FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO...

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Dissertação de Mestrado

<,

ESTUDO DA VAZÃO MÁSSICA DE ADIÇÃO DE SUBSTRATO PARA O PROCESSO DE PRODUÇÃO DE 2,3-BUTANODIOL EM SISTEMA

DESCONTÍNUO ALIMENTADO

Daniela Fernanda Zanão

Tranferido da Biblioteca do DEBIQ para a Bilblioteca

Universitária em Junbo/2004 Proc. nº 202/04

Lorena - SP - Brasil 2001


PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL



Dissertação de mestrado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Industrial

Banca examinadora:

Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata (Presidente) Dr. Adalberto Pessoa Júnior Ora. Inês Conceição Roberto

Estudante:

Daniela Fernanda Zanão



PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL



Este exemplar corresponde à versão final da dissertação de mestrado aprovada pela banca examinadora.

Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata Orientador e Presidente da Banca Examinadora


À minha família,

Ao meu namorado Alípio.

AGRADECIMENTOS

A Deus pelas vitórias conquistadas.

Ao Departamento de Biotecnologia da Faculdade de Engenharia

Química de Lorena pela oportunidade de realizar este trabalho.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo apoio financeiro.

Ao Professor Arnaldo Márcio Ramalho Prata pela amizade e orientação,

pelo apoio, incentivo e compreensão, pelas sugestões fundamentais para o

meu crescimento profissional.

Aos Professores Inês Conceição Roberto e João Batista de Almeida

pelas sugestões, contribuições e ensinamentos imprescindíveis para a

realização deste trabalho.

Aos professores Maria das Graças de Almeida Felipe e Silvio Silvério da

Silva pelos ensinamentos e incentivos.

À Rita de Cássia, Paulo Roberto e Nicamor pela amizade e contribuição

em vários momentos.

Aos amigos e companheiros de pela amizade, ajuda e cooperação.

À todos que de algum modo contribuíram para a realização deste

trabalho

CONTEÚDO

LISTA DE TABELAS .i

LISTA DE FIGURAS .iii

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3

2.1. Materiais Lignocelulósicos 3

2.2. 2,3-BUT ANODIOL 6 2.2.1. Aplicações 6 2.2.2. Produção 8 2.2.3. Processos de Produção .16

3. OBJETIVOS 18

4. MATERIAL E MÉTODOS 19

4.1. Hidrolisado 19 4.1.1. Obtenção 19 4.1.2. Concentração 19 4.1.3. Tratamento 20

4.2. Fermentação 21 4.2.1. Microrganismo 21 4.2.2. Meio de ativação 21 4.2.3. Meio de fermentação (fase batelada) 21 4.2.4. Meio de alimentação 22 4.2.5. Condições de fermentação 22

4.3. Concentração de hidrolisado 23

4.4. Efeito da vazão mássica de adição de substrato 24 4.4.1. Planejamento estatístico 24

4.5. Métodos analíticos 25 4.5.1. Concentração de Açúcares e Ácido Acético 25 4.5.2. Concentração de Produtos 25 4.5.3. Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural.. 26 4.5.4. Concentração celular 26 4.5.5. kLa 26

4.6. Parâmetros Fermentativos 27

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 29

5.1. Caracterização do hidrolisado 29

5.2 .. Concentração de Substrato 30

5.3 Meio de Ativação " 34

5.4. Efeito da vazão mássica de adição de substrato 35 5.4.1. Análise estatística 45 5.4.2 Planejamento Rotacional 51 5.4.3. Análise estatística para o planejamento rotacional.. 57

6. CONCLUSÕES 65

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 66

APÊNDICE

LISTA DE TABELAS

Tabela 2.1 Aplicações do 2,3-butanodiol 8

Tabela 4.1 Nutrientes do meio empregado por FRAZER, McCASKEY (1989) 22

Tabela 4.2 Fatores e níveis do planejamento fatorial 24

Tabela 4.3 Matriz de planejamento experimental fatorial 22 completo com triplicata do ponto central.. 25

Tabela 5.1 Composição do hidrolisado obtido 29

Tabela 5.2 Concentração de açúcares redutores totais (ART) e volume de hidrolisado antes e após o tratamento realizado conforme item 4.1.3 31

Tabela 5.3 Teores de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) de diferentes hidrolisados: concentrado antes do tratamento e concentrado após o tratamento 32

Tabela 5.4 Composição do hidrolisado obtido antes e após tratamento 33

Tabela 5.5 Concentração de açúcares redutores totais estimada e obtida, em hidrolisado submetido a tratamento seguido de concentração 33

Tabela 5.6 Parâmetros fermentativos dos ensaios 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 conduzidos em sistema descontínuo alimentado, em diferentes valores de vazão mássica de adição de substrato 45

Tabela 5.7 Matriz corrigida do planejamento fatorial 22 com os níveis reais e codificados para os fatores concentração de substrato no meio de alimentação e vazão de alimentação e os resultados obtidos de conversão de xilose em 2,3-butanodiol. 46

Tabela 5.8 Estimativas dos efeitos, erros-padrão e teste t para a conversão de xilose em 2,3-butanodiol 47

Tabela 5.9 Análise de variância dos fatores concentração de substrato no meio de alimentação e vazão de alimentação e suas interações 48

Tabela 5.10 Análise de variância da curvatura para o modelo que representa a conversão de xilose em 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 48

Tabela 5.11 Matriz de planejamento experimental rotacional 51

Tabela 5.12 Parâmetros fermentativos dos ensaios 8, 9, 10 e 11 conduzidos em sistema descontínuo alimentado em diferentes valores de vazão mássica 52

Tabela 5.13 Matriz corrigida do planejamento rotacional apresentando os níveis reais e codificados para os fatores concentração de substrato e vazão de alimentação e resultados obtidos em conversão de xilose em 2,3-butanodiol 58

Tabela 5.14 Estimativa dos efeitos, erros - padrão e teste t para a conversão de xilose em 2,3-butanodiol. 58

Ta bela 5.15 Análise de variância dos fatores concentração de substrato no meio de alimentação e vazão de alimentação e suas interações 60

Tabela 5.16 Análise de variância de regressão para o modelo que representa a conversão de xilose em 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 60

ii

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1 Classificação das principais bactérias produtoras de 2,3-butanodiol (MAGEE, KOSARIC, 1987).9Erro! Indicador não definido.

Figura 2.2 Conversão de pentoses e pentióis a D-Xilulose-5-P. Enzimas: (1) Quinase; (2) lsomerase; (3) Desidrogenase; (4) 3-Epimerase; (5) 4-Epimerase 11

Figura 2.3 Via das Pentases-Fosfato (JANSEN, TSAO, 1983) 12

Figura 2.4 Conversão de Piruvato a 2,3-butanodiol (JANSEN, TSAO, 1983) 13

Figura 4.1 Evaporador a vácuo de capacidade para 4 L. 20

Figura 4.2 Fermentador de bancada tipo BIOFLO Ili (New Brunswick Sc.Co.) 23

Figura 5.1 Concentração celular (a) e velocidade de crescimento celular (b) em função do tempo, durante cultivo de Klebsiella pneumoniae em meio sintético, em frascos agitados 34

Figura 5.2 Concentrações de células (-•-), açúcares (-9-) e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-4'-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 50 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 138,4 g/L (ensaio 1 ) 37

Figura 5.3 Concentrações de células (-•·), açúcares (-•-> e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células (-•·), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 50 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 238, 1 g/L (ensaio 2) 38

Figura 5.4 Concentrações de células (-•·), açúcares (-•-> e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-~-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 150 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 150,5 g/L (ensaio 3) 39

Figura 5.5 Concentrações de células (-•-), açúcares (-8-) e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-4'-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 150 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 253,6 g/L (ensaio 4) 40

Figura 5.6 Concentrações de células (-•·), açúcares (-9-) e de butanodiol (-A.-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-~-) e de butanodiol (-/\-) (b), em função do tempo,

iii

durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 203,6 g/L (ensaio 5) 41

Figura 5.7 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-.6.-) (a) e massas de células (-•·), açúcares (-•-> e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontinuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 201,6 g/L (ensaio 6) 42

Figura 5.8 Concentrações de células (-•·), açúcares (-•-) e de butanodiol (-.A-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-• -) e de butanodiol (-h -) ( b ), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 198,7 g/L (ensaio 7) 43

Figura 5.9 Distribuição de resíduos que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação e da vazão de alimentação, durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 47

Figura 5.10 Superfície de resposta descrita pelo fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator 8), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 49

Figura 5.11 Curvas de nível descritas pelo fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator 8), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 50

Figura 5.12 Concentrações de células (-•-), açúcares (-9-) e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células(-•-), açúcares (-flt-) e de butanodiol (-.~-) (b) em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 117 ,4 gil ( ensaio 8) 53

Figura 5.13 Concentrações de células (-•·), açúcares (-9-) e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células(-•-), açúcares (-0-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 265,5 g/L (ensaio 9) 54

iv

Figura 5.14 Concentrações de células (-•·), açúcares <-•-) e de butanodiol {-.Ã-) (a) e massas de células(·•·), açúcares (-•-) e de butanodiol (-.A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 32,6 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 189,5 g/L (ensaio 10) 55

Figura 5.15 Concentrações de células (-•·), açúcares (-•-) e de butanodiol (-•-) (a) e massas de células(·•·), açúcares <-•-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 170 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 191,6 gil (ensaio 11) 56

Figura 5.16 Distribuição de resíduos do modelo proposto que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação e da vazão de alimentação, durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 59

Figura 5.17 Superfície de resposta descrita pelo modelo que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator 8), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 62

Figura 5.18 Curvas de nível descritas pelo modelo que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator 8), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado 63

Figura 5.19 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-> e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células(-•-), açúcares (-9-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 170 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de

- ·-

117, 1 g/L 64

V

RESUMO

Estudo da vazão mássica de adição de substrato para o processo de produção de 2,3-butanodiol em sistema descontínuo alimentado. Daniela Fernanda Zanão. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientador: Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, 12600-970, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. Adalberto Pessoa Jr. e Ora: Inês Conceição Roberto. Novembro de 2001.

Pelo presente trabalho estudou-se a produção de 2,3-butanodiol, a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, empregando-se a bactéria Klebsiella pneumoniae, em sistema descontínuo alimentado.

Verificou-se o limite de concentração do hidrolisado em função da perda de açúcares e de volume durante o tratamento. Com base nos resultados obtidos optou-se pelo tratamento antes da concentração, para reduzir as perdas de volume e de açúcar. Concluiu-se que o hidrolisado pode ser concentrado até cerca de 400 g/L de açúcares redutores sem inviabilizar sua utilização em processos fermentativos sob o ponto de vista material.

Com o objetivo de verificar o efeito da vazão mássica de adição de substrato foram empregados diferentes valores de vazão de alimentação e de concentração de açúcares no meio de alimentação, de acordo com um planejamento fatorial 22 com triplicata no ponto central. A partir do planejamento estatístico pôde-se obter um modelo matemático para a conversão de xilose em 2,3-butanodiol, no nível de 95% de confiança. O ponto máximo de conversão de substrato em produto (0,43 g/g) foi obtido- empregando-se um valor de vazão mássica de 19,9 g/h (Si= 117, 1 g/L e~= 170 mUh).

Verificou-se ainda que o hidrolisado hemicelulósico com elevado nível de concentração pode impedir a atividade da bactéria, provavelmente devido aos altos níveis de inibidores.

ABSTRACT

ln the present work Klebsiella pneumoniae was employed to produce 2,3-butanediol from eucalyptus hemicellulosic hydrolysate by fed-batch fermentation system.

The hydrolysate concentration limit, as a function of substrate and volume losses during the treatment was verified. Basead on the results, the hydrolysate was treated before evaporation to reduce the volume and substrate losses. lt was also found that concentrating the hydrolysate up to 400 g/L does not make it inviable for fermentation processes.

ln order to verify the effect of the mass rate of substrate addition, different values of feed rate and substrate concentration were employed, according to a 22

factorial design. This statistical design made it possible to obtain a mathematical model for the conversion of xylose into 2,3-butanediol, at 95% confidence level. The maximum conversion factor (0.43 g/g) was attained when the mass rate was 19.9 g/h (Si= 117.1 g/L and <!> = 170 mUh).

lt was also found that a highly concentrated hemicellulosic hydrolysate can impair the bacterial activity, probably dueto the high leveis of inhibitors.

1. INTRODUÇÃO

Os materiais lignocelulósicos constituem a principal forma disponível de

biomassa na natureza, sendo uma fonte de substrato barata e renovável. Em

conseqüência da natureza polissacarídica, os materiais lignocelulósicos não

são diretamente utilizados pelos microrganismos, sendo necessário hidrolisar

seus componentes nos respectivos monômeros. O emprego desses materiais

para produção de 2,3-butanodiol tem sido considerado de interesse na área de

conversão de biomassa em combustíveis líquidos e em substâncias químicas

de interesse industrial.

A produção de 2,3-butanodiol por via fermentativa é de grande interesse

devido a variedade de aplicações deste composto. Pode ser utilizado como

anticongelante, devido ao baixo ponto de congelamento (-60 ºC) de seu

isômero levo. É considerado um importante intermediário químico, podendo ser

transformado em diversas substâncias de interesse industrial, como é o caso

do 1,3-butadieno, importante substância química empregada na fabricação de

borracha sintética. Outro produto de interesse industrial obtido a partir do

2,3-butanodiol é a metil-etil-cetona (MEC), que é utilizada como solvente

industrial.

