AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE CELULAR EM HUMANOS INDUZIDA...
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA AMANDA GUIMARÃES MORAES CAMARGO AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE CELULAR EM HUMANOS INDUZIDA POR N-(FOSFONOMETIL)GLICINA E DEMAIS COMPONENTES DA FORMULAÇÃO DE USO COMERCIAL Lorena 2018
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA
AMANDA GUIMARÃES MORAES CAMARGO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE CELULAR EM HUMANOS
INDUZIDA POR N-(FOSFONOMETIL)GLICINA E DEMAIS
COMPONENTES DA FORMULAÇÃO DE USO COMERCIAL
Lorena
2018
AMANDA GUIMARÃES MORAES CAMARGO
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE CELULAR EM HUMANOS INDUZIDA POR N-(FOSFONOMETIL)GLICINA E DEMAIS
COMPONENTES DA FORMULAÇÃO DE USO COMERCIAL
Trabalho de conclusão de curso
apresentado à Escola de
Engenharia de Lorena da
Universidade de São Paulo como
requisito final para conclusão da
Graduação do curso de
Engenharia Ambiental.
Orientador: Prof. Dr Morun Bernardino Neto.
Lorena
2018
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Automatizado da Escola de
Engenharia de Lorena, com os dados fornecidos pelo(a)
autor(a)
Camargo, Amanda Guimarães Moraes
A / Amanda Guimarães Moraes Camargo; orientador Morun
Bernardino Neto. - Lorena, 2018.
55 p.
Monografia apresentada como requisito parcial para a
conclusão de Graduação do Curso de Engenharia Ambiental -
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de São Paulo.
2018
1. Glifosato. 2. Toxicidade. 3. Herbicidas. 4. Saúde pública. I. Título. II. Neto, Morun Bernardino, orient.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por estar sempre presente nos momentos abençoando e
direcionando o melhor para minha vida.
Aos meus pais, Nelson e Mônica, por me ensinarem a correr atrás dos meus
sonhos e objetivos, por todo o suporte necessário para que eu pudesse realizar a
faculdade e me dedicar integralmente aos estudos.
Aos meus irmãos, Rodrigo e Rafaella, por serem referências pra mim.
Ao meu namorado Guilherme, por toda paciência e apoio emocional.
Ao meu orientador Prof Dr. Morun, pela paciência, pela dedicação, pela
confiança no meu trabalho.
Aos meus colegas do trabalho da UNESP, por me ajudarem a desenvolver
a pesquisa, por todas as discussões científicas.
À minha orientadora de Iniciação Científica, Gretta, e à minha amiga de
estágio, Kely, pela confiança, pelos aprendizados.
Agradecimento ao apoio dado pela Secretaria Municipal de Saúde da
Prefeitura de Lorena, que disponibilizou as amostras de material biológico.
RESUMO A toxicidade celular proveniente de pesticidas utilizados na agricultura
brasileira é um indicador de grande importância para a saúde do indivíduo e à saúde
pública. Por meio da avaliação da citotoxicidade de eritrócitos é possível inferir o
potencial de causar danos e de quebra da homeostase que um determinado
toxicante apresenta. Diversos pesticidas já proibidos em outros países por levarem
sérios danos ao meio ambiente e aos seres humanos, continuam liberados no
Brasil. Nesse contexto, destaca-se o glifosato (N-fosfonometil-glicina) o mais
vendido no país e um dos campeões de vendas no mundo. Por apresentar DL50
considerado baixo, o glifosato é tido como pouco tóxico e seguro quando usado
dentro da recomendação. No entanto os efeitos tóxicos produzidos por uma
formulação comercial vão além do componente ativo sendo que estabilizantes,
dispersantes e conservantes não são totalmente livres de ação tóxica. Este trabalho
visou avaliar a toxicidade celular em eritrócitos humanos induzida pelo glifosato e
demais componentes da formulação de uso comercial. Para tal, o comportamento
da fragilidade osmótica de eritrócitos na presença e ausência do toxicante foi
avaliado graficamente por meio da dependência de lise celular em função da
osmolaridade do meio. Os gráficos obtidos foram ajustados a uma sigmoide de
Boltzmann. Esse trabalho obteve uma correlação forte, inversa e significativa do
aumento da concentração da Hemoglobina com a diminuição da estabilidade
eritrocitária.
Palavras-chave: herbicidas, toxicidade, glifosato, saúde pública.
Sumário
1 INTRODUÇÃO .................................................................................... 9
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................. 11
2.1 Regularização ................................................................................ 16
2.2 Toxicologia ..................................................................................... 18
2.2.1 Toxicologia em crianças ........................................................... 19
2.3 Formulação .................................................................................... 20
2.4 Glifosato ......................................................................................... 21
2.4.1 Indenização .............................................................................. 25
2.5 MECANISMO DE AÇÃO ................................................................ 25
2.5.1 Em Vegetais ............................................................................. 25
2.5.2 Em Animais .............................................................................. 25
2.6 FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA (FOE) .................... 26
2.6.1 Estrutura da Membrana Plasmática ......................................... 26
2.6.2 Eritrócitos (células vermelhas) ................................................. 27
2.6.3 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária ................................ 28
3 OBJETIVOS ...................................................................................... 30
3.1 Objetivo geral ................................................................................. 30
3.2 Objetivos específicos ..................................................................... 30
4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................. 31
4.1 Considerações éticas ..................................................................... 31
4.2 Amostras de material biológico ...................................................... 31
4.3 Reagentes ...................................................................................... 32
4.4 Determinação da estabilidade de eritrócitos humanos na presença
de glifosato 32
4.5 Determinação das curvas de transição de hemólise ...................... 34
4.5.1 Determinação da concentração de glifosato ............................ 35
4.6 Determinação de variáveis bioquímicas e hematológicas .............. 36
4.7 Análise estatística dos dados experimentais .................................. 37
5 RESULTADOS .................................................................................. 38
5.1 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) ........................... 38
5.2 Análise descritiva exploratória ........................................................ 41
5.3 Teste de normalidade exploratória Shapiro Wilk ............................ 43
5.4 Teste de comparação de dois grupos de Wilcoxon ........................ 45
5.5 Matriz de correlações Teste de Spearman ..................................... 47
6 DISCUSSÃO ..................................................................................... 48
7 Considerações finais ......................................................................... 50
8 Agradecimento .................................................................................. 50
REFERÊNCIAS .......................................................................................... 51
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Evolução da área plantada em milhões de hectares de arroz, feijão,
cana de açúcar, soja e mandioca por ano. ........................................................... 13
Figura 2 : Os 10 ingredientes ativos mais vendidos. .................................. 22
Figura 3 - vendas de glifosato por ano ....................................................... 23
Figura 4: Partes típicas de uma molécula fosfolipídica representada em (a)
esquematicamente e em (b) por meio de fórmula estrutural condensada. ........... 27
Figura 5: Gráfico de osmose e ilustração de osmose em eritrócitos .......... 29
Figura 6: Amostras de material biológico.................................................... 32
Figura 7:Bancada Experimental. ................................................................ 33
Figura 8: (a) Banho termostatizado a 37,5 ˚C; (b) Adição de 20 µL de sangue
em todos os tubos. ................................................................................................ 33
Figura 9: Tubos eppendorfs com adição de sangue: (a) antes do banho
termostatizado; (b) após o banho termostatizado. ................................................ 33
Figura 10: Centrifuga com capacidade máxima de 16 tubos: (a) Vista
superior; (b) Equipamento aberto .......................................................................... 34
Figura 11: Leitura de sobrenadante no espectrofotômetro: (a) Leitura da
absorbância em 540nm; (b) Cubeta e tubo de eppendorfs de uma amostra com lise;
(c) Cubeta e tubo eppendorf de uma amostra sem lise. ....................................... 34
Figura 12: Glifosato e palavras chave. ....................................................... 50
8
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Curva típica de dependência de lise eritrocitária em função da
concentração de NaCl. .......................................................................................... 35
Gráfico 2: Curva de fragilidade eritrocitária induzida pela variação da
concentração de Roundup e concentração de NaCl constante em 0,9 g/dL. ....... 36
Gráfico 3:Curva de hemólise das dez amostras analisadas: (a) sem a
presença de glifosato; (b) com glifosato. ............................................................... 38
Gráfico 4:Curva de hemólise das três amostras analisadas com melhores
ajustes de correlação (0,98; 0,99; 0,99): (a) sem a presença de glifosato; (b) com
glifosato. ................................................................................................................ 39
Gráfico 5:Testes de comparação de dois grupos (com e sem caotrópico) de
Wilcoxon: (a)teste de Wilcoxon para dx com e sem herbicida; (b) Teste Wilcoxon
H50 com e sem herbicida ..................................................................................... 46
9
1 INTRODUÇÃO
O uso de pesticidas na agricultura brasileira faz parte de um problema de
saúde pública, devido sua toxicidade ao meio ambiente e ao homem. Os pesticidas,
também conhecidos como agrotóxicos, defensivos agrícolas ou defensivos
fitossanitários, têm como objetivo eliminar, prevenir ou mitigar pragas por meio de
seus componentes ativos, entretanto as substâncias consideradas inertes e que
fazem parte de sua formulação como estabilizantes, dispersantes e conservantes
não são totalmente livres de ação tóxica. A determinação dos limites de segurança
para uso dos pesticidas deve considerar os efeitos agudos e crônicos à saúde
humana não apenas dos componentes ativos, mas também dos demais
componentes das fórmulas comercializadas.
Diversos pesticidas já proibidos em outros países por levarem a importantes
danos ao meio ambiente e aos seres humanos, continuam liberados no Brasil.
Algumas empresas multinacionais, que não vendem tais produtos nos seus países
de origem, os comercializam no Brasil por serem liberados. Existem mais de 400
ingredientes ativos de pesticidas registrados no Brasil, sendo que alguns tiveram
seu registro aprovado há décadas. Ademais, para o registro ser obtido apenas os
efeitos tóxicos do princípio ativo isolado são considerados, o que não é factual pois
a formulação comercial apresenta muitos outros compostos que, agindo
simultaneamente, podem produzir efeitos sinérgicos, aditivos ou antagônicos.
