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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ MARIA ROSA DMENGEON PEDREIRO Estudo comparativo do efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o sistema de defesa antioxidante em eritrócitos dos peixes antárticos Notothenia rossii (Richardson, 1844) e Notothenia coriiceps (Richardson, 1844) CURITIBA 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
MARIA ROSA DMENGEON PEDREIRO
Estudo comparativo do efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o
sistema de defesa antioxidante em eritrócitos dos peixes antárticos
Notothenia rossii (Richardson, 1844) e Notothenia coriiceps (Richardson,
1844)
CURITIBA 2014
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
Estudo comparativo do efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o
sistema de defesa antioxidante em eritrócitos dos peixes antárticos : Notothenia
rossii (Richardson, 1844) e Notothenia coriiceps (Richardson, 1844)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e Molecular, Setor
de Ciências Biológicas da Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial à obtenção do título
de Mestre em Biologia Celular e Molecular
Orientadora: Drª Lucélia Donatti
CURITIBA
2014
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho, primeiramente a Deus, pois me possibilitou chegar
até aqui.
Aos meus pais Américo e Terezinha que sempre acreditaram que o estudo é o
único caminho para o crescimento e a independência pessoal.
Ao meu amado Adriano que com todo o seu apoio, carinho e paciência, me faz
crer que eu seria capaz de enfrentar todos os obstáculos.
Nada eu teria conseguido sem o amor de vocês!
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AGRADECIMENTOS
Agradeço...
A Deus, pelo dom de minha vida, e por minha profissão pela qual sou
apaixonada.
Aos meus pais, Américo e Terezinha, pois nunca mediram esforços para me
apoiar, e sempre me ajudaram e me encorajaram a enfrentar as dificuldades.
Ao meu noivo Adriano, que esteve sempre ao meu lado, por me ajudar sempre
a ver o lado bom das coisas, mesmo nos momentos mais difíceis. Sem seu
amor e carinho eu não teria conseguido.
Aos meus irmãos Filipe, Fernanda e Camila, que com sua amizade me dão a
certeza de que nunca estarei só.
À Lucélia Donatti, pela orientação, amizade e pelos conselhos valiosos. Devo
muito a você!
Ao Sr. Nino e aos técnicos Alessandra e Israel pela ajuda com o material de
microscopia.
Às amigas do laboratório de Biologia Adaptativa. À Alana pelo incentivo de que
mesmo nos momentos difíceis, tudo se resolverá, à Cintia, pela paciência ao
me ensinar as técnicas utilizadas, à Mariana por ser sempre tão prestativa, à
Pri pelas inúmeras aventuras, à Tânia pela ajuda com a estatística, e que
ajuda! A TODAS pela amizade e por todos os bons momentos! Tenho vocês
em meu coração!
Às agências de fomento, CAPES, CNPq, FAPERJ, INCT‐APA, sem as quais
não seria possível todo o deslocamento logístico necessários neste trabalho.
À marinha do Brasil, por apoio na Expedição Antártica XXIX, na qual os
bioensaios deste trabalho foram desenvolvidos.
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RESUMO
Peixes antárticos são espécies adaptadas ao frio, consideradas
estenotérmicas, sendo seu metabolismo eficiente em baixas temperaturas.
Estudos recentes sobre alterações climáticas relatam que a Península Antártica
apresenta aquecimento acelerado, é extremamente importante entender a
plasticidade metabólica e os mecanismos bioquímicos envolvidos na
aclimatação a altas temperaturas de peixes antárticos para a conservação
destas espécies e do ecossistema Antártico. O presente trabalho teve o
objetivo de analisar o efeito do estresse térmico sobre a morfologia e o sistema
de defesa antioxidante em eritrócitos de Notothenia rossii e Notothenia
coriiceps, expostos durante 1, 3 e 6 dias a 8+0.5°C e a 0+0.5°C. Variações
morfológicas nos eritrócitos e nos níveis de atividade de alguns constituintes
enzimáticos como a glutationa peroxidase (GPx); superóxido dismutase (SOD);
glutationa S-transferase (GST); catalase (CAT); glutationa redutase (GR) e
quantificação do constituinte não enzimático, glutationa reduzida (GSH) e
lipoperoxidação lipídica (LPO), por dosagem de malonaldeído (MDA) foram
analisados. Em N. coriiceps o aumento da temperatura a 8°C não modulou os
níveis de SOD e GPx. Mas modulou negativamente os níveis de CAT em 1
(87% menor em 8°C quando comparado a 0°C) e 3 dias (90% menor em 8°C
quando comparado a 0°C). A GST foi modulada positivamente em 3 dias
(57,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e negativamente em 6 dias
(81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). A GR foi modulada
positivamente em 1 dia ( 69,9% maior em 8°C quando comparado a 0°C) e 3
dias (81% maior em 8°C quando comparado a 0°C). Em Notothenia rossii o
aumento da temperatura não modulou os níveis de GPx e GR. Mas, a SOD foi
modulada positivamente em 6 dias (68% maiores em 8°C quando comparados
a 0°C) e a CAT foi modulada positivamente em 3 dias (97% maiores em 8°C
quando comparados a 0°C) e negativamente em 6 dias (86% menores em 8°C
quando comparados a 0°C). A GST também foi modulada negativamente em 6
dias (81,9% menor em 8°C quando comparados a 0°C). Os níveis de GSH não
foram modulados pela temperatura em ambas as espécies. O níveis de MDA
foram modulado negativamente em 3 dias a 8°C em ambas as espécies e
houve modulação positiva em 1 dia para N. coriiceps pelo aumento da
temperatura. Análises morfológicas dos eritrócitos indicaram que em N.
coriiceps o aquecimento a 8°C determinou o aumento da frequência de
alterações no formato celular, presença de vesículas na membrana plasmática,
núcleo em Blebbed e fissura nuclear. Em N. rossii o estresse térmico
influenciou o aumento da frequência de alterações no formato celular e a
presença de núcleos em Blebbed. A proporção de eritrócitos maduros e
imaturos, a frequência de micronúcleo, o deslocamento celular, volume celular
e nuclear não foram influenciados pelo estresse térmico em ambas as
espécies. Foi possível concluir que, nos nototenideos antárticos, N. rossii e N.
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coriiceps, espécies filogeneticamente muito próximas, os padrões de resposta
frente ao aumento da temperatura ambiental foram diferentes.
Palavras-chaves: eritrócitos, temperatura, estresse oxidativo, anormalidades
celulares.
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ABSTRACT
Antarctic fish are cold-adapted species, considered stenothermal; the metabolism of this fishes is very efficient at low temperatures. Recent studies about climatic changes report accelerated warming in the Antartic Peninsula. For the conservation of Antartic ecosystem and species is extremely important to understand the metabolic plasticity and biochemical mechanisms involved in high temperatures acclimation of Antartic fishes. This study aimed to verify the effect of heat stress on the morphology and the antioxidant defense system in erythrocytes of Notothenia coriiceps and Notothenia rossii, exposed for 1, 3 and 6 days to 8 +0.5 +0.5 ° C and 0 ° C. Morphological changes in erythrocytes and activity levels of some enzymatic constituents like glutathione peroxidase ( GPx ), superoxide dismutase ( SOD ), glutathione S - transferase ( GST ), catalase ( CAT ), glutathione reductase ( GR ) and quantification of non-enzymatic constituent, reduced glutathione ( GSH ) and lipid peroxidation ( LPO ), by measurement of malondialdehyde (MDA) were analyzed. The temperature increase to 8ºC in N.coriiceps do not modulated levels of SOD and GPx, although, negatively modulates the levels of CAT 1 (87 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C) and 3 days (90 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was positively modulated in 3 days (57.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively within 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). The GR was positively modulated at 1 day ( 69.9% 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and 3 days (81 % increase at 8 ° C as compared to 0 ° C). The temperature increase in N. rossii do not modulate GPx levels of GR . However, SOD was positively modulated in 6 days (68 % higher when compared to 8C 0 ° C) and CAT was positively modulated in 3 days (97% at 8 ° C higher in comparison to 0 ° C) and negatively 6 days (86 % lower at 8 ° C as compared to 0 ° C). GST was also negatively modulated in 6 days (81.9 % less than 8 ° C as compared to 0 ° C). Morphological analysis of erythrocytes indicated that in N. coriiceps heating at 8 °C determined the increase frequency of changes in cell format, presence of vesicles in plasma membrane and Blebbed nucleus. Heat stress at 6 days in N. rossii influenced an increase frequency of changes in cell shape and presence of Blebbed nucleus. The proportion of mature and immature erythrocytes, frequency of micronucleus and cell displacement, cell and nuclear volume were not affected by heat stress in both species. In conclusion, N. rossii and N. coriiceps, phylogenetically close Antarctic nototenideos, have different patterns of response due to increased environmental temperature. Keywords: erythrocytes, temperature, oxidative stress, cellular abnormalities.
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LISTA DE FIGURAS Figura 1- Contimente Antártico e Oceano Austral. ........................................................ 15
Figura 2: Espécies estudadas. ....................................................................................... 18
Figura 3: Local de estudo. .............................................................................................. 20
Figura 4: Geração de espécies reativas de oxigênio e danos celulares. ...................... 23
Figura 5: Representação esquemática dos sistemas de defesa antioxidantes. ........... 24
Figura 6: Locais de coleta na Baia do Almirantado – Ilha Rei George. ........................ 27
Figura 7: Coleta dos exemplares de N. coriiceps e N. rossii. ........................................ 28
Figura 8: Módulo de aquário da Estação Antártica Comandante Ferraz. ..................... 28
Figura 9: Desenho esquemático do protocolo experimental. ........................................ 29
Figura 10: Coleta de sangue. ......................................................................................... 30
Figura 11: Níveis de Atividade da superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT)...... 37
Figura 12: Níveis de Atividade da glutationa S-transferase (GST), glutationa redutase
(GR) e glutationa peroxidase (GPx). .............................................................................. 39
Figura 13: Concentração de Glutationa reduzida (GSH) e (MDA). ............................... 41
Figura 14: Morfologia de eritrócitos maduros e alterações morfológicas observadas em
N. coriiceps e N. rossii em microscopia de luz. ............................................................. 46
Figura 15: Alterações morfológicas em eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii
observadas em microscopia de luz. ............................................................................... 47
Figura 16: Alterações morfológicas em eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii
observadas em microscopia eletrônica de varredura. ................................................... 48
Figura 17: Alterações morfológicas em eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii
observadas em microscopia eletrônica de transmissão. ............................................... 49
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Efeito da temperatura na atividade das enzimas antioxidantes nos eritrócitos
de Notothenia coriiceps. .........................................................................................................42
Tabela 2: Efeito da temperatura na atividade das enzimas antioxidantes nos eritrócitos
de Notothenia rossii. ...............................................................................................................42
Tabela 3: Efeito da temperatura nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e
malonaldeído (MDA). .............................................................................................................43
Tabela 4: Alterações morfológicas nos eritrócitos de Notothenia coriiceps, submetidos
às temperaturas de 0° e 8°C por 1,3 e 6 dias. ....................................................................50
Tabela 5: Alterações morfológicas de eritrócitos de Notothenia rossii, submetidos às
temperaturas de 0° e 8°C por 1, 3 e 6 dias. ........................................................................51
Tabela 6: Maior eixo, menor eixo e volume celular e nuclear de eritrócitos de
Notothenia coriiceps, submetidos às temperaturas de 0° e 8°c por 1,3 e 6 dias. ..........52
Tabela 7: Maior eixo, menor eixo e volume celular e nuclear de eritrócitos de
Notothenia rossii, submetidos às temperaturas de 0° e 8°c por 1,3 e 6 dias. ................53
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LISTA DAS PRINCIPAIS ABREVIATURAS
AFGPs – Glicoproteínas anticongelantes (do inglês AntiFreeze GlicoProteins)
AR – Glaciar Ecology
BSA – Albumina bovina
CAT – Catalase(s)
CDNB – (1-cloro-2,4-dinitrobenzeno)
CME-UFPR – Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do
Paraná
CTmax – Temperatura Crítica máxima (do inglês Critical Thermal maximum)
DTNB - Ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico
EACF – Estação Antártica Comandante Ferraz
EBN – Eritrócito(s) com bolha(s) nucleare(s)
EDN – Eritrócito(s) com deslocamento nuclear
EDTA – Ácido etileno diamino tetraacético (do inglês Ethylenediaminetetracetic
acid)
EFC – Eritrócito(s) com alteração de formato celular
EFN – Eritrócito(s) com fissura nuclear
EI – Eritrócito imaturo
EM – Eritrócito maduro
ERO(s) – Espécie(s) Reativa(s) de Oxigênio
EVM – Eritrócito(s) com formação de vesículas na membrana celular
Eµ - Eritrócito com micronúcleo
GPx – Glutationa Peroxidase
GR – Glutationa Redutase
GSH – Glutationa Reduzida
GSSG – Glutationa dissulfeto (glutationa oxidada)
GST – Glutationa S-transferase(s)
H2 O2 – Peróxido de hidrogênio
LPO – Peroxidação lipídica (do inglês lipid peroxidation)
MET – Microscopia eletrênica de varredura
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
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MO – Microscopia de Luz
MDA – Malondialdeído
Mg – Miligramas
NADH –Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido (do inglês Reduced
nicotinamide adenine dinucleotide)
NBT – Azul de nitrotetrazólio
O2 - - Radical ânion superóxido
OH – Radical hidroxila
SOD – Superóxido dismutase(s)
PP- Punta Plaza
TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (do inglês Thiobarbituric
Acid Reactive Substances)
TCA - Ácido tricloroacético
U – Unidade Internacional de Enzimas
µM – Micrómetro
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SUMÁRIO
1. ................................................................................................. INTRODUÇÃO
........................................................................................................................ 15
2- OBJETIVOS ............................................................................................... 26
2. 1 - Objetivo Geral ........................................................................................ 26
2. 2 - Objetivos específicos ............................................................................. 26
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 27
3.1 Coletas ...................................................................................................... 27
3. 3 Procedimentos Analíticos ......................................................................... 31
3.3.1 Determinação da atividade das enzimas do estresse oxidativo .............. 31
3.3.2 Determinação da concentração de Glutationa Reduzida ........................ 33
3.3.3 Determinação do índice da Peroxidação Lipídica (LPO) ........................ 33
3.3.4 Análises morfológicas ............................................................................ 33
3.4 Análises estatísticas .................................................................................. 35
4. RESULTADOS ........................................................................................... 36
4.1 Atividade das enzimas antioxidantes ......................................................... 36
4.2 Determinação de GSH e LPO .................................................................. 40
4.3 Alterações Morfológicas ............................................................................ 43
5. DISCUSSÃO ............................................................................................... 54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 66
ANEXOS: ....................................................................................................... 88
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1. INTRODUÇÃO
O ambiente marinho antártico, representado pelo Oceano Austral ou
Oceano Antártico (SIDELL, 2000), ocupa aproximadamente 35 milhões de Km2
e apresenta uma variedade de características físicas e flutuações sazonais
relativas à sua posição geográfica (CLARK, 1983; EASTMAN, 1993). É
constituído pela porção sul dos oceanos Atlântico, Pacífico e Índico, com 3.000
a 5.000 metros de profundidade (EKAU, 1991) (Figura 1). Possui como
característica um sistema circumpolar de correntes e frentes hidrográficas,
incluindo a Convergência Antártica, uma das maiores e mais velozes correntes
marítimas, que isola e separa o Oceano Austral dos oceanos que o formam e
afeta diretamente as condições locais de clima (DI PRISCO et al., 1991;
FELICIO, 2007).
Figura 1- Contimente Antártico e Oceano Austral. Fonte: Modificado de Ahlert; Aquino, 2009.
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O estabelecimento da Convergência Antártica tornou o ambiente
antártico isolado climática e biologicamente (JOHNSTON et al., 1991), assim
os animais que vivem nesta região sofreram pressões adaptativas, que
selecionaram característica singulares para a vida (KAWALL e SOMERO 1996;
KAWALL, 1998; SOMERO et al. 1998; SOMERO, 2004) em um ambiente
extremamente frio e estável (SIDELL, 2000). A temperatura da água do mar
permanece estável em torno de -1,9°C nas regiões nordeste e em áreas
próximas à Península e ilhas pode variar de +1,5°C (no verão) a -1,8°C (no
inverno) (SIDELL, 2000). O regime de luz na Antártica é bem característico de
regiões polares. No inverno há longos períodos sem luz enquanto que no verão
a luz é praticamente constante. Já, na primavera e no outono as condições são
intermediárias (RIVKIN e PUTT, 1987).
A ictiofauna antártica concentra apenas 1,9% das espécies de peixes,
exclusivamente marinhos, do planeta, algo em torno de 322 espécies
distribuídas em 50 famílias (EASTMAN, 2005). A Subordem Notothenoidei, da
ordem Perciformes, predominante na região, está representada por 8 famílias,
44 gêneros e 129 espécies, destas, 101 são exclusivamente antárticas, sendo
a família Notothenidae a mais abundante (EASTMAN, 2005). Estudos sugerem
que esse grupo é monofilético, surgindo de um “vácuo ecológico”, e que a
fauna anterior teria sido totalmente extinta (EASTMAN, 1993). A grande maioria
das espécies da família Notothenidae é sedentária demersal, mas algumas
espécies teriam se adaptado a viver no ambiente pelágico, e outras associadas
ao gelo na superfície (EASTMAN, 1989; EKAU, 1991).
As espécies analisadas neste trabalho, Notothenia coriiceps e
Notothenia rossii, pertencem a família Notothenidae. Ambas as espécies são
endêmicas e representam duas das quatro espécies mais abundantes na Baía
do Almirantado (CASAUX et al., 1990; BARNES et al., 2006), sendo
encontradas normalmente em profundidades em torno de 200 metros
(FISHBASE, 2013), nas regiões Antárticas e Subantárticas, assim como nas
águas costeiras da Nova Zelândia e América do Sul (EASTMAN, 1993).
A coloração do corpo de adultos de N. coriiceps aproxima-se do marrom
escuro e pode apresentar manchas marrom claras, pretas ou esverdeadas
enquanto que o abdome pode variar de amarelo claro a amarelo–esverdeado,
17
dependendo da idade (FISHER e HUREAU, 1985). O corpo é largo com
cabeça grande levemente deprimida (Figura 2A). A espécie é caracteriza como
onívora, e sua dieta pode variar de acordo com disponibilidade de alimento
(CASAUX et al., 2003) e com a profundidade (KNOX, 1994). A ingestão
consiste de animais bentônicos como anfípodas, gastrópodes e bivalves
(principalmente em profundidades de até 20 metros) (KNOX, 1994), e animais
pelágicos como pequenos peixes e krill antártico (principalmente em
profundidades superiores a 170 metros) (PERMITIN e TARDIYERA, 1978;
KNOX, 1994).
A coloração do corpo de N. rossii pode variar de acordo com a idade. Os
juvenis podem variar de amarelo a marrom ou laranja, e os adultos marrom
clara com o dorso mais escuro apresentando pontos negros ao longo do corpo.
A cabeça e o corpo são levemente comprimidos com a boca disposta de forma
oblíqua (FISHER e HUREAU, 1985) (Figura 2B). A dieta de N. rossii é
classificada como ontogenética, são classificados como carnívoros e a ingestão
pode ser de anfípodas, gastrópodes, decápodes, organismos bentônicos e krill
antártico (HUREAU, 1970; TARVERDIYEVA, 1972; KNOX, 1994).
18
Figura 2: Espécies estudadas. Indivíduo adulto de Notothenia coriiceps (A). Indivíduo adulto
de Notothenia rossii (B). Fonte: Beatriz Bouchinhas.
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As baixas temperaturas dos mares antárticos não foram o único fator
seletivo e determinante da biodiversidade, mas o confinamento ecológico e a
oscilação sazonal do suprimento alimentar também são apontados como
fatores importantes para explicar a baixa diversidade de peixes antárticos
(EASTMAN, 1993). Outro aspecto importante reside na estabilidade térmica do
meio, em especial das zonas de gelo marinho permanente, a qual pode ter sido
de extrema importância para o processo de seleção e adaptação molecular dos
organismos antárticos (EASTMAN, 1991; HUBOLD, 1991; MONTGOMERY e
CLEMENTS, 2000).
Entre as adaptações conhecidas, os peixes antárticos possuem um
comportamento conhecido como adaptação metabólica ao frio (JOHNSTON et
al., 1991), isto é, apresentam metabolismo relativamente baixo, mas as taxas
metabólicas são mais altas do que o esperado caso fosse feita uma projeção
do metabolismo de peixes temperados em temperaturas próximas a 0°C
(JOHNSTON et al., 1991). Estudos indicam que algumas enzimas de peixes
antárticos são mais ativas em temperaturas baixas quando comparadas às
enzimas de peixes de águas mais quentes (MACDONALD et al., 1987). Outro
exemplo da influência das baixas temperaturas foi o surgimento, no sangue dos
nototenídeos antárticos, de proteínas anticongelantes (AFGPs- AntiFreeze
GlicoProteins) (CHEN et al., 1997; CHENG et al., 2003; HARDING et al., 2003;
JIN e DEVRIES, 2006; CHENG e DETRICH, 2007; CULLINS et al., 2011) e a
escassez de hemoglobina, sendo que em algumas espécies ela não é
expressa (DI PRISCO et al., 2007). JIN e DEVRIES (2006) aclimataram o
nototenídeo antártico, Pagothenia borchgrevinki, coletados na região de
McMurdo, à temperatura de 4°C durante 4 a 16 semanas. Foi observado que
após 16 semanas os níveis de AFGP no plasma diminuíram 60% na
concentração de pequenas AFGP e 20% na concentração de grandes AFGP.