Uma grande parte das substâncias nas quais o 2,3-butanodiol pode ser

convertido são atualmente obtidas do petróleo. Como a produção mundial do

petróleo encontra-se permanentemente ameaçada por problemas políticos ou

de esgotamento, tem-se aumentado o incentivo ao desenvolvimento de

tecnologias para produção de 2,3-butanodiol por via fermentativa.

1

A bactéria Klebsiella pneumoniae possui a capacidade de utilizar os

principais açúcares (glicose, xilose, arabinose e celobiose) derivados de

hidrolisados hemicelulósicos, além de ter a vantagem de ser facilmente

cultivada, crescendo rapidamente em meios simples.

Estudos foram realizados no DEBIQ-FAENQUIL visando otimizar o

processo de produção de 2,3-butanodiol o que tem permitido alcançar

produtividades cada vez maiores. PRATA (1997) empregou o sistema

descontínuo alimentado para produzir 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto, obtendo uma produtividade, eficiência e máxima

concentração de produto de 1,86 g/Lh, 80 % e 29,4 g/L, respectivamente,

porém com uma concentração de produto relativamente baixa, comparando-se

com os dados da literatura. Entende-se que esta concentração pode ser

aumentada fornecendo-se uma maior quantidade de substrato, uma vez que a

eficiência de conversão apresenta um valor próximo do teórico. Além disto,

GARCIA (1999) utilizando uma vazão de alimentação igual a 72 ml/h e S0 igual

a 90 g/L, verificou que não houve um acúmulo de substrato no meio na

condição de fermentação que proporcionou o melhor resultado de produção de

2,3-butanodiol, obtendo uma produtividade de 2, 15 g/Lh. Isso possibilita a

utilização de uma vazão de alimentação maior, o que resultaria em maiores

valores de produtividade. Assim, através do presente trabalho, pretende-se

aumentar a conversão de substrato em 2,3-butanodiol e a concentração de

produto no meio fermentado, determinando-se a melhor vazão mássica de

alimentação de substrato.

2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Materiais Lignocelulósicos

Grandes quantidades de resíduos vegetais e agro-industriais são

gerados e acumulados na natureza, ocasionando sérios problemas de poluição

ambiental (US ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, 1995). Estes

resíduos constituem reservas naturais renováveis e representam uma

importante fonte de matérias primas de baixo custo que podem ser utilizadas

para obtenção de insumos de alto valor como combustíveis líquidos e

substâncias químicas (KERN et ai., 1998).

O Brasil é um dos países que mais realiza reflorestamento, ocupando o

3º lugar dentre os países de clima tropical, com uma área plantada de 7

milhões de hectares, o que representa 16% dos 44 milhões registrados pela

FAO (Food Agricultura! Organization) em 1994. Este órgão estima uma

expansão das plantações para o ano 2050, de 3,2 vezes a área plantada em

1991.

Em virtude de seu rápido crescimento e o não comprometimento com as

florestas nativas e da aplicabilidade de sua madeira para diversos fins, o

eucalipto tem sido a essência florestal mais procurada para reflorestamento no

Brasil (GOMES, COUTO, 1986), o qual teve início em 1967 com o plantio de

13.877 hectares do mesmo em vários estados do país (MAGALHÃES, 1986). O

Governo do Estado de São Paulo tem planejado incrementar a área de

3

plantações de eucalipto de 750 mil hectares em 1990 para algo entre 1,5 e 2,8

milhões de hectares no ano de 2015 (FEARNSIDE, 1998).

Estes resíduos constituem a principal forma disponível de biomassa na

natureza, (KOUKLOS, VALKANAS, 1982). Os principais componentes dos

materiais lignocelulósicos são celulose, hemicelulose e lignina, em proporções

que variam de 40% a 50%, 15% a 30% e 10% a 30%, respectivamente

(DEKKER, 1985). Como exemplo pode-se citar o eucalipto, com cerca de 40 a

62% de celulose, 12 a 22% de hemicelulose e 15 a 22% de lignina (VITAL,

DELLA LUCIA, 1986).

A celulose, base estrutural da parede celular dos vegetais, pode ser

descrita como um polímero linear de moléculas de glicose, unidas por ligações

glicosídicas p-1,4; a hemicelulose é um polímero altamente complexo,

constituído por diferentes pentoses (xilose e arabinose) e hexases (glicose,

manose e galactose); a lignina, encontrada na parede celular de todas as

plantas vasculares, é uma macromolécula de estrutura polifenólica complexa

(FENGEL, WEGENER, 1989).

De acordo com DALE (1987), o custo de vários produtos de fermentação

de importância dependem do custo da fonte de carboidrato. Segundo este

autor, a conversão de materiais lignocelulósicos oferece potencial para a

obtenção de açúcares fermentescíveis de baixo custo. Para alcançá-lo é de

fundamental importância o uso integrado de todos os componentes da

biomassa vegetal. Esta condição também é mencionada por GARG, JAIN

( 1995) em sua revisão sobre produção fermentativa de 2,3-butanodiol.

Segundo Flickinger (1980), citado por YU et ai. (1985), a hemicelulose

pode servir como uma fonte abundante e barata de carboidratos

fermentecíveis. A eficiente utilização da hemicelulose poderia aumentar a

economia de muitos dos processos que geralmente enfatizam a conversão da

celulose em combustíveis líquidos e substâncias químicas. Somente a fração

celulósica é hoje utilizada para a manufatura de papel à partir da polpa de

madeira, ao passo que a lignina e a fração hemicelulósica são queimadas para

produzir calor ou descartadas (CONVERTI et ai., 2000) .

Em conseqüência de sua natureza polissacarídica, os materiais

lignocelulósicos não são utilizados diretamente pelos microrganismos em

processos fermentativos, sendo necessário proceder hidrólise de seus

4

componentes (DEKKER, 1985). Os principais produtos obtidos por hidrólises

químicas e enzimáticas de frações hemicelulósicas são uma mistura de

pentases (L-arabinose e D-xilose), hexoses (D-glucose, D-galactose e D-

manose), e dímeros de baixa massa molar como, por exemplo, a celobiose

(YU, SADDLER, 1982). Vários de métodos têm sido empregados para se

proceder ao fracionamento dos materiais lignocelulósicos, tais como hidrólise

ácida (TSAO, 1986) e enzimática (MOTWANI et ai. 1993). YU et ai. (1982)

estudaram a hidrólise ácida de lascas de madeira, submetidas previamente a

explosão a vapor, para produção de 2,3-butanodiol pela bactéria Klebsiella

pneumoniae. Utilizando material lignocelulósico, GONG et ai. (1997)

empregaram um processo de sacarificação e fermentação simultâneas para a

produção de 2,3-butanodiol. Neste caso, as frações de celulose e hemicelulose

foram hidrolisadas pela celulase, obtendo-se glicose, xilose e uma mistura de

outros açúcares em menor quantidade, predominando arabinose. Foram

obtidas maiores velocidades de hidrólise e rendimento em produto que nos

processos envolvendo hidrólise e fermentação separadas. Segundo Parisi

(1989), citado por PALMQUIST et ai. (2000), a hidrólise enzimática leva a um

maior rendimento em monossacarídeos que hidrólise ácida, devido a enzima

celulase catalizar somente as reações de hidrólise e não as reações de

degradação.

De acordo com FRAZER, McCASKEY (1989) um dos principais

problemas relativos a utilização dos hidrolisados hemicelulósicos é a presença

de substâncias inibidoras do crescimento dos microrganismos. Leonard, Hajny

(1945), citados por FRAZER, McCASKEY (1991), identificaram quatro grupos

de inibidores do crescimento microbiano em hidrolisado de madeira. O primeiro

grupo consiste de inibidores derivados de metais ou minerais presentes na

madeira, no solo ou nos equipamentos de hidrólise; o segundo é o grupo de

produtos da decomposição de carboidratos, incluindo furfural,

hidroximetilfurfural; os outros dois grupos são formados principalmente por

compostos fenólicos, incluindo produtos da degradação da lignina e compostos

derivados dos extrativos da madeira. NISHIKAWA et ai. (1988), em estudo

realizado com diversos inibidores concluíram que em baixas concentrações ou

com o prolongamento no tempo de fermentação pode-se atenuar o efeito

inibidor de alguns desses compostos. O processo de evaporação a vácuo é

5

necessário para aumentar a quantidade de açúcares nos hidrolisados. Este

processo associado com tratamento utilizando carvão ativado reduz a

concentração de ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e compostos

fenólicos (RODRIGUES et ai., 2001).

CONVERTI et ai. (2000) empregando o processo de "steam explosion"

para a hidrólise de Eucalyptus globulus para a produção de xilitol realizaram

diversos tratamentos para a remoção dos compostos inibidores. A precipitação

através de elevação e abaixamento de pH e a adsorção com carvão ativo

foram mais adequados para remoção dos compostos derivados da lignina.

PRATA, HISS (1998) verificaram que o tratamento por elevação do pH com

CaO e abaixamento com H2S04 combinado com a adsorção por carvão ativo

proporcionaram melhores resultados de crescimento da bactéria Klebsiel/a

pneumoniae em meio preparado com hidrolisado hemicelulósico de eucalipto,

obtido por hidrólise ácida.

2.2. 2,3-BUTANODIOL

2.2.1. Aplicações

O emprego de materiais lignocelulósicos para a produção de

2,3-butanodiol tem sido considerado de interesse na área de conversão de

biomassa em líquidos combustíveis e substâncias químicas de interesse

industrial.

O 2,3-butanodiol, também conhecido como 2,3-butilenoglicol,

2,3-dihidroxibutano e dimetilenoglicol, é um composto orgânico de grande

interesse econômico. Pode ser obtido tanto por via química como por via

fermentativa, sendo o principal produto da fermentação butileno-glicólica

(MAGEE, KOSARIC, 1987).

As pesquisas para obtenção do 2,3-butanodiol por via fermentativa se

intensificaram durante a li Guerra Mundial em antecipação à falta do

1,3-butadieno sintético obtido por fontes petroquímicas. Este composto pode

ser produzido pela desidratação do 2,3-butanodiol e usado na manufatura de

6

borracha sintética (PRESCOTT, DUNN, 1959; MADDOX, 1988). O processo

fermentativo de produção de 2,3-butanodiol tornou-se inviável em face do

desenvolvimento da rota química de obtenção do 1,3-butadieno a partir do

petróleo (VOLOCH et ai., 1985).

O 2,3-butanodiol possui uma série de aplicações, entre as quais

podemos citar a utilização do isômero levo, que devido ao seu baixo ponto de

congelamento (-60ºC), é a base de interesse comercial para uso como

anticongelante (Clendenving, 1946 e Clendenving, Wright, 1946, citados por

MAGEE, KOSARIC, 1987). SOL TYS et ai. (1998) empregaram 2,3-butanodiol

para o congelamento de fígado de rato, e EVANS, AZEMAN (1998) estudaram

as propriedades do dimetil sulfóxido e do 2,3-butanodiol como crioprotetores.

Pode também ser utilizado como combustível líquido, uma vez que possui calor

de combustão maior que o do metanol e próximo ao do etanol (MAGEE,

KOSARIC, 1987). O 2,3-butanodiol é um composto biodegradável podendo ser

empregado como um solvente ou agente de ligação para a produção de tintas

e polímeros, não agredindo o meio ambiente (AFSCHAR et ai., 1993).

O 2,3-butanodiol é conhecido por ter uma aplicação potencial na

obtenção de tintas de impressão, perfumes, explosivos, plastificantes e como

suporte para a indústria farmacêutica, entre outros (MAGEE, KOSARIC, 1987).

Este composto também pode ser transformado em diversas substâncias de

interesse para a indústria, sendo caracterizado como um importante

intermediário químico (MAGEE, KOSARIC, 1987). A Tabela 2.1 apresenta uma

relação de compostos dos quais o 2,3-butanodiol é precursor.

A maior parte dos compostos nos quais o 2,3-butanodiol pode ser

convertido, atualmente são obtidos a partir do petróleo. No entanto, as

atividades industriais baseadas nessa matéria-prima encontram-se

permanentemente ameaçadas por problemas de esgotamento ou políticos

(MERCADO, 2000).

7

Tabela 2.1 Aplicações do 2,3-butanodiol

COMPOSTO PROCESSO FINALIDADE REFERÊNCIA

Meti 1-eti 1-cetona Desidratação Solvente industrial NEISH,

catalisada por e aditivo para LEDINGHAM (1949)

ácido combustível

Éter Reação com Mistura à gasolina VOLOCH et ai.

tetra-metílico acetona (1985)

Diacetil Desidrogenação Aditivo para MAGEE, KOSARIC

catalítica alimentos (1987)

1,3-butadieno a. Desidrogenação Borracha sintética MAGEE, KOSARIC

catalítica de (1987)

2-buteno

b. Esterificação

com ácido acético e

pirólise do

diacetato formado

Diésteres do Esterificação Plastificantes de VOLOCH et ai.

butanodiol polímeros (1985)

termoplásticos

Adaptado de SILVEIRA (1991)

2.2.2. Produção

2.2.2.1. Microrganismo

Segundo Fields, Richmod (1967), citados por MAGEE, KOSARIC (1987),

inúmeras leveduras e fungos filamentosos têm habilidade de formar

2,3-butanodiol, no entanto os rendimentos são extremamente baixos, e em

conseqüência disso os processos que empregam estes microrganismos são

inviáveis. As bactérias são consideradas os organismos de importância

8

industrial para a fermentação butileno-glicólica (GARG, JAIN, 1995). As

principais espécies são encontradas no gênero Klebsiella, Bacillus, Serratia e

Pseudomonas (Figura 2.1) (MAGEE, KOSARIC, 1987). SAHA, BOTHAST

(1999) empregaram Enterobacter c/oacae no processo de obtenção de

2,3-butanodiol. CONVERTI et ai. (2001) utilizaram Enterobacter aerogenes e

Bacil/us licheniformis para produção de 2,3-butanodiol.

