bioplasticos

Biotecnologia Microbiana

Boletim de Biotecnologia

Luísa S. Serafi m¹, Paulo C. Lemos¹,² Maria A.M. Reis¹

¹ CQFB/REQUIMTE, Chemistry Department, FCT/UNL, Quinta da Torre, 2829-516 Caparica Portugal² Instituto de Tecnologia Química e Biológica (ITQB), UNL, 2870-156 Oeiras, Portugal

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Produção de Bioplásticos por Culturas Microbianas Mistas

1 Introdução

Os plásticos convencionais, produzi-dos a partir de derivados de petróleo, originam enormes problemas de contaminação ambiental por não serem biodegradáveis, persistindo como contaminantes durante longos períodos de tempo. Tem havido uma grande pesquisa no sentido de desen-volver polímeros biodegradáveis com propriedades idênticas às dos plásticos convencionais, de modo a poderem substituir estes últimos em aplicações semelhantes.

Existem no mercado diversos plásticos biodegradáveis tais como polihidro-xialcanoatos (PHAs), polilactato (PLA) e poliglicolatos (PGA). Os PHAs são termoplásticos e possuem propriedades físicas e químicas mui-to semelhantes às do polipropileno, o que os torna possíveis candidatos progressivamente mais aplicáveis na sua substituição.

O grande obstáculo à substituição do polipropileno por PHAs tem sido de natureza económica. De facto, o preço dos PHAs é cerca de nove vezes supe-rior ao do polipropileno (€ 9/kg para o PHB contra €1/kg para o polipropile-no) (Biby, 2002).

A razão principal do elevado custo dos PHAs decorre do facto de actual-mente serem produzidos por culturas microbianas puras e substratos caros (glucose e ácido propiónico), o que resulta em custos elevados de inves-timento e de produção (necessidade de um maior controlo da operação e de equipamento auxiliar para esteri-lização).

O uso de culturas mistas para pro-dução de PHAs pode constituir uma

alternativa interessante às culturas puras. A selecção de culturas mistas com elevada capacidade de acumula-ção de PHAs ocorre naturalmente em resultado das condições de operação do reactor e, consequentemente, não há necessidade de esterilização do sistema. Por outro lado, a utilização de culturas mistas facilita o uso de substratos complexos obtidos a partir de resíduos orgânicos, dado que a população microbiana se adapta con-tinuamente à mudança de substrato.

Assim, a possibilidade de produção de PHAs por culturas microbianas mistas pode reduzir substancialmente o custo destes biopolímeros e, consequente-mente, torná-los economicamente mais competitivos com o polipropile-no. O preço dos PHAs produzidos por culturas mistas pode, de facto, baixar para cerca de metade do preço dos produzidos por culturas puras, devido essencialmente à redução do custo dos substratos e dos custos de investimen-to (Meesters, 1998).

2- Características e Aplica-ções dos PHAs

Os PHAs existem no citoplasma da célula sob a forma de grânulos (0.2 a 0.5 µm de diâmetro) rodeados por uma membrana (Sudesh et al., 2000) (Figura 1). Os grânulos fl uorescentes de PHAs podem ser observados por microscopia de epifl uorescência usando corantes lipofílicos tais como o Azul de Nilo (Figura 4).

A fórmula química geral dos PHAs está representada na Figura 2. Foram identifi cados mais de 100 monómeros diferentes como constituintes dos PHAs em várias bactérias. O polihi-droxibutirato (PHB), constituído por monómeros de 3-hidroxibutirato, é o PHA mais bem caracterizado e o acumulado com maior frequência por bactérias (Madigan et al., 2000). Outros PHAs frequentemente acu-mulados por bactérias incluem o polihidroxivalerato (PHV), polihi-droximetilvalerato (PMHV) e o

Figura 1 – Grânulos de PHB acumulados por Azotobacter vinelandii UWD (Page et al., 1995)


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polihidroximetilbutirato (PMHB). A sua presença e proporção relativa dependem do tipo de substrato usado pelo microrganismo.

