BIOLOGIA MOLECULAR QUESTIONARIOS E PRATICAS

Universidade de So Paulo Instituto de Qumica

Biologia Molecular QBQ3401 Qumica-Noturno

2009

Professora: Nadja Cristhina de Souza Pinto

Monitores: Carolina Domeniche Romagna Dbora da Silva Freitas

QBQ-3401 / Biologia Molecular 2008

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QBQ-3401 Biologia Molecular

Qumica-Noturno - 2009

DOCENTE RESPONSVEL: Prof. Nadja Cristhina de Souza Pinto (sala 1065 Bloco 10 superior)

MONITORES: Carolina D. Romagna (sala 1065 Bloco 10 superior) Dbora da Silva Freitas (sala Bloco

HORRIO E SALAS: Aulas Expositivas e Exerccios (Discusso): 6as feiras das 19 s 22:40h - Sala 10 - Bloco 6 inferior Aulas Prticas: 6as feiras das 19 s 22:40h - Laboratrio Didtico - Bloco 7 superior

ORGANIZAO DO CURSO: O Curso envolve aulas expositivas, perodos para resoluo e discusso de exerccios e aulas prticas. Utilizando as informaes das aulas expositivas e a bibliografia recomendada, os alunos devero resolver os exerccios e entregar as resolues professora. Os exerccios sero discutidos em sala de aula com acompanhamento da professora e das monitoras.

Nas aulas prticas sero realizadas experincias que envolvem algumas tcnicas bsicas utilizadas em Biologia Molecular. Os alunos sero divididos em grupos e cada grupo dever apresentar um RELATRIO contendo os resultados obtidos e a resoluo das questes correspondentes. S sero aceitos relatrios de alunos que realizaram as aulas prticas. POR RAZES DE SEGURANA, O USO DO AVENTAL NAS AULAS PRTICAS OBRIGATRIO.

AVALIAO: A avaliao ser feita atravs da mdia ponderada das notas obtidas nas duas provas (P1, P2), nos quatro relatrios (R) e nos exerccios (E), de acordo com a frmula abaixo:

Nota final= (P1 x 2) + (P2 x 2) + (mdia dos 4 relatrios)+ (mdia dos exerccios) 6

A matria das provas ser CUMULATIVA. No final do curso, ser oferecida uma prova substitutiva para alunos que tenham sido impossibilitados de fazer uma das provas por motivo de doena, que incluir toda a matria do curso. Um atestado mdico dever ser entregue neste caso. O peso da prova substitutiva ser igual ao da prova perdida.

Os alunos que no atingirem Nota Final 5,0, porm atingirem 3,0 e 75% de frequncia podero realizar a prova de recuperao, que ser administrada em fevereiro 2010.

A FREQUNCIA OBRIGATRIA MINMA S AULAS DE 75%.


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CRONOGRAMA QBQ-3401

21/8 Aula1 - Introduo Biologia Molecular. Estrutura e Funo dos cidos Nuclicos. Exerccio 1

28/8 Aula 2 - Replicao do DNA. Exerccio 2 04/9 Experincia 1: Extrao de DNA de E. coli 11/9 Aula 3 - Mutao e Reparo de DNA. Exerccio 3 18/09 Aula 4 - Estrutura gnica e Transcrio. Exerccio 4 25/09 Experincia 2: Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) para deteco

de genes 02/10 Aula 5 - Cdigo Gentico. Exerccio 5 09/10 Prova 1 16/10 Aula 6 - Processamento do RNA e Traduo/Sntese de Protenas.

Exerccio 6 23/10 Aula 7 - Regulao da Expresso Gnica. Exerccio 7 30/10 Experincia 3: Transformao de bactrias com plasmdeos 06/11 Aula 8 - Transduo de Sinal e Cncer. Exerccio 8 13/11 Aula 9 - Tecnologia do DNA recombinante. Exerccio 9 20/11 CONSCINCIA NEGRA No haver aula 27/11 Experincia 4: Induo de Beta-galactosidase com IPTG 04/12 Prova 2 11/12 Prova substitutiva

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA:

Ingls: Biochemistry - D. Voet & J.G. Voet - John Wiley & Sons 3rd edition. 2004. Biochemistry J. M. Berg, J.L. Tymoczko & L. Stryer. W.H.Freeman 6th edition - 2006. Genes IX Lewis, B. Jones & Bartlett Publishers; 9th edition. 2007 Lehninger Principles of Biochemistry - D.L. Nelson & M.M. Cox. Worth Publishers 4th edition 2004. Molecular Biology of the Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. 5th Edition - 2003

Portugus: Bases Moleculares da Biotecnologia. A.H.Ulrich, W. Coli; P.L.Ho;M. Faria;C.A. Trujillo. Editora Roca.1 Edio. 2008 Biologia Molecular Bsica A. Zaha. Editora Mercado Aberto. - 3a edio. 2003 Biologia Molecular do Gene. James D. Watson, Nancy H. Hopkins, Jeffrey W. Roberts, Joan Argetsinger Steitz ,Alan M. Weiner. Editora Artmed. 5a edio. 2006 Bioqumica - L. Stryer - Editora Guanabara Koogan - 5a edio. - 2004. Fundamentos de Bioqumica D. Voet, J. G. Voet & C. W. Pratt Editora Artmed. 3a edio. 2006. Princpios de Bioqumica - A.L. Lehninger, D.L. Nelson & M.M. Cox. Editora Sarvier -4a edio. 2007.


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Exerccios


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Exerccio 1. Estrutura e Funo dos cidos Nucleicos

1.Quais as diferenas de composio e estrutura entre RNA e DNA. Como se distingue entre uracila e timina, e entre ribose e desoxirribose?

2. RNA facilmente hidrolizado por lcali, enquanto DNA no o . Por que?

3.Escreva a seqncia de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma fita com a seqncia:

(5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3') Exprima, em porcentagem, a composio de bases do DNA de fita dupla.

4. Uma molcula de cido nucleico tem a composio de bases abaixo. O que voc pode afirmar sobre esta molcula?

C = 24,1% G = 18,5% T = 24,6% A = 32,8%

5. Explique por que cidos nucleicos so desnaturados quando submetidos a alta temperatura ou pHs extremos? Uma molcula de DNA desnaturada por aquecimento pode ser renaturada? Como?