Considerando ainda que a mesma cultura costuma utilizar mais de um insumo
agrícola, esses efeitos de interação entre as formulações, ficam potencializados.
No período de 2007 a 2014 foram contabilizados no Ministério da Saúde 25
mil casos de intoxicação por pesticidas, cabe ressaltar que é estimado que para
cada caso de intoxicação notificado outros 50 não são notificados, segundo a
Organização Mundial de Saúde. No mesmo período foram contabilizados 1186
óbitos provenientes de intoxicação por pesticidas de uso agrícola.
Conceito importante quando se trata de intoxicação por pesticidas é o LMR
(Limite Máximo de Resíduos), definido como a quantidade máxima de resíduo de
agrotóxico permitida em alimentos. Os LMRs brasileiros são maiores que o da
União Europeia. Na plantação de soja, por exemplo, o LMR brasileiro é duzentas
vezes maior que o limite europeu.
10
O Brasil está entre os maiores consumidores mundiais de pesticidas e o
glifosato (N-(fosfonometil)glicina) é um dos campeões de venda. A população tem
convivido passivamente com a situação de insegurança alimentar por preocupar-
se mais com a aparência dos alimentos do que com a presença de resíduos tóxicos
neles. Destarte, é de interesse da saúde pública e políticas públicas
governamentais que a toxicologia descritiva dos efeitos adversos celulares de todos
os componentes das formulações comerciais desse produto sejam bem
conhecidos. Os grupos mais suscetíveis a esses efeitos são trabalhadores,
crianças, gestantes, lactentes e idosos. Esse trabalho objetiva contribuir com a
avaliação da toxicologia descritiva dos efeitos adversos celulares do glifosato e
demais componentes de sua formulação comercial em sujeitos de 1 a 15 anos.
11
2 REVISÃO DE LITERATURA
A transição da agricultura para agronegócio ocorreu a partir de 1950, quando
os agricultores receberam financiamentos do governo e de empresas
multinacionais. Essa transição ocasionou uma mudança na forma de produção,
pois até então era um modelo diversificado (ANDRIOLI, 2016).
Em 1970, ano em que o governo lançou o Plano Nacional de Defensivos
Agrícolas (PNDA) e a Criação da Indústria Brasileira de Defensivos, ocorreu um
incentivo ao uso de pesticidas por meio de crédito rural, dando início a uma era de
desenvolvimento tecno-científico/químico-dependente (BRASIL, 2016). Nesse
cenário, o governo também reduziu 60% do Imposto relativo à circulação de
mercadorias - ICMS, de acordo com a cláusula primeira do Convênio 100/1997, do
Conselho Nacional de Política Fazendária – Confaz (FEDERAL, 2018), isenção
total do PIS/PASESP (Programa de Integração Social/Programa de Formação do
Patrimônio do Servidor Público) e da Cofins (Contribuições para a Seguridade
Social), de acordo com o Decreto Federal nº 5630/05 e isenção total do IPI (Imposto
sobre Produtos Industrializados) ao comércio e à produção de pesticidas,
estabelecida pelo Decreto 7.660/2011.
O interesse do governo era focar em poucas matérias primas para
exportação a fim de obter divisas para o país e abastecer o mercado interno com
produtos importados. A mecanização da produção na agricultura disseminou uma
mentalidade capitalista-industrial nas áreas rurais. Nesse momento da história
acontece a mudança de uma produção coletiva sem fins lucrativos, para a
concentração e centralização da produção com fins lucrativos. (ANDRIOLI, 2016)
Em 1995, foi instituído o Programa Nacional de Fortalecimento da Agricultura
Familiar (Pronaf) por meio da Resolução 2.141 (24/08/95), destinado ao apoio
financeiro às atividades agropecuárias exploradas mediante emprego direto da
força de trabalho do produtor e de sua família. Entretanto esse apoio está vinculado
à aquisição de pesticidas na agricultura familiar. (CARNEIRO et al., 2015 e BRASIL,
MDA 2015).
Embora vários nomes sejam dados aos insumos agrícolas, somente o termo
agrotóxico é reconhecido legalmente no Brasil. A lei nº 7.802/1989 define
agrotóxico como:
12
Produtos ou agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento. (BRASIL, 1989)
O modelo do capital para a agricultura é o agronegócio, que é a relação
intrínseca entre capital financeiro internacional (bancos), as empresas
transnacionais e os latifundiários. Somados aos meios de comunicação de massa
que tem a finalidade de propagar os “falsos positivos” do agronegócio. Esse modelo
é formado pela produção intensiva de monocultivos. Para que essa produção seja
possível, são utilizados pesticidas de forma intensiva, máquinas pesadas,
comprometendo o solo, corpos hídricos e a biodiversidade. (CARNEIRO et al.,
2015). Esse processo teve amplo respaldo dos governos na ditadura civil militar
brasileira e ganhou mais força pós 1990 na dinâmica de privatização dos
organismos governamentais. Garantindo um Estado máximo para o capital e
mínimo para o povo (CARNEIRO, 2012).
A arrecadação com a venda de pesticidas aumentou de 2 para 7 bilhões de
dólares americanos entre 2001 e 2008, chegando a 8,5 bilhões, em 2011. Em 2009,
o Brasil obteve a posição de maior consumidor mundial de pesticidas (INCA, 2015).
O interesse econômico é notado em âmbitos do Legislativo, Judiciário, Executivo,
da pesquisa e da mídia em detrimento da saúde púbica, o que corresponde a uma
lógica primário-exportadora característica do país (PELAEZ et al., 2015).
Atualmente, está em tramitação na câmara o Projeto de Lei 3200/2015(“PL
3200/2015”, 2015), do deputado Covatti Filho (PP-RS), com a finalidade de revogar
as Leis nº 7.802, de 1989 e nº .974, de 2000. Esse PL desconsidera os critérios de
classificação toxicológica de defensivos fitossanitários do Sistema Globalmente
Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS), que foi
adotado pela Organização das Nações Unidas, em 2002.(PAN, 2012). Outra PL
com esse mesmo objetivo, de autoria do senador Blairo Maggi (SPART-MT), é a
PL nº6.299/12 justificada pela dificuldade de colocar novos produtos no mercado,
a proposta é revogar o Art. 3º e 9º da lei nº7.802/89. Concomitantemente, está em
tramitação no Congresso Nacional a PL nº6.670/16 (BRASIL. CÂMARA DOS
13
DEPUTADOS, 2016), porém de autoria da Comissão de Legislação Participativa,
para instituir a Política Nacional de Redução de Agrotóxicos (PNARA). Ou seja, dois
projetos de lei de autoria de políticos visam facilitar o uso dos pesticidas, defensivos
fitossanitários, ao passo que o projeto de lei de autoria da comissão de legislação
participativa quer instituir uma política nacional de redução dos pesticidas. Essa
contraposição deixa clara a luta política entre interesse econômico e a saúde
pública.
A criação de organismos geneticamente modificados surgiu como um elo
essencial na conformação de grandes conglomerados transnacionais e na
consolidação da cadeia de dependência química na agricultura industrial, no caso
do Brasil o maior exemplo é a soja transgênica que aumentou exponencialmente
as áreas plantadas, conforme apresentado na Figura 1. A soja transgênica é
adaptada para sobreviver em diversos ambientes e ser resistente ao herbicida à
base de glifosato. Por isso, a relação entre produção de transgênicos e venda de
pesticidas são diretamente proporcionais.
Figura 1: Evolução da área plantada em milhões de hectares de arroz, feijão, cana de açúcar, soja e mandioca por ano.
Fonte: IBGE – Pesquisa Agrícola Municipal, 2007 – 2017.
20072008
20092010
20112012
20132014
20152016
20170
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
AR
EA
(m
i h
a)
ARROZ
FEIJAO
CANA
SOJA
MANDIOCA
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A intenção do agronegócio no Brasil não é alimentar a população, nota-se
que os alimentos essenciais não tiveram aumento na área de plantação nos últimos
anos, pelo contrário acontece um declínio na área plantada de alimentos base
(feijão, arroz, mandioca) ao passo que aumenta a área da plantação de soja.
Atualmente, no Brasil, mais de 96% da soja, mais de 88% do milho e mais de 78%
do algodão são transgênicos, e majoritariamente resistentes ao glifosato (Fábio,
2017). Essa diminuição da área de produção de alimentos tem como
consequências desde a elevação de preço dos alimentos até a perda da soberania
alimentar, colocando em risco o objetivo governamental de combater a miséria e a
fome (CARNEIRO et al., 2015).
Por isso, é comum que, as empresas que produzem sementes transgênicas
também produzam os pesticidas, tornando-as com grande poder sobre a economia,
política e o Estado, afetando a bioética e a soberania alimentar pela articulação de
seus biopoderes e biopolíticas (ERNANI et al., 2012). A inserção de organismos
geneticamente modificados (OGM) ou transgênicos na agricultura é uma ameaça à
diversidade biológica, pode proporcionar deslocamento ou eliminação de espécies
não domesticadas, exposição de espécies a novos patógenos ou agentes tóxicos,
a geração de plantas daninhas ou pragas resistentes, a poluição genética, a erosão
da diversidade genética e a interrupção da reciclagem de nutrientes e energia.