Klebsiel/a pneumoniae e Bacil/us po/ymyxa são as bactérias usualmente

utilizadas para produção comercial de 2,3-butanodiol (MADDOX, 1988). Porém,

K/ebsiella pneumoniae produz o dobro de 2,3-butanodiol em relação ao Bacillus

polymyxa e apresenta baixa produção de etanol (MAGEE, KOSARIC, 1987). As

principais características dessa bactéria são a estabilidade genética (LONG,

PATRICK, 1963); a ausência de problemas de inibição pelo produto formado,

podendo chegar a concentrações de 2,3-butanodiol de 80 g/L

(SABLAYROLLES, GOMA, 1982) ou 90 g/L (TSAO, 1986) no meio de

fermentação. Um dos principais atributos da Klebsiella pneumoniae na

conversão de biomassa é sua capacidade de converter todos os principais

açúcares presentes nos hidrolisados hemicelulósicos (YU, SADDLER, 1982) e

celulósicos (YU et ai., 1984) em 2,3-butanodiol.

ORDEM FAMÍLIA GÊNERO ESPÉCIE

Klebsiella ----K preummioe

~area,L~---- E oerogenes

~&rraria-----Srrnrcescens Eubacterial

Pseudotmnadales---- Pseudotmnadaceae - Aeromnas --- A hydrophila

Figura 2.1 Classificação das principais bactérias produtoras de 2,3-butanodiol (MAGEE, KOSARIC, 1987).

9

2.2.2.2. Via Metabólica

O mecanismo bioquímico de obtenção de 2,3-butanodiol a partir de

pentases, por Klebsiella pneumoniae, consiste na conversão das mesmas em

xilulose-5-fosfato (Figura 2.2), a qual é convertida completamente em triose

utilizando as enzimas transaldolase e transcetolase da via das

Pentases-Fosfato, como ilustrado na Figura 2.3. Gliceraldeído-3-fosfato é

convertido a piruvato por enzimas da via glicolítica. A conversão de piruvato a

2,3-butanodiol, segundo JANSEN,TSAO (1983) é mostrada na Figura 2.4.

Os produtos da fermentação butileno-glicólica obtidos a partir de glicose,

identificados por PIRT (1957), são 2,3-butanodiol, etanol, C02, ácido fórmico e

acetoína. JANSEN, TSAO (1983), em trabalho sobre a bioconversão de

pentases em 2,3-butanodiol por Klebsiel/a pneumoniae, citam como produtos

provenientes desta fermentação os mesmos do metabolismo de glicose.

2.2.2.3. Fatores que influenciam a formação de produto

Temperatura

De acordo com MAGEE, KOSARIC (1987), a temperatura ótima para a

produção bacteriana de 2,3-butanodiol está no intervalo de 30-35 ºC.

CONVERTI et ai. (2001 ), utilizando Enterobacter aerogenes e Bacil/us

licheniformis para produção de 2,3-butanodiol, testaram diferentes

temperaturas entre 20 ºC e 45 ºC. Enterobacter aerogenes não mostrou

sensibilidade significativa a este parâmetro, sendo que os maiores rendimentos

de conversão foram encontrados a 39 ºC. Para Bacillus licheniformis, o máximo

rendimento foi obtido a 37 ºC, enquanto que houve um decréscimo na

produção de 2,3-butanodiol nas demais temperaturas. PIRT, CALLOW (1958),

utilizando cultura contínua para conversão de sacarose em 2,3-butanodiol por

Klebsiella pneumoniae, encontraram 30-37 ºC como intervalo ótimo de

temperatura. JANSEN, TSAO (1983) concluíram que a temperatura ótima para

crescimento da bactéria e para a formação de produto é aproximadamente

37 ºC. De fato, a maioria dos trabalhos que envolvem a produção de

2,3-butanodiol por Klebsiel/a pneumoniae é realizada a 37 ºC (FRAZER,

10

McCASKEY, 1989; SILVEIRA et ai., 1998; BERBERT, 1995; MENZEL et ai.,

1996; GARCIA, 1999). Alguns dos trabalhos que visam a produção de

2,3-butanodiol a partir de resíduos lignocelulósicos empregando esta bactéria

foram conduzidos a 37 ºC (GARCIA, 1999; FRAZER, McCASKEY, 1989; YU,

SADDLER, 1982; SADDLER et ai., 1983)

D-Ribose ( 1) D-Ribose-5-P

t (2)

D-Arabinose - (2) • + D-Ribulose (1) • D-Ribulose-5-P

Ribitol (3) t t D-Xilose (2) (4) l D-Lixose (2) +

• D-Xilulose-5-P -·--

D-Xilulose--(1) - t ~

D-Arabitol --(3) (5)

Xilitol (3 + L-Arabi nose---{2) • L-Ribulose--(1) • L-Ribulose-5-P

t (4)

L-Xilose (2) + + L-Lixose (2) L-Xilulose-(1) • L-Xilulose-5-P

L-Arabitol (3) t

Figura 2.2 Conversão de pentoses e pentióis a D-Xilulose-5-P. Enzimas: (1) Quinase; (2) lsomerase; (3) Desidrogenase; (4) 3-Epimerase; (5) 4- Epimerase.

11

Xilulose-5-P

i Ribulose-5-P

+ Ribose-5-P

1

Xilulose-5-P

1 V

____ T_r_an__,s/\tolase

+ Gliceraldeído-3-P

1

+ Sedoheptulose-7-P

1

Xi I ui ose-5-P

V Transaldolase

..-------/\'--------11 . + ... Entrose-4-P Frutose-6-P

ATP~l ATP~

Frutose-6-P ., 2 F rutose-16-di-P

V Transcetolase ..-----___,/\..____ + +

Gliceraldeído-3-P

+ 2 Diidrosiacetona-P 2 Gliceraldeído-3-P

2 Gliceraldeido-3-P

Reação global: 3 Xilulose-5-P + 5 ATP"-+ 5 Gliceraldeido-3-P

Figura 2.3 Via das Pentoses-Fosfato (JANSEN, TSAO, 1983).

12

CH3 C02 CH3 C02 CH3 NAD+ CH3 1 ?+ 1 / 1 ~ ... 1 C=O ... C=O ... C=O .11111 H-C-OH 1 1 ? 1

7oH2 1

COOH H3C-C-OH H3C-C-OH H-C-OH 1 1 1 COOH H CH3

2 Piruvato Acetolactato Acetil Metil

Carbinol

2,3-Butanodiol

Figura 2.4 Conversão de Piruvato a 2,3-butanodiol (JANSEN, TSAO, 1983)

pH

Assim como a temperatura, o pH é um parâmetro fundamental na

regulação do metabolismo bacteriano (MAGEE, KOSARIC, 1987). GROVER et ai. (1990) examinaram o efeito do pH sobre a produção de 2,3-butanodiol a

partir de hidrolisado de madeira, por Klebsiella pneumoniae, e verificaram que

o pH inicial ótimo variava entre 5,5 e 6,0. Segundo PIRT, CALLOW (1958) a

máxima produção de 2,3-butanodiol ocorre em uma faixa de pH que varia de

5,0 a 6,0. Em valores de pH acima de 6,0 a produção decresce, aumentando a

formação de acetato. PRATA (1997) observou que a produção de

2,3-butanodiol, por Klebsiella pneumoniae, em meio preparado com hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto, é favorecida em pH 5,8.

STÕRMER (1968a e b), descobriu que o pH ótimo para a ação da

enzima acetolactato sintase, necessária para a produção de 2,3-butanodiol, se

situa em torno de 5,8, e que o acetato tem o poder de ativar esta enzima e que

a atividade enzimática é inibida por fosfato e sulfato. Coincidentemente o pH

ideal para a atividade da acetolactato sintase, 5,8, se encontra na faixa de pH

na qual o ácido acético se apresenta em sua forma dissociada, ou seja acetato

(MAGEE, KOSARIC, 1987).

13

Concentração de substrato

Outro fator de grande importância para fermentação butileno-glicólica é a

concentração inicial de substrato. YU, SADDLER (1983) investigaram a

produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em altas concentrações

de açúcares. Sob condições limitadas de ar, 50 g de D-glucose e D-xilose por

litro foram convertidas de modo eficiente a 2,3-butanodiol, no entanto, a

eficiência da conversão decresceu com o aumento da concentração de

substrato (acima de 200 g/L). Esta tendência foi também observada em meios

contendo L-arabinose, D-galactose, D-manose e D-celobiose. Segundo Esener

et ai. (1981), citados por JANSEN, TSAO (1983), o decréscimo da velocidade

específica de crescimento com o aumento da concentração de substrato se

deve a diminuição da atividade de água.

SILVEIRA et ai. (1998), na fermentação de sacarose em sistema

descontínuo, verificou que o crescimento de Klebsiella pneumoniae é inibido

por concentrações iniciais de substrato acima de 60 gil. Utilizando uma

concentração inicial de 95 g/L de sacarose obteve-se uma produtividade de

1,34 g/L.h e uma conversão de substrato em produto de 0,49 g/g. No entanto,

para concentrações iniciais de sacarose acima de 100 g/L houve um

decréscimo no rendimento e na produtividade. Utilizando uma concentração

inicial de substrato de 204 g/L os valores de rendimento e produtividade obtidos

foram, respectivamente de 0,41 g/g e 1,05 g/Lh. Para evitar este problema foi

proposta a condução do processo em regime batelada alimentada. AFSCHAR

et ai. (1991) para minimizar a inibição da velocidade de crescimento celular por

altas concentrações de substrato empregou, para a produção de 2,3-butanodiol

a partir do melaço, o sistema de batelada com pulso de substrato. Após o

cultivo atingir uma alta concentração celular uma nova quantidade de substrato

foi adicionada. Utilizando esta fermentação em batelada com pulso de

substrato foi possível obter uma concentração de 98,6 g/L de 2,3-butanodiol.

A ótima concentração de açúcar freqüentemente depende do tipo de

matéria prima utilizada como fonte de carbono. Quando se utiliza meio

proveniente de materiais lignocelulósicos, por exemplo, um aumento na

concentração de açúcares resulta em aumento de outros componentes do

meio, sendo que alguns destes são inibitórios. Para meio sintético, quando

14

compostos inibitórios não estão presentes, a concentração inicial de açúcar de

aproximadamente 200 g/L pode ser empregada. (MADDOX, 1988).

A atividade de água pode explicar porque o processo de obtenção de

2,3-butanodiol é mais difícil com uma fonte complexa de carboidratos como

melado, hidrolisado de amido, ou hidrolisado de celulose. A concentração de

soluto total nestas fontes complexas de carbono é relativamente maior devido a

presença de não-carboidratos, como os compostos tóxicos. Esta maior

concentração de soluto causa diminuição da atividade de água, o que pode

explica as baixas velocidades metabólicas (JANSEN, TSAO, 1983).

Suprimento de oxigênio

Este é outro parâmetro importante que afeta o processo fermentativo. O

2,3-butanodiol é um produto do metabolismo anaeróbio, sendo que sua síntese

se inicia quando a concentração de oxigênio do meio se aproxima de zero

(JANSEN et ai., 1984). No entanto, SILVEIRA (1991) observou a formação de

produto em concentrações de oxigênio de até 80 % da concentração de

saturação em fermentação de sacarose por Klebsiella pneumoniae. No trabalho

de GARCIA (1999), em processo descontínuo alimentado, a partir de

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, também houve formação de

2,3-butanodiol em concentrações semelhantes de oxigênio dissolvido. Porém,

houve um nítido favorecimento da produção no momento em que a

porcentagem de oxigênio dissolvido no meio tornou-se próxima de zero.

JANSEN et ai. (1984) mostraram que um alto suprimento de oxigênio favorece

a formação de massa celular em detrimento da produção de 2,3-butanodiol.

Um decréscimo do suprimento de oxigênio aumenta o rendimento em produto,

porém leva a um decréscimo da velocidade de conversão devido a baixa

concentração celular. Neste sentido GARCIA (1999) definiu a melhor condição

de suprimento de oxigênio para o sistema descontínuo alimentado de produção

de 2,3-butanodiol, a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto. A

aeração foi avaliada em termos do coeficiente volumétrico de transferência de

oxigênio (kLa). Os resultados mostraram que a maior produtividade (2, 15 g/Lh)

foi encontrada utilizando-se o valor de kLa inicial igual a 100 n'. na fase de

batelada do processo descontínuo alimentado.

15

2.2.3. Processos de Produção

Diferentes sistemas de produção podem ser empregados em processos

fermentativos. Muitos estudos sobre fermentação de 2,3-butanodiol têm usado

a tradicional fermentação em sistema descontínuo (SABLA YROLLES, GOMA,

1984; RAMACHANDRAN et ai. 1990; BERBERT, 1995; JANSEN et ai. 1984).

Uma desvantagem da cultura em sistema descontínuo é que a concentração

final de 2,3-butanodiol é limitada por altas concentrações de substrato inicial

(JANSEN, TSAO, 1983). Para evitar este problema, alguns autores propõem

conduzir o processo em sistema descontínuo alimentado (SILVEIRA et ai.,

1998; OLSON, JOHNSON, 1948). O sistema descontínuo alimentado também

é indicado quando se tem problema de inibidores no meio de fermentação

(MOSER, 1985), como no emprego de materiais lignocelulósicos em que o

processo de hidrólise resulta na formação de diversos compostos inibidores

(SJOLANDER et ai., 1938). A produção de 2,3-butanodiol através de sistema

contínuo não é favorável, devido às baixas concentrações de produto e

rendimento obtidos, porém os níveis de produtividade são nitidamente

superiores aos demais (JANSEN, TSAO, 1983).

