Caracterización química de las toxinas

y efectos en la salud humana de las cianobacterias

Profa.Sandra M. F. O.Azevedo

IBCCF - UFRJ

Registros da ocorrência de florações de

cianobactérias

Relatos da observação de florações na Europa há

pelo menos 1000 anos

Geraldus Cambresis (1188 ) descreveu o lago Llangorse (Wales) como:

“the lake has many miracolous properties ....it sometimes turns

bright green, and in our days it has been known to become scarlet,

not all over, but as if blood were flowing along certains currentes

and eddies”.....

Há também relatos que indicam o conhecimento

tradicional da toxicidade de florações entre povos

primitivos da América do Norte, África e Austrália.

(Cood et al., 2005)

2 08:30

Primeiros relatos “técnicos” de mortes de

animais pela ingestão de cianobactérias

Local Cianobactérias Animais mortos Referencia

Jutland –

Dinamarca – 4

lagos

Não identificada Bovinos e peixes Hald

(1833)

Australia –

Lago

Alexandria

Nodularia

spumigena

Ovelhas, bovinos,

cavalos, porcos e

cães

Francis

(1878)

Pomerania

(Polonia) –

lago Barlewice

Microcystis

aeruginosa,

Anabaena flos-

aquae,

“limnochlide flos-

aquae”(Aphanizo

menon flos-aquae)

Potros, patos,

galinhas, porcos e

peixes

Benecke

(1884)

3 08:30

Toxicologia - Primeira metade do Sec. XX

Trabalhos confirmando efeitos tóxicos em animais domésticos:

Ex.: The effect on livestock of water contaminated with freshwater algae

(Graham,G.W., J.Am.Vet.Med.Assoc.1925,20:780-784)

Outros relatos na Argentina, África do Sul, Canadá, etc

Trabalhos relatando reações alérgicas na população exposta à

florações

Ex: Symptons of hay fever caused by algae. (Heise, H.A., J. Allergy

1949, 20:383)

Trabalhos pioneiros confirmando efeitos tóxicos de florações,

através de bioensaios

Development of toxicity in Blue-Green Algae (Grant,G.A. and Hughes,

E.O., Canadian J. Public Health 1953, 44: 334-339)

4 08:30

5

Estudos ecológicos

Estudos toxicológicos

Separação entre Ecologia and Toxicologia

DIFERENTES CEPAS DE ESPÉCIES DE

CIANOBACTÉRIAS

Substancias tóxicas

diversas

CIANOTOXINAS

Neurotoxinas

Hepatotoxinas

Citotoxinas

Endotoxinas - LPS

6 08:30

Cianotoxinas: Década de 1980

Neurotoxinas

Anatoxina-a

Anatoxina-a(s)

Saxitoxinas

Hepatotoxinas

Microcistinas

Nodularina

Cilindrospermopsina

7 08:30

Compound Chemistry Source LD50

µg kg-1

BW

botulin A (s.c.) protein soil bacteria (Chlostridium

sp.)

0.004 ciguatoxin 1 polyether marin dinoflagellates 0.25

batrachotoxin steroid

alkaloid

tropical frogs (Phyllobates

sp.)

2 saxitoxin alkaloid cyanobacteria 8

tetrodotoxin alkaloid puffer fish (symb. bacteria) 8 anatoxin-A(s) alkaloid cyanobacteria 40

microcystin-LR peptide cyanobacteria 50 amanitine peptide mushroom (Amanita

phalloides.)

100 anatoxin-A alkaloid cyanobacteria 250 aconitine terpenoid

alkaloid

monkshood (Aconitum sp.) 270 microcystin-RR peptide cyanobacteria 600

strychnine alkaloid Strychnos nux-vomica 980 phalloidine peptide mushroom (Amanita

phalloides)

2,000 cylindrospermopsin

psin

alkaloid cyanobacteria 2,100 rotenone alkaloid Lonchocarpus (fabaceae) 2,650

domoic acid amino acid diatom (Pseudonitzschia

sp.)

3,600 digitoxin steroid

glycoside

foxglove (Digitalis sp.) 3,900 ouabain steroid

glycoside

tropical plants 11,000 atropine alkaloid solanaceae 30,000

Toxicidade de algumas moléculas naturais

Toxicidade relativa à aplicação i.p. em camundongos;

Compilado do website da National Library of Medicine

8 08:30

B

D

Estruturas Química das Neurotoxinas

(A) anatoxina-a, (B) homoanatoxina-a, (C) anatoxina-a(s)

e (D) estrutura geral das saxitoxinas

A

D C

B

9 08:30

Saxitoxinas

R1

R2

R3

Carbamatos

R4: CONH2

N-Sulfocarbamoil

R4: CONHSO3-

Decarbamoil

R4: H

H H H STX GTX5 dcSTX

OH H H NeoSTX GTX6 dcneoSTX

OH H OSO3- GTX1 C3 dcGTX1

H H OSO3- GTX2 C1 dcGTX2

H OSO3- H GTX3 C2 dcGTX3

OH OSO3- H GTX4 C4 dcGTX4

Saxitoxinas

Bloqueio reversível

dos canais de sódio

Rapidamente

excretada pela urina

(t1/2 90 min.)