Motivo pelo qual anteriormente à autorização do cultivo de OGM’s deveria ter sido
realizado um estudo de avaliação de risco de efeitos diretos e indiretos na
agricultura, ecologia e socioeconomia. (NODARI, RO; GUERRA, 2001)
A estratégia de indústrias de pesticidas gera conflito de interesses, pois por
motivação financeira, abre portas para a violação de direitos da cidadania, em
detrimento da saúde e do bem-estar social. (CARNEIRO et al., 2015) Os incentivos
fiscais são conhecidos como extrafiscalidade. A extrafiscalidade pode ocorrer de
maneira positiva como é o caso de cigarros e bebidas que tem taxas maiores para
desestimular o consumo por meio do aumento do preço, como também de maneira
negativa porque ocorre a diminuição na arrecadação. (MELO; PATR, 2016)
Entretanto, acredita-se que esse incentivo para práticas protetivas evita a poluição
e degradação ambiental, compensando a extrafiscalidade. (CAVALCANTE;
PACOBAHYBA, 1988)
15
A extrafiscalidade no caso dos pesticidas é realizada de maneira
inconstitucional, do ponto de vista ético e socioambiental, pois um comércio danoso
ao meio ambiente está sendo estimulado. (MARA; MACEDO; PACOBAHYBA,
2011). A constituição federal brasileira de 1988 em seu artigo 225 diz:
Todos têm direito ao meio ambiente ecologicamente equilibrado, bem de uso comum do povo e essencial à sadia qualidade de vida, impondo-se ao Poder Público e à coletividade o dever de defendê-lo e preservá-lo para as presentes e futuras gerações. (BRASIL, 1988)
Não existe comissão ou grupo de trabalho, na estrutura do Confaz, que trate
de questões ambientais e que avaliem o impacto da adoção de isenções fiscais
(MARA; MACEDO; PACOBAHYBA, 2011). Não há como garantir um meio
ambiente ecologicamente equilibrado, defendido e preservado para as futuras
gerações nesse modo de produção agrícola, pois nesse modo há contaminação
das águas, do ar, da chuva, dos alimentos, do leite materno, do sangue, da urina
dos humanos e de outros animais (CARNEIRO et al., 2015). O Estado é ineficaz
para monitorar e controlar os danos à saúde e ao meio ambiente proveniente dos
pesticidas.(CARNEIRO et al., 2012)
Os grupos desfavorecidos (em função de sua classe, gênero, grupo étnico)
sofrem um processo de vulnerabilidade populacional. Esse processo não se refere
apenas aos grupos de maior exposição, mas das dificuldades que tais grupos têm
de reconhecer, tornar público e enfrentar os riscos, influenciando os processos
decisórios que os afetam (Porto, 2007). Os grupos desfavorecidos se tornam
invisíveis, por determinação e comodidade de quem está no poder (OLIVEIRA,
2014).
O padrão de exploração dos recursos naturais e do trabalho humano na
economia do agronegócio sugere uma dupla superexploração, na primeira década
do século XXI. A primeira é a violação sistemática da norma ambiental florestal,
comprovada pelo IBAMA, exigida sobre limites da área de reserva legal (florestal)
e áreas de preservação permanente (mata ciliar, topos e encostas de morros)
ocasionando com frequência a prorrogação de prazos de punição previstos em lei
(Código Florestal). A segunda superexploração relacionada com a exploração dos
recursos naturais estão o aumento físico de queimadas e desmatamentos,
corroborando com o aumento da emissão de dióxido de carbono na atmosfera, e a
16
intensificação do uso de pesticidas, com fortes evidências de vários tipos de
contaminação. Se forem somados os efeitos da emissão de dióxido de carbono, da
redução da biodiversidade e da expansão acelerada do uso dos pesticidas, obtém-
se um potencial de morbidades, ambiental e humana, que não são calculadas,
porém provocam custos sociais (CARNEIRO, 2012).
A carta abaixo foi elaborada pelos participantes do III Encontro Nacional de
Agroecologia relata a necessidade de mudança na política com relação ao uso dos
pesticidas:
O escandaloso aumento do uso de agrotóxicos, relacionado também com a liberação de sementes transgênicas, aparece nos alimentos, na contaminação de animais e plantas, solos, ar e das fontes e mananciais de água que servem de consumo humano. (...) Além de ser uma questão de saúde pública e de segurança nacional, os agrotóxicos ameaçam a vida no planeta. Por essa razão reafirmamos que não existe uso seguro de agrotóxicos. É necessário combater a ideia da existência de níveis aceitáveis de contaminação dos alimentos, da água e do corpo dos trabalhadores e trabalhadoras. Queremos o imediato fim da pulverização área e o banimento dos agrotóxicos proibidos em outros países. Exigimos o fim da isenção fiscal aos agrotóxicos e a destinação dos recursos arrecadados para o fortalecimento da agroecologia e a recuperação de ecossistemas degradados. Não aceitamos o relaxamento da legislação e tampouco o desmonte das instituições de regulação e controle dos agrotóxicos. São obrigações da Anvisa e do Ibama proteger a saúde da população e do ambiente. (...) Isso implica brecar a expansão do agronegócio sobre os territórios da agricultura familiar, camponesa, indígena e quilombola, bem como a demarcação de zonas livres de agrotóxicos e transgênicos (ANA, 2014, p.21).
2.1 Regularização
O glifosato é regularizado pelas seguintes portarias/resoluções: Portaria
nº10/85 (DOU14/03/85), Portaria nº 71/90 (DOU28/02/91), Autorização
DOU17/12/91, Portaria nº10/92 (DOU24/01/92), Portaria nº 474/98 (DOU15/06/98),
Portaria nº 888/98 (DOU27/11/98), Resolução RE nº93/00 (DOU04/08/00),
Resolução RE nº347/02 (DOU31/12/02). (Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários -
AGROFIT)
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária é responsável por avaliar e
classificar toxicologicamente os pesticidas. Estudos toxicológicos são realizados
para calcular parâmetros de segurança, tais como Ingestão Diária Aceitável (IDA)
de cada ingrediente ativo (IA) (SERRANO-CINCA; FUERTES-CALLÉN; MAR-
MOLINERO, 2005). IDA é a dose diária aceitável ou ingestão diária aceitável que,
ingerida diariamente durante toda a vida, parece não oferecer risco à saúde, de
acordo com a Portaria nº 3, de 16 de janeiro de 1992, do Ministério da Saúde. A
17
unidade de medida é mg de agrotóxico por kg de peso corpóreo, segundo a Portaria
3/1992.
A partir desse parâmetro de segurança a ANVISA define o Limite Máximo de
Resíduo (LMR), quantidade máxima de resíduo de agrotóxico legalmente aceita no
alimento (desde sua produção até seu consumo), e o Intervalo de Segurança
(tempo entre a última aplicação de agrotóxico e a colheita ou comercialização) para
avaliar o impacto na exposição antes de autorizar o uso de um ingrediente ativo na
atividade agrícola.
O cálculo da Ingestão Diária Máxima Teórica (IDMT), realizado pela agência
é dado pela Equação 1, sendo o somatório do produto do Limite Máximo Residual
vezes o alimento consumido, dividido pelo peso corpóreo.
Equação 1: Cálculo de Ingestão Diária Máxima Teórica
𝐼𝑀𝐷𝑇 = ∑(𝐿𝑀𝑅. 𝐴𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜)
𝑀𝑎𝑠𝑠𝑎 𝐶𝑜𝑟𝑝ó𝑟𝑒𝑎 (1)
Na plantação de café, no Brasil, o LMR permitido é dez vezes maior que o
permitido na União Europeia, sendo 1 mg/kg e 0,1 mg/kg, respectivamente.
Enquanto que na produção da cana de açúcar o limite permitido é vinte vezes maior
do que na União Europeia (0,05 mg/kg EU e 1 mg/kg BR). Na soja, o limite é
duzentas vezes maior que na união europeia, sendo 0,05 mg/kg na União Europeia
e 10 mg/kg no Brasil (BOMBARDI, 2017).
Entretanto, pode-se obter um agrotóxico com baixa toxicidade, mas não há
como descartar os efeitos crônicos. A maioria dos estudos de avaliação da
toxicidade é realizado com ingredientes ativos isolados, enquanto que os alimentos
que são consumidos pela população podem trazer em sua matriz dezenas de
ingredientes ativos (CARNEIRO et al., 2015).
O Programa de Análise de Resíduos Agrotóxicos em Alimentos (PARA) tem
a finalidade de estruturar um serviço para avaliar e promover a segurança dos
alimentos em relação aos resíduos de pesticidas. É coordenado pela ANVISA
juntamente com os órgãos estaduais e municipais de vigilância sanitária e
laboratórios estaduais de saúde pública. Os resultados do programa permitem
verificar se os alimentos comercializados no varejo apresentam níveis de resíduos
de pesticidas dentro dos Limites Máximos de Resíduos (LMR) estabelecidos pela
Anvisa; conferir se os pesticidas utilizados estão devidamente registrados no país
18
e se foram aplicados somente nos alimentos para os quais estão autorizados;
estimar a exposição da população a resíduos de pesticidas em alimentos de origem
vegetal e, consequentemente, avaliar o risco à saúde decorrente dessa exposição
(SERRANO-CINCA; FUERTES-CALLÉN; MAR-MOLINERO, 2005). Os resultados
do PARA evidenciam que a população brasileira em geral está exposta a pesticidas
(BRASIL, 2016).
2.2 Toxicologia
Toxicologia é a ciência que estuda os efeitos adversos de substâncias
químicas sobre organismos vivos. Um veneno é definido como um agente capaz
de produzir uma resposta prejudicial em um sistema biológico. De uma maneira
geral, todas as substâncias químicas apresentam o potencial de produzir lesão ou
morte dependendo da dose utilizada (WATKINS, 2012).
O termo DL50 corresponde à dosagem necessária para causar uma resposta
letal de 50% da população investigada. Entretanto, outros fatores também precisam
ser analisados. Alguns produtos químicos com baixa toxicidade podem apresentar
efeitos cancerígenos ou teratogênicos mesmo que não exista evidência de
toxicidade aguda (WATKINS, 2012).