Se forem usadas misturas de subs-tratos, os microrganismos podem sintetizar co-polímeros, compostos por diferentes monómeros. O co-polímero constituído por monómeros de 3-hidroxibutirato e de 3-hidroxi-valerato (3 HB-co-3HV) é produzido industrialmente por uma cultura pura de Ralstonia eutropha, usando como substratos ácido propiónico e gluco-se. A formação de um co-polímero contendo unidades de 3HB e 3HV altera as propriedades do material, conduzindo a uma diminuição da cristalinidade e da temperatura de fusão, obtendo-se um polímero menos rígido e mais resistente, que proporciona melhores condições de processamento. Consequentemente, as propriedades do co-polímero podem ser defi nidas variando a composição relativa dos ácidos orgânicos presentes no meio de cultura.

O peso molecular dos PHAs produ-zidos industrialmente por culturas puras varia entre 1.7 x 105 e 4.5 x 106. Os PHAs mais comuns são polímeros semicristalinos. O grau de cristali-nidade depende da composição do polímero: sendo 60-80% para o PHB e decrescendo para 30-40% para o co-polímero cujo conteúdo em unidades

HV é de 30% (mol/mol).

As aplicações mais gerais dos PHAs incluem fi lmes para embalagens e plásticos convencionais. Dado que os PHAs são biocompatíveis, são usados em aplicações médicas e farmacêuti-cas (fi os de sutura cirúrgica, implantes ósseos, fármacos de libertação lenta, etc.). Na agricultura, os PHAs são usados em produtos de libertação de reguladores de crescimento de plantas ou de pesticidas.

3- Microbiologia

Os PHAs são sintetizados por um grande número de bactérias Gram negativas e Gram positivas pertencen-tes pelo menos a 75 géneros diferentes. Alguns exemplos de culturas puras usadas industrialmente para produzir PHAs incluiem a Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelan-dii e diversas espécies de Pseudomonas. Os PHAs podem ser efi cientemente produzidos por microrganismos geneticamente modifi cados, como por exemplo a Echerichia coli recom-binante.

A produção de PHAs por estas bacté-rias ocorre, na maioria dos casos, em situações em que um nutriente, que não a fonte de carbono, é limitante para o crescimento. A quantidade de polímero acumulado por estas bac-

térias pode atingir 80 % do seu peso celular (Kim et al. 1994).

Para além de culturas puras microbia-nas, as culturas mistas tem sido refe-renciadas como produtoras de PHAs. A acumulação de PHAs por culturas mistas é particularmente importante em populações microbianas presentes em estações de tratamento de efl uen-tes que experimentam condições transientes de disponibilidade de carbono e/ou oxigénio. Exemplos de microrganismos que sintetizam PHAs em condições transientes de oxigénio são as Bactérias Acumuladoras de Fós-foro (PAOs “Polyphosphate Accumu-lating Organisms”), responsáveis pela remoção de concentrações elevadas de fósforo de efl uentes. Nas estações de tratamento biológico de efl uentes contaminados com fósforo, a bio-massa recircula continuamente entre ambientes anaeróbios e aeróbios, o que estimula a síntese de reservas intrace-lulares. A acumulação de reservas intracelulares, nomeadamente PHAs, tem um papel muito importante no metabolismo destes microrganismos. Nestes sistemas ocorre um outro grupo de microrganismos designado Bactérias Acumuladoras de Glicogé-nio (GAOs-”Glycogen Accumulating Organisms”) que sintetizam PHAs mas não acumulam fósforo (Liu et al., 1996). A quantidade de biopolímero acumulado por PAOs e GAOs é rela-tivamente baixa, não ultrapassando 20% do peso celular, o que limita a sua utilização para a produção industrial de PHAs.

A produção de PHAs por culturas mistas aeróbias é especialmente eleva-da quando estas são submetidas a con-dições transientes de disponibilidade de carbono. As condições transientes de excesso e falta de substrato causam respostas dinâmicas no metabolismo celular. Sob estas condições dinâmicas, o crescimento torna-se desequilibra-do (“unbalanced”), i.e. o substrato é consumido sem ocorrer um aumento correspondente de todos os com-ponentes celulares (sem síntese de biomassa activa) (Beccari et al., 1998). Neste caso, o substrato é armazenado no interior da célula sob a forma de PHAs. A produção de PHAs por cul-

Figura 2 – Fórmula química geral dos PHAs (Lee, 1996)



turas expostas a condições dinâmicas de disponibilidade de carbono, pode atingir valores superiores a 60% do peso celular (Reis et al., 2003). Não existe, até ao momento, uma identifi -cação microbiológica dos grupos ou grupo de bactérias pertencentes a este fénotipo.