11 08:30

(A) microcistinas, (B) nodularinas, (C) cilindrospermopsina

Estrutura Química das Hepatotoxinas

12 08:30

Cilindrospermopsina

Citotoxina: danos no fígado, rins, trato gastrointestinal, sistemas endócrino, imunológico e vascular, músculos;

Dois mecanismos possíveis de intoxicação:

1. Via rápida: LD50 24h 2.100,00 g/Kg ;

2. Via lenta: (5-6 dias) LD50 200 g/Kg

Este efeito é interpretado como a ação da toxina na inibição da síntese protéica, a qual parece ser irreversível.

NOAEL = 30 g/Kg/dia - para consumo oral

(camundongos machos)

TDI = 1 g/L, baseado em estudos de

carcinogenicidade

Microcistinas

Carmichael, 1994. Scientific American, 270:78-86

Cianotoxinas mais frequentemente encontradas

Heptapeptídeos cíclicos – mais de 90 variantes

14 08:30

compound source IARC class

GV µg L

-1

LD50

mg kg-1

BW

endrin pesticide n.carc. 0.6 1.4 carbofuran pesticide n.carc. 7 2

Microcystin-LR peptide 2B 1a 5

pentachlorophe

nol

wood

preservative

2B 9a 36

aldrin/dieldrin pesticide 3 0.03 44 chlorpyrifos pesticide n.carc. 30 60 acrylamide indust. chemical 2A 0.5 107

DDT pesticide 2B 1 135 chlordane pesticide 2B 0.2 145

arsenic metal 1 10 145 atrazine pesticide 3 2 850

simazine (rat) pesticide 3 2 971 metolachlor pesticide n.carc. 10 1150

cadmium (rat) metal 2A 3 2330 dioxan indust. chemical 2B 50 5300

Toxicidade oral para camundongos de compostos listados no

“WHO Guidelines for Drinking Water Quality”

a: GV provisório; dados de toxicidade compilados dosis.nlm.nih.gov/chemical.html;

1: carcinogênico; 2A: provavelmente carc.; 2B: possivelmente carc.; 3 não

classificável; n.carc.: não carcinogênico.

Microfilamentos em

hepatócitos normais

Microfilamentos em

hepatócitos após

exposição à microcistinas

Mecanismos de ação de microcistinas

Inibidores potentes

de Proteinas

Fosfatases da família

serina/treonina – PP1

e PP2A

Carmichael, 1994. Scientific American, 270:78-86

DL 50 (ip) – 50 a

1200µg/Kg de peso

16 08:30

Mecanismos de ação de microcistinas

ADDA se liga

ao sítio ativo

das PPs

Mdha se liga covalentemente ao

residuo de cisteína 273 das PPs

Gupta et al., (1997)

Cavidade

C-terminal Cavidade

ácida

Cavidade

hidrofóbica

Cavidade

C-terminal Cavidade

ácida

Cavidade

hidrofóbica

17 08:30

Efeitos agudos em humanos

Casos de problemas gastrointestinais e hepáticos relacionados com microcistinas em mananciais de abastecimento público

1931 – USA – Rios Ohio e Potomac – 5000-8000 pessoas afetadas durante uma floração de Microcystis

1981 – Australia – Armindale – enzimas hepáticas elevadas numa população abastecida por um reservatório que apresentava uma floração tóxica de Microcystis (Falconer et al.,1983)

1988 – Brasil – Itaparica – 2000 pessoas foram afetadas e 88 faleceram durante um período de 42 dias de floração de Microcystis e Anabaena no reservatório (Teixeira et al., 1993)

1994 – Suécia – 121 casos de problemas gastrointestinais relacionados com Microcystis na água potável (Annadotter et al., 2001).