Os efeitos tóxicos podem ser imediatos ou retardados. A diferença está no
tempo de resposta, os imediatos são observados logo após uma única dose,
enquanto o retardado precisa de um tempo maior de administração de uma
substância para que seja observado o efeito tóxico. Entre os efeitos tóxicos, eles
são classificados como reversíveis ou irreversíveis (WATKINS, 2012).
Substâncias químicas quando são administradas simultaneamente, podem
provocar respostas diferentes no indivíduo devido ao efeito da interação química.
Essa interação pode proporcionar um efeito aditivo, sinérgico, potenciação ou
antagonismo. O efeito aditivo corresponde à soma dos efeitos de cada substância
quando administradas isoladamente. O efeito sinérgico corresponde ao aumento
dos efeitos das substâncias administradas simultaneamente. O efeito de
potenciação corresponde a situação em que uma substância sem efeito tóxico
quando combinada com outra substância química tóxica, produz um efeito muito
mais tóxico. Antagonismo acontece quando as substâncias combinadas interferem
no efeito uma da outra (WATKINS, 2012).
19
2.2.1 Toxicologia em crianças
Esse grupo de 0 à 15 anos é um grupo heterogêneo, no qual a
suscetibilidade a exposição química pode variar ao longo dos estágios de
crescimento e desenvolvimento. Essa população apresenta características
diferentes em toda etapa do desenvolvimento que determinam diferentes formas e
níveis de exposição do que da população adulta (MAZOTO et al., 2011).
Crianças são mais suscetíveis a toxicologia devido às funções imaturas de
seus organismos (MAIOR et al., 2017). Devido à ampla faixa etária das crianças, é
improvável que uma única dose seja apropriada para toda a faixa etária
(BATCHELOR; MARRIOTT, 2015). Os estudos em crianças são, na maioria dos
casos, considerados antiéticos, resultando em dificuldades na obtenção de dados
críticos de segurança toxicológica nessa faixa etária.(ERNEST et al., 2007) Essa
falta de informação impõe riscos significantes a uma população já vulnerável.
As características da suscetibilidade das crianças são provenientes desde o
momento da exposição, como também em todo o processo da absorção,
biotransformação, metabolização, eliminação e dos mecanismos de ação.
(MAZOTO et al., 2011)
Recém-nascidos, ingerem, em média, sete vezes mais água que um adulto,
crianças entre um e cinco anos de idade comem três a quatro vezes mais e
respiram duas vezes mais que um adulto (proporcionalmente com a massa
corporal), tornando-as mais expostas às substâncias presentes na água, ar e nos
alimentos. (LANDRIGAN et al., 2004). A taxa de ventilação respiratória em crianças
é igual a 133 mL/min/kg peso/m² superficiepulmonar e para adultos é igual a 2
mL/min/kg peso/m² superficiepulmonar. Além disso, a permeabilidade da barreira
epidérmica encontra-se ainda em desenvolvimento em bebês pré-termo, resultando
em maior absorção percutânea das substâncias químicas (WHO, 2006).
O maior volume de fluido extracelular de recém-nascidos leva à maior
dissolução de substâncias hidrossolúveis. Da mesma forma, os recém-nascidos
possuem um menor volume de gordura corporal quando comparado aos adultos, o
que dificulta a dissolução de substâncias lipossolúveis. A capacidade de transporte
das substâncias químicas por meio da ligação com proteínas plasmáticas é menor
nos recém-nascidos devido à menor concentração de proteínas plasmáticas, em
particular a albumina.(KEARNS et al., 2003)
20
As crianças possuem maior fluxo sanguíneo para o cérebro e menor
circulação sanguínea para os rins, até a idade de cinco meses; maior peso relativo
do fígado; alvéolos pulmonares menores em tamanho e
quantidade(INTERGOVERNMENTAL FORUM ON CHEMICAL SAFETY (IFCS)
CHILDREN AND CHEMICAL SAFETY WORKING GROUP, 2005); taxa de filtração
glomerular é um terço da taxa de adultos, o que significa que substâncias químicas
permaneçam por mais tempo no organismo infantil; a imaturidade da barreira
hemantoencefálica facilita a passagem de substâncias químicas para o sistema
nervoso. (KOLLER et al., 2004)
No período de gestação, a criança não sofre maior exposição do que a
gestante. Entretanto, em algumas situações, o indivíduo que está se
desenvolvimento pode ser mais sensível ao modo de ação de uma determinada
substância química. A exposição intrauterina em altas concentrações pode
ocasionar paralisia cerebral e epilepsia, e em baixas concentrações pode ocasionar
déficits neuropsicológicos.(MAZOTO et al., 2011)
O centro de Informação a Assistência Toxicológica de Santa Catarina
(CIATox) relacionou várias revisões sistemáticas de bancos de dados e separou os
efeitos dos pesticidas em crianças e os efeitos em adultos, mesmo em baixas
doses. Em crianças são: baixo peso ao nascer, microcefalia, malformações
congênitas, déficit de atenção em crianças, autismo, prematuridade, redução de QI
de crianças, doenças respiratórias (asma e infecções respiratórias por repetição),
câncer (linfoma não-Hodgkin, leucemias, câncer de mama, próstata, testículos e
ovários), desregulação endócrina (infertilidade, disfunção sexual, disfunção
tireoidiana), neurotoxicidade (depressão e suicídio, doença de Parkinson, esclerose
lateral amiotrófica, polineuropatia). (CIATox, 2018)
2.3 Formulação
O ingrediente ativo não pode ser aplicado isolado por não ser quimicamente
estável. Essa fórmula é uma mistura entre o I.A. combinado com solventes,
surfactantes e ingredientes inertes para viabilização do armazenamento, transporte
e aplicação.
Os objetivos são: possibilitar a dispersão do formulado no veículo
(geralmente água) que possibilite a distribuição uniforme do componente em uma
21
grande área, garantir facilidade de manuseio e armazenamento do produto
formulado e aumentar a fitotoxicidade e reduzir a toxicidade, volatilidade e/ou
fotodecomposição. (VIDAL, R. A.; MEROTTO JR., 2001)
No caso do glifosato, o surfactante é responsável por aumentar a eficiência
pelo aumento da retenção de gotas nas folhas de absorção foliar, a hidratação das
folhas facilita a adsorção. Entretanto, a concentração deve ser estudada
previamente, estudos toxicológicos, pois a adição de 1% p/v de dois tipos diferentes
de surfactante reduziu a translocação de glifosato, em comparação à utilização sem
adição do surfactante. Ao passo que a adição de apenas 0,1% p/v maximizou a
translocação. (SHERRICK; HOLT; HESS, 1986)
A formulação Roundup®, que é a mais utilizada, é composta de surfactante
polioxietileno-amina, ácidos orgânicos de glifosato, sal de isopropilamina e água.
O principal produto de decomposição é o ácido aminometilfosfônico (AMPA)
e a o surfactante não iônico polioxietileno amina (POEA). (WILLIAMS; KROES;
MUNRO, 2000)
2.4 Glifosato
Glifosato (glyphosate) é o ingrediente ativo ou nome comum. O nome
científico é N-(fosfonometil)glicina (n-phosphonomethyl-glycine). O glifosato é o
ingrediente ativo do herbicida Roundup®. O herbicida glifosato, sal de
isopropilamina de n-(fosfonometil)-glicina, é um aminofosfonato análogo ao
aminoácido natural glicina, o qual ocupa o lugar deste aminoácido na síntese
proteica. Seu nome é uma contração de glicina e fosfato.
A fórmula química bruta é C3H8NO5P, pertence ao grupo químico da glicina
substituída. É amplamente utilizado na agricultura por ser considerado não tóxico
por apresentar um DL50 baixo ( > 4g/kg). (WHO, 1994). A primeira fórmula a base
de glifosato começou a ser vendida em 1974 e 20 anos depois já haviam mais de
90 herbicidas com esse IA.
O glifosato é um herbicida não seletivo e ação sistêmica, de amplo espectro,
provoca a morte do sistema radicular e de estruturas reprodutivas de plantas
perenes, como rizomas, bulbos e tubérculos. Permite a semeadura de culturas
imediatamente após a aplicação.(KRUSE; TREZZI, 2000).
22
É utilizado na agricultura em aplicação pós-emergência das plantas
infestantes nas culturas de algodão, ameixa, arroz, banana, cacau, café, cana-de-
açúcar, citros, coco, feijão, fumo, mação, mamão, milho, nectarina, pastagem, pêra,
pêssego, seringueira, soja, trigo e uva. Utilizado como maturador de cana-de-
açúcar, na eliminação de soqueira no cultivo de arroz e cana-de-açúcar, em pós
emergência das plantas infestantes em eucaliptos e pinus, controle de rebrota do
eucalipto, dessecante nas culturas de aveia preta, azevém e soja. Também tem
uso não agrícola, aplicação em margens de rodovias e ferrovias, áreas sob a rede
de transmissão elétrica, pátios industriais, oleodutos e aceiros. O uso
domissanitário é autorizado para jardinagem amadora. Para cada utilização existe
uma concentração máxima permitida já estabelecida. (ANVISA, 2015)
O glifosato é o herbicida com maior volume de produção em todo mundo. O
consumo aumentou significativamente com o desenvolvimento de organismos
geneticamente modificados, resistentes ao glifosato. A Figura 2 apresenta a relação
dos 10 ingredientes ativos mais vendidos no Brasil no ano de 2016, em toneladas
de ingrediente ativo, enquanto a Figura 3 apresenta a relação de vendas de
toneladas de glifosato por ano, no período de 2009 a 2016.
Figura 2 : Os 10 ingredientes ativos mais vendidos.
Fonte: Ibama / Consolidação de dados fornecidos pelas empresas registrantes de produtos técnicos, pesticidas e afins, conforme art. 41 do Decreto n° 4.074/2002.