6. O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a frmula: Tm = 69,3 + 0,41(%GC), onde GC a porcentagem de Guanina + Citosina

a) DNA de E. coli contm 50% GC. Calcular o Tm para o DNA desta bactria. b) As curvas de fuso da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm normalmente maior do que 65oC. Por que isto importante para a maioria dos organismos? c) Como varia o Tm com a fora inica da soluo? d) O que acontece com Tm quando se adiciona etanol soluo de DNA?

7. Quais das seguintes afirmaes sobre o DNA isolado de um cromossomo eucaritico so corretas? - resistente quebra durante a extrao por seu grande tamanho. - linear e no ramificado - uma molcula nica - Pode ter tamanho superior a 100 Mb

8. O ncleo de uma clula humana tem 6m de dimetro e a extenso total do DNA dos seus 46 cromossomos soma 1,8m. Como resolvida a discrepncia entre estas duas grandezas?


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Exerccio 2. Replicao do DNA

1. Combine as caractersticas da coluna da direita com o tipo de hlice do DNA da coluna da esquerda

(a) A-DNA (1) As pirimidinas esto na configurao anti (b) B DNA (2) Os fosfatos na cadeia esto em ziguezague (c) Z-DNA (3) A sua formao favorecida por superenovelamento negativo (4) Apresenta um sulco maior relativamente largo e profundo (5) Apresenta uma estrutura helicoidal no sentido dextrgiro (6) Tem 10,4 pares de bases por volta (7) Tem a estrutura similar quela do RNA de fita dupla (8) As fitas na hlice so anti-paralelas

2. Descreva o experimento de Meselson-Stahl. Qual seria o resultado deste experimento se a replicao do DNA fosse conservativa?

3. Combine as propriedades ou funes na coluna direita com a DNA polimerase na coluna da esquerda: (a) DNA polimerase I (1) envolvida na replicao (b) DNA polimerase II (2) requer um iniciador e um molde (c) DNA polimerase III (3) envolvida no reparo de DNA (4) sintetiza a maior parte do DNA durante a replicao (5) remove o iniciador e preenche as lacunas durante a replicao

4. O fragmento de DNA no esquema abaixo de fita dupla em ambas as extremidades, porm de fita simples no meio. As extremidades da fita superior esto indicadas.

5'____________________________3' __________P HO_________

a) O fosfato (P) indicado na fita inferior est na extremidade 5' ou 3' do fragmento ao qual ele pertence ? (Indique no esquema). b) Como voc esperaria que a lacuna fosse preenchida pelos processos de reparo do DNA "in vivo" ? c) Quantos fragmentos voc esperaria encontrar na fita inferior se o experimento fosse realizado "in vitro", na presena de todos os desoxirribonucleotdeos-trifosfato e DNA polimerase, mas na ausncia de DNA ligase?

5. Explique porque certas variedades mutantes da DNA polimerase I podem apresentar atividade de DNA polimerase praticamente ausente, mas podem ter atividade de exonuclease 5' 3' praticamente normal.

6. Qual a atividade da DNA polimerase III que responsvel pela editorao durante a replicao? Por que essa atividade importante?

7. Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que a duas fitas no podem ser replicadas pelo crescimento no mesmo sentido (como mostra a figura abaixo)? Como a clula supera o problema? Esquematize a formao da ligao fosfodiester durante a replicao a partir do nucleotdeo trifosfato livre, mostrando o grupo fosfato que incorporado.


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8. A tcnica de PCR (polymerase chain reaction) utilizada para obter grandes quantidades de DNA a partir de amostras contendo quantidades nfimas de DNA. a) Descreva os passos envolvidos nesta tcnica. b) Quais as caractersticas da DNA polimerase utilizada? Porque essas caractersticas so fundamentais ao desenvolvimento dessa tcnica? c) Exemplifique aplicaes desta tcnica.


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Exerccio 3. Mutao e Reparo do DNA

1. Quais os principais tipos de reparo de exciso e qual a especificidade de leses de cada via?

2. Descreva brevemente as etapas de reparo do DNA lesado por luz UV e as enzimas nelas envolvidas.

3. Como os dmeros de timina podem ser diretamente removidos do DNA?

4. Como a maquinaria de reparo de E. coli identifica a fita de DNA que tem um nucleotdeo no complementar incorporado durante a replicao?

5. Bromouracila um mutagnico que produz troca de bases, enquanto acridina causa adies ou delees de uma base no DNA. Mutaes causadas por acridina frequentemente podem ser compensadas por mutaes secundrias, distantes vrios nucleotdeos da primeira mutao, enquanto aquelas causadas por bromouracila geralmente requerem mudanas dentro do mesmo codon. Explique.

6. Explique como algumas cepas da bactria Salmonella so usadas para detectar substncias carcinognicas. Por que extrato de fgado de mamfero est envolvido no teste?

7. Que propriedade da DNA polimerase I responsvel pela observao de que bactrias mutantes polA1 so mais sensveis luz ultravioleta ? Explique.

8. Por que a taxa de mutacao observada em E.coli de 10-8 a 10-10 / par de bases replicado, apesar das taxas de erro da Pol I e Pol III serem de 10-6 a 10-7 /par de bases replicado?


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Exerccio 4. Estrutura gnica e Transcrio

1. Genes de eucariotos so geralmente constitudos de introns e exons. Estas seqncias so tanto transcritas como traduzidas? A remoo dos ntrons (splicing) tem que ser um processo extremamente preciso. Por que? D um exemplo de "splicing" aberrante que leva a um tipo de talassemia em humanos.

2. As DNA polimerases necessitam de um iniciador, ao qual se liga um novo nucleotdeo para o crescimento da cadeia polinucleotdica. necessrio um iniciador para a ao da RNA polimerase?

3. Que subunidades da RNA polimerase bacteriana so necessrias para a iniciao da transcrio a partir de um promotor? E para a terminao da transcrio? Explique como uma mutao poderia dar origem a uma E. coli resistente ao antibitico rifamicina.

