UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

Instituto de Ciências Biológicas

Departamento de Parasitologia

Programa de Pós-Graduação em Parasitologia

Gregório Guilherme Almeida

Complexo anfifílico de antimônio:

atividade leishmanicida in vitro e eficácia de uma

formulação tópica em modelo murino de leishmaniose

cutânea.

Belo Horizonte 2012

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como pré-requisito parcial para obtenção do grau de mestre em Parasitologia. Área de concentração: Protozoologia. Orientadora: Profª. Drª.Maria Norma Melo Universidade Federal de Minas Gerais Co-orientador: Frédéric Jean Georges Frézard Universidade Federal de Minas Gerais

Almeida, Gregório Guilherme.

Complexo anfifílico de antimônio: atividade leishmanicida in vitro e eficácia

de uma formulação tópica em modelo murino de leishmaniose cutânea.

[manuscrito] / Gregório Guilherme Almeida. – 2012.

81 f. : il. ; 29,5 cm.

Orientadora: Maria Norma Melo. Co-orientador: Frédéric Jean Georges

Frézard.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento

de Parasitologia.

1. Leishmaniose tegumentar - Teses. 2. Parasitologia – Teses. 3. Protozoologia

- Teses. 4. Administração tópica. 5. Octanoil N-metilglucamida. I. Melo, Maria

Norma. II. Frézard, Frédéric Jean Georges. III. Universidade Federal de Minas

Gerais. Departamento de Parasitologia. IV. Título.

CDU: 576.893.1

Este trabalho foi desenvolvido sob

orientação da Professora Dra. Maria

Norma Melo e a co-orientação do

Professor Dr. Frédéric Jean Georges

Frézard.

Aos meus pais, dedico este trabalho.

“(...)Dizia o livro: ‘As jibóias engolem, sem mastigar, a presa inteira. Em seguida, não podem mover-se e dormem os seis meses da digestão.’ Refleti muito então sobre as aventuras da selva, e fiz, com lápis de cor, o meu primeiro desenho. Meu desenho número 1 era assim:

Mostrei minha obra-prima às pessoas grandes e perguntei se o

meu desenho lhes fazia medo. Responderam-me: ‘Por que é que um chapéu faria medo?’

Meu desenho não representava um chapéu. Representava uma jibóia digerindo um elefante. Desenhei então o interior da jibóia, a fim de que as pessoas grandes pudessem compreender. Elas têm sempre necessidade de explicações. Meu desenho número 2 era assim:

As pessoas grandes aconselharam-me deixar de lado os desenhos

de jibóias abertas ou fechadas, e dedicar-me de preferência à geografia, à história, ao cálculo, à gramática.

Foi assim que abandonei, aos seis anos, uma esplêndida carreira de pintor. Eu fora desencorajado pelo insucesso do meu desenho número 1 e do meu desenho número 2. As pessoas grandes não compreendem nada sozinhas, e é cansativo, para as crianças, estar toda hora explicando.(...)”

Trecho de ‘O pequeno príncipe’, Antoine de Saint-Exupery

Agradecimentos

Pela vida, pela paciência, pelo carinho, pelo exemplo, pelo cuidado, pela

permissão e a negação, pela humilde sabedoria, por me entender nem sempre

me compreendendo, por me amar. Agradeço à minha mãe antes de tudo por

me permitir a vida.

Ao meu pai, irmãos e família, por serem, dentre os muitos exemplos ao

que serve a família, o meu exemplo de tolerância.

À Renata Gomes, por todos os momentos que vivemos, tranquilos ou

ruidosos, mas que nos fizeram chegar onde estamos. Te amo de coração.

A todos os amigos que hoje não estão presentes na minha rotina, mas

que contribuíram para quem eu sou hoje. Mantenho-os no anonimato da minha

memória, sempre com muito carinho. Nas palavras de Milton Nascimento, “o

que foi feito é preciso conhecer para melhor prosseguir.”. Fato.

A todos os amigos presentes, por serem sempre o que se propuseram

a ser. Não exigiria de vocês mais do que isso.

Aos colegas de mestrado, especialmente aqueles que se tornaram

grandes amigos. Agradeço ao Daniel Coscarelli pelos longos papos, pelas

artes, pelas Fissurelisses, mas acima de tudo pela amizade honesta e

profunda. Ao Antonio Mendes, por me fazer acreditar novamente em coisas

que eu julgava mortas e por me fazer ter uma postura mais positiva sobre o

mundo e a ciência. A ambos, sei que nossa amizade vai resistir à ação

corrosiva da rotina, e teremos muitas histórias para contar no futuro,

independente da distância.

Aos amigos do Laboratório de Biologia de Leishmania: à Gabriela

Vogas pela amizade e pela grande ajuda nesse projeto; Ao Sidney Ferreira

(Nino), pela ajuda, por ser exemplo de seriedade e competência; um

agradecimento especial à Soraia, pela ajuda, pelo suporte, e pela força.

Aos amigos do LabNano: Kelly Kato, Ana Paula, Flaviana Ribeiro,

Flávia Pontello, Priscila Gomes, Mariana Albanez, Lígia Souza, Erly

Azevedo e Rubens do Monte, pela ajuda, pela convivência divertidíssima e

por serem sempre fof@s comigo!!

Ao professor Dr. Frédéric Frézard e a professora Dra .Cynthia

Demicheli pela oportunidade de trabalhar com algo totalmente novo e

interessante. Obrigado pelo aprendizado e pelo apoio.

À equipe do Laboratório de Imunologia e Genômica de parasitos, em

especial à Sara e Natasha pelo suporte nos qPCRs, e especialmente ao

Professor Dr. Ricardo Fujiwara pela ajuda na análise estatística e

principalmente pela sua prestatividade, marca registrada da sua personalidade.

Aos Amigos do Centro de Pesquisas René Rachou: Marcelle Rocha

pela paciência e ajuda no projeto. À Paula Monalisa, Izabela Ibraim e Rafael

Assis pela convivência excepcional e aprendizado. Especialmente ao

Professor Dr. Rodrigo Soares, que além de um exemplo de pesquisador é um

grande amigo.

À Bárbara Verçosa pela ajuda essencial na contagem da LDU.

Ao Leonardo Maciel, por ser para mim o grande exemplo que é. Por ser

compreensivo, amigo e paciente.

À professora Dra. Maria Norma, “a chefa”. Não haveria páginas

suficientes nessa dissertação para lhe agradecer à altura do seu mérito. Pela

acolhida, pela gentileza, pelos (muitos) puxões de orelha, pelo carinho

excepcional, por me ensinar, por me permitir... A senhora é, não só um

exemplo, mas alguém muito especial que ficará eternizada por essas páginas,

que descrevem uma etapa da minha vida. À senhora meu sentimento sempre

de muito carinho e respeito. Muitíssimo obrigado!

À força sem nome que sempre me manteve de pé, que sempre encaixou

os momentos para que o caminho turbulento terminasse em um plano calmo.

Sei da sua existência e não ouso lhe dar nomes ou lhe encaixar nos conceitos

da minha limitação humana. Sei da sua essência e me basta. Continue me

guiando por onde for necessário para que eu possa fazer algo de útil para o

mundo. É por isso que estou aqui.

Aos cães, motivo pelo qual me tornei um veterinário e entrei na

empreitada contra a leishmaniose.

Sumário

Lista de Abreviaturas e Siglas 9

Lista de Tabelas e Figuras 10

Resumo 12

Abstract 14

1. Introdução

1.1. Leishmanioses 16

1.2. Ciclo biológico 17

1.3. Leishmaniose Tegumentar Americana 19

1.4. Formas Clínicas da LTA 20

1.5. Epidemiologia e Controle 21

1.6. Modelos experimentais utilizados em testes de novos

fármacos

24

1.7. Tratamento 25

1.8. Mecanismo de Ação dos Antimoniais 28

1.9. Octanoil N-Metilglucamida 29

2. Justificativa 32

3. Objetivos

3.1. Objetivo Geral 35

3.2. Objetivos Específicos 35

4. Material e Métodos

4.1. Síntese dos complexos de alquilmetilglucamidas com

antimônio

36

4.2. Manutenção do parasito 36

4.3. Animais 37

4.4. Estudo da Citotoxicidade in vitro 38

4.4.1. Isolamento de macrófagos peritoneais 38

4.4.2. Ensaio de citotoxicidade em macrófagos murinos

(MTT)

38

4.4.3. Concentração citotóxica in vitro 40

4.5. Estudo da atividade anti-amastigota in vitro. 40

4.5.1. Infecção experimental de macrófagos murinos com

Leishmania amazonensis.

40

4.5.2. Exposição dos macrófagos infectados aos

compostos

41

4.5.3. Concentração inibitória in vitro 42

4.5.4. Índice de Seletividade in vitro 42

4.6. Estudo da atividade anti-Leishmania in vivo 42

4.6.1. Isolamento das promastigotas metacíclicas 42

4.6.2. Infecção e tratamento dos camundongos 43

4.6.3. Quantificação da carga parasitária 44

4.7. Estudo da Permeação Percutânea in vitro 44

4.8. Análises Estatísticas 46

5. Resultados

5.1. Curva de Crescimento de Leishmania (Leishmania)

amazonensis

48

5.2. Citotoxicidade em macrófagos murinos 49

5.3. Atividade anti-amastigota in vitro 51

5.4. Absorção percutânea de Sb 53

5.5. Atividade anti-Leishmania in vivo 56

6. Discussão e Conclusões 60

7. Referências Bibliográficas 67

8. Anexos 80

9

Lista de Abreviaturas e Siglas

AM: Antimoniato de meglumina.

BALB/c: Linhagem isogênica de camundongos susceptíveis à leishmaniose.

CC50: Concentração citotóxica em 50%.

CEBIO: Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG.

CETEA: Comitê de Ética em Experimentação Animal.

CI50: Concentração inibitória em 50%.

DMSO: Dimetilsulfóxido.

GFAAS: Espetroscopia de absorção atômica em forno de grafite.

HSR/J: Linhagem de camundongos glabros.

IS: Índice de seletividade.

LA8: Octanoil N-Metilglucamida.

LA8-Sb: Octanoil N-Metilglucamida complexado ao antimônio pentavalente.

LC: Leishmaniose cutânea.

LCD: Leishmaniose cutânea anérgica difusa ou leishmaniose cutânea difusa.

LCL: Leishmaniose tegumentar localizada.

LCM: Leishmaniose cutâneomucosa.

LD: leishmaniose disseminada.

LDU: Unidades de Leishmania donovani (Leishmania donovani units).

LTA: Leishmaniose tegumentar americana.

LVA: Leishmaniose visceral americana.

MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5-difeniltetrazólio.

NatAM: Antimoniato de meglumina incorporado em gel de natrosol.

OMS: Organização Mundial de Saúde.

PBS: Tampão fosfato-salino.

PSG: Gel Secretório de Promastigotas.

RPM: Rotações por minuto.

Sb: Stibium, Antimônio.

SbIII: Antimônio trivalente.

SbV: Antimônio pentavalente.

SFB: Soro fetal bovino.

TDR: Programa Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais.

10

Lista de Tabelas e Figuras

Tabela 1: Percentagem média de macrófagos peritoneais viáveis de

BALB/c, com diferentes concentrações de Glucantime, após 24 horas de

exposição.

49

Tabela 2: Percentagem média de macrófagos peritoneais viáveis de

BALB/c, com diferentes concentrações de LA8-Sb, após 24 horas de

exposição.

49

Tabela 3: Percentagem média de macrófagos peritoneais viáveis de

BALB/c, em diferentes concentrações de LA8, após 24 horas de

exposição.

50

Tabela 4: Avaliação do peso médio de camundongos BALB/c infectados

com Leishmania (Leishmania) amazonensis tratados com Glucantime,

LA8 e LA8-Sb.

57

Figura 1: Ciclo de vida de Leishmania spp. 19

Figura 2: Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil –

1990 a 2010.