Glifosato e seus sais2,4-D
MancozebeAtrazina
Oleo mineralAcefato
Oleo vegetal
Carbendazim
Dicloreto de paraquate
Imidacloprido0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Ve
nd
as
(to
n. IA
)
Ingrediente ativo (IA)
23
Notável a disparidade de vendas do glifosato em relação aos demais
ingredientes ativos vendidos. Com 185.602,22 toneladas de ingredientes ativos
vendidos em 2016 no Brasil, o glifosato e seus sais garantem a liderança de vendas.
Figura 3 - vendas de glifosato por ano no Brasil.
Fonte: IBAMA.
Observa-se que de 2011 para 2012 houve um aumento considerável nas
vendas que se manteve em alta até o último relatório publicado do Ibama.
Atualmente, o glifosato está sendo reavaliado por análises toxicológicas que devem
ser concluídas até 2019 (ANVISA,2017).
A toxicidade da formulação comercial do glifosato foi discutida em um artigo
(SAMSEL; SENEFF, 2013a) sugerindo que essa formulação é o contribuinte chave
para epidemias de obesidade e de autismo nos Estados Unidos, bem como muitas
outras doenças e condições, como Alzheimer, Parkinson, infertilidade, depressão e
câncer.
Alguns estudos relatam evidências de carcinogenicidade proveniente do
glifosato em animais, considerando-o como provavelmente carcinogênico para
humanos, grupo 2A (GUYTON et al., 2015). Essa classificação é definida pela
Agência Internacional de Pesquisa Em Câncer, que faz parte da Organização
Mundial da Saúde e é dividida nos seguintes grupos: Grupo 1 o agente é
carcinogênico à humanos, Grupo 2A o agente provavelmente é carcinogênico à
2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 20160
50000
100000
150000
200000
VE
ND
AS
(to
n IA
)
ANO
24
humanos, Grupo 2B quando o agente é possivelmente carcinogênico à humanos,
Grupo 3 quando o agente não é classificado e Grupo 4 quando o agente
provavelmente não é carcinogênico à humanos. (International Agency for Research
on Cancer, 2017).
Autores já escreveram que o efeito da formulação comercial do glifosato é
maior do que o glifosato isolado. Em 2009, Nora Benachour e Gilles-Eric Seralin
realizaram um estudo feito com células placentárias e puderam concluir que as
formulações comerciais alteram a permeabilidade das células humanas e
apresentam toxicidade maior do que o ingrediente isolado. O glifosato isolado
provoca apoptose sem danos à membrana, enquanto a formulação perturba as
membranas celulares e mitocondriais e promove a necrose.
Em células embrionárias, placentárias (BENACHOUR; SÉRALINI, 2009),
como também em células de jovens e adultos (GASNIER et al., 2009) a formulação
se mostrou mais tóxica do que o glifosato isolado.
Um estudo americano com os seguintes dados: plantações de organismos
geneticamente modificados, aplicação do glifosato e doenças epidemiológicas,
correlacionou 22 doenças neste conjunto de dados de séries temporais. O
coeficiente de correlação de Pearson foi muito significante (<10-5) entre a aplicação
do glifosato e: hipertensão (R = 0,923), acidente vascular encefálico (R = 0,925),
prevalência de diabetes (R=0,971), incidência de diabetes (R=0,935), obesidade
(R=0,962), distúrbios no metabolismo de lipoproteínas (R=0,973), Alzheimer
(R=0,917), demência senil (R=0,994), Parkinson (R=0,875), esclerose múltipla
(R=0,828), autismo (R=0,989), doença inflamatória intestinal (R=0,938), infecção
intestinal (R=0,974), doença renal em estágio final (R=0,975), insuficiência renal
aguda (R=0,978), câncer de tireoide (R=0,988), câncer de fígado (R=0,960), câncer
de bexiga (R=0,981), câncer de pâncreas (R=0,918), câncer de rim (R=0,973) e
leucemia mieloide (R=0,878). (SWANSON et al., 2014)
Pela legislação brasileira, substâncias que tenham efeitos crônicos não
deveriam estar autorizadas. Pelo que já foi apontado no subtópico “Regularização”
neste trabalho, o órgão regulador é impossibilitado de cumprir as exigências
legais.(CARNEIRO et al., 2015)
25
2.4.1 Indenização
A maior fabricante de herbicidas à base de glifosato, Monsanto, foi
condenada a indenizar ao jardineiro Dewayne Johnson que atribuiu a causa de seu
câncer aos agrotóxicos Roundup e RangerPro, nos Estados Unidos. A justiça
sentenciou que a empresa pague US$289 mi como indenização (BBC, 2018). Esse
caso foi aberto em 2016 e recebeu prioridade devido à seriedade do linfoma não-
Hodgkin’s desenvolvido no jardineiro que aplicava o pesticida em escolas até 30
vezes ao ano (BELLON, 2018).
2.5 MECANISMO DE AÇÃO
2.5.1 Em Vegetais
O mecanismo de ação é a inibição da enzima 5enol-piruvilshiquimato- 3 -
fosfato sintase (EPSPS). Esse IA é absorvido na região fotossintetizante das
plantas, que apresentam clorofila, e desloca-se pelo floema para os tecidos
meristemáticos. A reação condensa shiquimato – 3 – fosfato e fosfoenolpiruvato em
5 – enolpiruvilshiquimimato3- fosfato e fosfato inorgânico, na etapa pré-corismato
da rota metabólica do shiquimato. Essa rota é a base para biossíntese de
aminoácidos aromáticos essenciais como: fenilalanina, tirosina e triptofano.
(JÚNIOR et al., 2010).
2.5.2 Em Animais
Como os seres humanos ou qualquer mamífero não apresentam a via do
shiquimato, ele é considerado não prejudicial a esses animais. Mas está presente
em algas, bactérias, archaea, fungos, procariontes, unicelulares e organismos
eucarióticos (RICHARDS et al., 2006). Sendo assim, as bactérias intestinais de
humanos sofrem com a alteração na via do shiquimato. Além de ajudar na digestão,
a microbiota intestinal sintetiza vitaminas, desintoxica xenobióticos e participa da
homeostase do sistema imunológico e da permeabilidade do trato gastrointestinal.
(LITTMAN; PAMER, 2011)
O glifosato atua na inibição de enzimas de citocromo P540 (CYP). Essas
enzimas são responsáveis por desintoxicar xenobióticos. Esta substância
interrompe o processo metabólico interferindo nas vias do citocromo CYP. O
citocromo CYP é conhecido como uma super-família de enzimas presentes na
26
maioria dos tecidos do corpo e são responsáveis por cerca de 75% das reações
envolvidas no metabolismo de drogas e a oxidação de moléculas orgânicas. O
impacto negativo sobre o corpo é insidioso e se manifesta lentamente com o tempo,
à medida que a inflamação danifica os sistemas celulares em todo o corpo. A
interferência das enzimas CYP atua sinergicamente com o rompimento da
biossíntese de aminoácidos aromáticos pelas bactérias intestinais e, também, o
comprometimento de sulfato sérico. (SAMSEL; SENEFF, 2013b)
Em humanos, apenas pequenas quantidades (~ 2%) do glifosato ingerido
são metabolizadas em ácido aminometilfosfônico (AMPA), e o restante entra na
corrente sanguínea e é eventualmente eliminado pela urina. (WILLIAMS; KROES;
MUNRO, 2000)
2.6 FRAGILIDADE OSMÓTICA ERITROCITÁRIA (FOE)
2.6.1 Estrutura da Membrana Plasmática A membrana é uma espécie de fronteira biológica que envolve a célula,
define seus limites e funciona como uma barreira seletiva que permite a troca de
algumas substâncias entre o interior e exterior, visto que o meio interior e exterior
apresentem mesmas substâncias mas com diferentes concentrações, tais como
Sódio, Cálcio, Glicose, Colesterol, entre outras (BRUCE, 2002).
Os gradientes iônicos são determinados pelas atividades das proteínas e
podem ser usados para sintetizar ATP e coordenar o transporte de solutos. Apesar
de pequenas variações, todas as membranas biológicas são constituídas
basicamente por uma fina camada de moléculas de lipídeos e proteínas unidas
principalmente por interações não covalentes (ELISA et al., 2017). Todos os
lipídeos da bicamada têm caráter anfifílico (parte solúvel em meio apolar e a outra,
em polar), o qual é responsável pela formação bi-camada da membrana
(KOHASIGAWA). As proteínas entram na célula e interferem em quase todas as
funções da membrana, inclusive no transporte de moléculas específicas e síntese
de ATP, por exemplo (ELISA et al., 2017).
Os fosfolipídeos são os mais abundantes na bicamada. São caracterizados
por uma cabeça polar, um grupo fosfato e duas caudas com cadeias
hidrocarbonadas. Neles, as duas longas cadeias de ácidos graxos estão
esterificadas com átomos de carbono do glicerol e o terceiro átomo de carbono do
27
glicerol está ligado a um grupo fosfato, o qual pode estar ligado a vários tipos de
grupamento de cabeças, como é apresentado na Figura 4 (ELISA et al., 2017).
Figura 4: Partes típicas de uma molécula fosfolipídica representada em (a) esquematicamente e em (b) por meio de fórmula estrutural condensada.
Fonte: ELISA et al., 2017.
A membrana biológica contém quantidades significativas de colesterol, que
é um esterol. Ele possui uma configuração em anel rígida ligada à somente um
grupo hidroxila polar e extensa superfície cíclica apolar. O colesterol é responsável
por mudar as propriedades físicas (fluidez), permeabilidade e flexibilidade da
membrana. Uma membrana plasmática de um eritrócito possui basicamente 23%
de colesterol da composição total de lipídeos em massa. (ELISA et al., 2017).
As membranas de animais não possuem a proteção da parede celular como
as células vegetais e bacterianas e por isso a sua estrutura pode ser afetada por
variações de concentração no meio. Essa ausência de proteção pode comprometer
a fisiologia da célula quando em situações adversas no meio levando, até mesmo,
à morte (MCNEIL; STEINHARDT, 2000).