Nos últimos 60 anos a temperatura da água do Oceano Austral
aumentou cerca de 0.2°C em profundidades entre 700 a 1100 metros (entre 35
e 65°S), e recentemente este aumento está sendo registrado em águas
superficiais (RENWICK, 2002; TURNER et al., 2005). A água dos lagos da
região está aquecendo mais rapidamente do que o ar, em consequência da
diminuição da camada de gelo (KING, 1994; KING e HARANGOZO, 1998;
20
QUAYALE et al.; 2002, 2003), causada pelas pressões ambientais sobre o
continente antártico (CLARKE et al., 2007, HELLMER et al., 2012, ROSS et al.,
2012).
A Península Antártica, onde se localiza a Estação Antártica Brasileira
Comandante Ferraz (EACF) - Baía do Almirantado, ilha Rei George,
arquipélago das Shetlands do Sul, local onde o presente estudo foi realizado, é
uma das três regiões do planeta, que apresenta aquecimento acelerado
(CLARKE et al., 2007; TURNER, 2007) (Figura 3). O aquecimento da
Península Antártica, tem provocando degelo intenso tanto de geleiras, como de
neve acumulada durante o inverno e do gelo marinho, acarretando alterações
na salinidade e na densidade da água do mar, diminuindo a salinidade do mar
em regiões costeiras (DI PRISCO, 2000; CLARKE et al., 2007).
Figura 3: Local de estudo. Na Península Antártica (A) encontra-se a Ilha Rei George (B), onde
localiza-se a Baia do Almirantado(C), local onde o presente estudo foi realizado. Fonte: Modificado de Simões et al., (2004).
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A temperatura é um fator abiótico que influencia diretamente a fisiologia
e a taxa metabólica de organismos ectotérmicos, pois limita reações
enzimáticas e afeta a estabilidade de macromoléculas (WEDEMEYER et al.,
1990; WEINSTEIN e SOMERO, 1998). No caso de ectotérmicos antárticos,
devido a estabilidade térmica do ambiente, essas variações podem ser letais
(WEINSTEIN e SOMERO, 1998).
Organismos antárticos possuem menor tolerância aguda ao calor,
quando comparados a espécies tropicais, mas podem suportar o aumento de
temperatura se aclimatados a temperaturas superiores, como por exemplo,
Trematomus bernacchii e Trematomus pennellii que após aclimatação a 4°C,
suportaram até 14°C (PODRABSKY e SOMERO, 2006). BILYK e DEVRIES
(2011) determinaram a temperatura crítica máxima (CTMax ambiental) de 11
espécies de peixes antárticos, dentre eles N. coriiceps e N. rossii, e para
ambas a CTMax encontrada foi em torno de 16.2°C (SEEBACHER et al.,
2005; PODRABSKI e SOMERO, 2006; HUDSON et al., 2008). PÖRTNER
(2002) verificou que a fase inicial de aclimatação ao calor em peixes antárticos
pode prejudicar o aporte de oxigênio aos órgão centrais. LOWE e DAVISON
(2005) ao submeter os nototenídeos Pagothenia borchgrevinki e T. bernacchii à
estresse térmico obseravaram que hove hiperglicemia associada à lenta
liberação de cortisol no plasma, e aumento do hematócrito em P.
Borchgrevinki, devido ao aumento da temperatura. Acredita-se que há aumento
no hematócrito, no início da aclimatação ao calor, para melhorar a capacidade
respiratória (HEISE e ABELE, 2008). O estresse térmico analisado em fígado e
músculo do peixe antártico Pachycara brachycephalum, causou diminuição do
conteúdo lipídico, redução de carboidratos e alteração nos níveis de proteínos
dos dois tecidos (BRODTE et al., 2006). THORNE et al. (2010), expuseram o
nototenídeo Harpagifer antarcticus a estresse térmico agudo (6°C por 48 horas)
e como resposta registaram repostas inflamatórias no tecido hepático.
Organismos vivos devem possuir sistemas que regulem e mantenham a
homeostase, já que estão sujeitos a mudanças rápidas nas condições bióticas
e abióticas do meio em que habitam que podem ou não ser estressoras
(MARIANO et al., 2009; COGO et al., 2009). São exemplos dessas alterações,
além da temperatura, as mudanças de pH e salinidade, poluentes orgânicos e
22
inorgânicos, aumento na concentração de amonia e nitrito e redução de O2
dissolvido (COGO et al., 2009).
Ao longo do processo evolutivo a sobrevivência dos organismos esteve
relacionada a capacidade de se ajustar aos agentes estressores e recuperar a
homeostase. A tolerância térmica, por exemplo, está estritamente relacionada à
capacidade do organismo em metabolizar o oxigênio, já que o equilíbrio de O2
nos tecidos pode ser alterado com o aumento ou o declínio da temperatura do
ambiente, gerando espécies reativas de oxigênio (EROs) (ABELE et al., 1998).
A partir do momento que o gás oxigênio passou a ser incorporado no
processo de respiração celular as EROs fazem parte do metabolismo dos
organismos aeróbicos (STADTMAN e LEVINE, 2000). As EROS são moléculas
ou ínos provenientes das reações de ativação ou redução do oxigênio
molecular, ou produtos da reação de redução do O2 (MONTEIRO et al., 2006).
A produção destes compostos na célula é natural e pode ter origens diferentes,
dentre elas, a utilização de 02 na cadeia respirátória pela mitocôndria a fim
obter enegia através de reações de oxidação, em processos de defesa
antimicrobiana por células fagocitárias em reações de auto-oxidação de 02 e
por microssomos do retículo endoplasmático (HALLIWELL e GUTTERIGGE,
2000). São exemplos de EROs, o ânion radical superóxido (O2-), o peróxido de
hidrogênio (H2O2), o radical hidroxila (OH) e o oxigênio livre (O) (STADTMAN e
LEVINE, 2000; MONTEIRO et al., 2006). Entretanto caso haja um desequilíbrio
, esses radicais podem ser prejudiciais e/ou letais as células pois reagem com
lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos (STADTMAN e LEVINE, 2000) (Figura 4).
23
Figura 4: Geração de EROs e danos celularesO metabolismo aeróbico pode resultar em
espécies reativas de oxigênio (EROs) (A). A ação dos radicais livres sobre estruturas celulares pode causar danos à célula (B). Fonte: Modificado de http://medicinanaturale.pro/antiossidanti-vitamine-minerali-alimentazione-spor/-(A); http://pierre.senellart.com/travaux/divers/freer.gif (B).
A fim de proteger a célula dos danos causados pelas EROs, houve a
seleção de um sistema de defesa antioxidante (DROGE, 2002; HALLIWELL,
2007), formado por enzimas capazes de anular os radicais resultantes do
metabolismo aeróbico (Figura 5), dentre elas, catalase (CAT), superóxido
dismutase (SOD), glutationa-S-trasferase (GST), glutationa peroxidase (GPx) e
glutationa redutase (GR) (LEHNINGER, et al., 2007). Já os compostos
antioxidantes não enzimáticos atuam impedindo reações de auto-oxidação e
podem reduzir radicais livres (SAYEED et al., 2003), sendo representados pelo
ácido ascórbico e tiós não proteicos, dentre eles a glutationa reduzida (GSH)
(AHMAD et al., 2000; ORUÇ et al., 2004).
24
Figura 5: Representação esquemática dos sistemas de defesa antioxidantes. Enzimas, SOD,
CAT, GPx e GR e suas vias de ação. Fonte: Modificado de http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/cell-signaling-enzymes/superoxide-dismutase.html
O estresse oxidativo se dá quando o sistema de defesa antioxidante não
é capaz de remover as EROs o que causará danos às moléculas orgânicas
(HAGERMAN, 2006). O estresse oxidativo pode ser desencadeado por
temperaturas extremas. Com o choque térmico há alteração no transporte de
elétrons e pode haver a formação de EROs, ocasionando modificações na
estrutura de moléculas importantes para a célula (COGO et al., 2009).
Os eritrócitos de peixes diferem dos mamíferos pois são células
nucleadas, ovais ou elípticas (CAMPBELL, 1991; DE CARVALHO et al., 2009),
entretanto sua origem é similar pois acredita-se que derivam de uma célula
fonte, que ao proliferar-se gera outras células, são classificados de acordo com
o grau de maturação, entretanto são considerados eritrócitos maduros as
células que após a diferenciação são capazes de desempenharem suas
funções específicas (TAVARES-DIAS e MORAES, 2004). Embora o tecido da
origem hematopoiética possa variar de entre as diferentes famílias de peixes
(FORERO, 1995; PIMPÃO, 2006), os principais tecidos que dão origem aos
eritrócitos e outras células sanguíneas são o baço e o rim cefálico, sendo que,
nestes tecidos a atividade eritropoiética pode sofrer influência de fatores
25
ambientais como aumento da temperatura e estresse (TAVARES-DIAS e
MORAES, 2004).
Estudos indicam que o número e o tamanho dos eritrócitos na circulação
estão relacionados à posição na escala evolutiva, habilidade natatória,
demanda respiratória e taxa metabólica das espécies, ou seja, maior número
de eritrócitos é encontrado em espécies mais ativas, eritrócitos de menor
tamanho e em menor número são encontrados em espécies mais sedentárias
(TANDON e JOSHI, 1976; RAMBHASKAR e SRINIVASA-RAO, 1987).
Os eritrócitos desempenham a função de transporte dos gases oxigênio
e carbônico (FRIEDMAN et al.,2004) e são células com alto teor de ácidos
graxos poli-insaturados em suas membranas (CLEMENS e WALLER,1987).
Assim os eritrócitos estão expostos ao ataque de EROs e por esse motivo
devem possuir múltiplos sistemas antioxidantes, para defender-se das EROs
(TIANO et al., 2000; 2003; FRIEDMAN et al., 2004). O estresse oxidativo em
eritrócitos pode ser avaliado por diversas abordagens experimentais e há
diferentes maneiras da célula responder a este estresse, seja por aumento nas
concentrações de antioxidantes não enzimáticos, alteração na atividade das
enzimas de defesa, e em casos mais graves a lise celular (BAINNY et al.,
1996), que pode ser causada por peroxidação lipídica (LPO) (GUTTERIDGE,
1995; LACKNER, 1998; DUTRA et al., 2008). Morfologicamente o estresse
oxidativo em eritrócitos pode causar acúmulo de danos e lesões celulares
(NAGASAKA, 2004), como perda de formato e até lise celular (BAINNY et al.,
1996).
Há pouca literatura sobre a aclimatação de peixes antárticos em
temperaturas diferentes da subzero (-1,96 a 0°C) (SOMERO e DEVRIES, 1967;
LOWE e DAVISON, 2005; JIN e DEVRIES 2006; CLARKE et al., 2007; CLARK
e PECK, 2009; BILYK e DEVRIES, 2011). Neste contexto, entender o
metabolismo oxidativo e suas defesas em eritrócitos, é importante, já que pode
fornecer informações básicas sobre aspectos fisiológicos e ecológicos de duas
espécies de peixes predominantes na Baía do Almirantado, Ilha Rei George,
Península Antártica. Os dados gerados neste trabalho podem servir de
subsídios para a tomada de decisão visando à conservação destas espécies
frente às mudanças climáticas globais.
26
2- OBJETIVOS
2. 1 - Objetivo Geral
Avaliar comparativamente aspectos do metabolismo oxidativo e suas
defesas antioxidantes, bem como as alterações morfológicas, em eritrócitos
dos peixes antárticos Notothenia rossii e Notothenia coriiceps frente ao
aumento da temperatura (8°C).
2. 2 - Objetivos específicos
Investigar as possíveis variações na atividade das enzimas antioxidantes
superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase
(GPx), glutationa S-tranferase (GST) e glutationa redutase (GR),
influenciado pelo estresse térmico, nos eritrócitos dos peixes antáricos
N. rossii e N. coriiceps.
Investigar as possíveis variações nas concentrações de glutationa
reduzida (GSH) influenciado pelo estresse térmico, nos eritrócitos dos
peixes antáricos N. rossii e N. coriiceps.
Avaliar a peroxidação lipídica (LPO) frente ao estresse térmico nos
eritrócitos dos peixes antáricos N. rossii e N. coriiceps.
Avaliar as possíveis alterações morfológicas causadas pelo estresse
térmico nos eritrócitos dos peixes antáricos N. rossii e N. coriiceps.
Comparar a atividade das enzimas antioxidantes, a concentração de
GSH e a LPO, bem como as alterações morfológicas, frente ao estresse
térmico nos eritrócitos dos peixes antáricos N. rossii e N. coriiceps.
27
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Coletas
Na Baía do Almirantado, Ilha Rei George, as coletas foram realizadas
em Ponta Plaza (PP - 62° 05’ 64,5’’ S; 58° 24’ 31.7’’ W) e Arctowski, em frente
ao glaciar Ecology (AR - 62°10’.65’’ S; 58°26.5’ W), locais de maior abundância
de N. rossii e N. coriiceps na Baía do Almirantado (Figura 6).
Figura 6: Locais de coleta na Baia do Almirantado – Ilha Rei George. Os espécimes de Nothenia coriiceps e Notothenia rossii foram coletados na Punta Plaza (PP) e no Glaciar Ecology (AR). A EACF está representada no mapa como CF (62º05’0”S/ 58º23’28”W). (Fonte: Edson Rodrigues Júnior)
Exemplares de N. rossii (n= 60) e de N. coriiceps (n=60), foram
capturados com linha e anzol. A profundidade de coleta variou entre 10 a 25
metros e a pesca foi realizada com o auxílio de botes pneumáticos do tipo
“Zodiac” ou a bordo da lancha oceanográfica “Skua” (Figura 7). Os peixes
foram transportados dos locais de coleta para os módulos de aquários
(laboratórios) da Estação Antártica Comandante Ferraz (EACF)
(62º05’0”S/58º23’28”W) e mantidos sob condições controladas de temperatura
(0◦C + 0.5◦C), salinidade (35 + 1,0 psu), fotoperíodo (12 horas luz/12 horas
escuro) e aeração durante 3 dias (Figura 8).
28
Figura 7: Coleta dos exemplares de N. coriiceps e N. rossii. Utilizando-se vara e anzol (A) a bordo de botes pneumáticos (B) ou a bordo da lancha oceanográfica "Skua”(C). (Fotos: Beatriz Bove da Costa Boucinhas (A e C); O autor (B).
Figura 8: Módulo de aquário da Estação Antártica Comandante Ferraz.Preparo dos tanques com termostato (A). Espécimes de N. coriiceps acondicionados em tanque (B). (Fotos: O autor (A); Edson Rodrigues Júnior (B)).
A B C
29
3.2 - Protocolo experimental
N. rossii e N. coriiceps foram randomicamente selecionadas e
transferidas para tanques de 1000 L contendo água do mar à temperatura de 8
± 0,5oC, durante 24 horas (1 dia), 72 horas (3 dias) e 144 horas (6 dias),
caracterizando os animais experimentais (Figura 9 A). Os animais controles
foram mantidos nas mesmas condições e tempos dos experimentais, com
exceção da temperatura que foi de 0 ± 0,5°C (Figura 9 B). A salinidade foi de
35 psu + 1,0 e o fotoperíodo de 12 horas luz e 12 horas escuro. O número de
peixes para cada situação experimental foi de 10 indivíduos.
Figura 9: Desenho esquemático do protocolo experimental. (A) Grupo experimental, animais
submetidos à temperatura de 8°C. (B) Grupo controle, animais mantidos à temperatura de 0°C. Fonte: O autor, 2013.
B A
30
A temperatura da água dos tanques foi rigorosamente mantida com
termostatos Aquaterm 09-01T-11457 (Full Cauge) acoplados a aquecedores
(Altman). A água do mar foi captada a uma profundidade de 4 metros, em
frente da EACF, e bombeada para os tanques. Os tanques foram limpos a cada
dois dias e 50% da água trocada.
A alimentação foi a base de músculo epaxial de peixes Antárticos,
oferecida a cada dois dias na quantidade correspondente a 1% da sua massa
corpórea.
Após a realização dos bioensaios, os animais foram anestesiados com
benzocaína 1% (p v-1
), o sangue coletado com seringa heparinizada mediante
punção da veia caudal (Figura 10). Em seguida os animais foram mortos via
secção medular e medidas biométricas (comprimento e peso) foram realizadas.
Figura 10: Coleta de sangue. Obtenção de sangue por meio da punção da veia caudal (A). Coleta de sangue realizada com seringa heparinizada (B). Fotos: Gabriela Raga.
31
Os eritrócitos foram obtidos mediante centrifugação do sangue total a
2000 rpm por 10 minutos a 40C. Após a retirada do plasma, parte dos
eritrócitos foi fixada em fixador Karnovsky com adaptações (paraformaldeído
2%, glutaraldeído 2,5% em tampãp cacodilato 0,1M pH 7.2 a 4C)
(KARNOVSKY, 1965) durante 2 horas e posteriormente transferida para
tampão cacodilato 0,1M pH 7.2 a 4C para as análises morfológicas. Parte dos
eritrócitos foi lavada em NaCl 0,9%, centrifugada a 5000 x g durante 10 min a
4°C e em seguida foi adicionado tampão Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 (3:1 v/v) para
obtenção do hemolizado que foi centrifugado a 12000 x g durante 15 min a 40C
e o sobrenadante congelado em nitrogênio líquido visando as análises
enzimáticas.
O material foi transportado da EACF para o Laboratório de Biologia
Adaptativa do Departamento de Biologia Celular da Universidade Federal do
Paraná, onde foram realizadas as analises enzimáticas e morfológicas.
3. 3 Procedimentos Analíticos
Maiores detalhes das metodologias utilizadas neste trabalho constam no
Anexo I.
3.3.1 Determinação da atividade das enzimas do estresse oxidativo
Os hemolizados das amostras foram tratados com clorofórmio e etanol
na proporção de 1:2 (ROCHE e BOGE, 1993), e centrifugados a 5000 x g por
15 minutos. O sobrenadante foi separado para as análises bioquímicas.
As leituras espectrofotométricas foram realizadas em leitor de
microplacas Epoch (Bio-Tech) com exceção da CAT que foi lida no
espectrofotometro Shimadzu UV-2600 em cubeta de quartzo.
A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método de
BRADFORD (1976), utilizando-se soro de albumina bovina (BSA) para o
estabelecimento da curva padrão e a absorbância das amostras foi verificada a
595nm. As amostras não foram normalizadas, pois continham concentração de
32
proteínas inferior a 1mg/mL. Os valores obtidos com a dosagem de proteínas
totais foram diretamente utilizados no cálculo das enzimas.
Os níveis de atividade da superóxido dismutase (SOD) foram avaliados
pela inibição da redução do azul de nitrotetrazólio (NBT) para azul formazan
pelo O2- gerado pela hidroxilamina em solução alcalina (CROUCH et al., 1981).
A leitura foi realizada em 560nm.
Os níveis de atividade da catalase (CAT) foram avaliados pelo consumo
de peróxido de hidrogênio (H2O2) espectrofotometricamente a 240nm. O meio
de reação conteve tampão fosfato de potássio (50mM, pH 7,0) e peróxido de
hidrogênio 10mM (BEUTLER, 1975).
Os níveis de atividade da glutationa peroxidase (GPx) foram
determinados através da oxidação de NADPH a 340nm. A enzima utiliza
glutationa reduzida (GSH) para reduzir peróxido orgânico originando glutationa
dissulfídica (GSSG). Esta última é reduzida pela enzima glutationa redutase
(GR) utilizando elétrons doados pelo NADPH (WENDEL, 1981).
Os níveis de atividade da glutationa-S-tranferase (GST) foram
determinados de acordo com a metolologia de KEEN et al. (1976) utilizando o
1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) como substrato. A glutationação do CDNB
foi medida espectrofotometricamente em 340nm.
Os níveis de atividade da glutationa redutase (GR) foram avaliados
espectrofotometricamente através da oxidação do NADPH com a concomitante
redução da GSSG com absorbância em 340nm. O meio de reação conteve
tampão fosfato de potássio (100mM, pH 7,0), EDTA 1mM, NADPH 0,1MmM e
glutationa oxidada 1mM (CARLBERG e MANNERVIK, 1985).
O valores da atividade das enzimas antioxidantes foram expressos em
U/mg de proteína. Uma unidade de actividade de SOD é definida como a
quantidade de enzima que inibe a reação de oxidação de NBT em 50% da
inibição máxima. Uma unidade de atividade de CAT, GPx, GST e GR é definida
como a quantidade de enzima que consome 1 mmol de substrato ou a geração
de um mol de produto por minuto.
33
3.3.2 Determinação da concentração de Glutationa Reduzida
A concentração de glutationa (GSH) e outros tióis foram determinados
através do método descrito por SEDILAK e LINDSAY (1968). Foi adicionado ao
material 200 uL de TCA a 30% à 50 uL de amostra, centrifugado a 9000
rpm/10min/40C. Ao sobrenadante foi acrescentado 0,25 mM DTNB. O método
baseia-se na precipitação de proteínas e posterior reação de tióis não proteicos
com o DTNB gerando produto que absorve luz a 415 nm. Os Valores de GSH
foram expressos em nmols de tióis por mg de proteínas.
