I-2 -Mioglobina_Doseamento_Cálculos_grupo1_PL2

I-2. Mioglobina: Extracção, purificação e

doseamento de proteína

Bioquímica Experimental II, PL2, 2011/2012, Grupo 1:

Alexandra Salvado 40267, Ana Lamy 40279, Andreia Sousa 40261 e Telmo Paiva 40243

Professora: Luísa Serralheiro

Objectivo

DQB-Licenciatura em Bioquímica 2

• Doseamento da quantidade total de proteína na carne.

Resumo


Amostra de carne

Técnica utilizadas

Centrifugação diferencial

Filtração – sobrenadante

Cromatografia de Exclusão Molecular

Método de Lowry Doseamento

Resultados:

• Rendimento do processo: 88% (G1: redução) e 64% (G3: oxidação);

• % proteína total na carne: 3,3% (G1) e 3,2% (G3) – concordantes

Mioglobina


• Proteína globular

• Armazenamento de O2

• Possui um grupo hémico (protoporfirina IX de ferro) ligado através

de resíduos de histina

• Apresenta duas formas estáveis e bastante comuns:

Oxi-mioglobina

( Fe2+ – O2 – Mb) Met-mioglobina

( Fe3+ – H2O – Mb)

Figura 1 – Met-mioglobina e oxi-mioglobina

Bylkas, S.A. & Anderson, L.A.

Procedimento


Centrifugação

5 000 RPM

(60 minutos)

Filtração

Filtração em Gel

Doseamento pelo

Método de Lowry

Quantidade total de Mb na carne

6

1. Preparação de uma série de soluções padrão

G1: [Sol.BSA] = 0,62 mg/mL G3: [Sol.BSA] = 0,50 mg/mL

VTOTAL= 2,4 mL Abs750nm Volumes

crescentes

Cálculo das concentrações padrão:

Ex.: Grupo 1 Tubo 2

Método de Lowry

DQB-Licenciatura em Bioquímica

Reagente C: 2,000 mL

Reagente D: 0,200 mL


7

Padrões para a recta de calibração



8 DQB-Licenciatura em Bioquímica


9

2. Tubos 10 a 15:

11

10

12

14

13

15

Met-Mb/ Oxi-Mb

Doseamento

Mb (sobrenadante)

Quantidade na carne

Abs750 nm

G1: 11, 12, 15

G3: 12, 15


Quantidade de Met-Mb na carne

10

3. [Met-Mb] – Tubo 11:

Grupo 1

cf

2,4 mL cuvette

Vi = 0,125 mL

Diluição em H2O

1/10

2 mL

1 mL

1 mL

Ferricianeto +

Sobrenadante (V=20 mL)

4 mL

Cor castanha

Centrifugação

(carne + tampão) = 20 mL

mcarne = 12,16 g



11

Ex.: Cálculos para o Tubo 11

Cuvette:

Em 0,125 mL:

Em 1 mL (com factor de diluição 1:10):

Diluição:

Fracções recolhidas:



12

Coluna:

No tampão inicial tinha-se:

Sobrenadante:

Massa de proteína total

no tubo 11

Concentração mássica:


M (Mb) ≈ M (Met-Mb) ≈ M (Oxi-Mb) ≈ 16900 g mol-1


Concentração molar:



4. Tubo 15

Grupo 1

Sobrenadante

Centrifugação

(carne + tampão) = 20 mL

mcarne = 12,16 g


cf

2,4 mL cuvette

Vi = 0,050 mL

1 mL

Diluição em H2O

1/10

V = 20 mL


15

Ex.: Cálculos para o Tubo 15


Cuvette:

Em 1 mL (com factor de diluição de 1:10):

Em 0,050 mL em 10 mL (diluição):


16

20 mL Tampão


mcarne = 12,16 g

Sobrenadante:

Tampão:

M (Mb) = 16900 g mol-1

1,18 × 10-3 mol L-1


17

Comparação das concentrações entre Met-Mb/Oxi-Mb e Mb


Rendimento da oxidação (G1):

% Proteína total na carne (G1):



Comparação entre os rendimentos e a quantidade total de Mb na carne

Valores em

concordância • Perdas na coluna cromatográfica

• Empacotamento deficiente

• Distribuição por outras fracções

• A proteína pode não ter sido toda oxidada ou reduzida

Conclusões

19

A partir do resultados experimentais, pode-se inferir que:

• A percentagem de proteína total na amostra de carne era cerca de

3%.

Aspectos a melhorar:

• Aumentar o tamanho da coluna cromatográfica;

• Medição mais rigorosa dos volumes das fracções colectadas;

•Ter o cuidado de manter cada fracção colectada em gelo;

• Aumentar o número de ensaios.

Referências


• Bylkas, S.A. & Anderson, L.A. (1997) Microburger biochemistry: extraction and

spectral characterization of myoglobin from hamburger. J. Chem. Ed., 74, 426-430.

• Voet, O.H., Voet, J.G. (1995). Biochemistry. 2ª ed. John Wiley & Sons, Nova Iorque.

• http://www.imb-jena.de/ImgLibDoc/ftir/IMAGE_FTIR.html, consultado a 2 de Março

de 2012.

• http://pucrs.campus2.br/~thompson/Roca107.pdfm, consultado a 1 de Março de

2012.

• http://repositorio.ul.pt/bitstream/10451/1299/9/19332_ulfc091258_tm_9_CAPITULO_

1.pdf, consultado a 1 de Março de 2012.

• http://pfbrandt.faculty.noctrl.edu/teaching/CHM205/lab/7_burger.pdf, consultado a 12

de Março de 2012.

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