2.6.2 Eritrócitos (células vermelhas)
Eritrócitos são os elementos celulares mais frequentes no sangue,
representam 95%. Eles apresentam forma de discos anucleados dotados de
Hemoglobina (Hb) carreadoras de Oxigênio (O2). Os eritrócitos transportam o
28
Oxigênio do pulmão para os tecidos periféricos e realizam o transporte de dióxido
de carbono (CO2) para fora do organismo.
Os eritrócitos são extensamente utilizados em estudos de determinação de
estrutura, composição e comportamento da membrana devido à sua estabilidade.
Ao sofrer hemólise por ação de qualquer fator ambiental, as células vermelhas
liberam hemoglobina no meio, as quais podem ser quantificadas por
espectrofotometria em 540 nm (A540nm). O valor de absorbância a A540 é
proporcional ao percentual de lise dos eritrócitos (NETTO, 2009). O teste de
fragilidade osmótica eritrocitária (FOE) é de baixo custo e de elevada eficiência para
avaliar a estabilidade das membranas e células.
2.6.3 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária
A fragilidade osmótica eritrocitária é usada para medir a resistência dos
eritrócitos à hemólise enquanto estão sendo expostos à vários níveis de
concentração salina (0 a 0,9 g/dL de NaCl em água destilada). A incubação dos
eritrócitos em 37°C por 24 horas aumenta a sensitividade do teste. (KHALID, 2015)
Quando as células estão em um meio hipotônico elas aumentam de volume até
atingir nível crítico, após o que são lisadas. A osmolaridade representa o número
de partículas de uma solução por litro (NETTO, 2009). As soluções hipotônicas
provocam osmose para dentro da célula, causando o aumento de volume celular
até o rompimento; enquanto as soluções hipertônicas provocam osmose efetiva
para fora da célula, resultando na redução do volume celular. A osmose é o fluxo
de água através de uma membrana semipermeável (permeável ao solvente e
impermeável ao soluto), por esse motivo o fluxo ocorre de onde a concentração de
soluto é menor para onde a concentração do soluto é maior como é ilustrado na
Figura 5.
29
Figura 5: Gráfico de osmose e ilustração de osmose em eritrócitos
Fonte: Elsevier Inc, 2004.
Os danos causados à integridade dos eritrócitos e a hemólise, contribuem
para patologias graves, incluindo disfunção endotelial, proteção tecidual, perda da
homeostase cardiovascular, metabolismo de óxido nítrico (NO) e controle da
reologia sanguínea (KUHN et al., 2017). Entre outros fatores conhecidos, o
colesterol interfere na fragilidade osmótica e o aumento do colesterol diminui a
fragilidade celular (SAGAWA, S; SHIRAKI, 1980).
30
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
• Avaliar a toxicidade celular em humanos do pesticida n-(fosfonometil)-glicina
e demais componentes da formulação de uso comercial
3.2 Objetivos específicos
• Obter as curvas de fragilidade osmótica celular para cada sujeito sem e com
a ação do caotrópico;
• Relacionar os fatores individuais, variáveis do hemograma e do lipidograma
à toxicidade observada;
• Avaliar a dependência entre idade e sensibilidade à intoxicação pelo
toxicante objeto desse trabalho.
31
4 MATERIAL E MÉTODOS
Material:
Amostras de sangue, Cloreto de Sódio (NaCl), Formulação comercial
de glifosato, Água destilada, Pipetas Automáticas de 1000 µL e 20 µL, ponteiras
descartáveis para as pipetas, tubos Eppendorfs®, estante para tubos, base de
isopor para banho termostatizado.
Equipamentos:
Banho termostatizado HAAKE DC10-B3, Centrífuga Bioeng 16 tubos,
Espectrofotômetro UV-VIS QUIMIS®.
4.1 Considerações éticas
Esse trabalho foi previamente submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa
em Humanos (CEP) por meio da Plataforma Brasil e tão somente mediante
autorização e obtenção do número de concessão relativo a esse projeto, que os
trabalhos experimentais foram iniciados. O número de CAAE (certificado de
apresentação para apreciação ética) é 99724718.1.0000.5467 e o número do
parecer de aprovado 2.933.304.
4.2 Amostras de material biológico
Amostras de sangue (3 mL) foram coletadas de sujeitos saudáveis, com idade
entre 1 e 15 anos, no Laboratório Municipal de Análises Clínicas da Prefeitura de
Lorena através de punção venosa após um período de jejum de 8-12 horas. Os
sujeitos participantes foram codificados e permaneceram incógnitos, não podendo
ser identificados até mesmo se os resultados da pesquisa pudessem beneficiá-los.
O sangue foi coletado em tubos evacuados contendo 50 μL de K3EDTA a 25 mmol/L
e seguiu a rotina de análise do laboratório onde foram processados de modo
totalmente automatizados o eritrograma em equipamento Pentra DF Nexus (Horiba
Medical Ltda) e o lipidograma por equipamento BT 3000-plus (Biotecnica
Instruments). O sangue total não usado e considerado material de descarte foi, em
no máximo 24 horas da sua obtenção, cedido à Universidade de São Paulo para o
estudo a que se propôs esse trabalho. O sangue total foi transportado em recipiente
acondicionado em ambiente refrigerado e mantido entre 0ºC a 4ºC até o momento
da análise. Os resíduos foram armazenados em descarpack para serem
32
incinerados juntamente com os resíduos biológicos do Laboratório Municipal de
Análises Clínicas.
Figura 6: Amostras de material biológico
Fonte: Próprio autor.
4.3 Reagentes
O reagente NaCl foi de grau ACS de pureza e obtido por meio do Laboratório
de Engenharia Ambiental ligado ao Departamento de Ciências Básicas e
Ambientais da EEL-USP. O herbicida utilizado foi o glifosato fabricado pela
Citromax (São Lourenço do Oeste, SC, Brasil) contendo glifosato 48% obtida em
lojas de produtos agropecuários no município de Lorena.
4.4 Determinação da estabilidade de eritrócitos humanos na
presença de glifosato
Dois conjuntos em duplicata de 8 tubos eppendorfs contendo 2 mL de
solução foram preparados: um conjunto com 2 mL concentração de NaCl com
concentrações entre 0,3 a 0,6 g.dL-1; o outro conjunto com 1 mL de concentração
de NaCl com concentração entre 0,3 e 0,6 g.dL-1 e 1 mL de solução de glifosato
com 25 µL/dL de concentração. Todos os tubos foram pré-incubados durante 15
minutos em banho termostatizado mantido a 37,5 °C. Após a adição de 20 μL de
sangue total, os tubos foram selados, homogeneizados e incubados durante 30 min
a 37,5 °C. Em seguida, após retirados do período de incubação, os tubos
eppendorfs foram centrifugados durante 2 min a 1600 x g a temperatura ambiente,
os sobrenadantes foram cuidadosamente removidos com uso de pipeta automática
e submetidos à leitura de absorbância a 540 nm em espectrofotômetro UV-VIS.
33
Figura 7:Bancada Experimental.
Fonte: Próprio Autor.
Figura 8: (a) Banho termostatizado a 37,5 ˚C; (b) Adição de 20 µL de sangue em todos os tubos.
(a) (b) Fonte: Próprio autor. Figura 9: Tubos eppendorfs com adição de sangue: (a) antes do banho termostatizado; (b)
após o banho termostatizado.
(a) (b) Fonte: Próprio autor.
34
Figura 10: Centrifuga com capacidade máxima de 16 tubos: (a) Vista superior; (b) Equipamento aberto
(a) (b) Fonte: Próprio autor. Figura 11: Leitura de sobrenadante no espectrofotômetro: (a) Leitura da absorbância em
540nm; (b) Cubeta e tubo de eppendorfs de uma amostra com lise; (c) Cubeta e tubo eppendorf de uma amostra sem lise.
(a) (b) (c)
Fonte: Próprio autor.
4.5 Determinação das curvas de transição de hemólise
Os gráficos de dependência de leitura de absorbância a 540nm versus
concentração de NaCl (X) foram ajustados à regressão sigmoidal, de acordo com
a equação de Boltzmann (Equação 2)
Equação 2: Equação de Boltzmann
𝐴540 =𝐴𝑚á𝑥 − 𝐴𝑚í𝑛
1 + 𝑒(𝑋−𝐻50)𝑑𝑋+ 𝐴𝑚í𝑛
35
Onde Amáx e Amín representam o máximo e o mínimo de A540 nos, H50 é a
concentração de NaCl capaz de promover 50% de hemólise e dX representa a
amplitude de concentração de sal necessária para promover a lise da população
total de eritrócitos, como está apresentado no Gráfico 1. As variáveis dX e H50 estão
relacionadas à estabilidade da membrana de eritrócitos. Quanto menor o valor de
dX, menor a estabilidade ou maior fragilidade osmótica dos eritrócitos, sendo que
uma menor variação na concentração de sal foi necessária para promover a lise
total. Por outro lado, quanto menor o valor de H50, maior a estabilidade e menor
fragilidade osmótica dos eritrócitos, pois o ponto médio da transição de hemólise
(H50) ocorreu com uma menor concentração de solução salina. Consequentemente,
a razão dX/H50 tem uma relação direta com a estabilidade osmótica dos eritrócitos.
Gráfico 1: Curva típica de dependência de lise eritrocitária em função da concentração de
NaCl.
Fonte: PARAISO et al., 2017.
4.5.1.1 Concentração de glifosato investigada A concentração de glifosato escolhida para investigação foi baseada em um
artigo dos autores Rodrigues et al. (2011) que realizou a curva da fragilidade
eritrocitária com a variação da concentração de glifosato com a concentração de
solução salina em 0,9 g/dL, conforme é mostrado no Gráfico 2.
36
Gráfico 2: Curva de fragilidade eritrocitária induzida pela variação da concentração de Roundup e concentração de NaCl constante em 0,9 g/dL.
Fonte: RODRIGUES et al., 2011.
