Marcadores Moleculares em Equinos

Universidade Federal de Pelotas

CDTec - Graduação em Biotecnologia

Disciplina de Biotecnologia Animal

Julho, 2013

Priscila M. M. de Leon Dra., Médica Veterinária

PNDP Biotecnologia/UFPel

Criação de Cavalos

• Finalidades:

Esporte

Trabalho no campo

Comercial

Hobby

Trabalho no campo

Esportes Equestres

Shire

Lusitano Andaluz Árabe

PSI

Raças de Equinos:

Crioulo

Marcadores Moleculares em Equinos

• Cavalos são valorizados como indivíduos;

• Selecionados de acordo a performance → fatores fisiológicos e

reprodutivos são prejudicados.

Marcadores Moleculares em Equinos

Biomarcadores aplicados à Reprodução

Biomarcadores aplicados à clínica e características morfológicas

Biomarcadores de performance esportiva

orfologia

Possibilidade de análises moleculares e estudo de genes candidatos a Biomarcadores para características específicas (clínica, morfologia, esporte e reprodução);

Genoma Equino - 1 milhão de SNPs

Banco de dados - SNPs por cromossomos

http://www.broadinstitute.org/mammals/horse/snp

http://www.uky.edu/Ag/Horsemap/welcome.html

Projeto Genoma Equino

Marcadores Moleculares na Reprodução Equina

• Biomarcadores na Embriologia (1000 genes participam do

desenvolvimento sexual) → aplicação de Biotécnicas da Reprodução;

• Identificação de Marcadores Moleculares de Viabilidade e Competência

celular → SNP e microssatélites;

• CRISP3 - cysteine-rich secretory protein 3

• uma das principais proteínas do plasma seminal equino;

• SNPs no gene CRISP3 são positivamente relacionadas com a fertilidade;

• SNP (G>A) tem um efeito sobre a fertilidade: garanhões heterozigotos apresentam uma fertilidade reduzida em relação aos homozigotos;

• SPATA 1: Spermatogenesis associated protein 1

• Proteína associada a espermatogênese;

• SNP (BIEC2-968854) foi associado a taxa de prenhes: garanhões heterezigotos apresentaram melhor taxa de prenhes em relação aos homozigotos para este SNP;

• INHBA: inhibin beta A

• Controle da secreção de FSH, controlando a espermatogenese;

• 5 SNPs em garanhões foram associados com taxas de prenhez (regulação do eixo hormonal hipotálamo-hipófise);

• A concentração intratesticular de inibina é um potencial marcador para a detecção precoce de problemas de fertilidade em jovens garanhões;

Objetivo:

Avaliar a expressão de genes relacionados com a apoptose (Bax, Bcl-2, survivin e p53) durante a maturação in vitro de oócitos equinos e comparar a expressão gênica entre oócitos e células do cumulus com diferentes características morfológicas.

Gene expression in equine cumulus oocyte complex

• Coleta e classificação dos COC

Materiais e Métodos:

Fig. 1. A) Oocytes classified as healthy morphological group, G1; B) Oocyte classified as morphological group with some signs of degeneration, G2.

Gene expression in equine cumulus oocyte complex

Materiais e Métodos:

• Cada grupo experimental: pools de 60 oócitos e céls do cumulus correspondentes (4 X)

• Extração RNA → confecção cDNA → qRT-PCR

Gene Acession Number Sequence TM Fragment

size

Efficiency

(%)

Coorelation

(R2)

Bcl-2 Eq XM_001499714.1 F 5’ GAGACCCCCAGTGCCATCAA 3’

57ºC 146 bp 99.9% 0.97 R 5’ GGGATGTCAGGTCGCTGAAT 3’

BaxEq XM_001489207.1 F 5’ TTTGCTTCAGGGTTTCATCC 3’

60ºC 162 bp 100% 0.94 R 5’ ATCCTCTGCAGCTCCATGTT 3’

p53 Eq XM_001918153.1 F 5’ AAAGGATGCCCATGCTACAGAGGA 3’