3.3.3 Determinação do índice da Peroxidação Lipídica (LPO)
O índice de peroxidação lipídica (LPO) foi avaliado pelos níveis dos
produtos finais da peroxidação lipídica, o malonaldeído (MDA), pela reação de
TBARS. Os níveis de MDA foram determinados espectrofotometricamente em
535 nm, utilizando MDA (Merck, Darmstadt, Germany) como padrão
(UCHIYAMA e MIHARA, 1978). Os valores de TBARS foram expressos em
nmols de MDA por grama de massa úmida.
3.3.4 Análises morfológicas
Para as análises de microscopia de luz (ML) após a fixação, realizou-se
o esfregaço das amostras em lâminas de vidro que foram coradas com May-
Grunwald (RIOS, 2010). As imagens foram obtidas utilizando o microscópio
com scanner Zeiss - Imager.Z2, através do programa MetaSystems/VSViewer.
Para as análises das alterações celulares, 1000 eritrócitos foram tipificados por
indivíduo em: eritrócitos maduros (EM), eritrócitos imaturos ou eritroblastos
(EI); eritrócito com alteração de formato celular (EFC); eritrócito com formação
de vesículas na membrana plasmática (EVM); eritrócito com deslocamento de
núcleo (EDN); eritrócito com presença de micronúcleo (Eµ); eritrócito com
34
bolha nuclear ou “Blebbed” (EBN) e eritrócito com fissura nuclear ou “Notched”-
(EFN), conforme metodologia adaptada de GRISOLIA et al. (2009) e SOUZA e
FONTANETTI (2006). Para as análises de volume celular, 250 eritrócitos foram
mensurados por indivíduo, onde obteve-se o eixo maior (µm) e o eixo menor
(µm) da célula e do núcleo. Em seguida aplicou-se a fórmula V=4/3π(a/2)(b2/2)
para cálculo dos volumes celular e nuclear, onde V = volume; π=3,14; a=eixo
maior; b= eixo menor (FELIP et al., 2009). Dados de volume foram expressos
em µm3.
Para as análises em microscopia eletrônica de transmissão (MET), após
fixação, os eritrócitos foram pós-fixados em tetróxido de ósmio a 2% em
tampão cacodilato 0,1M pH 7.2 por 1 hora. A contrastação em blocos foi feita
com acetato de uranila 2% durante 2 horas. O material foi desidratado em série
alcoólica crescente e em seguida colocado em acetona. A impregnação e
inclusão ocorreram em resina Epon-812 (LUFT, 1961). Os cortes foram obtidos
em ultramicrótomo Sorval Porter Blum MT-2 com utilização de navalhas de
vidro e de diamante. Os cortes ultra-finos foram contrastados em solução
aquosa de acetato de uranila 2% (WATSON, 1958) e nitrato de chumbo
(REYNOLDS, 1963). A visualização e documentação do material foram
realizadas em microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1200EX II do
Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Paraná (C.M.E.-
UFPR).
Nas análises em microscopia eletrônica de varredura (MEV) após
fixação, os eritrócitos foram submetidos ao ponto crítico, obtido em um Bal-Tec
CPD – 030 com gás carbônico e em seguida metalizados em ouro em um
Balzers SCD – 030. As análises e a documentação do material foram
realizadas no microscópio eletrônico de varredura JEOL-JSM 6360 LV do
C.M.E – UFPR.
35
3.4 Análises estatísticas
Para a análise dos níveis das enzimas do estresse oxidativo (SOD, CAT,
GPX, GST e GR) e dos parâmetros não enzimáticos (GSH e MDA) os dados
foram tratados estatisticamente através da análise de variância bi – fatorial
(ANOVA bi-fatorial) visando verificar o efeito das duas variáveis independentes
(temperatura e tempo de exposição) e a possível interação entre ambos. Em
caso significativo foi realizado o pós-teste de Tukey para a comparação das
médias. A homogeneidade das variâncias foi testada a priori pelo teste de
Levene e em caso significativo os dados foram log-transformados.
Os dados morfométricos referente as alterações morfológicas, foram
previamente testados para a normalidade através do teste Kolmogorov-
Smirnov e homogeneidade das variâncias através do teste de Levene. Caso os
dados fossem homogêneos eram submetidos à análise de variância bi-fatorial
(ANOVA duas-vias) (F), no qual o tempo de exposição (1, 3 e 6 dias) e a
temperatura (0 e 8°C) foram as variáveis categóricas. Em caso dos dados
serem não-paramétricos foi utilizada a análise não-paramétrica de Kruskal-
Wallis (H), através do software R 2.5.1. Em caso de
variação significativa (p<0,05) foram submetidos ao pós teste de Tukey e
comparações múltiplas respectivamente.
36
4. RESULTADOS
4.1 Atividade das enzimas antioxidantes
Em N. coriiceps os níveis de SOD não foram modulados pelo aumento
da temperatura a 8°C e ao longo do tempo (Figura 11A). Já em N. rossii, o
aquecimento em 8°C modulou positivamente os níveis de SOD em relação a
0°C, em 6 dias de exposição, sendo que a 8°C os níveis de SOD foram 68%
maiores quando comparados a 0°C. Ao longo dos tempos de exposição em
0°C os níveis de SOD em N. rossii aumentaram em 3 dias quando comparados
a 1 e 6 dias. Já em 8°C houve aumento nos níveis de SOD em 3 e 6 dias
quando comparados a 1 dia (Figura 11 B).
O aquecimento em 8°C modulou os níveis de CAT em relação a 0°C nas
duas espécies analisadas (Figuras 11 C - D). Em N. coriiceps os níveis de CAT
em 1 dia a 0°C foram 87% maiores quando comparados a 8°C, e em 3 dias a
0°C foram 90% maiores quando comparados a 8°C. Em N. rossii o
aquecimento em 8°C modulou os níveis de CAT em relação a 0°C em 3 e 6
dias. Em 3 dias os níveis de CAT em 8°C foram 97% maiores quando
comparados a 0°C e em 6 dias foram 86% menores em 8°C quando
comparados a 0°C. Ao longo do tempo, em N. coriiceps o tempo de exposição
não influenciou os níveis de CAT em 8°C, já em 0°C houve diminuição de 51%
entre 1 e 3 dias, e de 91% entre 3 e 6 dias (Figura 11 C) . Em N. rossii a 8°C
houve aumento de 88% nos níveis de CAT em 3 dias de exposição quando
comparado a 1 e 6 dias enquanto que em 0°C os níveis de CAT foram 86%
maiores em 1 dia quando comparado a 3 dias, e 79% maiores em 3 dias
quando comparado a 6 dias (Figura 11 D).
37
1 2 3 4 5 60
100
200
300
400
8°C0°C
A
a
a
aa
a
Tempo (dias)
SO
D U
/mg p
rote
ína
1 2 3 4 5 60
200
400
600
800B
b
a
b
b
a
*
0°C
8°C
Tempo (dias)
SO
D U
/mg p
rote
ína
1 2 3 4 5 60
1
2
3
4
5C
c
a
ab
a
*
*
0°C
8°C
Tempo (dias)
CA
T U
/mg p
rote
ína
1 2 3 4 5 60.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5D
b
a
b
a
c
*
*
0°C8°C
Tempo (dias)
CA
T U
/mg p
rote
ína
Notothenia coriiceps Notothenia rossii
Figura 11: Níveis de Atividade da superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). Eritrócitos de
Notothenia coriiceps (A e C) e Notothenia rossii (B e D), expostos a 0°C e 8°C (circulo vazio e
quadrado cheio respectivamente) durante 1, 3 e 6 dias. As linhas verticais indicam médias +
EP. As letras minúsculas diferentes indicam que há diferenças entre os tempos de exposição
em cada temperatura (0°C e 8°C). Asteriscos indicam diferenças significativas (P ≤ 0,05) entre
as temperaturas (0°C e 8°C).
O aquecimento em 8°C não modulou os níveis de GPx em relação a 0°C
em ambas as espécies analisadas (Figura 12 A-B). Em N. coriiceps ao longo
do tempo, os níveis de GPx apresentaram variações, sendo que em 0°C foram
51% e 66% maiores em 1 dia quando comparados a 3 e 6 dias
respectivamente. Em 8°C os níveis de GPx foram 56% menores em 6 dias
quando comparados aos níveis de 1 dia. Em N. rossii, em 0°C os níveis de GPx
diminuíram 50% em 3 dias em relação a 1 dia e estes níveis mantiveram-se
constantes em 6 dias quando comparamos com 1 dia. Já, em 8°C houve
diminuição dos níveis de GPx entre 1 e 3 dias, sendo 46,4% menor em 3 dias.
O aquecimento em 8°C modulou os níveis de GST em relação a 0◦C em
ambas as espécies analisadas. Em N. coriiceps a modulação positiva dos
níveis de GST ocorreu em 3 dias, sendo 57,9% maior em 8°C quando
comparada a 0°C (Figura 12 C), enquanto que em N. rossii a modulação
38
negativa ocorreu em 6 dias, sendo 81,9% menor em 8°C quando comparada a
0°C (Figura 12 D). Em ambas as espécies analisadas houve diferença nos
níveis de GST ao longo dos tempos de exposição. Em N.coriiceps, a 0°C, em 1
e 3 dias os níveis de GST foram 66% menores quando comparados a 6 dias
enquanto que em 8°C foram 52% e 57% menores em 1 dia quando
comparados a 3 e 6 dias respectivamente. Já em N. rossii a 8◦C os níveis de
GST foram 85% menores em 6 dias quando comparados a 1 e 3 dias enquanto
que a 0◦C os níveis de GST não foram alterados ao longo do tempo.
O aquecimento em 8oC modulou os níveis de GR em relação a 0oC em
N. coriiceps enquanto que em N.rossii não foi observado esta modulação
(Figuras 12 E-F). Em N. coriiceps em 8°C houve modulação positiva nos níveis
de GR em 1 e 3 dias quando comparados a 0°C, sendo respectivamente 69,9%
e 81% maiores em 8°C. Ao longo do tempo em N. coriiceps em 8°C os níveis
de GR foram 68% e 76% maiores em 1 dia quando comparados a 3 e 6 dias
respectivamente. Já em 0°C os níveis de GR em 3 dias foram 80% menores,
quando comparados a 1 dia e 70% menor quando comparado a 6 dias (Figura
12E). Ao longo do tempo em N. rossii a 0°C houve aumento de 79% e 73%,
nos níveis de GR respectivamente em 3 e 6 dias quando comparados a 1 dia.
Em 8°C houve aumento de 48% e 55% nos níveis GR respectivamente em 3 e
6 dias quando comparados a 1 dia (Figura 12F).
39
1 2 3 4 5 60.0
0.1
0.2
0.3
0.4
8°C0°C
A
ab
b
a
a
b
Tempo (dias)
GP
X U
/mg p
rote
ína
1 2 3 4 5 60.0
0.1
0.2
0.3
0.4B
b
aba
b
a
b
0°C
8°C
Tempo (dias)
GP
X U
/mg p
rote
ína
1 2 3 4 5 60.0
0.1
0.2
0.3C
b
a
b
a
*
0°C
8°C
Tempo (dias)
GS
T U
/mg p
rote
ína
1 2 3 4 5 60.0
0.1
0.2
0.3D
aa
a
b
*a
0°C
8°C
Tempo (dias)
GS
T U
/mg p
rote
ína
1 2 3 4 5 60.000
0.005
0.010
0.015E
b
a
ba
ab
*
*
0°C
8°C
Tempo (dias)
GR
U/m
g p
rote
ína
1 2 3 4 5 60.000
0.005
0.010
0.015F
bb
aa
0°C
8°C
Tempo (dias)
GR
U/m
g p
rote
ína
Notothenia coriiceps Notothenia rossii
Figura 12: Níveis de Atividade da glutationa S-transferase (GST), glutationa redutase (GR) e glutationa peroxidase (GPx). Eritrócitos de Notothenia coriiceps (A, C e E) e Notothenia rossii (B, D e F), expostos a 0°C e 8°C (circulo vazio e quadrado cheio respectivamente) durante 1, 3 e 6 dias. As linhas verticais indicam médias +EP. As letras minúsculas diferentes indicam que há diferenças entre os tempos de exposição em cada temperatura (0°C e 8°C). Asteriscos indicam diferenças significativas (P ≤ 0,05) entre as temperaturas (0°C e 8°C).
40
4.2 Determinação de GSH e LPO
O aquecimento em 8°C não modulou a concentração de GSH em
relação a 0°C em ambas as espécies analisadas (Figuras 13 A-B). Em N.
coriiceps ao longo do tempo os níveis de GSH em 0°C em 3 e 6 dias foram
respectivamente 59,38% e 56,66% menores quando comparados a 1 dia. Em
8°C a concentração de GSH em 6 dias foi 53,68% menor quando comparado a
1 dia (Figura 13 A). Em N. rossii não houve diferença significativa o longo dos
tempos de exposição (Figura 13 B).
O aquecimento em 8°C modulou o conteúdo de MDA em relação a 0°C
em ambas as espécies analisadas (Figuras 13 C-D). Em N. coriiceps ocorreu
modulação negativa em 3 dias, sendo 44, 3% menor em 8°C quando
comparado a 0°C (Figura 13 C). Em N. rossii ocorreu modulação positiva em 1
dia, sendo 54,47% maior em 8°C quando comparado a 0°C, em 3 dias foi
observada modulação negativa, sendo 61,94% menor em 8°C quando
comparado a 0°C (Figura 13 C). Houve diferenças no conteúdo de MDA ao
longo dos tempos de exposição em ambas as espécies. Em N. coriiceps a 0°C
o conteúdo de MDA em 1 dia foi 62,34% e 54,44% menor quando comparado a
3 e 6 dias, respectivamente. Em 8°C o conteúdo de MDA em 6 dias foi 52,6% e
22,7% maior quando comparado a 1 e 3 dias, respectivamente. Em N. rossii a
0°C houve aumento de 49,39% e 67,75% no conteúdo de MDA
respectivamente em 3 e 6 dias quando comparados a 1 dia, e em 3 dias a 8°C
houve diminuição de 65,77% e 83,18% no conteúdo de MDA respectivamente
quando comparado a 1 e 6 dias. (Figura 13 C-D )
41
1 2 3 4 5 60
200
400
600A
a
aba
b
b
b
0°C
8°C
Tempo (dias)
GS
H [
tiois
] nm
ole
s/m
g
pro
tein
a
1 2 3 4 5 680
100
120
140
160
180
200B 0°C
8°C
Tempo (dias)
GS
H [
tiois
] nm
ole
s/m
g
pro
tein
a
1 2 3 4 5 60
2
4
6
8
10C
a
a
bb
*
0°C
8°C
Tempo exposição
MD
A (
nm
ols
/gw
m)
1 2 3 4 5 60
10
20
30
40
50D
a
b
ba
b
c
*
*
0°C
8°C
Tempo exposição
MD
A (
nm
ols
/gw
m)
Notothenia coriiceps Notothenia rossii
Figura 13: Concentração de Glutationa reduzida (GSH) e (MDA). Eritrócitos de Notothenia coriiceps (A e C) e Notothenia rossii (B e D), expostos a 0°C e 8°C (circulo vazio e quadrado cheio respectivamente) durante 1, 3 e 6 dias. As linhas verticais indicam médias + EP. As letras minúsculas diferentes indicam que há diferenças entre os tempos de exposição em cada temperatura (0°C e 8°C).
Os valores médio + erro padrão (EP) da determinação da atividade das
enzimas antioxidantes (SOD, GST, GPx, GR e CAT) e da concentração do
antioxidante não enzimático da GSH e da LPO estão apresentados nas
tabelas 1, 2 e 3 respectivamente:
42
Tabela 1: Efeito da temperatura na atividade das enzimas antioxidantes nos eritrócitos de Notothenia coriiceps. Valores médios + EP. da atividade da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa-S-transferase (GST), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) nos eritrócitos de Notothenia coriiceps, expostos as temperaturas de 0°C e 8°C por 1,3 e 6 dias. O número de amostras para cada análise está indicado entre parênteses. Valores expressos em U/mg proteína.
SOD CAT GPX GST GR
0°C – 1 dia 154,59 + 17,27 (9) 3,41 + 0,31 (10) 0,33 + 0,03 (9) 0,08 + 0,01 (8) 0,0031 + 0,0006 (8)
0°C – 3 dias 191,65 + 13,06 (10) 1,67 + 0,20 (10) 0,16 + 0,02 (9) 0,08 + 0,01 (10) 0,0006 + 0,0001 (9)
0°C – 6 dias 239,15 + 51,18 (8) 0,15 + 0,02 (10) 0,11 + 0,01 (9) 0,24 + 0,03 (9) 0,0020 + 0,0003 (8)
8°C – 1 dia 208,83 + 26,05 (9) 0,42 + 0,13 (9) 0,25 + 0,03 (10) 0,09 + 0,01 (9) 0,0103 + 0,0020 (10)
8°C – 3 dias 296,76 + 24,12 (8) 0,16 + 0,02 (9) 0,19 + 0,02 (10) 0,19 + 0,00 (9) 0,0032 + 0,0002 (10)
8°C – 6 dias 216,24 + 17,74 (10) 0,15 + 0,02 (9) 0,11 + 0,01 (10) 0,21 + 0,03 (9) 0,0024 + 0,0002 (9)
Tabela 2: Efeito da temperatura na atividade das enzimas antioxidantes nos eritrócitos de Notothenia rossii. Valores médios + EP da atividade da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa-S-transferase (GST), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) nos eritrócitos de Notothenia rossii, expostos as temperaturas de 0°C e 8°C por 1,3 e 6dias. O número de amostras para cada análise está indicado entre parênteses. Valores expressos em U/mg proteína.
SOD CAT GPX GST GR
0°C – 1 dia 113,05 + 9,15 (8) 0,14 + 0,01 (8) 0,36 + 0,02 (9) 0,12 + 0,01 (9) 0,0016 + 0,0002 (8)
0°C – 3 dias 495,30 + 76,58 (8) 1,00 + 0,12 (8) 0,18 + 0,03 (7) 0,10 + 0,02 (9) 0,0078 + 0,0005 (8)
0°C – 6 dias 126,58 + 18,52 (8) 1,79 + 0,18 (9) 0,18 + 0,02 (8) 0,11 + 0,01 (8) 0,0061 + 0,0006 (8)
8°C – 1 dia 110,97 + 13,61 (8) 0,21 + 0,02 (9) 0,28 + 0,03 (8) 0,14 + 0,02 (9) 0,0026 + 0,0002 (8)
8°C – 3 dias 422,68 + 69,31 (7) 1,97 + 0,31 (8) 0,15 + 0,03 (8) 0,14 + 0,02 (10) 0,0050 + 0,0002 (8)
8°C – 6 dias 406,00 + 43,00 (9) 0,25 + 0,03 (8) 0,20 + 0,01 (9) 0,02 + 0,00 (7) 0,0058 + 0,0010 (9)
43
Tabela 3: Efeito da temperatura nos níveis de glutationa reduzida (GSH) e malonaldeído
(MDA). Valores médios + EP da atividade da enzima glutationa reduzida (U/mg proteina ou [tiois] nmoles. mg proteína
-1) e malonaldeído ([MDA] µmols . gwm
-1) nos eritrócitos de
Notothenia coriiceps (NC) Notothenia rossii (NR) expostos as temperaturas de 0°C e 8°C por 1,3 e 6 dias. NC NR N. coriiceps N. rossii
GSH MDA GSH MDA
0°C – 1 dia 408,15 + 86,37 (8) 3,28 + 0,26 (10) 108,59 + 6,65 (10) 9,11 + 1,13 (9)
0°C – 3 dias 165,78 + 17,91 (10) 8,71 + 0,40 (8) 144,6508 + 29,42 (10) 18,00 + 1,60 (10)
0°C – 6 dias 176,87 + 28,83 (9) 7,20 + 0,64 (10) 133,26 + 24,10 (10) 28,25 + 2,85 (8)
8°C – 1 dia 290,78 + 42,40 (10) 3,75 + 0,33 (5) 134,53 + 15,17 (10) 20,01 + 3,08 (8)
8°C – 3 dias 219,00 + 37,37 (9) 4,85 + 0,33 (7) 116,20 + 17,79 (10) 6,85 + 1,08 (10)
8°C – 6 dias 134,67 + 6,20 (10) 7,91 + 0,86 (10) 99,23 + 13,85 (10) 40,74 + 3,21 (8)
4.3 Alterações Morfológicas
As alterações morfológicas encontradas em eritrócitos de N.coriiceps e
N.rossii podem ser visualizadas nas figuras 14 (ML), 15 (ML), 16 (MEV) e 17
(MET).
Em ambas as espécies, eritrócitos normais considerados como controle,
possuem formato oval a elipsoidal com núcleo central acompanhando o
formato da célula e elétron denso devido ao predomínio de heterocromatina
(Figuras 14A-B e 16A-B). O citoplasma é homogêneo em ML (Figuras 14A-B),
mas, contendo compartimentos limitados por membranas quando visualizados
em MET (Figura 17C). Eritrócitos maduros (Figura 14A-B) e eritrócitos imaturos
ou eritroblastos com formatos celular e nuclear arredondados e cromatina
menos densa (Figura 14C) foram observados tanto em N. coriiceps quanto em
N.rossii, sendo que a proporção entre células maduras e eritroblastos estão
representadas respectivamente nas tabelas 4 e 5.