4. A seguinte fita simples de DNA vai se transcrita in vitro:

5'- ATGTACCGAAGTGGTTT - 3'

Coloque os grupos fosfato e um asterisco naqueles que sero radiativos quando a transcrio for feita na presena de [ 32P]-ATP (a?) b) Faa o mesmo para [32P]-UTP

5. Defina "promotor", enumere as suas propriedades e diga como podem ser localizados atravs da tcnica de "footprinting".

6. Combine as descries na coluna da direita com a RNA pol DNA-dependente eucaritica apropriada: a) RNA pol I (1) localizada no nuclolo (2) localizada no nucleoplasma (3) sintetiza hnRNA b) RNA pol II (4) sintetiza tRNA (5) sintetiza rRNA

(6) sintetiza precursores do rRNA c) RNA pol III (7) inibida por -amanitina (8) sintetiza RNA na direo 5'-3' (9) composta de vrias subunidades

7. Voc usaria num paciente, como agente teraputico anti-bacteriano, qual destes antibiticos: a) rifamicina ou b) actinomicina D ? Justifique a sua escolha.

8. Quais as principais caractersticas das seqncias de promotores de genes eucariticos transcritos em mRNAs? Qual a funo dos fatores de transcrio e enhancers?


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Exerccio 5: O Cdigo Gentico

1. No desenho abaixo, da esquerda para a direita, indique as pontas 5' e 3' em cada uma das fitas. Selecione uma das opes abaixo e explique o porqu de suas escolhas:

fita codificadora de DNA ___________________________________________________

fita complementar ou fita molde de DNA ___________________________________________________

fita de mRNA ___________________________________________________

fita de tRNA (anticdon para Metionina)

2. Faa um x no cido nucleico (pode ser mais de um) que corresponde aos conceitos abaixo:

cdigo gentico ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA cdon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA anti-cdon ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA moldura de leitura ( ) DNA ( ) mRNA ( ) rRNA ( ) tRNA

3. Baseando-se na lista de cdons e amino cidos abaixo, quais das seguintes afirmaes so corretas? AGU = serina AGC = serina AAG = lisina AAA = lisina AUG = metionina AUA = isoleucina a) O cdigo gentico degenerado b) A alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons poderia levar substituio de uma isoleucina por uma lisina no polipeptdeo. c) A alterao de um nico nucleotdeo no DNA que dirige a sntese destes cdons necessariamente levaria substituio de um aminocido no polipeptdeo codificado.

4. Um tRNA com o anticdon ACU se ligaria a um ribossomo na presena de um dos cdons da questo 3. Qual? Olhando a tabela ao final deste exerccio faa a previso do anti-cdon para terminao da traduo e a seqncia das bases correspondentes no DNA codificador .

5. Uma globina de 146 aminocidos sofreu uma mutao no cdon correspondente ao sexto aminocido da cadeia (ver tabela ao final do exerccio). A anlise do DNA indicou uma mudana de TTC para TAC na fita molde. Pergunta- se:


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a) A mutao provocou a troca de um aminocido por outro? Em caso afirmativo, quais so estes aminocidos? b) Quais as implicaes para a estrutura da protena?

6. Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. coli tem a seguinte sequncia 5'...AGGTTACCTAGTTGC...3' Qual a sequncia do polipeptdeo que seria codificado pelo mRNA sintetizado na questo 3 (no intendi!). Assuma que o quadro de leitura comea com o primeiro nucleotdeo.

7. Abaixo est anotado o gene completo da insulina como se encontra no Banco de dados NCBI. Para facilitar a leitura e a contagem, h um nmero que denota a primeira base da fila e as bases esto separadas por um espao colocado a cada 10 bases. O cdon de iniciao e o cdon de terminao esto sublinhados e em negrito. Qual o nmero de aminocidos na protena resultante da transcrio desta seqncia? Explique porque.

1 gctgcatcag aagaggccat caagcacatc actgtccttc tgccatggcc ctgtggatgc 61 gcctcctgcc cctgctggcg ctgctggccc tctggggacc tgacccagcc gcagcctttg 121 tgaaccaaca cctgtgcggc tcacacctgg tggaagctct ctacctagtg tgcggggaac 181 gaggcttctt ctacacaccc aagacccgcc gggaggcaga ggacctgcag gtggggcagg 241 tggagctggg cgggggccct ggtgcaggca gcctgcagcc cttggccctg gaggggtccc 301 tgcagaagcg tggcattgtg gaacaatgct gtaccagcat ctgctccctc taccagctgg 361 agaactactg caactagacg cagcccgcag gcagcccccc acccgccgcc tcctgcaccg 421 agagagatgg aataaagccc ttgaaccagc

8. O gene de uma protena, cuja seqncia parcial est indicada abaixo, sofreu uma srie de mutaes pontuais independentes, o que levar produo de diferentes RNAs mensageiros, Indique a seqncia de aminocidos do peptdeo correspondente (a tabela se encontra no fim dos exerccios) e explique a conseqncia do tipo de mutao que ocorreu em cada um dos RNAs resultantes.

5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUGGCUUGUAACU....3' (a) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGGGGCUUGUAACU....3' (b) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCAUGGCUUGUAACU.....3' (c) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUCGCUGUAUACU......3' (d) 5'UUCACACAGGAAACAGCUAUGCGAAGCGUUGGCUUGUAACU....3'


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Exerccios 6. Sntese de protenas

1. Considere a seguinte sequncia de um fragmento de DNA isolado de bactria: 5'CTGATAAGGGATTTAAATTATGTGTCAATCACGAATGCTAATCGCTTAACACTTC 3'

a) Assumindo que esta seqncia corresponde seqncia da fita codificadora, qual seria a seqncia de aminocidos do polipeptdeo produzido quando um mRNA transcrito deste gene for traduzido? Que caractersticas na seqncia do mRNA determinam qual o cdon iniciador? Considere a primeira base como o incio da transcrio.

b) De acordo com o princpio de oscilao no pareamento de bases ("wobble"), qual o nmero mnimo de tRNAs necessrio para decodificar os seis cdons de leucina - UUA, UUG, CUU, CUC, CUA e CUG ? Explique.

2. Num sistema de sntese de protenas in vitro, que permita o incio e trmino da sntese em qualquer seqncia de RNA, que peptdeo seria produzido pelo poli-ribonucleotdeo 5'-UUUGUUUUUGUU-3'? Indique qual o aminocido N-terminal e o C-terminal do polipeptdeo obtido.

3. O cdon AUG funciona tanto para iniciar uma cadeia polipeptdica quanto para dirigir a incorporao de uma metionina em posies internas de uma protena. Quais os mecanismos de seleo do cdon AUG para a iniciao da traduo em procariotos?