Algumas plantas produtoras de cere-ais, tais como o girassol e a soja, con-seguem sintetizar PHAs. Contudo, o rendimento de produção (4% do peso da planta) é muito inferior ao produ-zido por bactérias, o que, actualmente, reduz a viabilidade de produção de PHAs por esta via.

Este artigo aborda a produção de PHAs por culturas mistas sujeitas a condições dinâmicas de disponibilida-de de carbono.

4 Processo de Produção de PHAs por culturas mistas em Condições Transientes de Adição de Carbono

4.1- Mecanismo de produção de PHAs

Quando uma cultura microbiana experimenta um aumento brusco na concentração de substrato disponível, após um período de limitação do crescimento, podem ocorrer dois tipos de adaptação, que dependem essen-cialmente da natureza do substrato, da cultura microbiana e das condições de operação (Daiger e Grady, 1982): a biomassa pode adaptar-se às novas condições aumentando o crescimento celular (crescimento como resposta) ou rapidamente acumular o substrato sob a forma de reservas intracelulares (acumulação como resposta). A acu-mulação de reservas é a resposta mais rápida porque requer uma menor adaptação fi siológica dos micror-ganismos. Nestas condições, há um desacoplamento entre o consumo de substrato e o crescimento, ocorrendo acumulação de reservas intracelula-res. O fenómeno de acumulação de reservas intracelulares é geralmente dominante (cerca de 70%) sobre o

crescimento. Se o tempo de exposição ao substrato se prolongar de tal modo que ocorra adaptação fi siológica, o crescimento celular torna-se o proces-so dominante.

O mecanismo de acumulação de reservas poliméricas quando os microrganismos são sujeitos a condi-ções transientes de carbono (períodos curtos de excesso de carbono alterna-dos com períodos longos de limitação de carbono externo) foi proposto por Majone et al. (1999):

- Após um período prolongado de limitação de carbono (“fome”), os microrganismos, quando expostos a elevadas concentrações de car-bono (“fartura”), transformam a maior parte do substrato em reser-vas poliméricas internas e o restan-te em crescimento celular (Figura 3). Após a exaustão do substrato externo, as reservas internas são usadas para crescimento e manu-tenção celular. Neste período de limitação de carbono, a velocidade específi ca de crescimento atinge valores muito baixos, o que obriga o microrganismo a uma adaptação fi siológica na fase seguinte quando confrontado com um excesso de carbono disponível, resultando preferencialmente num mecanis-mo de acumulação de reservas em detrimento do crescimento celular. Nestas condições, e contrariamen-te ao que acontece com as PAOs e

GAOs, a acumulação de reservas intracelulares a partir do substrato externo e o crescimento, ocorrem em simultâneo.

Neste tipo de sistemas dinâmicos, os microrganismos que possuem a capacidade de acumular substrato sob a forma de reservas intracelula-res podem sobreviver durante a fase de ausência de carbono externo e, portanto, têm uma vantagem competi-tiva sobre os microrganismos que não possuem esta capacidade, tornado-se dominantes.

A Figura 4 representa os grânulos de PHB corados no início e no fi m da fase de “fartura” para uma cultura mista sujeita a ciclos de “fome” e “fartura”.

4.2-Metabolismo

Não existe ainda nenhum modelo metabólico para o processo de pro-dução de PHAs por culturas aeróbias sujeitas a condições dinâmicas de adição de carbono, mas provavelmen-te não será muito diferente do que é conhecido para culturas puras que acumulam PHAs (Figura 5). O com-posto intermediário chave na síntese e degradação de PHAs é o acetil-CoA. Enquanto existe substrato externo for-ma-se acetil-CoA, que é parcialmente desviado para a produção de PHAs e para crescimento, através do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA). Na síntese de PHB são condensadas duas

Figura 3 – Perfi s de concentrações e da velocidade especifi ca de crescimento num processo com culturas mistas submetidas a condições dinâmicas de adição de carbono.



moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, sendo esta reacção catalisada pela enzima 3- Cetotiolase. A síntese de PHB prossegue pela acção das enzimas NADPH redutase e PHB sintetase. Após a exaustão do substrato externo, o PHB é degradado, produ-zindo-se acetil-CoA que é usado para crescimento e manutenção celular (ciclo a tracejado na Figura 5).