Escolheu-se o valor de 25 µL/dL por estar numa região da curva de dx do
gráfico.
4.6 Determinação de variáveis bioquímicas e hematológicas
O hemograma e o lipidograma foram processados pelo Laboratório
Municipal de Análises Clínicas da Prefeitura de Lorena e os valores de referência
(sujeitos entre 0 e 15 anos) foram eritrócitos (RBC), 3,9 a 5,9 milhões de mm3; Hb
12,0-18,0 g/dL; hematócrito 35,6-48,6%; média do volume corpuscular (MCV), 76-
96 fl; corpuscular média hemoglobina (MCH), 27 - 31 pg; concentração média
corpuscular de hemoglobina (MCHC), 32,9-36%; distribuição das células
vermelhas largura (RDW), 12-15%; glicose (Glu), 60-99 mg/dL; albumina (HSA),
3,5 a 5,2 g/dL; contagem de plaquetas 150 a 400 mil/mm3; colesterol total (t-C),
<150 (ótimo) e ≥ 170 mg/dL (alto); alta densidade colesterol de lipoproteína (HDL-
C), <35 (baixa) e > 45 mg/dL (ideal), colesterol de lipoproteína de baixa densidade
(LDL-C), <100 (bom) e > 130 mg/dL (Alto); lipoproteína de muito baixa densidade
(VLDL-C), até 42 mg/dL; e triglicerídeos (TG), <100 (ótimo) e > 130 mg/dL (alto).
37
4.7 Análise estatística dos dados experimentais
Os efeitos citotóxicos do glifosato foram avaliados graficamente por meio do
Software OriginPro 9.5 (MicroCal™, Northampton, MA, EUA). Para avaliação da
citotoxicidade induzida por glifosato, após obtenção dos parâmetros de toxicidade
celular por meio dos testes FOE, os dados foram tratados por análise estatística
descritiva e exploratória e comparados pelo Teste de U de Wilcoxon. Dados de
variáveis individuais gênero e idade também foram obtidos de cada um dos sujeitos.
A busca de correlação entre as variáveis do eritrograma, do lipidograma e variáveis
individuais com os parâmetros de estabilidade celular também foram processadas
por meio do teste de Rhô de Spearman. Em todos os testes foi usado o Software
OriginPro 9.5 (MicroCal™).
38
5 RESULTADOS
5.1 Teste de fragilidade osmótica eritrocitária (FOE)
Primeiramente, foram determinadas as linhas de base de dependência da
hemólise em função da concentração de NaCl de cada indivíduo a partir das leituras
de absorbância a 540 nm da concentração de hemoglobina, ajustadas pela
equação de Boltzmann.
O Gráfico 3 apresenta as curvas de hemólise de todas amostras de material
biológico diferentes em concentrações que variaram entre 0,3 g/dL a 0,6 g/dL de
NaCl. Para uma melhor visualização, o Gráfico 4 apresenta apenas três amostras
e mesma escala de gráfico para comparação. O herbicida utilizado parece diminuir
a amplitude da concentração de sal necessária para promover a lise da população
total dos eritrócitos.
Gráfico 3:Curva de hemólise das dez amostras analisadas: (a) sem a presença de glifosato; (b) com glifosato.
(a) (b)
Fonte: Próprio Autor.
0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
Ab
so
rbâ
ncia
(5
40
nm
)
NaCl (g/dL)
Fit Curve 1
Fit Curve 2
Fit Curve 3
Fit Curve 4
Fit Curve 5
Fit Curve 6
Fit Curve 7
Fit Curve 8
Fit Curve 9
Fit Curve 10
0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55 0,60
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
Ab
so
rbâ
ncia
(5
40
nm
)
NaCl (g/dL)
Fit Curve 1
Fit Curve 2
Fit Curve 3
Fit Curve 4
Fit Curve 5
Fit Curve 6
Fit Curve 7
Fit Curve 8
Fit Curve 9
Fit Curve 10
39
Gráfico 4:Curva de hemólise das três amostras analisadas com melhores ajustes de correlação (0,98; 0,99; 0,99): (a) sem a presença de glifosato; (b) com glifosato.
(a) (b)
Fonte: Próprio autor.
0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Ab
so
rbâ
ncia
(5
40
nm
)
NaCl (g/dL)
Fit Curve 5
Fit Curve 7
Fit Curve 10
0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Ab
so
rbâ
ncia
(5
40
nm
)
NaCl (g/dL)
Fit Curve 5
Fit Curve 7
Fit Curve 10
40
Tabela 1: Análise descritiva exploratória dos parâmetros Amax, Amin, dX, H50 e dX/H50 obtidos dos ajustes das curvas da dependência de hemólise em linha de regressão sigmoidal (n=10).
Sem herbicida Com herbicida
Amax Amin dX H50 dX/H50 Amax Amin dX H50 dX/H50
Mínimo 0,8223 0,038 0,0009 0,4367 0,0021 0,6831 0,0259 0,0062 0,4211 0,0136
Máximo 1,178 0,1521 0,0488 0,47 0,1062 1,2237 0,2192 0,0277 0,4698 0,0652
Amplitude Total 0,3557 0,1142 0,0478 0,0333 0,1041 0,5406 0,1933 0,0215 0,0488 0,0516
Mediana 1,0622 0,08 0,0187 0,4479 0,04 1,0444 0,0896 0,0117 0,4467 0,0268
Primeiro Quartil (25%) 0,982 0,0566 0,0118 0,44 0,0262 0,8136 0,0579 0,0079 0,4358 0,0176
Terceiro Quartil (75%) 1,1402 0,1003 0,0231 0,4585 0,0527 1,0831 0,1283 0,0175 0,4508 0,0389
Desvio Interquartílico 0,1581 0,0437 0,0113 0,0186 0,0265 0,2695 0,0703 0,0096 0,015 0,0213
Fonte: Próprio autor.
41
5.2 Análise descritiva exploratória
A população de sujeitos envolvidos no estudo possui características relativas
ao eritrograma, lipidograma, parâmetros de estabilidade e idade e gênero,
apresentados na Tabela 2.
Os gêneros dos indivíduos analisados foram formados por 40% feminino e
60% masculino. A variação das idades entre as amostras foi de 4 a 15 anos com
mediana em 8 anos. Os parâmetros do eritrograma estão, em média, dentro da
normalidade. Os valores: mediana e valor máximo de colesterol, valor máximo e
mediana de plaquetas, o valor máximo de VLDL e valor máximo e mediana de
triglicérides estão maiores que o desejável.
42
Tabela 2: Análise descritiva exploratória das variáveis do eritrograma e lipidograma da população (n=10).
Mínimo Máximo Amplitude
Total Mediana
Primeiro Quartil (25%)
Terceiro Quartil (75%)
Desvio Interquartílico
Idade (anos) 4 15 11 8 6,25 11 4,75
Hemácias (milhões/mm3) 4,3 5,57 1,27 4,775 4,62 5,12 0,5
Hemoglobina (mg/dL) 12,3 14,5 2,2 13,3 12,825 13,9 1,075
Hematócrito (%) 37,3 44,7 7,4 41,1 40,075 43,7 3,625
VCM (fL) 80,3 89,5 9,2 86,55 83,6 86,775 3,175
HCM (pg) 25,5 29,2 3,7 27,85 26,175 28,525 2,35
CHCM (%) 30,9 33,5 2,6 32,35 31,725 32,475 0,75
Plaquetas (103/mm3) 219 562 343 422,5 309,5 483,25 173,75
t-Colesterol 60 182 126 143 138,25 149,5 11,25
LDL (mg/dL) 30 101 71 67 55,75 71,5 15,75
HDL (mg/dL) 3 68 65 47 40,75 52,25 11,5
VLDL (mg/dL) 15 67 52 26,5 22 33 11
Triglicerídeos (mg/dL) 77 333 256 132,5 111,25 163,75 52,5
Fonte: Próprio autor.
43
5.3 Teste de normalidade exploratória Shapiro Wilk
A normalidade dos dados é verificação necessária para a escolha dos testes
estatísticos de comparação adequados para os dados. Destarte, o teste de
normalidade de Shapiro Wilk foi aplicado a todos os conjuntos de dados (Tabelas
3 e 4). O teste de normalidade Shapiro Wilk avalia se a variável aleatória se adere
a distribuição normal contra a hipótese alternativa de que a variável aleatória não
adere à distribuição Normal. A maneira mais fácil de tomar a decisão é observar o
valor-p dos testes e comparar com o nível de significância adotado. Se o valor-p do
teste for menor que o nível de significância escolhido, rejeita-se a hipótese de
normalidade. Os resultados mostraram distribuição não significativamente diferente
da normal para a maioria dos conjuntos de dados, entretanto as variáveis gênero,
t-colesterol, VLDL e triglicérides não apresentaram normalidade e, por isso, o
estudo optou por uma estratégia não paramétrica de análise.
44
Tabela 3:Teste de normalidade Shapiro Wilk dos parâmetros de ajuste das curvas de dependência da hemólise em linha de regressão de sigmoidal na presença e ausência do herbicida (n=10).
Sem herbicida Com herbicida
Amax Amin dX H50 dX/H50 Amax Amin dX H50 dX/H50
Média 1,0401 0,0831 0,0192 0,4503 0,0425 0,9831 0,0976 0,014 0,4442 0,0317
Desvio Padrão 0,1229 0,0345 0,0133 0,0116 0,0291 0,1971 0,0562 0,0079 0,0146 0,0186
W 0,9035 0,9609 0,9334 0,9204 0,9447 0,866 0,9244 0,8727 0,9538 0,8651
p 0,3 0,7699 0,4733 0,3977 0,5794 0,0944 0,421 0,1215 0,6858 0,0927
Fonte: Próprio autor.
45
Tabela 4:Teste de normalidade Shapiro Wilk das variáveis do eritrograma e lipidograma da população (n=10).