22

Figura 3: Fórmula estrutural proposta para o Glucantime. 27

Figura 4: Fórmulas estruturais propostas para o octanoil N-

metilglucamida e o complexo LA8-Sb.

30

Figura 5: Representação esquemática de uma Célula de Difusão de

Franz.

45

Figura 6: Curva de crescimento para Leishmania amazonensis (cepa

PH8) em meio -MEM completo.

48

Figura 7: Curvas de CC50 do Glucantime, do LA8 e do LA8-Sb para

macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c.

50

Figura 8: Atividade anti-amastigota in vitro dos compostos LA8, LA8-Sb e

Glucantime em diferentes concentrações no modelo de macrófagos

peritoneais de BALB/c, infectados com formas promastigotas de fase

estacionária de Leishmania amazonensis.

52

11

Figura 9: Imagens de microscopia ótica das lâminas do teste de

atividade anti-amastigota in vitro com as maiores concentrações

utilizadas no teste para cada composto.

52

Figura 10: Curva de CI50 do Glucantime para macrófagos peritoneais de

BALB/c, em diferentes concentrações.

53

Figura 11: Percentual da permeação cutânea de Sb através da pele de

camundongos Hairless, após oito horas de exposição às formulações, na

presença e na ausência de estrato córneo.

54

Figura 12: Permeação percutânea de antimônio através pele de

camundongos Hairless, em função do tempo, na pele íntegra e na

ausência do estrato córneo.

55

Figura 13: Diâmetro médio da lesão em função do tempo de tratamento

de camundongos BALB/c tratados com Glucantime, LA8 e LA8-Sb.

57

Figura 14: Avaliação da eficácia da formulação tópica de LA8-Sb em

camundongos infectados com L. amazonensis.

57

Figura 15: Avaliação do efeito do tratamento em camundongos BALB/c

fêmeas infectadas com L. (L.) amazonensis.

58

12

Resumo

As leishmanioses são consideradas um grande problema de saúde pública em

vários países onde incidem. A OMS as classifica como doenças

negligenciadas, e incentiva a busca de novos fármacos ou formulações que

sejam eficazes e que tenham baixa toxicidade ao homem. O tratamento com as

drogas disponíveis demandam longo tempo de tratamento e apresentam

diversos efeitos colaterais, comprometendo a adesão dos pacientes. Além do

desenvolvimento de novos fármacos, há pesquisas direcionadas a potencializar

a atividade leishmanicida de drogas já utilizadas e diminuindo sua toxicidade. O

LA8 é uma alquilmetilglucamida capaz de se complexar ao antimônio

pentavalente e, devido à sua propriedade anfifílica, o complexo resultante é

potencialmente eficaz contra a leishmaniose quando administrado por vias não

invasivas como a tópica e a oral. O objetivo do presente estudo foi avaliar sua

eficácia in vitro e in vivo em camundongos BALB/c experimentalmente

infectados com Leishmania amazonensis. Os ensaios in vitro mostraram que o

complexo LA8-Sb foi cerca de 100 vezes mais tóxico (CC50 = 0,26mM de Sb)

para macrófagos peritoneais murinos que o Glucantime (CC50 = 26,31mM de

Sb) e 6 vezes mais tóxico que o seu ligante LA8 isoladamente (CC50 = 4,89mM

de LA8). Não foi possível observar atividade anti-amastigota do complexo LA8-

Sb em culturas de macrófagos peritoneais murinos infectados com L.

amazonensis, em concentrações abaixo da concentração citotóxica (CC50). No

estudo da atividade in vivo, camundongos BALB/c infectados na base da cauda

com L. amazonensis, foram tratados duas vezes ao dia, por 21 dias com uma

formulação tópica contendo LA8-Sb. Foi observada uma estabilização no

tamanho da lesão além da diminuição da carga parasitária. A permeação

percutânea do antimônio presente no complexo foi avaliada no modelo de

células de difusão de Franz usando pele de camundongos glabros, mostrando

taxas de permeação de antimônio de 0,008% e 4,27%, respectivamente na

pele íntegra e na pele sem o estrato córneo, após 8 horas. Na ausência de

estrato córneo, o LA8-Sb promoveu uma liberação mais sustentada de

antimônio que o antimoniato de meglumina. O presente estudo permite concluir

que o complexo anfifílico de antimônio LA8-Sb apresenta atividade anti-

13

leishmania após aplicação tópica em modelo murino de leishmaniose cutânea,

apesar da aparente ineficácia em modelo in vitro de macrófagos peritoneais

infectados. Novos estudos são necessários para elucidação do mecanismo de

ação da nova formulação bem como sua otimização.

14

Abstract

Leishmaniasis is considered a major public health problem in 88 countries

worldwide. It is considered a neglect disease by The World Health Organization,

thus reinforcing the need of new effective and less toxic compounds. The

available drugs require long-term treatment and cause several side effects. In

addition to the development of new drugs, another strategy is to enhance the

leishmanicidal activity of available drugs and decrease its toxicity. LA8 is an

amphiphilic alquilmetilglucamida that binds to pentavalent antimony and is a

potentially effective molecule against leishmaniasis. The aim of this study was

to evaluate its in vitro and in vivo efficacy against Leishmania amazonensis

infected BALB/c mice with by a topical formulation. Also, in vitro assays using

mice peritoneal macrophages showed that the complex LA8-Sb was about 100

times more toxic (CC50 = 0.26mM Sb) than Glucantime (CC50 = 26.31mM Sb)

and 6 times more toxic than LA8 and its ligand alone (CC50 = 4.89mM LA8).

There is no anti-amastigote activity after 72 hours of exposure, in

concentrations below the cytotoxic concentration (CC 50), when incubated in

infected with L. amazonensis murine peritoneal macrophages. BALB/c mice

were inoculated at the tail base with L. amazonensis and treated twice a day

for 3 weeks with a topical formulation containing LA8-Sb. This assay resulted in

stabilization of the lesion size and a decrease in parasite burden. The

percutaneous permeation of the antimony present in the complex was

evaluated by the Franz diffusion cell model. The antimony permeations were

about 0.008% and 4.27% in the intact and stripped skin, respectively. The

present study shows that the topical formulation, despite the in vitro results may

present an anti-leishmania activity in vivo. Further studies are needed to

elucidate the potential effectiveness of the LA8-Sb.

15

1.I

ntr

oduçã

o

16

1.1. Leishmanioses

As leishmanioses são doenças infecciosas causadas por várias

espécies de protozoários do gênero Leishmania (Ross,1903), transmitidas

pela picada de diversas espécies de flebotomíneos infectados. A doença

apresenta um grande espectro de manifestações clínicas, usualmente

divididas em leishmaniose cutânea (LC), leishmaniose cutaneomucosa

(LCM) e leishmaniose visceral (Silveira et al., 2004; Lainson & Shaw, 2005)

Anualmente, são reportados 600.000 novos casos de leishmaniose

no mundo, podendo esse valor chegar a dois milhões de novos casos por

ano, sendo aproximadamente 1,5 milhões, das formas cutânea e

cutaneomucosa, e 500 mil da forma visceral, com um total de 12 milhões de

pessoas infectadas, e uma população de risco de 350 milhões de

indivíduos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) relata a ocorrência de

leishmanioses em 88 países, com notificação compulsória em apenas 32

(WHO, 2010).

Acredita-se que leishmaniose tegumentar americana (LTA) seja

autóctone do continente Americano (Altamirano-Enciso et al., 2003). Figuras

humanas em objetos de cerâmica datadas de 400 a 900 a.C., conhecidas

como huacos, encontradas no Peru e Equador, evidenciam mutilações em

faces humanas sugestivas de LTA. Relatos de lesões faciais em ameríndios

foram encontrados em diversos manuscritos da época da colonização

espanhola (Lainson & Shaw, 2005).

No entanto, somente em 1909, Carini e Paranhos identificaram o que

seriam posteriormente conhecidas como as formas amastigotas, em lesões

tegumentares em pacientes no estado de São Paulo. Em 1911, Gaspar de

Oliveira Vianna, denominou tais parasitos como Leishmania brasiliensis,

sendo essa nomenclatura substituída pelo similar em inglês Leishmania

braziliensis, por Matta em 1916 (Lainson & Shaw, 2005).

Desde então a LTA vem sendo diagnosticada em todos os estados

brasileiros. Em 1985, foram notificados cerda de 13000 casos de LTA,

atualmente estimados em cerca de 30000 casos notificados por ano no país

(Ministério da Saúde, 2007).

17

As leishmanioses são consideradas pela OMS como sendo doenças

negligenciadas pelos sistemas de saúde dos países onde ocorrem. O

Programa Especial para Pesquisa e Treinamento em Doenças Tropicais

(TDR), que tem como foco doenças negligenciadas que afetam populações

pobres e marginalizadas, coloca as leishmanioses como enfermidades

prioritárias entre as endemias abordadas pelo Programa (WHO, 2010).

1.2. Ciclo Biológico

Leishmania é um protozoário pertencente à família

Trypanosomatidae, parasito intracelular obrigatório das células do sistema

fagocítico mononuclear, com duas formas principais: uma flagelada ou

promastigota, encontrada no tubo digestório do inseto vetor, e outra

aflagelada ou amastigota, observada nos tecidos dos hospedeiros

mamíferos (Bates, 2007).

Há diferentes hipóteses sobre a evolução do gênero Leishmania,

mas os dados atualmente disponíveis sugerem que ele evoluiu em

mamíferos americanos e migraram com seus hospedeiros para o Velho

Mundo, de onde se disseminaram por volta de 24 a 14 milhões de anos

atrás (Shaw, 2011; Kuhls et al., 2011).

O parasito possui um ciclo de vida heteroxeno (Figura 1). São

transmitidos por fêmeas adultas de flebotomíneos que se infectam ao

realizar um repasto sanguíneo em um hospedeiro reservatório, ingerindo as

formas amastigotas presentes na pele (Montoya-Lerma 1992). No trato

digestório do hospedeiro invertebrado elas sofrem uma transformação,

desenvolvendo um flagelo anterior, passando então a se chamar

promastigotas, dentro da matriz peritrófica, uma membrana constituída por

proteínas, glicoproteínas, e microfilamentos de quitina que encerra o

sangue ingerido, formando uma barreira que protege o epitélio intestinal da

abrasão por partículas de alimentos e microrganismos (Pimenta et al., 1997;

Kamhawi, 2006).

Essas formas, especificamente chamadas de promastigotas

procíclicas, se multiplicam e são capazes de se aderir ao epitélio intestinal

do flebotomíneo devido a um conjunto de glicoproteínas de membrana. A

18

adesão propiciada por essas moléculas impede que o parasito seja expelido

com as excretas do flebotomíneo, após a digestão do sangue (Sacks &

Kamhawi, 2001).

As promastigotas procíclicas passam por mudanças morfológicas e

fisiológicas no tubo digestório do vetor, e parte dessa população se

diferencia em formas metacíclicas, através de um processo chamado

metaciclogênese, onde há uma mudança do perfil de moléculas

citoplasmáticas e de membrana do parasito, o que garante sua liberação do

tubo digestório do inseto vetor, tornando-as mais infectantes ao hospedeiro

mamífero (Pimenta et al., 1992; Sacks & Sher, 2002; Soares et al., 2005).

Esse processo ocorre durante o tempo em que o último repasto

sanguíneo-tissular é digerido. Após a metaciclogênese, as promastigotas

metacíclicas migram para a parte anterior do tubo digestório do inseto, onde

produzem uma glicoproteína de consistência gelatinosa chamada PSG

(promastigote secretory gel). Acredita-se que esse gel obstrua a passagem

de alimento, quando do repasto sanguíneo-tissular, obrigando o

flebotomíneo a regurgitar saliva juntamente com as formas promastigotas

metacíclicas, no local da picada (Bates, 2007).