63ºC 82 bp 90.5% 0.98 R 5’ AGTAGACTGGCCCTTCTTGGTCTT 3’

SurvivinEq XM_001915400.1 F 5’ TTCATCCACTGTCCCACTGA 3’

57ºC 98 bp 70.5% 0.98 R 5’ GTTCCTCTATGGGGTCGTCA 3’

GAPDH NM_001163856.1 F 5’ GCC GTA ACT TCT GTG CTG TG 3’

61ºC 150 bp 84.0% 0.98 R 5’ AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG 3’

Table 1. Primers used in qRT-PCR reaction for equine oocytes.

Gene expression in equine cumulus oocyte complex

Resultados:

• Expressão de Gênica:

Survivin: ↑ mOocG1 que mCumG1 (p <0,02)

P53: ↓ mOocG1 que mCumG1 (p = 0.007)

Objetivo:

Identificar polimorfismo da p53 equina e determinar a frequência dos genótipos em equinos, correlacionando com parâmetros reprodutivos de éguas Puro Sangue Inglês (PSI).

• DNA biobank: 105 éguas PSI (Blood and Tissue Dneasy Kit - Qiagen)

Material e Métodos:

Equine p53 SNP

• Parâmetros Reprodutivos

Número de montas naturais

Diagnóstico positivo de gestação

Nascimento de potro

Aborto

Gestação gemelar

Placentite

Endometrite pós-cobertura

Ciclo anovulatório

Natimortos

• A região alvo da p53 foi amplificada por PCR:

– Primers: forward 5’ TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA 3’

reverse 5’ TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC 3’

– Produto de 199 bp

• Identificação do SNP por PCR-RFLP com enzima BstUI

– Sítio de restrição: CG/CG

• Arg/Arg: fragmentos de 113 bp e 86 bp

• Arg/Pro: fragmentos de 199bp, 113 bp e 86 bp

• Pro/Pro: fragmento de 199 bp

Material e Métodos:

Equine p53 SNP

• Identificamos 3 possíveis genótipos da p53 em equinos PSI

Resultados:

Figure 1. A) Amplification of a 199 bp fragment of p53 containing codon 72; B) Restriction fragment length polymorphism demonstrating three possible genotypes: Arg/Pro (A/P) (199, 113 and 86 bp fragments); Arg/Arg (A/A) (113 and 86 bp fragments); and Pro/Pro (P/P) (199 bp fragment).

Equine p53 SNP

% Genotype (n/total)/ Reproductive Parameters

Arg/Arg Arg/Pro Pro/Pro

Mating 1 16.2 (32/198) 59.1 (117/198) 24.7 (49/198)

2 or + 16.2 (11/56) 67.9 (38/56) 12.5 (7/56)

Pregnancy No 10.0 (2/20) 60.0 (12/20) 30.0 (6/20)

Yes 17.5 (41/234) 61.1 (143/234) 21.4 (50/234)

Birth of foal No 14.3 (6/42) 69.0 (29/42) 16.7 (7/42)

Yes 17.5 (37/212) 59.4 (126/212) 23.1(49/212)

Abortion No 17.5 (40/228) 58.3 (133/228) 24.1(55/228)**

Yes 11.5 (3/26) 84.6 (22/26)* 3.8 (1/26)

Twin gestation No 16.1 (38/236) 61.9 (146/236) 22.0 (52/236)

Yes 27.8 (5/18) 50.0 (9/18) 22.2 (4/18)

Endometritis No 16.6 (37/223) 61.4 (137/223) 22.0 (49/223)

Yes 19.4 (6/31) 58.1 (18/31) 22.6 (7/31)

Stillborn No 16.5 (41/248) 60.9 (151/248) 22.6 (56/248)

Yes 33.3 (2/6) 66.7 (4/6) 0 (0/6)

Acyclic No 16.0 (39/243) 61.3 (149/243) 22.6 (55/243)

Yes 36.4 (4/11) 54.5 (6/11) 9.1 (1/11)

Table 1. Distribution of the codon 72 SNP in p53 and association with reproductive variables in thoroughbred mares.

