Haemophihcs influenzae...
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昭 和56年9月10日595
原 著
Ampicillin耐 性 Haemophihcs influenzae の迅速判定法の検討
千葉大学医学部小児科学教室
黒 崎 知 道 中村 明 上 原 す ゞ子
寺 島 周 沖 本 由理
(昭和56年3月23日 受付)
(昭和56年5月12日 受理)
Key words: Ampicillin-resistant Haemophilus influenzae, Rapid 13-lactamase test
要 旨
1973年 末 よ り,欧 米 に てAmpicillin耐 性 Haemophilus inftuenzae (以下ABPC耐 性 H. influenzae) 感染症
が 出現 し,治 療上問題 となつてい る.近 年我 が国で もABPC耐 性H. influenzae が 分離 され,今 後本菌 に よ
る全身感染症の増 加が予測 され る.そ の際, 簡 単 で迅 速 に β-lactamase 産生の有無を判定する方法が必要で
ある.臨 床分離 された H. influenzae 94株 につ いて, iodometric method を 応用 したRosenblattら の 方 法 に
準 じたslidetestと,cephalosporin87/312を 用 い た chromogenic method に て,β-lactamase産 生 の有 無 を
検討 し.ABPCに 対す る最小発育阻止濃度 (以下MIC)と 比較 し,合 わせてABPCの 他4種 類 の 抗 生剤 の
MICも 測 定 した. slide test, cephalosporin 87/312に て,β-lactamase産 生 が認 め られ た の は21株 で,2つ の
方法 とも陽性 であつ た.ABPCのMICは, β-lactamase産 生株 で1.56μg/ml以 上 で あ り,非 産 生株 で は0.78
μg/ml以 下 で あ り,rapidβ-lactamase testの 信 頼 性 を 確認 した.β-lactamase 産 生 株 のMICは,PIPC3.13~
12.5μg/mlに てABPCと 交 叉耐 性 を示 した が, CP 0.39~0.78μg/ml, MINO 0.2~0.78μg/ml, 6059-S 0.05
~0.1μg/mlと 感 性 で あ り,抗 菌 力 は6059-S>MINO>CP>PIPCの 順 で あ つ た.
緒 言
H. infiuenzaeは,下 気道感染症の主要原因1菌で
あ るが,小 児 化 膿 性 髄 膜 炎,特 に3ヵ 月 以降3歳
未 満 の主 要 原因 菌 で も あ る.1973年 以 降,欧 米 を
中 心 にABPC耐 性H.influenzaeに よ る 全 身 感
染 症 が 出現 し,治 療 上 問 題 となつ て い る1).し か
し,H.influenzaeのABPC感 受 性 は培 地,接 種
菌量 な どで 著 し く 影 響 を うけ2)3),デ ィ ス ク法 の
み で は 耐 性 菌 と 断定 して は な らな い とされ て い
る.か とい つ て,日 常検 査 に てMIC測 定 を 施 行
す る こ と も困 難 で あ る.稀 に,β-lactamase非 産
生 性ABPC耐 性H.influenzaeが あ るが4)5),大
部分 のABPC耐 性H.influenzaeで は,β-lactam-
aseを 産 生 す るた め6),産 生 能 を 簡 便 で 迅 速 に 判
定 す る 方法 は 日常 検 査 に 有 用 で あ る.今 回,我
々は,iodometric methodを 応 用 したrapidslide
test7)と,cephalosporin87/3128)を 用 い たchro-
mogenic methodに て,β-lactamase産 生 の有 無
を 判 定 し,ABPCに 対 す るMICと 比 較 検 討 し
た の で報 告 す る.
方 法
1.被 験 株
1979年8月 か ら1980年2月 まで に,千 葉 大 学 小
児 科 お よび 関 連 病 院 小 児 科 で 分 離 され たH.infl-
uenzaeと,1975年 以 来,上 記 期 間 まで に 検 討 して
ABPCに 低 感 受 性 で あつ た 株,計94株 で あ る.
同 定 は,グ ラ ム 陰 性 短 桿 菌 で,発 育 にX因 子,別刷請求 先:(〒280)千 葉市亥鼻1-8-1
千葉大学医学部小児科 黒崎 知道
596 感染症学雑 誌 第55巻 第9号
V因 子 の 両 因 子 を 必 要 と し,porphyrintest陰 性
の 菌 と し た.菌 株 は,チ ョ コ レ ー ト培 地 に 純 培 養
し,5%ブ ド ウ 糖 加3%ス キ ム ミル ク(pH7-4)
に 入 れ,-70℃ に 凍 結 保 存 して お い た も の で あ
る.