4.3 – Optimização do processo

Um dos factores que tem limitado a produção de PHAs por culturas mis-tas tem sido o baixo rendimento de produção quando comparado com o obtido por culturas puras, nomeada-mente por Ralstonia eutropha, usada na produção Industrial de PHAs (Kim et al., 1994). De facto, enquanto este microrganismo é capaz de acumular cerca de 80% (massa de PHA por massa celular), o valor referido na literatura para culturas mistas não ultrapassa 60% (Reis et al., 2003). Este valor máximo de acumulação de PHAs foi obtido com culturas de lamas activadas, sujeitas a condições transientes de adição de substrato (“Fome e Fartura”) descritas anterior-mente. Deverá notar-se, contudo, que o interesse pela produção de PHAs por culturas mistas tem tido como principal objectivo estudar os meca-nismos de acumulação de reservas intracelulares e não a sua optimização com vista à produção industrial, pelo que é de esperar que, manipulando os

parâmetros de operação do processo, o rendimento de produção de PHAs por culturas mistas possa atingir valores superiores aos descritos na literatura.

A optimização da produção de PHAs tem de passar necessariamente pela selecção da confi guração de reactor e das condições de operação que con-duzam à obtenção de rendimentos e produtividades elevadas. A confi gura-ção de reactor mais usada para estudar a produção de PHAs por culturas mistas, usando o processo de “Fome e Fartura”, é o reactor descontínuo

Figura 5 – Metabolismo de síntese e degradação de PHB por diversos microrganismos (modifi ca-do a partir de Sudesh et al., 2000).

sequencial (SBR). O SBR é operado em ciclos de cerca de 12 a 24 horas. A adição de substrato é feita por pulso, sendo consumido em cerca de 1 a 2 horas, seguindo-se um período de cerca de 10 a 22 horas de ausência de carbono externo (Dircks et al., 2001, Serafi m et al., 2002). Os SBRs são reactores ideais para seleccionar populações microbianas com elevada capacidade de acumulação de PHAs, porque a biomassa cresce em condi-ções transientes. Este tipo de reactor é fácil de controlar e é altamente

Figura 4 – Grânulos de PHAs observados por microscopia de epifl uorescência após coloração com Azul de Nilo.(a) início da fase de “fartura” ; (b) fi m da fase de “fartura”

(b)(a)



fl exível, permitindo a alteração rápida dos ciclos de operação (duração da alimentação e extensão do ciclo).

4.3.1- Efeito da concentração de substrato

O efeito da concentração de substrato na quantidade de polímero produzida foi estudado usando acetato como substrato e um SBR operado com ciclos de 12 horas. O acetato foi adi-cionado num único pulso, sendo con-sumido entre 1-4 horas, dependendo da concentração usada, seguindo-se um período de 8 a 11 horas de ausên-cia de carbono. Os resultados obtidos para as diferentes concentrações de acetato estão representados na Figura 6. Verifi ca-se que o conteúdo em PHB na biomassa aumenta com a concen-tração de substrato, atingindo 67% do peso celular. No entanto, a produtivi-dade específi ca em polímero atinge o máximo (0.75 mmmol C/mmol X.h) para 90mmol C/l e decresce acentua-damente para a concentração de subs-trato de 180mmol C/l. Este decréscimo é originado pela inibição da síntese de PHB para elevadas concentrações de substrato. A razão entre a quantidade de polímero produzido e de substrato consumido (Yp/s), é independente da concentração de substrato usada, atin-gindo um valor médio de 0.72 Cmmol HB/Cmmol HAc.

É interessante notar que as produtivi-dades específi cas (0.41-0.75 Cmmol HB/Cmmmol X.h) obtidas por culturas mistas sujeitas a condições transientes de adição de carbono, são cerca de uma ordem de grandeza superiores às obtidas (0.013 Cmmol HB/Cmmmol X.h) por culturas puras usadas industrialmente (Kim et al., 1994). Do ponto de vista da optimiza-ção do processo, esta característica das culturas mistas é muito importante, por permitir obter elevadas produti-vidades com concentrações celulares baixas.