Os parasitos inoculados são fagocitados primeiramente por

neutrófilos, e em seguida perdem o flagelo transformando-se em

amastigotas (Peters et al., 2008). Horas depois são fagocitados por

macrófagos, onde são internalizados no vacúolo parasitóforo, que logo se

liga aos lisossomos, dando origem ao vacúolo fagolisossomal, onde o

parasito permanece em um ambiente hostil, contendo enzimas lisossomais

e metabólitos reativos do oxigênio. No entanto, devido a diversos

mecanismos de evasão à resposta imune do hospedeiro, a Leishmania se

adapta a sobreviver neste ambiente, onde se multiplica por divisão binária,

até levar a ruptura da célula infectada e liberar formas amastigotas que são

fagocitadas por outros macrófagos (Peters et al., 2008; Sacks & Sher,

2002).

19

Figura 1: Ciclo de vida da Leishmania spp. – adaptado de Harhay et al., 2012.

1.3. Leishmaniose Tegumentar Americana

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é causada por diversas

espécies de Leishmania e está amplamente distribuída na América Latina.

A doença tem caráter zoonótico, ocorrendo naturalmente em animais

silvestres podendo acometer o homem (Lainson, 1983).

Nas Américas, são atualmente reconhecidas pelo menos 11 espécies

dermotrópicas de Leishmania causadoras de doença humana e oito

somente em animais. No entanto, no Brasil já foram identificadas oito

espécies, sendo seis do subgênero Viannia e duas do subgênero

Leishmania. As três principais espécies são: L. (V.) braziliensis, L.(V.)

guyanensis e L.(L.) amazonensis, e, mais recentemente, as espécies L. (V.)

lainsoni, L. (V.) naiffi, L. (V.) shawi, L. (V.) lindenbergi foram identificadas

em estados das regiões Norte e Nordeste (Lainson & Shaw, 2005).

Após a infecção por Leishmania podem ser observados diferentes

graus de susceptibilidade a esses parasitos, sendo alguns indivíduos

naturalmente resistentes (assintomáticos) e outros, apresentando diferentes

graus de susceptibilidade à infecção (sintomáticos) (Silveira et al., 2004).

20

Dependendo da espécie de Leishmania envolvida na infecção e da

resposta imune mediada por células do individuo infectado, se desenvolve

um amplo espectro de formas clínicas da doença, convencionalmente

conhecido como leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose

cutâneomucosa-(LCM), leishmaniose cutânea anérgica difusa ou

simplesmente leishmaniose cutânea difusa (LCD) e leishmaniose

disseminada (LD) (Cástes et al., 1983; Carvalho et al., 1985; Lainson &

Shaw, 2005).

1.3.1. Formas clínicas da LTA

Dentre os aspectos clínicos da LTA, destacam-se lesões de pele com

úlceras localizadas (LCL) ou múltiplas, o que representa a forma mais

frequente da doença, tendo como agente etiológico qualquer uma das

espécies dos subgêneros neotropicais. A L.(V.) braziliensis é considerada o

mais prevalente parasito associado a esta forma de doença. Representa o

acometimento primário da pele, sendo a lesão única ou múltipla, geralmente

do tipo ulcerado, com tendência à cura espontânea ou apresentando boa

resposta ao tratamento (Silveira et al., 2004).

Inicialmente a lesão tem aspecto papular e indolor, podendo ou não

ser pruriginosa. Posteriormente a pápula evolui, produzindo uma lesão

inflamada, ulcerada, circular e de bordas elevadas (Gontijo & De Carvalho,

2003). A lesão pode permanecer única, mas em muitos casos macrófagos

infectados podem transportar amastigotas para outras regiões do

organismo, produzindo lesões secundárias (Lainson & Shaw, 2005).

Um parasito em especial, Leishmania (V.) braziliensis, tende a

produzir lesões metastáticas nas mucosas oral, nasal e laringo-faringiana. A

leishmaniose cutaneomucosa manifesta-se por lesões destrutivas

localizadas nas mucosas das vias aéreas superiores (Berman, 1997;

Bittencourt & Barral-Neto, 1995).

Embora muitos pacientes possam apresentar as lesões na pele e nas

mucosas, é observado que a maioria dos casos de LCM registrados na

Amazônia, ocorre em pacientes infectados com L. (L.) braziliensis que

apresentam lesão cutânea crônica não tratada ou de cura espontânea

21

(Silveira et al., 1999). É caracterizada por apresentar metástases nas

mucosas que conduzem a quadros clínicos desfigurantes (Marsden, 1986).

A LCD é uma manifestação relativamente rara caracterizada por

lesões nodulares disseminadas por todo o corpo, ricas em amastigotas. Em

alguns casos ocorrem múltiplas e até centenas de lesões papulares e de

aparência acneiforme, que acometem vários segmentos corporais,

envolvendo com frequência a face e o tronco. É uma forma clínica grave

que ocorre em pacientes com anergia e deficiência específica na resposta

imune celular a antígenos de Leishmania, sendo esses pacientes negativos

no teste de Montenegro (Silveira et al., 2004; Lainson & Shaw, 2005; ).

A forma cutânea difusa é causada por algumas espécies do

subgênero Leishmania, sendo Leishmania (Leishmania) amazonensis a

única espécie considerada responsável pela forma clínica no Brasil

(Lainson, 1983; Lainson & Shaw, 2005). Demonstrou-se que pacientes

acometidos com a LCD, apresentam uma resposta do tipo Th2 exuberante

(Moraes et al., 1999). A gravidade desse quadro se complica quando

observado que os pacientes não apresentam uma resposta satisfatória ao

tratamento com antimoniais (Silveira & Lainson et al., 2004).

1.3.2. Epidemiologia e Controle

Até a década de 1950 a LTA disseminou-se praticamente por todo o

território nacional, coincidindo com o desflorestamento provocado pela

construção de estradas e instalação de aglomerados populacionais, com

maior incidência nos estados de São Paulo, Paraná, Minas Gerais, Ceará e

Pernambuco. A partir daí até a década de 1960, a doença parece ter

entrado em declínio, com o desmatamento já completado nas regiões mais

urbanizadas do país, além da relativa estabilidade das populações rurais

(Furtado, 1994). Desde então, a transmissão da doença vem sendo descrita

em vários municípios de todas as unidades federadas (UF) (Ministério da

Saúde, 2007).

Nas últimas décadas, as análises epidemiológicas da leishmaniose

tegumentar americana têm sugerido mudanças no padrão de transmissão

da doença, inicialmente considerada zoonoses de animais silvestres, que

22

acometia ocasionalmente pessoas em contato com as florestas.

Posteriormente, a doença começou a ocorrer em zonas rurais, já

praticamente desmatadas, e em regiões periurbanas (Passos et al., 1993).

Acredita-se que essa mudança no perfil de transmissão possa estar

relacionada a uma adaptação de algumas espécies de flebotomíneos aos

ambientes modificados pelo homem e os animais domésticos envolvidos no

ciclo de transmissão (Tolezano et al., 1980; Lainson, 1989; Marzochi, 1992).

Em 2010 foram registrados 21981 casos no Brasil, sendo 72,8% dos

casos registrados nas regiões Norte e Nordeste, 14,4% na região Centro-

oeste, 11% na região Sudeste e 1,1% na região Sul do país (Figura 2)

(Sinan/SVS/MS, 2012).

Observa-se a existência de três perfis epidemiológicos:

Segundo o Manual de Vigilância Epidemiológica da LTA, produzido

pelo Ministério da Saúde (MS), podem ser observados três padrões

epidemiológicos da doença no Brasil:

a) Silvestre – em que ocorre a transmissão em áreas de vegetação

primária (zoonose de animais silvestres);

b) Ocupacional ou Lazer – em que a transmissão esta associada à

exploração desordenada da floresta e derrubada de matas para construção

de estradas e usinas hidroelétricas, extrativismo vegetal, desenvolvimento

de atividades agropecuárias e ecoturismo; (antropozoonose);

10000

15000

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10

Casos de LTA no Brasil de 1990 a 2010

Casos de LTA

Figura 2 - Casos de Leishmaniose Tegumentar Americana no Brasil –1990 a

2010. Adaptado pelo autor de Sinan/SVS/MS, 2012.

23

c) Rural ou periurbana – em áreas de colonização (zoonose de matas

residuais) ou periurbana, em que houve adaptação do vetor ao peridomicílio

(zoonose de matas residuais e/ou antropozoonose).

Em virtude das características epidemiológicas da LTA, as

estratégias de controle devem ser flexíveis, distintas e adequadas a cada

região ou foco em particular. A diversidade de agentes etiológicos, de

reservatórios, de vetores e a situação epidemiológica da LTA, aliada ao

conhecimento ainda insuficiente sobre vários aspectos da sua

epidemiologia, evidenciam a complexidade do controle desta endemia. Para

definir as estratégias e a necessidade das ações de controle para cada área

de LTA a ser trabalhada, deverão ser considerados os aspectos

epidemiológicos, bem como seus determinantes (Ministério da Saúde,

2007).

No Brasil, a vigilância epidemiológica e a metodologia para controle

da LTA é determinada pelo Ministério da Saúde. Todo caso suspeito de LTA

deve ser submetido à investigação clínica e epidemiológica, e a método

auxiliar de diagnóstico. Caso seja confirmado, inicia-se o tratamento

segundo as normas técnicas preconizadas pelo Ministério da Saúde e

acompanha-se mensalmente o paciente, pelos três primeiros meses e, uma

vez curado, bimensalmente, até completar doze meses após o término do

tratamento (Ministério da Saúde, 2007).

Os casos de LTA devem ser obrigatoriamente notificados ao MS em

uma ficha de notificação padronizada pelo Sistema de Informação de

Agravos de Notificação (SINAN). As informações contidas nesses

formulários são essenciais para caracterização da doença em uma região e

apartir deles, serão observadas a necessidade de adoção de medidas de

controle, destacando que o diagnóstico precoce, e o tratamento adequado

dos pacientes, bem como as atividades educativas, devem ser prioridades

em todas as situações (Ministério da Saúde, 2007).

Embora não seja fatal, a leishmaniose cutânea é tratada para

acelerar a cura, reduzir as lesões e prevenir a disseminação do parasito ou

as recaídas, reduzindo assim a morbidade. Vale enfatizar que, mesmo com

o tratamento adequado, a ocorrência de recidivas e/ou comprometimento

24

mucoso é frequente, sendo de 2% nos casos tratados e em torno de 10%

nos casos não tratados (Marsden, 1986).

1.4. Modelos experimentais utilizados em testes de novos fármacos

O estudo da LTA recorre aos modelos experimentais para induzir

infecções experimentais utilizadas na análise de diversos aspectos do

parasitismo por Leishmania e mesmo na avaliação da eficácia de novos

candidatos a vacinas e fármacos (Passero, 2011).

Existem diversos sistemas de teste in vitro e in vivo, com

características específicas para conduzir à uma otimização do teste. Os

ensaios in vitro constituem uma primeira etapa para avaliação da eficácia

de novas drogas e são utilizadas tanto as formas promastigotas quanto as

amastigotas (Gupta & Nishi, 2011).

Dentre os requisitos para esses ensaios podemos citar a utilização

do parasito na sua forma encontrada no hospedeiro mamífero, uma

população de células em divisão, medidas reprodutíveis e quantificáveis da

atividade da nova droga, e a mensuração da atividade de drogas padrão,

como o glucantime, em concentrações compatíveis com o modelo in vivo

(Croft, 1986). Além desses requisitos, é interessante que o sistema utilize

pequenas quantidades do composto, rápida execução e baixo custo (Croft

et al., 2006).

Os modelos in vitro que simulam o ambiente da fase amastigota

intracelular tem sido descritos como mais confiáveis para avaliação das

novas drogas (Croft, 1986). Esses têm utilizados macrófagos primários e

linhagens de células imortalizadas como hospedeiras, incluindo

macrófagos peritoneais de camundongos e sangue humano derivados de

monócitos, macrófagos humanos, células THP-1, promonócitos humanos

U937 e células J774.1(Seifert et al., 2010). Nesses modelos, a atividade da

droga é mensurada através da contagem em microscopia ótica do

percentual de macrófagos infectados e/ou o número de amastigotas por

macrófago (Neal & Croft, 1984).