2.Rapid β-lactamase test
1) Rapid slide test (iodometric method)7)
Rosenblattら の 方 法 に 準 じて 行 つ た -ペ ニ シ
リ ン ・ カ リ ウ ム100万 単 位 を 蒸 留 水1mlに 溶 解 し,
0.15mlず つ 分 注 し ,-20℃ に 凍 結 保 存 す る.
ヨ ー ド カ リ1.5gと ヨ ウ 素0.3gを0.1Mリ ン酸 緩
衝 液(pH6.4)100mlで 溶 解 して 作 成 した ヨ ウ素
液 を4℃ に 保 存 す る.上 述 の ペ ニ シ リ ン0.15m】
含 ん だ バ イ ア ル に ヨ ウ 素 液1.1ml混 合 し,ペ ニ
シ リ ン ・ ヨ ウ素 混 合 液 を 作 成 す る.固 型 培 地 上 に
発 育 し た コ ロ ニ ー を1エ ー ゼ と り,ペ ニ シ リ ン ・
ヨ ウ 素 混 合 液 を 滴 下 し た ガ ラ ス 板 上で 混 合 し,た
だ ち に0.4%デ ン プ ン液(DIFCO)を 滴 下 す る.
陰 性 な ら 紫 色 に 変 色 し,陽 性 な ら 白 色 と な る
(Fig.1).
最 終 決 定 は,β-lactamase微 産 生 株 を 検 出 す る
た め に5分 後 に 行 つ た.
2)cephalosporin 87/312 (Glaxo)(chromogenic
method)8)
cephalosporin 87/312は,β-lactamaseに 基 質 と
し て 作 用 す る.こ のcePhalosporinは, β-lacta-
maseに よ り,β-lactam環 が 開 裂 す る と 最 大 吸
光 度 が386nmか ら482nmに 変 化 し,こ の 結 果,
黄 色 か ら 赤 色 へ と 変 色 す る.今 回,我 々 は5%
馬 消 化 血 液 を 加 え た ト リ ブ ト ソ イ ブ イ ヨ ン(栄
研)で18時 間 培 養 し た 菌 液50μlとcephalosporin
87/312液50μlをmicroplateに て 混 合 し,30分
後 に 判 定 した(Fig.2),
3.抗 生 物 質 感 受 性 試 験
1)培 地
感 受 性 測 定 に は,荒 井 ら の 方 法9)に 従 つ て 作 成
し た 馬 消 化 血 液 を5%加 え たHeart infusion agar
(栄 研)を 用 い,増 菌 に は,5%ウ マ 消 化 血 液 加
ト リ プ ト ソイ ブ イ ヨ ン(栄 研)を 使 用 した.
2)使 用 抗 生 物 質
Fig. 1 Slide test for, e-lactamase production .
White colour on left shows /3-lactamase positive re-
action, whereas purple colour on right indicates a
negative result.
Fig. 2 Broth method utilizing the cephalosporin
87/312 (Glaxo) for detection of /3-lactamase pro-
ducing strains of H. influenzae. A colour change
from yellow to red occured in wells containing
ƒÀ-lactamase producing strains . Wells containing
no bacteria (two wells in right bottom) and non
ƒÀ-lactamase producing strains remained yellow .
Ampicillin (ABPC), Piperacillin (PIPC), Chl-
oramphenicol (CP), Minocycline (MINO), 6059-
S
3)MIC測 定
5%ウ マ消 化 血 液 加 トリブ トソ イ ブ イ ヨ ンに て
18時 間 増 菌 した 菌 液 を 生 食 水 に て106CFU/mlに
調 整 し,ミ ク ロプ ラ ンタ ーを 用 い て抗 生物 質 加 固
型 培 地 に5μlず つ 接 種 し,37℃,20時 間 培 養 後,
MICを 判 定 した .
昭 和56年9.月10日597
Table 1 Distribution of MICs against H. influenzae (76 strains)
Mlc in μg/ml
4.血 清 型別
Bacto-H.influenzae antisera (DIFCO)を 用 い,
ス ライ ドグ ラス上 の 凝 集 に よ り 血 清 型 別 を 行 つ
た.