18 08:30

Relações da cadeia trófica e saúde

Courtesy H. Pearl 19 08:30

Exposição Humana a Cianotoxinas

Diferentes vias: exposição

Oral

Água potável

Alimento

(bioacumulação)

Atividades

recreacionais

Atividades

recreacionais

Atividades

profissionais

Intravenosa Hemodialise

Parenteral

Inalação

20 08:30

Caruaru – fevereiro de 1996

117 de 136 pacientes (86%) dialisados

passaram a apresentar os seguintes

sintomas :

Dor de cabeça, distúrbios visuais,

náusea e vômito.

Hepatomegalia

60 mortes ocorridas até outubro 1996

puderam ser atribuídas a uma mesma

síndrome

21 08:30

O que ocorreu:

22 08:30

O que ocorreu:

Sistema de purificação de

água da clínica

Sala de hemodiálise

23 08:30

Concentrações de Microcistina e Cilindrospermopsina no carvão

ativado, resinas de troca iônica e areia das clínicas A e B

Clínica/tipo de amostra

Microcistina

(µg/g)

Cilindrospermopsina

(µg/g)

Clínica A – carvão

1.0

19.70

Clínica A – resina

aniôanica

0.5

0.02

Clínica A – resina

catiônica

2.1

0.05

Clínica A – areia

ND

ND

Clínica B – carvão

3.4

ND

Clínica B - areia

ND

ND

ND = não detectado

24 08:30

Espectro por HPLC/PDA a partir de extrato de

amostra de fígado de paciente renal crônico

Carmichael et al (2001)) 25 08:30

Análises histopatológicas

Azevedo et al.(2002) 26 08:30

27 08:30

Descrição de espécies de cianobactérias presentes no

reservatório de Tabocas – amostras fitoplanctônicas de março

a maio de 1996

•Presença de várias espécies picoplanctônicas

•Descrição de espécie nova – Romeria caruaru

28 08:30

29 08:30

Avanços no conhecimento sobre toxicologia de

microcistinas em vertebrados

Após pelo menos 4 décadas de estudos:

Fígado não é o único órgão afetado. Há dados consistentes sobre

efeitos no coração, gônadas, cérebro, rins, pulmão e intestino.

Os efeitos decorrentes da exposição a doses subletais (única ou

crônica) estão relacionados também com estresse oxidativo e/ou

resposta inflamatória.

A via detoxicação parece ser preferencialmente pela ação de GSH e a

biotransformação de microcistinas pode se dar por ligação direta com

GSH ou pela ação da glutationa S-transferase – excreção pelas fezes e

urina.

Processo de excreção lento, pois microcistinas podem permanecer na

circulação sanguínea por pelo menos 2 meses após uma única

exposição (dados em peixes, camundongos, ratos e humanos)

30 08:30

Entrada

Dano ao fígado

Liberação de ALT

Liberação de LDH

Entrada

Dano ao fígado

Liberação de ALT

Liberação de LDH

Ativação: fosfolipase A2 e

cicloxigenase

Produção: mediadores

inflamatórios,

TNF-α e IL-1

Respostas à Microcistinas ao nível celular

31 08:30

Leucócitos isolados de voluntários saudáveis e pacientes renais

crônicos, incubados por 24 horas com 10µg/L de microcistinas-

LR, mostraram que essa dose pode induzir mudanças na função

dessas células, especialmente relacionadas com a formação de

espécies reativas de oxigênio (ROS)

32 08:30

Novembro de 2001:

Água da rede de abastecimento do Rio de Janeiro apresentou forte

cheiro de geosmina

Análise do fitoplâncton no manancial : dominância Anabaena e

Microcystis.

Análises Microcistinas:

Água da rede – 0,4 g MCYST/L

Setor de diálise do HUCCF-UFRJ – água pós-carvão ativado: 0,3 g

MCYST/L (3/12/01) – monitoramento subsequente (Dez. a Fev) –

nenhum resultado positivo

Análises de MCYSTs no soro de 12 pacientes durante 2 meses. 08:30 33

MCYSTs detectadas por ELISA no soro de pacientes

renais crônicos

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1/dez 11/dez 21/dez 31/dez 10/jan 20/jan 30/jan

Dias de hemodiálise

Co

nce

ntr

açã

o d

e M

CY

ST

s (

ng

/mL

) P3

P4

P6

P8

P13

P14

P21

P24

P27

P31

P34

P38

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1/dez 11/dez 21/dez 31/dez 10/jan 20/jan 30/jan