4. No que consiste a sequncia de Shine Dalgarno? Ela universal? Explique.

5. Escreva os produtos finais das seguintes reaes: a) valina + ATP + tRNAVal + valil-tRNA sintetase b) valina + ATP + tRNAIle + isoleucil-tRNA sintetase

6. Explique quais so os mecanismos de ao dos antibiticos que agem na clula procaritica. Se muitos antibiticos exercem sua ao por inibio da sntese protica, como alguns destes antibiticos podem ser usados em humanos para combater infeces microbianas sem causar efeitos txicos devido inibio da sntese protica eucaritica?

7. O que se entende por chaperona?

8. Quais eventos podem acontecer com uma protena depois de terminada sua sntese?


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Exerccio 7. Regulao da Expresso Gnica

1. Compare a expresso gnica em procariotos e eucariotos quanto a: a) grau de acoplamento da transcrio e da traduo. b) nmero de produtos gnicos em um transcrito primrio. c) nmero de protenas resultantes da traduo de um transcrito primrio. d) proporo de seqncias codificadoras no DNA. e) organizao de genes em operons.

2. Defina expresso gnica constitutiva. Compare expresso gnica induzida com represso gnica. Use o esquema proposto por Jacob e Monod para o operon da lactose e defina os termos operon, gene estrutural, gene regulador, operador, promotor, indutor, repressor e co-repressor.

3. Numa cultura de E.coli em um meio contendo tanto lactose quanto glicose, qual dos acares metabolizado preferencialmente? Qual o mecanismo que permite esta seletividade? O que acontece quando a glicose se esgota durante o crescimento da bactria?

4. Para o cultivo de E.coli utilizaram-se meios contendo alm dos sais necessrios, os componentes: a) lactose d) glicose + cAMP b) lactose + glicose e) lactose + glicose + cAMP c) glicose

Analise a produo de - galactosidase em cada caso, justificando a resposta segundo o modelo de Jacob e Monod.

5. Qual o efeito da deleo do gene regulador do operon lac? Haveria outro tipo de mutao resultando no mesmo efeito?

6. Um mutante incapaz de crescer tanto em galactose quanto em arabinose, alm de diversas outras fontes de carbono, foi isolado de uma cultura de E. coli do tipo selvagem. Que tipo de mutao pode ter produzido estes resultados?

7. Demonstrou-se que o operon para a biossntese do aminocido fenilalanina de certa bactria regulado por um mecanismo de atenuao. O que pode ser afirmado sobre a seqncia de aminocidos do peptdeo lder para este operon? Explique.

8. A cromatina que ativa transcricionalmente (eucromatina) tem estrutura dispersa, enquanto a cromatina que inativa (heterocromatina) compacta. Quando ncleos de clulas de galinha produzindo globina foram tratados brevemente com DNase pancretica, os genes de globina de adultos foram seletivamente destrudos, mas os genes para globina embrinica e ovalbumina permaneceram intactos. Quando os ncleos de clulas de oviduto foram tratadas com DNase, os genes de ovalbumina foram destrudos. Explique estes resultados.


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Exerccio 8. Transduo de Sinal e Cncer

1. Descreva o mecanismo de ativao: a. das Protenas G pelos receptores serpentina b. da Protena Quinase A por cAMP

2. O que so protooncogenes e oncogenes? Que tipos de protenas estes genes podem codificar?

3. A protena c-src homloga protena viral oncognica conhecida com v-src e atua como tirosina quinase citosslica, cuja atividade regulada por fosforilao. Qual a caracterstica de v-src que a torna uma protena oncognica.

4. Qual o tipo de modificao covalente reversvel em protenas mais frequente nas cascatas de sinalizao intracelular? Quais so as enzimas que catalisam esta modificao?

5. O cAMP (AMP cclico) um importante mensageiro secundrio para muitos hormnios. Como pode ocorrer a ativao da enzima adenilato ciclase aps ativao de um receptor hormonal?

6. Como a transcrio de certos genes pode ser influenciada em resposta a um sinal extracelular?

7 A predisposio ao cncer pode ser hereditria. Explique este fato lembrando-se que existem protenas que agem como supressores do crescimento celular.

8. Retinoblastoma, um cncer de retina que aflige crianas, est asssociado a uma deleo no cromossomo 13. Proponha uma possvel funo para o gene selvagem (Rb) e que codifica uma protena de 105 kD localizada no ncleo e capaz de se ligar ao DNA.


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Exerccio 9. Tecnologia do DNA recombinante

1. A figura na pgina seguinte mostra o autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA pelo mtodo de Sanger. Escreva a seqncia deste fragmento de DNA lendo o gel de baixo para cima. Traduza a seqncia obtida, considerando as trs fases de leitura. O que aconteceria se durante a leitura do gel voc tivesse omitido uma base? Como voc faria para ter segurana absoluta da seqncia deste fragmento de DNA?

2. O que a diferencia a tcnica de Southern blot da tcnica de Northern blot?

3. Voc gostaria de analisar os nveis de expresso do gene que codifica a protena A de um fungo em resposta ao estresse hipertrmico. Que metodologias poderia utilizar? Por outro lado, se voc quiser analisar simultaneamente os nveis de expresso de milhares de genes deste fungo na mesma condio, qual seria a metodologia mais adequada?

4. Qual a diferena entre uma biblioteca genmica e uma biblioteca de cDNA? Explique como a presena de ntrons em genes eucariticos complica a gerao de produtos proticos que eles codificam quando a expresso feita em bactria. Como se pode resolver este problema?

5. A partir de uma biblioteca de cDNA voc isolou um cDNA completo que codifica para uma protena que um potente estimulador do sistema imunolgico. Agora voc deseja clonar este cDNA em um vetor de expresso para produzir grande quantidade desta protena em E. coli. O cDNA possui nas suas extremidades stios para enzima BamHI e voc planeja clon-lo no stio de BamHI do vetor de expresso. Esta sua primeira vez com experimentos de clonagem e voc decide seguir cuidadosamente as instrues do manual de clonagem que recomenda que o vetor digerido deve ser tratado com fosfatase alcalina para remover o fosfato da extremidade 5.

a) Por que deve ser feito o tratamento com fosfatase alcalina? b) Como voc analisaria se a clonagem foi bem sucedida? c) A protena de seu interesse afeta o crescimento das bactrias. Como voc faria para obter grande quantidade desta protena recombinante?