Média Desvio Padrão
W p
Idade (anos) 8,9 3,755 0,9388 0,5091
Gênero F (%) 0,4 0,5164 0,6402 0,0082
Hemácias (milhões/mm3) 4,879 0,4136 0,9224 0,4093
Hemoglobina (mg/dL) 13,36 0,7183 0,9558 0,7092
Hematócrito (%) 41,52 2,4156 0,9483 0,6214
VCM (fL) 85,32 3,0419 0,9168 0,3773
HCM (pg) 27,46 1,3962 0,9081 0,3269
CHCM (%) 32,19 0,7031 0,9489 0,6279
Plaquetas (103/mm3) 405,1 114,3799 0,9517 0,6609
t-Colesterol 141,3 32,9715 0,8109 0,0241
LDL (mg/dL) 65,4 18,8515 0,9631 0,7956
HDL (mg/dL) 45,3 18,0742 0,8783 0,154
VLDL (mg/dL) 30,5 15,0794 0,8223 0,0336
Triglicerídeos (mg/dL) 152,4 74,3448 0,818 0,03
Fonte: Próprio autor.
5.4 Teste de comparação de dois grupos de Wilcoxon
O teste de Wilcoxon é uma prova não paramétrica destinada à comparar dois
conjuntos de dados pareados cujos valores estejam em escala minimamente
ordinal, sendo o correspondente não paramétrico ao teste t-Student pareado.
O teste de comparação de ranks de Wilcoxon foi usado para comparar os
valores dos parâmetros de estabilidade dX e H50 com a intenção de avaliar o
impacto do caotrópico sobre a estabilidade celular. Os resultados não mostraram
46
diferenças significantes entre os valores de dx (p = 0,2411) e H50 (p = 0,2026)
(Gráfico 5 e Tabela 5)
Gráfico 5:Testes de comparação de dois grupos (com e sem caotrópico) de Wilcoxon: (a)teste de Wilcoxon para dx com e sem herbicida; (b) Teste Wilcoxon H50 com e sem herbicida
(a) (b)
Fonte: Próprio autor. Tabela 5: Teste de comparação de dois grupos de Wilcoxon.
Resultados Wilcoxon
dX H50
T = 16 15
Número de pares = 10 10
Z = 1,1722 1,2741
p-valor (bilateral) = 0,2411 0,2026 Fonte: Próprio autor.
47
5.5 Matriz de correlações Teste de Spearman
A busca de correlações entre as variáveis foi processada por meio do teste
de correlação de Spearman (𝜌). O teste de correlações de Spearman é um teste
livre de distribuição e tem o objetivo de avaliar o grau de associação linear entre
duas variáveis sendo ainda capaz de considerar ligeiras fugas da linearidade. Por
meio do coeficiente Rhô (𝜌) de Spearman é possível avaliar a existência de
associação entre as variáveis bem como a força e o sentido dessa associação.
Os resultados mostraram apenas uma correlação significante com os
parâmetros de estabilidade dX e H50. Apenas a hemoglobina (Hb) no grupo
intervenção teve relação significante (p = 0,0367) forte e inversa (ρ = -0,6975) com
o parâmetro dX (Tabela 6).
Correlações já conhecidas na literatura como a associação entre gênero,
idade, Col-t, HDL, LDL e triglicerídeos com os parâmetros de estabilidade, não
foram verificadas.
Tabela 6:Correlações de Spearman entre os parâmetros de estabilidade dX e H50 com as variáveis do eritrograma, lipidograma e gênero e idade.
Ausência do caotrópico
Presença do caotrópico
dX H50 dX H50
Gênero Spearman Corr. 0.35533 0.4264 0.54772 0.49747
Gênero Sig. 0.31364 0.21914 0.12687 0.14346
Idade (anos) Spearman Corr. 0.28049 -0.10976 -0.26892 -0.11586
Idade (anos) Sig. 0.43246 0.76278 0.48412 0.74994 Hemácias (mi/mm³)
Spearman Corr. 0.09091 0.32121 -0.55 -0.21212
Hemácias (mi/mm³) Sig. 0.80277 0.36547 0.12498 0.55631
Hb (mg/dL) Spearman Corr. 0.29879 0.2622 -0.6975 -0.13415
Hb (mg/dL) Sig. 0.4017 0.46427 0.03672 0.71177
Ht (%) Spearman Corr. 0.29787 0.32827 -0.65 -0.1459
Ht (%) Sig. 0.4032 0.35442 0.05807 0.68756
VCM (fL) Spearman Corr. -0.05455 0.07879 0.35 0.04242
VCM (fL) Sig. 0.88104 0.82872 0.35582 0.90736
HCM (pg) Spearman Corr. -0.0304 -0.231 0.24268 0.02432
HCM (pg) Sig. 0.93357 0.52079 0.52924 0.94684
48
CHCM (%) Spearman Corr. 0.07927 -0.38415 0.03361 -0.08537
CHCM (%) Sig. 0.82768 0.27308 0.93159 0.81461 Plaquetas (10³/mm³)
Spearman Corr. 0.05455 0.11515 0.23333 0.24848
Plaquetas (10³/mm³) Sig. 0.88104 0.75142 0.5457 0.48878
t-Col (mg/dL) Spearman Corr. 0.01824 0.28572 -0.38494 0.10942
t-Col (mg/dL) Sig. 0.96012 0.42357 0.3063 0.76348
LDL (mg/dL) Spearman Corr. -0.01818 0.23636 -0.38333 -0.11515
LDL (mg/dL) Sig. 0.96024 0.51089 0.30849 0.75142
HDL (mg/dL) Spearman Corr. -0.29787 -0.13982 -0.24268 0.01824
HDL (mg/dL) Sig. 0.4032 0.70006 0.52924 0.96012
VLDL (mg/dL) Spearman Corr. 0.2614 0.24316 0.00837 0.13374
VLDL (mg/dL) Sig. 0.46568 0.49843 0.98295 0.71262 Triglicerídeos (mg/dL)
Spearman Corr. 0.27273 0.18788 0.01667 0.12727
Triglicerídeos (mg/dL) Sig. 0.44584 0.60322 0.96605 0.72606
Fonte: Próprio autor.
6 DISCUSSÃO
A análise descritiva exploratória destacou alguns valores fora do intervalo de
referência do laboratório, entretanto essas variações não induziram os resultados.
Os resultados do teste de Shapiro Wilk mostraram distribuição não
significativamente normal para conjuntos de dados já citados na literatura
(BERNARDINO-NETO, 2011), amostras pequenas dificilmente conseguem provar
normalidade (TORMAN; COSTER; RIBOLDI, 2012).
Devido a isso optou-se por uma estratégia não paramétrica de análise, a qual
não pressupõe que os dados tenham distribuição normal. O teste de Wilcoxon, não
permitiu que fosse rejeitada a igualdade dos grupos (p>0,05), mas não se pode
descartar os efeitos crônicos do pesticida analisado.
A matriz de correlação de Spearman apresentou uma correlação forte,
inversa e significante para Hemoglobina e dX. O autor Bernardino -Neto (2011),
encontrou essa correlação, eliminou a influência de variáveis externas moduladoras
e a correlação permaneceu.
49
Correlações esperadas já vistas na literatura entre dX e H50 com idade,
gênero, colesterol total, HDL, LDL não foram encontradas e acredita-se que seja
por causa do tamanho da amostra.
Se reconhece que essa pesquisa teve limitação primordial de tempo. Foram
nove meses de pesquisa teórica e prática, os testes não foram iniciados até a
autorização do Comitê de Ética, não foi possível analisar mais indivíduos pelo
tempo, não foi possível fazer os testes de fragilidade com a variação da
concentração de glifosato conforme era previsto.
7 CONCLUSÃO
Esse estudo não conseguiu provar que a concentração de glifosato de 25
µL/dL seja capaz de desestabilizar a célula, entretanto não se pode garantir que
essa concentração não seja capaz de desestabilizar a célula em efeito crônico.
Sugere-se que outros estudos sejam realizados.
50
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Figura 12: Glifosato e palavras chave.
Fonte: Autoria própria.
A Figura 12 é o resultado de uma busca na base de dados Scopus com o
termo Glyphosate, a partir dos documentos obtidos realizou-se uma exportação dos
dados para o software VOSviewer para uma análise geral do assunto. O tamanho
dos círculos e das letras correspondem a maior ou menor relação com o termo
pesquisado, então observou-se a relação dos mais relacionados e foi a base de
estudo para esse trabalho.
9 AGRADECIMENTO
Agradecimento ao apoio dado pela Secretaria Municipal de Saúde da
Prefeitura de Lorena.
51
REFERÊNCIAS
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ENCONTRO NACIONAL DE AGROECOLOGIA, 48 p, Rio de Janeiro, 2014,
Disponível em: <scientiaestudia,org,br/radar/rss_2014_05,doc> Acessado em: 29
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sobre tecnologia e agricultura familiar no noroeste do Estado do Rio Grande
do Sul. Revista Contexto e Educação (2013).
ANVISA. Monografia do Glifosato. n. 1, p. 3–6, 2015.
BATCHELOR, H. K.; MARRIOTT, J. F. Formulations for children: Problems
and solutions. British Journal of Clinical Pharmacology, v. 79, n. 3, p. 405–418,
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BENACHOUR, N.; SÉRALINI, G. E. Glyphosate formulations induce
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BOMBARDI, L. M. Atlas: Geografia do Uso de Agrotóxicos no Brasil e
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BRASIL. CâMARA DOS DEPUTADOS. Projeto de Lei no 6670/2016, 2016.
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<http://www.camara.gov.br/proposicoesWeb/prop_mostrarintegra;jsessionid=9DA
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BRASIL. Constituição da República Federativa do Brasil. Texto
constitucional originalmente publicado no Diário Oficial da União de 5 de
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BRASIL. Relatório Nacional de Vigilância em Saúde de Populações
Expostas a Agrotóxicos: Agrotóxicos na ótica do Sistema Único de Saúde.
2016.
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