Dias de hemodiálise

Co

nce

ntr

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CY

ST

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P13

P14

P21

P24

P27

P31

P34

P38

34 08:30

Concentração de MCYST em fígado, pulmão e soro

sem

ana

1

sem

ana

3

sem

ana

5

sem

ana

7

0.0

200.0

400.0

600.0

800.0

ng

de M

CY

ST

/g d

e t

ecid

o

a

Concentração de MCYST (ng de MCYST/g de tecido) de ratos injetados via

ip com 55g/kg. n=5. p<0,001 (dados não publicados)

sem

ana

1

sem

ana

3

sem

ana

5

sem

ana

7

0.0

5.0

10.0

15.0

ng

de M

CY

ST

/g d

e t

ecid

o

semana 1

semana 3

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

ng d

e M

CY

ST/

mL

Fígado Pulmão

Soro

35 08:30

Efeitos de Microcistinas no Pulmão

36 08:30

Efeito de Microcistinas no parênquina pulmonar

10

0

m

B

10

0

m

A

10

0

m

E

10

0

m

F

10

0

m

D

10

0

m

C

100 m

B

100

m

A

100 m

E

100 m

F

100 m

D

100 m

C

10

0

m

B

1

0

0

m

A

10

0

m

E

10

0

m

F

10

0

m

D

10

0

m

C

10

0

m

B

1

0

0

m

A

10

0

m

E

10

0

m

F

10

0

m

D

10

0

m

C

100

m

B

100

m

A

100

m

E

100

m

F

100

m

D

100

m

C

Fotomicrografias do parênquima pulmonar (200x). A, grupo

controle; B, C, D, E, F, camundongos sacrificados após 2, 8, 24,

48 e 96 horas, após injeção ip de MCYST-LR (40µg/Kg).

37 08:30

38 08:30

Impactos das Cianotoxinas na Biota Aquática e

para a saúde humana

Efeito indireto

Efeito direto

Bioacumulação

Ingestão de células e/ou cianotoxinas

diretamente da água

Consumo de outros organismos que

já tenham acumulado cianotoxinas

39 08:30

Florações de

cianobactérias em

lagoas costeiras:

Jornal O Globo 23/09/2004

Jornal O Globo 30/08/2001 40 08:30

Ago Sep Sep Oct Oct Nov Nov

0

20

40

60

se

sto

n p

oin

t 1

; liv

er

an

d v

isc

era

l o

rga

ns

0

100

200

300 se

sto

n p

oin

t 3 a

nd

mu

sc

le

Seston point 1 (µg.L-1) Seston point 3 (µg.L-1) Liver (µg.g-1)

Visceral organs (µg.g-1) Muscle (µg.Kg-1)

Concentração de microcistinas no seston e em

peixes da Lagoa de Jacarepaguá - 1998

Magalhães et al (2001) 41 08:30

Dec Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov

/98 /99

0

0,5

1

1,5

2

Estimated daily intake Tolerable Daily Intake (TDI = 0.04µg.Kg-1.day-1)

Magalhães et al (2001)

Estimativa da ingestão diária de microcistinas

Magalhães et al (2001) 42 08:30

*calculados para pessoas de 70 kg usando 0.04 µg kg-1 PC d-1 e

um consumo de 150 g peso fresco.

**dados compilados de Ibelings & Chorus, Environ. Poll. (2007)

Microcistinas em organismos aquáticos

consumíveis como alimento humano**

Organism MC µg g-1

TDI

factor* Reference

Pejerrey 0.05 - 0.34 2.7 - 18.2 Cazenave et al. 2005

Carp 0.038 2.0 Li et al. 2004

Tilapia 0.002 - 0.337 0.1 - 18.1 Magalhaes et al. 2001

Unidentified crab 0.103 5.5 Magalhaes et al. 2003

Red Swamp Crawfish 0.005 - 0.010 0.3 - 0.5 Chen & Xie, 2005a

Freshwater Shrimp 0.006 - 0.026 0.3 - 1.4 Chen & Xie, 2005a

Anodonta woodiania 0.009 - 0.026 0.5 - 1.4 Chen & Xie, 2005b

Hyriopsis cumingii 0.022 - 0.039 1.2 - 2.1 Chen & Xie, 2005b

Lamprotula leai 0.021 - 0.058 1.1 - 3.1 Chen & Xie, 2005b

43 08:30

Toxinas muito potentes e possivelmente carcinogênicas;

Potencialmente podem ocorrer em qualquer ecossistema

aquático;

Ocorrem geralmente em altas concentrações intracelulares,

mas podem estar bastante diluídas no ambiente;

Altamente variáveis quanto a estrutura química e

propriedades;

Produzidas naturalmente sendo dificilmente consideradas

pelas legislações;

Moléculas relativamente estáveis e, portanto, não facilmente

degradadas.

Após Várias Décadas de Pesquisa sobre Cianotoxinas...

O Que Falta Saber?

Efeitos da toxicidade crônica

Mecanismos de detoxicação

Mecanismos de excreção