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G A T C


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6. O gene completo (contendo todos os exons e ntrons) do hormnio de crescimento de ratos pode ser expresso em camundongos sob o controle de um promotor indutvel por Cd2+. Como podem ser obtidos tais camundongos transgnicos? Quais as suas caractersticas? Como voc explica o fato da expresso do gene do rato ser expresso perfeitamente em camundongos?

7. Planeje a obteno de cabras transgnicas que possam produzir o hormnio de crescimento humano em seu leite.

8. H poucos anos, cientistas europeus realizaram a clonagem de uma ovelha (Dolly), a partir de clulas de uma ovelha adulta. Compare este tipo de experincia com a obteno de um animal transgnico.


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ROTEIRO PARA AS AULAS PRTICAS


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ROTEIRO PARA AULAS PRTICAS

RECOMENDAES:

1. Por razes de segurana no ser permitido ao aluno frequentar as aulas sem avental. PROIBIDO COMER, BEBER E FUMAR NO LABORATRIO.

2. Leia com detalhe o protocolo e preste ateno s instrues fornecidas antes de iniciar a experincia.

3. Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponveis com cuidado, para evitar desperdcio e quebra.

4. Mantenha sua rea de trabalho organizada. Ao terminar a experincia passe gua na vidraria utilizada e coloque-a no local indicado.

5. O relatrio individual dever ser entregue no final de cada uma das aulas prticas. O relatrio dever ser feito de acordo com modelo ao final de cada protocolo experimental. Aps preenchidas, as respectivas folhas devem ser destacadas e entregues.

6. Qualquer dvida ou acidente pea auxlio s tcnicas, s monitoras ou professora.

USO DO AVENTAL NAS AULAS PRTICAS OBRIGATRIO.


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EXPERINCIA No.1: EXTRAO DE DNA (E RNA) DE Escherichia coli.

Fundamento

Freqentemente necessria a purificao de DNA de alto peso molecular para sua manipulao e anlise subsequentes. Procedimentos mais comuns para preparao de DNA genmico bacteriano consistem na lise das bactrias com a utilizao de lisozima e/ou detergente, seguida de extraes com solventes orgnicos (fenol/clorofrmio) para remoo de protenas. Os cidos nuclicos so ento precipitados com etanol na presena de concentraes relativamente altas de sal (0,1M 0,5M). Na obteno de DNA de alto peso molecular (molcula longa e fibrosa) devem ser tomados cuidados para se evitar sua fragmentao.

Material - 2 Tubos de ensaio mdio

- 1 Proveta de 50 mL

- 1 clice graduado

- 1 basto de vidro

- 1 tubo de centrifuga

- 1 recipiente de descarte c/ lisoforme

- 10 mL de SDS 10%

- 10 mL de NaCl 1%

- 1 frasco de Clorofrmio c/ lcool Isoamlico na Capela - 1 frasco de Etanol no freezer -20 C

Procedimento Experimental

Ser utilizada uma cultura de bactrias E.coli HB101 que foi inoculada ontem no final da tarde em meio de cultura lquido esterilizado (meio LB: triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 1%, pH final ajustado para 7,5 com NaOH) e mantida sob agitao vigorosa a 37C at hoje pela manh, quando a cultura foi transferida para a geladeira.

1. Coletar as bactrias pela centrifugao de 20mL da cultura a 5000rpm por 5 min. Descartar o meio de cultura em um frasco contendo Lisoform a 10 %. Secar bem o tubo, invertendo-o sobre papel absorvente. Balancear os tubos!

2. Adicionar 6mL da soluo I (citrato de sdio 0,015M, NaCl 0,15M, pH final ajustado para 7,0 com HCl). Tampar o tubo e ressuspender o precipitado de bactrias por inverso.

3. Remover a tampa e adicionar 0,7mL da soluo II [Dodecil Sulfato de Sdio (SDS) 10% (m/V)]. Fechar o tubo e incub-lo em banho-maria a 60C por 10 min, com agitao manual suave.

4. Retirar o tubo do banho, abrir e deix-lo a temperatura ambiente por 5min. Adicionar igual volume (6,7mL) da soluo III (Clorofrmio:alcool isoamlico 24:1 V/V). No pipetar com a boca! Fechar muito bem o tubo. Agitar suavemente por 10 min temperatura ambiente. Esta etapa deve ser realizada na capela de exausto.


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5. Centrifugar 5 minutos a 5000 rpm.

6. Remover delicadamente a fase aquosa (fase superior) com pipeta Pasteur de ponta grossa para uma proveta. Estimar o volume e transferir para um clice graduado.

7. Medir, na mesma proveta, 2 volumes de etanol resfriado a -20C e adicion-lo lentamente com pipeta Pasteur, pela parede do clice.

8. "Enrolar" o DNA com uma pipeta Pasteur de ponta curva. Transfer-lo para um tubo de ensaio contendo 10mL de Soluo IV (NaCl 1%). Aquecer a 50oC, por 10-20 minutos, at completa dissoluo.

9. Identificar o tubo com o nmero do grupo. Tomar uma alquota e diluir em 1 mL de gua. Medir a D.O.260nm e D.O.280nm e calcular a relao D.O.260nm /D.O.280nm. Estimar a quantidade de DNA obtida assumindo que D.O.260nm (Densidade ptica a 260nm) = 1 equivale a 50g DNA/mL.


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RELATRIO - EXPERINCIA No.1

Grupo No. Data Nomes dos Integrantes do Grupo:

OBJETIVO DA EXPERINCIA:_________________________________________ _____________________________________________________________________

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RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________ _____________________________________________________________________

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QUESTES:

1. Qual a funo do SDS, Clorofrmio: lcool Isoamlico e Etanol nas etapas da purificao? Consultar tabela (no fim da apostila).

2. Por que possvel "enrolar" o DNA no basto de vidro?

3. Cite dois cuidados importantes para o sucesso da experincia realizada.

4. Se compararmos as medidas de absoro a 260nm e a 280nm da amostra de DNA obtida e de uma soluo de DNA puro obtido a partir do mesmo volume inicial de cultura de bactrias, o que observaramos? Por que?