AFSCHAR et ai. (1991), na produção de 2,3-butanodiol a partir do

melaço, conduziram fermentações em sistema contínuo, descontínuo

alimentado e descontínuo com pulso de substrato. Os melhores valores de

produtividade (1,0 - 1, 1 g/L.h), rendimento (96 - 100% do valor teórico) e

concentração de 2,3-butanodiol (95,2 - 98,6 g/L) foram obtidos utilizando-se o

sistema de descontínuo com pulso.

GARCIA (1999) na produção de 2,3-butanodiol a partir de hidrolisado

hemicelulósico de eucalipto empregando o sistema descontínuo alimentado, na

condição de fermentação que proporcionou o melhor resultado de produção,

obteve uma produtividade de 2, 15 g/Lh. Numa tabela comparativa das

produtividades obtidas em diferentes formas de condução do processo

(Tabela 2.2), o autor ressalta o seu processo como promissor, em razão do

valor obtido, considerando o uso de uma matéria prima impura.

16

Tabela 2.2 Alguns resultados descritos na literatura para a fermentação butileno-glicólica por Klebsiel/a pneumoniae

Modo de Substrato ou Yp,s Produtividade Referência operação Matéria-Prima (g/g) (g/Lh)

Batelada Glicose 0,45 1,10 SABLA YROLLES, GOMA, 1984

Batelada Sacarose 0,41 1,05 SILVEIRA, 1991

Batelada Xilose 0,30 1,35 JANSEN etal., 1984

Batelada Lactose 0,21 0,86 RAMACHANDRAN et ai., 1990

Batelada Melaço 0,50 1, 10 AFSCHAR et ai., 1991

Batelada Hidrolisado de 0,48 - FRAZER, madeira McCASKEY, 1989

Batelada Caldo-de-cana - 3,2 BERBET, 1995

Batelada Glicose 0,37 0,92 OLSON, alimentada JOHNSON, , 1948

Batelada Glicose 0,46 0,50 YU, SADDLER, alimentada 1983

Batelada Sacarose 0,35 2,63 SILVEIRA, 1991 alimentada

Batelada Hidrolisado de 0,45 1,86 PRATA, 1997 alimentada eucalipto

Batelada Xilose 0,50 0,50 YU, SADDLER, alimentada 1983

Contínuo Sacarose 0,32 3,28 PIRT, CALLOW, 1958

Contínuo e/ Glicose 0,43 9,84 RAMACHANDRAN, reciclo GOMA, 1988

17

3. OBJETIVOS

Geral

Aumentar a conversão de substrato em 2,3-butanodiol e a concentração

de produto no meio fermentado para o processo de obtenção de 2,3-butanodiol

por Klebsiella pneumoniae a partir de hidrolisado hemicelulósico de eucalipto,

em sistema descontínuo alimentado.

Específicos

• Verificar o limite de concentração do hidrolisado em função da perda de

açúcares e de volume durante o tratamento.

• Estudar a vazão de alimentação e a concentração de substrato no meio de

alimentação, em sistema descontínuo alimentado, visando a máxima

conversão de substrato em 2,3-butanodiol e concentração de produto no

meio fermentado.

18

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Hidrolisado

4.1.1. Obtenção

O hidrolisado hemicelulósico de eucalipto foi obtido a partir de cavacos

de eucalipto com dimensões aproximadas de 20 x 1 O x 5 mm, provenientes da

indústria de Papel Simão Ltda. A hidrólise foi conduzida em reator cilíndrico tipo

eixo rotativo a alta pressão, utilizando-se o processo de hidrólise ácida, nas

seguintes condições: solução ácida 0,35 % de ácido sulfúrico; relação matéria

seca : solução ácida igual a 1 :4; temperatura de 156 ºC e tempo de 26 minutos.

Após separar o hidrolisado do cavaco, este foi filtrado para separação dos

sólidos em suspensão.

4.1.2. Concentração

O hidrolisado foi concentrado à vácuo, em evaporador de capacidade

para 4,0 L (Figura 4.1 ), a uma temperatura de 70 ± 5 ºC, afim de se obter

teores de açúcares redutores desejados.

19

4.1.3. Tratamento

Antes de se proceder ao preparo do meio de fermentação o hidrolisado

foi submetido a um tratamento para remoção de compostos inibidores do

crescimento microbiano. O tratamento se baseou na variação do pH (elevação

a 8,0 com óxido de cálcio e abaixamento a 5,4 com ácido sulfúrico) seguida da

adsorção por carvão ativo em pó. O hidrolisado ficou em contato com o carvão

(15% após concentração e 4% antes da concentração) durante 1 hora, sob

agitação mecânica e temperatura de 30 ± 5 ºC. Em seguida o mesmo foi

separado por filtração.

Ci) Entrada de hidrolisado ! 11 : 0 Saída de hidrolisado

concentrado . 6 \ 0 Vácuo e saída de 1 1 )

.. ~-,..

condensado ; 10 ) © Entrada de vapor

( 5) 8 © Saída de vapor

. 7 ) i 9 1 ® Entrada de água de - resfriamento 0 Saída de água de resfriamento

- (!) Reservatório de líquido 1 3) ® Aquecimento

-- ~ Condensador

( 4 !

@ Defletor de espuma

1 2 1 --

Figura 4.1 - Evaporador a vácuo de capacidade para 4 L.

20

4.2. Fermentação

4.2.1. Microrganismo

Foi empregada, para todos os experimentos, a bactéria Klebsiella

pneumoniae NRRL 8-199, a qual foi mantida sob refrigeração em ágar

inclinado, contendo nutrientes do meio sintético FRAZER, McCASKEY (1989)

(Tabela 4.1).

4.2.2. Meio de ativação

Para a identificação da fase de maior velocidade de crescimento da

bactéria para que a inoculação fosse feita com as células nestas condições, a

bactéria foi ativada em meio sintético, em frascos Erlenmeyer de volume útil de

500 ml, sendo o volume utilizado de 100 ml, por cerca de 1 O horas, sob

agitação de 180 rpm, a 37 ºC, em incubadora de movimento circular (lnnova

4000 - New Brunswick Sc.Co.).

O meio foi constituído por uma solução de xilose suplementada com

nutrientes do meio sintético (Tabela 4.1). Após a adição dos nutrientes o pH foi

ajustado para 6,2, quando necessário. A concentração inicial de xilose no meio

foi de 20 gil.

4.2.3. Meio de fermentação (fase batelada)

O meio foi constituído por uma solução de xilose (30 g/L) e nutrientes do

meio sintético (Tabela 4.1). Após a mistura das soluções o pH foi ajustado para

6,9, quando necessário.

21

4.2.4. Meio de alimentação

O meio foi constituído pelo hidrolisado hemicelulósico de eucalipto obtido

e tratado conforme descrito anteriormente, e suplementado com os nutrientes

do meio sintético (Tabela 4.1). Após a adição dos nutrientes e ajuste do pH

para 5,8 o meio foi filtrado para remoção de sólidos em suspensão. As

soluções dos nutrientes foram preparadas com concentrações 40 vezes

maiores que as indicadas na Tabela 4.1, para evitar a diluição do hidrolisado no

momento do preparo do meio. Todas as soluções foram esterilizadas a 121 ºC

por 15 minutos.

Tabela 4.1 Nutrientes do meio empregado por FRAZER, McCASKEY (1989).

Nutriente Concentração final (g/L)

Fosfato diásico de amônio (NH4)2HP04 4,0

Fosfato monobásico de potássio (KH2P04) 1,0

Cloreto de sódio(NaCI) 1,0

Fosfato dibásico de sódio (Na2HP04) 1,0

Sulfato de magnésio (MgS04) 0,2

Extrato de levedura 1,5

pH = 6,2

4.2.5. Condições de fermentação

Foi empregado sistema descontínuo alimentado, sendo os ensaios

conduzidos em fermentador de bancada tipo BIOFLO Ili (New Brunswick

Sc.Co.) (Figura 4.2), com capacidade útil de 1,25 L, equipado com controle de

temperatura, pH, agitação e aeração, e medidor de oxigênio dissolvido. Na fase

inicial (batelada) os experimentos foram conduzidos a 37 ºC, pH mantido em

5,8 (ajustado com NaOH 6 N), sendo a aeração e a agitação definidas

conforme o valor de kLa (100 h-1). A concentração celular inicial foi igual a

22

0,6 g/L. A alimentação foi iniciada após 4 horas, quando a velocidade de

consumo de substrato for máxima (GARCIA, 1999).

Figura 4.2 Fermentador de bancada tipo BIOFLO Ili (New Brunswick Sc.Co.).

4.3. Concentração de hidrolisado

Inicialmente o hidrolisado foi concentrado até teores de açúcares

redutores totais iguais a 2,6, 6,0, 6,9 e 10,0 vezes o seu valor inicial. Em

seguida foi submetido ao tratamento descrito no item 4.1.3 e analisado quanto

ao teor açúcares redutores totais e volume final de hidrolisado.

23

4.4. Efeito da vazão mássica de adição de substrato

Nesta etapa foi empregado um planejamento fatorial completo de acordo

com a metodologia proposta por BARROS NETO et ai. (1995), em que os

fatores estudados foram: vazão de alimentação e concentração de substrato no

meio de alimentação, possibilitando a avaliação da vazão mássica de adição

de substrato.

4.4.1. Planejamento estatístico

A Tabela 4.2 mostra os fatores e os níveis das variáveis estudadas. A

Tabela 4.3 apresenta a matriz de planejamento experimental (fatorial completo

22 com triplicata do ponto central), contendo os fatores e níveis codificados. Os

níveis máximo e mínimo para concentração de substrato no meio de

alimentação e vazão de alimentação foram determinados com base nos

trabalhos realizados por PRATA (1997) e GARCIA (1999).

Para a análise dos resultados foi empregada como variável resposta o

fator de conversão de xilose em 2,3-butanodiol.

Tabela 4.2 Fatores e níveis do planejamento fatorial

Fatores -1 o +1

Si (g/L) 150 200 250 ~ (ml/h) 50 100 150

I Níveis

Si: Concentração de substrato no meio de alimentação; ~: vazão de alimentação.

Nível superior: +1; Nível inferior: -1; Nível central: O

24

Ta bela 4.3 Matriz de planejamento experimental fatorial 22 completo com triplicata do ponto central.

Experimentos I Si ~

1 -1 -1

2 +1 -1

3 -1 +1

4 +1 +1

5 o o 6 o o 7 o o

4.5. Métodos analíticos

4.5.1. Concentração de Açúcares e Ácido Acético

Os açúcares redutores e o ácido acético foram dosados por

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em cromatógrafo WATERS,

equipado com coluna 810-RAD Aminex HPX 87H (300 x 7,8 mm), acoplado a

um detector de índice de refração WATERS 410 operando nas seguintes

condições: temperatura: 45 ºC; eluente: ácido sulfúrico 0,01 N; fluxo do eluente:

0,6 ml/min; volume de amostra: 20 µL.

4.5.2. Concentração de Produtos

Os produtos da fermentação 2,3-butanodiol e acetoína foram

quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em

cromatógrafo WATERS equipado com coluna HAMILTON PRP X-300,

acoplado a um detector de índice de refração, operando nas seguintes

25

condições: temperatura 50 ºC; eluente: água pura; fluxo do eluente:

0,8 mUmin; volume de amostra: 20 µL.

4.5.3. Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural

As concentrações de furfural e hidroximetilfurfural foram determinadas

por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em cromatógrafo WATERS

equipado com coluna HEWLETT-PACKARD RP 18, acoplado a um detector

ultravioleta UV-2487, operando nas seguintes condições: temperatura 25 ºC;

eluente: acetonitrila e água na proporção de 1 :8 com 1 % de ácido acético; fluxo

do eluente: 0,8 mUmin; volume de amostra: 20 µL.

4.5.4. Concentração celular

O crescimento celular foi medido por densidade ótica, em

espectrofotômetro BECKMAN OU 6408. A concentração celular foi

determinada utilizando-se uma curva de calibração de absorbância (600 nm)

em função da massa seca de células previamente separadas por centrifugação

e ressuspendidas em água.

O coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) foi estimado

com base no método polarográfico descrito por Wise (1951 ), citado por

STANBURY, WHITAKER (1986).

Primeiramente a concentração de oxigênio dissolvido no meio foi

reduzida a zero através da injeção de nitrogênio. Em seguida o líquido foi

agitado e aerado de acordo com as condições desejadas, e o aumento da

concentração de oxigênio dissolvido foi monitorado por uma sonda do tipo

polarográfica. A variação da concentração de oxigênio em função do tempo

pode ser expressa pela seguinte equação:

26

dCL/dt = kLa (C* - CL), que integrada resulta em:

ln (C* - CL) = -kia . t, onde:

C* é a concentração de oxigênio dissolvido na saturação

CL é a concentração de oxigênio dissolvido no meio no tempo t

Portanto, medindo-se vários valores de CL, compreendidos entre O e

100 % da saturação do meio com ar, e calculando-se, para cada medida, a

diferença entre C* e CL, obtém-se a curva ln (C* - CL) em função do tempo,

sendo a sua inclinação correspondente a -k.a.