• Estudo da múltipla interação gênica em características complexas;

Potencial na investigação, diagnóstico e tratamento de doenças;

Estratégias para reduzir prevalência de doenças associadas a

alelos, preservando a diversidade genética e condicionamento físico geral;

Teste diagnóstico comercial disponível, facilitando:

– identificação de portadores;

– confirmação do diagnóstico de casos clínicos;

– gestão dos alelos no melhoramento genético da população;

Biomarcadores aplicados à Clínica de equinos

11 mutações identificadas causando 10 síndromes clínicas

Epidermólise Bolhosa Juncional - JEB

• Doença autossômica recessiva dermatológica (humano x equino);

• Inserção de Citosina no gene LAMC2 em ECA5, codificando um stop codon;

• deleção de 6.589 pb nos exons 24-27 do gene LAMA3 no ECA 8;

• O defeito molecular é uma falha na produção de laminina, proteína da membrana basal heterotrimérica que faz a adesão entre as camadas da pele derme e epiderme;

• Características clínicas: áreas de mucosa e tegumento desprovidas de epitélio e com ulcerações graves;

Melanoma

• Acomete cavalos de pelagem tordilha;

• A pelagem tordilha é herdada em um padrão autossômico dominante, com homozigotos mostrando mais rápido e completo branqueamento e maior incidência de melanoma;

• Duplicação do intron 6 do gene syntaxin-17 no ECA 25;

• Metástases: gânglios linfáticos, fígado, pulmão, baço e músculo;

• Programa de melhoramento genético minimizando a geração de homozigotos;

Pelagem Simples

Pelagem Composta

Pelagem Conjugada

http://www.vgl.ucdavis.edu/services/horse.php

• Cavalos Puro Sangue Inglês (PSI) foram selecionados para o

excepcional desempenho de corrida, resultando na adaptação

dos sistemas estruturais e funcionais, contribuindo para a elite

dos fenótipos atléticos;

Biomarcadores aplicados ao Cavalo Atleta

Capacidade atlética do PSI:

• capacidade metabólica aeróbica e anaeróbica;

• Sistemas Cardiovascular e Respiratório:

↑Volume pulmonar; [Hemoglobina]; débito

cardíaco; Densidade Mitocondrial; Glicogênio;

* Genes do Fenótipo Atlético

Biomarcadores de performance:

• Força e composição muscular;

• Metabolismo muscular e tolerância ao exercicio;

• Biogênese mitocondrial;

• Capacidade hemodinâmica e de metabolismo aeróbico;

• Tendão e ligamento;

• Mente e motivação.

• Genes responsáveis pela oxidação de ácidos graxos, o aumento da sensibilidade à insulina e da força muscular:

ACSS1 (acil-CoA sintetase membro da família de cadeia curta 1)

ACTA1 (actina, alfa 1)

ACTN2 (actinina, alfa 2)

ADHFE1 (álcool desidrogenase, contendo ferro, 1)

MTFR1 (regulador fissão mitocondrial 1),

PDK4 (quinase piruvato desidrogenase, isozima 4)

TNC (tenascina C).

Peroxisome proliferator-activated receptor-c coactivator 1a (PGC-1a): fator crítico na adaptação do músculo esquelético ao exercício, agindo através do controle da transcrição de genes de angiogênese, oxidação de ácidos graxos, fosforilação oxidativa, biogênese mitocondrial e tipo de fibra muscular;

Levando ao aumento capacidade oxidativa e maior resistência à fadiga;

Miostatina, codificada pelo gene MSTN, é um membro da superfamília de TGF-b que regula desenvolvimento do músculo esquelético;

• creatine kinase muscle (CKM), cytochrome c oxidase subunit IV isoform 1 (COX4I1), cytochrome c oxidase subunit IV isoform 2 (COX4I2) and pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 (PDK4)

diferentes protocolos de exercícios provocam respostas transcricionais variáveis em genes exercício;

• Vinte novos SNPs foram detectados em 3 genes - ACTN3, CKM e COX4I2;

• No entanto 3 SNPs em CKM e COX4I2 foram significativamente diferentes entre cavalos alta performance e controle (nunca ganhou uma corrida).