Qualitativamente, as análises de ML, MET e MEV para ambas as
espécies, tanto para os animais controle (0°C) quanto para os experimentais
(8°C) indicaram a presença de alterações na morfologia celular, onde os
eritrócitos perderam a forma oval original adquirindo formato irregular (Figuras
44
14D; 16E-F; 17D-E-F). Lise celular foi observada, havendo rompimento de
membranas e extravasamento do citoplasma celular (Figuras 16G-H).
Membranas plasmáticas foram alteradas, com ondulações ou saliências
(Figuras 16C; 17G), havendo formação de vesículas (Figuras 14D; 16D; 17H-I )
e deslocamento nuclear para a periferia da célula (Figuras 15A; 17J).
Alterações nucleares, como a presença de micronúleos (Figura 15B), bolhas
nucleares ou “Blebbed”, caracterizado pela perda no formato elipsoidal da
membrana do núcleo, podendo apresentar protuberâncias no núcleo contendo
cromatina (Figura 15C) e núcleo com fissura ou “Notched”, caracterizado por
corte ou invaginação do envelope nuclear (Figuras 15D; 17K) foram
observadas.
Os valores médios e o erro padrão (EP) das alterações morfológicas
observadas neste trabalho estão representados na Tabela 4 para N. coriiceps e
Tabela 5 para N. rossii.
O aquecimento em 8°C não influenciou na proporção de células
maduras e eritroblastos, em ambas as espécies analisadas, mas ao longo do
tempo esta proporção variou somente em N. rossii a 0°C. (Tabelas 4 e 5). A
frequência de eritrócitos apresentando alterações de formato celular (EFC) foi
influenciada pelo aumento da temperatura (8°C) em ambas as espécies
analisadas (Tabelas 4 e 5). Em N. coriiceps em 1 dia a 8°C (16, 30 + 4,63) a
frequência de EFC foi 9,3 vezes maior quando comparada a 0°C (1,75 + 0,94)
enquanto que em 3 dias a 8°C (14,56 + 2,01) a frequência de EFC foi 2,4 vezes
maior quando comparada a 0°C (6,11 + 1,55) (Tabela 4). Em N. rossii em 6
dias a 8°C (3,11 + 0,68) houve aumento de 9,4 vezes na frequência de EFC
quando comparados a 0°C (0,33 + 0,24). Ao longo dos tempos, apenas em N.
rossii a 0°C foi observada diferença na frequência de EFC entre 1 e 6 dias
(Tabela 5).
O aquecimento em 8°C influenciou na frequência de eritrócitos com
formação de vesículas na membrana plasmática (EVM) somente em N.
coriiceps (Tabelas 4 e 5). Em 1 dia a 8°C (63,20 + 7,38) a frequência de EVM
foi 3,3 vezes maior comparado a 1 dia a 0°C (19,38 + 3,35). Em ambas as
espécies, ao longo dos tempos de exposição não foram observadas diferenças
nas frequências de EVM (Tabelas 4 e 5).
45
Em N.coriiceps e N. rossii a frequência de deslocamento nuclear (EDN)
e micronúcleo (Eµ) não foram influenciados pelo aumento da temperatura nem
ao longo do tempo (Tabelas 4 e 5).
A frequência de alterações na morfologia nuclear com bolhas nucleares
ou Blebbed (EBN) foram influenciadas pelo aquecimento em 8°C em ambas as
espécies analisadas (Tabelas 4 e 5). Em N. coriiceps em 3 dias a 8°C (27, 78 +
5,49) a frequência (EBN) foi 3,8 vezes maior quando comparada a 0°C (7,22 +
1,27) enquanto que em 6 dias a 8°C (29,78 + 5,02) a frequência de EBN foi 3
vezes maior quando comparada a 0°C (9,90 + 1,79) (Tabela 4). Em N. rossii a
frequência de EBN em 6 dias a 8°C (27,22 + 1,85) foi 2,2 vezes maior quando
comparada a 0°C (12,33 + 1,55) (Tabela 5). Em ambas as espécies, ao longo
dos tempos de exposição não foram observadas diferenças nas frequências de
EBN (Tabelas 4 e 5).
A frequência de alterações na morfologia nuclear do tipo fissura nuclear
ou “Notched” (EFN) foi influenciada pelo aquecimento em 8°C somente em N.
coriiceps (Tabelas 4 e 5). Em 6 dias a 8°C ( 8,78 + 1,66) a frequência de EFN
foi 3,6 vezes maior quando comparada a 0°C (2,40 + 0,62). Em ambas as
espécies, ao longo dos tempos de exposição não foram observadas diferenças
nas frequências de EFN (Tabelas 4 e 5).
Para ambas as espécies obtiveram-se as medidas do maior eixo celular
e nuclear (µm), menor eixo celular e nuclear (µm) e volume celular e nuclear
(µm³). Em ambas as espécies N. coriiceps (Tabela 6) e N. rossii (Tabela 7) o
aumento da temperatura não influenciou na medida dos eixos e volume celular
e nuclear dos eritrócitos e não houve diferença entre os grupos experimentais
(8°C) e os grupos controles (0°C). Em N. coriiceps 0°C em 1 dia registrou-se
que o menor eixo do eritrócito foi em média 12, 53% e 11,47% maior quando
comparado a 3 e 6 dias, respectivamente. E o volume do eritrócito em 1 dia
0°C foi 25,3% e 19,35% maior quando comparado a 3 e 6 dias,
respectivamente. Em N.rossii o tempo não influenciou na alteração dos
parâmetros analisados.
46
Figura 14: Morfologia de eritrócitos maduros e alterações morfológicas observadas em N.
coriiceps e N. rossii em microscopia de luz. A e B Eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii, respectivamente, a 0°C - 6 dias (considerados controle) (barra = 10 µm). C: Eritroblasto de N. rossii a 8°C – 1 dia (seta larga preta)(barra = 5 µm). D: Eritrócitos de N. rossii a 8°C - 6 dias com alteração na morfologia celular (asteristo) e formação de vesículas de membrana. Vesículas em formação (seta estreita preta) (barra = 10 µm).
47
Figura 15: Alterações morfológicas em eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii observadas em
microscopia de luz. A: Eritrócito de N. coriiceps a 0°C – 6 dias com deslocamento de núcleo (seta vermelha) (barra = 5 µm) B: Eritrócito de N. coriiceps a 8°C - 3 dias com presença de micronúcleo (seta preta fina) (barra = 5 µm). C: Eritrócito de N. coriiceps a 8°C - 3 dias apresentando alteração na morfologia nuclear, em bledd (seta larga). (barra = 10 µm) D: Eritrócito de N. coriiceps a 8°C - 3 dias com fissura nuclear (seta vazada) (barra = 5 µm).
48
Figura 16: Alterações morfológicas em eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii observadas em microscopia eletrônica de varredura. A e B- Eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii, respectivamente, a 0°C por 6 dias (considerados controle). C- Notothenia rossii 0°C – 6 dias: Eritrócito com ondulações ou saliências na membrana (setas finas pretas). D- N. coriiceps 8°C – 6 dias: Eritrócito com formação de vesícula de membrana. Vesículas em formação (seta fina preta). E- N. rossii 8°C – 1 dia e F- N. coriiceps 8°C – 3 dias: Eritrócitos com alteração na morfologia celular (asteristo), com perda do formato elipsoidal. G- N. rossii 8°C – 6 dias e H- N. coriiceps 8°C – 6 dias: Eritrócitos com extravazamento citoplasmático (setas vazadas).
49
Figura 17: Alterações morfológicas em eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii observadas em microscopia eletrônica de transmissão. A- N. coriiceps 0°C – 6 dias e B- N. rossii 0°C – 3 dias: Eritrócitos com morfologia celular e nuclear regulares, considerados controle (barra = 2 µm). C- N. coriiceps 0°C – 1 dia: Citoplasma de eritrócito apresentando compartimentos limitados por membrana (seta vazada) (barra = 0,5 µm). D- N. coriiceps 8°C – 3 dias (barra = 5 µm). E- N. rossii 8°C – 3 dias (barra = 2 µm) e F- N. rossii 8°C – 6 dias (barra = 2 µm): Eritrócito com alterações na morfologia celular (asterisco). G- N. rossii 0°C – 1 dia: Eritrócito com ondulações ou saliências na membrana (seta fina) (barra = 0,5 µm). H- N. rossii 8°C – 3 dias e I- N. rossii 8°C – 6 dias: Eritrócito com formação de vesículas na membrana celular. sendo Vesículas em formação ou sendo liberadas (seta fina) (barra = 0,5 µm). J- N. coriiceps 8°C – 1 dia: Eritrócito apresentando deslocamento nuclear (seta entalhada) (barra = 5 µm).. K- N. coriiceps 8°C – 6 dias: Eritrócito com fissura nuclear (seta entalhada) (barra = 2 µm). L- N. coriiceps 8°C 1 dia:
Eritrócito com núcleo apresentando intensa heterocromatinização (seta entalhada) (barra = 2 µm).
50
Tabela 4: Frequência das alterações morfológicas nos eritrócitos de Notothenia coriiceps, submetidos às temperaturas de 0° e 8°C por 1,3 e 6 dias. Média (+ EP) da proporção entre células maduras e eritroblastos, no número de células maduras, numero de células com alteração na forma celular e da membrana plasmática e alterações nucleares (núcleo deslocado, micronúcleo alterado, em forma de fenda ou disforme) observados em 1000 eritrócitos. O resultado da ANOVA não paramétrica comparando os grupos experimentais é apresentado, os asteriscos sobre o p indicam interações significativas. As letras sobrescritas indicam os resultados do pós-teste entre os tempos para cada temperatura investigada e os asteriscos indicam a diferença entre as temperaturas para cada um dos tempos.
0°C 8°C
Kruskal-Wallis
p
1 dia 3 dias 6 dias 1 dia 3 dias 6 dias
Proporção células maduras (EM) /eritroblastos (EB)
3,22 + 0,30
2,45 + 0,24
3,12 + 0,28
4,11 + 0,64
3,24 + 0,66
3,07 + 0,25
5,72 0,33
Células em maturação (EB) 31,13 + 2,81
23,89 + 2,26
30,20 + 2,62
39,20 + 5,90
31,11 + 6,03
29,78 + 2,32
5,83 0,32
Alteração
celular
Formato (EFC)
1,75 + 0,94*
6,11 + 1,55*
4,90 + 0,57
16,30 + 4,63
14,56 + 2,01
5,89 + 0,56
28,02 <0,001*
Formação de vesículas (EVM)
19,38 + 3,35*
14,56 + 2,05
27,80 + 3,14
63,20 + 7,38
28,44 + 5,31
25,56 + 1,93
30,89 <0,001*
Deslocamento (EDN)
7,13 + 1,73
9,00 + 2,07
12,70 + 3,79
5,20 + 0,70
5,44 + 1,92
7,44 + 1,96
4,97 0,42
Alteração
Nuclear
Micronúcleo (Eµ)
1,00 + 0,38
0,67 + 0,29
0,20 + 0,13
1,10 + 0,43
0,75 + 0,30
0,63 + 0,35
4,51 0,48
Bolha nuclear ou Blebbed (EBN)
20,63 + 2,85
7,22 + 1,27*
9,90 + 1,79*
21,70 + 2,44
27,78 + 5,49
29,78 + 5,02
27,36 <0,001*
Fissura nuclear (EFN)
5,38 + 0,53
2,67 + 0,87
2,40 + 0,62*
5,80 + 1,12
7,67 + 1,86
8,78 + 1,66
17,10 <0,001*
51
Tabela 5: Frequência das alterações morfológicas de eritrócitos de Notothenia rossii, submetidos às temperaturas de 0° e 8°C por 1, 3 e 6 dias. Média (+ EP) da proporção entre células maduras e eritroblastos, no número de células maduras, numero de células com alteração na forma celular e da membrana plasmática e alterações nucleares (núcleo deslocado, micronúcleo alterado, em forma de fenda ou disforme) observados em 1000 eritrócitos. O resultado da ANOVA não paramétrica comparando os grupos experimentais é apresentado, os asteriscos sobre o p indicam interações significativas. As letras sobrescritas indicam os resultados do pós-teste entre os tempos para cada temperatura investigada e os asteriscos indicam a diferença entre as temperaturas para cada um dos tempos.
0°C 8°C
Kruskal-Wallis
p
1 dia 3 dias 6 dias 1 dia 3 dias 6 dias
Proporção células maduras (EM)/eritroblastos(EB)
3,55 + 0,40
a 2,09 + 0,19
b 1,74 + 0,12
b
3,19 + 0,40
2,79 +0,13
2,75 +0,38
24,95 <0,001*
Células em maturação 34,17 + 3,74
a
20,44 + 1,77
b
17,11 + 1,17
b
30,78 + 3,72
27,10 +1,24
26,67 +3,58
24,95 <0,001*
Alteração celular
Formato(EFC) 4,17 + 0,48
a
0,89 +0,20
ab
0,33 + 0,24
b *
5,11 + 1,65
3,40 +0,79
3,11 +0,68
26,62 <0,001*
Formação de vesículas (EVM)
28,83 + 3,96
22,56 + 2,76
18,89 + 1,79
35,78 + 3,90
26,10 +0,98
43,33 +4,11 26,71 <0,001*
Deslocamento 6,00
+ 2,97 4,44 + 1,28
5,00 + 2,19
7,33 + 2,12
5,80 +0,94
2,78 +0,55
6,79 0,24
Alteração Nuclear
Micronúcleo 0,33 + 0,21
0,00 0,22 + 0,22
1,22 + 0,43
0,40 +0,16
1,44 +0,85
12,98 0,02*
Bolha nuclear ou Blebbed (EBN)
13,17 + 3,66
10,67 + 1,24
12,33 + 1,55 *
18,33 + 2,40
15,40 +1,84
27,22 + ,85 23,66 <0,001*
Fissura nuclear (EFN)
2,83 + 0,95
2,44 + 0,77
2,67 + 0,83
7,22 + 2,40
4,00 +0,67
2,44 +1,43
13,12 0,02*
52
Tabela 6: Medida de maior eixo, menor eixo e volume celular e nuclear de eritrócitos de Notothenia coriiceps, submetidos às temperaturas de 0° e 8°c por 1,3 e 6 dias. São apresentados a média + EP (mínimo-máximo) e número de indivíduos dos eixos maior e menor da célula e do núcleo do eritrócito e volume celular e nuclear. O resultado da ANOVA duas vias (co-fatores utilizados tempo (t) e temperatura (te)) comparando os grupos experimentais são apresentados, os asteriscos indicam interações significativas e as letras sobrescritas indicam os resultados do pós-teste Tukey entre os tempos para cada temperatura e os asterisco indicam a diferença entre as temperaturas para cada um dos tempos investigados.
0°C 8°C ANOVA
1 dia 3 dias 6 dias 1 dia 3 dias 6 dias F P
Eritrócito
Maior eixo 12,42 + 0,04
(8,01–19,05) 1785
12,11 + 0,03 (6,96-17,56)
2482
12,84 + 0,03 (6,52-18,20)
2239
12,82 + 0,03 (7,19-19,30)
2250
12,40 + 0,03 (7,54-17,94)
2233
12,14 + 0,03 (7,12-19,06)
2225
T: 0,00 TE: 1,10 TXTE: 2,80
0,98 0,34 0,07
Menor eixo 9,41 + 0,03A
(6,06-13,52) 1785
8,23 + 0,02 B
(4,30-11,75)
2500
8,33 + 0,02 B
(4,45-11,78)
2250
8,72 + 0,02 (5,48-12,40)
2250
8,64 + 0,02 (4,23-12,16)
2250
8,21 + 0,03 (4,08-11,97)
2250
T: 0,52 TE: 6,56 TXTE: 2,89
0,47 0,00* 0,06
Volume 589,4 + 4,1 A
(168,7-1307,2)
1777
440,2 + 2,9 B
(99,2-
1120,0) 2482
475,4 + 3,0 AB
(110,0-1106,0)
2239
521,0 + 3,3 (169,7-1391,4)
2250
490,6 + 2,7 (116,2-1074,8)
2233
438,1 + 3,0 (97,7-1021,7)
2225
T: 0,56 TE: 6,64 TXTE: 2,28
0,46 0,03* 0,11
Núcleo do eritrócito
Maior eixo 5,88 + 0,02 (3,48-12,87)
1793
5,48 + 0,02 (2,73-10,95)
2500
5,90 + 0,02 (3,40-8,88)
2250
5,93 + 0,02 (2,27-8,98)
2250
5,83 + 0,02 (3,34-13,53)
2248
5,46 + 0,02 (3,02-9,23)
2250
T: 0,00 TE: 2,11 TXTE: 5,00
0,95 0,13 0,01*
Menor eixo 3,43 + 0,02 (1,09-11,41)
1790
3,07 + 0,01 (1,00-5,87)
2495
3,17 + 0,02 (0,91-6,06)
2245
3,37 + 0,01 (0,98-5,83)
2250
3,30 + 0,02 (1,37-8,91)
2250
3,08 + 0,02 (1,00-6,08)
2248
T: 0,19 TE: 4,79 TXTE: 2,01
0,67 0,01* 0,14
Volume 38,62 + 0,54 (6,16-378,83)
1785
29,05 + 0,31 (3,26-97,43)
2488
33,60 + 0,40 (3,96-141,25)
2239
37,45 + 0,37 (4,63-114,87)
2243
34,67 + 0,35 (4,73-217,99)
2245
29,03 + 0,33 (2,55-116,85)
2246
T: 0,00 TE: 4,43 TXTE: 2,44
0,98 0,02* 0,10
53
Tabela 7: Medida de maior eixo, menor eixo e volume celular e nuclear de eritrócitos de Notothenia rossii, submetidos às temperaturas de 0° e 8°c por
1,3 e 6 dias. São apresentados a média + ep (mínimo-máximo) e número de indivíduos dos eixos maior e menor da célula e do núcleo do eritrócito e volume celular e nuclear. O resultado da ANOVA não paramétrica comparando os grupos experimentais são apresentados, os asteriscos indicam interações significativas e as letras sobrescritas indicam os resultados do pós-teste entre os tempos para cada temperatura e os asteriscos indicam a diferença entre as temperaturas para cada um dos tempos investigados.
0°C 8°C
Kruskal-Wallis
P
1 dia 3 dias 6 dias 1 dia 3 dias 6 dias
Eritrócito
Maior eixo 14,72 + 0,04
(10,67–21,79) 1363
15,14 + 0,13 (1,83-72,33)
2095
14,06 + 0,03 (9,18-18,54)
2398
13,96 + 0,07 (1,20-20,30)
991
13,75 + 0,03 (8,57-18,63)
2250
13,00 + 0,06 (8,43-20,39)
1065 21,80 <0,001*
Menor eixo 9,66 + 0,04 (4,11-13,26)
1357
9,18 + 0,03 (1,31-14,39)
2100
9,43 + 0,02 (1,96-13,47)
2396
9,16 + 0,05 (4,48-13,28)
990
8,71 + 0,02 (5,28-12,85)
2247
9,40 + 0,05 (5,12-13,77)
1069 12,29 0,03*
Volume 734,1 + 5,9 (121,3-1833,9)
1357
688,2 + 8,3 (19,5-
5074,7) 2094
670,0 + 3,9 (35,4-1480,5)
2393
640,53 + 8,3 (190,3-1465,1)
989
554,7 + 3,3 (172,4-1276,3)
2247
630,6 + 8,2 (115,6-1846,7)
1064
13,57 0,02*
Núcleo do eritrócito
Maior eixo 5,75 + 0,03 (2,01-8,88)
1363
5,78 + 0,02 (1,01-13,02)
2099
5,72 + 0,02 (3,25-8,66)
2400
5,96 + 0,03 (3,13-9,27)
991
5,83 + 0,02 (3,18-10,02)
2249
5,40 + 0,04 (2,86-12,13)
1070 3,28 0,66
Menor eixo 3,18 + 0,02 (0,93-6,38)
1363
3,08 + 0,02 (0,91-5,67)
2100
3,12 + 0,01 (0,92-5,40)
2400
3,18 + 0,02 (1,46-5,66)
991
3,37 + 0,02 (0,81-8,96)
2249
3,22 + 0,03 (1,5-11,2)
1070 7,38 0,19
Volume 32,10 + 0,41 (3,05-107,97)
1363
30,38 + 0,34 (2,41-
114,57) 2099
30,70 + 0,28 (1,99-85,24)
2399
33,90 + 0,56 (6,72-116,31)
991
38,47 + 0,62 (1,94-333,17)
2248
33,06 + 0,75 (4,97-204,85)
1069 7,53 0,18
54
5. DISCUSSÃO
Os eritrócitos são células sensíveis ao estresse oxidativo (CIMEM, 2008;
HUA-TAO LI el al, 2013), por desempenharem papel central no transporte de
O2 e CO2. O citoplasma dos eritrócitos apresenta concentrações elevadas de
ferro e oxigênio, que em combinação podem gerar espécies reativas de
oxigênio (EROs) (HUA-TAO LI el al., 2013). Estudos indicam que os eritrócitos
possuem mecanismos responsáveis pela defesa frente à formação de ânion
superóxido, em consequência das altas concentrações de oxigênio que é
transportado por essas células (HOLETON, 1970; CASSINI et al. 1993).