結 果
1.薬 剤 感 受 性
MIC測 定 を行 つ たH.influenzae94株 の うち,
同 一 症例 か ら の 同一 感 受 性 の 菌 で,臨 床 経 過
よ りone episodeと 考 え られ る 菌 に つ い て は,
1株 のみ を 集 計 に入 れ て,76株 のMIC分 布 を
Table1に 示 した.ABPC, PIPC, CP, MINOお
よび6059-Sの5剤 中,本 菌 が最 も良好 な感 受 性 を
示 した の は6059-Sで あ り,106CFU/ml接 種 に て
0.1μg/ml以 下 のMICを 示 した も のが,実 に96
%に 達 し,低 感受 性 の もの で も0.39μg/mlで あ
つ た.ABPCは0.39~0.78μg/mlセ こ ピー クを 示
した が,25μg/mlと 低 感 受 性 の株 もみ られ,2峰
性 を示 した.PIPCに 関 して は,0.2μg/ml以 下 と
1.56~12.5μg/mlに ピ ー クが あ り,ABPCと 同様
に2峰 性 を 示 した.CPに 関 して も,0.39~0.78
μg/mlと6.25~12.5μg/mlと2峰 性 を 示 した.
MINOに 関 して は,12.5μg/mlと1株 のみ が 低
感受 性 を示 した が,そ の他 は0.2~0.78μg/mlに
分 布 して い た.
2.β-lactamase産 生 能
前 述 の2つ の 方 法 に て施 行 し,そ の結 果 をTa-
ble2に 示 した.ABPCのMICO.78μg/ml以
下 の73株 は,す べ てiodometric methodお よび
chromogenicmethod両 法 と もに 陰性 で あ り,1.56
Table 2 Correlation between tests for detection
of PC-ase and agar dilution susceptibility to
ampicillin
MIC*: minimum inhibitory concentration in
μg/mI
μg/ml以 上 の21株 は す べ て 陽 性 で あ り,こ れ ら
を耐 性 菌 とした.
3.ABPC耐 性 菌 の検 討
1976年,慢 性 気 管 支 炎 の症 例 を筆 頭 に現 在 まで
12例 よ り分 離 され て い る(Table3).こ れ らの株
のMICをTable4に,そ の集 積 率 をFig.3に
示 す.PC剤 で あ るPIPCに は,ABPCと 交 叉
Fig. 3 Cumulative percentage of 14 ampicillin-resistant strains of H. influenzae inhibited by 5antibiotics.
598 感 染症学雑 誌 第55巻 第9号
Table 3 Clinical diagnosis and bacteriological findings of Ampicillin-resistant H. in fluenzae
n.t*: non-typable N-P** : Nasopharynx
Table 4 MICs of 5 antibiotics against 1e-lactamase producing strains of H. influenzae
MIC in μg/ml
昭和56年9月10日599
耐 性 を 示 す が,CP,MINO,6059-Sに 関 して は
低 感受 性株 は認 め られず,多 剤 耐 性 と考 え られ る
菌 は分 離 され て い な い.血 清 型 別 は,化 膿 性 関 節
炎 の症 例 の 関 節炎,血 液,鼻 咽 腔,お よび扁 桃 周
囲 膿 瘍 の 患 児 の 咽頭 よ り 分 離 され た株 がtypeb
で あ り,慢 性 気 管 支 炎 の症例(A.I.,M.N.)の 増
悪 期 に 分 離 され た 株 が,typeaお よびtypecで
あ った が,こ れ らの 株 以外 の株 で は す べ てnon-
typableで あつ た.