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5. Qual o espectro de absoro do DNA na luz ultravioleta. Como se compara com o espectro de absoro de albumina?

6. Como voc faria para obter DNA puro a partir dessa preparao que contm DNA e RNA?

7. Por que ocorre o efeito hipercrmico na desnaturao do DNA?


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EXPERINCIA No. 2: TRANSFORMAO DE BACTRIAS COM PLASMDEOS CONTENDO GENES DE RESISTNCIA A ANTIBITICOS.

Fundamento

A tcnica de transformao permite a introduo de plasmdeo em uma bactria e sua manuteno como um elemento autnomo auto-replicativo. Este plasmdeo pode conferir bactria hospedeira certas propriedades (por exemplo, resistncia a drogas) que podem ter valor seletivo no meio. Vrias tcnicas so disponveis para transformar uma bactria. Na aula prtica usaremos o mtodo do CaCl2. Neste mtodo as bactrias so submetidas a um tratamento num meio hipotnico contendo clcio que as torna competentes para a transformao pelo DNA plasmidial. Usaremos o plasmdeo pBR322 (ver mapa abaixo). O plasmdio pBR322 comumente usado para clonagem de genes inteiros ou de fragmentos de genes. Alm da origem de replicao que permite sua propagao em bactrias (E. coli) o pBR322 apresenta duas marcas genticas, ou seja, genes que codificam para protenas que conferem resistncia a ampicilina (ampr) e tetraciclina (tetr). Portanto a introduo de pBR322 em E. coli que normalmente sensvel tanto ampicilina como tetraciclina, leva ao aparecimento de bactrias capazes de crescer em meio (lquido ou slido) contendo estes antibiticos. Note que a introduo de genes exgenos no stio da enzima de restrio Pst I leva perda da resistncia ampicilina, uma vez que este stio est localizado na regio ampr. Da mesma forma, clonagem no stio da enzima Bam HI leva perda da resistncia a tetraciclina. Transformao de bactrias que so sensveis a um antibitico, em resistentes, ser revelada atravs de plaqueamento (inoculao) de bactrias em placas de gar contendo meio LB (meio rico de Luria Bertani) na ausncia e na presena de antibiticos (ampicilina ou tetraciclina).

Procedimento Experimental


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O ideal seria fazermos a experincia em condies estreis, para evitar contaminao. Como isto no ser possvel, manipule convenientemente o material estril fornecido. NO ABRA AS PLACAS DE GAR AT O MOMENTO DE USO.

As bactrias competentes para transformao foram preparadas a partir de uma cultura em fase exponencial do crescimento e atravs de sucessivas lavagens do precipitado de bactrias com uma soluo de CaCl2 e mantidas congelads a -80oC.

1. Inocular 5 ml de meio LB lquido com uma colnia de bactrias HB101 (E. coli) e incubar 37C at o dia seguinte sob forte agitao (200-250 rpm).

2. Diluir a pr-cultura 1/10 em 10 ml de meio LB, incubar 37C sob agitao at OD600nm =0,3 (fase logartmica de crescimento).

3. Transferir a cultura para o gelo, coletar as bactrias por centrifugao (4000 rpm, 5min). Ressuspender o sedimento de bactrias em 10 ml de tampo acetato de sdio (frio) 20 mM pH 6,5 contendo CaCl2 0,1M. Incubar no gelo por 20 minutos.

4. Coletar as bactrias (4000 rpm, 5 min) e ressuspender em 1 ml do mesmo tampo (frio).

5. Aps pelo menos 30 min no gelo estas BACTRIAS COMPETENTES podem ser transformadas.

6. Para transformar, distribuir 0,1 mL/tubo da suspenso de bactrias competentes para cada um de 2 tubos. Adicionar o DNA transformante (0,5 g DNA de pBR322 em 10 l de tampo 10 mM Tris pH 7,5 contendo 1 mM EDTA) a um dos tubos. O outro tubo ser usado como controle (bactria apenas).

7. Incubar em gelo por 15 min antes de dar o choque trmico (42C por exatamente 90 segundos). Transferir os tubos novamente para o gelo por 2 min.

8. Adicionar 0,9 ml/tubo de meio LB e incubar a 37C sem agitao, em banho-maria, por uma hora.

9. Transferir 25l ou 250l da suspenso para placas de gar LB e LB-A (LB contendo ampicilina ou carbenicilina) previamente identificadas conforme a tabela abaixo. Espalhar as bactrias com o auxlio de uma ala de vidro, previamente flambada e em seguida resfriada na prpria tampa da placa de Petri.

10. Incubar as placas por __ h e contar as colnias formadas.

Nmero de colnias/ placa Placa LB Placa LB-A #1 Bactrias controle 25L #2 Bactrias controle 250L

#3 Bactrias transformadas 25L #4 Bactrias transformadas 250L


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Nome: Grupo No. Data

OBJETIVO DA EXPERINCIA:________________________________________ _____________________________________________________________________

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RESULTADOS OBTIDOS: 1. Preencher a tabela com o nmero de colnias obtido em cada caso.

Nmero de colnias/ placa

Placa LB Placa LB-A #1 Bactrias controle 25L #2 Bactrias controle 250L

#3 Bactrias transformadas 25L #4 Bactrias transformadas 250L

2. Qual a eficincia de transformao obtida, em termos de n de colnias/ug de DNA? _____________________________________________________________________

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Nome:

QUESTES:

1. Por que se usa cultura em fase exponencial de crescimento para obter bactrias competentes?

2. Qual o papel do choque trmico?

3. Por que as bactrias devem ser incubadas por 60 min a 37C antes de espalh-las em placas de gar?

4. Que utilidade teria esta tcnica do ponto de vista biotecnolgico? D um exemplo.


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EXPERINCIA No.3: INDUO DA -GALAGTOSIDASE POR IPTG.

Fundamento A -galactosidase de E.coli uma enzima indutvel que hidrolisa -D-galactosdeos. A atividade desta enzima pode ser medida com substratos cromognicos que quando hidrolisados do origem a produtos coloridos. Um exemplo o orto-nitrofenil--D-galactosdeo (ONPG) que incolor, mas na presena de -galactosidase convertido a galactose e orto-nitrofenol. O orto-nitrofenol amarelo e sua absoro pode ser medida a 420nm. Altos nveis de -galactosidase s so medidos em culturas crescendo na presena de lactose ou de um indutor no metabolizvel, o IPTG (isopropil-tiogalactosdeo).