Aplicação de Diagnóstico Molecular em Equinos

• Biomarcadores: Performance em Cavalos Atletas; Características

Reprodutivas; Cor da Pelagem; Doenças Hereditárias;

DNA livre fetal (ccffDNA): diagnósticos pré-natal não invasivo;

• ccffDNA: circulating cell-free fetal DNA

– Identificado em mulheres (Lo et al. 1997)

– Alternativa de diagnóstico pré-natal não-invasivo (Finning & Chitty 2008)

– 10% do DNA é fetal na plasma de mulheres gestantes (Lun et al. 2008)

Introdução:

Equine ccffDNA

Equine ccffDNA

Objetivos:

Detecção da presença do ccffDNA no plasma de éguas prenhas através da determinação por amplificação do SRY;

Realizar um estudo de validação pré-desenvolvimento de um teste de laboratório, através de PCR, 2nd-PCR e qPCR;

• População em estudo: – 20 éguas prenhas

– 2 éguas vazias

– 2 éguas virgens

– DNA genômico de 10 fêmeas

– DNA genômico de 10 machos

• Coleta e preparação da amostra: – Sangue venoso é coletado e processado (centrifugações) dentro de 15

mim

• Extração do ccffDNA – 1mL de plasma

– QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) (Akolekar et al., 2010)

Material e Métodos:

Equine ccffDNA

• Sexagem Molecular: – Padronizada com DNA genômico de macho e fêmea

– Sequenciamento

– Detecção do SRY (182 bp)

– Controle com GAPDH (150 bp)

– 10µL como template da reação de PCR

• Controles: – NTC (no-template control )

– Controle negativo (DNA genômico de fêmea)

– Controle positivo (2% de DNA genômico de macho)

* Confirmação do sexo fetal no nascimento

Material e Métodos:

Equine ccffDNA

Resultados:

Equine ccffDNA

Figure 1. Molecular sexing test using equine circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) for SRY amplification: A) Polymerase chain reaction (PCR); B) Second round Polymerase chain reaction (2nd-PCR); C) Quantitative Real Time Polymerase chain reaction (qPCR). M: ccffDNA of male pregnant mare; F: ccffDNA of female pregnant mare; +TC: positive control; -TC: negative control; NTC: non-template control;

Resultados:

Equine ccffDNA

Table 1. Sensitivity of molecular sexing by SRY and GAPDH genes amplification in equine circulating cell-free fetal DNA (ccffDDNA).

Samples SRY PCR % (n/total)

GAPDH PCR % (n/total)

SRY 2nd-PCR* % (n/total)

GAPDH 2nd-PCR % (n/total)

SRY qPCR % (n/total)

GAPDH qPCR % (n/total)

ccffDNA

Male pregnancy 72.7 (8/11)

100 (11/11)

90.9 (10/11)

100 (11/11)

90.9 (10/11)

100 (11/11)

Female pregmancy 0 (0/9)

100 (9/9)

0 (0/9)

100 (9/9)

0 (0/9)

100 (9/9)

Control Genomic DNA

Male 100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

100 (10/10)

Female 0 (0/10)

100 (10/10)

0 (0/10)

100 (10/10)

0 (0/10)

100 (10/10)

Control mares

ccffDNA non-pregnant 0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

ccffDNA virgin 0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

0 (0/2)

100 (2/2)

SRY/PCR: Acurácia 85% (17/20)

SRY/2nd-PCR e qPCR : Acurácia 95% (19/20)

Equine ccffDNA

Conclusões:

• Este é o primeiro estudo demonstrando a presença do ccffDNA no plasma de éguas prenhas;

• Os resultados deste estudo demonstram que é possível a determinação do sexo fetal em éguas utilizando ccffDNA para amplificação do SRY.