4.6. Parâmetros Fermentativos

As massas de células formadas, de substrato consumido e de produto

formado foram obtidas de acordo com as seguintes equações:

Mxt= Mx.-Mxo Msc = Mso-Ms,+ Msa Mpt = Mpi-Mpo, onde:

Mxt é a massa de células formada

Mx1 é a massa de células formada no tempo t

Mxo é a massa inicial de células

Msc é a massa de substrato consumido

Mso é a massa inicial de substrato

Mst é a massa de substrato no instante t

Msa é a massa de substrato adicionada até o instante t

Mpt é a massa de produto formada até o instante t

Mpt é a massa de produto no instante t

Mpo é a massa inicial de produto

27

As produtividades foram obtidas dividindo-se a variação da massa de

produto formado pelo intervalo de tempo correspondente à concentração

máxima de produto. Foram consideradas as massas de produto formadas a

partir do início da alimentação do reator.

Pr= (Mp-Mpo)/t

O fator de conversão de substrato em produto foi obtido

dividindo-se a massa de produto formado no tempo correspondente à máxima

concentração de produto pela massa de substrato consumido.

Y p/s = Mpr/Msc

A eficiência de fermentação foi definida pela relação entre o fator de

conversão obtido e o coeficiente estequiométrico. Para a conversão de xilose,

glicose e arabinose em 2,3-butanodiol o valor estequiométrico é de 0,5 g por

grama de substrato.

11 = (Yp1s/0,5)x100

28

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Caracterização do hidrolisado

Foram realizadas 20 hidrólises em reator de capacidade útil de 50 L, no

qual foi possível obter em cada batelada, em média, 23 L de hidrolisado

hemicelulósico com pH igual a 1,98 a partir de 8,97 Kg de cavacos de

eucalipto, que foi caracterizado quanto ao teor de açúcares (xilose, glicose e

arabinose), ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural (Tabela 5.1 ).

Tabela 5.1 Composição do hidrolisado obtido.

COMPONENTES I CONCENTRAÇÃO (g/L)

Xilose 27,6

Glicose 1,90

Arabinose 0,50

Ácido acético 6,70

Furfural 1,20

Hidroximetilfurfural 0,10

Observa-se uma predominância de xilose em relação aos demais

açúcares presentes no hidrolisado hemicelulósico, resultado semelhante ao

obtido por GARCIA (1999). A concentração de carboidratos redutores totais

29

(31,6 g/L), determinada pelo método colorimétrico de NELSON (1944), foi

maior que a obtida por PRATA (1997), que foi em torno de 23,0 g/L. Verifica-se

também a presença de ácido acético proveniente da fração hemicelulósica

(FENGEL, WEGENER, 1989), furfural e hidroximetilfurfural, grupo de inibidores

provenientes da decomposição de carboidratos identificados por Leonard,

Hajny (1945), citados por FRAZER, McCASKEY (1991). Comparando-se os

resultados de composição do hidrolisado com os obtidos por ALMEIDA e

SILVA (1996), o qual definiu as condições de hidrólise empregadas no presente

trabalho, verificou-se grande semelhança, indicando que o processo foi

conduzido adequadamente. As principais diferenças foram quanto aos teores

de ácido acético e furfural obtidos por aquele autor (5,4 g/L e 2, 1 g/L,

respectivamente).

5.2. Concentração de Substrato

Esta etapa do trabalho teve como objetivo definir se é possível obter

hidrolisados com altas concentrações, sem que ocorram perdas de açúcares e

de volume, que inviabilizam sua utilização em processos fermentativos sob o

ponto de vista da perda de açúcares e de volume, assim como utilizar estes

resultados como um direcionamento para o Planejamento Estatístico (item

4.4.1).

O hidrolisado obtido foi concentrado utilizando-se diferentes fatores de

concentração, e submetidos a tratamento, conforme descrito no item 4.1.3,

para a remoção dos compostos inibidores. PRATA, HISS (1998), utilizando

hidrolisado hemicelulósico de eucalipto, verificaram que o tratamento por

elevação do pH com CaO e abaixamento com H2S04 combinado com a

adsorção por carvão ativo proporciona os melhores resultados de crescimento

da bactéria Klebsiella pneumoniae. As concentrações de açúcares e os

volumes antes e após o tratamento encontram-se na Tabela 5.2. Realizou-se

também o tratamento do hidrolisado sem concentrar, para fins de comparação.

Observa-se que as perdas de volume aumentaram à medida que se utilizou

hidrolisado com fator de concentração mais alto. O aumento na perda de

30

açúcar, apesar de não inviabilizar a utilização dos hidrolisados, foi maior no

hidrolisado mais concentrado. Fato semelhante foi observado por RODRIGUES

et ai. (2001), no tratamento de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana

de açúcar, por elevação e abaixamento de pH com CaO e H3P04,

respectivamente, combinado com adsorção por carvão ativo.

Como pode ser observado, houve uma nítida diferença entre as perdas

de volume dos hidrolisados sem concentrar e concentrado. Utilizando-se 3,3

como fator de concentração, a perda de volume foi de 63%, enquanto que sem

concentrar a perda foi de 23%. Estes resultados tornam inviável o uso do

tratamento após a concentração, uma vez que para altas concentrações seria

necessário um volume muito grande de hidrolisado, e conseqüentemente,

realizar um número maior de hidrólises.

A Tabela 5.3 apresenta uma comparação da remoção dos compostos

inibidores em hidrolisados com fatores de concentração semelhantes, sendo

que um deles foi primeiramente concentrado e depois tratado, e o outro foi

tratado e posteriormente concentrado. A partir dos resultados podemos

observar que o furfural e o hidroximetilfurfural, em ambos os casos, foram

totalmente removidos. Assim, concluímos que não há diferença na remoção de

compostos inibidores quando o tratamento é realizado antes ou depois da

concentração.

Tabela 5.2 Concentração de açúcares redutores totais (ART) e volume de hidrolisado antes e após o tratamento realizado conforme item 4.1.3.

Fator de ART ART Perda de Volume Volume Perda de concentra- inicial final ART (%) inicial final volume

ção (g/L) (g/L) (ml) (ml) (%)

Sem 30,0 27,6 7,9 100 77,0 23,0 concentrar

3,3 78,5 71,4 9,0 100 37,0 63,0

6,7 179,7 163,2 9, 1 100 30,0 70,0

10,0 207,0 187,9 9,2 100 23,0 77,0

13,3 300,0 261,5 12,8 100 20,0 80,0

31

Com base nos resultados obtidos optou-se, portanto, pelo tratamento

antes da concentração, o que permite reduzir as perdas de volume e de açúcar

(Tabela 5.3), e obter um hidrolisado, com relação aos inibidores (furfural e

hidroximetilfurfural), com características semelhantes ao hidrolisado obtido a

partir do procedimento anterior (concentração antes do tratamento). Embora

não se tenha dosado os compostos fenólicos, o mesmo comportamento pode

ser esperado para os mesmos, uma vez que RODRIGUES et ai. (2001), no

tratamento de hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana de açúcar,

concluíram que a adição de carvão antes do processo de evaporação a vácuo

favorece a remoção de compostos fenólicos.

Tabela 5.3 Teores de furfural e hidroximetilfurfural (HMF) de diferentes hidrolisados: concentrado antes do tratamento e concentrado após o tratamento.

Hidrolisado Fator de Furfural HMF Perda de Perda de Concentração açúcar volume

(%) (%)

Concentrado e 10,0 nd nd 9,2 77,0 Tratado

Tratado e 10,8 nd nd 7,3 23,0 Concentrado

nd - não detectado

Os experimentos para determinação do limite de concentração foram

realizados tratando-se o hidrolisado conforme descrito no item 4.1.3, e

posteriormente concentrando-se os mesmos até diferentes teores de substrato.

A caracterização do hidrolisado, quanto aos teores de açúcares (xilose,

glicose e arabinose), ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural, antes e após o

tratamento está apresentada na Tabela 5.4. Observa-se que com o tratamento

há uma ligeira queda na concentração de açúcares e que os compostos

inibidores do crescimento microbiano, furfural e hidroximetilfurfural, foram

totalmente removidos. Além disso, observa-se que o tratamento empregado

não remove o ácido acético.

O hidrolisado foi concentrado com o objetivo de se obter 100, 200, 300 e

400 g/L de açúcares redutores totais. Os resultados estão apresentados na

Tabela 5.5. Observa-se que com o aumento do fator de concentração há uma

32

elevação na perda de açúcares. Como as porcentagens de açúcar perdido não

foram relevantes (menores que 10%), pode-se concluir que o hidrolisado pode

ser concentrado utilizando-se 14,5 como fator de concentração, sem inviabilizar

a utilização do mesmo.

Este teste para determinar se hidrolisados altamente concentrados

continuam viáveis para utilização em processos fermentativos foi realizado

utilizando-se 14,5 como fator de concentração máximo, atingindo-se uma

concentração de açúcares redutores totais de 366, 18 g/L. Não foi estudado um

fator maior, devido à máxima concentração utilizada no Planejamento

Estatístico ser de 250 gil.

Tabela 5.4 Composição do hidrolisado obtido antes e após tratamento.

CONCENTRAÇÃO (g/L) COMPONENTES

Sem tratar Tratado

Xilose 27,6 25,9 -

Glicose 1,90 1,4

Arabinose 0,50 0,3

Ácido acético 6,70 6,2

Furfural 1,20 o Hidroximetilfurfural 0, 10 o

Tabela 5.5 Concentração de açúcares redutores totais (ART)estimada e obtida, em hidrolisado submetido a tratamento seguido de concentração.

Fator de ART estimada ART obtida (g/L) Perda de açúcar Concentração (g/L) (%)

3,6 100 97,5 2,5

7,2 200 188,3 5,9

10,8 300 278,0 7,3 -

14,5 400 366,2 8,5

33

5.3 Meio de Ativação

A ativação das células, para utilização nos ensaios em fermentador de

bancada, foi realizada em frascos de 500 ml com 100 ml de meio sintético,

como descrito no item 4.2.2.

Primeiramente, conduziu-se uma fermentação em batelada nas

condições citadas anteriormente, para determinar a fase em que a bactéria

atinge a maior velocidade de crescimento celular. Durante esta fase as células

2 . 5

~·~· {a) 2 , O •

Q) / "'C - o::: 1 , 5 l(U C) / o~ • ~ (/)

1 , O / - (U e: :, Q) - • o-(!) / c:o 0,5 o o ~· º·º o 2 4 6 8 1 O 1 2

Tem p o ( h )

0,4

( -. -

s: ....J o, 3

Q) - "O O)

(b)

Q) o "O.., 0,2 (1) e:

"O CD

o E o·-

- U O ,1 CD (1)

> CD ... o

o 2 4 6 8

Tempo (h) 1 O 1 2

Figura 5.1 Concentração celular (a) e velocidade de crescimento celular (b) em função do tempo, durante cultivo de Klebsiella pneumoniae em meio sintético, em frascos agitados.

34

estão em alta atividade, sendo o momento mais adequado para a inoculação. A

Figura 5.1 a apresenta a curva de crescimento celular deste cultivo.

A Figura 5.1 b apresenta a curva de velocidade de crescimento celular

em função do tempo, obtida durante o cultivo de Klebsiel/a pneumoniae em

frascos agitados. A partir dos resultados, observamos que a fase de maior

velocidade de crescimento celular encontra-se em um tempo de

aproximadamente 6 horas. Determinou-se, então, que este seria o tempo

padronizado para inoculação.

5.4. Efeito da vazão mássica de adição de substrato

Com o objetivo de verificar o efeito da vazão mássica de adição de

substrato foram empregados diferentes valores de vazão de alimentação e

concentração de açúcares no meio de alimentação, de acordo com um

planejamento fatorial 22 (item 4.4.1 ).

As Figuras 5.2 a 5.8 apresentam os perfis das fermentações em sistema

descontínuo alimentado realizados com base no planejamento fatorial, onde as

setas indicam o final da alimentação.

Verifica-se que em todos os ensaios ocorreu um acúmulo de substrato

durante a fase de alimentação, o que indica que a velocidade de consumo foi

menor que a de fornecimento. Este acúmulo foi menor no ensaio 1

(Figuras 5.2), onde utilizou-se a menor vazão mássica de alimentação (6,8 g/h),

indicando que a velocidade de adição de inibidores no meio de fermentação foi

baixa, não afetando o desempenho do microrganismo.

Pelas Figuras 5.5 a 5.8 (ensaios 4, 5, 6 e 7) verifica-se que o substrato

não foi consumido após o final da alimentação. No ensaio 4 utilizou-se as mais

altas concentração de substrato e vazão de alimentação, o que corresponde

consequentemente à mais alta velocidade de adição de inibidores no meio de

fermentação, prejudicando o desempenho do microrganismo. Nos ensaios 5, 6

e 7 a vazão mássica de adição de substrato foi mais baixa que a utilizada no

ensaio 3 (Figuras 5.4), no entanto a concentração do hidrolisado utilizado foi

maior, acarretando também uma alta concentração de inibidores no meio de

alimentação. O crescimento celular durante a fase de alimentação também foi

menor, e pode ser explicado pela ação dos inibidores, que é muito maior

35

nestes ensaios, como relatado anteriormente. Segundo PARAJÓ ef ai. (1998)

os inibidores podem limitar o consumo de substrato, prejudicar o crescimento

celular e a formação de produto, e até mesmo interromper o processo

fermentativo.