Embora a geração de EROs seja parte integrante do metabolismo, pois atuam
em várias vias de sinalização celular (IMAI e NAKAGAWA, 2002, GRIM et al.,
2013), fatores abióticos externos podem alterar a homeostase redox do
organismo gerando o estresse oxidativo (BAGNYUKOVA, 2006), que pode
ocasionar danos ás moléculas biológicas (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007;
GRIM et al., 2013). Estudos com peixes e invertebrados marinhos
demonstraram que a aclimatação a temperaturas mais elevadas,
principalmente de maneira aguda, resulta em danos oxidativos (PARIHA e
DUBEY, 1995; ESTEVEZ et al., 2002;. LUSHCHAK e BAGNYUJOVA, 2006,
MUELLER et al., 2012; GRIM et al., 2013). Quando isso acontece, é necessária
a rápida remoção das EROs, pelos componentes enzimáticos e não
enzimáticos do sistema de defesa antioxidante (JOS et al., 2005; HUA-TAO LI
el al., 2013).
Neste trabalho, investigamos se eritrócitos de N. coriiceps e N. rossii,
duas espécies endêmicas da Antártica, sofrem alterações na morfologia celular
e possuem a capacidade de passar por ajustes no metabolismo oxidativo e de
defesas antioxidantes frente ao aumento da temperatura ambiental. A
temperatura de 0°C foi escolhida como controle por estar dentro da faixa média
de variação térmica do Oceano Austral (SIDELL, 2000) e da Baía do
Almirantado, local de coletas das espécies utilizados neste trabalho. A
temperatura de 8°C é uma condição próxima à máxima térmica tolerada pelos
55
peixes antárticos (SOMERO e DEVRIES, 1967; PÖRTNER et al. 2004; LOWE
e DAVISON, 2005).
Os padrões de resposta e os perfis ao longo do tempo dos níveis de
atividade das enzimas antioxidantes de eritrócitos ao aumento da temperatura
ambiental foram diferentes entre N. coriiceps e N. rossii. Isto pode ser
explicado por diferenças fenotípicas espécie – específicas descritas para
peixes teleósteos, (MARTÍNEZ- ALVAREZ et al, 2005; GRIM et al., 2011;
VINAGRE et al , 2012; GRIM et al., 2013; MADEIRA et al., 2013). AKSNES e
LEIF (1981), ao analizarem, nove espécies de peixes da costa norueguesa,
verificaram que a atividade de SOD, CAT e GPx pode variar de acordo com a
espécie e o tecido analisado, sendo que os níveis de CAT variaram até quatro
vezes na mesma família de peixes. WDZIECZAK et al.(1981), obtiveram
valores significativamente diferentes das atividades de SOD e CAT em
eritrócitos de sete espécies de peixes de água doce e quatro marinhas
coletados diretamente da natureza.
Há poucos estudos avaliando o efeito da temperatura no sistema de
defesa antioxidante de organismos marinhos, sendo que as informações
disponíveis envolvem geralmente invertebrados (WISTON et al., 1990; ABELE
et al., 2002; PARK et al., 2008; KELLER et al., 2004; BROUWER et al., 2003).
Para peixes ainda são excassas as referências disponíveis (VINAGRE et al.,
2012), e não há relato do comportamento do metabolismo oxidativo e seus
marcadores, analisados neste trabalho, frente ao aumento da temperatura em
eritrócitos de peixes antárticos. No entanto, outros marcadores foram utilizados
e a aclimatação e a tolerância térmica de organismos antárticos a temperaturas
elevadas têm sido estudadas (SOMERO e DEVRIES, 1967; BRAUER et al.,
2005; LOWE et al., 2005; LANNIG et al., 2005; BRODTE et al., 2006; JIN e
DEVRIES 2006; CLARKE et al., 2007; FRANKLIN et al., 2007; CLARK e PECK,
2009; BILYK e DEVRIES, 2011; WINDISCH et al., 2011, JAYASUNDARA,
2013).
SOD e CAT são enzimas importantes no combate à EROs em
organismos aquáticos (WINSTON e GIULIOZ, 1991; HUA-TAO LI el al., 2013).
A SOD catalisa a dismutação de O2• em H2O2, sendo este último decomposto
pela CAT em O2 e H2O2 (VASCONCELOS et al., 2007), assim as duas enzimas
56
atuam associadas metabolicamente (AEBI, 1984). A SOD é uma metaloenzima
e algumas isoformas estão bem estabelecidas em peixes antárticos (CASSINI
et al., 1997; KEN et al., 2002; SANTOVITO et al., 2006). Acredita-se que essa
família de metaloenzimas evoluiu para manter-se cataliticamente ativa, mesmo
frente aos desafios de pressão térmica (CASSINI et al., 1997; ABELE e
PUNTARULO, 2004; LESSER, 2006).
Os níveis de SOD em eritrócitos de N. rossii, coletados da natureza, são
aproximadamente de 240 U/mg proteína (ANSALDO et al., 2000) enquanto que
no presente estudo variaram de 113,05 + 9,15 a 495,30 + 76,58 U/mg
proteínas, não possibilitando comparação devido as condições experimentais
envolvidas. Para N. coriiceps os níveis basais encontrados na natureza não
são documentados. O aquecimento em 8°C não alterou os níveis de atividade
da SOD em eritrócitos de N. coriiceps enquanto que em N. rossii modulou
positivamente. Apesar, de trabalharem com outros tipos celulares e tecidos,
MULLER et al. (2012) ao analisarem tecidos cardíaco e muscular de N.
coriiceps e outras espécies de peixes antárticos também não encontraram
alteração nos níveis de SOD ao expor os animais a sua temperatura crítica
máxima (CTMax). Em peixes não antárticos, a não modulação da SOD foi
observada por BAGNYKOVA (2007) em cérebro, fígado e rins do peixe de
água doce Carassius auratus transferidos de 3°C para 23°C por até 5 dias e
por GRIM et al. (2010) no músculo cardíaco das espécies marinhas Fundulus
heteroclitus macrolepidotus e Lepomis macrochirus mantidos em 25°C durante
dois meses. A modulação positiva da SOD em peixes de água doce foi
verificada por PARIHAR et al. (1997) nas brânquias de Heteropneustes fossilis
transferidos de 25°C para 32°C ou 37°C por até 4 horas e por LUSHCHAK
(2006) nos rins, cérebro e músculo de C. auratus, exposto a 35°C durante 1-12
horas. Estes estudos, como os resultados encontrados por nós, sugerem que
a modulação da SOD frente ao aumento da temperatura pode estar
relacionada ao tempo de exposição. Neste trabalho, não analisamos os níveis
de SOD nas horas iniciais do aquecimento a 8°C, isto é, antes de 24 horas, no
entanto, nossos resultados indicam que, para N.rossii seis dias é tempo
suficiente para que ocorra a modulação positiva da SOD frente ao aquecimento
a 8°C enquanto que para N.coriiceps não, o que pode indicar que os eritrócitos
57
desta espécie não foram capazes de aumentar a expressão de SOD frente ao
desafio térmico, ou que o aumento da temperatura pode ter prejudicado a
atividade da enzima, levando ao maior acúmulo de radicais O2• na célula.
Os níveis de CAT em N. coriiceps foram modulados negativamente
frente ao estresse térmico, enquanto que em N. rossii houve inicialmente
aumento (modulação positiva) seguido de queda (modulação negativa) na
atividade da CAT. Resultados semelhantes foram encontrados por VINAGRE et
al. (2012) em músculo do peixe marinho Dicentrarchus labrax exposto a 18°C
(controle), 24°C e 28°C (experimentais) por até 30 dias. A resposta ao
estresse oxidativo, para a CAT pode ser dependente do tempo de exposição à
temperaturas elevadas, sendo menor fora do ótimo de temperatura para a
espécie (VINAGRE et al. 2012), como o observado neste trabalho para N.
coriiceps em todos os tempos analisados. Estes dados sugerem que N.
coriiceps é mais suceptível ao aumento da temperatura quando comparado a
N. rossii que apresentou níveis menores de CAT somente em 6 dias. Já,
trabalhos com peixes aclimatados a altas temperaturas e a curto período de
tempo (inferior a 24 horas) os resultados encontrados são diferentes.
MUELLER et al. (2012), não verificaram modulação dos níveis de CAT no
coração e músculo em N. coriiceps exposta a sua CTMax que foi de 17,1 ± 0,2
°C durante 4,5 horas e por LUSHCHAK (2006) em figado de C. auratus, onde
houve diminuição de 40% nos níveis de CAT após 1 hora de choque térmico
retornando ao nívies iniciais após 6 horas. BAGNYKOVA (2006) verificou em C.
auratus, coletados na natureza, que a atividade da CAT não foi alterada ao
longo do inverno e verão, sugerindo que talvez as EROs geradas pelo aumento
da temperatura possam ter sido neutralizadas pelas defesas antioxidantes não
enzimáticas e que a não modulação da CAT esteja associada à sua localização
intracelular em peroxissomas. BENEDETTI (2010) analisou o efeito da
sazonalidade sobre os níveis da CAT no fígado de três nototenídeos antárticos
do gênero Trematomus e verificou que a atividade da CAT nos peixes
antárticos é menor do que em peixes de clima temperado e que a capacidade
de decompor peróxido de hidrogênio via CAT não é reforçada em peixes
antárticos. FRIDOVICH (1974), sugeriu que a CAT não é regulada de acordo
58
com a necessidade da célula, ou seja, não haveria aumento na expressão da
enzima, mesmo com o aumento intracelular de peróxidos.
GPx, GST e GR são enzimas antioxidantes dependentes de GSH e
estão relacionadas principalmente a biomarcadores para poluição ambiental,
exposição a xenobiontes e metais pesados em peixes tropicais (BAINY et al.,
1996; STEGEMAN et al., 1992, LACKNER, 1998) e antárticos (BENETTI et al.
2007; GHOSH et al. 2013). Porém esses marcadores já foram utilizados para
avaliar estresse oxidativo induzido pelo estresse térmico em peixes tropicais e
temperados (HEISE at al., 2006; BAGNYUKOVA et al., 2007; LEGGATT et al.,
2007; GRIM et al., 2013).
A GPx é uma selenoproteína que reduz hidroperóxidos (H2O2) a água
(H2O) e oxigênio (O2) convertendo GSH em GSSG (BRIGELIUS-FLOHE,
1999). A GST catalisa a conjugação de GSH a metabólitos tóxicos facilitando a
excreção destas substâncias (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999), além de
serem importantes para a desintoxicação dos peróxidos lipídicos (RUDNEVA et
al., 2010). A GR é uma flavoproteína dependente de NADPH, importante no
metabolismo oxidativo pois recupera glutationa oxidada para a forma reduzida
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999), sendo esta recuperação importante pois
mantém ativo e integro o sistema celular de proteção antioxidante
(VASCONCELOS et al., 2007).
Em N. coriiceps e N. rossii, o aquecimento em 8°C não influenciou a
atividade de GPx. Resultados semelhantes foram obtidos por GRIM et al.
(2013) em músculos cardíaco e esquelético de robalo (Morone saxatilis)
aclimatados a 25°C por seis semanas. LEGGATT (2007) submeteu linhagens
de células hepáticas (RTH-149) do peixe de água doce Oncorhynchus mykiss a
alterações de temperatura e verificou que a atividade da GPx não é modulada
pela temperatura. Brânquias e glândula digestiva do molusco antártico
Lanternula elliptica aumentaram sua atividade de GPx após doze horas de
estresse térmico (PARK et al., 2008). Estudos indicam que peixes antárticos
apresentam níveis mais elevados de defesas antioxidantes quando
comparados a peixes tropicais (GRIM et al., 2013) e análises de microarranjo
revelaram que a GPx é up-regulada em tecidos de notothenídeos antárticos
quando comparados à peixes de clima temperado (CHEN et al., 2008). O que
59
pode explicar a não modulção da enzima sob estresse oxidativo, em N.
coriiceps e N. rossii, no presente estudo.
Nos eritrócitos de N. coriiceps a temperatura de 8°C modulou
positivamente a atividade de GST em 3 dias enquanto que em N. rossii
modulou negativamente em 6 dias. RUDNEVA et al. (2010), ao analisarem
espécies de peixes teleósteos e elasmobrânquios descreveram que a atividade
de GST em eritrócitos é inferior aos valores encontrados no fígado e que há
diferenças interespecíficas na atividade da GST nos eritrócitos. Ao induzirem o
estresse térmico, em peixes marinhos, MADEIRA et al. (2013) verificaram
aumento na atividade de GST muscular, após exposição a sua CTMáx e
concluíram que embora o aumento tenha sido registrado, é possível observar a
depleção da atividade do antioxidante devido à desnaturação da proteína,
sendo a hipertermia capaz de reduzir as defesas antioxidantes. O aumento leve
de estresse oxidativo é capaz de induzir o aumento da atividade de GST, mas
em casos de forte estresse oxidativo a enzima pode ter sua atividade suprimida
(LI el al., 2010), o que pode ter ocorrido em N.rossii especificamente neste
caso, onde houve redução da GST frente ao estresse térmico quando
comparada ao controle.
O aumento da temperatura (8°C) modulou positivamente os níveis de
GR somente em N. coriiceps em 1 e 3 dias. Estes resultados podem estar
diretamente ligados a não modulação de GSH, em N. coriiceps, pois o aumento
da atividade da GR seria capaz de manter os níveis de GSH. Entretanto, são
necessários estudos complementares, pois mesmo sem a modulação da GR
em N. rossii não se observou queda nos níveis de GSH. Estes resultados
podem estar relacionados à ação de múltiplos sistemas alternativos presentes
no citosol do eritrócito capazes de reduzir GSSG e manter os níveis de GSH
suficientemente altos frente ao estresse oxidativo (MORGAN et al., 2012). A
GSH é um antioxidante não enzimático de baixo peso molecular, importante
por neutralizar EROs e servir de cofator para várias enzimas GSH -
dependentes (HALLIWELL e GUTTERIGDE, 2007; GRIM et al., 2013). Assim a
GSH é utilizada como biomarcador para estresse oxidativo induzido
principalmente por contaminação ambiental (ATLI e CANLI, 2008; ZANG et al.,
2008), sendo que a diminuição na concentração de GSH indicaria estresse
60
agudo e o aumento da adaptação à detoxificação (VAN DER OOST et al.,
2003). Em eritrócitos uma das funções de GSH é proteger a célula contra a
formação espontânea de metahemoglobina (CIMEN, 2008). Se esgotados de
GSH os eritrócitos tornam-se muito sensíveis ao estresse oxidativo (LI et al.,
2006).
Os eritrócitos de peixes, assim como de outros vertebrados, são células
suceptíveis à peroxidação lipídica (LPO), pois apresentam alto conteúdo de
ácidos graxos polinsaturados em sua membrana e à presença de hemoglobina.
Acredita-se que a maior causa de hemólise seja a desnaturação oxidativa da
membrana de eritrócitos por LPO (LACKNER, 1998). A LPO pode ser explicada
como uma reação em cadeia iniciada pela reação de um radical livre (um
oxigênio molecular) com um ácido graxo insaturado, resultando em radicais
peroxilas (BENZIE, 1996; HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999; LIMA e
ABDALLA, 2001), que podem reagir com o DNA, e outras moléculas biológicas
(GUTTERIDGE, 1995). A LPO pode ainda afetar membranas biológicas,
diminuindo a fluidez, alterando potencial de membrana e permeabilidade,
ocasionando eventualmente a ruptura da estrutura (GUTTERIDGE, 1995;
DUTRA et al., 2008). O presente estudo avaliou através dos níveis de
malonaldeído (MDA), um dos produtos finais da peroxidação lipídica, os
indicies de LPO. O aumento dos níveis de MDA foi detectado nos peixe
antártico Pleuragrama antarcticum, no início da primavera austral, quando as
condições pró-oxidativas aumentam (REGOLI et al., 2005). Em um estudo
comparativo entre icefishes e notothenídeos submetidos a CTMax, o aumento
nos níveis de MDA no músculo cardíaco, só foi verificado no primeiro grupo
(MUELLER et al., 2012). Em ambas as espécies deste trabalho, houve
modulação negativa dos níveis de MDA em 8°C a 3 dias, e em N. coriiceps
este resultado pode estar associado, de forma positiva com os níveis de GST,
já que esta enzima é responsável pela remoção dos produtos da
lipoperoxidação (HERMES-LIMA, 2004; BAGNYUKOVA et al. 2006), assim o
aumento nos níveis de GST a 8°C em 3 dias pode ter influenciado na
modulação negativa de MDA. Já em N. rossii a modulação positiva dos níveis
de MDA a 8°C em 1 dia, pode indicar estado de estresse oxidativo devido ao
aumento da temperatura por choque térmico. Pode haver associação entre os
61
níveis de MDA e GST ao longo dos tempos de exposição em 8°C, já que os
níveis de MDA aumentaram quando comparamos 3 e 6 dias, e os níveis de
GST diminuíram quando comparamos os mesmos tempos, o que pode indicar
que sob a temperatura de 8°C a enzima não foi capaz de metabolizar o
excesso de MDA.
Alterações na morfologia celular e nuclear dos eritrócitos estão
relacionadas a distúrbios que alteram sua homeostase (TAVARES-DIAS e
MORAES, 2004). Os radicais livres em excesso são capazes de promover, nos
eritrócitos de peixes, degradações no DNA e LPO que danificam membranas
celulares, causando danos irreversíveis que podem levar à apoptose (CIMEN,
2008).
Alterações nos parâmetros hematológicos podem variar de acordo com
a capacidade que a espécie possui de enfrentar os desafios térmicos (QIANG
et al., 2013). Estudos indicam que a elevação da temperatura é capaz de
aumentar o número de eritrócitos na circulação de peixes (GUIJARRO et ai.,
2003; DE PEDRO et ai., 2005). O aumento do número de eritroblastos
(eritrócitos imaturos) na circulação indica maior atividade eritropoiética que
pode ser estimulada diretamente pela carência de oxigênio (HOUSTON e
MURRAD, 1992). O aumento da temperatura diminui a concentração de O2 na
água e causa hipóxia, e consequentemente ocorre aumento da atividade
eritropoiética em peixes visando melhorar o aporte de oxigênio aos tecidos
(HOUSTON e MURRAD, 1992; VALENZUELA et al., 2002; WELLS et al.,
2005). HOUSTON e MURAD (1991) verificaram que o estresse térmico por
aclimatação lenta ou choque térmico em C. auratus aumentou o número de
eritroblastos na circulação, indicando maturação acelerada. Neste trabalho, o
aquecimento em 8°C, em ambas as espécies não alterou a frequência de
eritroblastos e a proporção de células maduras e eritroblastos, indicando que
N. coriiceps e N. rossii, foram capazes de enfrentar o estresse térmico sem
aumento da atividade eritropoiética.
A alteração de forma dos eritrócitos foi influenciada pelo aumento da
temperatura (8°C) em ambas as espécies, ocorrendo alterações do formato
celular com maior frequência nos tempos iniciais (1 e 3 dias) em N. coriiceps e
em 6 dias em N. rosii. Alterações no formato de eritrócitos estão relacionadas a
62
macromoléculas celulares constituintes do citoesqueleto, dentre elas,
filamentos de actina, abundantes nestas células (CIMA e BALLARIN, 1999,
OLIVEIRA-RIBEIRO et al., 2006). ANBUMANI e MOHANKUMAR (2012)
sugerem que essas alterações no formato celular acarretam perda de conteúdo
citoplasmático e antecedem eventos apoptóticos.
A frequência de eritrócitos com formação de vesículas na membrana
plasmática (EVM) foi influenciada pelo aumento da temperatura (8°C) e foi
observada somente em N. coriiceps. A formação de vesículas na membrana
plasmática de eritrócitos é muito estudada em humanos (GREENWALT, 2006).
Em peixes WONG et al. (2012) foram os primeiros a descrever essa alteração
em eritrócitos de Sparus sarba, e embora os marcadores de fragmentação
nuclear e ativação de caspases tenham indicado processos de morte celular,
corpos apoptóticos não foram visualizados. A formação de vesículas ocorreria
pelo enfraquecimento do citoesqueleto em determinadas áreas (WONG et al.,
2012), e o fluxo citoplasmático nestas regiões formaria as saliências (TAYLOR
et al., 2008) vistas em microscopia, como o observado neste trabalho.
As análises do volume celular têm por objetivo avaliar a perda de
conteúdo citoplasmático ou nuclear. O aumento do volume celular pode sugerir
a perda de hemoglobina, ou alterações do grupo heme, assim o aumento da
área de trocas gasosas, ocasionada pelo aumento do volume, compensaria
essa perda (CIMA e BALLARIN, 1999; OLIVEIRA-RIBEIRO et al., 2006). Em
mamíferos há estudos que relacionam a alteração de volume celular com
hipertermia, já que o aumento da temperatura estimularia a entrada de Ca2+ e o
aumento deste íon no citosol, induz a formação de vesículas (FOLLER et al. ,
2010). A entrada de Ca2+, provoca ainda a perda citosólica de K+ e Cl o que
leva a célula a perder água e diminuir seu volume (FOLLER et al. , 2010;
MOORE et al., 2013). Mas, em peixes, estudos indicam que alterações de
volume podem estar relacionadas a contaminantes, como por exemplo, os
metais pesados (OLIVEIRA-RIBEIRO et al., 2006). Para as espécies
analisadas o aumento da temperatura não acarretou em alterações nos
volumes celular e nuclear. Entretanto estudos complementares são
necessários, para melhor compreender as alterações de volume e suas
63
relações com formação de vesículas, observadas neste trabalho, frente ao
estresse térmico.
As alterações na morfologia nuclear de eritrócitos podem indicar
impactos ambientais sobre os organismos (CARRASCO et al., 1990;
TALYKINA et al., 2003; SOUZA e FONTANETTI, 2006; DA SILVA et al.,2012).