4.3.2- Estratégia de operação do Reactor

Uma forma de garantir a produção de elevadas quantidades de polímero, minimizando a inibição por substrato, será adicionar o substrato de forma semi-contínua (“fed-batch”) ou con-tínua. No último caso o substrato, correspondente ao máximo anterior (180mmol C/l), é adicionado conti-nuamente durante a fase de “fartura”, seguindo-se um período de “fome”. No primeiro caso, a mesma quantidade de substrato é distribuída por três pulsos sequenciais, seguindo-se igualmente um período de “fome”.

Os resultados obtidos para os dois tipos de estratégia de alimentação do reactor estão representados na

Figura 7. A alimentação em contínuo (Figura 7a) resultou numa diminuição na produtividade do reactor (0.30 Cmmol HB/Cmmmol X.h) e no conteúdo em polímero nas células (56%), relativamente à situação em que a mesma quantidade de substrato (180mmol C/l) tinha sido adicionada num pulso (Figura 6). Este resultado pode ser explicado pelo facto de no sistema alimentado em contínuo, o substrato dentro do reactor ter sido limitante para o processo de acumu-lação de PHB. Pelo contrário, quando a mesma quantidade de substrato foi adicionada em três pulsos (Figura 7b), a produtividade (0.80 Cmmol HB/Cmmmol X.h) e a quantidade de polímero acumulado (78.5%) aumen-taram signifi cativamente em relação às experiências em que o substrato foi adicionado num único pulso e em contínuo. O conteúdo em PHB nas células (78.5%) é idêntico ao obtido por culturas puras (80%), o que torna o processo de “ Fome e Fartura” extre-mamente atractivo para a produção industrial de PHAs.

A adição de 4 pulsos de carbono não originou qualquer aumento na acu-mulação de PHB, podendo afi rmar-se que as células atingiram a máxima capacidade de acumulação de políme-ro para 180mmol C/l, distribuído em três pulsos.

5-Conclusões

Manipulando os parâmetros de opera-ção do reactor, a quantidade de PHB obtida por culturas mistas pode atin-gir valores semelhantes aos obtidos por culturas puras.

Embora este estudo tenha sido efec-tuado com ácido acético, experiências realizadas com outro tipo de substra-tos, tais como ácido propiónico e ácido butírico, revelaram que os ácidos orgâ-nicos voláteis são excelentes substratos para a produção de PHAs por culturas mistas. Tendo em conta este aspecto, pode-se concluir que a produção de PHAs por culturas mistas abre novas perspectivas à utilização e valorização de resíduos industriais que possuam na sua composição compostos orgâni-

Figura 6 – Efeito da concentração de substrato na produtividade especifi ca (qp), no rendimento de produção de PHB (Yp/s) e no conteúdo em PHB na biomassa (%HB).



cos fermentáveis (ex. soro de leite, res-caldo de melaço) ou fermentados (ex. ácidos orgânicos). No primeiro caso o processo deve incluir uma etapa de fermentação a montante do processo de produção de biopolímero.

No caso de se desenvolverem condi-ções que tornem o processo de pro-dução de PHAs por culturas mistas e resíduos industriais economicamente viável, num futuro próximo esta tecnologia permitiria reduzir de forma signifi cativa a utilização de plásticos não biodegradáveis e a necessidade de tratamento do tipo de resíduos indus-triais referidos, resolvendo um duplo problema ambiental.

Agradecimentos

Este projecto (POCTI/35675/BIO/2000) foi fi nanciado pela Fundação para a Ciên-cia e Tecnologia (FCT). Luísa S. Serafi m e Paulo C. Lemos agradecem à FCT pelas bolsas PRAXIS XXI BD/18287/98 e BPD/20197/99, respectivamente.

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(a) (b)

Figura 7 – Produção de PHB para dois tipos de adição de substrato: (a)- alimentação em contínuo; (b) – alimentação por pulsos. (æ - velocidade de adição de acetato (a) e concentração de acetato (b), à- % de PHB, ç- OUR (velocidade específi ca de consumo de oxigénio (oxygen uptake rate), ó-concentração de amónia).

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