A atividade de drogas utilizando as formas promastigotas é de fácil

mensuração e rápida execução. No entanto, diferenças observadas em sua

25

susceptibilidade a drogas padrão em comparação com as formas

amastigotas, e as diferenças bioquímicas que existem entre as duas

formas, tornam esse modelo mais útil para determinação da toxicidade de

novas moléculas (Croft et al., 2006). Outros modelos foram descritos

utilizando amastigotas axênicas (Callahan et al., 1997). No entanto, foram

observadas diferenças na sensibilidade a drogas dessas formas em

comparação com as amastigotas intracelulares (Ephros et al., 1999).

Os ensaios in vivo são essenciais para determinar os parâmetros de

absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade de uma nova

droga. O modelo murino é o mais utilizado, pois requer um pequeno

volume do composto e reproduz bem os resultados utilizando apenas 5

animais por grupo (Gupta & Nishi, 2011). Os modelos utilizando

camundongos BALB/c são extensivamente utilizados devido à

susceptibilidade desse camundongo a diversas espécies de Leishmania

causadora de LT, e por ser uma linhagem cuja cura é excepcionalmente

difícil, mesmo utilizando as drogas padrão (Croft et al., 2006).

Nesses modelos a determinação da atividade da formulação é feita

através da mensuração do tamanho da lesão pela quantificação da carga

parasitária in situ. São descritos diversos métodos de quantificação da

carga parasitária da lesão, utilizando o cultivo dos parasitos através de

biópsias das lesões em diluição limitante (Titus et al., 1985), a LDU

(Leishmania donovani Units) que consiste na relação entre número de

amastigotas por células nucleadas do hospedeiro e o peso do órgão

parasitado (Stauber, 1956) e pelo método de PCR em tempo real (Bretagne

et al., 2001).

1.5. Tratamento

Gaspar Vianna, em 1912, foi o primeiro a utilizar o antimônio

trivalente (tártaro emético) no tratamento contra a leishmaniose. Por ser

muito tóxica, sua utilização clínica foi suspensa em decorrência aos seus

efeitos tóxicos. Desde então, esse medicamento sofreu várias modificações

para reduzir esses efeitos. Em 1947 os complexos de antimônio

26

pentavalente (SbV), menos tóxicos, foram introduzidos na quimioterapia das

leishmanioses (Berman, 1997; WHO, 2010).

Devido à sua comprovada eficácia terapêutica, os antimoniais

pentavalentes ainda são os fármacos de primeira escolha, utilizados no

tratamento convencional de ambas as formas de leishmaniose, em muitos

países da América do sul e norte da África, além da Turquia, Bangladesh

Nepal e Índia, excetuando-se o caso especial de Bíhar, norte da Índia

(Marsden et al., 1985; Murray et al., 2005).

Os antimoniais pentavalentes atualmente em uso são o Antimoniato

de N-metil glucamina (Glucantime®, Aventis) e Estibogluconato de sódio

(Pentostan®), administrados por via endovenosa ou intramuscular (Rath et

al., 2003; Herwaldt, 1999). Esses compostos são aplicados em injeções

intramusculares ou intralesionais e frequentemente causam dor no local da

aplicação e às vezes efeitos colaterais sistêmicos, sendo requerida

supervisão médica (Al khawajah et al., 1997). Outra modalidade de

tratamento inclui o uso de vacinas associadas ao tratamento com

antimonias, obtendo resultados promissores no que diz respeito ao volume

de droga administrada e tempo de tratamento, reduzindo, portanto, sua

toxicidade (Mayrink et al., 2006).

Dentre os efeitos colaterais podemos citar náusea, fraqueza, vômito,

mialgia, dor abdominal, nefrotoxicidade, alterações hepáticas e distúrbios

cardiológicos, o que representa um problema na utilização destes

medicamentos (Balaña-Fouce et al., 1998; Marsden, 1985; Masmoudi et al.,

2005; Rodrigues et al., 1999). Ao lado disso, foi relatada resposta

terapêutica variável e falhas no tratamento com antimoniais (Lawn et al.,

2003; Sundar, 2001; Marsden et al.,1985).

A estrutura abaixo é proposta para o Glucantime, medicamento

usado no Brasil para o tratamento de Leishmanioses.

27

Figura 3: Fórmula estrutural proposta para o Glucantime, adaptadas de Frézard et al.,

2008.

Como medicamento de segunda escolha é usado o Desoxicolato

sódico de anfotericina B e suas formulações lipossomais. Esse é um

antibiótico antifúngico, usado para o tratamento de pacientes em estado

grave, gestantes, recidivantes e nos casos de falha terapêutica (Ministério

da saúde, 2007).

Apesar das altas taxas de cura na quimioterapia antimonial, sua

utilização é limitada devido a vários fatores. O tratamento com os

antimoniais é longo, requerendo doses repetidas. O aparecimento de

reações adversas é frequente, sendo a mais grave a cardiotoxicidade. Este

efeito é diretamente relacionado com a dose e com o tempo de utilização do

fármaco. Outras reações adversas frequentes são artralgias, mialgias,

inapetência, náuseas, vômitos, dor abdominal, plenitude gástrica,

epigastralgia, pirose, dor no local da aplicação, febre e elevação de enzimas

hepáticas e pancreáticas. Ocasionalmente observam-se anemia, leucopenia

ou trombocitopenia (Ganier & Croft, 2002; Berman, 2005).

Além das dificuldades de administração desses compostos, um dos

grandes problemas enfrentados atualmente é o crescente número de

relatos de casos de resistência de cepas de Leishmania aos compostos

antimoniais pentavalentes (Sundar, 2001; Croft et al., 2006). No estado de

Bihar, na Índia, mais de 60% dos pacientes com leishmaniose visceral não

respondem ao tratamento com antimoniais pentavalentes (Sundar, 2001).

28

Na América do Sul, a ocorrência de resistência ao Sb é desconhecida (Lima

et al., 2007).

Tendo em foco essas limitações, a organização mundial de saúde

recomenda e apoia pesquisas no desenvolvimento de novas drogas. No

entanto, a falta de apelo comercial para a indústria farmacêutica e a política

pública de muitos países, em se tratando de doenças negligenciadas,

resultam em um suporte insuficiente a tal desenvolvimento. Portanto,

estratégias baseadas na melhoria dos fármacos existentes são mais bem

sucedidas do que o desenvolvimento de novas moléculas, com o objetivo

de reduzir sua toxicidade, melhorando sua eficácia além, de utilizar vias de

administração menos invasivas, como a via oral e a tópica (Frézard &

Demicheli, 2010).

Somente o miltefosine (1-0-hexadecilfosfocolina), originalmente

desenvolvido para o tratamento de metástases cutâneas em carcinomas

mamários, foi lançado no mercado como uma opção racional de fármaco a

ser usado contra as leishmanioses (Hilgard et al., 1993).

Diversos outros fármacos encontram-se em fase clínica de teste,

como as formulações lipossomais de anfotericina B, a sitamaquina, a

buparvaquona e o imiquimod, que apresentaram bons resultados nas fases

pré-clínicas (Croft et al, 2006).

Apenas a paromomicina, um antibiótico aminoglicosídeo identificado

como tendo ação leishmanicida na década de 60, obteve bons resultados

quando administrada por via tópica (El-On et al., 1992). Outras formulações

de paromomicina envolvendo outros veículos foram testadas obtendo

resultados variáveis (Soto et al., 2002; Iraji & Sadeghinia, 2005; Aguiar et

al., 2009).

1.6. Mecanismos de ação dos antimoniais

O mecanismo de ação dos antimoniais pentavalentes não foi

completamente elucidado. No entanto, há dois modelos propostos para

explicar esse mecanismo de ação. De acordo com o primeiro modelo, o

antimônio pentavalente seria uma pró-droga que seria reduzida no

29

organismo a antimônio trivalente (Shaked-Mishan et al., 2001, Goodwin &

Page, 1943)

Estudos recentes indicam que pelo menos quatro diferentes tióis

podem agir como agentes redutores nessa conversão: Glutationa, o tiol

predominante no citosol de células de mamíferos; cisteína e cisteinil-glicina,

os principais tióis presentes em lisossomos, e a tripanotiona, predominante

no citosol de Leishmania (Ferreira et al., 2003). Aparentemente a redução

do antimônio ocorre preferencialmente em amastigotas devido ao pH e

temperatura do ambiente intracelular (Shaked-Mishan et al., 2001). Estudos

recentes sugerem ainda a participação de enzimas específicas do parasito

na redução do antimônio pentavalente para trivalente (Denton et al., 2004;

Zhou et al., 2004).

Um segundo modelo propõe uma atividade intrínseca do antimônio

contra a Leishmania. Foi demonstrado que o antimônio pentavalente pode

formar complexos estáveis com ribonucleosídeos, interferindo no processo

de β-oxidação de ácidos graxos e glicólise do parasito e na depleção dos

níveis de ATP intracelular (Demicheli et al., 2002; Rath et al., 2003).

Recentemente, Ferreira (2010) propôs um grupo de moléculas

anfifílicas complexadas ao antimônio para o tratamento das leishmanioses.

São elas o Octanoil N-metilglucamida (LA8), o Decanoil N-metilglucamida

(LA10) e o Dodecanoil N-metilglucamida (LA12), respectivamente contendo

8, 10 e 12 carbonos na porção apolar da molécula.

Dado que a localização intracelular de Leishmania dificulta a ação

dos fármacos, pela barreira natural representada pela membrana das

células, o uso de compostos anfifílicos apresentaria uma vantagem ao

facilitar a passagem através dessa barreira.

1.7. Octanoil N-metilglucamida

O composto octanoil N-metil-glucamida (LA8), uma

alquilmetilglucamida, apresenta uma extremidade polar, com sítios de

ligação para o SbV, e uma extremidade hidrocarbônica, podendo assim

formar nanossistemas micelares e direcionar sua captação por macrófagos

que alberguem o parasito. Por ser um composto anfifílico, espera-se que ele

30

possa atravessar barreiras biológicas específicas como a membrana

plasmática, o epitélio do trato gastrintestinal e a pele (Ferreira, 2010).

Dados obtidos por microscopia eletrônica de transmissão indicam

que as alquilmetilglucamidas formam nano agregados de diâmetro médio

entre 20 e 200nm. Suas propriedades anfifílicas sugerem que sua

formulação tópica possa ser uma proposta relevante para o tratamento da

LTA (Ferreira, 2010).

Figura 4: Fórmulas estruturais propostas para o octanoil N-metilglucamida (a) e o

complexo LA8-Sb (b), baseado em dados de Espectrometria de massa (ESI-EM)

(Ferreira, 2010).

31

2.Ju

stif

icat

iva

32

Nos últimos anos houve um significativo aumento do número de

casos de leishmaniose, além da expansão geográfica da doença em todo o

mundo, sendo, portanto considerada um grande problema de saúde pública

em vários países onde incide. A OMS classifica a doença como

negligenciada, ocupando lugar de destaque dentre as doenças tropicais e

parasitárias. Isso torna importante o desenvolvimento de pesquisas e de

novas estratégias que possam contribuir com o controle da doença.

O tratamento, sobretudo nas formas tegumentares da doença, cuja

epidemiologia é bastante complexa, é essencial para o controle. Inúmeros

novos compostos têm sido estudados para o tratamento das leishmanioses.

No entanto, existe hoje uma carência de opções terapêuticas ou

tratamentos mais adequados para esta doença. Tal carência é o reflexo de

políticas públicas ineficientes, do escasso investimento da indústria

farmacêutica no desenvolvimento de novas drogas. Além disso, há um

desinteresse do mercado internacional no investimento para o

desenvolvimento de novas drogas eficazes contra doenças negligenciadas

de países em desenvolvimento e subdesenvolvidos.