O deslocamento de núcleo para a periferia da célula (EDN), por exemplo, é um
tipo de alteração citoplasmática, que está envolvida com o processo de
denucleação e consequentemente à formação de células anucleadas
(ANBUMANI e MOHANKUMAR, 2012). Embora essa alteração tenha sido
registrada no presente estudo, não houve diferenças nas frequências de EDN
por influência do aumento da temperatura em N. coriiceps e N. rossii.
Estudos recentes ressaltam a importância da análise de outras
alterações nucleares além da presença de micronúcleo (BOLOGNESI et al.,
2006; OSMAN et al., 2011; ANBUMANI e MOHANKUMAR, 2012), indicando
correlação entre elas (OSMAN e HARABAWY , 2010). Embora os processos
que levam à formação de tais alterações não estejam bem estabelecidos
(ANBUMANI e MOHANKUMAR, 2012), acredita-se que mutações na lâmina
nuclear (filamento intermediário, constituinte estrutural do envoltório nuclear)
sejam responsáveis pela perda do formato oval e estabilidade do envelope
nuclear (ALBERTS et al., 1997; STRUNJAK-PEROVIC et al., 2009; ANBUMANI
e MOHANKUMAR, 2012). Os processos celulares intrínsecos que levam à
formação de micronúcleos são conhecidos e resultam da fragmentação do
material genético (efeito clastogênico) ou de falhas na formação do fuso
mitótico levando à eliminação de cromossomos inteiros (efeito aneugênico)
(LAU et al., 2007). Agentes químicos, físicos ou biológicos induzem a formação
de micronúcleos (SOUZA e FONTANETTI, 2006; DA SILVA et al.,2012).
Estudos indicam que as demais alterações nucleares registradas no presente
estudo possuem origem semelhante ao micronúcleo (FENECH et al., 1999;
FENECH, 2000; SERRANO e GARCIA, 2001; ÇAVAS e ERGENE-
GOZUKARA, 2003), e a formação destas alterações nucleares possibilitariam a
eliminação e inativação do material genético danificado da célula (SOUZA e
FONTANETTI, 2006). A temperatura de 8°C não influenciou a presença de
micronúcleos, mas aumentou a frequência de bolhas nucleares ou Blebbed
64
(EBN) em N. coriiceps (3 e 6 dias) e N. rossii (6 dias). NORMANN et al., (2010)
verificaram maior frequência de alterações nucleares, como bolhas e fissuras,
do que presença de micronúcleo, em eritrócitos de peixes de água doce e
sugeriram que tais resultados estariam relacionados à exposição aguda ao
contaminante. Assim, o aumento na frequência de alterações nucleares estaria
relacionado à exposição aguda ao agente estressor, indicando células
apoptóticas (ANBUMANI e MOHANKUMAR, 2012). Exposições prolongadas ao
agente estressor permitiriam substituições celulares (MURANLI e GUNER,
2011) ou reparos aos danos celulares (ANBUMANI e MOHANKUMAR, 2012).
65
6. CONCLUSÃO
Em ambas as espécies N. rossii e N. coriiceps, espécies
filogeneticamente muito próximas (NEAR e CHENG, 2008), os padrões
de resposta frente ao aumento da temperatura ambiental foram
diferentes;
Em N. coriiceps o aumento da temperatura a 8°C modulou
a atividade de CAT, GST, GR e LPO;
Em N. rossii o aumento da temperatura a 8°C modulou a
atividade de SOD, CAT, GST e LPO;
Para N. coriiceps os marcadores: SOD, GPX e GSH podem
não ser indicados para avaliar estresse oxidativo por aumento da
temperatura;
Para N. rossii os marcadores: GPX, GR e GSH podem não
ser indicados para avaliar estresse oxidativo por aumento da
temperatura;
Em N. coriiceps o aumento da temperatura a 8°C
influenciou na frequência das seguintes alterações celulares: alteração
de formato celular, formação de vesículas, bolha nuclear e fissura
nuclear;
Em N. rossii o aumento da temperatura a 8°C influenciou
na frequência das seguintes alterações celulares: alteração de formato
celular e bolha nuclear;
Embora sejam necessários estudos complementares, os
eritrócitos podem fornecer material para monitoramento do impacto do
aquecimento global, sem que haja prejuízo para a espécie estudada,
visto que não há necessidade de sacrifício do animal;
66
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABELE, D.; BURLANDO, B.; VIARENGO, A.; PORTNER, H. O.. Exposure to elevated temperatures and hydrogen peroxide elicits oxidative stress and antioxidant response in the Antarctic intertidal limpet Nacella concinna. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, v. 120, n. 2, p. 425-435, 1998. ABELE, E. M., PUNTARULO, D.: Lipid radical generation in polar (Laternula elliptica) and temperate (Mya arenaria) bivalves. Comp. Biochem. Physiol, B v.132, p. 729–737, 2002. ABELE, D., PUNTARULO, S.: Formation of reactive species and induction of antioxidant defence systems in polar and temperate marine invertebrates and fish. Comp. Biochem. Physiol. A, v. 138, p. 405–415, 2004. AEBI, H. Catalase in vitro. Methods Enzymol., v.105, p.121-126, 1984. AHLERT, S.; AQUINO, F. Mapa da Antártica. Climanálise, Boletim de Monitoramento e Análise Climática – CPTEC/INPE. Disponível em: http://www6.cptec.inpe.br/revclima/boletim/. Acesso em: 10/06/2013. AHMAD, I.,HAMID T, FATIMA M, CHAND HS, JAIN SK, ATHAR M, RAISUDDIN S.: Induction of hepatic antioxidantes in freshwater catfish (Channa punctatus, Bloch) is a biomarker of paper mill effluent exposure. Biochim. Biophys. Acta, v.1519, p.37-48, 2000. ALBERTS, B; BRAY, D; LEWIS, J. et al.: Biologia Molecular da Célula. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, p. 1294, 1997. AKSNES A. and REIN. L., Catalase, glutathione peroxidase and superoxide dismutase in different fish species. Comp. Biochem, Physiol B, Vol. 69, p. 893-896, 1981. ANSALDO M, LUQUET CM, EVELSON PA, POLO JAM, LLESUY S.: Antioxidant levels from different Antarctic fish caught around South Georgia Island and Shag Rocks. Polar Biol, v. 23, p.160 – 165, 2000.
67
ANBUMANI, S. E MOHANKUMAR MARY N.: Gamma radiation induced micronuclei and erythrocyte cellular abnormalities in the fish Catla catla. Aquatic Toxicology, v.122– 123 , p. 125– 132, 2012. ATLI, G. E CANLI, M.: Responses of metallothionein and reduced glutathione in a freshwater fish Oreochromis niloticus following metal exposures. Environmental Toxicology and Pharmacology, v.25, p. 33–38, 2008. BAGNYUKOVA T.V., CHAHRAK, O. I., LUSHCHAK, V. I.: Coordinated response of goldfish antioxidant defenses to environmental stress. Aquatic Toxicology, v. 78, p. 325–331, 2006. BAGNYUKOVA, T.V., LUZHNA, L.I., POGRIBNY, I.P., LUSHCHAK, V.I.,. Oxidative stress and antioxidant defenses in goldfish liver in response to short-term exposure to arsenite. Environ. Mol. Mutagen, v. 48, p.658–665, 2007. BAGNYUKOVA, T.V., LUSHCHAK, O.V., STOREY, K.B., LUSHCHAK, V.I: Oxidative stress and antioxidant defense responses by goldfish tissues to acute change of temperature from 3 to 23 °C. J. Therm. Biol., v. 32, p. 227–234, 2007. BAINY, A.C.D.; SAITO, E.; CARVALHO, P.S.M.; JUNQUEIRA, V.B.C. Oxidative stress in gills, erythrocytes, liver and kidney of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from a polluted site. Aquat. Toxicol., v.34, p. 151-162, 1996. BARNES, D.K.A., FUENTES, V., CLARKE, A., SCHLOSS, I.R., WALLACE, M.I.. Spatial andtemporal variation in shallow seawater temperatures around Antarctica. Deep-Sea Research Part II: Topical Studieis in Oceanography, v.53, p. 853-865, 2006. BENEDETTI, M., MARTUCCIO, G., FATTORINI, D., CANAPA, A., BARUCCA, M., NIGRO, M., REGOLI, F.. Oxidative and modulatory effects of trace metals on metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons in the Antarctic fish Trematomus bernacchii, Aquat. Toxicol, v. 85, p. 167–175, 2007. BENEDETTI M., NIGRO M., REGOLI F.,: Characterisation of antioxidant defences in three Antarctic notothenioid species from Terra Nova Bay (Ross Sea). Chemistry and Ecology, v. 26:4, p.305-314, 2010.
68
BEUTLER, E. Red cell metabolism: a manual of biochemical methods. New York: Grune e Stratton, p.160, 1975. BENZIE, I.F.F. Lipid peroxidation: a review of causes, consequences, measurements and dietary influences. Int. J. Food Sci. Nut., v.47, p. 233-261, 1996. BILYK KT, DEVRIES AL.: Heat tolerance and its plasticity in Antarctic fishes. Comp Biochem Physiol, v.158A, p.382–390, 2011. BOLOGNESI, C., PERRONE, E., ROGGIERI, P., PAMPANIN, D.M., SCIUTTO, A.: Assessment of micronuclei induction in peripheral erythrocytes of fish exposed to xenobiotics under controlled conditions. Aquatic Toxicology, p.78S, S93–S98, 2006. BRADFORD M.M.. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, v.72(1), p. 248 – 254, 1976. BRAUER PR, SANMANN JN, PETZEL DH. Effects of warm acclimation on Na+, K+-ATPase-subunit expression in chloride cells of Antarctic fish. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol, v.285, p.600–609, 2005. BRIGELIUS-FLOHÉ, R.: Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. Free Radic. Biol. Med, v.27, p.951–965, 1999. BRODTE, E.; KNUST, R.; PÖRTNER, H. O.. Temperature-dependent energy allocation to growth in Antarctic and boreal eelpout (Zoarcidae). Polar Biology, v. 30, p. 95–107, 2006. BROUWER, M., BROUWER, T.H., GRATER, W., BROWN-PETERSON, N.: Replacement of a cytosolic copper/zinc superoxide dismutase by a novel cytosolic manganese superoxide dismutase in crustaceans that use copper (haemocyanin) for oxygen transport. Biochem. J., v.374, p.219–228, 2003. CAMPBELL, T. W. Hematology of exotic animals. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, v. 13, n. 6, p. 950-957, 1991.
69
CARLBERG, I.; MANNERVIK, B. Glutathione-Reductase. Methods Enzymol, v.113, p.484-490, 1985. CARRASCO, K.R., TILBURY, K.L., MAYERS, M.S.: Assessment of the piscine micronuclei test as in situ biological indicator of chemical contaminants effects, Can. J. Fish. Aquat. Sci, v.47, 1990. CASAUX, R. J., MAZZOTTA, A. S. E BERRERA-ORO, E. R. Seasonal aspects of the biology and diet of nearshore nototheniid fish at Potter Cove, South Shetland Islands, Antartica. Polar Biology, v. 11, n.1, p. 63-72. 1990. CASAUX, R.; BARRERA-ORO, E.; BARONI, A.; RAMÓN, A. Ecology of inshore notothenioid fish from the Danco Coast, Antarctic Peninsula. Polar Biology, v.26, p.157-165. 2003. CASSINI A., FAVERO M., ALBERGONI V. - Comparative studies of antioxidant enzymes in red-blooded and white-blooded antarctic teleost fish. Pagothenia bernacchii and Chionodraco hamatus. Camp. Btochem. Physrol. v. 106C, n. 2, p. 333-336, 1993. CASSINI, A., FAVERO, M., DE LAURETO, P., ALBERGON, V.: Cu–Zn superxide dismutase from Pagothenia bernacchii: catalytic and molecular properties. In: Battaglia, B., Valencia, J., Walton, D.W.H. (Eds.), Antarctic Communities, Species, Structure, and Survival. Cambridge University Press, p. 266–271, 1997. CAVAS, T., ERGENE-GOZUKARA, S.: Micronuclei, nuclear lesions and interphase silver stained nucleolar organizer regions (AgNORs) as cytogenotoxicity indicators in Oreochromis niloticus exposed to textile mill effluent. Mutation Research, v.538, p. 81–91, 2003. CIMA F., BALLARIN L.: TBT-induced apoptosis in tunicate haemocytes. Appl. Organometal. Chem., v.13, p. 697-703, 1999. CHENG, C.H.; CHEN, L.; NEAR, T. J.; JIN, Y. Functional antifreeze glycoprotein genes in temperate-water New Zealand nototheniid fish infer an Antarctic evolutionary origin. Mol. Biol. Evol, v.20(11), p.1897–1908, 2003. CHENG, C.H.; Detrich III, H.W. Molecular ecophysiology of Antarctic notothenioid fishes. Phil. Trans. R. Soc. B, v.362, p. 2215–2232. 2007.
70
CHEN, L.; DE VRIES, A. L. E CHENG, C. C. Convergent evolution of antifreeze glycoproteins in Antartic notothenioid fish and Arctic cod. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Evolution, v. 94, p. 3817–3822. 1997. CHEN, Z., CHENG, C.H., ZHANG, J., CAO, L., CHEN, L., ZHOU, L., JIN, Y., YA, H., DENG, C., DAI, Z., XU, Q., HU, P., SUN, S., SHEN, Y.: Transcriptomic and genomic evolution under constant cold in Antarctic notothenioids fish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v.105, p.12944–12949, 2008. CIMEN MYB. Free radical metabolism in human erythrocytes. Clin Chim Acta, v.390, p.1-11, 2008. CLARKE, A.. Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev, v.21, p.341–453, 1983. CLARK, A., MURPHY, E.J., MEREDITH, M.P., KING, J.C., PECK, L.S., BARNES, D.K.A., SMITH, R.C. Climate change and the marine ecosystem of the western Antarctic Peninsula. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, v. 362, p.149-166, 2007. CLARK, M.S.; PECK, L.S. HSP70 heat shock proteins and environmental stress in Antarctic marine organisms: a mini-review. Marine Genomics, v.2, p.11-18, 2009. CLEMENS, M.R., WALLER, H.D. Lipid peroxidation in erythrocytes. Chem Phys Lipids, v.45, p.251– 68, 1987. COGO AJD, SIQUEIRA AF, RAMOS AC, CRUZ ZMA e SILVA AG. Utilização de enzimas do estresse oxidativo como biomarcadoras de impactos ambientais. Natureza on line, v.7(1), p.37-42, 2009. [on line] http://www.naturezaonline.com.br CROUCH, R.K.; GANDY, S.C.; KIMSEY, G. The inhibition of islet superoxide dismutase by diabetogenic drugs. Diabetes, v.30, p.235-41, 1981. CULLINS, T.L.; DE VRIES, A.L.; TORRES, J.J. Antifreeze proteins in pelagic fishes from Marguerite Bay (Western Antarctica). Deep-Sea Research II, v.58, p. 1690-1694, 2011.
71
DA SILVA, A.S.E., DE LIMA, J.T.A.X., BLANCO, B.S.. Hematologia em peixes (Revisão Bibliográfica) - Revista Centauro, v.3, n.1, p. 24 - 32, 2012. Versão On-line ISSN 178-7573. DE CARVALHO, ELIANORA GOMES; SEIBERT, CARLA SIMONE; COELHO, MICHELLA SOARES; MARQUES, ELINEIDE EUGEN. Hematological parameters of native fish species of the Tocantins river, Auchenipterus nuchalis, Psectrogaster amazonica and Squaliforma emarginata (Teleostei, Ostariophysi)/Parametros hematologicos de especies nativas do rio Tocantins, Auchenipterus nuchalis, Psectrogaster amazonica e Squaliforma emarginata (Teleostei, Ostariophysi) The Free Library (April, 1), 2009. Disponível em: http://www.thefreelibrary.com/Hematological parameters of native fish species of the Tocantins...-a0230483658. Acesso em: 28/11/2013. DE PEDRO, N.; GUIJARRO, A.I.; LÓPEZ-PATIÑO, M.A; MARTÍNEZ-ÁLVAREZ, R.; DELGADO, M.J. Daily and seasonal variations in hematological and biochemical parameters in the tench, Tinca tinca Linnaeus, 1758. Aquaculture Research, v. 36, n. 12, p. 1185-1196, 2005. DI PRISCO, G.; MARESCA, B.; TOTA, B. Biology of antarctic fish. Spriger-Verlag, Berlin, 1991. DI PRISCO, G. Life style and biochemical adaptation in Antarctic fishes. J. Mar. Sys., v.27, p.253-265, 2000. DI PRISCO, G.; EASTMAN, J. T.; GIORDANO, D.; PARISI, E.; VERDE, C. Biogeography and adaptation of Notothenioid fish: Hemoglobin function and globin–gene evolution. Gene., v.398, p.143–155, 2007. DRÖGE, J.A. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological Reviews, v.82, p. 47-95, 2002. DUTRA, B. K., SANTOS, R. B., BUENO, A A P., OLIVEIRA, G. T. Seasonal variations in the biochemical composition and lipoperoxidation of Hyalella curvispina (Crustacea, Amphipoda). Comparative biochemistry and physiology. Part A, Molecular & integrative physiology, v.151 (3), p. 322, 2008. EASTMAN, J.T. The fossil and modern fish faunas of Antarctica: Evolution and Diversity. In Biology of Antarctic Fish (ed. G. di Prisco, B. Maresca e B. Tota). New York: Springer-Verlag, p. 116-130, 1991.
72
EASTMAN, J.T. Zoogeographic origins and evolution of the modern fauna. Antarctic Fish Biology. Evolution in a Unique Environment. San Diego, Academic Press, 1993. EASTMAN, J.T. The nature of the diversity of Antarctic fishes. Polar Biology, v.28, p. 93-107, 2005. EASTMAN, J.T., GRANDE, L. Evolution of the Antarctica fish fauna with emphasis on the recent notothenioids. In: CRAME, J.A. Origins and evolution of the Antarctica biota. Geol. Soc. Spec. Publ., v. 47, p. 241-252, 1989. EKAU, W. Morphological Adaptations and Mode of Life in High Antarctic Fish. In: DI PRISCO, G., Maresca, B., Tota, B. Biology of Antarctic Fish. Berlim: Springer- Verlag, p.23-29, 1991. ESTEVEZ, S.M., ABELE, D., PUNTAROLO, S.. Lipid radical generation in polar (Laternula elliptica) and temperate (Mya arenaria) bivalves. Comp. Biochem. Physiol., B 132, 729– 737, 2002. FELÍCIO, R.. Antártida: A geografia do continente gelado e as operações brasileiras. Disponível em: http://confins.revues.org/index122.html. Acesso em: 24/10/2014. FELIP A., CARRILLO M., HERRÁEZ M.P., ZANUY S., BASURCO B., Protocol K - Erythrocyte meas urements [Pratical guide of protocols: methods of verification of the ploidy]. Advances in fish reproduction and their application to broodstock management: a pratical manual for sea bass Zaragoza : CIHEAM / CSIC-IATS. Options Méditerranéennes : Série B. Etudes et Recherches, n. 63, p.71-74, 2009. FENECH, M.; CROTT, J.; TURNER, J.; BROWN, S. Necrosis, apoptosis, cytostasis and DNA damage in human lymphocytes measured simultaneously within the cytokinesis-block micronucleus assay: description of the method and results for hydrogen peroxide. Mutagenesis, v. 14, p. 605-612, 1999. FENECH, M.: The in vitro micronucleus technique, Mutat. Res., v.455, p.81–95, 2000.
73
FISHBASE. Disponível em: http://www.fishbase.org/summary/Notothenia-rossii.html e http://www.fishbase.org/summary/Notothenia-coriiceps.html. Acesso em 01/08/2014. FISHER, W., HUREAU, J.C. (Eds) FAO Species identification sheets for fishery purposes: Southern Ocean. Food and Agriculture Organization of United Nations. Rome, v. 2, 1985. FOLLER, M., BRAUN, M., QADRI, S.M., LANG, E., MAHMUD, H., LANG, F..Temperature sensitivity of suicidal erythrocyte death. Eur J Clin Invest ,
v.40, p. 534‐540, 2010.
FORERO, A.R. Determinacion de algunos aspectos hematologicos de Oncorhynchus mikiss (Salmoniformes :Salmonidae). Rev. Biol. Trop., v.43,p.283-288,1995. FRANKLIN C.E., DAVISON W., SEEBACHER F., Antarctic fish can compensate for rising temperatures: thermal acclimation of cardiac performance in Pagothenia borchgrevinki. J Exp Biol, v. 210, p. 3068–3074, 2007. FRIDOVlCH I. Superoxide dismutases. Adv. Enzymol., v.41, p.35-97, 1974. FRIEDMAN, J.S. et al. SOD2-deficiency anemia: protein oxidation and altered protein expression reveal targets of damage, stress response, and antioxidant responsiveness. Blood, v.104, p. 2565-2573, 2004. GHOSH R, LOKMAN PM, LAMARE MD, METCALF VJ, BURRITT DJ, DAVISON W, HAGEMAN KJ.: Changes in physiological responses of an Antarctic fish, the emerald rock cod (Trematomus bernacchii), following exposure to polybrominated diphenyl ethers (PBDEs). Aquat Toxicol. Mar., v.15, p.128-129, 2013. GRIM, J.M., MILES, D.R.B., CROCKETT, E.L.: Temperature acclimation alters oxidative capacities and composition of membrane lipids without influencing activities of enzymatic antioxidants or susceptibility to lipid peroxidation in fish muscle. J. Exp. Biol., v. 213, p.445–452, 2010.