Procedimento Experimental Ser utilizada uma pr-cultura de bactrias E.coli CSH23 que foi semeada ontem no final da tarde em meio de cultura lquido esteril e mantida at hoje pela manh, quando a cultura foi transferida para geladeira.

1. Tomar uma alquota da pr-cultura de bactrias e diluir em meio lquido na presena e ausncia de IPTG (1mM) sob agitao vigorosa a 37C at a cultura atingir D.O.600nm (Densidade ptica a 600nm) = 0,7. Esfrie as culturas no gelo por 20 min.

2. Retirar 0L, 50L e 100L de cada cultura, transferindo separadamente para 3 tubos Eppendorf previamente identificados. Complete com gua para um volume final de 100L. Adicione 0,7mL de tampo de ensaio (tampo fosfato de sdio 0,1M pH 7,0 contendo KCl 10mM, MgSO4 1mM e -mercaptoetanol 50mM).

No descarte o restante das culturas, mantendo-as no gelo.

3. Adicionar 50 L de cloroformio. Agitar bem. Incubar os tubos em banho de gua a 30oC por 5 min.

-IPTG +IPTG

Cultura - 50l 100l 50l 100l

H2O 100l 50l - 50l -

T.E. 700l 700l 700l 700l 700l Clorofrmio 50l 50l 50l 50l 50l


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4. Iniciar a reao pela adio de 200 L de ONPG (4mg/mL) e incubar a mistura de reao em banho de gua a 30oC por 10 min.

5. Interromper a reao adicionando 0,4mL de Na2CO3 1M.

6. Centrifuguar os tubos por 5 minutos na minicentrfuga.

7. Remover delicadamente o sobrenadante de cada tubo para a cubeta sem retirar o clorofrmio, e faa a leitura da D.O.420nm (Densidade ptica a 420nm). Enxaguar as cubetas com gua entre a cada leitura.

8. Fazer uma diluio 1:10 das culturas de E.coli e faa a leitura da D.O.600nm (Densidade ptica a 600nm).

9. Calcular a atividade de -galactosidase das duas culturas:

Atividade de -galactosidase = culturadaODmLvolumetempo

OD

nm

nm

600

420

..)((min)..1000

UNIDADES



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RESULTADOS OBTIDOS :_____________________________________________ _____________________________________________________________________

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Nome:

QUESTES:

1. O que voc pode concluir sobre o gentipo da cepa CSH23?

2. O que voc esperaria encontrar em um experimento semelhante utilizando uma cepa cujo gentipo I-O+Z+? E no caso de uma cepa I+O-Z+? Proponha um experimento para distinguir entre estas cepas.


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EXPERINCIA No. 4: DIGESTO DE DNA PLASMIDIAL COM ENZIMAS DE RESTRIO e ELETROFORESE DE DNA EM GEL DE AGAROSE

Fundamento

Preparaes de DNA plasmidial ou cromossomal purificadas podem ser submetidas a digesto com enzimas de restrio para identificao e caracterizao do DNA. A escolha das enzimas de restrio deve ser baseada no mapa de restrio (quando disponvel) ou opta-se pelo emprego de um conjunto de enzimas de forma a permitir a caracterizao do DNA em questo, ou seja, obter seu mapa fsico. As enzimas de restrio classificam-se em 3 gupos quanto a fora inica para a atividade (alta, mdia e baixa). As enzimas de restrio comercialmente disponveis costumam vir acompanhadas do tampo correspondente e instrues para realizar a reao.

Procedimento experimental

A - Digesto do DNA com enzimas de restrio

Na experincia a ser realizada o DNA do plasmdeo ser digerido com 4 enzimas de restrio diferentes.

Cada grupo (ver tabela abaixo) receber um tubo Eppendorf contendo os componentes da reao com exceo do DNA plasmidial. Manter o tubo em banho de gelo.

- Cada aluno dever providenciar uma folha de papel monolog para construo do grfico (Questo 3).

1. Acrescentar 10L da soluo de plasmdeo (DBQ1, 150ng/10L) no tubo.

GRUPOS 1,7,13,19 2,8,14,20 3,9,15,21 4,10,16,22 5,11,17,23 6,12,18,24 EcoRI BglII EcoRI e

BglII EcoRI e

XbaI BglII e XbaI

sem enzima

H2O 7 L 7 L 6 L 6 L 6 L 10L Tampo da enzima (10X)

2 L 2 L 2 L 2 L 2 L -

Enzima (1 U) 1L 1L 1L / 1L 1L / 1L 1L / 1L - Plasmdeo 10L 10L 10L 10L 10L 10L Volume total 20L 20L 20L 20L 20L 20L

2. Misturar o contedo dos tubos por agitao e centrifugao rpida.

3. Incubar a reao em banho maria a 37C durante 60min.

4. Interromper a reao pela adio de 1L EDTA 0,1 M (Opcional). Transferir o tubo para um banho a 65C, durante 15min. Retirar o tubo do banho e rapidamente coloc-lo em gelo.

5. Adicionar a cada um dos tubos 5L de tampo da amostra. Misturar e centrifugar. A amostra est pronta para ser analisada em eletroforese em gel de agarose.


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Tampo de digesto 10X Tampo da amostra Tris-HCl 100mM - 500mM* Tris 10mM pH 8, NaCl 500mM-1M* EDTA 1mM pH 8, MgCl2 100mM azul de bromofenol 0,25% p/v DTT 10mM xileno cianol 0,25% p/v *(depende da enzima) sacarose 40% p/v

B. Fracionamento do DNA em gel de agarose.

Preparo do gel de agarose 1,0%

OBS: Sero montados dois gis com espao para aplicao de at 14 amostras

1. Pesar 1,0 g de agarose. Adicionar 100mL de tampo TBE (Tris-borato 89mM, EDTA 2mM pH 8).

2. Aquecer em banho fervente e misturar at completa dissoluo da agarose. Enquanto espera-se a dissoluo da agarose, preparar a forma para o gel. Resfriar at 40C (at conseguir segurar com as mos) e acrescentar 5L de uma soluo de brometo de etdio 10mg/mL. CUIDADO BROMETO DE ETDIO CARCINOGNICO! Despejar sobre a forma para o gel previamente preparada, incluindo a colocao do pente. Deixar solidificar por pelo menos 30min.