A OMS sugere a busca de novos compostos que sejam eficazes e

que tenham baixa toxicidade para o homem. É necessário buscar

estratégias para solucionar esta questão, pois apesar dos avanços no

conhecimento das bases moleculares e celulares das patologias, o

desenvolvimento de novas drogas para o tratamento destas doenças

avança a passos lentos (Nwaka, 2003).

Desde o ano 2000, existe uma interação entre grupos de pesquisa do

Instituto de Ciências Exatas / ICEX (Departamento de Química) e do

Instituto de Ciências Biológicas / ICB (Departamentos de Parasitologia e

Fisiologia e Biofísica), no estudo, desenvolvimento e testes pré-clínicos de

drogas leishmanicidas. Além do desenvolvimento racional de novas

moléculas, o grupo desenvolve pesquisas com os fármacos já existentes,

no sentido de potencializar seu efeito leishmanicida e diminuir sua

toxicidade.

A partir da interação desses grupos de pesquisa foi desenvolvida a

molécula LA8-Sb, com características anfifílicas interessantes em

formulações para o tratamento tópico da leishmaniose cutânea. Dessa

33

forma, foi proposto um estudo envolvendo o octanoil N-metilglucamida

(LA8) e o complexo incorporado com antimônio pentavalente (LA8-Sb) in

vitro e in vivo, contra formas cutâneas de leishmaniose, em macrófagos

experimentalmente infectados e camundongos também experimentalmente

inoculados com Leishmania (L.) amazonensis.

34

2. D

3. d

3. O

bje

tivos

35

3.1. Objetivo Geral

Avaliar a eficácia do composto LA8-SbV in vitro e in vivo por via

tópica em camundongos BALB/c experimentalmente infectados com

Leishmania (Leishmania) amazonensis.

3.2. Objetivos Específicos

Avaliar a citotoxicidade in vitro dos compostos LA8 e LA8-SbV em

macrófagos peritoneais murinos.

Avaliar a atividade anti-amastigota in vitro dos compostos LA8 e LA8-SbV

em macrófagos peritoneais murinos experimentalmente infectados com

Leishmania amazonensis.

Avaliar a permeação percutânea de antimônio in vitro a partir do complexo

LA8-SbV, utilizando pele de camundongos Hairless, com e sem o estrato

córneo.

Avaliar a eficácia, através do acompanhamento do tamanho das lesões em

função do tempo e da determinação da carga parasitária por LDU, do

tratamento tópico com o LA8-SbV em camundongos BALB/c

experimentalmente infectados com L. (L.) amazonensis.

36

4. d

4.

Mat

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l e

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37

4.1. Síntese dos complexos de alquilmetilglucamidas com antimônio

(Ferreira, 2010)

A síntese do complexo foi realizada no Departamento de Química da

UFMG e no Laboratório de biofísica de sistemas Nanoestruturados do ICB,

segundo protocolo descrito por Ferreira (2010).

4.2. Manutenção do parasito

Para a realização dos experimentos foi utilizada a cepa de referência

da Organização Mundial de Saúde: Leishmania (L.) amazonensis

(IFLA/BR/1967/PH8). Os parasitos foram isolados em meio de cultura a

partir de lesão de hamsters (Mesocricetus auratus), nos quais são mantidas

as cepas para uso do Laboratório de Biologia de Leishmania. As

promastigotas foram cultivadas em meio MEM suplementado com 10%

de soro fetal bovino, 50μg/mL de estreptomicina e 1000U/mL de penicilina

(MEM completo) e incubadas em estufa a 24±1°C em garrafas plásticas

de cultura celular de 50mL (Sarsted, USA).

4.3. Animais

Foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas de 6 a 8 semanas de

idade, provenientes do Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO-ICB/UFMG) e

do Biotério do Centro de Pesquisas René Rachou da Fiocruz (CPqRR).

Os animais foram mantidos no Biotério do Departamento de

Parasitologia do ICB-UFMG, sobre condições adequadas de manejo

técnico, de acordo com o Colégio Brasileiro de Medicina Veterinária.

Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação

Animal (CETEA) – protocolo 206/2010 (Anexo 1).

38

4.4. Estudo da citotoxicidade in vitro.

4.4.1. Isolamento de macrófagos peritoneais

O ensaio de citotoxicidade foi realizado com macrófagos peritoneais

de camundongos BALB/c. Os macrófagos foram elicitados com injeção

intraperitoneal de 2mL de tioglicolato 3% (Gibco®

- Grand Island, NY,USA)

para indução de uma resposta inflamatória. Após três dias, os

camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical e foi obtido o

lavado da cavidade peritoneal com injeção de 10mL de meio RPMI 1640

(Cultilab, Brasil) e posterior recuperação do fluido (Zhang et al., 2008).

O lavado foi centrifugado a 2000g por 10 minutos (Centrifuga

HERMLE, modelo 2323 K), o sobrenadante descartado e o “pellet”

ressuspendido em meio RPMI 1640 suplementado 10% SFB, 50μg/mL de

estreptomicina e 1000U/mL de penicilina (RPMI 1640 completo). As células

foram quantificadas em câmara hemocitométrica de Neubauer com o auxílio

do corante vital azul de Trypan (Cascade BiologicalTM-USA) a 0,4%.

Apenas as células viáveis foram consideradas para cálculo do

inóculo. O número de células/mL da amostra foi estimado como a média

aritmética de duas contagens dos quatro quadrantes da câmara,

multiplicado pelo inverso da diluição da amostra e por 104 (fator de correção

da câmara).

4.4.2. Ensaio de citotoxicidade em macrófagos murinos (MTT

assay)

Para o ensaio de citotoxicidade foi utilizado o protocolo descrito por

Denizot & Lang, (1986), com modificações. Os macrófagos isolados

segundo descrito no ítem 3.4.1., foram então, incubados em placa de 96

poços (TPP®, Switzerland), com o volume de células ajustado para 3x105

macrófagos por poço em um volume final de 100μL de meio RPMI 1640

completo. As placas foram incubadas a 37ºC em estufa (Forma Scientific,

39

Inc. modelo 3154 S/N 31433) com atmosfera de 5% de CO2

por 1 hora, para

aderência dos macrófagos aos poços.

Após o período de incubação, as culturas foram visualizadas em

microscópio invertido (Olympus Optical CO – contraste de fase) para

observação dos macrófagos aderidos e, os poços foram então lavados com

meio RPMI 1640 previamente aquecido a 37ºC, para remover possíveis

células não aderentes.

Após as lavagens para retirada das células não aderidas e o

esgotamento dos poços, os macrófagos aderidos à placa foram incubados

na presença dos compostos LA8 (nas concentrações de 10.0, 7.5, 5.0, 2.5 e

1.0mM), LA8-Sb (nas concentrações de 1.0, 0.5, 0.25, 0.1 e 0.05mM de Sb)

e Glucantime® (nas concentrações de 332.6, 110.8, 22.1, 11.0, e 2.2mM de

Sb) diluídos em um volume final de 100μL de meio RPMI 1640 completo.

Como controle positivo do experimento, macrófagos aderidos foram

incubados apenas com RPMI 1640 completo, e como controle negativo,

macrófagos foram expostos à solução fixadora ISOTON (ácido cítrico 0,05

M, NaCl 0,12 M, formaldeído 0,5%, pH 7,2).

As culturas permaneceram expostas aos compostos durante 20

horas, incubadas a 37ºC com atmosfera de 5% de CO2. Após os períodos

de incubação, foram adicionados aos poços 10μL da solução MTT (brometo

de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)]- 2,5-difeniltetrazólio) (Sigma®Co-USA) a

5mg/mL (50μg/poço). As placas foram novamente incubadas por 4 horas a

37ºC com atmosfera de 5% de CO2. Após incubação, o sobrenadante foi

removido e adicionou-se 100μL de dimetilsulfóxido (DMSO – Sigma® Co -

USA.), para solubilizar os cristais de formazan formados. Posteriormente, as

placas foram submetidas à leitura em espectrofotômetro, onde a densidade

ótica foi lida em comprimento de onda de 570nm.

O valor final da densidade ótica de cada poço foi subtraído do valor

da densidade ótica de uma triplicata de poços contendo apenas DMSO.

Cada concentração dos compostos foi testada em triplicata em pelo menos

três experimentos independentes. Os resultados foram expressos em

gráficos de porcentagem, sendo os valores do eixo y relativos ao controle,

considerado como apresentando 100% de viabilidade.

40

4.4.3. Concentração citotóxica in vitro

A concentração citotóxica (CC50) foi definida como àquela que gerou

redução de 50% na absorbância, nos ensaios de MTT. Foi calculada por

análise de regressão “Sigmoidal fit”, utilizando o programa Origin® 6.0, a

partir dos dados obtidos em cada experimento.

4.5. Estudo da atividade leishmanicida in vitro.

4.5.1. Infecção experimental de macrófagos murinos com

Leishmania amazonensis.

Foram realizados ensaios da toxicidade in vitro dos compostos

anfifílicos LA8 e LA8-Sb sobre as formas amastigotas de L. amazonensis,

internalizadas em macrófagos peritoneais de camundongos.

Para a realização deste ensaio, os macrófagos murinos obtidos

conforme descrito no item 4.4.1., foram incubados em placas de 24 poços

(TPP®, Switzerland), contendo previamente em cada poço, uma lamínula

estéril, em formato circular, com 13 mm de diâmetro. A população de

células foi ajustada para 2x105

macrófagos por poço, em um volume final de

0,5mL.

As células foram incubadas em estufa a 37ºC, com atmosfera de 5%

de CO2 durante 1 hora, para que ocorresse a aderência dos macrófagos às

lamínulas. Após o período de incubação, com os macrófagos já aderidos, foi

feita a infecção destes com L. amazonensis.

Culturas de promastigotas de L. amazonensis em fase estacionária

de crescimento foram centrifugadas três vezes em meio RPMI sem soro a

2800g por 10 minutos. O pellet foi ressuspenso em meio RPMI 1640

completo, as promastigotas foram quantificadas em câmara de Neubauer e

ajustadas para uma concentração correspondente a 2x106

células em

0,5mL, a serem incubadas por poço, o que corresponde a uma proporção

de 10 promastigotas por macrófago. O meio de cultura utilizado na

41

incubação dos macrófagos foi então substituído pelo meio de cultura

contendo as formas promastigotas.

A placa foi incubada durante 5 horas, em estufa a 34ºC e atmosfera

de 5% de CO2, para que houvesse a infecção dos macrófagos. Após este

período foram feitas três lavagens dos poços com meio RPMI 1640

completo, aquecido a 34ºC, para remover promastigotas não fagocitadas e

células não aderidas (Berman & Lee, 1984; Neal & Croft, 1984).

4.5.2. Exposição dos macrófagos infectados aos compostos

Os compostos foram previamente diluídos em meio de cultura RPMI

1640 completo, nas concentrações 1.0, 0.5 e 0.1mM para o LA8; 0.2, 0.1 e

0.05mM de Sb, para o LA8-Sb e nas concentrações de 10.0, 5.0, e 1.0mM

de Sb para o Glucantime®,

respeitando os valores de citotoxicidade de cada

droga, obtidos no ensaio de MTT em macrófagos. Cada concentração dos

compostos foi testada em triplicata em pelo menos três experimentos

independentes.

Após a terceira lavagem e o esgotamento completo dos poços que

continham as lamínulas, os compostos nas diferentes concentrações, foram

adicionados sobre as lamínulas com macrófagos infectados, em um volume

final de 500L por poço. Macrófagos não infectados também foram

expostos às mesmas concentrações das drogas.

As placas foram incubadas em estufa a 34ºC com atmosfera de 5%

de CO2 por 24 horas na presença dos compostos e na presença apenas de

RPMI 1640 completo como parâmetro de controle. Após o período de

incubação, as lamínulas foram retiradas dos poços, coradas por Panótico

rápido (Laborclin®) e montadas em lâminas permanentes com Bálsamo do

Canadá (Vetec®

- USA). As lâminas foram analisadas em microscópio ótico

com objetiva de imersão (1000X).