74
GRIM, J.M., HYNDMAN, K.A., KRISKA, T., GIROTTI, A., CROCKETT, E.L.: Relationship between oxidizable fatty acid content and level of antioxidant glutathione peroxidases in marine fishes. J. Exp. Biol., v.214, p.3751–3759, 2011. GRIM, J.M., SIMONIK E. A., SEMONES, M.C., KUHN, D.E., CROCKETT, E.L: The glutathione-dependent system of antioxidant defense is not modulated by temperature acclimation in muscle tissues from striped bass, Morone saxatilis- Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, v.164, p. 383–390, 2013. GREENWALT, T.J.. The how and why of exocytic vesicles. Transfusion, v.46, p.143–152, 2006. GRISOLIA, C. K.; RIVERO, C. L. G.; STARLING, F. L. R. M.; SILVA, I. C. R.; BARBOSA, A. C.; DOREA, J. G. Profile of micronucleus frequencies and DNA 67 damage in different species of fish in a eutrophic tropical lake. Genetics and Molecular Biology, v. 32, p. 138-143, 2009. GUIJARRO, A.I.; LOPEZ-PATIÑO, M.A., PINILLOS, M.L. ISORNA, E., DE PEDRO, N., ALONSO-GÓMEZ, A.L., ALONSOBEDATE, M.; DELGADO, M.J. Seasonal changes in haematology and metabolic resources in the tench. Journal of Fish Biology, v. 62, n. 4, p. 803-815, 2003. GUTTERIDGE, JMC. Lipid peroxidation and antioxidants as biomarkers of tissue damage. Clin. Chem., v.41, p.1819–1828, 1995. HAGERMAN, H. M. A. Oxidative Stress. Exercise and Aging, v. 1, p.184, 2006. HALLIWELL, B. AND GUTTERIDGE, J. M. C.: Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford: Oxford University Press, 1999. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. Free radicals in biology and medicine. 3.ed. Oxford University Press, p. 936, 2000. HALLIWELL, B., GUTTERIDGE,J.: Free Radicals in Biology and Medicine. Oxford University Press, Oxford, London, 2007.
75
HARDING, M. M.; ANDERBERG, P. I.; HAYMET, A. D. J. “Antifreeze” glycoproteins from polar fish. Eur. J. Biochem, v. 270, n.7, p.1381-1392, 2003. HEISE, K., PUNTARULO S., NIKINMAA M., ABELE, D.,. PÖRTNER, HANS-O.: Oxidative stress during stressful heat exposure and recovery in the North Sea eelpout Zoarces viviparus L. The Journal of Experimental Biology, v.209, p.353-363, 2006. HEISE K, ABELE D.. Responde of blood parameters of the Antarctic fish Notothenia coriiceps (Richardson, 1844) to warming and hypoxia. The Potter Cove coastal ecosystem, Antarctica. Synopsis of reasearcj performes 1999-2006 at the Dallmann Laboratory and Jubany Station, King George Island (Isla 25 de Mayo). Wiencke C, Ferreyra G, Abele D, Marenssi S (Eds.) Berichte zur Polarforschu, 2008. Disponível em: hdl:10013/epic.30247. HELLMER, H.H., KAUKER, F., TIMMERMANN, R., DETERMANN, J., RAE, J.. Twenty-first-century warming of a large Antarctic ice-shelf cavity by a redirected coastal current. Nature, v. 485, p. 225–228, 2012. HERMES-LIMA, M. Oxygen in biology and biochemistry: role of free radicals. In: STOREY, K.B. (ed.) Functional metabolism: regulation and adaptation. New York, John Wiley e Sons, Inc., p. 319-368, 2004. HOLETON G. F.. Oxygen uptake and circulation by a haemoglobinless antarctic fish compared with three redblooded antarctic fish. Comp. Biochem. Physiol., v.34, p.457- 465, 1970. HUA-TAO LI, LIN FENGA, WEI-DAN JIANGA, YANG LIUA, JUN JIANGA, SHU-HONG LI, XIAO-QIU ZHOUA,: Oxidative stress parameters and anti-apoptotic response to hydroxyl radicals in fish erythrocytes: Protective effects of glutamine, alanine, citrulline and proline. Aquatic Toxicology, v.126, p. 169– 179, 2013. HUREAU, J.C. Biologie comparée de quelques poissons antarctiques (Nototheniidae), Bull. Inst. Océanogr., Monaco, v. 68, p. 1-244, 1970. HUBOLD, G. Ecology of notothenioid fish in the Weddell Sea. In: (Ed.). Biology of Antarctic fishes. Springer-Verlag, New York, p.3-22. 1991. HUDSON HA, BRAURER PR, SCOWELD MA, PETZEL DH.: Effects of warm acclimation on serum osmolality, cortisol and hematocrit levels in the Antarctic fish Trematomus bernacchii. Polar Biol., v.31, p. 991-997. 2008.
76
HOUSTON, A. H. and MURADA, A.: Hematological characterization of goldfish, Carassius auratus L., by image analysis: effects of thermal acclimation and heat shock. Can. J. Zool., v.69, p. 2041-2047, 1991. HOUSTON, A.H., MURRAD, A.: Erythrodynamics in goldfish, Carassius auratus L.: temperature effects. Physiology Zoology, v.65 (1), p.55– 76, 1992. IMAI, H., NAKAGAWA, Y.:Biological Significance of phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx, GPx4) in mammalian cells. Free Radic. Biol. Med., v. 34, p.145–169, 2002. JAYASUNDARA, N.; HEALY, T.M.; SOMERO, G.N. Effects of temperature acclimation on cardiorespiratory performance of the Antarctic notothenioid Trematomus bernacchii. Polar Biology, v. 36, p. 1047-1057, 2013. JIN, Y., DEVRIES, A. L. Antifreeze glycoprotein levels in Antarctic notothenioid fishes inhabiting different thermal environments and the effect of warm acclimation. Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology, v. 144, n. 3, p. 290-300. 2006. JOHNSTON, I.A., CLARKE, A., WARD, P. Temperature and metabolic rate in sedentary fish from the Antartic, North Sea and Indo-West Pacific Ocean. Mar Bio., Berlin, v. 191, p. 191-195, 1991. JOS, Á., PICHARDO, S., PRIETO, A.I., REPETTO, G., VÁZQUEZ, C.M., MORENO, I., CAMEÁN, A.M..: Toxic cyanobacterial cells containing microcystins induce oxidative stress in exposed tilapia fish (Oreochromis sp.) under laboratory conditions. Aquatic Toxicology, v.72, p. 261–271, 2005. KAWALL H.G., SOMERO G.N.. Temperature compensation of enzymatic activities in brain of Antarctic fishes: evidence for metabolic cold adaptation. Antarctic Journal of United States, v. 1996, p. 115-117, 1996. KAWALL H.G.. Metabolic responses of Antarctic organisms: responses to the ice-edge bloom and cold adaptation. Tese de doutorado em “Marine Science”. Department of Marine Science. College of Arts and Science. University of South Florida, p. 101, 1998.
77
KARNOVSKY, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell. Biol., v. 27, p.137-138, 1965 KEEN, J.H.; HABIG, W.H.; JAKOBY, W.B. Mechanism for several activities of the gluthatione Stransferases. J. Biol. Chem., v.251, p.6183–6188, 1976. KEN, C.F., WENG, D.F., DUAN, K.J., LIN, C.T.: Characterization of copper/ zinc-superoxide dismutase from Pagrus major cDNA and enzyme stability. J. Agric. Food Chem., v. 50, p. 784–789, 2002. KING, J.C.. Recent climate variability in the vicinity of the Antarctic Peninsula. Int. J. Climatol., v. 14, p. 357-369, 1994. KING, J.C.; HARANGOZO, S.A. Climate change in the western Antarctic Peninsula since 1945: observations and possible causes. Annals of Glaciology. 27: 571-575.1998. KELLER, M., SOMMER, A.M., PORTNER, H.O., ABELE, D.: Seasonality of energetic functioning and production of reactive oxygen species by lugworm (Arenicola marina) mitochondria exposed to acute temperature changes. J. Exp. Biol., v. 207, p. 2529–2538, 2004. KNOX, G. A. The biology of the Southern Ocean. Cambridge University Press, p.444, 1994. LACKNER, R. “Oxidative stress” in fish by environmental pollutants. In: BRAUNBECK, T, HINTON, D.E., STREIT, B; Fish Ecotoxicology. Birkhauser Verl., Basel, pp.203-224. 1998. LANNIG, G., STORCH, D., PÖRTNER, H-O.. Aerobic mitochondrial capacities in Antarctic and temperate eelpout (Zoarcidae) subjected to warm versus cold acclimation. Polar Biolol, v. 28, p. 575-584, 2005. LAU, A.H.; KNAKIEVICZ, T.; PRÁ, D.; ERDTMANN, B. FRESHWATER PLANARIANS AS NOVEL ORGANISMS FOR GENOTOXICITY TESTING: Analysis of chromosome aberrations. Environmental and Molecular Mutagenesis, v. 48, p. 475-482, 2007.
78
LEGGATT, R.A., BRAUNER, C.J., SCHULTE, P.M., IWAMA, G.K.: Effects of acclimation and incubation temperature on the glutathione antioxidant system in killifish and RTH-149 cells. Comp. Biochem. Physiol. A, v.146, p.322–328, 2007. LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica, 4a. Edição, Editora Sarvier, 2007. LESSER, M.P. Oxidative stress in marine environments: biochemistry and physiological ecology. Annu. Rev. Physiol., v.68, p. 253–278, 2006. LI, S.-D., SU, Y.-D., LI, M. AND ZOU, CH.-G.: Hemin-mediated hemolisis in erythrocytes: effects of ascorbic acid and glutathione. Acta Biochem. Biophys. Sinica., v. 38(1), p. 63-69, 2006. LI Z.H., ZLABEK V., GRABIC R., LI P., RANDAK T.: Modulation of glutathione-related antioxidant defense system of fish chronically treated by the fungicide propiconazole. Comparative Biochemistry and Physiology C, v. 152, p. 392–398, 2010. LIMA, ÉMERSON SILVA; ABDALLA, DULCINEIA SAES PARRA. Peroxidação lipídica: mecanismos e avaliação em amostras biológicas. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 37, n. 3, p. 293-303, 2001. LOWE, C. J.; DAVISON, W. Plasma osmolarity, glucose concentration and erythrocyte responses of two Antarctic nototheniid fishes to acute and chronic thermal change. Journal of Fish Biology, v. 67, n. 3, p. 752-766, 2005. LUFT, J. A. Improvements in an epoxy resin embedding methods. Journal of Biophysics, Biochemistry and Cytology, v. 9, p. 409-414, 1961. LUSHCHAK, V.I., BAGNYUJOVA, T.: Temperature increase results in oxidative stress in goldfish tissues. I. Indices of oxidative stress. Comp. Biochem. Physiol. C, v.143, p.30–35, 2006. MACDONALD J.A, MONTGOMERY J.C, WELLS R.M.G Comparative physiology of Antarctic fishes. Adv Mar Biol, v. 24, p. 321-388, 1987.
79
MADEIRA, D., NARCISO, L.S, CABRAL, H.N., VINAGRE, C., DINIZ, M.S.: Influence of temperature in thermal and oxidative stress responses in estuarine fish. Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, v.166, p. 237–243, 2013. MARIANO, W.S.; OBA, E.T.; SANTOS, L.R.B.; FERNANDES, M.N. Respostas fisiologicas de jeju, Hoplerythrinus unitaeniatus (Characiformes, Erythrinidae) expostos ao ar atmosferico. Rev. Bras. Saúde Prod. An., v. 10 (1), p. 210-223, 2009. MARTÍNEZ-ÁLVAREZ, R., MORALES, A., SANZ, A.: Antioxidant defences in fish: biotic and abiotic factors. Rev. Fish Biol. Fish., v.15, p.75–88, 2005. MONTEIRO, D.A.; ALMEIDA, J.A.; RANTIN, F.T.; KALININ, A.L. Oxidative stress biomarkers in the freshwater characid fish, Brycon cephalus, exposed to organophosphorus insecticide Folisuper 600 (methyl parathion).Comp Biochem Physiol Part C, v. 143, p. 141-149, 2006. MONTGOMERY, J.; CLEMENTS, K. Disaptation and recovery in the evolution of Antarctic fishes. Trends in Ecology and Evolution, v. 15, n. 7, p. 267-271, 2000. MOORE, T., SOROKULOVA, I., PUSTOVYY, O., GLOBA, L., VODYANOY, V.. Microscopic evaluation of vesicles shed by rat erythrocytes at elevated temperatures, Journal of Thermal Biology. Disponível em: http://dx.doi.org/10.1016/j.jtherbio. Acesso em: 01/08/2013. MORGAN, B., EZERIŅA, D., AMOAKO T. N E., RIEMER, J., SEEDORF, M. e DICK, T.P.: Multiple glutathione disulfide removal pathways mediate cytosolic redox homeostasis. Nature America, Inc. All rights reserved doi:10.1038/nchembio.1142, 2012. MUELLER, I.A., DEVOR, D.P., GRIM, J.M., BEERS, J.M., CROCKETT, E.L., O'BRIEN, .M.,:Exposure to critical thermal maxima causes oxidative stress in hearts of white- but not red-blooded Antarctic notothenioid fishes. J. Exp. Biol., v. 215, p. 3655–3664, 2012. MURANLI, F.D.G., GUNER, U.: Induction of micronuclei and nuclear abnormalities in erythrocytes of mosquito fish (Gambusia affinis) following exposure to the pyrethroid insecticide lambda-cyhalothrin. Mutation Research, v. 726, p. 104– 108, 2011.
80
NAGASAKA, R.; OKAMOTO, N.; USHIO, H. Partial oxidative-stress perturbs membrane permeability and fluidity of fish nucleated red blood cells. Comparative Biochemistry and Physiology, v. 139, p. 259-266, 2004.
NEAR, T. J. & CHENG, C.H.C. Phylogenetics of notothenioid fishes (Teleostei: Acanthomorpha): Inferences from mitochondrial and nuclear gene sequences. Molecular Phylogenetics and Evolution, v.47, p. 832–840, 2008. NORMANN, C.A.B.M; Correa, L., PINTO, M. S.: Dano Ambiental em trecho do Rio dos Sinos – Relatório- 2010. OLIVEIRA-RIBEIRO, C.A., FILIPACK NETO, F., MELA, M., SILVA, P.H., RANDI, M.A.F., COSTA, J.R.A., PELLETIER, E.: Hematological findings in neotropical fish Hoplias malabaricus exposed to subchronic and dietary doses of methylmercury, inorganic lead and tributyltin chloride. Environ. Res., v.101, p. 74–80, 2006. ORUÇ, E. Ö, SEVGILER, Y., ÜNER, N. Tissue-specific oxidative stress responses in fish exposed to 2,4-D and azinphosmethyl. Comp Biochem Physiol Part C, v.137,p. 43-51, 2004. OSMAN, A.G.M., HARABAWY, A.: Hematotoxic and genotoxic potential of ultrtaviolet A radiation on the African cat fish Clarias gariepinus (Burchell, 1822). Journal of Fisheries International, v. 5, p.44–53, 2010. OSMAN, A.G.M., ABD EL REHEEM, A.M., MOUSTAFA, M.A., MAHMOUD, U.M., ABUEL-FADL, K.Y., KLOAS, W.:In situ evaluation of the genotoxic potential of the river Nile: I. Micronucleus and nuclear lesions tests of erythrocytes of Oreochromis niloticus niloticus (Linnaeus, 1758) and Clarias gariepinus (Burchell, 1822). Toxicological and Environmental Chemistry, v. 93, p.1002–1017, 2011. PARIHAR, M.S., DUBEY, A.K.: Lipid peroxidation and ascorbic acid status in respiratory organs of male and female freshwater catfish Heteropneustes fossilis exposed to temperature increase. Comp. Biochem. Physiol. C., v.112, p.309–313, 1995. PARIHAR, M. S., TARANGINI, J., HEMNANI, T., DUBEY A. K and PRAKASH, P.. Responses of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and reduced glutathione antioxidant defenses in gills of the freshwater catfish
81
(heteropneustes fossills) to short-term elevated temperature - J. rhcrm. Eiol., v.22, n. 2, p. 151-156, 1997. PARK H, AHN IY, PARK KI,: Hyun S. Response of antioxidant defence system to thermal stress in the Antarctic clam Laternula elliptica. Antarctic Sci, v. 20(6), p. 521-526, 2008. PERMITIN, Y. Y., TARVERDIYEVA, M. I. The feeding of fish of the family Nototheniidae and Chaenichthyidae of the South Orkneys. Biol. Morya (Vladivost), Vlaadivostok, v. 2, p. 75-81, 1978. PIMPÃO, C.T. Avaliação da estimulação de LPS na migração celular em Rhamdia quelen expostos à deltametrina. Rev. Acad., Curitiba, v.3, n.4, p. 11-17, out/dez. 2005. PODRABSKI JE, SOMERO GN: Inducible heat tolerance in Antarctic notothenioid fishes. Polar Biol., v.30, p.39-43, 2006. PÖRTNER H.O.: Climate variations and the physiological basis of temperature dependent biogeography: systemic to molecular hierarchy of thermal tolerance in animals. Comp Biochem Physiol., v.132A, p.739-761, 2002. PORTNER, H. O., MARK, F. C. e BOCK, C.: Oxygen limited thermal tolerance in fish? Answers obtained by nuclear magnetic resonance techniques. Resp. Physiol. Neurobiol., v.141, p.243–260, 2004. QIANG, J., YANG H., WANG, H., KPUNDEH, M.D., PAO XU, P.: Interacting effects of water temperature and dietary protein level on hematological parameters in Nile tilapia juveniles, Oreochromis niloticus (L.) and mortality under Streptococcus iniae infection. Fish & Shellfish Immunology, v.34, p. 8-16, 2013. QUAYALE, W.C., PECK, L.S., ELLIS-EVANS, C.J., PEAT, H.J., HARRIGAN, P.R..Extreme responses to climate change in Antarctic lakes. Science, v. 295, p. 645, 2002. QUAYALE, W.C., CONVEY, P., PECK, L.S., ELLIS-EVANS, C.J., BUTLER, H.G., PEAT, H.G.. Ecological responses of maritime Antarctic lakes to regional climate change. Antarct. Res. Ser, v. 76, p.335–347, 2003.
82
RAMBHASKAR, B.; SRINIVASA-RAO, K. Comparative haematological of ten species of marine fish from Visakhapatnam coast. J. Fish Biol, v.30, p. 59-66, 1987.
REGOLI F., NIGRO M., BENEDETTI M., FATTORINI D., GORBI S. Antioxidant efficiency in early life stages of the Antarctic silverfish, Pleuragramma antarcticum: Responsiveness to pro-oxidant conditions of platelet ice and chemical exposure. Aquatic Toxicology, v.75, p.43–52, 2005. REINOLDS, E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology, v. 17, p. 208-212, 1963. RENWICK, J.A.. Southern Hemisphere Circulation and Relations with Sea Ice and Sea Surface Temperature. J. Climate, v.15, p. 3058-3068, 2002. RIOS, F. S. . HEMATOLOGIA. In: CIRO ALBERTO DE OLIVEIRA RIBEIRO; HERCULANO S. REIS FILHO; SONIA R. GROTZNER. (Org.). Técnicas e métodos para utilização prática de microcopia. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 2010. RIVKIN, R. B., PUTT, M. Diel periodicity of photosystensis in polar phytoplankton: influence on primary production. Science (Washington DC), v.238, p. 1285 -1288. 1987. ROCHE, H., BOGE´, G.,. Effects of Cu, Zn and Cr salts on antioxidant enzyme activities in vitro of red blood cells of a marine fish Dicentrarchus labrax. Toxicol. In Vitro, v. 7, p.623-629, 1993. ROSS, N., BINGHAM, R.G,, CORR, H.F.J., FERRACCIOLI, F., JORDAN, T.A., BROCQ, A.L., RIPPIN, D.M., YOUNG, D., BLANKENSHIP, D.D., SIEGERT, M.J..Steep reverse bed slope at the grounding line of the Weddell Sea sector in West Antarctica. Nature Geoscience, v.5, p. 393–396, 2012. RUDNEVA, IRINA I., KUZMINOVA, NATALYA S., SKURATOVSKAYA, EKATERINA N.: Glutathione-S-Transferase Activity in Tissues of Black Sea Fish Species Asian. J. Exp. Biol. SCI., v.1 (1), p.141-150, 2010.
