropriada de eNOS uma vez que a sua atenuação pode causar que NOS produza superóxido ao invés de NO15,16,32. Com base nos resultados obtidos, não mostrando qualquer altera-ção nos níveis de mRNA da subunidade p22phox de NADPH oxidase e uma diminuição na regulação de hsp90 (Figura 4, painéis B e C), pode-se sugerir que o aumento virtual de produção de superóxido por eNOS desacoplada, pode também contribuir para a indução do receptor B1, especialmente em células sujeitas H2O2 em doses acima de 0,1 mM. No entanto, o nível de expressão relativamente mais elevado de hsp90 em células controle não é tão surpreendente porque a linhagem de células endoteliais, SVEC4-10E2, foi derivada de nódulos linfáticos de camundongos24, e células tumorais frequentemente superexpressam hsp90, como foi recentemente descrito9,32.

A atenuação da expressão de hsp90 por H2O2 pode ser esclarecida correlacionando este resulta-do com o papel já conhecido de ROS na apoptose celular9,23,31. Apesar de não prosseguirmos com uma investigação sobre a apoptose neste estudo, é bem conhecido que hsp90 tem diversas funções em células de mamíferos14,32. Em adição a inte-racção com eNOS, a chaperona hsp90 liga-se a muitas outras proteínas, como as de sobrevivência e ciclinas-cinases dependentes, que estão envol-vidas nas vias de transdução que regulam o ciclo celular, a sobrevivência e a morte celular. Além disso, a sua função e expressão são em grande parte dependente dos componentes de diferentes compartimentos celulares, incluindo cavéolas14, onde interage com receptores de cininas12,33. As-sim, a baixa regulação da hsp90 em consequência do aumento de H2O2 pode estar associada com os mecanismos de sobrevivência das células subme-

tidas a dano oxidativo severo, especialmente em concentrações mais elevadas de H2O2.

Em resumo, demonstramos que o receptor B1 pode ser induzido por condições pró-oxidantes produzidas por H2O2 em células endoteliais. Sob as mesmas condições, nenhuma mudança na ex-pressão de NADPH oxidase foi observada, mas

o aumento de H2O2. Uma vez que mau funcio-namento da hsp90 está associado com a geração de superóxido por eNOS, a atenuação dos níveis de hsp90 possivelmente potencializa a indução do receptor B1 por H2O2 na linhagem de células utilizadas neste estudo.

Portanto, estes resultados sugerem que a indução do receptor B1 pode ser um sensor de um desequilíbrio entre espécies vasoconstritoras oxidativas e espécies vasodilatadoras nitrosativas,

-tresse oxidativo em muitas condições patológicas. Outros estudos irão avaliar a expressão do recep-tor B1 em modelos mais complexos de estresse oxidativo associados à disfunção endotelial, como alguns animais hipertensos, bem como receptores de cininas e camundongos knockout NOS. Além disso, enquanto que o receptor B1 tem sido um

este receptor deve ser também considerado no de-senvolvimento de agentes vasculares reguladores da homeostase.

AgRAdECIMEntOS

Somos gratos a Darci Souza Marinho por um excelente suporte técnico e ao Dr. Michel Rabino-vitch pelas úteis sugestões no manuscrito. A.C.A e

Estado de São Paulo. Este trabalho foi suportado por concessões do FAPESP (02/06857-6).



IndUCtIOn OF thE BRAdyKInIn B1 RECEPtOR IS tRIggEREd By OxIdAtIvE StRESS PROdUCEd By hydROgEn PEROxIdE In

IMMORtALIzEd EndOthELIAL MOUSE CELLS

Subtitle: Induction of the bradykinin B1 receptor by h2O2 in cells

1

1

H OH O 1

1 receptor in 1mM H O –treated cells was similar

in response to B1-

1Increasing H O -

B1 O

1 O

Keywords: Bradykinin B1

ABStRACt

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