Foi feita a contagem de 300 macrófagos por lamínula da triplicata,

especificando-se o número de macrófagos infectados e número de

macrófagos não infectados. Desta forma, foram estabelecidas as taxas de

infecção dos macrófagos em cada lamínula da triplicata e, por fim, obteve-

se a média da taxa de infecção entre as triplicatas.

42

As médias dos percentuais de infecção de macrófagos, estabelecidas

na presença de cada um dos compostos, foram comparadas com a taxa de

infecção média dos controles sem droga.

4.5.3. Concentração inibitória in vitro

A concentração inibitória (CI50) foi definida como aquela que gerou

redução de 50% na taxa de infecção dos macrófagos in vitro. Foi calculado

por análise de regressão “Sigmoidal fit” utilizando o programa Origin 6.0®, a

partir dos dados obtidos em cada experimento.

4.5.4. Índice de Seletividade in vitro

O índice de seletividade (IS) foi calculado pela razão CC50 / CI50.

4.6. Estudo da atividade leishmanicida in vivo

4.6.1. Isolamento das promastigotas metacíclicas

O protocolo descrito a seguir foi adaptado a partir daquele descrito

por Späth & Beverley (2001).

As promastigotas foram cultivadas como descrito anteriormente. No

sexto dia de incubação, a cultura foi transferida da garrafa para um tubo

cônico de 50mL, lavando a garrafa duas vezes com PBS estéril para

remover os parasitos aderidos. O material transferido foi centrifugado a

2000g por 15 minutos a 4ºC.

Durante a centrifugação foi preparada uma solução de Ficoll 400

(Sigma Aldrich) a 10% (2mL de Ficoll 20% estéril, 1,6mL de água Milli-Q

estéril e 400L de PBS 10X estéril.).

A solução a 10% foi então pipetada sobre uma solução de Ficoll a

20%, ambas em um volume de 2mL cada, em um tubo cônico de 15mL,

montando assim um gradiente de concentração.

43

Após a centrifugação da cultura, o sobrenadante foi descartado e o

pellet ressuspendido e homogeneizado em 2mL de PBS estéril. Esta

solução foi então cuidadosamente aplicada sobre o gradiente de Ficoll e

centrifugada a 1150g por 10 minutos a 4ºC.

Após a centrifugação foi observada a formação de um anel branco

sobre a solução de Ficoll a 10%. Foi coletado o sobrenadante sobre o anel,

rico em promastigotas metacíclicas e ressuspenso para 10mL de PBS.

Após essa etapa o isolado foi lavado três vezes, centrifugando a 2000 g por

15 minutos a 4ºC, descartando o sobrenadante e adicionando-se 10mL de

PBS estéril.

Após a última lavagem, o sobrenadante foi descartado e o pellet

ressuspendido em 1mL de PBS. As formas metacíclicas foram contadas em

câmara de Neubauer e o volume do inóculo ajustado para 108 parasitos por

mL, equivalente a 106 parasitos em 10L, sendo esse o volume final do

inóculo por camundongo.

4.6.2. Infecção e tratamento dos camundongos

Foram inoculadas 1x106 promastigotas metacíclicas de L. (L.)

amazonensis (cepa IFLA/BR/1967/PH8) cultivadas como descrito no item

4.2 em 20 camundongos BALB/c (fêmeas, 6 a 8 semanas de vida). A

inoculação foi realizada por injeção subcutânea, ajustada a um volume final

de 10L de inócuo em PBS, na base da cauda, previamente tricotomizada.

Os camundongos foram divididos em quatro grupos de cinco animais:

um grupo controle ao qual se administrou apenas PBS. Um grupo controle

ao qual foi administrado Glucantime® por via intra-peritonial na dose de

200mg de SbV/kg uma vez ao dia. Em um dos grupos foi testado o

complexo LA8-SbV na concentração de 170mM (51,7mg de SbV/kg/12h) e

outro grupo ao qual foi testado LA8 na concentração de 510mM,

equivalente à concentração de LA8 no complexo. Nos grupos LA8 e LA8-

Sb, as formulações foram administrados por via tópica sobre toda a lesão

com o auxílio de seringas de 1mL, no volume de 50L/animal duas vezes

ao dia, por 21 dias.

44

O tratamento se iniciou aproximadamente no 45º dia após infecção,

quando as úlceras mediam em média 3mm de diâmetro, sendo esse valor

estimado pela média das maiores medidas da lesão, respectivamente

perpendicular e paralela à coluna vertebral do camundongo.

Os camundongos foram marcados e pesados individualmente

semanalmente, durante a execução do protocolo de tratamento, para avaliar

indícios de toxicidade sistêmica, causada pelas formulações. As lesões

foram medidas semanalmente a partir de uma semana antes do tratamento.

Foi considerado como diâmetro médio da lesão a média das medidas

da maior distância entre as bordas crânio-caudal e a maior medida do seu

eixo perpendicular. Os animais foram eutanasiados 24 horas após o término

do tratamento para quantificação da carga parasitária da lesão.

4.6.3. Quantificação da carga parasitária

A carga parasitária da lesão foi estimada utilizando-se o método descrito

por Stauber (1956).

Após eutanásia dos camundongos, as lesões foram removidas e foram

confeccionadas imprints da lesão. As lâminas foram coradas com corante

Panótico rápido (Laborclin®) e fotografadas em aumento de 40X em um

microscópio ótico. As imagens obtidas foram analisadas por um software de

análises de imagens assistido (Media Cybernetics Image Proplan 4.5).

Foi contado o número de amastigotas em relação a 1000 células do

hospedeiro e o resultado foi multiplicado por um fator de correção (2x104) e

pelo peso da lesão. Os resultados foram expressos como número de

amastigotas na lesão.

4.7. Estudo da permeação percutânea in vitro

Para o estudo da permeação percutânea dos compostos testados

foram utilizadas células de difusão de Franz, constituídas por um

compartimento superior e um inferior com volume aproximado de 6mL

(Figura 5). A membrana utilizada foi a pele do dorso de camundongos sem

pêlo (Hairless, linhagem HSR/J), sendo os experimentos realizados com

45

pele íntegra e na ausência do estrato córneo, representando uma lesão

ulcerada.

Para obtenção das peles, os camundongos sem pêlo (machos de 8

semanas, pesando de 25 a 30g), foram eutanasiados por deslocamento

cervical. O dorso foi limpo com água destilada e a pele retirada. Após

remoção do tecido adiposo subcutâneo com o auxílio de bisturi e inspeção

visual, a pele foi colocada nas células de Franz.

O compartimento receptor foi preenchido com o tampão HEPES 5mM

/NaCl 0,15M pH 7,4, ficando em contato com a pele pelo período de 1 hora

para promover equilíbrio do sistema. Após este período, o tampão foi

retirado e o compartimento receptor novamente preenchido com tampão.

Foram aplicados 100L sobre a superfície da pele de camundongo hairless

os compostos LA8-Sb 0,2M diluído em água destilada estéril e uma

formulação de antimoniato de meglumina (AM) na concentração de 0,35M

previamente incorporado em gel natrosol a 2% (adicionou-se um volume de

gel de natrosol a 4% a um volume igual de AM a 0,7M, à temperatura

ambiente e homogeneizou-se em vórtex por cerca de 20 minutos). As

formulações foram espalhadas com bastão de vidro, garantindo desta forma

homogeneidade da distribuição das formulações sobre a pele.

Durante o procedimento, o fluido receptor foi mantido a 37oC e

agitado continuamente com uma barra magnética. O compartimento doador

foi mantido aberto, permitindo a evaporação da fase aquosa volátil das

formulações mimetizando o processo como ocorreria in vivo (condição não

Figura 5 - Representação esquemática de uma Célula de Difusão de Franz.

46

oclusiva). Em diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6 e 8 horas) após a

aplicação das formulações, o fluido receptor foi coletado e o compartimento

receptor novamente preenchido com um novo tampão.

A concentração de antimônio nos fluidos coletados em diferentes

tempos foi determinada por espectroscopia de absorção atômica, em um

espectrômetro Perkin Elmer® AAnalyst 600 (GFAAS), equipado com

plataforma de aquecimento do tipo forno de grafite e corretor Zeeman de

background, do Laboratório de Biofísica de Nano Sistemas/Departamento

de Fisiologia e Biofísica, ICB/UFMG.

Foram realizados dois estudos de permeação percutânea in vitro, a

partir de formulações do LA8-Sb diluído em água deionizada e de

antimoniato de meglumina incorporado ao gel de natrosol (NatAM). O

primeiro estudo utilizou pele íntegra, e o segundo a pele com o estrato

córneo removido.

4.8. Análises estatísticas

A análise estatística foi realizada com o auxílio do programa

GraphPad Prism versão 5.0 e Origin versão 6.0.

Para calcular os valores de IC50 e CC50, foram feitas regressões não

lineares das médias dos valores encontrados para cada concentração em,

pelo menos, três experimentos independentes.

Para a análise da evolução da lesão dos camundongos, foi utilizado o

teste Two-way repeated measure ANOVA, seguido pelo teste de Bonferroni.

A média dos pesos dos animais foi avaliada para cada grupo por análise de

variância (ANOVA) com delineamento em parcelas subdivididas.

Para comparar os valores da absorção percutânea in vitro foi usado o

teste One-way ANOVA seguido do teste de Tukey’s.

Em todos os métodos, as diferenças foram consideradas

estatisticamente significativas quando o valor de p obtido fosse menor que

0,05 (p < 0,05). Os testes paramétricos foram utilizados somente quando os

dados apresentavam distribuição gaussiana, determinada pelo teste

Kolmogorov-Smirnov (Soares & Siqueira, 2002; Sampaio, 2007).

47

5. d

5.

Res

ult

ados

48

5.1. Curva de crescimento

As formas promastigotas de Leishmania amazonensis foram cultivadas

como descrito no item 4.2. Para a realização da curva de crescimento foi

utilizada uma cultura na segunda passagem, de um isolado de L. amazonensis

de hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente infectados.

Foi observado um grande aumento do número de parasitos na fase

logarítmica, até o terceiro dia de incubação, estabilizando-se a partir do quarto

dia. No quinto dia foi observado um grande número de formas metacíclicas

(Figura 6).

0 1 2 3 4 5 6 70

1.0107

2.0107

3.0107

4.0107

Tempo (dias)

Nú

mero

de

pro

masti

go

tas/m

L

Figura 6 - Curva de crescimento para Leishmania amazonensis (cepa PH8) em meio

MEM completo. Os desvios padrões estão representados por barras verticais.

Para a infecção dos camundongos do estudo in vivo foi utilizada cultura

no sexto dia de crescimento, rica em formas metacíclicas isoladas conforme

descrito anteriormente.

Para os estudos in vitro foram utilizadas as formas promastigotas

presentes na fase estacionária da curva, especificamente, no quinto dia.

49

5.2. Citotoxicidade em macrófagos murinos

As Tabelas 3, 4 e 5 mostram as médias dos resultados obtidos nos

testes de viabilidade de macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c na

presença do ligante LA8, o complexo LA8-Sb e o Glucantime. Os dados foram

expressos em porcentagem de viabilidade celular relativa, tendo como

referência, a média dos resultados obtidos na leitura dos poços controles, onde

não foram aplicadas formulações, considerando as mesmas como 100% de

viabilidade relativa (Tabelas 1 a 3).

O valor da concentração citotóxica para 50% dos macrófagos (CC50) foi

determinado para o ligante LA8, o complexo LA8-Sb e o Glucantime, através

do método citado no item 4.4.2.

O Glucantime apresentou um valor de CC50 de 26,31mM de Sb (tabela 2,

figura 8). O ligante LA8 e o complexo LA8-Sb, por outro lado, mostraram um

valor de CC50 de 4,89mM e 0,26mM de Sb (equivalente a 0,78mM de LA8)

respectivamente (Figura 7).