83
SANTOVITO G., CASSINI A., PICCINNI, E.: Cu,Zn superoxide dismutase from Trematomus bernacchii: Functional conservation and erratic molecular evolution in Antarctic teleosts - Comparative Biochemistry and Physiology C, v.143, p. 444–454, 2006. SAYEED, I.; PARVEZ, S.; PANDEY, S.; BIN-HAFEEZ, B.; HANQUE, R.; RAISUDDIN, S. Oxidative stress biomarkers of exposure to deltamethrin in freshwater fish, Channa punctatus Bloch. Ecotox. Env. Saf, v.56, p. 295-301, 2003. SEEBACHER F, DAVISON W, LOWE CJ, FRANKLIN CE.: A falsification of the thermal specialization paradigm: compensation for elevated temperatures in Antarctic fishes. Biol Lett, v. 1(2), p.151-154, 2005. SERRANO-GARCIA,L., MONTERO-MONTAYA, R.: Micronuclei and chromatid buds are the result of related genotoxic events, Environ. Mol. Mutagen, v. 38, p.38–45, 2001. SIDELL, B. D. Life at Body Temperatures below 0ºC: The Physiology and Biochemistry of Antarctic Fishes. Gravitational and Space Biology Bulletin, v.13(2), 2000. SEDLAK, J. e LINDSAY, R.H. Estimation of total protein bound and nonprotein sulphydril groups in tissues with Ellman’s reagent. Analytical Biochemistry, v.25, p.192-205, 1968. SIES, H.; KOCH, O.R.; MARTINO, E.; BOVERIS, A. Increased biliary glutathione disulfide release in chronically ethanol-treated rats. FEBS Letters, v.103, p.287-290, 1979. SIMÕES, J.C.; ARIGONY-NETO, J.; BREMER, U.F. O uso de mapas antárticos em publicações. Pesquisa Antártica Brasileira, v.4, p.191-197, 2004. SOMERO GN, DEVRIES AL.: Temperature tolerance of some Antarctic fishes. Science, v.156 (772), p. 257, 1967. SOMERO G.N., FIELDS P.A., HOFMANN G.E., WEINSTEIN R.B., KAWALL H.. Cold adaptation and stenothermy in Antarctic Notothenioids fishes: what has
84
been gained and what has been lost? Fishes of Antarctica- A Biological Overview. Springer -Verlag, Milano, p. 363, 1998. SOMERO, G. N. Adaptation of enzymes to temperature: searching for basic "strategies". Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, v. 139, n. 3, p. 321-333, 2004. SOUZA, T. S.; FONTANETTI, C. S.: Micronucleus test and observation of nuclear alterations in erythrocytes of Nile tilapia exposed to waters affected by refinery effluent. Mutatation Research, v.605, p.87–93, 2006. STRUNJAK-PEROVIC, I., POPOVIC, N.T., COZ-RAKOVAC, R., JADAN, M.: Nuclear abnormalities of marine fish erythrocytes. Journal of Fish Biology, v.74, p. 2239–2249, 2009. STADTMAN, E.R.; LEVINE, R.L. Protein oxidation. Ann NY Acad Sci, v.899, p. 191–208, 2000. STEGEMAN, J.J; BROUWER, M.; DI GIULIO, R.T.; FÖRLIN, L.; FOWLER, B.A.; SANDERS, B.M.; VAN VELD, P.A. Molecular responses to environmental contamination: enzyme and protein systems as indicators of chemical exposure and effect. In: HUGGET, R.J.; KIMERLE, R.A.; MEHRLE JR, P.M.; BERGMAN, H.L. (eds.) Biomarkers. Biochemical, physiological, and histological markers of anthropogenic stress. Boca Raton, Lewis Publishers, p. 235-335, 1992. TANDON, R.S.; JOSHI, B.D. Total red and white blood cell count of 33 species of fresh water teleosts. Z. Tierphysiol. Tierernahrg. Futtermittelkde, v.37, p. 293-297, 1976. TARVERDYIEVA, M.I. Daily food consumption and feeding pattern of the South Georgian cod (Notothenia rossii marmorata) and the Patagonian toothfish (Dissostichus eleginoides) in the South Georgia area. J. Ichthyol., Bethesda, v. 12, n.4, p. 684-692, 1972. TAVARES-DIAS, M.; MORAES, F. R. Hematologia de peixes teleósteos. Ribeirão Preto. Villimpress, p.144, 2004.
85
TAYLOR, R.C., CULLEN, S.P., MARTIN, S.J.: Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 9, p. 231–241, 2008. TALYKINA MG, PAPOULIAS DM, ALLERT JA, IZYUOV YU, VILLALOBOS SA, GIESY JP, TILLITT DE: The effect of polychlorinated naphthalenes and tributyltin on the occurrence of aberrant nuclei in erythroid cells of medaka. Environ. Sciences, v.10(6), p. 337–348, 2003. TIANO, L., BALLARINI, P., SANTONI, G., WOZNIAK, M., FALCIONI, G.. Morphological and functional changes of mitochondria from density separated trout erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta , v.1457, p.118–128, 2000. TIANO, L., FEDELIA, D., SANTONIB, G., DAVIESC, I., WAKABAYASHID, T., FALCIONIA, G..Ebselen prevents mitochondrial ageing due to oxidative stress: in vitro study of fish erythrocytes. Mitochondrion, v. 2, p. 428–436, 2003. THORNE MAS, BURNS G, FRASER KPP, HILLYARD G, CLARK MS. Transcription profiling of acute temperature stress in the Antarctic plunderfish Harpagifer antarcticus. Mar Genomics, v. 3(1), p. 35-44, 2010. TURNER, J.; COLWELL, S.R; MARSHALL, G.J.; LACHALAN-COPE, T.A.; CARLETON, A.M.; JONES, P.D.; LAGUN, V.; REID, P.A.; IAGOVIKINA, S. Antarctic climate change during the last 50 years. International Journal of Climatology, v. 25, p. 279-294, 2005. TURNER, J.; OVERLAND, J.E.; WALSH, J.E. An Artic and Antarctic perspective on recent climate change. International Journal of Climatology, v. 27, p. 277-293, 2007. UCHIYAMA, M., & MIHARA, M.. Determination of malondialdehyde precursor in tissue by thiobarbituric acid method. Analytical Biochemistry, v. 86, p.271–278, 1978. VALENZUELA, A.; ALVEAL, K.; TARIFÑO, E. Respuestas hematologicas de truchas (oncorhynchus mykiss walbaum 1792) a estrés hipoxico agudo: serie roja. 2002. Proceeding of the IV Symposium-Workshop of Chilean Association of Ichthyology. Gayana, v. 66, n. 2, p. 255-261, 2002.
86
VINAGRE, C., MADEIRA, D., NARCISO, L.S, CABRAL, H.N., DINIZ, M.S.: Effect of temperature on oxidative stress in fish: Lipid peroxidation and catalase activity in the muscle of juvenile seabass, Dicentrarchus labrax. Ecol. Indic., v.23, p. 274–279, 2012. VAN DER OOST, R., BEYER, J., VERMEULEN, N.P.E.: Fish bioaccumulation and biomarkers risk assessment: a review. Environmental Toxicology and Pharmacology, v. 13, p.57-149, 2003. VASCONCELOS, R.P., REIS-SANTOS, P., FONSECA, V., MAIA, A., RUANO, M., FRANÇA, S.,VINAGRE, C., COSTA, M.J., CABRAL, H.: Assessing anthropogenic pressures on estuarine fish nurseries along the Portuguese coast: a multi-metric index and conceptual approach. Science of the Total Environment, v. 374, p.199-215, 2007. ZHANG X., YANG F., ZHANG X., XU Y., LIAO T., SONG S., WANG H.: Induction of hepatic enzymes and oxidative stress in Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus) exposed to waterborne hexabromocyclododecane (HBCDD). Aquatic Toxicology, v. 86, p. 4–11, 2008. WATSON, M. L. Staining of tissue sections for electron microscopy with heavy metals. Journal of Biophysics, Biochemestry and Cytology, v. 4, p. 75-478, 1958. WDZIECZAK, J., ZALENA, G., BARTKOWIAK, A., WITAS H., and LEYKO, W.; Comparative studies on superoxide dismutase, catalase and peroxidase levels in erythrocytes of different fish species. Comp. Biochem. Physiol., v.68B, 1981. WEDEMEYER, G.A., BARTON, B.A., MCLEAY, D.J.. Stress and acclimation. In Schreck, C.B., Moyle, P.B. (eds.), Methods for fish biology. American Fisheries Society, Bethesda, Maryland, p. 451–489, 1990. WEINSTEIN RB, SOMERO GN. .Effects of temperature on mitochondrial function in the Antarctic fish Trematomus bernacchii. Comp Physiol B, v.168, p. 190-196, 1998. WELLS, R.M.G.; BALDWINS, J.; SEYMOUR, R.S.; CHRISTIAN, K.; BRITTAIN, T. Red blood cell function and haematology in two tropical freshwater fishes from Australia. Comparative Physiology and Biochemistry, v. 141, p. 87-93, 2005.
87
WENDEL, A. Glutathione peroxidase. Methods Enzymol, v.77, p.325-333, 1981. WINDISCH, S.H., KATHÖVER, R., PÖRTNER, H-O., Frickenhaus, S., Lucassen, M.. Thermal acclimation in Antarctic fish: Transcriptomic profiling of metabolic pathways. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol, v.301, p.1453-1466, 2011. WINSTON, G.W., LIVINGSTONE, D.R., LIPS, F.: Oxygen reduction metabolism by the digestive gland of the common marine mussel, Mytilus edulis L. J. Exp. Zool., v. 255, p.296–308, 1990. WINSTON, G.W., GIULIOZ, R.T.D.;Prooxidant and Antioxidant in aquatic organisms. Aquatic Toxicology, v.19, p.137–161,1991. WONG, S.K., ZHANG, X.H., WOO, N.Y.S.. Vibrio alginolyticus thermolabile hemolysin (TLH) induces apoptosis, membrane vesiculation and necrosis in sea bream erythrocytes.- Aquaculture, v.330–333, p. 29–36, 2012.
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ANEXOS
Anexo 1........................................................................................................... 89
Anexo 2........................................................................................................... 94
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Anexo 1 – Processamento Enzimático
1.1 Superóxido dismutase (SOD) (CROUCH et al., 1981)
MEIO DE REAÇÃO 1. Solução de NBT (7,5 ml) Preparar solução de EDTA 1,0 mM (10 ml) - dissolver 0,0037 g de EDTA sal dissódico (MM = 372,24 g.mol-1) em 10 ml de água desionizada. Em outro recipiente, adicionar 375 μl da solução de EDTA a 1,0 mM em 7,125 ml de água desionizada e dissolver 0,0018 g de NBT (MM = 817.64 g.mol-1; [NBT] final na microplaca = 100 μM) nesta solução de EDTA ([final] = 0,05 mM. 2. Solução de hidroxilamina (12 ml) Dissolver 0,0615 g de cloreto de hidroxilamina (MM = 69.49 g.mol-1) em 12 ml de tampão carbonato de sódio a 182 mM, pH 10,2 ([hidroxilamina] final na microplaca = 36,85 mM) MONTAR A PLACA - Pipetar em triplicata 30 μl do sobrenadante da amostra; - Pipetar branco - 30 μl de etanol a 25% em PBS (branco, em triplicata) em microplaca de 96 poços; - Pipetar 70 μl da amostra de solução de NBT - Pipetar 100 μl de solução de hidroxilamina para iniciar a reação - Leitura em: 560 nm (tempo zero) e após 4 h de incubação. Proteger da luz durante a incubação. PARA CÁLCULO DA ATIVIDADE: [(ABS/h do branco / ABS/h da amostra) -1] x 20/3. Os resultados serão expressos em: Unidades x mg proteina-1 (1 unidade de SOD equivale a atividade capaz de inibir a redução do NBT em 50%). REAGENTES: - PBS, pH 7,2; Água desionizada;Tampão carbonato de sódio (182 mM, pH 10,2); Solução de EDTA (0,05 mM); etanol; Azul de nitrotetrazólio (NBT); Cloreto ou sulfato de hidroxilamina;30 μl de amostra tratada com etanol e clorofómio;
90
1.2 Catalase (CAT) (baseado em AEBI, 1984)
MEIO DE REAÇÃO (50 ml) - 2,5 ml de Tampão Tris-HCl 1,0 M, EDTA 5,0 mM, pH 8,0 (pode ser estocado) 47,32 ml de água desionizada -180 μl de H2O2 (30%, d=1,1 g.ml-1, MM = 34 g.mol-1; concentração final no ensaio = 30 mM) CUBETA: – Pipetar 990 μl de meio de reação em cubeta de quartzo; - Pipetar 10 μl da amostra – Misturar por inversão – Leitura em 240 nm (tempo total = 60 s, intervalos = 1 s) em espectrofotômetro de cubeta. PARA CÁLCULO DA ATIVIDADE: Selecionar o primeiro intervalo de 30 s cujo r2 > 0,99 e calcular delta ABS no intervalo de 1 min ((ABS inicial – ABS final) x2). REAGENTES: - Peróxido de hidrogênio; Água ultrapura;Tampão Tris-EDTA; PBS, pH 7,2; - Utilizar cubeta de quartzo. - 10 μl da amostra
91
1.3 Glutationa S-Transferase (GST) (KEEN et al., 1976 modificado)
MEIO DE REAÇÃO (20 ml) - 0,0093 g de GSH ([GSH] final = 1,5 mM) - 0,0122 g de CDNB ([CDNB] final = 2 mM; diluir inicialmente em 1 ml de etanol PA)19 ml de tampão fosfato de potássio (0,1 M, pH 6,5) MONTAR A PLACA – Branco: 20 μl de tampão fosfato de potássio; - 20 μl da amostra em microplaca de 96 poços (em triplicata) - 180 μl de meio de reação (com micropipeta multicanal) Leitura em: 340 nm (tempo total = 300 s, intervalos = 20-50 s) PARA CÁLCULO DA ATIVIDADE: Para calcular a atividade da GST empregar a fórmula: (ΔABS/min x 10)/5,76. Os resultados serão expressos em: μmoles de tioéter formado x min-1 x mg de proteína-1.
REAGENTES: - Tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 6,5; PBS, pH 7,2; Glutationa (GSH); 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB);
92
1. 4 Glutationa Peroxidase (GPx)
MEIO DE REAÇÃO (para 100 poços) - 0,0027 g de azida sódica (MM = 65,01 g.mol-1; [azida] final na microplaca = 2 mM) - 0,0035 g de NADPH (MM = 833,4 g.mol-1; [NADPH] final na microplaca = 0,2 mM) - 0,0127 g de GSH (MM = 307,32 g.mol-1; [GSH] final na microplaca = 2 mM) - 45 μl de glutationa redutase (GR, 2,7 mg prot.ml-1, 168 U.mg prot-1; [GR] final na microplaca = 1 U.ml-1) - 14,45 ml de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0).
SOLUÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (10 ml)
Preparar uma solução contendo 26 μl de H2O2 (~30%, d=1,1 g.ml-1, MM = 34
g.mol-1) em 10 ml de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0). Então, pipetar 1
ml desta solução + 9 ml de tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) ([H2O2]
final na microplaca = 0,5 mM).
MONTAR A PLACA: - 20 μl do sobrenadante da amostra (em triplicata) em microplaca de 96 poços - Branco: 20 μl de PBS; - 140 μl de meio de reação 1 (com micropipeta multicanal) e aguardar 2 min –40 μl de solução com peróxido de hidrogênio (com micropipeta multicanal) - Leitura em: 340 nm (tempo total = 180 s, intervalos = 10-20 s);
CÁLCULO DA ATIVIDADE;
Para calcular a atividade da GPx empregar a fórmula: (ΔABS/min x 10)/3,732.
Os resultados serão expressos em: μmoles de NADPH oxidado x min-1 x mg
de proteína-1.
REAGENTES: - Tampão fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0); Solução de H2O2 (5 mM); PBS, pH 7,2; Glutationa reduzida (GSH); Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido (NADPH); Glutationa redutase (GR).
93
1.5 Glutationa Redutase (GR) (SIES et al., 1979)
MEIO DE REAÇÃO (16 ml) - 0,0089 g de NADPH (MM = 833,4 g.mol-1; [NADPH] final na microplaca = 0,5 mM) - 0,0653 g de GSSG (MM = 612,63 g.mol-1; [GSSG] final na microplaca = 5,0 mM) - 16 ml de tampão fosfato de potássio 0,1 M, EDTA 5,0 mM, pH 7,6
MONTAR A PLACA: - 50 μl do sobrenadante da amostra (em triplicata) em microplaca de 96 poços - 50 μl de PBS (branco, em triplicata) em microplaca de 96 poços - 150 μl de meio de reação (com micropipeta multicanal) 7 - Leitura em 340 nm (tempo total = 10 min, intervalos = 40 s)
CÁLCULO DA ATIVIDADE
Para calcular a atividade da GPx empregar a fórmula: (ΔABS/min x 3)/14,928.
Os resultados serão expressos em: μmoles de NADPH oxidado x min-1 x mg
de proteína-1.
REAGENTES: - Tampão fosfato de potássio 0,1 M, EDTA 5,0 mM, pH 7,6; PBS, pH 7,2; Glutationa dissulfeto (GSS); Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido (NADPH);
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ANEXO 2 – Processamento – Defesa antioxidante
2.1 Glutationa Reduzida (GSH) e outros tióis (baseado em SEDLAK e
LINDSAY, 1968)
Soluções: 1. Solução de ácido tricloroacético a 50% (10 ml) Dissolver 5 g de ácido tricloroacético em 10 ml de água desionizada 2. Solução de DTNB (8 ml) Dissolver 0,0079 g de ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB, MM=396,3 g.mol-1) em 500 μl de metanol PA. Então, adicionar 7,5 ml de tampão Tris-base a 0,4 M, pH 8,9 ([DTNB] = 2,5 mM). 3. Curva-padrão de GSH (fazer uma curva para cada análise realizada) Dissolver 0,0012 g GSH (MM = 307,32 g.mol-1) em 976 μl de tampão tris-base a 0,4 M, pH 8,9 ([GSH] = 4 mM). PREPARAR AMOSTRA: - Adicionar 50 μl da solução de ácido tricloroacético a 50% aos 200 μl do sobrenadante ainda congelado do tecido ([proteínas] > 5 mg.ml-1). - Branco: 50 μl da solução de ácido tricloroacético a 50% em 200 μl de PBS - Misturar bem - Centrifugar a 5000 g por 10 min e 4 °C MONTAR PLACA: – Pipetar 50 μl do branco; – Pipetar 50 μl da curva-padrão; – Pipetar 50 μl do sobrenadante das amostras; – 230 μl do tampão Tris-base 0,4 M, pH 8,9 – em todos os poços; – Adicionar em todos os poços utilizados 20 μl de solução de DTNB – encubar por 5-10 min a temperatura ambiente - Leitura em 415 nm; PARA CÁLCULO DA CONCETRAÇÃO DE GSH: Com a curva padrão encontrar a equação da reta (y= a x + b), calcular a concentração de tióis através da fórmula [Tióis] =((Média ABS – branco) x 1,25) / (a x [proteínas]). A concentração de tióis será expressa em nanomoles de tióis x mg de proteínas-1
REAGENTES: - Água desionizada; PBS, pH 7,2; Tampão tris-base a 0,4 M, pH 8,9; Ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB); Ácido tricloroacético (TCA); Metanol.
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2.2 Determinação da concentração de Malonaldeído (MDA)
QuantiChromTM TBARS Assay Kit (DTBA-100)
CONTEÚDO DO KIT:
TBA Reagente : 25 ml de padrão: MDA 50 ul de 15 mM 10 % de ácido tricloroacético ( TCA) a 25 mL.
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA:
1 . Para soro e plasma , transferir 100 ul de cada amostra para um tubo de 1,5 ml marcado. Para as amostras de tecido , pesar ~ 20 mg em 200 ul de fosfato arrefecida com gelo de solução salina tamponada ( PBS ) . Homogeneizar o tecido por breve sonicação ( por exemplo, 20 segundos) sobre o gelo . Se desejado , remover 20 mL alíquota para análise de proteínas . Colocar 100 mL de lisado de tecido num tubo rotulado 1,5 mL de micro - centrífuga . Para as células , de colheita 5 x 10 6 células em 200 ul de PBS gelado e sonicado a romper as células . Se desejado , remover 20 mL alíquota para análise de proteínas . Colocar 100 mL de lisado celular num tubo de 1,5 mL de micro - centrífuga rotulado
2 . Adicionar 200 mL de 10 % de TCA a 100 uL de cada amostra . Incubar por 5 minutos em gelo.
3 . Centrifugar 5 min a 14.000 rpm em centrífuga de microtubos (Centrifugador Eppendorf). Transferir 200 mL de cada sobrenadante límpido para um novo tubo marcado . Factor de diluição para estas amostras pré-tratadas é n = 3.
PROCEDIMENTO ensaio colorimétrico:
Configure banho-maria ou bloco de aquecimento e ajustar a temperatura para 100 ° C. Equilibrar todos os componentes à temperatura ambiente. Adicionar 450 mL dH2O a 15 mm tubo padrão e misture (MDA final de 1,5 mM).
1 . Padrões . Misturar 15 uL de MDA a 1,5 mM, com 735 mL dH 2O ( final de 30 iM MDA ) . Dilui-se os padrões , como mostrado na Tabela .
Amostras. Transferir 200 uL de cada amostra para tubos separados .
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2 . Reação de cor . Para cada um dos padrões e amostras , adicionar 200 mL de reagente TBA . Tubos Vortex para misturar e incubar a 100 ° C durante 60 min . Esfriar os tubos à temperatura ambiente. Vortex e brevemente centrífuga tubos. 3 . Pipetar 100 ul em duplicata a partir de cada tubo para poços de uma placa de 96 poços de fundo plano clara . Ler em 535nm ( 525 a 545nm ) . CÁLCULO. Para calcular a concentração de TBARS da amostra, aplica-se a fórmula:
n é o factor de diluição da amostra (n = 3 para amostras desproteinizadas).