Furfural e hidroximetilfurfural foram totalmente removidos com o

tratamento empregado, no entanto outros grupos de inibidores, diferente dos

que foram relatados e analisados, que não foram removidos ou reduzidos a

teores satisfatórios, podem estar presentes, e, provavelmente com a

concentração do hidrolisado hemicelulósico até fatores próximos a 1 O houve a

elevação da concentração dos mesmos. Dentre os inibidores conhecidos

encontram-se os compostos fenólicos, que são produtos da degradação da

lignina (FENGEL, WEGENER, 1989). Segundo estudo realizado por FRAZER,

McCASKEY (1991) o crescimento da bactéria Klebsiella pneumoniae foi inibido

por concentrações de compostos fenólicos acima de O, 10% (p/v), enquanto

concentrações acima de 0,05% (p/v) inibiram a produção de 2,3-butanodiol.

Outro grupo de inibidores presentes nos hidrolisados hemicelulósicos

corresponde aos íons contidos nos materiais lignocelulósicos ou resultantes da

corrosão do equipamento de hidrólise e do evaporador utilizado, uma vez que

este possui partes de metal que entram em contato direto com o líquido. Outras

técnicas mais eficientes de tratamento do hidrolisado, como a utilização de

resinas de troca iônica, podem ser empregadas, a fim de remover os inibidores

ou reduzir os seus teores a níveis não prejudiciais.

Quanto à concentração de produto, o maior valor (39,3 g/L) foi obtido no

ensaio 2 (238, 1 g/L e 50 mUh), fato explicado pela grande quantidade de

substrato fornecida, e pelas condições mais brandas de adição de substrato.

Esta concentração de 2,3-butanodiol foi maior que a máxima concentração

alcançada por GARCIA (1999), que utilizou concentração de substrato no meio

de alimentação de 90 g/L e vazão de alimentação de 72 mUh, resultando numa

vazão mássica de 6,48 g/h. No entanto, o fator de conversão de substrato em

produto e a produtividade foram menores. Isto evidencia a influência da

velocidade de adição do substrato, sobretudo quando se trata de meio impuro,

contendo substâncias inibidoras do metabolismo microbiano. Parece existir um

limite de concentração de substrato para vazões de alimentação a partir de

100 mUh, conforme se constata pelos ensaios 4 a 7 (Figuras 5.5 a 5.8).

36

1 6 O ....-.. .....J - 1 4 O C>

........, 1 2 O o

l(U 1 O O o,

ti] 8 O ,._ - 6 O e: Q) 4 O o e: 2 O o o o

o

(a)

5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tempo (h)

2 O O 1 8 O 1 6 O

....-.. 1 4 O C>

1 2 O ti] 1 O O ti)

ti) 8 O ti]

6 O :1!:

40 2 O

o o

(b)

i A. ·-·------ À.

.-=·:i .. · ... li. .. ·

• • • 5 1 o 1 5 2 o 2 5 3 o

T e m p o ( h )

Figura 5.2 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-.6.-) (a) e massas de células(-•-), açúcares(-•-) e de butanodiol (-.6.-) (b ), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 50 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 138,4 g/L (ensaio 1 ).

37

1 6 O .......... _J 1 4 O -- O) - 1 2 O

o 1 O O •ta o, 8 O ttl ..... ...... 6 O e (l) 4 O o e 2 O o o o

o

(a)

!

5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O Tempo (h)

2 O O

1 8 O

1 6 O

.......... 1 4 O O> 1 2 O - ta100 (/)

(/) 8 O ttl 6 O ~ 4 O

2 O

o o

(b)

!

5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O Tempo (h)

Figura 5.3 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-..&.-) (a) e massas de células(-•-), açúcares(-•-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 50 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 238, 1 g/L (ensaio 2).

38

........ 1 6 O

.....1 -- 1 4 O O) - 1 2 O

o •<U

1 O O

o,, 8 O

(IJ .... .... 6 O e: (1) 4 O o e: 2 O o o o

o

2 O O

1 8 O

1 6 O ........ .....1 1 4 O -- O> 1 2 O ..........

1 O O (IJ

(/J 8 O (/J

(IJ 6 O

~ 4 O

2 O

o o

(a)

5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O Tempo (h)

(b)

l •

• Íii.,-· --

- ... ----:·· / . • 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tempo (h)

Figura 5.4 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células(-•-), açúcares(-•-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 150 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 150,5 g/L (ensaio 3).

39

1 6 O

....J 1 4 O - C) 1 2 O - o 1 O O

1(0

o, 8 O co .... - 6 O e Q) 4 O o e 2 O o o o

o

(a)

=lll~lll~llll=ll=llil=ll=I

5 1 O 2 O 2 5 1 5 3 O

Tempo (h)

2 O O l ~ • (b) 1 8 O •

1 6 O

- 1 4 O C)

- 1 2 O ro 1 O O (/J

(/J • 8 O ro

6 O ~

4 O

2 O

o o 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tem p o ( h )

Figura 5.5 Concentrações de células (-•-). açúcares (-•-) e de butanodiol (-Ã-) (a) e massas de células(-•-). açúcares(-•-) e de butanodiol (-.A-) (b ), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 150 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 253,6 g/L (ensaio 4).

40

1 6 O ..--.. ...1 -._ 1 4 O O> -1 2 O

o 1 O O •Ctl

o- 8 O (ti ,._ .... 6 O e (1) 4 O o e 2 O o o o o

(a)

! ·-·------- / ·-· • ,/

.I / =lll=R---l!l~t~a~-ri---11

5 2 5 3 O 1 O 1 5 2 O Tempo (h)

2 O O 1 8 O (b)

1 1 6 O 1 4 O •

..--.. O> 1 2 O - 1 O O (ti

!/) 8 O !/)

(ti 60 ~ 4 O

2 O -- --· . .... , • • ·-dr= o

o 5 1 O 1 5 20 25 30 Tem p o ( h )

Figura 5.6 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A.-) (a) e massas de células(-•-), açúcares(-•-) e de butanodiol (-.A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 203,6 g/L (ensaio 5).

41

1 60 - (a) ....1 1 4 O

l .._ O)

......... 1 2 O

o 1 o o /·--·--·-· /. IC'IJ

./ o- 8 O / cu .... 6 O e: / Q) 4 O o

e: 2 O o o o =Ili- .. R - .. e-m--!11--lll~Pll

o 5 1 o 1 5 2 O 2 5 3 O T e m p o (h )

2 O O 1 8 O l 1 6 O (b)

• • ..-.. 1 4 O C)

'-"120 ca 1 O O cn cn 8 O (O

6 O ~

4 O 2 O

o o 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

T e m p o ( h )

Figura 5.7 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-.Ã-) (a) e massas de células(-•-). açúcares(-•-) e de butanodiol (-.A.-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 201,6 g/L (ensaio 6).

42

1 6 O - _J 1 4 O -- C) -120

o ,m100

o- (\l 8 O ,._ ..... e: 6 O Q)

o 4 O e: o 2 O o

o o

(a)

5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O Tempo (h)

2 O O

1 8 O (b)

l 1 6 O

,....._ 1 4 O • O)

........, 1 2 O

ro 1 O O (/)

(/) 8 O ro

6 O ~

4 O

2 O

o o 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tem p o ( h )

Figura 5.8 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células(-•-), açúcares(-•-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 198, 7 g/L (ensaio 7).

43

Os parâmetros fermentativos conversão de substrato em produto (Yp1s),

eficiência da fermentação (ri) e produtividade, foram calculados conforme

mostrado no item 3.6, e estão apresentados na Tabela 5.6. Os maiores valores

de eficiência (76 %) e conversão de substrato em 2,3-butanodiol (0,38 g/g)

foram obtidos no ensaio 3, em que utilizou-se uma vazão de alimentação de

150 mUh e concentração de substrato de 150,5 g/L. YU, SADDLER (1983)

utilizando uma concentração de xilose de 190 g/L na produção de

2,3-butanodiol, por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado

com adições diárias de substrato junto com extrato de levedura, obtiveram um

fator de conversão de substrato em produto de 0,46 g/g, maior que o obtido no

ensaio 3 (Tabela 5.6). No entanto, os referidos autores utilizaram meio

sintético, que não possuí inibidores do metabolismo microbiano como os

hidrolisados hemicelulósicos. Os menores valores de conversão de substrato

em 2,3-butanodiol foram obtidos quando as concentrações de substrato

utilizadas foram superiores a 200 g/L, e com uma velocidade de adição maior

que 100 mUh (ensaios 4 a 7), ensaios em que as cargas de inibidores são

maiores. No entanto, quando a concentração de substrato foi de 238, 1 g/L e

empregou-se uma vazão de 50 mUh (ensaio 2) os valores dos parâmetros

foram nitidamente superiores, fato que pode ser explicado pela baixa vazão de

alimentação utilizada. Os maiores valores de produtividade foram obtidos nos

ensaios 1, 2 e 3. Os baixos valores de produtividade quando comparados aos

obtidos por GARCIA (1999) (2,15 g/Lh) e PRATA (1997) (1,86 g/Lh) podem ser

explicados pelo prolongamento do tempo de fermentação devido as altas

concentrações de açúcares empregadas. Uma conseqüência direta do uso de

meios de alimentação com altos teores de substrato, sobretudo em se tratando

de matérias-primas impuras, pode ser observado pelos valores de Yp/s obtidos.

O maior valor (0,38 g/g) foi menor que o obtido por GARCIA (1999), que foi de

0,47 glg, com Si = 90,0 g/L e ~ = 72 mUh, empregando hidrolisado

semelhante.

Para confirmar os resultados dos ensaios 4, 5, 6 e 7, que foram

nitidamente inferiores, alguns destes experimentos foram repetidos, tendo-se

concluído que os baixos valores dos parâmetros fermentativos e as baixas

concentrações de 2,3-butanodiol obtidos foram decorrentes das próprias

44

condições empregadas (200 g/L, 100 mUh e 250 g/L, 150 mUh). Cabe

salientar que os ensaios 5, 6 e 7 correspondem às três repetições do ponto

central.

Estes resultados sugerem que o aumento da vazão de alimentação

favorece a conversão de substrato em 2,3-butanodiol quando são empregados

baixos valores de concentração de substrato, ou quando são empregadas

menores vazões de alimentação com altas concentrações de substrato.

Tabela 5.6 Parâmetros fermentativos dos ensaios 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 conduzidos em sistema descontínuo alimentado, em diferentes valores de vazão mássica de adição de substrato.

Ensaio Si (g/L) cj, (ml/h) Vazão Mássica Yp,s (g/g) T) (%) Qp (g/h) (g/Lh)

1 138,4 50 6,8 0,26 52 1,37

2 238,1 50 11,4 0,31 62 1,30

3 150,5 150 22,6 0,38 76 1,33

4 250,6 150 38,0 0,22 44 0,16

5 203,6 100 20,3 0,18 36 0,22

6 201,6 100 20,2 0,20 40 0,22

7 198,7 100 18,9 0,20 40 0,22

5.4.1. Análise estatística

O estudo do efeito da vazão mássica de adição de substrato baseou-se

em um planejamento fatorial 22, onde os fatores estudados foram a vazão de

alimentação e a concentração de açúcares redutores totais no meio de

alimentação, conforme mostrado no item 4.4.1.

Na Tabela 5.7, encontra-se a matriz do planejamento fatorial 22 com 3

repetições no ponto central, tendo a conversão de xilose em 2,3-butanodiol

como variável resposta. Foi necessário corrigir os níveis do fator concentração

de substrato devido a variações do mesmo.

45

A análise estatística dos dados apresentados encontra-se na Tabela 5.8.

São apresentados as estimativas dos efeitos, os erros-padrão e o teste t de

"Student". A partir desta análise verificou-se que os efeitos principais e os

efeitos de interação não foram significativos ao nível de 95% de confiança

(tcar.>ttab).

A análise de variância dos resultados, apresentada na Tabela 5.9, indica

que um modelo linear não pode ser aplicado, devido ao baixo valor de R2

obtido. A partir desta constatação, foi realizada a análise da curvatura, como

apresentada na Tabela 5.1 O. Como pode ser observado, esta é estatisticamente significativa (p<0,05), indicando que existe uma curvatura do

modelo proposto e que, provavelmente, existe uma relação quadrática entre os

efeitos e sua interação com a variável resposta.

Na Figura 5.9, encontra-se a distribuição de resíduos, onde se verifica

que a mesma mostrou-se tendenciosa, indicando que o modelo linear não é adequado. Assim há a possibilidade de se empregar um modelo quadrático

para representar o processo.

A superfície de resposta e as curvas de nível que descrevem a influência

da concentração de substrato no meio de alimentação e vazão de alimentação

no rendimento estão apresentadas nas Figuras 5.1 O e 5.11, respectivamente. A

partir da análise das figuras podemos concluir que o aumento da vazão de

alimentação associado ao decréscimo na concentração de substrato favorece a

conversão de substrato a 2,3-butanodiol.

Tabela 5.7 Matriz corrigida do planejamento fatorial 22 com os níveis reais e codificados para os fatores concentração de substrato no meio de alimentação e vazão de alimentação e os resultados obtidos de conversão de xilose em 2,3-butanodiol.

Variáveis Variáveis codificadas Resposta

Experimentos Si (g/L) cj> (ml/h) Si (fator A) cj> (fator B) Yp,s 1 136,4 50 -1,2724 -1 0,26 2 238,1 50 +0,7622 -1 0,31 3 150,5 150 -0,9900 +1 0,38 4 253,6 150 +1,0724 +1 0,22 5 203,6 100 -0,0264 o 0,18 6 201,6 100 +0,0720 o 0,20 7 198,7 100 +0,0312 o 0,20

46

Tabela 5.8 Estimativas dos efeitos, erros-padrão e teste t para a conversão de xilose em 2,3-butanodiol.