Tabela 1: Percentagem média de macrófagos peritoneais de BALB/c viáveis, em

diferentes concentrações de Glucantime, após 24 horas de exposição.

Concentração de SbV

(mM de Sb)

Viabilidade Celular (%)

Média Desvio padrão

332,6 43,92 31,40

110,8 41,89 8,65

22,1 76,05 7,96

11 88,43 9,49

2,2 98,29 9,25

Tabela 2: Percentagem média de macrófagos peritoneais de BALB/c viáveis, em

diferentes concentrações de LA8-Sb, após 24 horas de exposição.

Concentração de SbV

(mM de Sb)

Viabilidade Celular (%)

Média Desvio padrão

1 2,53 1,10

0,5 3,49 1,61

0,25 56,21 9,45

0,1 99,24 10,81

0,05 104,84 8,32

50

Tabela 3: Percentagem média de macrófagos peritoneais de BALB/c viáveis, em

diferentes concentrações de LA8, após 24 horas de exposição.

Concentração de LA8

(mM)

Viabilidade Celular (%)

Média Desvio padrão

10 15,35 7,87

7,5 20,87 9,38

5 46,10 7,84

2,5 74,98 13,23

1 86,62 10,84

Figura 7 - Curvas de viabilidade de macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c em

função da concentração de Glucantime, LA8 (octanoil-N-metilglucamida) e LA8-Sb

(octanoil-N-metilglucamida+Sb). Os dados mostrados representam a média de 3

experimentos independentes.

Os resultados obtidos indicam que o complexo LA8-Sb é cerca de 6

vezes mais tóxico para macrófagos que o ligante LA8, quando comparamos as

51

concentrações do ligante em ambos os compostos. A atividade citotóxica do

complexo é cerca de 100 vezes maior que atividade obtida para o Glucantime

neste ensaio, quando comparamos as concentrações de antimônio presentes

em ambas as formulações.

5.3. Atividade anti-amastigota in vitro

Procuramos determinar o valor da concentração capaz de reduzir em

50% o número de macrófagos parasitados (CI50) no modelo de macrófagos

infectados com Leishmania amazonensis, para o ligante LA8, o complexo LA8-

Sb e Glucantime, através do método citado no item 4.5.2.

As concentrações utilizadas foram determinadas selecionando-se

valores abaixo daqueles que permitiam uma viabilidade celular acima de 80%,

nos testes de citotoxicidade em macrófagos.

Para um estudo preliminar da atividade leishmanicida do LA8 e do LA8-

Sb foram selecionados apenas três concentrações a serem testadas como

citado no material e métodos. No entanto, como não foi observada atividade

anti-amastigota dos compostos testados, em concentrações muito próximas

daquelas tóxicas para macrófagos, optamos por não realizar um novo teste

com outras concentrações.

O Glucantime apresentou atividade leishmanicida nas concentrações de

10 e 5 mM de Sb, quando comparado ao grupo controle. Os compostos LA8 e

LA8-Sb não apresentaram atividade nas concentrações testadas (Figura 8).

Não foram observados macrófagos viáveis na concentração de 0,2 mM

do complexo LA8-Sb, sendo observadas raras amastigotas ou grumos de

amastigotas, muitas delas não apresentando a morfologia clássica do parasito

(Figura 9).

Devido ao fato das concentrações utilizadas neste teste para o ligante e

o complexo serem muito próximas das concentrações citotóxicas, não foi

possível determinar o índice de seletividade desses compostos.

52

10mM 5mM 1mM 1mM 0,5mM 0,1mM 0,2mM 0,1mM 0,05mM

0

50

100

Glucantime LA8 LA8-Sb

Controle

*

*

Célu

las p

ara

sita

das (

%)

Figura 8 - Atividade leishmanicida in vitro dos compostos LA8, LA8-Sb e Glucantime em

diferentes concentrações no modelo de macrófagos peritoneais de BALB/c, infectados

com formas promastigotas de fase estacionária de Leishmania amazonensis. Os dados

são mostrados como a percentagem média de células parasitadas com relação ao

controle não tratado. Os asteriscos evidenciam diferenças estatisticamente significativas

em comparação ao controle (p<0,001)

Figura 9 - Imagens de microscopia ótica das lâminas do teste de atividade anti-

amastigota in vitro com as maiores concentrações utilizadas no teste para cada

composto. Grupo controle (A), Glucantime 10,0mM (B), LA8-Sb 0,2mM (C) e LA8 1,0mM

(D). Aumento de 40x.

A CI50 calculada para o Glucantime foi de 4,21mM de Sb, (Figura 10), e

o índice de seletividade estimado neste experimento foi de 6,2.

53

Figura 10 - Curva de inibição do número de macrófagos peritoneais infectados em

função da concentração de Glucantime. Os valores são mostrados como a média de 3

experimentos independentes.

5.4. Permeação percutânea de Sb

A permeação média de antimônio a partir da formulação NatAM nestas

condições descritas no item 4,8, após oito horas de exposição foi de 0,33 ±

0,26% e 14,57 ± 1,08%, respectivamente. Para o composto LA8-Sb, estes

valores foram 0,008 ± 0,003% e 4,27 ± 2,49%, respectivamente (Figura 11).

Foi observada uma baixa permeação de antimônio em ambas as

formulações testadas, após oito horas de exposição, quando a pele

apresentava o estrato córneo. Entretanto, a permeação de Sb para ambos as

formulações foi maior na ausência de estrato córneo (p < 0,05) (Figura 12).

54

NatAM LA8-Sb NatAM LA8-Sb

0.010.020.030.200.350.50

5

10

15

Pele íntegra Ausência de estrato córneo

20

**

*

**

% d

e S

b p

erm

eado

Figura 11 - Percentual da permeação cutânea de Sb através da pele de camundongos

Hairless, após oito horas de exposição às formulações na presença e na ausência de

estrato córneo. Os asteriscos representam diferença estatística significante (* = p < 0,05

e ** = p < 0,001) (n=3).

A formulação NatAM apresentou uma taxa de permeação maior que o

LA8-Sb na presença de estrato córneo (p < 0,05) após 8 horas (figura 12-A). O

mesmo foi observado na ausência de estrato córneo (p < 0,001) (Figura 12-B).

Na ausência de estrato córneo, destaca-se a liberação sustentada de Sb a

partir da formulação LA8-Sb, representada pela inclinação da curva

visualmente menor que a de NatAM.

55

0 2 4 6 8 100.0

0.2

0.4

0.6NatAM

LA8-Sb

A

Horas

% d

e S

b p

erm

eado

0 2 4 6 8 100

5

10

15

20NatAM

LA8-Sb

B

Horas

% d

e S

b p

erm

eado

Figura 12 - Permeação percutânea de antimônio em função do tempo, em células de

difusão de Franz usando pele íntegra de camundongos Hairless (A) ou na ausência do

estrato córneo (B). Os dados representam a média (n=3) e os desvios-padrão são

representados por barras verticais.

56

5.5. Atividade anti-leishmania in vivo

A eficácia in vivo dos compostos LA8 e LA8-Sb foi avaliada em

camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis. O tratamento foi

iniciado 45 dias após a infecção através de aplicação tópica das formulações

na lesão conforme descrito no item 4.7.2. Foram determinados dois

parâmetros: diâmetro médio da lesão e carga parasitária estimada pela técnica

de LDU.

O peso dos camundongos foi aferido para avaliação da toxicidade

sistêmica do composto (Tabela 4). Não foi observada alteração nas médias dos

pesos dos camundongos tratados com nenhuma das formulações utilizadas no

ensaio in vivo.

Tabela 4 - Avaliação do peso médio de camundongos BALB/c infectados com L. (L.)

amazonensis tratados com Glucantime, LA8 e LA8-Sb. Os valores apresentados se

referem às médias e desvio padrão de dois experimentos independentes (n=5).

Não foi observada redução do tamanho da lesão dos camundongos

tratados com o ligante, quando comparados com o grupo controle no 21º dia de

tratamento. Entretanto, foi observada diminuição do diâmetro médio da lesão

dos camundongos tratados com o Glucantime, a partir do 14º dia de tratamento

e com o complexo LA8-Sb a partir do 21º dia de tratamento (Figuras 13 e 15).

Quando comparamos a evolução da lesão em cada grupo, é observada

uma diminuição no tamanho da lesão com o passar do tempo no grupo tratado

com Glucantime. Os grupos controle e LA8 apresentaram um aumento do

tamanho da lesão como esperado. Por outro lado, o grupo tratado com o

complexo LA8-Sb não apresentou diferença significativa no tamanho da lesão

com relação ao tempo (Figura 15).

Tempo de tratamento (dias)

Controle Glucantime LA8 LA8-Sb

0 20,94 ± 0,67 20,08 ± 1,40 19,58 ± 2,01 19,32 ± 1,15

7 21,50 ± 0,90 20,84 ± 2,04 20,26 ± 0,90 19,42 ± 1,17

14 21,20 ± 0,92 20,86 ± 2,12 20,52 ± 0,98 20,06 ± 1,06

21 20,38 ± 0,25 20,56 ± 2,13 20,66 ± 1,20 20,06 ± 1,29

57

0 7 14 210.0

0.5

1.0

1.5Controle

Glucantime

LA8

LA8-Sb*

** **

Tempo (dias)

Diâ

metr

o m

éd

io (

mm

)

Figura 13 - Diâmetro médio da lesão em função do tempo de tratamento de

camundongos BALB/c tratados com Glucantime (200mg Sb/Kg/IP/24h por 21 dias), LA8-

Sb (51,7mg Sb/kg/12h) e LA8 (mesma concentração de LA8 no complexo LA8-Sb). Os

desvios padrão estão representados por barras verticais. Os asteriscos representam

diferença significativa com relação ao grupo controle (*p < 0,05 e **p<0,01)(n=5).

Controle Glucantime LA8 LA8-Sb0

2.0109

4.0109

6.0109

8.0109

*

*,a

Carg

a p

ara

sit

ári

a

Figura 14 - Avaliação da eficácia da formulação tópica de LA8-Sb em camundongos

infectados com L. amazonensis. Os dados são mostrados como as cargas parasitárias

médias e os desvios padrão determinados após 21 dias de tratamento pela técnica de

LDU. Camundongos BALB/c foram tratados com Glucantime (200mg Sb/Kg/24h por via

IP), LA8-Sb (51,7mg Sb/kg/12h) e LA8 (mesma concentração de LA8 no complexo LA8-

Sb). Grupos marcados com asterisco diferem do grupo controle pelo teste ANOVA (p

<0,001). O grupo marcado com o “a” difere do Glucantime ao nível de significância de

5% (p < 0,05) (n=5).

58

Os imprints das lesões mostraram a presença de macrófagos, em sua

maioria, infectados por Leishmania, e raros linfócitos, neutrófilos e eosinófilos,

além de inúmeras amastigotas extracelulares.

A carga parasitária estimada pela técnica de LDU mostrou uma

significativa diminuição do número de parasitos nos grupos tratados com

Glucantime e LA8-Sb (p < 0,01) com relação ao grupo controle não tratado.

Também foi observada diferença estatística entre os grupos LA8 e LA8-Sb (p <

0,05).

Figura 15 - Avaliação do efeito do tratamento em camundongos BALB/c fêmeas

infectadas com L. (L.) amazonensis. As imagens representam o mesmo animal em cada

grupo.

Dias de

tratamento Controle Glucantime LA8 LA8-Sb

0

7

14

21

59

6.

Dis

cuss

ão e

Co

ncl

usõ

es

60

A quimioterapia ainda constitui o pilar para o controle de doenças que,

como as leishmanioses, não dispõem de vacinas eficazes (Kouni, 2003). As

leishmanioses são consideradas doenças negligenciadas e foram

caracterizadas pela OMS como doença emergente e de difícil controle. A OMS

propõe a erradicação de leishmaniose no mundo até 2015, dentro do plano

global para o combate de doenças tropicais negligenciadas – 2008 – 2015

(WHO, 2011).