考 案
H.influenzaeは,下 気 道 感 染 症 の主 要 原 因 菌 で
あ るが,特 に3ヵ 月以 降,3歳 未 満 の小 児 化 膿 性
髄 膜 炎 の 主要 原 因菌 で あ る.小 林 ら10)は,本 邦 に
お け る13年 間 の小 児 化 膿 性 髄 膜 炎 の動 向 を各 機 関
に報 告 を 依 頼 し て 集 計 し,Haemphilusに よ る髄
膜 炎 は1972年 以 降 著 明 な 増 加傾 向 を 示 して い る
と述 べ,上 原 ら11)は,気 道 由来 のH.influenzae
で,ABPC耐 性 株 が1979年 よ り 増 加 傾 向 に あ る
と述 べ て い る.Syriopoulourら12)は,type bと
non-bのABPC耐 性 率,お よび 鼻 咽 腔 保 菌 者 よ
り分 離 され た 株 と,髄 液,血 液,耳 漏 の 病 巣 由 来
株 のABPC耐 性 率 は 類 似 して お り,ABPC耐 性
菌 に よ る 疾 患 と,ABPC耐 性H.influenzaeの 咽
頭 保 菌 とに関 連 が あ る こ とを 示 唆 して い る.以 上
よ り考 え る と,今 後,我 国 で もABPC耐 性E
influmzaeに よ る 全 身 感 染 症 が 増 加 す る も の と思
わ れ る.こ の よ うな 状 況 下,本 邦 で も1979年5
月,千 葉 市 立 病 院 に て2歳 男 児 の 化 膿 性 関 節
炎13),続 い て1979年9月 か ら11月 に か け て 国 立 岡
山 病 院 に お い て 化 膿 性髄 膜 炎3例14)の 計4例 の
ABPC耐 性H.influenzaeの 全 身 感 染 症 が 出現 し
て い る.Commitee on Infectious Diseasesで は1),
H.influenzae type bの 全 身 感 染 症 が 疑 わ れ た な
ら,非 経 口PC剤 とCPの 併 用 を勧 め て い るが,
CPの 血 液毒 性 を考 え る と,CPは 理 想 的 な 抗 生
剤 で は な い.抗 生 剤 感受 性 の結 果 は,培 養 後2~
3日 経 過 しな い と 得 られ な い し,ま た 本 菌 の感
受 性 は接 種 菌 量,お よび 培 地 に て 著 しい 影 響 を
うけ,デ ィス ク法 で 耐 性 を 示 して も 再 試 験 で 感
性 を示 す こ ともあ り,臨 床 の場 に お いて 使 用 薬 剤
の決 定 に 苦 慮 す る こ とが 多 々あ る.へBPC耐 性
H.influenzaeは,ほ とん どす べ て β-lactamaseを
産 生 す る の で,β-lactamase産 生 能 の検 出 のた め
の迅 速 か つ 信 頼 し うる 方 法 は,ABPC耐 性 株 を
予 測 す るの に 有用 で あ る.
この 期 待 を担 う方法 と して,rapidβ-lactamase
test15)が あ る.rapidβ-lactamase testの 利 点 と
して は,固 型 培 地 上 に 発 育 す るや 否 や 即 行 うこ
とが 可 能 で あ り,髄 膜 炎,膿 胸 等,純 培 養 状 に分
離 され る場 合 に は,一 夜 でABPC耐 性 か 否 か 判
定 可 能 で あ り,他 の方 法 よ りは 少 な くと も24時 間
早 く耐 性 に 関す る情 報 が 得 られ,適 合抗 生 剤 を
早 期 に 使 用 し うる こ とで あ る.rapid β-lactamase
testと して,acidometric method, iodometric me-
thod,chromogenic methodが あ るが,H.fnfluen-
zaeの β-lactamase産 生 能 の 判 定 に,cephalo-
sporin87/312を 基 質 と して 用 い るchromogenic
methodは,acidometric methodやiodometric
methodと 比 較 してbufferやpHの 調 節 が そ れ
程 厳 密 で な く,ま た,非 特 異 的 な反 応 もな く,菌
培 養液 や 固 型 培 地 上 の 菌 の β-lactamase活 性 の
迅 速 な 検 出 に信 頼 し うる方法 と され て い る16)17).
しか し,こ のcephalosporin87/3121入 手 困難 で
あ り,ル ー チ ンの検 査 に使 用 で きな い の が 実情 で
あ る.Skinnerら17)は,phenol redを 用 いたaci-
dometric methodの 方 が,iodometric methodよ
りも時 間 が か か らず 簡 便 で あ る と述 べ て い るが,
基 質 と して 用 い るPC剤 の量 に 差 が あ り,比 較
す る こ とに 関 し,や や 問 題 が あ る ので は な い か と
考 え る.iodometric methodは ヨー ドとデ ンプ ン
が 反 応 す る と紫 色 に な るが,β-lactamaseが 存 在
す る と,基 質 と して 用 い るPC剤 の β-lactam環
が 開 裂 し,ペ ニ シ ロ酸 と な る.こ の ペ ニ シ ロ酸
は ヨー ドと 結 合 しや す く,容 易 にペ ニ シ ロ酸 ・
ヨー ド結 合 物 が で き,デ ン プ ンを 作 用 させ て も
反 応 せ ず,白 色 の ま まで あ る といつ た 原 理 を
応 用 して い る.こ のiodometric methodを 用 い
たRosenblattら の方 法 は,我 々 の検 討 で はaci-
dometric methodほ どpH調 整 が 厳 密 で な く簡
便 で あ り,ABPCのMIC,お よびchromogenic
600 感染症学雑誌 第55巻 第9号
methodの 結 果 と も一 致 し,時 間 も5分 以 内 で判
定 で き,信 頼 し うる方 法 で あ る.さ らに,変 色が
鋭 敏 で あ り,試 薬 の入 手 も容 易 な こ とか ら考 え る
と,日 常 検 査 室 で のル ーチ ンの検 査 に適 して い る
と 考 え られ る.し か し,Rosenblattら は 白金 耳