3. Retirar o pente e transferir o gel para a cuba. Adicionar tampo TBE cuba de modo a cobrir o gel com menor volume possvel.

4. Aplicar as amostras preparadas na experincia anterior. Ligar a fonte de eletroforese e aplicar aproximadamente 100V. Cuidado para no tocar o tampo.

5. Interromper a eletroforese quando o corante azul estiver a 0,5cm do fim do gel.

6. Tranferir o gel para o transiluminador e, em seguida observar o gel sob luz UV, utilizando culos protetores. Fotografar o padro de bandas observado com uma rgua posicionada na lateral do gel.

OBS: Ordem de aplicao das amostras nos gis

GEL 1: 1 - 2 - 3 - 4 -5 6 - Padro de tamanho - 7 - 8 - 9 10 11- 12

GEL 2: 13 - 14 -15 16 17 18 - Padro de tamanho - 19 20 21 22 23 24


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RESULTADOS OBTIDOS: :____________________________________________ _____________________________________________________________________

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Nome:

QUESTES:

1. Por que se observam duas bandas no plasmdeo que no foi incubado com a enzima?

2. Por que se utiliza EtBr (Brometo de Etdio) no gel e no tampo da eletroforese?

3. Gis de agarose podem ser usados para anlise de fragmentos de DNA que tenham entre 70 e 800.000 pares de base. Assim, possvel estimar o tamanho e a quantidade dos fragmentos de DNA. O tamanho pode ser estimado tomando-se por base a sua mobilidade em relao de outros de tamanho conhecido. Se o gel foi fotografado com uma rgua ao lado, a mobilidade relativa pode ser lida diretamente da foto. O grfico da mobilidade em cm (M) contra o tamanho em pb (L) dar uma curva que pode ser usada para leitura do tamanho com relao a uma determinada mobilidade. Entretanto, a interpolao muito mais precisa se a funo puder ser encontrada em uma linha reta: grfico de log L versus M. Desenhe a reta utilizando papel monolog (eixo x, mobilidade em cm, eixo y, tamanho em pb). Usando-se a mistura de padres de tamanho em pb conhecida calcule o tamanho dos fragmentos obtidos da digesto do pQBQ com as enzimas utilizadas. Faa um desenho do pQBQ indicando a posio dos stios de clivagem para estas enzimas.


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PROPRIEDADES FSICO-QUMICAS DOS CIDOS NUCLEICOS

DNA RNA

Fora inica baixa ("Salting in") alta ("salting out)

Solubiliza Precipita

Solubiliza Precipita

Meio cido 0,5N (brando) frio

Precipita Despurina

Precipita Despurina

Meio alcalino brando (0,3N KOH; 37C; 18h)

ss: estvel ds: desnatura

Hidrolisa 2' e 3'nucleosdeos

Solvente orgnico (cte dieletr. < que da H2O) ex.: etanol, isopropanol

Precipita

Precipita

Agentes desnaturantes que quebram pontes de H ex.: formamida, uria

ss: estvel ds: desnatura

1ria: estvel 2ria: destruda

Luz UV (260 nm)

ss: absorve mais ds: absorve menos

Absorve

Calor

ss: estvel ds: desnatura (T

m)

1ria: estvel 2ria: destruda

Nucleases Exonucleases + +

Endonucleases + +


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INIBIDORES DE TRANSCRIO OU DE TRADUO

ANTIBITICOS

Rifamicina (Streptomyces) Rifampicina (sinttica) Inibe iniciao da transcrio (impede a formao da la. ligao fosfdieser) mas no inibe elongao da cadeia de mRNA. Liga-se subunidade de RNAP.

Actinomicina D: Estrutura: 2 peptdeos + 3 anis benzeno fenoxazona (ver p 715 Stryer). Extrada de Streptomyces. Inibe transcrio. Liga-se a dsDNA impedindo que seja usado como template. Anis fenoxazona intercalam-se entre as bases nitrogenadas do RNA. Usado em tratamento de cncer.

-Amanitina (octapeptdeo cclico) de um cogumelo (Amanita) Inibe RNAPII (muito) e III (um pouco, em maior concentrao). Liga-se a RNAPII bloqueando a formao de mRNA ou de precursores de mRNA. Inibe elongao.

Puromicina: Inibe traduo. Anlogo de aminoacil-tRNA. Liga-se ao stio A do ribossomo, impedindo a entrada de aminoacil-tRNAS. Foma ligao peptdica com a cadeia polipeptdica nascente (peptidil transferase). Peptidil-puromicina: peptdeo liberado do ribossomo contendo puromicina ligada covalentemente ao C-terminal.

Tetraciclina: Liga-se ao stio A do ribossomo, impede ligao de aminoacil-tRNA neste stio.

Cloranfenicol: S inibe a sntese de protenas de procariotos e mitocndira (no inibe a sntese protica extramitocondrial de eucariotos).

Cicloheximida: Inibe a formao dos ribossomos de eucariotos (80S), mas no de procariotos (70S).

Estreptomicina: Causa leitura incorreta do cdigo gentico.

TOXINAS

Diftrica: Inibe sntese protica. Alvo EF2 que cataliza a translocao do peptdeo. O fragmento A da toxina cataliza a transferncia de ADP para EF2 (ADP-ribosilao) inativando este fator de elongao da cadeia polipeptdica.

Ricina: Inativa a subunidade 60S dos ribossomos eucariticos.


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CDIGO GENTICO UUU Phe UCU Ser UAU Tyr UGU Cys UUC Phe UCC Ser UAC Tyr UGC Cys UUA Leu UCA Ser UAA STOP UGA STOP UUG Leu UCG Ser UAG STOP UGG Trp CUU Leu CCU Pro CAU His CGU Arg CUC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg CUA Leu CCA Pro CAA Gln CGA Arg CUG Leu CCG Pro CAG Gln CGG Arg AUU Ile ACU Thr AAU Asn AGU Ser AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser AUA Ile ACA Thr AAA Lys AGA Arg AUG Met ACG Thr AAG Lys AGG Arg GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gly GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gly GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gly GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gly

AUG parte do sinal de iniciao e tambm o cdon para as metioninas internas cadeia.

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