Efeitos j Estimativas / Erros - Padrão / t

Média 0,2522 ±0,0298 8,46

Si (fator A) -0,0636 ±0,0759 0,83

~ (fator B) 0,0148 ±0,0793 0,19

Si X~ -0,0897 ±0,0759 1,18

Erro estimado a partir do erro total com 3 graus de liberdade (t = 3, 13245)

0.07

•

-0.08 ~~~~~-'

0.17 0.2 0.23 0.26 0.29 0.32 0.35

0.04

0.01 residuos

-0.02

-0.05 ..

Valores previstos

Figura 5.9 Distribuição de resíduos que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação e da vazão de alimentação, durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiel/a pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

47

Tabela 5.9 Análise de variância dos fatores concentração de substrato no meio de alimentação e vazão de alimentação e suas interações.

Efeitos Soma dos Graus de Quadrado F p Quadrados Liberdade Médio

Si 0,00427979 1 0,0042798 0,70 0,4721

q, 0,00021312 1 0,0002131 0,03 0,8655

Si X cj> 0,00851942 1 0,0085194 1,40 0,3225

Erro total 0,01830897 3 0,0061030 -- --

Total 10,031400001 6

R = 0,42

Tabela 5.10 Análise de var,ancia da curvatura para o modelo que representa a conversão de xilose em 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

Fonte de Soma dos Graus de Quadrado F p variação Quadrados Liberdade Médio

Si 0,00006657 1 0,0000666 0,49 0,5616

cl> 0,00000566 1 0,0000057 0,04 0,8585

Si Xq, 0,02138064 1 0,0213806 158,70 0,0062*

Curvatura 0,01803951 1 0,0180395 133,90 0,0074*

Erro total 0,00026945 2 0,0001347 -- --

Total 10,031400001 6

R = 0,99

48

0.22

0.34

0.30

Yp/s 0.26

0.2 0.6

1 0.6

0.2 -0.2

-0.6 Fator a -1

0.18 -1

1

Fator A

Figura 5.10 Superfície de resposta descrita pelo fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator 8), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiel/a pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

49

1 06 Çtº3 T 270:6 \

I !

0.18

-0.6

0.20

0.2 Fatora

-0.2

.. t. / 0.21

0.23

0.24

-1 -0.6 -0.2 0.2 0.6 1

Fator A

Figura 5.11 Curvas de nível descritas pelo fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator B), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

50

5.4.2 Planejamento Rotacional

Um planejamento fatorial 22 rotacional com triplicata no ponto central,

como mostrado na Tabela 5.11, foi proposto para verificar se o modelo

quadrático é adequado para representar a conversão de substrato em

2,3-butanodiol por Klebsiel/a pneumoniae em sistema descontínuo alimentado

e determinar valores de concentração de substrato e vazão de alimentação que

proporcionem aumentar a conversão de substrato em 2,3-butanodiol. Para

completar este planejamento, além dos experimentos discutidos anteriormente,

mais quatro ensaios foram realizados (8, 9, 1 O e 11 ).

Tabela 5.11 Matriz de planejamento experimental rotacional

Experimentos I Si 1 ~

1 -1 -1

2 +1 -1

3 -1 +1

4 +1 +1

5 o o

6 o o 7 o o

8 -1,4142 o

9 +1,4142 o 10 o -1,4142

11 o +1,4142

Os perfis das fermentações ( ensaios 8, 9, 1 O e 11) são apresentados

nas Figuras 5.12 a 5.15, onde as setas indicam o final da alimentação. Verifica-

se que os perfis obtidos são parecidos com os dos ensaios 4 a 7, em que o

substrato não foi consumido após o final da alimentação, indicando que a

51

concentração de inibidores utilizando estas condições foram altas, limitando o

consumo de substrato e a formação de produto. No entanto, as concentrações

de produto obtidas foram maiores que as obtidas nos ensaios 4, 5, 6 e 7,

indicando que estas condições são mais favoráveis para a formação de

produto.

Os parâmetros fermentativos conversão de substrato em produto (Yp1s).

eficiência da fermentação (rt) e produtividade (Op), foram calculados conforme

mostrado no item 3.6, e estão apresentados na Tabela 5.12. O valor de Yp,s

para o ensaio 8 (Si = 117 ,4 g/L e cj> = 100 mUh) foi maior que dos demais

ensaios. A produtividade nos ensaios 8, 9, 1 O e 11 foram nitidamente maiores

que as obtidas nos ensaios 4, 5, 6 e 7, no entanto menores que nos ensaios 1,

2 e 3, provavelmente devido a alta carga de inibidores no meio. Como pode ser

observado nas Figuras 5.12 a 5.15, à exceção do ensaio 8, o consumo de

açúcar foi mínimo, provavelmente decorrente do efeito de inibidores. Isto pode

ser constatado pelo fato de a concentração de substrato ter permanecido

constante após o término da alimentação. No entanto, os valores de Yp1s foram

maiores, indicando que a conversão de substrato em produto não foi afetada e

o açúcar consumido foi convertido em 2,3-butanodiol.

Tabela 5.12 Parâmetros fermentativos dos ensaios 8, 9, 10 e 11 conduzidos em sistema descontínuo alimentado em diferentes valores de vazão mássica.

Ensaio Si (g/L) cj> (mUh) Vazão Mássica Yp1s (g/g) TI(%) Qp (g/h)

(g/h)

8 117,4 100 11,7 0,40 80 0,60

9 256,5 100 26,6 0,37 74 0,60

10 189,5 32,6 6,2 0,33 67 0,30

11 191,6 170 32,6 0,21 41 0,82

52

- 1 6 O (a) ...J - 1 4 O C)

1 2 O o

,ca 1 O O o,

ca 8 O i .... - 6 O ./·-·-· e: ,/ 1

Q) 4 O ,/ o / e: 2 O o A--A-----A

o ~·=•=•=•=·--· . o o 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O T e m p o ( h )

2 O O

1 8 O

1 6 O .......... 1 4 O

O> '-" 1 2 O

aJ 1 O O ,n ,n 8 O aJ 6 O ~ 4 O

2 O

o o

(b)

l 1 -----------

•..... ,-----·--------t--------~------------········--:-·- .... 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tempo (h)

Figura 5.12 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-.à-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A-) (b) em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 117,4 g/L (ensaio 8).

53

2 O O

1 8 O

1 6 O

- 1 4 O O)

- 1 2 O cu 1 o o u, u, 8 O cu 6 O ~ 4 O

2 O = a g

o o 5

1 6 O

.....1 1 4 O - O) 1 2 O - o 1 O O

•CU

o- 8 O cu ..... 6 O - e (!) 4 O o 2 O e o o o o

t /·-·-· • .I I

(a)

5 3 O 1 O 1 5 2 O 2 5 Tempo (h)

l ·~ (b)

..•....... 1 ..... :1 ...

1 O 1 5 3 O 2 O 2 5 Tempo (h)

Figura 5.13 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 265,5 g/L ( ensaio 9).

54

1 6 O _J -- 1 4 O O) _. 1 2 O o 1 O O

•CU o- 8 O cu L.. 6 O e (!) 4 O o e 2 O o o o o

2 O O

1 8 O

1 6 O

...--.. 1 4 O O) _. 1 2 O

cu 1 O O (/)

(/) 8 O cu 6 O

:;E 4 O

2 O

o o

(a)

5 10 15 20 Tempo (h)

2 5 3 O

(b)

5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O Tempo (h)

Figura 5.14 Concentrações de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-Â-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-A-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 32,6 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 189,5 g/L (ensaio 10).

55

1 6 O ........_

....J - 1 4 O C)

........... 1 2 O

o 1 O O •tU o, 8 O t1J 1... - 6 O e <1> 4 O o e 2 O o o o o

(a)

5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tempo (h)

2 O O

1 8 O

1 6 O t

(b)

....-.. 1 4 O ·~ • O> '-' 1 2 O

t1J100 (/)

(/) 8 O t1J 6 O ~ 4 O

2 O

o o 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

T e m p o ( h )

Figura 5.15 Concentrações de células (-•-}, açúcares (-•-) e de butanodiol (-.A-) (a) e massas de células (-•-}, açúcares (-•-) e de butanodiol (-.A-) (b}, em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 170 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 191,6 g/L (ensaio 11).

56

5.4.3. Análise estatística para o planejamento rotacional

A matriz do planejamento fatorial rotacional 22 com 3 repetições no

ponto central, tendo a conversão de xilose em 2,3-butanodiol como variável

resposta encontra-se na Tabela 5.13. Foi necessário corrigir os níveis do fator

concentração de substrato devido às variações do mesmo.

Na Tabela 5.14 são apresentadas as estimativas dos efeitos,

erros-padrão e teste t de "Student". A análise de variância (ANOVA) está

representada na Tabela 5.15. A partir desta análise verificou-se que somente

as interações Si x ~ e Si2 foram significativos ao nível de 95% de confiança.

Através de uma análise inicial foi possível fazer uma triagem dos fatores e suas

interações. Como o efeito principal Si não foi significativo ao nível de 95% de

confiança e excluí-lo não afetaria no valor do coeficiente de determinação (R2},

este fator foi eliminado.

A Figura 5.16 apresenta a distribuição de resíduos para o modelo

proposto. Verifica-se que os pontos estão dispostos de maneira aleatória,

indicando que o modelo não é tendencioso.

Na Tabela 5.16, encontra-se a análise de variância de ajuste do modelo

referente aos dados da Tabela 5.13. Verifica-se que o F estimado (8,56) para o

modelo (cujo valor de R2 é igual a 0,8508, ou seja, consegue prever 85,08%

das variâncias dos resultados experimentais), é maior que o F tabelado (4,53),

evidenciando que o modelo é significativo dentro da região estudada.

Após as análises realizadas, foi possível obter um modelo estatístico que

representa a conversão de substrato em 2,3-butanodiol por Klebsiella

pneumoniae em sistema descontínuo alimentado nas condições estudadas,

representado pela seguinte equação:

Yp,s = O, 1974 - 0,0281 ~ + 0,0782 Si2 - 0,0733 Si x ~ + 0,03141 ~2

Observa-se pela análise da superfície de resposta (Figura 5.17) e pelas

curvas de níveis (Figura 5.18) que a região estudada era a região de mínimo.

No entanto, como o modelo foi significativo, este buscou a região ótima,

encontrando o ponto máximo de conversão de substrato em 2,3-butanodiol

57

Tabela 5.13 Matriz corrigida do planejamento rotacional apresentando os níveis reais e codificados para os fatores concentração de substrato e vazão de alimentação e resultados obtidos em conversão de xilose em 2,3-butanodiol.

Variáveis Variáveis codificadas Resposta

Experimentos Si (g/L) cj> (ml/h) Si (fator A) cj> (fator B) Yp1s

1 136,38 50 -1,2724 -1 0,26

2 238, 11 50 +0,7622 -1 0,31

3 150,50 150 -0,9900 +1 0,38

4 253,62 150 +1,0724 +1 0,22

5 203,60 100 -0,0264 o 0,18

6 201,56 100 +0,0720 o 0,20

7 198,68 100 +0,0312 o 0,20

8 265,46 100 1,3092 o 0,40

9 117,40 100 -1,6520 o 0,37

10 191,63 170 -0, 1674 1,4142 0,33

11 189,31 30 -0,2138 -1,3478 0,21

Tabela 5.14 Estimativa dos efeitos, erros - padrão e teste t para a conversão de xilose em 2,3-butanodiol.

Efeitos j Estimativas j Erros - Padrão t

Média 0,195366 ±0,025677 7,61*

Si 0,011387 ±0,032339 0,35

cj> -0,057515 ±0,032625 1,76

Si X cj> -0, 148326 ±0,044634 3,32*

Si2 0,160880 ±0,034870 4,61*

cj,2 0,065136 ±0,039166 1,66

Erro estimado a partir do erro total com 5 graus de liberdade (t = 2,57141) * Significativo ao nível de 95% de confiança

58

0.06

•

1 1 • ' 1 1 ' ' \ ' ' • 1 • 1 ' 1 1 ' J 1 ' J 1 1

0.04

0.02

resíduos

-0.02

-0.04

-0.06

O. 19 0.23 0.27 0.31 0.35 0.39 0.43 Valores Previstos

Figura 5.16 Distribuição de resíduos do modelo proposto que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação e da vazão de alimentação, durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiel/a pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

59

Tabela 5.15 Análise de variância dos fatores concentração de substrato no meio de alimentação e vazão de alimentação e suas interações.

Efeitos Soma dos Graus de Quadrado F p

Quadrados Liberdade Médio

~ 0,00592278 1 0,00592278 3,53 O, 1095

Si X~ 0,02147590 1 0,0214759 12,79 0,0117*

Si2 0,04557930 1 0,04557930 27,14 0,0020*

4>2 0,00520700 1 0,00520700 3, 10 O, 1288

Erro total 0,01007760 6 0,01007760 - -

Total 10,010077601 10

R = 0,850842

Tabela 5.16 Análise de variâncla de regressão para o modelo que representa a conversão de xilose em 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

Fatores e Soma dos Graus de Quadrado F p

interações Quadrados Liberdade Médio

Modelo 0,0574860 4 0,01437150 8,56 0,0118*

Resíduo 0,0100776 6 0,00167961 - -

Total 1 0.06756361 10

R = 0,850842

(0,5 g/g), na vazão de alimentação de 170 mUh e na concentração de

açúcares redutores no meio de alimentação de 133 g/L.

