Introdução:

• Aproximadamente um terço da população mundial está infectada por M. tuberculosis.

• 9 milhões de novos casos por ano.• 1,8 milhões de mortes por ano.

• Por que a procura de antígenos novos são importantes?

• Produção de reagentes para diagnóstico e novas vacinas.

Introdução:

PPD

• O genoma do M. tuberculosis possui 16 regiões do genoma deletadas em outras Mycobactérias (utilizadas para BCG, por exemplo)

Introdução:

• Rv3874• Rv3875• Rv3619c

Introdução:

Proteína inteira• In vivo

O que se tinha?

Overlaping (peptídeos sintéticos)• In vitro (ativação de linfócitos T)

O que foi feito:

Clonagem:Amplificação: PCR• DNA M. tuberculosis• Iniciadores• dNTPs• Enzima + Tampão

Purificação

Ligação

Ligação: vetor de clonagem univeral

Transformação: Choque térmico

• Eletroporação

• Genegun

• Vírus

Outras técnicas de transformação:

Seleção das culturas: Ampicilina

• Bioluminescência • Azul/branco

Outras técnicas de seleção:

Restrição enzimática: BamHI e Hind III

Ligação no vetor de expressão:

Inseriram a sequencia para cauda de histidina no pGEX

Vantagem: duplo sistema de purificação

• Transformação: Choque térmico

• Seleção das colônias

• SequenciamentoExpressão:

IPTG

Purificação:

• Resina, para retirar a GST +• Coluna de Ni, para retirar a cauda de Histidina

Purificação:

Western Blotting:Anticorpo: anti- GST

Anticorpo: anti- His

Imunização:

• Rv3874• Rv3875• Rv3619c

+

• Adjuvante de Freud• 2 apresentações com 2 semanas de

intervalo • Após 2 semanas retira-se o soro

Elisa:

Resposta Imune celular:

Linfócito B

Epítopos lineares:

Proteínas também geraram epítopos lineares, assim como os peptídeos, na imunização

ABCPred Predition server

• O vetor construído e a dupla purificação são eficientes

• As proteínas são imunogênicas nos coelhos

Conclusões:

Questionamento:

• Qual a vantagem da produção da proteína recombinante para a resposta imune em coelhos?