に とる 菌 量 が 少 な い と β-lactamase産 生 株 で も
変 色 せ ず,False-negativeに な る可 能 性 が あ り,
細 菌 を1エ ー ゼ 充 分 に とる 必 要 が あ る と 述 べ て
い る.我 々の 検 討 で も,菌 量 が 少 な い とFalse-
negativeに な り,1エ ー ゼ 充 分 に とる 必 要 が あ
る.と こ ろで,ABPC耐 性H.influeuaeに は,β-
lactamase非 産 生 株 も稀 に あ り,β-lactamase産
生 が 示 され れ ば,そ の菌 株 は 耐性 とみ な し,非 産
生 株 で あ れ ばMICに よ る最 終 判 定 を行 わ な け れ
ば な らな い とい うこ とを胆 に命 じて お くべ き で あ
る.一 定 のA8PCを 含 ん だ 培 地 にH.infzueuae
を接 種 し,そ の発 育 した コ ロニ ー数 の比 率 に よつ
てABPC耐 性 か否 か を決 定 す る方 法18)や,broth
dilution methodを 簡 便 化 したMICの 測 定 法19)
も報 告 され て い るが 一般 的 では な い.
抗 菌 力 に 関 して,最 近 新 薬 の 開発 が 目覚 しい
が,こ の 中 でEinfluenzae,こ とに β-lactamase産
生 性 のH.influenzaeに 対 して抗 菌 力 がす ぐれ 期 待
し うる抗 生 剤 の報 告 が み られ て い る20).こ の 中 で
今 回 我 々が 検 討 した6059-Sは,in vitroに て 良好
な感 受 性 を示 して お り,髄 液 移 行 も良好 で あ る こ
と よ り,期 待 し うる抗 生 剤 と して 今 後 の検 討 が 待
た れ る.
結 語
1.rapidβ-lactamase testと して,iodometric
methodを 応 用 したslide test(Rosehblatt,1978)
と,cephalosporin 87/312を 用 いたchromogenic
methodをH.influenzaeに 応 用 した .両 方 法 に
よ る β-lactamase産 生 性 の有 無 は完 全 に 一 致 し,
H.influenzaeに 対 す るABPCのMICと 相 関(陽
性株 はMIC1.56μg/ml以 上)し,A8PC耐 性
H.influenzaeの 早 期 判 定 に 信 頼 性 が あ り,日 常 検
査 に適 して い る.
2. ABPC耐 性H.influenzaeに 対 して,6059-S
は,MIC0.1μg/ml以 下 で 良 好 な 抗菌 力 を有 して
い た.
稿 を 終 るにあた り,御 校閲 いただ きました 千葉大学
小児科,中 島博徳教授 に深謝 いた します.
文 献
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Evaluation of Two Rapid Tests for Detecting Ampicillin-Resistant Strains of
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Tomomichi KUROSAKI, Akira NAKAMURA, Suzuko UEHARA, Itaru TERASHIMA &
Yuri OKIMOTO
Department of Peidatrics, Chiba University, School of medicine
In 1979, systemic infections due to ampicillin-resistant H.influenzae were reported in Japan. Rapid detec-
tion of ampicillin resistance would be fascilitate to initiate adequate chemotherapy. A total of 94 strains of
H.influenzae isolated from clinical specimens out of children were tested with repid slide test, a modification of
iodometric method (according to Rosenblatt, 1978), and chromogenic method using Glaxo compound 87/312,
for detection of beta-lactamase.
The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by an agar dilution method. The inoculum
size was approximately 106 CFU/ml. The results of rapid beta-lactamase tests were compared with an am-
picillin MIC.
Twenty-one strains of H.influenzae were proved to be beta-lactamase positive by both methods. These
strains showed ampicillin MICs of •†1.56pg/ml. Seventy-three strains were negative beta-lactamase tests, which
presented ampicillin MIC, of •…0.78,ug/ml.
The 21 ampicillin-resistant strains were readily distinguished from 73 sensitive strains. Rapid beta-
lactamase tests were confirmed to be reliable indicators of ampicillin-resistant H.influenzae. These methods for
rapid beta-lactamase detection can be applied in routine laboratory examinations.