O arsenal quimioterapêutico para o tratamento das leishmanioses é

pequeno, sendo os antimoniais pentavalentes as drogas de primeira escolha

para o tratamento. Além da elevada toxicidade dos fármacos de primeira

escolha, as vias de administração são muito desconfortáveis para os pacientes

e em algumas situações são contraindicados. Além disso, a resistência aos

antimoniais, tem se apresentado como um problema na quimioterapia da

doença, sobretudo no estado de Bíhar, na Índia, mas também em outras partes

do mundo (Farault-Gambarelli et al., 1997; Rojas et al., 2006;Sundar et al.,

2001).

Tendo em foco os problemas ressaltados, existem dificuldades que

ainda devem ser consideradas para o desenvolvimento de novos fármacos: o

parasito se localiza dentro de fagolisossomas de macrófagos, o que dificulta a

ação potencial de fármacos. Novas moléculas devem ter baixa toxicidade e

novas estratégias, particularmente na escolha dos alvos e novas vias de

administração, devem ser consideradas.

Como descrito anteriormente, a proposta de estudar o LA8 complexado

com o antimônio pentavalente, faz parte de um estudo mais amplo do Grupo de

Desenvolvimento de Compostos Leishmanicida e do Grupo Interdisciplinar de

Drogas Leishmanicida da UFMG (ICEX/ICB), que nos últimos anos tem

estudado vários compostos complexados ao SbV.

Um estudo realizado por Ferreira (2010) avaliou o coeficiente de partição

óleo/água do complexo LA8-Sb, demonstrando que o seu balanço

hidrofóbico/hidrofílico caracteriza este novo complexo como sendo anfifílico,

sugerindo uma maior facilidade para atravessar membranas e tecidos

biológicos.

A incorporação de antimônio em macrófagos peritoneais de

camundongos BALB/c foi avaliada pela equipe do Laboratório de Biofísica de

61

Sistemas Nanoestruturados/ Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG,

e mostrou que essas células, quando incubadas por 4 horas com o complexo,

foram capazes de incorporar mais antimônio do que quando se utilizou o

Glucantime ou o antimoniato de potássio (KSb(OH)6) na mesma concentração

de Sb (dados não publicados).

Os nossos resultados mostram que o complexo LA8-Sb apresentou uma

elevada toxicidade (CC50=0,26mM de Sb) para macrófagos murinos, cerca de

100 vezes maior que a do Glucantime quando comparada à concentração de

antimônio em ambos os compostos, e 6 vezes mais tóxico que o ligante,

quando comparada à concentração da molécula LA8.

O conjunto desses dados sugere um papel central do SbV na

citotoxicidade do complexo LA8-Sb. Apesar do antimônio pentavalente ser

menos tóxico que a forma trivalente (Berman et al., 1997), ele pode ser

reduzido à sua forma trivalente no organismo (Burguera et al.,1993; Petit,1990).

Acredita-se que a redução pode estar ligada ao metabolismo dos tióis, uma vez

que a glutationa pode promover a redução do SbV a SbIII no antimoniato de N-

metilglucamina (AM), em condições próximas às fisiológicas (Frézard et al.,,

2001).

Com base nos resultados obtidos nos experimentos citados, foi

levantada a hipótese de que o complexo LA8-Sb poderia atuar como uma “pró-

droga”, sendo ativa contra formas amastigotas após a metabolização no tecido.

Os valores encontrados nos testes de citotoxicidade (figura 8) e de

atividade anti-amastigota para o Glucantime (figuras 9 e 11) no presente

estudo, bem como o índice de seletividade encontrado (IS = 6,2) diferem dos

encontrados na literatura. O modelo utilizado neste trabalho foi o sistema de

macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c infectados com formas

promastigotas em fase estacionária de crescimento, sendo internalizadas e

diferenciadas em formas amastigotas. Este modelo foi utilizado por outros

autores, como Sereno & Lemesre, (1997), Morais-Teixeira et al., (2008) e

Pinheiro et al., (2011).

Nesse trabalho obtivemos um valor de CI50 cerca 22 vezes maior que o

encontrado por Morais-Teixeira et al., (2008), quando utilizado um modelo

experimental semelhante. No entanto, foi observado que no trabalho citado as

temperaturas de incubação foram diferentes das utilizadas nesse trabalho, uma

62

vez que nos nossos experimentos, ocorria morte celular da cepa quando

incubadas a 37ºC.

Em resumo, não há um modelo padronizado para os testes de novas

moléculas. Os trabalhos utilizam desde diferentes cepas do parasito, diferentes

formas evolutivas, crescidas em diferentes meios de cultura, além de diferentes

linhagens de macrófagos, o que inviabiliza em muitos casos, a comparação

entre os índices de seletividade encontrados (Gupta, 2011; Borborema et al.,

2011; Callahan et al., 1997; Morais-Teixeira et al., 2008; Torres-Santos et al.,

2004 ; Grecco et al., 2012). Novos modelos têm sido propostos para screening

de novas moléculas, utilizando parasitos transfectados com genes que

expressam proteínas fluorescentes, mas esses modelos ainda não foram bem

estabelecidos e, portanto, pouco difundidos (Pulido, 2012; Siqueira-Neto et al.,

2010; De Muylder et al., 2011).

Além disso, muitos destes trabalhos utilizam formas promastigotas como

modelo de screening (Tahghighi, 2012; Sanchez-Moreno, 2012; Fouladvand,

2011, Tariku, 2011). No entanto, considerando as diferenças entre as formas

evolutivas de Leishmania, principalmente no que tange as diferenças

proteômicas (Leifso, 2007, Brotherton, 2010), o modelo utilizando parasitos

internalizados em macrófagos pode ser considerado uma metodologia

preferencial (Croft, 1986), embora esse seja trabalhoso, caro, não

automatizável, (Gupta, 2011) e que muitas vezes não reflete a atividade in vivo.

Acreditamos que as diferenças encontradas nos valores de

citotoxicidade desse trabalho, podem estar relacionadas com os diferentes

modelos experimentais e protocolos utilizados pelos vários autores.

Nos experimentos de atividade anti-amastigota in vitro, foi observada

ainda, a morte celular dos macrófagos infectados, expostos à concentração de

0,2mM do complexo por 72 horas. Uma dose menor e relativamente próxima,

0,1mM, apresentou uma menor toxicidade, mas foi incapaz de reduzir a

infecção in vitro (figura 8).

Os resultados indicam que o complexo apresenta uma toxicidade

elevada para macrófagos peritoneais murinos, e não apresenta atividade

seletiva contra as formas amastigotas de Leishmania amazonensis, em

concentrações abaixo da sua concentração citotóxica e no tempo de 72 horas.

63

Com relação ao estudo da atividade in vivo, foi observada diminuição do

diâmetro médio da lesão dos camundongos tratados com o Glucantime IP, a

partir do 14º dia de tratamento e do complexo LA8-Sb no 21º dia de tratamento

(figuras 13 e 15). Por outro lado, não foi observada redução do tamanho da

lesão dos camundongos experimentalmente infectados e tratados com o ligante

LA8, quando comparados com o grupo controle. Não houve indícios de

toxicidade sistêmica durante os tratamentos, quando se utilizou como

parâmetro o peso médio dos camundongos tratados (tabela 4).

A carga parasitária dos camundongos, avaliada pelo método de LDU

(Stauber, 1956), mostrou que houve uma redução significativa no número de

parasitos do grupo tratado com o Glucantime e LA8-Sb, quando comparado

como grupo controle (figura 14). Esses resultados associados com os obtidos

na avaliação do tamanho da lesão, sugerem que a formulação tópica de LA8-

Sb apresenta uma atividade anti-Leishmania in vivo, tal como demonstrado nos

ensaios realizados previamente por via oral.

No presente trabalho, investigamos também a permeação percutânea in

vitro de antimônio a partir da formulação tópica de LA8-Sb, que foi comparada

àquela do antimoniato de meglumina hidrofílico incorporado em gel de natrosol

(Nat-AM). A formulação LA8-Sb promoveu uma taxa de permeação

significativamente menor que o Nat-AM, tanto na presença quanto na ausência

de estrato córneo.

Vale ressaltar que a pele sem estrato córneo representa uma condição

fisiopatológica mais próxima àquela de uma lesão cutânea causada por

Leishmania amazonensis. Nessa condição, a menor taxa de permeação

percutânea de antimônio a partir da formulação LA8-Sb indica uma liberação

mais sustentada do metal, podendo contribuir a uma ação mais prolongada.

O fato da permeação do LA8-Sb estar significativamente aumentada

após retirada do estrato córneo sugere também a retenção do complexo no

estrato córneo quando a formulação é aplicada em pele intata. As propriedades

de barreira do estrato córneo são atribuídas à composição dos lipídeos

presentes, ao arranjo estrutural desta matriz intercelular e ao envelope lipídico

que circunda as células (Moser et al., 2001). A maior retenção do complexo

LA8-Sb no estrato córneo poderia ser explicada por uma interação do

64

complexo com alguns dos constituintes dessa barreira. Entretanto, outras

formulações contendo o complexo podem potencializar a absorção de Sb.

A observação do aumento de permeação percutânea de antimônio a partir do

Nat-AM, após retirada do estrato córneo, está de acordo com os resultados de

Martins et al (2006) que avaliaram a absorção percutânea de AM complexado

ou não à -ciclodextrina (-CO),

Um estudo realizado pela equipe do Laboratório de Biofísica de

Sistemas Nanoestruturados/ Departamento de Fisiologia e Biofísica da UFMG,

avaliou a atividade in vivo de LA8-Sb contra Leishmania infantum (cepa BH46),

em camundongos BALB/c fêmeas tratadas por via oral na dose de 200mg

Sb/Kg/12h. Neste estudo, foi observada uma diminuição da carga parasitária

no fígado. Observou-se em um estudo concomitante que uma dose oral de 600

mM do ligante, duas vezes ao dia, foi letal para 50% dos camundongos em 10

dias de tratamento (dados não publicados).

Foi mostrado ainda que o complexo facilita a absorção de antimônio

quando administrado por via oral a camundongos swiss, permitindo uma

absorção até nove vezes maior de Sb, quando comparado à absorção pela

administração oral de AM (Ferreira, 2010).

Os resultados obtidos nesse experimento e nos demais trabalhos dos

grupos de pesquisa reforçam a hipótese de que o LA8-Sb possa atuar como

uma “pró-droga”, sendo ativa após uma metabolização no organismo. Isso

explicaria a diferença entre sua atividade in vitro e in vivo. Novos testes foram

conduzidos para avaliação dessa hipótese.

Como perspectivas para novos ensaios, o grupo pretende testar

novamente a formulação utilizando métodos moleculares para quantificação

mais precisa da carga parasitária, além de um acompanhamento dos animais

tratados após um período de tratamento.

Apesar do tratamento por via tópica com a formulação do complexo LA8-

Sb ter mostrado uma atividade anti-leishmania e uma discreta diminuição do

crescimento da lesão, novos estudos são necessários para melhor avaliação

do complexo, sendo proposta avaliação de novas formulações..

Estudos recentes têm mostrado o potencial terapêutico de associações de

fármacos com eficácia já comprovada. Esses estudos mostraram que as

associações podem acelerar a resolução das lesões e potencializar a eficácia

65

do tratamento diminuindo suas doses e consequentemente sua toxicidade

(Aguiar et al., 2009; Da Silva et al., 2012). Pretende-se também testar as

possíveis associações do complexo com tratamentos convencionais,

diminuindo assim as doses e a toxicidade do tratamento como um todo.

O presente estudo permite concluir que o complexo anfifílico de

antimônio LA8-Sb apresenta atividade anti-leishmania após aplicação tópica

em modelo murino de leishmaniose cutânea causada por L. amazonensis,

apesar da aparente ineficácia em modelo in vitro de macrófagos infectados.

Novos estudos são necessários para elucidação do modo de atuação da nova

formulação bem como sua otimização.

66

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An

exos

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Anexo 1