Para a validação do modelo proposto para a conversão de substrato em

2,3-butanodiol por Klebsiel/a pneumoniae em sistema descontínuo alimentado,

foi realizado um ensaio nas condições citadas acima. Devido às variações da

concentração de substrato, o Si utilizado foi de 117, 1 g/L.

A Figura 5.19 apresenta os resultados obtidos do ensaio para validação

do modelo. Obteve-se experimentalmente um valor de conversão de xilose em

60

2,3-butanodiol de 0,43 g/g (86% do valor teórico). Este valor se encontra

próximo ao valor estimado (0,5 g/g), o que mostra que o modelo representou

matematicamente a conversão em estudo.

Os baixos valores de conversão de substrato em produto, produtividade

e concentração de produto dos ensaios 4 a 11 podem ser atribuídos às altas

cargas de inibidores que podem estar presentes no meio de alimentação. O

tratamento empregado para remoção destes compostos, provavelmente não foi

suficiente para removê-los a níveis que não afetem o desempenho do

microrganismo. A utilização de técnicas mais eficientes, como o tratamento

com resinas de troca iônica, pode ser uma das alternativas para reduzir esses

inibidores a níveis satisfatórios. VINALS (2001) verificou a eficiência deste

tratamento para a remoção de ácido acético, furfural e hidroximetilfurfural e

para minimizar o teor de compostos fenólicos na produção de xilitol a partir de

hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, sendo, inclusive,

mais eficiente que carvão ativo. Além da degradação da lignina e dos açúcares,

estes compostos podem ser provenientes do equipamento de hidrólise, que

devido ao longo tempo de uso encontra-se com pontos de corrosão, o que

pode ter contribuído para o aumento da carga de íons prejudiciais do

hidrolisado ou para a formação de alguma substância desconhecida e que

tenha alguma ação inibidora. O estudo dos parâmetros de hidrólise para se

determinar condições mais brandas é uma maneira de reduzir a carga de

inibidores do hidrolisado .. A utilização de uma vazão de alimentação crescente

também pode ser citada como alternativa para minimizar o efeito dos inibidores

no processo fermentativo.

61

0.68

0.58

Ypls 0.48

0.38

0.28

1 1.5

Fator A

Figura 5.17 Superfície de resposta descrita pelo modelo que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator 8), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

62

-0.5

-1

Fator B O

-1.5

-1.5 -1 -0.5 O 0.5 1 1.5

Fator A

Figura 5.18 Curvas de nível descritas pelo modelo que representa o fator de conversão de substrato em produto, em função da concentração de substrato no meio de alimentação (fator A) e da vazão de alimentação (fator 8), durante a produção de 2,3-butanodiol por Klebsiella pneumoniae em sistema descontínuo alimentado.

63

1 6 O ....1 -- 1 4 O O)

.......... 1 2 O o 1 O O

•t'IJ o, 8 O ('IJ .... - 6 O e Q) 4 O o

2 O e o o o o

2 O O

1 8 O

1 6 O ..--.. 1 4 O O)

........- 1 2 O

Ct:l 1 O O !/)

!/) 8 O Ct:l 6 O 2 4 O

2 O

o o

(a)

··--- / ------· . ~. / ~.--------------- ... ······· ... ·~·-······- -1!1.---=::::.::_:A ... A A . A •------

- IA··········Â· ::::::=-ll!=••=-=---·--·--·--·--·--·--•--11- 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tempo (h)

(b)

··~-------

. A· .-- -11.-- - . .A--· - A··

• • • • • • • • 5 1 O 1 5 2 O 2 5 3 O

Tempo (h)

Figura 5.19 Concentrações de células (-!!!!!-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-•-) (a) e massas de células (-•-), açúcares (-•-) e de butanodiol (-Á-) (b), em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de i 70 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 1 i 7, i g/L.

64

6. CONCLUSÕES

Com base nos resultados do presente trabalho, conclui-se que:

o O tratamento do hidrolisado antes do processo de concentração permite

reduzir as perdas de volume e de açúcar.

o Após o tratamento, o hidrolisado pode ser concentrado utilizando-se um

fator igual a 14,5 (aproximadamente 400 g/L de açúcares redutores) sem

inviabilizar sua utilização em processos fermentativos, sob o ponto de vista

material.

o Existe um limite de concentração de substrato para vazões de alimentação

acima de 100 mUh, quando se emprega hidrolisado hemicelulósico de

eucalipto para a produção de 2,3-butanodiol, nas condições estudadas.

CJ O aumento na vazão de alimentação favorece a conversão de xilose em

2,3-butanodiol quando são empregados baixos valores de concentração de

substrato no meio de alimentação.

CJ Através da utilização da análise estatística obteve-se um modelo

matemático para a conversão de substrato em 2,3-butanodiol. O modelo

proposto foi comprovado experimentalmente e se mostrou adequado, sendo

0,43 g/g o maior valor de conversão de substrato em produto obtido para o

processo estudado, quando empregou-se um valor de vazão mássica de

adição de substrato igual 19,9 g/h, correspondente a uma vazão de

alimentação de 170 ml/h e uma concentração de substrato igual a

117, 1 g/L.

65

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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71

Apêndice

Tabela A1 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 50 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 136,4 g/L (ensaio 1).

Tempo (h) j Cél. (g/l) j Subs. (g/l) j Prod. (g/l) j Mx (g) j Ms (g) j Mp (g)

o 5,3 4,8 0,6 3,2 2,9 0,4

3 8,5 10,6 3,4 6,4 8,0 2,5

6 10,0 7,8 8,8 9,0 7,0 7,9

9 11,5 5,0 15,0 12,0 5,2 15,7

12 11,0 1,9 17,0 13,3 2,3 20,5

14,5 11,0 1,1 20,2 15,0 1,5 27,3

17,5 11,0 0,4 17,4 15,0 0,5 23,6

Tabela A2 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 50 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 238,1 g/l (ensaio 2).

Tempo (h) j Cél. (g/L) j Subs. (g/l) j Prod. (g/l) j Mx (g) j Ms (g) j Mp (g)

o 4,4 14,8 0,8 2,6 8,9 0,5

3 8,5 25,8 6,0 6,4 19,3 4,5

6 8,7 32,7 9,2 7,8 29,5 8,3

9 8,6 37,6 14,3 9,0 39,5 15,0

12 8,7 41,4 14,9 10,4 43,3 17,9

15 7,9 44,5 20,3 10,6 60,1 27,4

18 9,0 35,2 23,0 12,2 47,5 31,0

21 10, 1 25,3 29,4 13,6 34,2 39,8

24 9,8 17,2 32,4 13,2 23,2 43,8

27 10,7 11,7 33,4 14,5 15,8 45,0

30 11,0 7,8 39,3 14,9 10,6 53,0

Tabela A3 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 150 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 150,5 g/L (ensaio 3).

Tempo (h) 1 Cél. (g/L) 1 Subs. (g/L) 1 Prod. (g/L) 1 Mx (g) 1 Ms (g) 1 Mp (g)

o - 17,4 0,7 - 0,4 0,4

2 3,7 42,3 3,0 3,3 38,1 2,7

4 3,2 58,4 4,2 3,9 70,0 5, 1

5 3,4 62,3 4,4 4,6 84,1 5,9

8 3,3 54,4 7,5 4,4 73,4 10, 1

11 3,4 44,0 11, 1 4,6 59,4 15,0

14 3,6 30,0 18,7 4,9 40,5 25,2

17 3,0 24,4 21,9 4,0 32,9 29,5

18 3, 1 18,7 25,3 4,1 25,2 34,2

21 3,3 10,8 28,1 4,4 14,6 38,0

Tabela A4 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto, em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 150 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 253,6 gil. (ensaio 4)


o 3,6 18,8 1,9 2,2 11,2 1,1

2 3,5 94,7 2,4 3,2 85,2 2,2

4 3,4 127,2 2,5 4,0 152,7 3,0

5 3,9 142,0 2,4 5,3 190,6 3,2

8 3,9 135,4 2,4 5,3 182,8 3,3

11 3,9 141 ,2 2,6 5,3 190,6 3,5

14 4,5 144,3 2,6 6, 1 194,8 3,5

17 4,3 138,5 2,4 5,8 186,9 3,2

Tabela A5 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 203,6 g/L. (ensaio 5)


o 4,7 18,8 1,8 2,8 11,3 1,1

2 4,9 56,5 3,9 3,9 45,2 3, 1

4 3,7 81,3 3, 1 3,7 81,3 3, 1

6 2,8 99,0 3,3 3,3 118,9 3,9

7,5 2,5 106,6 3,7 3,4 143,9 4,4

10,5 3,2 109,0 3,2 4,2 147,1 4,4

13,5 3,4 104,7 3,8 4,7 141,3 5, 1

16,5 3,4 101,6 3, 1 4,5 137, 1 4, 1

Tabela A6 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 201,6 g/L. (ensaio 6)

Tempo (h) 1 Cél. (g/L) / subs. (g/L) j Prod. (g/L) / Mx (g) / Ms (g) / Mp (g)

o 4,5 22,0 1,8 2,7 13,2 1,1

2 5,0 58,6 3,9 4,0 46,9 3, 1

4 4,8 84,3 3,7 4,8 84,3 3,7

6 4,5 100, 1 3,3 5,4 120, 1 3,9

7,5 3,9 110,3 3,5 5,2 148,8 4,7

10,5 3,8 107,5 3,5 5, 1 145,2 4,7

13,5 4,2 106,8 3,8 5,7 144,2 5, 1

16,5 4,3 106, 1 3,6 5,8 143,2 4,8



o 6,2 18,6 2,0 3,7 11,2 1,2

2 6, 1 55,9 3,7 4,9 44,7 3,0

4 5,3 79,8 3,9 5,3 79,8 3,9

6 4,4 98,7 3, 1 5,3 118,5 3,7

7,5 4,0 104,9 2,7 5,4 141,7 3,7

10,5 4,3 104,4 3,2 5,8 141,0 4,4

13,5 4,6 103,4 3,9 6,2 139,6 5,3

16,5 4,7 103,3 3,3 6,3 139,4 4,4

Tabela AS Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 100 mUh e concentração de substrato no meio de alimentação de 117 ,4 g/L. (ensaio 8)


o 4,4 17,5 0,8 2,6 10,5 0,5

2 4,6 35,3 5,7 3,7 28,3 4,5

4 4,7 45,7 6,4 4,7 45,7 6,4

6 5,0 55,8 6,5 6,0 66,9 7,8

7,5 4,9 61,2 4,9 6,6 82,6 6,6

10,5 4,9 58,1 8,2 6,6 78,4 11, 1

13,5 5,0 55,5 9,2 6,8 75,0 12,5

19,5 5,0 53,6 9,5 6,8 72,4 12,8



o 4,4 15,0 1,6 2,6 9,0 0,9 1,5 5,0 72,2 4,1 4,0 57,8 3,2 3 5,5 97,7 4,8 5,5 97,7 4,8

4,41 5,9 116,6 5, 1 7,1 139,9 6, 1 7,41 6,0 130,9 5,2 8, 1 176,7 7,0 10,41 6,5 129,3 4,8 8,8 174,6 6,5 13,41 6,8 127,4 5,0 9,2 172,0 6,7

Tabela A10 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 32,6 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 189,31 g/L. (ensaio 10)


o 4,6 17,6 0,5 2,8 10,6 0,3 3 3,8 26,7 6,9 2,7 18,7 4,8 6 3,8 35,0 9,9 3,0 27,8 7,8 9 4,0 45,4 8,9 3,6 40,5 8,0 12 4,7 59,5 8,9 4,7 58,9 8,8 15 4,7 72,6 8,2 5, 1 79,0 9,0 18 4,8 81, 1 7,6 5,7 96,2 9, 1 21 4,8 86,3 7,2 6,5 110,8 9,3 23 4,9 92,4 7, 1 6,3 124,8 9,5 26 4,8 91,4 6,8 6,4 123,5 9,2 29 5,0 95,1 6,7 6,8 128,4 9,0



o 4,7 12,7 1,6 2,8 7,6 1,0

2 4,9 60,5 4,5 4,2 51,7 3,8

4 4,9 76,8 4,4 5,5 85,3 4,9

6 5,0 100,0 4,4 6,8 134,9 5,9

7,5 5,3 100,4 4,3 7,2 135,5 5,8

10,5 5,3 97,9 4,2 7,1 132,2 5,7

Tabela A12 Concentrações e massas de células, açúcares redutores totais e produto em função do tempo, durante fermentação em sistema descontínuo alimentado com vazão de alimentação de 170 ml/h e concentração de substrato no meio de alimentação de 117,1 g/L (Validação do modelo)


o 4,3 12,5 0,5 2,6 7,5 0,3

2 3,9 42,6 4, 1 3,7 40,0 3,8

4 3,4 56,4 5, 1 4,3 72,2 6,6

4,46 3,5 57,4 5,9 4,8 77,5 7,9

7,46 3,9 52,3 8,5 5,3 70,6 11,5

10,46 4,7 42,8 10,7 6,3 57,7 14,4

13,46 4,6 32,6 13,7 6,2 43,9 18,5

16,46 4,7 25,6 16,0 6,3 34,5 21,6

19,46 4,3 20,9 22,2 5,8 28,2 29,9

22,46 4,3 21,0 20,2 5,8 28,4 27,2

25,46 4,7 17,9 23,2 6,4 24,2 31,3

28,46 4,7 15,9 23,0 6,3 21,5 31,0

31,46 4,7 11, 1 22,8 6,3 14,9 30,8

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